CN101773668B - 一种抗病毒相关蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗病毒相关蛋白及其用途。本发明公开了TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂的用途，用于制备调节先天免疫反应信号转导通路的组合物。本发明还公开了以TRIM21蛋白作为靶点，筛选调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质的方法。本发明首次揭示了调节先天免疫反应信号转导通路的新的靶点，为抗病毒药物的开发提供了新的途径。

Description

一种抗病毒相关蛋白及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种抗病毒相关蛋白及其用途。

背景技术

病原体感染一直是威胁人类健康的重大疾患，世界卫生组织(WHO)在一份报告中指出了威胁人类的6大类感染性疾病分别是：急性呼吸疾病、腹泻痢疾、获得性免疫缺损综合症(艾滋病)、结核病、疟疾和麻疹。其中很大一部分是由于病毒感染引起的。近两年，艾滋病的大规模扩散，萨斯病毒(SARS-CoV)的世界性传播，新型流感病毒(Avian-Flu)的出现都向人们敲响了警钟：还缺乏有效的抗病毒药物。

人类对于病毒的研究可以上溯到千年以前，早在宋代，中国古人已经知道使用天花患者病愈后的“疥痂”进行鼻腔接种，预防健康儿童感染天花。但是直到几十年前科研人员才通过超过滤的方法证实病毒也是一种生命形式。经过50年的快速发展，关于病毒的研究已经形成了一门独立的学科——病毒学。免疫学也是一门既古老又年轻的学科，它以生物体的免疫系统为研究对象，试图阐明生物体针对外界病原体等刺激，产生防御型应答的具体机理。过去，病毒学与免疫学是作为两个相对独立的学科，分别进行各自的研究。随着医学的发展，免疫学已经变得越来越重要，发展出了很多分支，例如：免疫血液学、免疫药理学、免疫病理学、生殖免疫学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学。与之相对应，近年在先天免疫(Innate Immune)研究领域内产生了革命性的突破，将病毒与宿主的相互作用提升到细胞信号转导及相关重要调节功能的研究层面。病毒学与免疫学之间的交叉研究已经成为生物医学的一个重要热点与突破领域。

在长期的对抗过程中，病毒与宿主之间产生了协同进化：一方面，宿主细胞(特别是哺乳动物细胞)获得了先天免疫系统，这一系统是宿主对抗病毒感染的重要防线；另一方面，一些病毒则进化出了逃避宿主清除的方法。所谓先天免疫系统，是相对获得性免疫系统(Adapt Immune System)而言，它是细胞对抗感染的第一道防线。在细胞的外膜、胞浆内、内膜等部位分布着大量的受体(Pathogen Recognition Receptor；简称PRR)，例如Toll分子样受体(Toll-LikeReceptor；简称为TLR)，RIG-I，Mda-5等。与此对应，病毒的核酸以及蛋白分子上都有一些能够被受体识别的固有分子模式(Pathogen Associated MolecularPattern；简称PAMP)。细胞的PRR识别病毒的PAMP以后，感应到病毒的入侵，激活下游信号转导通路，诱导产生干扰素、白介素等细胞因子以及其它一些效应分子，建立抗病毒状态，最终清除病毒或者自我凋亡，从而达到对抗病毒的目的。从识别病原体感染把入侵信号向下游传递，到激活效应基因的转录产生清除病原体的效果，再到通过一系列的调控与反馈使细胞回复到正常状态，参与这一个过程的细胞组分都属于先天免疫系统。

根据病毒的结构、遗传物质以及生理特征的不同，大致可以将病毒划分为三类：DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。这些病毒有多种逃避宿主清除的方法，其中很重要的一种就是直接干扰宿主的先天免疫反应信号通路。通过模拟、拮抗、修饰、降解等多种策略对信号通路中的重要调控节点进行作用，阻断先天免疫反应的正常运行。例如，丙肝病毒(HCV)编码一种蛋白酶，可以降解先天免疫信号通路一个关键节点蛋白MAVS，造成病毒入侵信号不能向下游传递，也就不能激活干扰素-β(Interferon-β)的表达。这一现象从反面提示我们：可以通过人为干预先天免疫信号通路的方法，达到对抗病毒的目的。

因此，本领域需要基于干预先天免疫信号通路，研究对抗病毒的新途径，找到对于抗病毒感染有用的物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗病毒相关蛋白及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂的用途，用于制备调节先天免疫反应信号转导通路的组合物。

在另一优选例中，所述的先天免疫反应信号转导通路包括干扰素调节因子3(IRF3)介导的信号转导通路。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白或其促进剂用于制备促进先天免疫反应信号转导通路的激活的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于提高干扰素-β的表达；或用于抑制病毒感染。

在另一优选例中，所述的病毒是DNA病毒、RNA病毒或逆转录病毒。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白的抑制剂用于制备抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的组合物。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白包括：

(a)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；

(b)具有SEQ ID NO：2中第251-475位氨基酸序列的蛋白；

(c)将(a)或(b)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳的1-10个，更佳的1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)所限定的蛋白功能的衍生的蛋白；或

(d)(a)或(b)所限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白还用于与干扰素调节因子3(IRF3)相互作用，抑制干扰素调节因子3的泛素化。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白的促进剂是以重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含编码TRIM21蛋白的基因。较佳的，所述编码TRIM21蛋白的基因具有SEQ ID NO：1所示的序列。

在另一优选例中，所述的TRIM21蛋白的抑制剂是特异性沉默TRIM21mRNA的小干扰RNA。更佳的，所述的小干扰RNA具有SEQ ID NO：3所示的序列。

在本发明的第二方面，提供一种分离的TRIM21蛋白，所述的蛋白选自：

(i)具有SEQ ID NO：2中第251-475位氨基酸序列的蛋白；或

(ii)将(i)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳的1-10个，更佳的1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(i)所限定的蛋白功能的衍生的蛋白；

