CN108318689A

CN108318689A - 一种多发性骨髓瘤的诊断方法

Info

Publication number: CN108318689A
Application number: CN201810311864.3A
Authority: CN
Inventors: 赵永娟; 李汉璋; 黎婷
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明涉及一种多发性骨髓瘤的诊断方法。本发明首次发现在统计学上，血浆可溶性CD38浓度与多发性骨髓瘤病程正相关，因此基于DepID的设计，也就是基于结合在蛋白上两个表位的单域抗体和萤光素酶的检测方法，将血浆可溶性CD38浓度用于多发性骨髓瘤诊断和治疗的伴随诊断的指标。

Description

一种多发性骨髓瘤的诊断方法

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种多发性骨髓瘤的诊断方法。

背景技术

CD38是一个单次跨膜的糖蛋白，常被用作细胞分化的标记分子。1996年，首次发现可溶性CD38(soluble CD38，sCD38)，它被认为是全长CD38分子的膜外结构域被切割释放的产物。它们存在于多种生理及病理体液和肿瘤细胞培养上清中，保留了CD38的抗原特性和催化活性¹。随后的研究发现，可溶性CD38能够作为一种信号分子，具有诱导细胞增殖和迁移²、延长记忆抗体寿命³和调节母胎耐受等⁴等功能。

CD38在多种血液癌细胞，例如多发性骨髓瘤细胞表面呈现异常高表达⁵，而在正常淋巴细胞、骨髓细胞以及一些非造血细胞上处于低表达状态。因此，CD38被认为是一个治疗多发性骨髓瘤的靶标，多个针对其的治疗性单克隆抗体正在研发过程中⁶。细胞表面CD38的表达量是多发性骨髓瘤的一个诊断指标，但是病人骨髓瘤细胞的获取需要做骨髓穿刺，具有入侵性，而且骨髓的局部抽取并不能反映病人整体骨髓瘤的负荷，所以血液诊断具有优越性。

由于病人血浆是一个复杂体系，可溶性CD38含量很低，需要高灵敏方法才能进行精确检测。目前市场上检测灵敏度最高的一款CD38检测ELISA试剂盒，采用传统抗体进行固相夹心酶联免疫吸附，其检测灵敏度标称93.75pg/mL。缺点：1)检测灵敏度仍然有限；2)检测特异性不强，不适合检测复杂样本；3)成本高，一个试剂盒5000元仅能做96个样品/测试。

参考文献

1Funaro,A.et al.Identification and characterization of an activesoluble form of human CD38in normal and pathological fluids.Internationalimmunology 8,1643-1650(1996).

2Deaglio,S.et al.CD38/CD31interactions activate genetic pathwaysleading to proliferation and migration in chronic lymphocytic leukemiacells.Molecular medicine 16,87-91,doi:10.2119/molmed.2009.00146(2010).

3Liu,X.Q.,Hart,D.N.,MacPherson,G.G.,Good,M.F.&Wykes,M.N.SolubleCD38significantly prolongs the lifespan of memory B-cell responses.Immunology125,14-20,doi:10.1111/j.1365-2567.2008.02914.x(2008).

4Kim,B.J.et al.Seminal CD38is a pivotal regulator for fetomaternaltolerance.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 112,1559-1564,doi:10.1073/pnas.1413493112(2015).

5Lin,P.,Owens,R.,Tricot,G.&Wilson,C.S.Flow cytometricimmunophenotypic analysis of 306cases of multiple myeloma.American journal ofclinical pathology 121,482-488,doi:10.1309/74R4-TB90-BUWH-27JX(2004).

6van de Donk,N.,Richardson,P.G.&Malavasi,F.CD38antibodies in multiplemyeloma:back to the future.Blood 131,13-29,doi:10.1182/blood-2017-06-740944(2018).

