DE60037648T2

DE60037648T2 - Fusionsproteine, die zwei lösliche gp130 Moleküle enthalten

Info

Publication number: DE60037648T2
Application number: DE60037648T
Authority: DE
Inventors: Stefan Rose-John
Original assignee: Conaris Research Institute AG
Current assignee: Conaris Research Institute AG
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2010-06-17
Anticipated expiration: 2020-04-22
Also published as: EP1148065A1; SI1148065T1; ES2298106T3; DK1148065T3; ATE382636T1; PT1148065E; DE60037648D1; EP1148065B1; CY1107380T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Fusionsmolekül, das zwei lösliche gp130 (sgp130) Moleküle umfasst. Insbesondere wird ein Fc Fusionsprotein von löslichem gp130 (sgp130-Fc) erzeugt und blockiert, wie sich in mehreren Zellkulturmodellen sowie mit Lamina propria Zellen von Patienten mit Crohn-Krankheit gezeigt hat, IL-6 Reaktionen abhängig von löslichem IL-6R spezifisch, während Reaktionen über das membrangebundene IL-6R unbeeinflusst bleiben.
Zusätzlich hat sgp130-Fc auch die Proliferation gehemmt, die durch den Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) und Oncostatin M (OSM) induziert wurde.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das pleiotropische Zytokin Interleukin-6 (IL-6) zeigt ein breites Spektrum an biologischen Funktionen, von denen die Stimulation von B-Zellen und die Induktion der Akutphasenproteinsynthese in der Leber am bemerkenswertesten sind. IL-6 übt seine Wirkung auf Zielzellen über die Bindung an einen IL-6 spezifischen Oberflächenrezeptor („IL-6R” oder „gp80”) aus. Dieser Rezeptor/Ligand-Komplex erleichtert die Homodimerisierung von gp130, der zweiten Untereinheit des IL-6 Rezeptorkomplexes.
Die Dimerisierung von gp130 führt zur Transduktion eines IL-6 Signals (Tags u. a., 1997 a). Lösliche Formen von Il-6R (sIL-6R), die von zwei Mechanismen erzeugt werden, dem alternativen Spleißen und dem Shedding bzw. Freisetzen, sind auch in der Lage, die gp130 Dimerisierung auszulösen und die Komplexierung mit IL-6 zu signalisieren (Tags u. a., 1997 a sowie Rose-John u. a., 1994).
Da der zytoplasmatische Teil von IL-6R nicht zur Signaltransduktion beiträgt (Tags u. a., 1989), kann eine Signalisierung durch ein gp130 Homodimer durch IL-6 im Komplex mit membrangebundenem oder löslichem IL-6R induziert sein (Tags u. a., 1997 b).
Das Vorhandensein von sIL-6R führt allerdings zu einer Sensibilisierung von auf IL-6 reagierenden Zellen in Richtung auf den Ligand, wie zuvor für die menschlichen Hepatomzellen HepG2 beschrieben (Peters u. a., 1996). Weiterhin ist gezeigt worden, dass Hybridomzellen, die strikt von IL-6 abhängen, nicht in Reaktion auf sehr geringe Mengen an IL-6 proliferieren, wenn sIL-6R, das in Kulturmedien vorhanden ist, koninuierlich entfernt wird (Galliard u. a., 1997).
Anfänglich wird als ein Interleukin-6 Signaltransducer beschrieben, ist gp130, eine Transducer-Kette, die sich viele Zytokine teilen, wie beispielsweise IL-6, IL-11, der Leukämie inhibitorische Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und der ziliäre neurotrophe Faktor (CNTF). Alle diese Zytokine wirken über einen zwei- oder dreigeteilten Rezeptorkomplex, bei dem die Signalisierung durch eine Homodimerisierung (bei IL-6) oder eine Heterodimerisierung mit LIF-Rb/gp190 Protein (für IL-11, LIF, oSM und CNFT) von gp130 ausgelöst wird. Diese Zytokine vermitteln daher ähnliche biologische Aktivitäten in verschiedenen Geweben.
Während gp130 auf fast allen Zellarten gefunden werden kann, zeigt das IL-6R eine viel eingeschränktere Expression. Die Freisetzung von sIL-6R durch eine Zellart macht andere Zellen, die nur gp130 exprimieren, empfänglich für IL-6. Dieses Szenario wird Transsignalisierung genannt (Rose-John u. a., 1994), Tatsächlich sind mehrere zelluläre Aktivitäten beschrieben worden, die den Komplex von sIL-6R und IL-6 erfordern und mit IL-6 allein nicht zu sehen sind.
Lösliches gp130 Protein wird in hohen Konzentrationen in menschlichem Plasma (Narazaki u. a., 1993) gefunden.
Vor kurzem ist das Designer-Zytokin Hyper-IL-6 (H-IL-6) beschrieben worden, bei dem der COOH Terminus von sIL-6R kovalent an den NH₂ Terminus von reifem IL-6 durch einen flexiblen Peptidlinker fusioniert ist. Wie mit dem Komplex von IL-6/sIL-6R zu sehen ist, wirkt H-IL-6 auch auf Zellen, die nur gp130 exprimieren. Im Gegensatz zu den einzelnen Komponenten IL-6 und sIL-6R reicht eine 100- bis 1000-fach niedrigere Konzentration dieses Fusionsmoleküls aus, um vergleichbare biologische Signale hervorzurufen (Fischer u. a., 1997).
Die WO 99/02552 beschreibt chimäre Proteine, die von der Fusion der natürlich auftretenden Form von sIL-6R und IL-6 konstruiert sind, welche zur Behandlung von mit IL-6 verwandten Erkankungen nützlich sind.
Eine Ausführungsform von WO 95/11303 beschreibt heterodimere Proteine, die die extrazelluläre Domäne eines Zytokinrezeptors, wie beispielsweise sIL-6R oder sCNTFR, und die extrazelluläre Domäne von gp130 umfassen. Wie berichtet wird, sind solche Heterodimere wirksame Antagonisten von IL-6 oder CNTF, weil sie als Fallen für IL-6 oder CNTF fungieren, um so das Zytokin unzugänglich zu machen und so einen signaltransduzierenden Komplex mit den nativen membrange bundenen Formen ihrer Rezeptoren zu bilden. Die US-Patente Nr. 5,783,672 und 5,426,048 beschreiben die Erzeugung von heterodimeren Rezeptorproteinen, die OSM-Rß + gp130 bzw. LIF-R + gp130 umfassen.
Die extrazellulären Anteile von vielen Zytokinrezeptoren, wie beispielsweise beide TNF Rezeptoren (Van Zee u. a., 1992), sind an die konstante Region einer schwere Kette eines Immunglobulins (Fc) fusioniert worden. Dadurch werden mit Disulfid verbundene Rezeptorhomodimere erzeugt, die ähnlich den IgG Antikörpern sind. Solche Fusionsproteine werden Fc Proteine oder Immunadhäsine genannt. Sie zeigen eine erhöhte Affinität für ihre Liganden und eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit im Vergleich zu den monomeren löslichen Rezeptoren (als Übersicht Ashkenazi u. a., 1997). Weiterhin sind biologisch aktive Fc Fusionsproteine von IL-2, IL-10, IL-15 und IL-17 beschrieben worden. Ähnlich den Antikörpern können sekretierte rekombinante Fc Fusionsproteine aus einem Kulturmedium durch eine einzelstufige Reinigung über Protein A oder Protein G Sepharose gereinigt werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Fusionsmolekül vorzusehen, das zwei lösliche gp130 (sgp130) Moleküle umfasst. Insbesondere wird ein Fc Fusionsprotein von löslichem gp130 (sgp130-Fc) erzeugt, das, wie festgestellt wurde, stark in COS-7 Zellen exprimiert ist. Wie sich in mehreren Zellkulturmodellen sowie mit Lamina propria Zellen von Patienten mit Crohn-Krankheit gezeigt hat, blockiert dieses Fusionsprotein spezifisch IL-6 Reaktionen abhängig von löslichem IL-6R, während Reaktionen über das membrangebundene IL-6R unbeeinflusst bleiben. Darüber hinaus hat sgp130-Fc auch die Proliferation gehemmt, die trotz etwa 1000-fach höherer Konzentrationen durch den Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF) und Oncostatin M (OSM) induziert wird.
Die Fusionsmoleküle der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können mit bekannten Verfahren konstruiert werden. Die verwendeten Domänen können aus der ganzen extrazellulären Domäne von gp130 bestehen oder sie können aus Mutanten oder Fragmenten davon bestehen, die die Fähigkeit zur Hemmung der Aktitvät des agonistischen Komplexes IL-6/sIL-6R beibehalten.
Über die Klonierung und Expression von humanem gp130 ist 1990 zusammen mit der putativen extrazellulären Domäne berichtet worden (Hibi u. a., 1990).