并且，所述的蛋白不包括具有SEQ ID NO：2全长氨基酸序列的蛋白。

在本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的蛋白。

在本发明的第四方面，提供一种质粒载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的第六方面，提供一种所述的蛋白片段的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的蛋白片段。

在本发明的第七方面，提供一种筛选调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达TRIM21蛋白的体系接触；

(2)检测候选物质对TRIM21蛋白的表达或活性的影响；

若所述候选物质提高TRIM21蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；

若所述候选物质抑制TRIM21蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达TRIM21蛋白的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中TRIM21蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达TRIM21蛋白的体系；

如果测试组中TRIM21蛋白的表达或活性在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；

如果测试组中TRIM21蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物质是抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述体系中还表达干扰素调节因子3蛋白，且所述的TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用(相互结合)；以及

步骤(2)包括：检测候选物质对TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用的影响；

若所述候选物质促进TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用(更佳地抑制干扰素调节因子3蛋白的泛素化)，则表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；

若所述候选物质抑制TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用(更佳地加速干扰素调节因子3蛋白的泛素化)，则表明该候选物质是抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达TRIM21蛋白和干扰素调节因子3蛋白的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达TRIM21蛋白和干扰素调节因子3蛋白的体系；

如果测试组中TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白的相互作用在统计学上强于(优选显著强于，如强20％以上，较佳的强50％以上；更佳的强80％以上)对照组，就表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；如果测试组中TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱20％以上，较佳的弱50％以上；更佳的弱80％以上)对照组，就表明该候选物质是抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制炎症性疾病有用的组合物。

在本发明的第八方面，提供一种用于调节先天免疫反应信号转导通路的复合体，所述的复合体含有TRIM21蛋白和干扰素调节因子3蛋白。

另一方面，本发明提供所述的复合体的用途，用于筛选调节先天免疫反应信号转导通路的物质。

另一方面，本发明提供一种特异性识别TRIM21蛋白的物质的用途，用于制备诊断自体免疫性疾病的试剂。

在另一优选例中，所述的特异性识别TRIM21蛋白的物质是特异性抗TRIM21蛋白的抗体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.人TRIM21蛋白质的cDNA编码序列(SEQ ID NO：1)。来源于人细胞总mRNA反转录后得到的目标序列测序结果。

图2.人TRIM21基因的SiRNA序列(SiRNA-TRIM21，SEQ ID NO：3)；以及对照序列(NC，SEQ ID NO：4)。

图3.人TRIM21基因编码的蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。为所获得的cDNA序列按照真核细胞使用的密码子进行翻译的序列。

图4.人TRIM21的多克隆抗体纯化SDS-PAGE。

其中，M：分子量标准；S：多克隆抗血清样品；F：过protein-AG柱后的穿出液样品；E1，E2：为两管洗脱样品；H：多克隆抗体的重链；L：多克隆抗体的轻链。

图5.人TRIM21在293T细胞内的定位。

使用多克隆抗体对细胞进行免疫荧光染色，抗TRIM21的抗体为红色荧光标记，细胞核使用蓝色荧光染料DAPI直接染色，overlap为两种荧光复合在一起后的图象，TRIM21在细胞核内核外都有分布。

图6.TRIM21影响IRF3信号通路的报告基因试验柱形图。

INFβ-luc为干扰素-β的特异性报告基因质粒，它上面有多个转录因子的结合位点，其中主要有IRF3、AP1以及NF-κB的结合位点；PRDIII-I-luc为IRF3转录因子的特异性报告基因质粒；κB-luc为NF-κB的特异性报告基因质粒；本图显示：TRIM21通过影响IRF3信号通路而影响到下游的干扰素-β的表达，而不是NF-κB信号通路。

图7.TRIM21对IRF3泛素化降解的影响SDS-PAGE图。

使用SiRNA-TRIM21序列以及它的负对照SiRNA-NC分别处理被仙台病毒感染的细胞，结果SiRNA-TRIM21能够降低细胞内源的TRIM21的表达水平，但是SiRNA-NC却不能；同时TRIM21的表达水平的降低造成了IRF3被泛素化的程度增高，降解加速。

图8.TRIM21突变体以及截短体对IRF3泛素化降解的影响。

本图显示了使用TRIM21序列以及它的突变体、截短体分别处理被仙台病毒感染的细胞。结果显示：TRIM21(WT)、一个突变体(3A)以及一个截短体(ΔR)都能够抑制细胞内IRF3的泛素化。

图9.B30.2结构域参与TRIM21与IRF3的相互作用。

TRIM21的C-端的保守结构域B30.2(251-475)对于TRIM21与IRF3之间的相互作用很重要，在GST-沉降试验中，缺失这一段的截短体没有检测到与IRF3的相互作用，而缺失1-250位的截短体仍然能够与IRF3相互作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次揭示TRIM21蛋白是一种对于调节先天免疫反应信号转导通路有用的物质，其通过与干扰素调节因子3(IRF3)相互作用，抑制IRF3的泛素化，促进细胞分泌干扰素。因此，TRIM21蛋白及其促进剂是对于抑制病毒的有效物质，TRIM21蛋白本身或TRIM21蛋白与IRF3蛋白的相互作用也可以作为筛选抗病毒药物的靶点。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“病毒”包括在病毒学专业领域中，被列入DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒所属的各种病毒，只要所述病毒在侵入后能够使得机体先天免疫反应信号转导通路发生应激的反应；或者所述病毒在侵入后尽管不能使得机体先天免疫反应信号转导通路发生应激的反应，但在机体先天免疫反应信号转导通路被所述的TRIM21蛋白或其调节剂(特别是促进剂)激活后，能够被该通路所抑制的病毒。所述的病毒还包括所有能够被干扰素(特别是干扰素β)抑制的病毒。