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多发性骨髓瘤的诊断方法，填补多发性骨髓瘤缺少伴随诊断的空白。

为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了可溶性CD38的检测方法，即三明治夹心法，包括捕获抗体、检测抗体。

本发明第二方面，提供了一种捕获抗体、一种检测抗体，即CD38单域抗体和CD38单域抗体萤光素酶融合蛋白，包括CD38单域抗体部分和萤火虫萤光素酶部分。

本发明第三方面，提供了两种DNA分子，它编码本发明所述的捕获抗体和检测抗体，或本发明所述的CD38单域抗体萤光素酶融合蛋白。

本发明第四方面，提供了两种表达载体，它包含CD38单域抗体基因序列和萤火虫萤光素酶突变体的基因序列。

本发明第五方面，提供了两种宿主细胞，它含有前文所述的表达载体。

本发明所述CD38单域抗体1053的编码基因的CDS序列，其cDNA序列全长为546bp(序列1)，具体序列如下：

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGGCTCAGGACGCACCTTCAGGAACTATCCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGGTATTACCTGGGTCGGTGCTAGCACACTCTATGCAGACTTCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATAGTTGTGCAGCAGGTCGCGGTATAGTGGCTGGTAGGATCCCAGCTGAGTATGCCGACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCATCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG

编码产生长度为181个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列2)，具体序列如下：

本发明所述CD38单域抗体551的编码基因的CDS序列，其cDNA序列全长为558bp(序列3)，具体序列如下：

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGACACTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGGCTCCGGTAGCAGATTCGATAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCCGCTATTAGCTGGAGTAGTGGCACTACGCGCTATTTAGACACCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAGTACGGTATATCTTCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCTCGATATCAGCCGAGGTACTACGACTCAGGGGATATGGATGGATATGAGTATGACAACTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCATCACCATCACGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAG

编码产生长度为185个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列4)，具体序列如下：

本发明所述检测抗体的编码基因的CDS序列，其cDNA序列全长为2085bp(序列5)，具体序列如下：

TCCGGTACCATGGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGGCTCAGGACGCACCTTCAGGAACTATCCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGGTATTACCTGGGTCGGTGCTAGCACACTCTATGCAGACTTCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATAGTTGTGCAGCAGGTCGCGGTATAGTGGCTGGTAGGATCCCAGCTGAGTATGCCGACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGAGCTCCCGGGGGCGGCCGCCTGCAGAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTGA

编码产生长度为694个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)的蛋白质序列(序列6)，具体序列如下：

实施本发明，具有以下有益效果：本发明首次发现在统计学上，血浆可溶性CD38浓度与多发性骨髓瘤病程正相关，因此基于DepID的设计，也就是基于结合在蛋白上两个表位的单域抗体和萤光素酶的检测方法，将血浆可溶性CD38浓度用于多发性骨髓瘤诊断和治疗的伴随诊断的指标。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，对实施例描述中所使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1是CD38单域抗体1053、551和重组蛋白1053-Fluc2的SDS-PAGE分析图；

图2是单域抗体1053、551、375、NbGFP与标记单域抗体551-AF488结合CD38的竞争图；

图3是单域抗体1053、551、375、NbGFP与标记单域抗体1053-AF488结合CD38的竞争图；

图4是DepID法的检测原理图；

图5是DepID法检测CD38的标准曲线；

图6是DepID法检测特异性图；

图7是DepID检测的志愿者与多发性骨髓瘤病人血浆中可溶性CD38水平比较；

图8是不同病程阶段多发性骨髓瘤病人血浆中可溶性CD38水平比较。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。

由于可溶性CD38来源于细胞表面的CD38，血浆中可溶性CD38的浓度可以反映多发性骨髓瘤细胞的增殖和肿瘤微环境中脱落酶(Sheddase)活性状态，可用作诊断和监测多发性骨髓瘤疾病发展的标志物。

本发明描述了一种基于两个结合于CD38不同表位的单域抗体开发的特异的、超高灵敏的可溶性CD38检测方法——双表位蛋白识别法(Dual epitopes proteinIDentification，DepID)，并显示了可溶性CD38和多发性骨髓瘤病程的相关性。