Wie festgestellt wurde, ist eine Spleißvariante der cDNA, die eine lösliche Form von gp130 kodiert, in Blastozysten exprimiert worden (Sharkey u. a., 1995). Einer solchen Variante fehlt die intrazelluläre Signalisierungsdomäne. Fusionsmoleküle gemäß der Erfindung, die zwei solche sgp130 Varianten umfassen, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Fusionen können direkt sein (der C-Terminus von einer Polypeptidkette ist mit dem N-Terminus der anderen durch eine einfache kovalente Bindung verbunden) oder sie können eine flexible Linkerdomäne, wie beispielsweise die Gelenkregion von humanem IgG, oder Polypeptidlinker, die aus kleinen Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Serin, Threonin oder Alanin, in verschiedenen Längen und Kombinationen bestehen, verwenden. Darüber hinaus können die Fusionsmoleküle der Erfindung mit His-His-His-His-His-His (His6) markiert werden, um eine schnelle Reinigung mittels Metall-Chelat-Chromatographie zu erlauben, und/oder mit Epitopen, für die Antikörper zur Verfügung stehen, um den Nachweis auf Western Blot, Immunpräzipitation oder Aktivitätserschöpfung/Blockierung in Bioassays zu ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform wird das Fusionsprotein der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung mit einem ähnlichen Verfahren hergestellt, das allerdings die Fc-Domäne von humanem IgG1 verwendet (Aruffo u. a., 1991). In diesem Fall werden homodimere Moleküle, die die Fc-Domäne tragen, als Disulfid-verbundene Homodimere exprimiert.
In einer anderen Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung werden die Fusionsproteine der Erfindung durch Expression als Fusionsmoleküle unter der Verwendung von flexiblen Linker-Loops bzw. Linker-Schleifen hergestellt. Ein DNA-Konstrukt, das das Fusionsprotein kodiert, ist derart konstruiert, dass es zwei lösliche oder extrazelluläre Domänen exprimiert, die durch eine flexible Schleife hintereinander zusammenfusioniert sind („Kopf an Kopf”). Diese Schleife kann vollständig künstlich (z. B. Polyglycin-Repeats, die in einem bestimmten Intervall durch Serin oder Threonin unterbrochen sind) oder von natürlich auftretenden Proteinen „geborgt” sein (z. B. der Gelenkregion von hIgG).
Außerdem fasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von manipulierten, mutierten Versionen von gp130 mit neuen Eigenschaften ins Auge, die die Bindung des agonistischen Komplexes IL-6/sIL-6R ermöglichen.
Eine Auswahl von Mitteln kann verwendet werden, um Mutationen von sgp130, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, zu erzeugen und zu identifizieren. Verwendet werden können die willkürliche Mutagenese mittels Standardverfahren des DNA kodierenden sgp130 und anschließend die Analyse der gesammelten Produkte, um mutierte Zy tokine mit den gewünschten neuartigen Eigenschaften zu identifizieren, wie nachfolgend erläutert. Die Mutagenese durch Gentechnik findet weithin Verwendung, um den strukturellen Aufbau von funktionellen Domänen von rekombinanten Proteinen zu erhellen. Mehrere unterschiedliche Ansätze sind in der Literatur zum Durchführen einer Deletions- oder Substitutionsmutagenese beschrieben worden. Die erfolgreichsten scheinen die Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham u. a., 1989a) und Homolog-Scanning-Mutagenese (Cunningham u. a., 1989b) zu sein.
Die Fusionsmoleküle der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können durch Klonieren und Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem mittels der geeigneten Expressionsvektoren hergestellt werden. Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren kann verwendet werden.
Zum Beispiel werden die DNA-Moleküle, die für die Proteine der Erfindung kodieren, in geeignet konstruierte Expressionsvektoren mittels Verfahren eingeführt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe Sambrook u. a., 1989). Doppelsträngige cDNA ist mit Plasmidvektoren durch homopolymeres „Tailing” oder durch eine Restriktionsverbindung, die die Verwendung von synthetischen DNA Linkern oder Ligationsverfahren mit glattem Ende umfasst, verbunden: DNA Ligasen werden verwendet, um die DNA Moleküle zu ligieren, und ein unerwünschtes Verbinden wird durch Behandlung mit Alkaliphosphatase vermieden.
Um das gewünschte Protein exprimieren zu können, sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nukleotidsequenzen umfassen, die transkriptions- und translationsregulatorische Informationen enthalten, die mit der das gewünschte Protein kodierenden DNA derart verbunden sind, dass eine Genexpression und Produktion des Proteins erlaubt ist.
Damit das Gen transkribiert werden kann, muss zuerst ein Promotor vorausgehen, der durch RNA-Polymerase erkennbar ist, an den die Polymerase bindet und so das Transkriptionsverfahren einleitet. Es gibt eine Auswahl von solchen im Einsatz befindlichen Promotoren, die mit unterschiedlichen Wirksamkeiten arbeiten (starke und schwache Promotoren).
Für eukaryontische Wirte können unterschiedliche transkriptions- und translationsregulatorische Sequenzen verwendet werden, und zwar abhängig von der Natur des Wirts. Sie können aus viralen Quellen, wie beispielsweise Adenovirus, Rinderpapillomvirus, Simian-Virus oder dergleichen, stammen, bei denen die regulatorischen Signale mit einem bestimmten, ein hohes Expressionsniveau besitzendes Gen in Verbindung stehen. Beispiele sind die TK Promotoren von Herpes-Virus, der frühe SV40-Promotor, der Hefe-gal4-Genpromotor usw. Transkriptionsregulatorische Initiationssignale können ausgewählt werden, die die Repression und Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gene moduliert werden kann.
Das DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz umfasst, die für das Fusionsmolekül der Erfindung kodiert, wird in den/die Vektor(en) eingeführt, die die funktionsfähig verbundene transkriptions- und translationsregulatorischen Signale aufweisen, wodurch die gewünschten Gensequenzen in die Wirtszelle integriert werden können. Die Zellen, die durch die eingeführte DNA stabil transformiert sind, können auch durch Einführen von einem oder mehreren Markern ausgewählt werden, die die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann auch die Phototrophie für einen auxotropen Wirt, Biozidresistenz, z. B. Antibiotika oder Schwermetalle, wie beispielsweise Kupfer oder dergleichen, vorsehen. Das auswählbare Markergen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA Gensequenzen verbunden sein oder in dieselbe Zelle durch Kotransfektion eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können auch für die optimale Synthese von Proteinen der Erfindung benötigt werden.
Faktoren, die für die Auswahl eines bestimmten Plasmids oder Virusvektors wichtig sind, umfassen: die Leichtigkeit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und aus den Empfängerzellen ausgewählt werden können, die den Vektor nicht enthalten; Die Zahl der Vektorkopien, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird; und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen den Wirtszellen von unterschiedlichen Arten „hin und her zu schicken”.
Sobald der/die Vektor(en) der DNA-Sequenz, die das/die Konstrukt(e) enthält/enthalten zur Expression hergestellt wurde(n), kann/können das/die DNA-Konstrukts(e) durch jede aus einer Auswahl von geeigneten Mitteln in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastfusion, Elektroporation, Kalziumphosphat-Präzipitation, direkte Mikroinjektion usw.
Wirtszellen können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bevorzugt sind eukaryontische Wirte, z. B. Säugetierzellen, wie beispielsweise Zellen vom Menschen, Affen, von der Maus und von Ovarien chinesischer Hamster (CHO), weil sie posttranslationale Modifikationen für Proteinmoleküle vorsehen, einschließlich die korrekte Faltung oder Glykosylierung an den richtigen Stellen vorsehen. Weiterhin können Hefezellen posttranslationale Peptidmodifikationen, einschließlich die Glykosylierung, durchführen. Es gibt eine Anzahl von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und eine große Kopienzahl von Plasmiden verwenden, die zur Herstellung der gewünschten Proteine in Hefe benutzt werden können, Hefe erkennt Leader-Sequenzen auf klonierten Säugetiergenprodukten und sekretiert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
Nach der Einführung des/der Vektor(en) werden die Wirtszellen in einem ausgewählten Medium wachsen gelassen, das das Wachstum von Vektor enthaltenden. Zellen auswählt. Die Expression der klonierten Gensequenz(en) führt zur Herstellung der gewünschten Proteine.
Die Reinigung der rekombinanten Proteine wird durch eines der Verfahren, die für diesen Zweck bekannt sind, d. h. ein herkömmliches Verfahren, das die Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen umfasst, durchgeführt. Ein weiteres Reinigungsverfahren, das bevorzugt zum Reinigen des Proteins der Erfindung verwendet werden kann, ist die Affinitätschromatographie mittels monoklonaler Antikörper, die das Zielprotein binden und die auf einer in einer Säule enthaltenen Gelmatrix erzeugt und immobilisiert werden. Unreine Präparate, die das rekombinante Protein enthalten, werden durch die Säule geleitet. Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen hindurchgeleitet werden. Nach dem Waschen wird das Protein aus dem Gel durch Änderung des pH-Werts oder der Ionenstärke eluiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das die DNA-Sequenz umfasst, die für das obige Fusionsprotein kodiert, sowie Nukleotidsequenzen, die weitgehend gleich sind. „Nukleotidsequenzen, die weitgehend gleich sind” umfasst alle anderen Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes auch für die gegebene Aminosäuresequenz kodieren.
Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung des Fusionsproteins der Erfindung werden die DNA-Sequenzen von bestehenden Klonen erhalten.
