CN108018303A - 一种人Ro52重组蛋白的制备方法 - Google Patents

一种人Ro52重组蛋白的制备方法 Download PDF

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周延庆
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杨阳
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Jiangsu Hao Bo Biomedical Ltd By Share Ltd
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Abstract

本发明涉及一种人Ro52重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。本发明通过采用原核表达系统以及通过对工艺参数的控制，使得人Ro52重组蛋白的制备方法简单易操作、成本低、产量高（1L诱导表达量可获得2.95mg的人Ro52重组蛋白），并且人Ro52重组蛋白的纯度高（>90%）。

Description

一种人Ro52重组蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于基因工程和生物工程技术领域，具体涉及一种人Ro52重组蛋白的制备方法。
背景技术
用可溶性组织抗原和干燥综合征 (Sjfgren'ssyndrome)患者血清进行免疫扩散实验时发现了2种特异性抗原，命名为干燥综合征A 型抗原和B型抗原，随后发现干燥综合征A型抗原(SSA)由2 种蛋白组成，分别称为Ro52 和Ro60。Ro52是多种自身免疫疾病的靶抗原，如系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性硬化症和皮肌炎等，抗Ro52抗体也是新生儿先天性心脏传导阻滞的重要疾病原因。多项研究表明，干燥综合征患者血清中存在高滴度的抗Ro52抗体，因此研制Ro/SSA抗体检测试剂盒具有重要的临床意义。
研制Ro/SSA抗体检测试剂盒重要的原料就是Ro52蛋白，目前，国内外主要使用组织提取法，从动物（小牛、猪、兔等）胸腺或人脾脏中提取纯化天然自身抗原作为检测相应自身抗体的配体，但此方法存在产量少、纯度低、批间差异大且成本高等缺点。
福建医科大学宋涛发表的硕士学位论文公开了人自身抗原Ro52的酵母重组表达及其抗体检测斑点免疫金渗滤法的建立，其以人白血病MPN细胞的cDNA文库为模板，PCR扩增人Ro52全长基因序列，将PCR产物回收进行TA克隆并鉴定；将测序正确的TA克隆和Ppic9K抽提质粒双酶切后连接，重组质粒经线性化后采用电穿孔法导入巴斯德毕赤酵母SMD1168株中，构建重组Ro52酵母真核表达载体。利用G418筛选高表达的重组菌，并对高表达重组菌进行PCR鉴定；诱导Ro52酵母菌分泌表达获得目的蛋白，经硫酸铵浓缩沉淀，通过SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。其采用的是真核表达载体进行Ro52蛋白的制备，该方法存在操作复杂、周期长、成本高、产量低等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产量高、成本低的人Ro52重组蛋白的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是一种人Ro52重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；
步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；
步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；
步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。
本发明中，所述的原核表达载体是具有多克隆位点且可通过多个调控原件在原核表达系统进行调控表达外源基因的分子生物学载体。
优选地，所述的原核表达载体为pET-28a (+)载体。
本发明中，所述的原核表达系统是可以表达外源基因的原核细胞。
优选地，所述的原核表达系统为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选地，采用化学转染或物理转染将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。
进一步优选地，采用热激法将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。
优选地，采用镍柱进行所述的亲和层析。
根据一个优选实施方式，步骤（1）的具体实施方式为：根据人Homo sapienstripartite motif containing 21的mRNA序列，对Ro52全长基因进行原核表达系统密码子优化后由人工直接合成，并亚克隆至原核表达载体得到重组载体。
具体地，所述的人Homo sapiens tripartite motif containing 21的mRNA序列的GenBank序列登录号为BC010861，其序列参见SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列见SEQ IDNO.2。
根据一个优选实施方式，步骤（2）的具体实施方式为：将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞冰浴至融化，然后加入所述的重组载体，混合均匀后在冰上放置30 min；然后在42℃的水浴中热激90s；再转移至冰浴，放置2min；然后加入LB培养基，在37℃、180 rpm摇床温育1h，使细菌复苏，然后以4000 rpm的转速离心3 min，弃去上清得到重组质粒转化产物；将所述的重组质粒转化产物均匀涂布于含有100 µg/mL 氨苄西林的LB平板上，倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到所述的转化子，其中，所述的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、所述的重组载体和所述的LB培养基的投料体积比为100：10：500。