TRIM蛋白及其用途

TRIM21蛋白是TRIM蛋白家族的成员之一。TRIM家族在哺乳动物细胞中已经发现了近百个，扮演了各种各样不同的角色，其中一部分和抗病毒有关系。但是目前还没有关于TRIM21的抗病毒作用方面的报道。本发明人第一次证实了TRIM21参与了IRF3介导的信号转导通路，并且是一个可抑制病毒的蛋白。它通过和IRF3相互作用，影响Pin1蛋白对磷酸化激活的IRF3进行构象改变，减慢IRF3的泛素化降解，维持IRF3信号通路的持续激活，促进细胞分泌干扰素。因此，TRIM21是抗病毒药物设计的新靶点。

TRIM21蛋白在兽亚纲哺乳动物中是较为保守的，存在相同且高度保守的结构域，在蛋白高级结构上非常接近，因此本发明所述的TRIM21蛋白是来源于哺乳动物(如人、鼠、猴、羊、牛等)的任何一种TRIM21蛋白。

在本发明中，所用的TRIM21蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的TRIM21蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组TRIM21蛋白。优选的，本发明可采用重组的TRIM21蛋白。

任何适合的TRIM21蛋白均可用于本发明。所述TRIM21蛋白包括全长的TRIM21蛋白或其生物活性片段。优选的，所述TRIM21蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2所示的序列基本上相同，其编码序列例如可以与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的TRIM21蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。TRIM21蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种TRIM21蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，TRIM21蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的TRIM21蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长TRIM21蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长TRIM21蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。优选地，所述的TRIM21蛋白的生物活性片段与SEQ ID NO：2中第251-475位所示的序列基本上相同。

本发明也可采用经修饰或改良的TRIM21蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的TRIM21蛋白。所述经过修饰或改良的TRIM21蛋白可以是与天然存在的TRIM21蛋白具有较小的共同点，但也能调节哺乳动物的先天免疫反应信号转导通路，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响TRIM21蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

一旦分离获得了所述蛋白的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。

本发明还包括了编码所述的TRIM21蛋白或其生物活性片段或衍生物的分离的核酸，也可以是其互补链。编码TRIM21蛋白或其生物活性片段或衍生物的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的TRIM21蛋白或其生物活性片段或衍生物的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白。

本发明还包括了包含编码所述TRIM21蛋白或其生物活性片段或衍生物的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

此外，含有编码所述TRIM21蛋白或其生物活性片段或衍生物核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

基于本发明人的新发现，本发明提供了TRIM21蛋白的用途，用于制备调节先天免疫反应信号转导通路的组合物；或用于筛选调节先天免疫反应信号转导通路的物质。例如，所述的TRIM21用于促进先天免疫反应信号转导通路的激活，与IRF3相互作用，减缓IRF3的泛素化，促进IRF3信号转导通路的激活，促进细胞分泌干扰素。所述的TRIM21蛋白通过调控细胞对外界病原体感染的应激反应强度，达到抗感染，特别是抗病毒感染的目的。

干扰素调节因子3

干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3；简称IRF3)是先天免疫反应信号转导通路中关键性的节点分子。它是一个转录因子，负责一系列下游效应靶基因的激活，因此发生在IRF3上的微小变化，会造成下游效应的巨大变化。细胞在漫长的时间里，进化出多种调控IRF3转录激活活性的手段。静息状态下，IRF3呈自抑制状态，主要分布在胞质中。在病毒感染激活上游信号通路以后，IRF3的多个残基位置发生磷酸化，分子构象发生改变并转变成二聚体，进入细胞核内结合到DNA上，启动基因的转录。完成使命以后，又会很快地被一个叫做Pin1的脯氨酸异构酶改变构象，再被一个尚未鉴定的泛素连接酶(E3)泛素化，转运到蛋白酶体中降解。

作为本发明的优选方式，所述的IRF3蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_001562.1所示的序列基本上相同，其核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_001571.4所示的序列基本上相同。可与TRIM21蛋白发生相互作用的IRF3蛋白的生物活性片段或衍生蛋白也可用于本发明。

TRIM21的促进剂或抑制剂及其用途

如本文所用，所述的TRIM21的促进剂包括了上调剂、激活剂、激动剂等。任何可提高TRIM21蛋白的活性、维持TRIM21蛋白的稳定性、促进TRIM21蛋白的表达、延长TRIM21蛋白有效作用时间、或促进TRIM21的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进先天免疫反应信号转导通路的激活的有效物质。

如本文所用，所述的TRIM21的抑制剂包括了下调剂、阻滞剂、阻断剂、拮抗剂等。任何可降低TRIM21蛋白的活性、降低TRIM21蛋白的稳定性、抑制TRIM21蛋白的表达、减少TRIM21蛋白有效作用时间、或抑制TRIM21的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的TRIM21的促进剂例如是一表达载体，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码TRIM21的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述表达载体在转入细胞后表达(或过表达)TRIM21。更优选地，所述的表达载体是pCMV-TRIM21载体或pcDNA3.1-TRIM21载体。

作为本发明的优选方式，所述的TRIM21的抑制剂是(但不限于)：特异性抗TRIM21的抗体，所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，只要其对于TRIM21具有特异性结合能力，且能够通过与TRIM21的结合而抑制TRIM21的活性；或特异性抑制TRIM21编码基因的转录或翻译的干扰分子或反义核苷酸。针对已知蛋白或已知基因的干扰分子或反义核苷酸的制备方法是本领域人员熟知的。更优选地，所述的干扰分子是小干扰RNA，具有SEQ ID NO：3所示的序列。