Analoge oder Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in Übereinstimmung mit dem folgenden Verfahren bestimmt wer den. Die DNA der nativen Sequenzen ist im Stand der Technik bekannt und wird in der Literatur gefunden. Polypeptide, die durch eine Nukleinsäure, wie beispielsweise eine DNA oder RNA, kodiert werden, die mit dem Komplement der nativen DNA oder RNA unter stark stringenten oder mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, solange das Polypeptid die biologische Aktivität der nativen Sequenz aufrechterhält, sollen auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Stringente Bedingungen sind eine Funktion der im Hybridisierungsexperiment verwendeten Temperatur der Molarität der monovalenten Kationen und des prozentualen Formamidanteils in der Hybridisierungslösung. Um den Grad an Stringenz, der mit einer bestimmten Bedingungsreihe verknüpft ist zu bestimmen, wird zuerst die Gleichung von Meinkoth u. a. (1984) verwendet, um die Stabilität von Hybriden mit 100%iger Identität zu bestimmen, und zwar ausgedrückt als Schmelztemperatur Tm des DNA-DNA-Hybrids: Tm = 81,5°C + 16,6(_LogM) + 0,41(%GC) – 0,61(% Form) – 500/L, worin M die Molarität von monovalenten Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von G und C Nukleotiden in der DNA ist, % Form der prozentuale Anteil von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in den Basenpaaren darstellt. Für jedes 1°C, das die Tm von der für ein Hybrid mit 100%iger Identität berechneten reduziert wird, wird die erlaubte Menge an Fehlpaarungen um etwa 1% erhöht. Daher Wird, wenn die Tm für jedes gegebene Hybridisierungsexperiment bei den spezifischen Salz- und Formamidkonzentrationen 10°C unter der Tm liegt, die für ein 100%iges Hybrid gemäß der Gleichung von Meinkoth berechnet wird, die Hybridisierung auftreten, selbst wenn es bis zu etwa 10% Fehlpaarungen gibt.
Wie hier verwendet, sind stark stringente Bedingungen solche, die bis zu etwa 15% Sequenzdivergenz tolerant sind, während mäßig stringente Bedingungen solche sind, die bis zu etwa 20% Sequenzdiver genz tolerant sind. Ohne Einschränkungen verwenden Beispiele für stark stringente (12–15°C unter der berechneten Tm des Hybrids) und mäßig stringente (15–20°C unter der berechneten Tm des Hybrids) Bedingungen eine Waschlösung von 2 × SSC (standard saline citrate) und 0,5% SDS bei der geeigneten Temperatur unterhalb der berechneten Tm des Hybrids. Die abschließende Stringenz der Bedingungen beruht primär auf den Waschbedingungen, insbesondere wenn die verwendeten Hybridisierungsbedingungen solche sind, die es ermöglichen, dass sich weniger stabile Hybride zusammen mit stabilen Hybriden bilden. Die Waschbedingungen bei höherer Stringenz entfernen dann die weniger stabilen Hybride. Eine übliche Hybridisierungsbedingung, die mit den stark stringenten bis mäßig stringenten, oben beschriebenen Waschbedingungen verwendet werden kann, ist die Hybridisierung in einer Lösung von 6 × SSC (oder 6 × SSPE), 5 × Denhardt-Reagens, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachsspermien-DNA bei einer Temperatur von ungefähr 20° bis 25°C unter der Tm. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstelle von SSC zu verwenden (Ausubel, 1987–1998).
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die PEGylierte oder andere chemisch modifizierte Formen des Hybridproteins enthalten.
Die Fusionsmoleküle der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind zur Behandlung und/oder Verhinderung von allen Pathologien von Nutzen, bei denen die Aktivität des agonistischen Komplexes IL-6/sIL-6R verhindert werden muss. Zum Beispiel umfassen die therapeutischen Verwendungen der Fusionsmoleküle folgendes.

a) IL-6 scheint direkt an dem multiplen Myelom beteiligt, indem es entweder autokrin oder parakrin wirkt, um die Tumorbildung zu fördern (van Oers u. a., 1993). Weiterhin erzeugen die erhöhten IL-6 Niveaus unerwünschte Nebenwirkungen, wie beispielsweise Knochenresorption, Hyperkalzämie und Kachexie. Für diese Fällen ist bekannt, dass sIL-6R die Zielzellen für IL-6 sensibilisiert. Daher sind die Fusionsmoleküle der Erfindung, wie hier beschrieben, sowohl im Hinblick auf die Nebenwirkungen als auch zur Hemmung des Tumorwachstums vorteilhaft.
b) Bei Autoimmunerkrankungen: Die pathogene Bedeutung von IL-6 bei Autoimmunerkrankungen ist von vielen Autoren in der Literatur besprochen worden (siehe Yoshizaki u. a., 1992), so dass eine Störung der IL-6 Signaltransduktion für die Autoimmunkrankheitstherapie von Nutzen sein kann (Nishimoto u. a., 1999). Beispiele für solche Pathologien sind systemischer Lupus erythemathodes, Hashimoto Thyreoiditis, Sklerodermie, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Autoimmunepithelitis, Diabetes mellitus, Sjögren-Syndrom, Polymyositis, Glomerulonephritis und andere entzündliche Erkrankungen, wie beispielsweise Psoriasis und Crohn-Krankheit.
c) Bei Osteoporose, die durch Absenken der Östrogenniveaus bei postmenopausalen Frauen oder durch Ovariektomie schlimmer werden kann, scheint IL-6 der kritische Mittler der Osteoklastogenese zu sein, die zu einer Knochenresorption führt (Jilka u. a., 1992). Im wesentlichen scheint IL-6 nur eine Hauptrolle beim östrogenerschöpften Zustand zu spielen und ist offensichtlich minimal am normalen Knochenerhalt beteiligt. Damit übereinstimmend zeigt der Versuchsbeweis, dass funktionsblockierende Antikörper für IL-6 die Zahl der Osteoklasten reduzieren können [Jilka u. a., 1992]. Obwohl auch eine Östrogenersatztherapie angewendet wird, scheinen Nebenwirkungen aufzutreten, die ein erhöhtes Risiko für Endometrial- und Brustkrebs auf weisen können. Daher sind die Fusionsmoleküle der Erfindung, wie hier beschrieben, für eine Reduzierung der Osteoklastogenese auf normale Niveaus spezifischer.
d) IL-6 kann ein Vermittler des Tumornekrosefaktors (TNF) sein, der zu einer Kachexie in Verbindung mit AIDS und Krebs führt (Strassmann u. a., 1992), vielleicht durch eine Reduzierung der Lipoproteinlipaseaktivität in adipösem Gewebe (Greenberg u. a., 1992). Demgemäß wären die hier beschriebenen Fusionsmoleküle der Erfindung zur Erleichterung oder Reduzierung einer Kachexie bei solchen Patienten von Nutzen.
e) Bakterielle und virale Infektionen: das Vorhandensein von humanem Herpesvirus 8 (HHV8) ist in über 90% der Kaposisarkom(KS)-Läsionen gezeigt worden. Außerdem wird das Virus in einem primären Effusionslymphom (PEL) und bei Patienten mit multizentrischer Castleman Krankheit (MCD) identifiziert. Faszinierenderweise hat sich gezeigt, dass dendritische Zellen aus dem Knochenmark von Patienten mit multiplem Myelom (MM) mit HHV8 infiziert sind. Seit dieser Zeit ist die Verbindung von HHV8 mit MM Thema einer heftigen Debatte, die kürzlich wieder aufgenommen wurde. Das Genom von HHV8 kodiert für mehrere Proteine mit signifikanten Homologien für humane antiapoptotische Proteine, Chemokine und Cytokine, einschließlich eine virale Form von Interleukin-6 (vIL-6) mit 25% Homologie für humanes IL-6 (Moore u. a., 1996).

vIL-6 hat, wie gezeigt wurde, biologische Aktivitäten, die an humanes IL-6 erinnern, d. h. die Stimulation der Proliferation von Maushybridom und humanen Myelomzellen. Vor kurzem wurde bei Mäusen gezeigt, denen vIL-6 transfizierte NIH3T3 Zellen injiziert wurden, dass vIL-6 Angiogenese und Hämatopoese induzierte. Es wurde daraus geschlossen, dass durch diese Funktionen vIL-6 eine wichtige Rolle bei der Pa thogenese von Störungen in Verbindung mit HHV8 spielt. Der Beitrag von IL-R6 zur vIL-6 Signalisierung ist kontrovers diskutiert worden. Molden u. a., die ungereinigte Überstände von mit vIL-6 transfizierten COS-7 Zellen verwenden, haben gezeigt, dass die STAT Aktivität in Zellen induziert wurde, die gp130 aber kein IL-6R exprimieren (Molden u. a., 1997). Im Gegensatz dazu haben Burger u. a. festgestellt, dass die Aktivität von vIL-6 durch einen IL-6 Rezeptorantagonisten reduziert wurde, was für eine Beteiligung von IL-6R an der vIL-6 Signalisierung spricht (Burger u. a., 1998). Hier zeigen wir, dass gereinigtes rekombinantes vIL-6 physikalisch mit gp130 nicht aber mit IL-6R eine Wechseleirkung einging und dass IL-R6 für die biologische Wirksamkeit von vIL-6 verzichtbar war. Die Aktivität von vIL-6 wird durch das sgp130-Fc Fusionsprotein gehemmt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen die oben beschriebenen Fusionsmoleküle in einem pharmakologisch annehmbaren Träger, verbunden mit einem Träger und/oder eingearbeitet in Liposome, Mikrokapseln und einem Präparat mit kontrollierter Freisetzung. Zum Beispiel kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine oder mehrere Fusionsmoleküle in wässriger Lösung, wie beispielsweise sterilem Wasser, Kochsalzlösung, Phosphatpuffer oder Dextroselösung, umfassen. Alternativ können die Wirkstoffe in einem Feststoff (z. B. Wachs) oder einer halbfesten (z. B. gelatinöse) Formulierung enthalten sein, die in einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, implantiert werden können.