本发明将筛选得到的一系列CD38单域抗体，经过流式细胞术的方法，筛选出能够同时结合CD38的单域抗体对，即单域抗体1053和551，其中单域抗体551作为捕获抗体，单域抗体1053和萤火虫萤光素酶突变体Fluc2的融合蛋白作为检测抗体。将单域抗体551包被在ELISA板底来捕获溶液中的CD38，检测抗体中的Fluc2催化萤光素的发光信号来评估CD38的浓度(如图4所示)，开发出一种特异性超高灵敏度的可溶性CD38检测方法DepID。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对DepID检测抗体表达载体的构建

(1)PCR扩增CD38单域抗体1053的基因序列，使用限制性内切酶KpnI和SacI(购自Thermo Scientific)酶切pRHSUL2载体和1053基因序列，并用T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)连接两个片段，构建pRHSUL2-1053。

(2)使用限制性内切酶SacI和PstI酶切pRHSUL2-1053载体，含有SacI和PstI粘性末端以及2×G₄S序列的两条DNA单链经退火，使用T4DNA连接酶将2×G₄S插入pRHSUL2-1053，构建pRHSUL2-1053-G₄S。

(3)PCR扩增萤火虫萤光素酶突变体Fluc2的基因序列，使用限制性内切酶PstI和HindⅢ酶切pRHSUL2-1053-G₄S和Fluc2基因序列，用T4DNA连接酶连接两个片段，构建pRHSUL2-1053-G₄S-Fluc2，即DepID检测抗体的表达载体。

实施例2：CD38单域抗体和DepID检测抗体1053-Fluc2的表达和纯化

(1)将CD38单域抗体表达载体pHEN2-1053、pHEN2-551及测序鉴定正确的重组质粒pRHSUL2-1053-G₄S-Fluc2转化到表达宿主菌Rosetta2(DE3)中，37℃扩大培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加1mM IPTG 18℃诱导表达，收集菌体超声破碎，高速离心收集上清，用于进一步纯化。

(2)CD38单域抗体经Ni-NTA亲和层析和阴离子交换层析纯化，得到纯化的蛋白。

(3)DepID检测抗体经Ni-NTA纯化后，使用sumo proteinase切除包含有6×HisSumo-tag，再经一次Ni-NTA反相层析，收集流出液进行Q柱交换层析，即得重组蛋白1053-Fluc2。单域抗体1053、551和重组蛋白1053-Fluc2的SDS-PAGE结果如图1。

实施例3：CD38单域抗体标记

(1)CD38单域抗体超滤，将溶液置换为不含Tris的缓冲液例如PBS；

(2)可与氨基反应的荧光染料Alexa Fluor^TM 488琥珀酰亚酯(ThermoScientific)用DMSO溶解；

(3)在CD38单域抗体中加入约5倍摩尔数的上述荧光染料，4℃避光旋转混合过夜；

(4)超滤，将CD38单域抗体溶液中未标记上的荧光染料去除。

实施例4：CD38单域抗体对的选择

(1)多发性骨髓瘤细胞系LP-1计数，将细胞密度调至5×10⁵/mL，预冷的PBS(含1mg/mL BSA)洗两遍；

(2)加0.5μg/mL标记的单域抗体和梯度浓度的单域抗体，4℃避光孵育30min；

(3)预冷的PBS(含1mg/mL BSA)洗两遍，100μL PBS(含1mg/mL BSA)重悬；

(4)流式细胞术检测，检测结果如图2和图3所示，单域抗体1053和551能够相互不影响同时结合于CD38的不同表位。

实施例5：DepID方法步骤

(1)单域抗体551用PBS稀释至10μg/mL，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜；

(2)PBS洗板三次；

(3)1％BSA稀释于0.1％PBST(PBS，0.1％Tween 20)，每孔100μL，室温封闭1h；

(4)0.1％PBST洗涤三次；

(5)取CD38标准品或样品20μL与0.5μg/mL 1053-Fluc2、1mg/mL BSA稀释于0.1％PBST至100μL，加到ELISA板，室温孵育1h；