本发明还提供了TRIM21蛋白的促进剂的用途。所述的TRIM21的促进剂用于制备调节先天免疫反应信号转导通路的组合物。例如，所述的TRIM21的促进剂通过促进TRIM21的表达或活性，用于促进先天免疫反应信号转导通路的激活，减缓IRF3的泛素化，促进IRF3信号转导通路的激活，促进细胞分泌干扰素。

本发明还提供了TRIM21蛋白的抑制剂剂的用途。所述的TRIM21的抑制剂用于制备调节先天免疫反应信号转导通路的组合物。例如，所述的TRIM21的抑制剂通过抑制TRIM21的表达或活性，用于抑制先天免疫反应信号转导通路的激活，促进IRF3的泛素化，抑制IRF3信号转导通路的激活。

筛选调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质

在得知了所述的TRIM21蛋白对于调节先天免疫反应信号转导通路的用途后，可以基于该特征来筛选通过调节TRIM21的活性或表达调节先天免疫反应信号转导通路的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达TRIM21蛋白的体系接触；和检测候选物质对TRIM21蛋白的影响；若所述候选物质可提高TRIM21蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是可用于促进先天免疫反应信号转导通路的潜在物质；若所述候选物质可降低TRIM21的表达或活性，则表明该候选物质是可用于抑制先天免疫反应信号转导通路的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到TRIM21蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达TRIM21的体系。

本发明还提供一种调节先天免疫反应信号转导通路相关的复合体，所述的复合体含有TRIM21蛋白和IRF3蛋白，两种蛋白相互结合。本发明人通过免疫共沉淀技术证明，TRIM21蛋白和IRF3蛋白能够相互结合，形成复合体。本发明人的发现提示TRIM21通过与IRF3的相互作用，调节IRF3相关的信号转导通路。可利用所述的复合体筛选调节TRIM21与IRF3相互作用的物质，该物质通过影响TRIM21与IRF3相互作用调节IRF3相关的信号转导通路。

基于以上新发现，本发明还提供了一种筛选调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质的方法，所述方法包括：向TRIM21蛋白和IRF3蛋白相互作用(相互结合)的反应体系中添加待筛选的候选物质，并检测TRIM21蛋白和IRF3蛋白相互作用情况；如果TRIM21蛋白和IRF3蛋白的相互作用在统计学上减弱，就表明该候选物质是抑制先天免疫反应信号转导通路的潜在物质；如果TRIM21蛋白和IRF3蛋白的相互作用在统计学上增强，就表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到TRIM21蛋白和IRF3蛋白相互作用的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的、TRIM21蛋白和IRF3蛋白相互作用的反应体系。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了免疫共沉淀技术来鉴定TRIM21蛋白和IRF3蛋白的相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞试验或动物试验，以进一步选择和确定对于调节先天免疫反应信号转导通路有用的物质。

本发明所述的体系包括但不限于：细胞(如原核细胞(如大肠杆菌细胞)，真核细胞(如CHO细胞，293细胞)或酵母细胞)或细胞培养物体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节先天免疫反应信号转导通路的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库。

组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的TRIM21蛋白，或其促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可直接用于调节先天免疫反应信号转导通路。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的TRIM21蛋白或其生物活性片段每天以约0.00001-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

抗TRIM21的抗体

在得知了所述TRIM21蛋白及其序列之后，可基于此来筛选或制备特异性识别或封闭TRIM21蛋白的试剂，例如特异性结合TRIM21蛋白的抗体。如利用所述TRIM21蛋白制备一系列抗体，从这些抗体中找到结合特异性良好的试剂。

所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的TRIM21蛋白或表达TRIM21蛋白的细胞可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。可用于制备多克隆抗体的动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、几内亚猪、兔子、羊、牛、马、鸡。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

作为本发明的优选方式，本发明提供了一种多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性地结合所述的TRIM21蛋白。所述的抗体是如下制备的：用所述的TRIM21蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。所述的多克隆抗体特异性良好，对于TRIM21蛋白具有优异的特异性结合效果，且对于TRIM21蛋白以外的其它蛋白不发生交叉结合。

本发明的主要优点在于：

(1)首次证明TRIM21蛋白是调控宿主细胞先天免疫反应信号转导通路的重要分子，能够影响干扰素的表达，对抗病毒感染。可通过TRIM21蛋白或其促进剂或抑制剂来调控细胞对外界病原体感染的应激反应强度，达到抗感染，特别是病毒感染的目的。

(2)由于TRIM21是一个自体免疫的标志蛋白，本发明人还制备了高效的抗TRIM21的多克隆抗体，可以用来进行疾病筛查等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1.TRIM21 cDNA的克隆

本发明的实施例中，使用Invitrogen公司Trizol试剂抽提293T细胞RNA，使用Promega公司反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下：

A)选择生长良好的293T细胞(购自ATCC)，吸去培养基，无菌PBS冲洗。使用PBS吹起悬浮以后，在血细胞计数板上计数。收集5×10⁶个细胞于1.5ml EP管中，加入1ml Trizol试剂后，用移液器将细胞吹散开，室温放置5分钟，让细胞完全裂解。

B)在裂解液中加入0.2ml氯仿，于振荡器上剧烈震荡，使两相溶液充分混合。室温放置3分钟后，4℃12000g高速离心15分钟，此时溶液呈两相，所需RNA在上层无色水相中。

C)小心将水相转移到一个新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，震荡混匀后放置室温15分钟，4℃12000g高速离心10分钟，此时RNA呈胶状沉淀在EP管底部。

D)加入1.5ml 75％乙醇对沉淀的RNA进行震荡分散，4℃7500g离心5分钟，小心吸去上清。重复清洗步骤一次。倒置EP管，让残留的乙醇自然挥发，获得分离的RNA作为模板。