Der Verabreichungsweg kann jede auf dem Fachgebiet bekannte Verabreichungsart sein, einschließlich, aber nicht ausschließlich, intravenös, intrathekal, subkutan, durch Injektion in das beteiligte Gewebe, intaarteriell, intranasal, oral oder über eine implantierte Einrichtung. Die Verabreichung kann zur Verteilung des Wirkstoffs der Erfindung über den ganzen Körper oder in einem lokalisierten Bereich führen.
Zum Beispiel kann bei manchen Bedingungen, die entfernt liegende Regionen des Nervensystems beteiligen, die intravenöse oder intrathekale Verabreichung des Stoffs erwünscht sein. In einigen Situationen kann ein Wirkstoff enthaltendes Implantat im oder nahe dem lädierten Bereich platziert werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung stellt daher das Verfahren zur Behandlung und/oder Verhinderung von einer der oben erwähnten Erkrankungen durch eine wirksame Menge an Fusionsmolekül der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff dar.
Eine „wirksame Menge” betrifft eine Menge an Wirkstoffen, die ausreicht, um den Verlauf und die Schwere der Krankheit zu beeinflussen, die zur Reduzierung oder Remission einer solchen Pathologie führt. Die wirksame Menge hängt vom Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab.
Wirkdosen, die zur Behandlung und/oder Verhindering dieser oder anderer verwandter Erkrankungen oder Störungen nützlich sind, können mit Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe zum Beispiel Fingl u. a., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman und Gilman, Hrsg. Macmillan Publishing Co., New York, Seite 1–46 (1975)).
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die das Fusionsmolekül der Erfindung in Gegenwart von einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen enthalten.
„Pharmazeutsch annehmbar” bedeutet, dass jeder Träger umfasst ist, der die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs nicht stört und der für den Wirt, an den er verabreicht wird, nicht toxisch ist.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die in keiner Weise als für die vorliegende Erfindung einschränkend anzusehen sind. Diese Beispiele beziehen sich auf die nachfolgend näher erläuterten Figuren.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Schematische Dartellungen von sgp130-Fc und sgp130his Konstrukten.
2
Wechselwirkung von gp130 Proteinen mit dem IL-6/sIL-6R Komplex. (A) Metabolisch markiertes H-IL-6 wurde aus 200 μl Kulturmedium von transfizierten COS-7 Zellen unter Verwendung von 0,5 g sgp130-Fc (Spur 2) oder einem unwichtigen Fc Fusionsprotein (R27080Fc) als negative Kontrolle (Spur 1) immunpräzipitiert. (B) Metabolisch markiertes sgp130his wurde aus 200 μ Kulturmedium von transfizierten COS-7 Zellen unter Verwendung von 0,5 μg H-IL-6-Fc (Spur 2) oder dem nicht verwandten R27080Fc Protein als negative Kontrolle (Spur 1) immunpräzipitiert. Immunkomplexe wurden mit SDS-PAGE und Fluorographie analysiert.
3
Bindung von humanem und Maus-gp130 an IL-6/FL-6R Komplexkomponente: Metabolisch markiertes Maus sIL-6R (Spur 1–7) oder humanes sIL-6R (Spur 8–14) wurde aus 250 μl Kulturmedien von transfizierten COS-7 Zellen entweder unter Verwendung von 1 μg humanem sgp130-Fc (h), Maus gp130Fc (m) oder humanem IL-6Fc (h) im munpräzipitiert, wie in der Darstellung angegeben. Die Präzipitation fand in Gegenwart oder bei Fehlen von 350 ng humanem IL-6 (h) oder Maus IL-6 (m) statt, wie angegeben. Die Immunkomplexe wurden mittels SDS-PAGE und Fluorographie analysiert.
4
Die Kinetik der Bindung von H-IL-6 an immobilisiertes sgp130-Fc. (A) Assoziierung von H-IL-6 an immobilisiertes sgp130-Fc führte zu einem Anstieg des Resonanzwinkels alpha als Funktion der Zeit. Die Assoziierungsphase wurde für unterschiedliche nanomolare H-IL-6 Konzentrationen aufgezeichnet, wie angegeben. (B) Berechnung der erhaltenen Daten aus den Kurven ermöglichte die Bestimmung der Dissoziierungsratenkonstante kd aus dem Ordinatenabschnitt und der Assoziationsratenkonstante ka aus der Neigung der Kurve. Alle kinetischen Experimente wurden bei einer kontrollierten Temperatur (25°C) durchgeführt.
5
(A) Proliferation von BAF/gp130 Zellen in Reaktion auf 5 ng/ml H-IL-6 und steigenden Mengen an sg130-Fc oder sgp130his. (B) Proliferation von BAF/gp130/IL-6R Zellen in Reaktion auf 1 ng/ml IL-6 und steigenden Mengen an sgp130-Fc oder sgp130his. Die Daten bedeuten mittlere Werte +/– Standardabweichung von zwei parallelen Experimenten. (C) Proliferation von BAF/gp130 Zellen in Reaktion auf 100 ng/ml IL-6 zusammen mit 50 ng/ml sIL-6R und steigenden Mengen an sgp130-Fc oder 10 ng/ml H-IL-6 und steigenden Mengen an sgp130-Fc. Die Daten stellen mittlere Werte +/– Standardabweichung von drei parallelen Experimenten dar.
6
Proliferation von 10 BAF/gp130/LIFR/CNTFR Zellen in Reaktion auf 10 ng/ml H-IL-6, 1 ng/ml LIF, 10 ng/ml OSM oder 0,5 ng/ml CNTF in Ge genwart von steigenden Mengen an sgp130-Fc. Die Daten stellen mittlere Werte +/– Stadardabweichung von zwei parallelen Experimenten dar.
7
Hemmung der akuten Phase in Hepatomzellen: (A) HepG2 Zellen wurden mit 100 ng/ml IL-6 oder H-IL-6 18 h lang in Gegenwart oder bei Fehlen von 1 μg/ml sgp130-Fc stimuliert, (B) HepG2/IL-6 Zellen wurden mit 100 ng/ml IL-6R-Fc oder H-IL-6 mit oder ohne 1 μg/ml sgp130-Fc 18 h lang stimuliert. Die nicht stimulierten Zellen, die mit oder ohne sgp130-Fc behandelt wurden, wurden als Kontrolle (co) verwendet. Die α1-Antichymotrypsinexpression der Zellen wurde durch 4 h Pulsmarkierung und anschließende Immunpräzipitation mit einem spezifischen Antikörper analysiert. Immunkomplexe wurden mit SDS-PAGE und Fluorographie analysiert.
8
Die Analyse der Apoptose in mononukleären Lamina propria Zellen (LPMC) eines Crohn-Patient. LPMCs wurden wie beschrieben isoliert und wie beschrieben 48 h lang in Gegenwart oder bei Fehlen von 10 μg/ml eines neutralisierenden IL-6R-spezifischen Antikörpers oder sgp130-Fc kultiviert. Anschließend wurden Zellen auf Annexin V und Propidiumiodid gefärbt und mit FACS analysiert. Der prozentuale Anteil der apoptotischen (Annexin V positiven und Propidiumiodid negativen) Zellen ist gezeigt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Materialien
DMEM, Penicillin und Streptomycin wurden von Gibco (Eggenstein, Deutschland) gekauft. FCS wurde von Seromeal (Berlin, Deutschland) erhalten. DEAE Dextran wurde von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) gekauft. Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland) oder AGS (Heidelberg, Deutschland) bezogen. T4-DNA-Ligase und Polynucleotidkinase wurden von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) erhalten. Protein A Sepharose stammte von Pharmacia (Freiburg, Deutschland). Tran-35S-Label (44 TBq/mmol) stammte von ICN (Meckenheim, Deutschland), [6-3H]Thymidin (74 GBq/mmol) wurde von Amersham International (Aylesburg, UK) erhalten, Röntgenfilme (X-OMAT-AR) stammten von Eastman Kodak (Rochester, NJ). H-IL-6 wurde wie beschrieben erzeugt; H-IL-6, sIL-6R, H-IL-6-Fc und IL-6-Fc wurden wie beschrieben hergestellt (Fischer u. a., 1997); Özbek u. a., 1998; Jostock u. a., 1999.