(6)0.1％PBST洗涤三次；

(7)加萤光素底物动态检测，取初始15s平均值计算，检测CD38的标准曲线如图5，其灵敏度可达10pg/mL。

实施例6：DepID特异性检测

(1)取出CD38单域抗体珠子，PBS洗两遍；

(2)CD38标准品或血浆样品，每个样品平均分成两份，其中一份加入CD38单域抗体珠子4℃共孵育3h后，离心取出上清；

(3)CD38单域抗体珠子处理后的样品和未处理的样品，按照实施例5进行检测，特异性结果见图6，单域抗体珠子去除样本中的CD38后，检测信号降低至背景水平。

(4)多发性骨髓瘤国际分期系统是依赖于血清β2微球蛋白的，疾病Ⅰ期血清β2微球蛋白<3.5mg/L，疾病Ⅲ期血清β2微球蛋白≥5.5mg/L，疾病Ⅱ期介于二者之间。同时检测健康志愿者与多发性骨髓瘤病人血浆样本，结果如图7所示，病人血浆可溶性CD38明显高于正常水平；并且随着病程的进展，病人血浆可溶性CD38水平也随之升高，如图8所示。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

序列表

<110> 北京大学深圳研究生院

<120> 一种多发性骨髓瘤的诊断方法

<130>

<160> 6

<210> 1

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCGGC CCAGCCGGCC 60

ATGGCCGATG TGCAGCTGCA GGAGTCTGGA GGAGGCTTGG TGCAGGCTGG GGGCTCTCTG 120

AGACTCTCCT GTACAGGCTC AGGACGCACC TTCAGGAACT ATCCCATGGC CTGGTTCCGC 180

CAGGCTCCAG GAAAGGAGCG TGAGTTTGTA GCAGGTATTA CCTGGGTCGG TGCTAGCACA 240

CTCTATGCAG ACTTCGCGAA GGGCCGATTC ACCATCTCCA GAGACAACGC CAAGAACACG 300

GTGTATCTGC AAATGAACAG CCTGAAACCT GAGGACACGG CCGTTTATAG TTGTGCAGCA 360

GGTCGCGGTA TAGTGGCTGG TAGGATCCCA GCTGAGTATG CCGACTGGGG CCAGGGCACC 420

CAGGTCACCG TCTCCTCAGA ACCCAAGACA CCAAAACCAC AACCAGCGGC CGCACATCAT 480

CATCACCATC ACGGGGCCGC AGAACAAAAA CTCATCTCAG AAGAGGATCT GAATGGGGCC 540

GCATAG 546

<210> 2

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala 10

Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala 20

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 30

Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu 40

Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Arg Thr 50

Phe Arg Asn Tyr Pro Met Ala Trp Phe Arg 60

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 70

Ala Gly Ile Thr Trp Val Gly Ala Ser Thr 80

Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg Phe 90

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 100

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala 120

Gly Arg Gly Ile Val Ala Gly Arg Ile Pro 130

Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr 140

Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr 150

Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala His His 160

His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys 170

Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 180

Ala 181

<210> 3

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCGGC CCAGCCGGCC 60

ATGGCCGATG TGCAGCTGCA GGAGTCAGGA GGAGGATTGG TGCAGGCTGG ACACTCTCTG 120

AGACTCTCCT GTGTAGGCTC CGGTAGCAGA TTCGATAACT ATGCCATGGG CTGGTTCCGC 180

CAGGCTCCAG GGAAGGAGCG TGAATTTGTA GCCGCTATTA GCTGGAGTAG TGGCACTACG 240

CGCTATTTAG ACACCGTGAA GGGCCGATTC ACCATCTCCA GAGACAACGC CAAGAGTACG 300

GTATATCTTC AAATGAACAG CCTGAAACCT GAGGACACGG CCGTTTATTA CTGTGCAGCT 360

CGATATCAGC CGAGGTACTA CGACTCAGGG GATATGGATG GATATGAGTA TGACAACTGG 420

GGTCAGGGGA CCCAGGTCAC CGTCTCCTCA GAACCCAAGA CACCAAAACC ACAACCAGCG 480

GCCGCACATC ATCATCACCA TCACGGGGCC GCAGAACAAA AACTCATCTC AGAAGAGGAT 540

CTGAATGGGG CCGCATAG 558

<210> 4

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala 10

Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala 20

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 30

Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly His Ser Leu 40

Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Ser Arg 50

Phe Asp Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg 60

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 70

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Ser Gly Thr Thr 80

Arg Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe 90

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr 100