E)在完全干燥之前，向EP管中加入无RNA酶的水，轻吹分散，在55℃水浴中溶解10分钟，测定A_260/280，确定数值在1.6左右，按照吸光度定量。

F)取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入1μg RNA模板和0.5μg引物(OligodT)。调整体积至15μl，70℃处理5分钟，冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入5×第一链缓冲液5μl、RNA酶抑制剂25U、M-MLV反转录酶200U后，用H₂O调至总体积25μl，震荡混匀。

G)离心将反应液集中在管底，在Eppendorf PCR仪上，42℃温浴1小时，完成后取出置于冰上，获得TRIM21 cDNA，其序列如图1，编码如图3所示的蛋白序列。

2.TRIM21原核表达载体的构建

得到TRIM21 cDNA后，使用TOYOBO公司高保真KOD PCR试剂盒扩增目标基因。

A)取薄壁PCR管向其中依次加入：5μl 10×PCR缓冲液、4μl dNTP、1μl酶、1μl cDNA模板、两端引物各1μl，并用去离子水调至总体积50μl。两条引物序列为：

TRIM21-5’：TCACGAATTCATGGCTTCAGCAGCACGCTT(SEQ ID NO：5)；

TRIM21-3’：TGACCTCGAGTCAATAGTCAGTGGATCCTT(SEQ ID NO：6)。

B)震荡混合均匀后，离心收集反应液于PCR管底，使用下列程序进行目标片段扩增：95℃5分钟，94℃20秒，55℃25秒，68℃1分钟，30个循环。

C)琼脂糖电泳检测PCR产物，选取条带大小正确，条带清晰的样品，进行切胶纯化。

D)纯化产物使用EcoRI、XhoI双酶切，37℃反应2小时，琼脂糖电泳，再次进行切胶纯化，用作外源片段。

E)使用EcoRI、XhoI分别对pGEX-6p-1(购自Amersham Pharmacia公司)以及pET-28a(购自Novagen)进行双酶切，37℃反应2小时，琼脂糖电泳，切胶纯化切出的线性片段，用做载体大片段。

F)使用T4连接酶连接外源片段以及载体大片段，16℃放置过夜，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。培养过夜，挑取单克隆送样测序。

G)测序正确的克隆，制备甘油菌，于-80℃长期保存。

pCMV-TRIM21质粒的构建：以TRIM21 cDNA为模板，用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6扩增，用EcoRI/XhoI酶切扩增产物后插入到pCMV载体(购自Clontech)的EcoRI/XhoI位点。

pcDNA3.1-TRIM21质粒的构建：以TRIM21 cDNA为模板，用引物SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6扩增，用EcoRI/XhoI酶切扩增产物后插入到pcDNA3.1载体(购自Invitrogen)的EcoRI/XhoI位点。

3.外源DNA载体以及SiRNA的转染

本发明人设计了人TRIM21基因的SiRNA序列(SiRNA-TRIM21)，同时设计了与TRIM21 RNA序列不互补的阴性对照SiRNA序列(NC)，它们的序列如图2所示。

对于小量外源DNA以及SiRNA的转染使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂盒完成，这里所指出的“适量”或“适合”是参照Invitrogen公司Lipofectamine 2000说明书确定。

A)在转染前一天，将健康生长细胞按照适合密度转接到新的12孔培养板中，加入不含抗生素的DMEM培养基培养，培养过夜。

B)当细胞生长密度达到覆盖80％培养板底部时，开始转化。首先用不含有血清的OPTI-DMEM将DNA和RNA干扰分子稀释到适当浓度，轻轻地混合。再用不含有血清的OPTI-DMEM将适量Lipofectamine 2000脂质体稀释到适当浓度，轻轻混匀。放置5分钟后，将两个溶液混合，再在室温放置20分钟。

C)取适量加入到12孔细胞培养板中，放置二氧化碳培养箱中，37℃继续培养适当时间，进行后续步骤。

II.实施例

实施例1.通过免疫共沉淀(co-IP)发现TRIM21与IRF3相互作用

先前已经知道，与IRF3拥有直接相互作用的蛋白质分子有多种。本发明重点关注IRF3信号通路被病毒激活后，与IRF3拥有直接相互作用的蛋白质分子，因为这类分子可能在宿主细胞抗病毒过程中起到重要作用。本发明首先使用了外源转染携带TBK1(Tank Binding Kinase)基因(GenBank登录号NM_013254.2)的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen)的方法模拟病毒对293T细胞的IRF3信号通路的激活。收集细胞后，进行裂解，离心取细胞裂解上清，再使用IRF3的单克隆抗体(购自Santa cruz)进行co-IP试验。经过银染鉴定，发现有一个52kDa的条带在刺激前后表达量有明显变化。对该条带切胶鉴定，质谱分析显示该条带是TRIM21蛋白。使用TRIM21的特异性抗体(购自Santacruz)对该条带进行免疫杂交(Western Blotting)，证实了质谱鉴定的结果。

实施例2.克隆TRIM21的cDNA序列

TRIM21是一个52kDa左右的蛋白，被划分在TRIM(Tripartitemotif-containing)蛋白家族。这一家族蛋白有一些共同特征：在N-端具有三个锌指结构(一个Ring-finger以及两个B-Box结构)，一个coiled-coil区域，在C-端具有SPRY结构域。这一蛋白是核蛋白复合物(RoSSA ribonucleoprotein)的组成成分，有文献报道其具有DNA以及RNA结合的能力。编码人TRIM21蛋白的基因位于人基因组染色体11上，由7个不连续的外显子组成。使用RNA抽提试剂盒抽提293T细胞RNA以后，使用通用引物Oligo dT进行反转录获得cDNA，再使用两端序列引物进行扩增。5’端带有EcoRI限制性内切酶位点，3’端有XhoI限制性内切酶位点。扩增产物电泳以后，切下目标条带，转入常规载体中测序。制备甘油菌，冻存于-80℃。