Das humane IL-6R-Fc wurde durch Fusion der cDNA, die für den extrazellulären Teil von humanem IL-6R kodiert, an eine cDNA, die für den humanen Fc Teil von IgG1 kodiert, mit den Restriktionsstellen Sspl bzw. EcoRV konstruiert. Humanes sIL-6R und Maus sIL-R cDNAs wurden wie zuvor beschrieben erzeugt (Mackiewicz u. a., 1992; Mackiewicz u. a., 1995). Der pCDM8 Vektor (Invitrogen, Leek, NL) wurde zur Expression von sIL-6R Proteinen in Säugetierzellen verwendet. H-IL-6 im pCDM8 Expressionsvektor
Konstruktion der gp130 Expressionsplasmide
Die cDNA Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne von gp130 kodiert, wurde an ein Bgl2/NotI Fragment fusioniert, das die konstante Region einer schweren Kette von humanem IgG1 kodiert [Franslow u. a., 1992]. Ein Xhol/EcoR1 Fragment der gp130 cDNA wurde an den Fc Teil über einen synthetischen Oligonukleotidadaptor ligiert. Um eine mit poly His markierte Version von löslichem gp130 zu erhalten, wurde der Fc-Teil im sgp130-Fc Konstrukt durch einen synthetischen Oligonukleotidadaptor ersetzt, der für 6 Histidinreste kodiert, und zwar gefolgt von einem translationalen Stoppkodon. Zur Expression der Proteine wurde das Säugetierexpressionsplasmid pDC409 (Giri u. a., 1994) verwendet.
Kultur und Transfektion von Zellen
HepG2, COS-7, BAF/gp130 und BAF/gp130/IL-6R Zellen wurden in DMEM bei 37°C, 5% CO2 in einer mit Wasser gesättigten Atmosphäre wachsen gelassen. Die Zellkulturmedien wurden mit 10% FCS, 100 mg/I Streptomycin und 60 mg/I Penicillin ergänzt. BAF/gp130/IL-6R wurden in Gegenwart von 10 ng/ml IL-6, BAF/gp130 in Gegenwart von 10 ng/ml H-IL-6, BAF/gp130/LIFR/CNTFR in Gegenwart von 10 ng/ml CNTF kultiviert. COS-7 Zellen wurden mit dem DEAE Dextranverfahren transfiziert (McMahan u. a., 1991). Zur Herstellung von rekombinanten Proteinen wurden Zellen in Medien mit 0,5% FCS kultiviert und Überstände wurden am Tag 5 nach der Transfektion gesammelt.
Reinigung von rekombinanten Proteinen
Sgp130-Fc wurde wie zuvor für IL-6Fc beschrieben gereinigt. sgp130his wurde aus 900 ml Kulturmedien bei einem t mi NJ/Chelatsäule (Pharmacia) durch Elution mit 100 mM Imidazol mittels eines FPLC Systems (Aekta Explorer, Pharmacia) gereinigt. Protein enthaltende Fraktionen, die durch SDS-PAGE und anschließendes Silberfärben identifiziert wurden, wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert. Konzentrationen von gereinigten Proteinen wurden mit einem BCA Mikroproteinassay (Pierce, Rockford, IL) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt oder von der silbergefärbten SDS-PAGE geschätzt.
Immunpräzipitation von Proteinen
Zellen wurden metabolisch 48 h nach der Transfektion mit 50 mCi/mi [³⁵S]Methionin/[³⁵S]Cystein in Methionin/Cystein-freiem Medium 8 Stunden lang markiert. Sekretierte Proteine wurden unter Verwendung von 1 μg/ml geeigneten Antikörpern oder Fc Proteinen immunpräzipitiert. Immunkomplexe wurden aus Kulturmedien mittels Protein A Sepharose präzipitiert, mit SDS-PAGE (Laemmli, 1970) analysiert und mit Fluorographie unter Verwendung der fluorographischen Intensivierlösung „Amplify” (Amersham) sichtbar gemacht.
Bindungsassay
sgp130-Fc wurde kovalent an eine Carboxylmethyldextranmatrix (Fisons, Loughborough, UK) in Anlehnung an die Empfehlungen des Herstellers immobilisiert (Krebs u. a., 1998). Die Bindungsexperimente wurden bei kontrollierter Temperatur (25°C) mit unterschiedlichen Konzentrationen von H-IL-6 mittels IASYS^TM (Fisons) optischem Biosensor durchgeführt. Die Assoziierungs- und Dissoziierungsaffinogramme wurden durch nicht lineare Regression mit der FASTfit (Fisons) Software analysiert, die den Marquard-Levenburg Algorithmus für die iterative Datenanpassung verwendet.
Proliferationsassays
BAF/gp130, BAG/gp130/IL-6R und BAF/gp130/LIFR/CNTFR Zellen (Kallen u. a., 1999) wurden umfangreich mit PBS gewaschen, um die Wachstumsfaktoren zu entfernen, und in cytokinfreiem Medium resuspendiert. 5 × 10³ Zellen/Loch einer 96-er Platte wurden in einem Endvolumen von 100 mi mit Cytokinen und steigenden Mengen an gp130 Proteinen, wie in den Figuren angegeben, 68 Stunden lang kultiviert und anschließend mit 0,25 mCi [³H]Thymidin 4 Stunden lang pulsmarkiert. Die Zellen wurden auf Glasfiltern geerntet und eingearbeitetes [³H]Thymidin wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
Akutphasenassay auf Hepatomzellen
HepG2 Zellen und HepG2 Zellen, die stabil mit humaner IL-6 cDNA (HepG2/IL-6 Zellen)(Mackiewicz u. a., 1992) transfiziert waren, wurden fast bis zur Konfluenz wachsen gelassen und 18 h lang mit 100 ng/ml IL-6, H-IL-6 oder sIL-6R-Fc in Gegenwart oder bei Fehlen von 1 μg/ml sgp130-Fc stimuliert, wie in den Figuren angegeben.
Anschließend wurden die Zellen 4 h lang mit [³⁵S]-Cystein/Methionin (10 μCi/ml) pulsmarkiert. Die Überstände der Zellen wurden mit Pansorbin 1 h lang behandelt, bevor radioaktives markiertes α1-Antichymotrypsin mit einem spezifischen Antikörper (Gibco, Eggenstein, Deutschland) immunpräzipitiert wurde, und mit SDS-PAGE und Fluorographie festgestellt.
Isolierung und Stimulation von humanen mononukleären Lamina propria Zellen
Mononukleäre Lamina propria Zellen (LPMC) wurden in kompletten Medien kultiviert, die aus RPMI-1640 mit 3 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES Puffer, 10 μg/ml Gentamycin (Whittecker, Walkersville, MD), je 100 U/mi Penicillin und Streptomycin (Whittacker), 0,05 mM 2ME (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) und 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum bestanden. Die Zellen wurden mit C-reaktivem Protein (10 μg/ml Sigma Chem), 50 ng/ml PMA und 10 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA, Sigma) in Gegenwart oder bei Fehlen von sgp130-Fc oder einem neutralisierenden IL-6R spezifischen Antikörper stimuliert, und zwar sowohl bei 1 als auch 10 μg/ml, wie in der Figur angegeben. Nach 48 h wurden die Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid mittels des Anne xin V FITC Apoptosedetektionskits I (Pharmingen) gefärbt und mit FACS analysiert.
Ergebnisse und Diskussion
Expression und Reinigung von löslichem gp130 Protein.
Zwei lösliche Formen von gp130 wurden erzeugt. Die cDNA, die den extrazellulären Teil von humanem oder Maus gp130 kodierte, wurde mit der konstanten Region einer schweren Kette von humanem IgG1 (sgp130-Fc) fusioniert. Diese Art von Fusionsproteinen werden allgemein Fc Proteine oder Immunadhäsine genannt (Ashkenazi u. a., 1997; Jostok u. a., 1999). Eine schematische Darstellung von sgp130-Fc ist in der 1 gezeigt. Im zweiten Konstrukt, wurde eine „Hexa-Histidin”-Sequenz-Markierung an den COOH-Terminus des extrazellulären Teils von humanem gp130 (sgp130his) angefügt (1). sgp130-Fc und sgp130his wurden transient in COS-7 Zellen exprimiert und aus Kulturmedien durch Affinitätschromatographie bei Protein A Sepharose bzw. Ni-Chelatagarose gereinigt. Gereinigte gp130 Proteine wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und Silberfärbung analysiert.
Bindung von sgp130-Fc an den Komplex von IL-6 und löslichem IL-6R.
Die Bildung eines ternären Komplexes aus IL-6 und den löslichen Formen aus IL-6R und gp130 ist zuvor gezeigt worden. Um die Bindung von sgp130-Fc und sgp130his an IL-6/sIL-6R zu analysieren, haben wir das Fusionsprotein „Hyper-IL-6” (H-IL-6) verwendet, bei dem der COOH-Terminus der Ligandenbindungsdomäne von IL-6R an den NH2-Terminus von IL-6 über einen flexiblen Peptidlinker fusioniert ist (Fischer u. a., 1997). Wie in der 2 gezeigt, wurden radiomarkiertes H-IL-6 und sgp130his mit sgp130-Fc bzw. H-IL-6Fc immunpräzipitiert.
Humanes IL-6 bindet das humane sIL-6R und mit niedrigerer Affinität das Maus sIL-6R, während Maus IL-6 nur den Maus-Rezeptor bindet. Daher war es von Interesse zu untersuchen, ob weitere Arteinschränkungen auf die Bildung des ternären Komplexes von IL-6, sIL-6R und sgp130 anwendbar sind (3). Radiomarkiertes murines oder humanes sIL-6R wurde mit Maus oder humanem sgp130-Fc bei Fehlen oder Vorhandensein von Maus oder humanem IL-6 immunpräzipitiert. Kein sIL-6R wurde durch sgp130-Fc bei Fehlen von IL-6 kopräzipitiert. Maus sIL-6R bildete einen ternären Komplex mit allen Kombinationen von IL-6 und sgp130-Fc. Wie erwartet, konnte humanes sIL-6R nur durch Maus oder humanes sgp130-Fc in Gegenwart von humanem IL-6 kopräzipitiert werden. Interessanterweise wurde das Maus sIL-6R nicht durch IL-6Fc, einem Fusionsprotein von humanem IL-6 und humanem IgG1, präzipitiert, was eine sehr niedrige Affinität von humanem IL-6 für Maus sIL-6R bei Fehlen von gp130 anzeigt. Unsere Ergebnisse zeigen klar, dass humanes sIL-6R mit Maus sgp130 Wechselwirken kann und umgekehrt.