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 120

Arg Tyr Gln Pro Arg Tyr Tyr Asp Ser Gly 130

Asp Met Asp Gly Tyr Glu Tyr Asp Asn Trp 140

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 150

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala 160

Ala Ala His His His His His His Gly Ala 170

Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 180

Leu Asn Gly Ala Ala 185

<210> 5

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

TCCGGTACCA TGGATGTGCA GCTGCAGGAG TCTGGAGGAG GCTTGGTGCA GGCTGGGGGC 60

TCTCTGAGAC TCTCCTGTAC AGGCTCAGGA CGCACCTTCA GGAACTATCC CATGGCCTGG 120

TTCCGCCAGG CTCCAGGAAA GGAGCGTGAG TTTGTAGCAG GTATTACCTG GGTCGGTGCT 180

AGCACACTCT ATGCAGACTT CGCGAAGGGC CGATTCACCA TCTCCAGAGA CAACGCCAAG 240

AACACGGTGT ATCTGCAAAT GAACAGCCTG AAACCTGAGG ACACGGCCGT TTATAGTTGT 300

GCAGCAGGTC GCGGTATAGT GGCTGGTAGG ATCCCAGCTG AGTATGCCGA CTGGGGCCAG 360

GGCACCCAGG TCACCGTCTC CTCAGAACCC AAGACACCAA AACCACAACC AGCGGAGCTC 420

CCGGGGGCGG CCGCCTGCAG AATGGAAGAC GCCAAAAACA TAAAGAAAGG CCCGGCGCCA 480

TTCTATCCGC TGGAAGATGG AACCGCTGGA GAGCAACTGC ATAAGGCTAT GAAGAGATAC 540

GCCCTGGTTC CTGGAACAAT TGCTTTTACA GATGCACATA TCGAGGTGGA CATCACTTAC 600

GCTGAGTACT TCGAAATGTC CGTTCGGTTG GCAGAAGCTA TGAAACGATA TGGGCTGAAT 660

ACAAATCACA GAATCGTCGT ATGCAGTGAA AACTCTCTTC AATTCTTTAT GCCGGTGTTG 720

GGCGCGTTAT TTATCGGAGT TGCAGTTGCG CCCGCGAACG ACATTTATAA TGAACGTGAA 780

TTGCTCAACA GTATGGGCAT TTCGCAGCCT ACCGTGGTGT TCGTTTCCAA AAAGGGGTTG 840

CAAAAAATTT TGAACGTGCA AAAAAAGCTC CCAATCATCC AAAAAATTAT TATCATGGAT 900

TCTAAAACGG ATTACCAGGG ATTTCAGTCG ATGTACACGT TCGTCACATC TCATCTACCT 960

CCCGGTTTTA ATGAATACGA TTTTGTGCCA GAGTCCTTCG ATAGGGACAA GACAATTGCA 1020

CTGATCATGA ACTCCTCTGG ATCTACTGGT CTGCCTAAAG GTGTCGCTCT GCCTCATAGA 1080

ACTGCCTGCG TGAGATTCTC GCATGCCAGA GATCCTATTT TTGGCAATCA AATCATTCCG 1140

GATACTGCGA TTTTAAGTGT TGTTCCATTC CATCACGGTT TTGGAATGTT TACTACACTC 1200

GGATATTTGA TATGTGGATT TCGAGTCGTC TTAATGTATA GATTTGAAGA AGAGCTGTTT 1260

CTGAGGAGCC TTCAGGATTA CAAGATTCAA AGTGCGCTGC TGGTGCCAAC CCTATTCTCC 1320

TTCTTCGCCA AAAGCACTCT GATTGACAAA TACGATTTAT CTAATTTACA CGAAATTGCT 1380

TCTGGTGGCG CTCCCCTCTC TAAGGAAGTC GGGGAAGCGG TTGCCAAGAG GTTCCATCTG 1440

CCAGGTATCA GGCAAGGATA TGGGCTCACT GAGACTACAT CAGCTATTCT GATTACACCC 1500

GAGGGGGATG ATAAACCGGG CGCGGTCGGT AAAGTTGTTC CATTTTTTGA AGCGAAGGTT 1560

GTGGATCTGG ATACCGGGAA AACGCTGGGC GTTAATCAAA GAGGCGAACT GTGTGTGAGA 1620

GGTCCTATGA TTATGTCCGG TTATGTAAAC AATCCGGAAG CGACCAACGC CTTGATTGAC 1680

AAGGATGGAT GGCTACATTC TGGAGACATA GCTTACTGGG ACGAAGACGA ACACTTCTTC 1740

ATCGTTGACC GCCTGAAGTC TCTGATTAAG TACAAAGGCT ATCAGGTGGC TCCCGCTGAA 1800

TTGGAATCCA TCTTGCTCCA ACACCCCAAC ATCTTCGACG CAGGTGTCGC AGGTCTTCCC 1860

GACGATGACG CCGGTGAACT TCCCGCCGCC GTTGTTGTTT TGGAGCACGG AAAGACGATG 1920

ACGGAAAAAG AGATCGTGGA TTACGTCGCC AGTCAAGTAA CAACCGCGAA AAAGTTGCGC 1980

GGAGGAGTTG TGTTTGTGGA CGAAGTACCG AAAGGTCTTA CCGGAAAACT CGACGCAAGA 2040

AAAATCAGAG AGATCCTCAT AAAGGCCAAG AAGGGCGGAA AGTGA 2085

<210> 6

<211> 694

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Gly Thr Met Asp Val Gln Leu Gln Glu 10

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 20

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly 30

Arg Thr Phe Arg Asn Tyr Pro Met Ala Trp 40

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 50

Phe Val Ala Gly Ile Thr Trp Val Gly Ala 60

Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly 70

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 90

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 100