实施例3.原核表达TRIM21以及抗体制备

TRIM21的DNA编码序列获得以后，使用EcoRI和XhoI双酶切，再转入到大肠杆菌表达载体pET-28a以及pGEX-6p-1的相应位点中。这两种载体都是原核表达载体，拥有Lac操纵子，在大肠杆菌中受IPTG诱导而表达。其中，pET-28a载体上带有组氨酸标签(His₆-tag)序列，相应的TRIM21表达产物是连接有His₆-tag的融合蛋白，可以使用金属鏊合树脂进行亲和纯化。PGEX-6p-1载体编码一个谷胱甘肽转移酶(GST)，因此相应的TRIM21表达产物是连接有GST的融合蛋白，可以通过谷胱甘肽(GSH)树脂进行亲和纯化。同时GST-TRIM21融合蛋白上有一个蛋白酶的切点，通过在柱蛋白酶解，可以将TRIM21与GST蛋白分离开来，避免在制备抗体过程中影响抗体的特异性。

通过亲和纯化，蛋白酶解以及分子筛分离，纯化后的TRIM21原核表达产物免疫新西兰大白兔。按照常规方法，免疫强化3次，抽血清测定效价。效价达到要求以后，取全血于表面皿中静置凝结，小心吸取溶血上清，再离心除去沉淀，得到的血清冻存于-80℃。对血清中抗体的纯化，使用protein AG beads亲和纯化，纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果见图4。

实施例4.TRIM21在细胞内的分布

使用免疫荧光染色的方法观察TRIM21在细胞内的分布。首先处理好载玻片与盖玻片，在染色前一天将细胞铺于盖玻片上，平置于12孔培养板中生长。待细胞生长到合适浓度以后，取出盖玻片用PBS缓冲液进行冲洗。预处理完成以后，使用4％多聚甲醛固定。用含有0.2-0.5％Triton-X 100的PBS对细胞膜进行穿孔。再用常规方法制备的抗TRIM21的鼠多克隆抗体以及相应的荧光二抗(羊抗鼠，购自Sigma)进行染色，标示细胞内的TRIM21的分布。细胞核的定位，使用DAPI染色。封片以后，进行镜检，选择细胞形态保存完好并且染色良好的视野进行拍照，再对获得的图片进行分析。结果见图5。TRIM21在细胞内呈弥散分布，细胞核内与细胞质中均有分布。

实施例5.IFR3介导的细胞信号转导通路受到TRIM21影响

早期已经知道TRIM21是一个泛素连接酶E3，那么它对IRF3转录因子的调控可能与它的E3活性有关系。本发明人首先使用表达TRIM21的真核载体pCMV或者pcDNA3.1转染293T细胞，再使用仙台病毒(SeV，获自武汉病毒所)刺激转染以及未转染的细胞，报告基因的实验结果显示：外源转入的TRIM21能够促进细胞分泌干扰素-β，见图6。前面已经介绍干扰素-β的分泌受到IRF3信号通路的调控，而干扰素-β的表达量提高能够促进细胞对抗病毒的能力。此处共转的报告质粒有三种(IFN-β-Luc，PRDIII-I-Luc和κB-Luc)，构建方法是：IFN-β-Luc质粒是将干扰素-β的启动子序列(GenBank登录号NC_000009.10)导入真核表达质粒PGL3(购自Promega)的多克隆位点区，这样就可以通过荧光素的发光强度代表细胞内干扰素-β的表达水平；PRDIII-I-Luc质粒是将IRF3特异性识别元件PRDIII-I核酸序列(GenBank登录号NC_000009.10)导入真核表达质粒PGL3的多克隆位点区；κB-Luc质粒是将NF-κB特异性识别元件的核酸序列(GenBank登录号NC_000009.10)导入真核表达质粒PGL3的多克隆位点区。使用pTK-Renilla(购自Promega，Madison，WI)质粒作为归一化对照。

在过表达(Over-expression)实验之后，本发明还使用了RNA干扰(KnockDown)的方法降低了细胞内的TRIM21的表达量。此时，报告基因的结果显示：细胞分泌干扰素-β的能力随着TRIM21表达量的降低而降低。定量PCR以及其它一些实验的结果也证实了TRIM21通过与IRF3相互作用，影响IFR3介导的细胞信号转导通路，调控细胞分泌干扰素。试验结果还显示，TRIM21的泛素连接酶活性并没有在调控IRF3信号通路过程中直接起作用。也就是说，TRIM21是一个干扰素正调控因子，能够帮助细胞分泌干扰素。

实施例6.RNA干扰TRIM21影响IRF3的泛素化降解

为了研究TRIM21的作用机理，本发明人对IRF3的泛素化进行了深入研究。前面已经介绍了IRF3被磷酸化激活以后，结合到受它调控的基因的启动子区域，诱导下游基因转录。完成任务以后，IRF3首先被Pin1蛋白改变构象，再被一个未知的泛素连接酶E3泛素化，转运到蛋白酶体中降解。因此，IRF3的泛素化程度越高，则说明细胞对IRF3的降解速度越快。在仙台病毒刺激时，通过MG132抑制蛋白酶体降解，可以观测到IRF3的泛素化，如果此时再对内源的TRIM21进行RNA干扰，可以发现IRF3的泛素化明显加强，见图7。这说明了在生理条件下，TRIM21通过抑制了IRF3的泛素化，影响IFR3介导的细胞信号转导通路。在本发明中，本发明人还证实了TRIM21与IRF3的相互作用影响了Pin1对IRF3的构象转变作用。已经有报道Pin1对IRF3的构象转变作用发生在IRF3被泛素化之前，那么就可以理解为何TRIM21与IRF3之间的相互作用能够影响IRF3的泛素化降解了。