Die Kinetik der Bindung von H-IL-6 an sgp130-Fc wurde durch Plasmonresonanz gemessen (4A). sgp130-Fc wurde an eine IASYS^TM Küvette immobilisiert (siehe „Materialien und Methoden”) und eine Realzeitwechselwirkung von H-IL-6 und sgp130-Fc wurde analysiert. In der 4 sind Assoziierungskurven, die für 7 Konzentrationen von H-IL-6 aufgezeichnet wurden, gezeigt. Die erhaltenen Daten wurden verwendet, um eine Assoziierungsrate, kass = 4,08 × 106 +/– 2,55 × 105 M-1 s-l und eine Dissoziierungsrate, kdiss = 1,71 × 10 – 2 +/– 0,0012 s-l, zwischen H-IL-6 und sgp130-Fc zu berechnen. Von diesen Werten kann eine Affinität von Kd = 4,20 nM abgeleitet werden (4B).
Hemmung der sI£-6IR abhängigen Proliferation von BAF/3 Zellen.
Nachdem gezeigt wurde, dass sgp130 speziell mit dem Komplex von IL-6/sIL-6R wechselwirkt, war von Interesse zu wissen, ob sgp130 Proteine die biologische Aktivität von IL-6 und sIL-6R stören. Wir verwendeten die IL-3 abhängigen Prä-B-Zellen BA/3, die gp130 nicht exprimieren und daher nicht auf IL-6 oder FL-6/sIL-6R reagieren. BAF/3 Zellen, die stabil mit humanem gp130 c-DNA (BAF/gp130) oder humanem gp130 und sIL-6R cDNAs (BAF/gp130/Il-6R) transfiziert sind, wachsen allerdings bei Fehlen von IL-3 in Reaktion auf IL-6/sIL-6R bzw. IL-6 0. Die Proliferation von BAF/gp130 Zellen, die durch H-IL-6 stimuliert waren, wurde durch sgp130-Fc und sgp130his dosisabhängig blockiert (5A). Es zeigte sich, dass sgp130-Fc etwa 10-mal aktiver als sgp130his war, wenn beide Proteine in gleichen molaren Konzentrationen verwendet wurden. Keines der gp130 Proteine hatte einen Einfluss auf die Proliferation von BAF/gp130/IL-6R Zellen, die durch IL-6 induziert waren (5B). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass sgp130 speziell die Aktivität von mit Il-6 komplexiertem sIL-6R neutralisiert und Reaktionen, die über das membrangebundene IL-6R ausgelöst werden, nicht stört. Weiterhin haben wir die Wirkung von sgp130-Fc auf die BAF Zellproliferation, die durch H-IL-6 und IL-6 plus sIL-6R induziert wurde, hervorgerufen und ähnliche Ergebnisse erhalten. Eine Konzentration von 20 ng sgp130-Fc/mi führte zu einer 50%igen Hemmung der Proliferation, die durch 10 H-IL-6 bzw. 10 IL-6 plus 50 sIL-6R induziert wurde (5C).
Wirkung von sgp130-Fc auf die Reaktionen auf andere IL-6 Zytokine.
Außer als Signaltransduktionsuntereinheit des IL-6R Komplexes ist gp130 z. B. auch an der Signalisierung in Reaktion auf den Leukämie inhibitorischen Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und ziliären neurotrophen Faktor (CNTF) beteiligt. LIF und OSM wirken über einen Oberflächenrezeptor, der aus gp130 und LIFR zusammengesetzt ist. Der CNTFR Komplex enthält auch gp130 und LIFR und, ähnlich wie der IL- 6R Komplex, ein zusätzliches Ligandenbindungsprotein (CNTFR). Um die Wirkung von sgp130-Fc auf Reaktionen auf diese IL-6 Zytokine zu untersuchen, verwendeten wir BAF/3 Zellen, die gp130, LIFR und CNTFR exprimieren (BAF/gp130/LIFR/CNTFR). Während sgp130-Fc keine Wirkung auf die CNTF induzierte Proliferation dieser Zellen hatte, wurde die Proliferation, die durch LIF und OSM stimuliert wurde, bei hohen Konzentrationen von sgp130-Fc gehemmt (6). sgp130-Fc beeinflusste nicht die Reaktion von BAF/gp130/LIFR/CNTFR Zellen auf IL-3. Von Interesse ist, dass die hemmende Wirkung von sgp130-Fc auf sie durch LIF und OSM induzierte Proliferation sehr schwach im Vergleich zu seiner Wirkung auf die durch H-IL-6 stimulierte Reaktion ist.
sgp130-Fc hemmt die sIL-6R abhängige Akutphasenproteinsynthese in HepG2 Hepatom ce/rs.
Humane Hepatomzellen HepG2 synthetisieren so genannte Akutphasenproteine, wie beispielsweise Haptoglobin und cd-Antichymotrypsin, in Reaktion auf IL-6 (Gauldie u. a., 1987) oder IL-6/sIL-6R (Mackiewicz u. a., 1992). HepG2 Zellen, die mit IL-6 oder HqL-6 bei Fehlen oder Vorhandensein von sgp130-Fc behandelt wurden, wurden metabolisch 4 Stunden lang markiert und anschließend wurde die in die Kulturmedien sekretierte α1-Antichymotrypsinmenge analysiert (7A). sgp130-Fc hatte keine Wirkung auf die IL-6 induzierte Synthese des Proteins, während die H-Il-6 induzierte Synthese von al-Antichymotrypsin stark gehemmt war. Diese Ergebnisse unterstreichen unseren Befund, dass sgp130-Fc speziell die sIL-6R abhängigen Reaktionen hemmt und das zelloberflächenexprimierte IL-6R nicht stört.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit HepG2-IL-6 Zellen erhalten. Diese Zellen verloren bei stabiler Transfektion einer humanen IL-6 cDNA die Oberflächenexpression von IL-6R. Obwohl diese Zellen hohe Mengen an IL-6 in ihr Kulturmedium sekretieren, wurden sie vollständig unempfänglich gegenüber IL-6. HepG2-IL-6 Zellen konnten allerdings durch den Komplex von IL-6/sIL-6R stimuliert werden [33]. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen, die mit HepG2 Zellen erhalten wurden, wurde die sIL-6R und H-IL-6 induzierte α1-Antichymotrypsinsynthese in HepG2-IL-6 Zellen stark durch sgp130-Fc gehemmt.
sgp130-Fc hemmt die antiapoptotische Wirkung von sIL-6R auf die Lamina propria Zellen von Crohn-Patienten
Die Crohn-Krankheit (MCD) ist eine chronische entzündliche Erkrankung des Gastrointestinaltrakts. Es ist vorgeschlagen worden, dass eine Aktivierung des mukosalen Immunsystems in Reaktion auf bakterielle Antigene mit folgender pathologischer Zytokinproduktion eine pathogene Schlüsselrolle spielt. Ein neutralisierender Antikörper, der gegen IL-6R gerichtet war, war in der Lage, die Resistenz von mononukleären Lamina propria Zellen (LPMC) bei MCD Patienten gegenüber Apoptose zu unterdrücken. Wir wollten analysieren, ob eine antiapoptotische Wirkung von IL-6 in diesem System über das oberflächenexprimierte IL-6R transduziert wird oder ob die Resistenz von immunkompetenten Zellen gegen Apoptose vom Vorhandensein von sIL-6R abhängt. LPMC wurden in Gegenwart von neutralisierendem anti-IL-6R-Antikörper oder sgp130-Fc unter den Bedingungen, die in „Materialien und Methoden” beschrieben sind, kultiviert. Apoptotische Zellen wurden als Annexin V positive, propidiumiodidnegative Zellen mittels FACS Analyse bestimmt/nachgewiesen. Unbehandelte Proben enthielten um die 60% apoptotische Zellen. Die Behandlung mit IL-6R neutralisierendem Antikörper oder sgp130-Fc führte zu einem Anstieg von apoptotischen Zellen um 15% bzw. 13%. Die Wirksamkeit von sgp130-Fc deutet auf eine wichtige Rolle von sIL-6R bezüglich der Resistenz von LPMC gegenüber Apoptose. Es ist nicht wahrscheinlich, dass membranexprimiertes IL-6R zur antiapoptotischen Wirkung bei trägt, da Antikörper und sgp130-Fc Behandlung zu einem ähnlichen Anstieg bezüglich der Zahl von apoptotischen Zellen führte.