Ala Ala Gly Arg Gly Ile Val Ala Gly Arg 110

Ile Pro Ala Glu Tyr Ala Asp Trp Gly Gln 120

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro 130

Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Glu Leu 140

Pro Gly Ala Ala Ala Cys Arg Met Glu Asp 150

Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro 160

Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly 170

Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr 180

Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr 190

Asp Ala His Ile Glu Val Asp Ile Thr Tyr 200

Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu 210

Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn 220

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Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu 240

Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala 250

Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu 260

Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro 270

Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu 280

Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu 290

Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp 300

Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser 310

Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro 320

Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro 330

Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala 340

Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly 350

Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg 360

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Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro 380

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Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe 420

Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln 430

Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser 440

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Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val 470

Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu 480

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Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly 510

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Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly 530

Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg 540

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Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp 560

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Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu 600

Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn 610

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Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala 630

Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met 640

Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala 650

Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg 660

Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro 670

Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg 680

Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys 690

Lys Gly Gly Lys 694

Claims

1.一种多发性骨髓瘤的诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、检测血浆中可溶性CD38浓度；

S2、将血浆可溶性CD38浓度，用作诊断和/或监测多发性骨髓瘤疾病发展的标志物。

2.根据权利要求1所述的多发性骨髓瘤的诊断方法，其特征在于，根据血浆可溶性CD38浓度与多发性骨髓瘤病程的关系，确定多发性骨髓瘤的病程。

3.根据权利要求2所述的多发性骨髓瘤的诊断方法，其特征在于，血浆可溶性CD38浓度与多发性骨髓瘤病程正相关。

4.根据权利要求1所述的多发性骨髓瘤的诊断方法，其特征在于，基于结合在CD38蛋白上两个表位的单域抗体和萤光素酶的检测方法，检测血浆中可溶性CD38浓度。

5.根据权利要求4所述的多发性骨髓瘤的诊断方法，其特征在于，使用单域抗体551作为捕获抗体，使用单域抗体1053和萤光素酶的融合蛋白作为检测抗体，检测血浆中可溶性CD38浓度。