实施例7.TRIM21对细胞抗病毒能力的影响

如前所述，TRIM21为了研究TRIM21对细胞抗病毒能力的直接影响，本发明人使用外源TRIM21真核表达质粒转染293T细胞，细胞培养一段时间以后再使用仙台病毒感染。感染后的细胞培养一段时间以后，收集培养基上清，离心后分成两个部分。一部分用作ELISA实验直接测定细胞培养上清中干扰素-β的含量，实验结果表明：转染外源TRIM21表达载体的细胞培养基离心上清中干扰素-β的含量有明显上升。另外一部分离心上清被直接用作抗病毒实验，用离心上清处理未转染的293T细胞，再使用水疱性口疡病毒(VSV，获自武汉病毒所)感染。然后，用病毒空斑实验检测感染后上清中的病毒滴度，结果显示：与没有使用上清处理的对照组细胞相比，使用上清处理的细胞形成的空斑减少73％，死亡率降低86％。该研究结果证实转染外源TRIM21能够增加细胞培养上清中干扰素-β的分泌量，促进细胞对抗病毒感染。

本发明还使用RNA干扰技术对TRIM21的抗病毒作用进行了研究，得到了统一的结果：转入TRIM21的SiRNA抑制分子，降低了细胞内TRIM21的表达水平，导致细胞培养上清中的干扰素-β降低7倍，抗病毒能力减弱17倍。

实施例8.TRIM21突变体以及截短体对IRF3泛素化降解的影响

本发明人还比较了TRIM21蛋白以及它的突变体、截短体对IRF3泛素化降解的影响，点突变以及截短体的构建均是采用常规的现有技术。突变体3A为3个氨基酸(C16A；C31A；H33A)发生突变的TRIM21蛋白；突变体4M为4个氨基酸(R324D；F325A；P329G，V331D)发生突变的TRIM21蛋白；截短体ΔR为第1-79位氨基酸缺失的TRIM21蛋白。以上氨基酸位点的确定基于SEQ ID NO：2所示的序列。上述突变体或截短体的编码基因分别导入到pCMV或者pcDNA3.1真核表达载体，转染293T细胞。然后用仙台病毒感染293T细胞，之后裂解细胞，裂解液进行Ni-NTA沉降。

结果见图8，显示TRIM21(WT)、突变体(3A)以及截短体(ΔR)都能够抑制细胞内IRF3的泛素化。说明了TRIM21蛋白的一些衍生蛋白也具有野生型TRIM21蛋白的作用。

实施例9.TRIM21中与IRF3相互作用的结构域

为了找到TRIM21蛋白中对于与IRF3相互作用发挥决定作用的结构域，本发明人还设计了TRIM21的截短片段，为分别含有SEQ ID NO：2序列中第1-184、79-250、251-475位氨基酸序列的TRIM21(1-184)、TRIM21(79-250)、TRIM21(251-475)。通过常规的GST沉降试验来检测这些截短片段与IRF3的相互作用情况。

结果如图9所示，TRIM21的C-端的保守结构域B30.2(TRIM21(251-475))对于TRIM21与IRF3之间的相互作用很重要，在GST-沉降试验中，缺失这一段的截短体没有检测到与IRF3的相互作用，而缺失1-250位的截短体仍然能够与IRF3相互作用。

实施例10.筛选药物

如前述实施例1方法构建TRIM21与IRF3蛋白相互作用的免疫共沉淀体系。用外源转染TBK1载体的方法模拟病毒对293T细胞的IRF3信号通路的激活。设置以下组：

测试组：用候选物质处理的上述重组293T细胞；

对照组：不用候选物质处理的上述重组293T细胞。

经过上述处理后，用裂解缓冲液裂解细胞，通过免疫共沉淀观察两种蛋白的相互作用情况。免疫沉淀复合物经常规SDS-PAGE和Western印迹分析。

如果与对照组相比，测试组中的TRIM21与IRF3蛋白相互作用显著增强，则说明该候选物质是潜在的促进先天免疫反应信号转导通路的激活的物质；反之，如测试组中的TRIM21与IRF3蛋白相互作用显著变弱，则说明该候选物质是潜在的抑制先天免疫反应信号转导通路的激活的物质。其中，TRIM21与IRF3相互作用的强弱可以使用常规的报告基因方法或者检测IRF3泛素化水平的方法实现。

总之，本发明使用分子生物学、细胞生物学、免疫学等技术手段证实了TRIM21能够与IRF3直接相互作用，阻断磷酸化激活的IRF3分子被Pin1作用，进而抑制IRF3分子的泛素化降解。也指出了通过外源导入DNA或者SiRNA的手段，能够改变细胞内TRIM21的表达水平，进而影响细胞内IRF3介导的信号转导通路。同时，由于IRF3介导的信号转导通路主要负责细胞对抗病毒感染，因此TRIM21分子是一个新的抗病毒药物设计靶点。本发明的多克隆抗体，可以用于ELISA、IP、Western blotting以及胶体金检测等多种测试手段，对几种自体免疫性疾病的筛查有用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种抗病毒相关蛋白及其用途