BEISPIEL 2
Materialien, Antikörper und Zelllinien
Der gp130 neutralisierende Antikörper GPX7 wurde uns freundlicherweise von Dr. Yasukawa überlassen (Tosoh, Tokyo, Japan). BAF/3 Zellen, die stabil mit humanem gp130 und IL-6R cDNAs transfiziert waren, sind zuvor beschrieben worden (Fischer u. a., 1997). Eine Rolle Für die immunglobulinartige Domäne des humanen IL-6 Rezeptors: der intrazelluläre Proteintransport und Freisetzung. Eur J Biochem 263:438). Die Herstellung und Charakterisierung der Zelllinie HepG2-IL-6 ist beschrieben worden (Mackiewicz u. a., 1992).
Expression und Reinigung von rekombinantem vIL-6
vIL-6 DNA wurde mit PCR amplifiziert und in das Säugetierexpressionsplasmid pDC409 (Jostock u. a., 1999) als DNA eingeführt, die für ein mit Hexahistidin markiertes Protein mittels SalI und NotI Restriktionsstellen 3'-kodiert. COS-7 Zellen wurden mit DEAE Dextran transfiziert, die Überstände wurden nach 5 Tagen gesammelt und bei Ni-NTA Agarose gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt (Quiagen, Hilden, Deutschland). Das Säulenmaterial wurde mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5/500 mM NaCl/20 mM Imidazol äquilibriert, nach dem Beladen des Kulturüberstands wurde die Säule mit Äqulibrierungspuffer gewaschen und mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5/500 mM NaCl/100 mM Imidazol eluiert. Die eluierten Proteine wurden gepoolt und gegen PBS bei 4°C dialysiert.
Präzipitation von vIL-6 mit Fc Fusionsproteinen,
COS-7 Zellen wurden mit dem vIL-6 Expressionsplasmid transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch für 8 h mit 50 μCi/&ml [³⁵S]-Cystein/Methionin in Cystein/Methionin-freiem Medium (Gibco, Eggenstein, Deutschland) markiert. Die Überstände wurden 2 h lang bei 4°C mit einem Kaninchen-Antiserum, das gegen ein bakteriell exprimiertes vIL-6 Protein exprimiert wurde, inkubiert. Alternativ wurden die überstände mit 2 pg/ml humanem IL-6-Fc (Jostock u. a., 1999), humanem sgp130-Fc oder einem humanen IL-6R-Fc inkubiert. Das humane IL-6R-Fc wurde unter Fusion der cDNA, die für den extrazellulären Teil des humanen IL-6R kodiert, an eine cDNA, die für den humanen Fc-Teil von IgG1 kodiert, konstruiert (Jostock u. a., 1999), und zwar unter Verwendung der Restriktionsstellen SspI bzw. EcoRV. Der extrazelluläre Teil von gp130 wurde an den Fc-Teil von humanem IgG1 (Jostock u. a., 1999) als XhoI-EcoRI Fragment fusioniert. Alle Fc-Proteine wurden transient in COS-7 Zellen exprimiert und an Protein A-Sepharose gereinigt (Jostock u. a., 1999). Die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose präzipitiert, mittels SDS-PAGE getrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht.
BAF/3 Zellproliferationsassays
Die Proliferation von transfizierten BAF/3 Zellen wurde in 96-er Mikrotitrationsplatten gemessen. Die Zellen wurden für 68 h Zytokinen ausgesetzt und anschließend mit [³H]-Thymidin 4 h lang pulsmarkiert. Die Proliferationsraten wurden durch Ernten der Zellen auf Glasfiltern und Bestimmen der eingeführten Radioaktivität durch Szintillationszählung gemessen. Für jedes Zytokin wurde der Proliferationsassay mindestens dreimal dreifach durchgeführt.
Analyse von phosphorylierten STAT3 in Hepatomzellen
HepG2-IL-6 Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen. 4 h vor der Stimulierung mit Zytokinen wurden die Zellen serummäßig ausgehungert. Nach 15 min Stimulation wurden die Zellen in PBS gewaschen und in Laemmli-Puffer lysiert. Die Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE Elektrophorese getrennt und durch Western Blotting unter Verwendung von phospho-STAT3 (Y705) mAB Biolabs, Frankfurt, Deutschland) analysiert.
Isolierung und Kultur von humanen vaskulären Zellen der glatten Muskulatur.
Zellen der glatten Muskulatur (SMC) wurden von Stücken der menschlichen Aorten, die während einer Aneurysmaoperation gesammelt wurden (5 männliche Spender, mittleres Alter 72 Jahre), durch die Großzügigkeit von Dr. W. Schmiedt erhalten (Abteilung für Herz- und Thoraxoperation, Universität Mainz, Deutschland). Isolierte Medienfragmente wurden präpariert (Ross, 1971) und die Zellen von glatten Muskeln wurden aus den Medienfragmenten wachsen gelassen, die im Medium mit 1 ng/ml humanem rekombinantem basischem Fibroblastwachstumsfaktor, 25 mg/L Gentamycin und 1,25 mg/L Amphotericin B bei 37°C in 5% CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre wachsen gelassen wurden. Die Reinheit von SMCs wurde durch Färben mit einem α–Aktin mAB (Klon 1A4, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bewertet. Das Medium wurde alle 3 Tage geändert. 24 h vor den Experimenten wurden SMC in DMEM ohne jegliche Zusätze wachsen gelassen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Trypan-Blau-Ausschluss untersucht.
RT-PCR von Chemokin und Cytokin mRNA und indirekte Immunfluoreszenz.
Die zelluläre Gesamt-RNA wurde von konfluenten SMC Kulturen isoliert und die Umkehrtranskription von 1 pg Gesamt-RNA wurde gefolgt von einer PCR durchgeführt, die wie folgt ausgeführt wurde: anfängliche Denaturierung für 5 min bei 95°C, dann Denaturierung für 40 sec bei 95°C, Wiederverbindung für 1 mm bei 62°C und Erweiterung für 3 mm bei 72°C. PCR Primer für MCP-1, IL-6, gp130 und GAPDH waren wie beschrieben (Klouche u. a., 1999). PCR Primer für das LIF-R sind in der Referenz beschrieben worden (Shimon u. a., 1997). Die PCR Produkte wurden auf 1% Agarosegelen in 1 × TBE laufen gelassen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Für die immunocytochemische Analyse wurden die Zellen mit 18,5% Formaldehyd/12,5% Glutaraldehyd 2 h lang bei Raumtemperatur fixiert und mit PE markiertem gp130 spezifischem mAB (Klon AM64, IgG1; Pharmingen, San Diego, USA) über Nacht bei 4°C gefolgt von Anbringung und Photographie inkubiert.
Ergebnisse
Um vIL-6 in Säugetierzellen zu exprimieren, wurde die cDNA in einen Expressionsvektor kloniert (Fischer u. a., 1997), der dem COOH Terminus des Proteins eine Hexahistidin-Markierung zufügte. Das Protein wurde bis nahe der Homogenität über Ni-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach SDS-PAGE Analyse des gereinigten Proteins ist eine Doppelbande von 24–26 kDA sichtbar, die höchstwahrscheinlich unterschiedliche glycosylierte Formen von vIL-6 widerspiegelt.
Das metabolisch ³⁵S-markierte vIL-6 Protein konnte aus dem Überstand von transfizierten Zellen mit einem Kaninchen Antiserum, das gegen ein bakteriell exprimiertes vIL-6 Protein erzeugt wurde, ausgefällt werden. Um auf physikalische Wechselwirkung mit Rezeptoruntereinheiten des IL-6 Rezeptorsystems zu testen, wurde das ³⁵S-vIL-6 Protein mit Fc Fusionsproteinen inkubiert, die IL-6, den extrazellulären Teil des IL-6R und den extrazellulären Teil von gp130 enthielten. Pro teinkomplexe wurden mit Protein A Sepharose ausgefällt. Weder IL-6-Fc noch IL-6R-Fc traten mit vIL-6 in Wechselwirkung. Im Gegensatz dazu fällte sgp130-Fc das vIL-6 Protein mit aus, was die Bindung von vIL-6 an den extrazellulären Teil von gp130 zeigt. Die Spezifität der Wechselwirkung der Fc Proteine mit ihren verwandten Liganden wird wie folgt gezeigt. Humanes metabolisch ³⁵S-markiertes IL-6 wird mit IL-6R-Fc als breite Bande ausgefällt, die unterschiedliche Glykosylierungszustände von rekombinant exprimiertem humanem IL-6 reflektiert (Schiel u. a., 1990). Kein IL-6 wurde mit IL-6-Fc und sgp130-Fc ausgefällt. Im Gegensatz dazu wird ein Fusionsprotein von sIL-6R und IL-6 (Hyper-IL-6), das wie sich gezeigt hat, direkt gp130 stimuliert (Fischer u. a., 1997), mit sgp130-Fc aber nicht mit IL-6-Fc oder IL-6R-Fc ausgefällt.
Als nächstes fragten wir, ob vIL-6 an gp130 an derselben Stelle wie der IL-6/sIL-6R Komplex gebunden hatte. Die Ausfällung von metabolisch markiertem vIL-6 durch sgp130-Fc wurde in Gegenwart oder bei Fehlen von humanem IL-6 und Hyper-IL-6 durchgeführt. Die Bindung von vIL-6 an sgp130-Fc wurde nicht durch einen Überschuss an humanem IL-6 beeinflusst. Die Ausfällung von vIL-6 durch sgp130-Fc war allerdings vollständing in Gegenwart von Hyper-IL-6 blockiert. Dieses Experiment zeigte klar, dass vIL-6 und Hyper-IL-6 um dieselbe Bindungsstelle auf humanem gp130 kämpften.
Nachdem eine direkte Wechselwirkung von vIL-6 mit gp130 gezeigt wurde, fragten wir als nächstes, ob das IL-6R für die biologische Aktivität von vIL-6 benötigt wurde. Wir verwendeten die IL-3 unabhängigen Prä-B-Zellen BAF/3, die gp130 nicht exprimieren und daher nicht auf IL-6 oder IL-6/siL-6R reagieren. BAF/3 Zellen, die stabil mit humanem gp130 cDNA oder humaner gp130 und IL-6R cDNAs transfiziert waren, wachsen allerdings bei Fehlen von IL-3 in Reaktion auf IL-6/sIL-6R oder IL-6 (Vollmer u. a., 1999). BAF/3 Zellen, die mit gp130 cDNA trans fiziert waren (BAF-130 Zellen), wachsen in Reaktion auf steigende Mengen an Hyper-IL-6. Wenn dieselben Zellen mit IL-6 stimuliert wurden, wurde kein Wachstum der Zellen beobachtet. Zellen, die mit vIL-6 stimuliert waren, zeigten allerdings eine dosisabhängige Proliferation. In Übereinstimmung mit der niedrigeren Wirksamkeit der Bindung an gp130, zeigte sich, dass vIL-6 eine 20–50-fache niedrigere spezifische biologische Aktivität als Hyper-IL-6 hatte. Auf BAF/3 Zellen, die mit gp130 und IL-6R cDNAs transfiziert waren (BAF-130/IL-6R Zellen), wurde die Proliferation in Reaktion auf IL-6, Hyper-IL-6 und vIL-6 beobachtet. Die spezifische biologische Aktivität von IL-6 war 100-fach höher als die von vIL-6. BAF-130/IL-6R Zellen sind gegenüber IL-6 empfänglicher als gegenüber Hyper-IL-6, da sie mehr IL-6R als gp130 exprimieren (Vollmer u. a., 1999).
Als nächstes haben wir untersucht, ob sgp130-Fc die biologische Aktivität von vIL-6 hemmte. Wir haben festgestellt, dass die Zugabe von sgp130-Fc zu BAF-130 Zellen, die mit Hyper-IL-6 oder vIL-6 stimuliert waren, zu einer dosisabhängigen Hemmung der zytokininduzierten Proliferation führte. Im Gegensatz dazu hemmte in BAF-130/IL-6R Zellen, die mit humanem IL-6 stimuliert waren, sgp130-Fc nicht die IL-6 induzierte Proliferation. Das Fehlen der Hemmung von humanem IL-6 kann anzeigen, dass es keinen freien Zugang des sgp130-Fc Fusionsproteins zum membranassoziierten IL-6/IL-6R Komplex gibt. Daher hemmt das sgp130-Fc Fusionsprotein spezifisch vIL-6 aber nicht humanes IL-6, das über das membrangebundene IL-6R wirkt.
Die Zytokinstimulation von gp130 führt zur gp130 Dimerisierung, anschließenden Phosphorylierung von gp130, Aktivierung von JAK Kinasen und Tyrosinphosphorylierung von STAT3. Phosphoryliertes STAT3 dimerisiert und transloziert in den Nukleus, wo es. spezifische DNA Sequenzen bindet und als Transkriptionsfaktor wirkt (Tags u. a., 1997). Wir haben daher gefragt, ob die zelluläre Stimulation durch vIL-6 auch durch gp130 Aktivierung vermittelt wurde. Die Zugabe von neutralisierendem mAB, das gegen gp130 gerichtet war, blockierte vollständig die Proliferation von BAF-130 Zellen, die durch Hyper-IL-6 und durch vIL-6 induziert waren. Dasselbe gp130 neutralisierende mAB beeinflusste nicht die Proliferation von nicht transfizierten BAF/3 Zellen, die durch IL-3 induziert waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Hyper-IL-6 als auch vIL-6 über die gp130 Aktivierung wirkten.
Um zu zeigen, dass die Stimulierung von Zellen mit vIL-6 zur intrazellulären Phosphorylierung und Aktivierung von STAT3 führte, verwendeten wir HepG2-IL-6 Zellen. HepG2 Zellen verloren bei stabiler Transfektion einer humanen IL-6 cDNA die Oberflächenexpression von IL-6R und wurden daher vollständig unempfänglich gegenüber IL-6. HepG2-IL-6 Zellen konnten allerdings durch den Komplex von IL-6/sIL-6R stimuliert werden (Mackiewicz u. a., 1992). Bei nicht stimulierten und mit IL-6 stimulierten HepG2-IL-6 Zellen war keine Phosphorylierung von STAT3 feststellbar. Im Gegensatz dazu führte die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Hyper-IL-6 oder vIL-6 zur Phosphrylierung von STAT3. Diese Phosphorylierung von STAT3 konnte vollständig durch eine Neutralisierung von mAB, das gegen gp130 gerichtet war, blockiert werden. Diese Experimente zeigen, dass die Aktivierung durch vIL-6 nicht durch das zellgebundene IL-6R vermittelt wurde. Weiterhin legen unsere Ergebnisse nahe, dass vIL-6 und Hyper-IL-6 denselben zellulären Aktivierungsmechanismus über gp130 verwenden.
Das Kaposi-Sarkom ist gekennzeichnet durch eine neue Gefäßbildung und Proliferation von Spindelzellen, „KS-Zellen”, die mit Endothelzellen, Fibroblasten und entzündlichen Zellen verbunden sind. Historisch gesehen wurden proliferierende Spindelzellen als von Endothelzellen stammend angesehen, in letzter Zeit sind aber beide Arten von Mesenchymalzellen, Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur, als potentielle Progenitoren vorgeschlagen worden. Die immunhistochemi sche Färbung und Northern Blot Analyse zeigten eine Koexpression von Antigenen, die für Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur spezifisch waren (Kaaya u. a., 1995). In früheren Untersuchungen wurde beobachtet, dass Zellen der glatten Muskulator nur mit IL-6 in Gegenwart von sIL-6R stimuliert werden konnten (Klouche u. a., 1999).
Wir haben daher die Stimulation von humanen primären Zellen der glatten Muskulatur durch vIL-6 untersucht. In humanen Zellen der glatten Muskulatur wird die mRNA Expression von IL-6, dem Monozyten anziehenden Chemokin MCP-1 und von gp130 zeitabhängig bei Stimulation durch vIL-6 hochreguliert. Sowohl die Induktion von MCP-1 als auch die viral kodierten Chemokine können an der charakteristischen Anziehung und dem Vorhandensein von entzündlichen Zellen in KS beteiligt sein.
Neben gp130 teilen sich Zytokine der IL-6 Familie, wie beispielsweise LIF, CNTF, OSM und CT-1, die Rezeptoruntereinheit LIF-R (Tags u. a., 1997). Wir haben deshalb gefragt, ob die Expression von LIF-R mRNA auch durch vIL-6 und Hyper-IL-6 moduliert wurde. Die Behandlung von Zellen der glatten Muskulatur mit Hyper-IL-6 und vIL-6 führte zu einer Hochregulation der LIF-R mRNA, wie durch das Auftreten einer 359 bp DNA-Bande bei RT-PCR gemessen, was zeigt, dass die Stimulation von Zellen der glatten Muskulator durch vIL-6 zu einer erhöhten Expression des Korezeptors für die IL-6 Familienmitglieder LIF, CNTF, OSM und CT-1 führte.
Außerdem haben wir festgestellt, dass die gp130 Zelloberflächenexpression nach der Behandlung der Zellen mit vIL-6 und die vIL-6 induzierte Proliferation der Zellen stark erhöht ist. Bemerkenswerterweise ging die Expression von gp130 der von IL-6 voran, was die Induktion einer Autokrinstimulationsschleife durch vIL-6 zeigt. Die Behandlung mit humanem IL-6 bei Fehlen von sIL-6R hatte keine Wirkung auf MCP-1, IL-6 und die gp130 Expression und auf die Proliferation (Klouche u. a., 1999). Wir haben aus diesen Daten geschlossen, dass vIL-6, wie der IL-6/sIL-6R Komplex, einen proentzündlichen Zustand in humanem Zellen der glatten Muskulatur hervorruft.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Fusionsmolekül, dass zwei lösliche gp130 Moleküle umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei zwei lösliche gp130 Moleküle mit einer flexiblen Schleife zu einem Tandem fusioniert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest eines der zwei löslichen gp130 Moleküle eine vollständige, extrazelluläre Domäne von gp130 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 3, wobei die zwei löslichen gp130 Moleküle durch eine einfache kovalente Bindung miteinander verbunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die zwei löslichen gp130 Moleküle durch einen flexiblen Peptidlinker miteinander verbunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die zwei löslichen gp130 Moleküle an die Fc Domäne der IgG Proteine fusioniert sind, so dass sie als Disulfid-verbundener Homodimer exprimiert werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein DNA Molekül, dass ein Molekül, wie in Anspruch 1 definiert, kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Expressionsvektor, der ein DNA Molekül, wie in Anspruch 1 definiert, enthält.
Verwendung einer Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhinderung von multiplem Myelom, Autoimmunkrankheiten, Osteoporose, Kachexia oder bakteriellen und viralen Infektionen.