<130>090091

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1428

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>1

atggcttcag cagcacgctt gacaatgatg tgggaggagg tcacatgccc tatctgcctg  60

gaccccttcg tggagcctgt gagcatcgag tgtggccaca gcttctgcca ggaatgcatc  120

tctcaggttg ggaaaggtgg gggcagcgtc tgtcctgtgt gccggcagcg ctttctgctc  180

aagaatctcc ggcccaatcg acagctagcc aacatggtga acaaccttaa agaaatcagc  240

caggaggcca gagagggcac acagggggaa cggtgtgcag tgcatggaga gagacttcac  300

ctgttctgtg agaaagatgg gaaggccctt tgctgggtat gtgcccagtc tcggaaacac  360

cgtgaccacg ccatggtccc tcttgaggag gctgcacagg agtaccagga gaagctccag  420

gtggcattag gggaactgag aagaaagcag gagttggctg agaagttgga agtggaaatt  480

gcaataaaga gagcagactg gaagaaaaca gtggaaacac agaaatctag gattcacgca  540

gagtttgtgc agcaaaaaaa cttcctggtt gaagaagaac agaggcagct gcaggagctg  600

gagaaggatg agagggagca gctgagaatc ctgggggaga aagaggccaa gctggcccag  660

cagagccagg ccctacagga gctcatctca gagctagatc gaaggtgcca cagctcagca  720

ctggaactgc tgcaggaggt gataattgtc ctggaaagga gtgagtcctg gaacctgaag  780

gacctggata ttacctctcc agaactcagg agtgtgtgcc atgtgccagg gctgaagaag  840

atgctgagga catgtgcagt ccacatcact ctggatccag acacagccaa tccgtggctg  900

atactttcag aagatcggag acaagtgagg cttggagaca cccagcagag catacctgga  960

aatgaagaga gatttgatag ttatcctatg gtcctgggtg cccagcactt tcactctgga  1020

aaacattact gggaggtaga tgtgacagga aaggaggcct gggacctggg tgtctgcaga  1080

gactctgtgc gcaggaaggg gcactttttg cttagttcca agagtggctt ctggacaatt  1140

tggttgtgga acaaacaaaa atatgaggct ggcacctacc cccagactcc cctccacctt  1200

caggtgcctc catgccaagt tgggattttc ctggactatg aggctggcat ggtctccttc  1260

tacaacatca ctgaccatgg ctccctcatc tactccttct ctgaatgtgc ctttacagga  1320

cctctgcggc ccttcttcag tcctggtttc aatgatggag gaaaaaacac agcccctcta  1380

accctctgtc cactgaatat tggatcacaa ggatccactg actattga               1428

<210>2

<211>475

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>2

Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys

1               5                   10                  15

Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly

            20                  25                  30

His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly

        35                  40                  45

Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg

    50                  55                  60

Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser

65                  70                  75                  80

Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly

                85                  90                  95

Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp

            100                 105                 110

Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu

        115                 120                 125

Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly

    130                 135                 140

Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile

145                 150                 155                 160

Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser

                165                 170                 175

Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu

            180                 185                 190

Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu

        195                 200                 205

Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala

    210                 215                 220

Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala

225                 230                 235                 240

Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser

                245                 250                 255

Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val

            260                 265                 270

Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Val His

        275                 280                 285

Ile Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Pro Trp Leu Ile Leu Ser Glu

    290                 295                 300

Asp Arg Arg Gln Val Arg Leu Gly Asp Thr Gln Gln Ser Ile Pro Gly

305                 310                 315                 320

Asn Glu Glu Arg Phe Asp Ser Tyr Pro Met Val Leu Gly Ala Gln His

                325                 330                 335

Phe His Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Thr Gly Lys Glu

            340                 345                 350

Ala Trp Asp Leu Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Arg Arg Lys Gly His

        355                 360                 365

Phe Leu Leu Ser Ser Lys Ser Gly Phe Trp Thr Ile Trp Leu Trp Asn

    370                 375                 380

Lys Gln Lys Tyr Glu Ala Gly Thr Tyr Pro Gln Thr Pro Leu His Leu

385                 390                 395                 400

Gln Val Pro Pro Cys Gln Val Gly Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly

                405                 410                 415

Met Val Ser Phe Tyr Asn Ile Thr Asp His Gly Ser Leu Ile Tyr Ser

            420                 425                 430

Phe Ser Glu Cys Ala Phe Thr Gly Pro Leu Arg Pro Phe Phe Ser Pro

        435                 440                 445

Gly Phe Asn Asp Gly 6ly Lys Asn Thr Ala Pro Leu Thr Leu Cys Pro

    450                 455                 460

Leu Asn Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr Asp Tyr

465                 470                 475

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>3

gcaggaguug gcugagaag               19

<210>4

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>4

uucuccgaag gugucacgu               19

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

tcacgaattc atggcttcag cagcacgctt   30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

tgacctcgag tcaatagtca gtggatcctt   30

Claims (9)

1.一种TRIM21蛋白或其促进剂的用途，用于制备调节先天免疫反应信号转导通路且抑制病毒感染的组合物；所述的TRIM21蛋白的促进剂是重组表达载体，所述表达载体中含有一表达盒，其中包含编码TRIM21蛋白的基因。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的先天免疫反应信号转导通路包括干扰素调节因子3介导的信号转导通路。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TRIM21蛋白或其促进剂用于制备促进干扰素调节因子3介导的信号转导通路的激活的组合物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于提高干扰素-β的表达。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TRIM21蛋白选自：

(a)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；

(b)SEQ ID NO：2中第251-475位氨基酸序列的蛋白。

6.一种分离的TRIM21蛋白，所述的蛋白选自：

(i)SEQ ID NO：2中第251-475位氨基酸序列的蛋白；

并且，所述的蛋白不包括具有SEQ ID NO：2全长氨基酸序列的蛋白。

7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求6所述的蛋白。

8.一种筛选促进先天免疫反应信号转导通路的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达TRIM21蛋白的体系接触；所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系；

(2)检测候选物质对TRIM21蛋白的表达或活性的影响；

若所述候选物质提高TRIM21蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述体系中还表达干扰素调节因子3蛋白，且所述的TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用；以及

步骤(2)包括：检测候选物质对TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用的影响；

若所述候选物质促进TRIM21蛋白与干扰素调节因子3蛋白相互作用，则表明该候选物质是促进先天免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。

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