进一步优选地，弃去上清的体积为体系总体积的80%。
根据一个优选实施方式，步骤（3）的具体实施方式为：挑取所述的培养皿中的单菌落至含100 mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250 rpm过夜培养；然后取培养后的菌液至含100mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250 rpm的条件下扩大培养至OD600=0.6~1时，加入终浓度为0.05~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃、180 rpm的条件下继续培养诱导3 ~5h，于10000rpm离心10 min，收集菌体得到表达菌。
进一步优选地，第一次培养时采用的LB培养基与扩大培养时采用的培养基的体积比为1：100。
根据一个优选实施方式，步骤（4）的具体实施方式为：将所述的表达菌用细菌裂解缓冲液重悬，重悬后的菌液于冰上用超声破碎仪超声波破碎至半透明；在9500 rpm、 4℃下离心20min，收集沉淀，将所述的沉淀用含有8M尿素的Binding buffer搅拌溶解，于冰上超声波破碎至半透明，然后用Sigma 3K15离心机以9500 rpm、4℃下离心20min，收集上清液；将Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，用10倍柱床体积的水、5倍柱床体积的BindingBuffer先后洗涤树脂，然后将所述的上清液直接上经处理后的所述的多聚色谱柱；用含有8M的尿素的Washing Buffer洗涤树脂，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平；然后用含有8M的尿素的Eluting Buffer多次将His标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集流出液，直至流出液的吸光度在平稳280 nm基线处，得到所述的人Ro52重组蛋白；其中，所述的表达菌、所述的细菌裂解缓冲液、所述的含有8M尿素的Binding buffer的投料体积比为1000：50：30。
进一步优选地，所述的细菌裂解缓冲液的pH为7.5~8.5，含有20~55mM的三羟甲基氨基甲烷，质量百分比为5~20%的甘油，质量百分比为0.09~0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚，50~200 ug/mL的溶菌酶。
进一步优选地，采用超声破碎的条件为：功率200~500W，超声时间5秒，间隙时间10秒，工作次数20次。
进一步优选地，所述的含有8M尿素的Binding buffer的pH为7.5~8.5，含有20~55mM的Tris-HCl，5~20mM的咪唑。
进一步优选地，所述的含有8M的尿素的Washing Buffer的pH为7.5~8.5，含有20~55mM的Tris-HCl，30~60mM的咪唑。
进一步优选地，所述的含有8M的尿素的Eluting Buffer的pH为7.5~8.5，含有20~55mM的Tris-HCl，300~600mM的咪唑。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明通过采用原核表达系统以及通过对工艺参数的控制，使得人Ro52重组蛋白的制备方法简单易操作、成本低、产量高（1L诱导表达量可获得2.95mg的人Ro52重组蛋白），并且人Ro52重组蛋白的纯度高（>90%）。
附图说明
附图1为人Ro52重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道1为Marker，泳道2为诱导后且纯化前样品，泳道3为上样流出液，泳道4为漂洗收集液，泳道5为洗脱收集液；
附图2为人Ro52重组蛋白Western Blot分析图，其中，E-P表示阳性血清检测纯化后的Ro52，P-P表示阳性血清检测诱导表达前的菌体裂解液；E-N表示阴性血清检测纯化后的Ro52。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
菌株和载体：大肠杆菌BL21(DE3)和pET-28a (+)载体均购自Invitrogen公司。
培养基：LB（1% 蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1% NaCl，pH7.0）。
生化试剂：Pierce BCA Protein Assay Kit、Ni-NTA Agarose购自Thermo Fisher公司；
Bio-Rad 4X Loading buffer、BioRad TGX Stain-Free™ PRotein Gels和PrecisionPlus Protein标准品均购自Bio-Rad公司。
实施例一：人Ro52基因人工合成
根据GenBank已公开的人Homo sapiens tripartite motif containing 21 (TRIM21)的DNA列（GenBank序列登录号：BC010861 ），基因全长序列见SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。对Ro52全长基因进行原核表达系统密码子优化后由人工直接合成，并亚克隆至表达载体pET-28a (+)上。
实施例二：表达菌株BL21(DE3)-pET28a (+)-Ro52制备
1．取出制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴至融化。
．每100 mL感受态细胞加上述重组质粒pET28a (+)-Ro52 10 µL、ddH2O 1 µL（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30 min。
．将离心管放置42℃水浴，热激90 s。
．快速将离心管转移至冰浴，放置2 min。
．每管加500 µL LB培养基，在37℃摇床180 rpm 温育1 h，使细菌复苏。4000 rpm离心3 min，弃去约500 µL上清，细胞重悬。
．将重组质粒转化产物100 µL，阴性对照100 µL，均匀涂布于含有100 µg/mL Amp（氨苄西林）的LB平板上。
．倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到转化子。
实施例三：人Ro52基因融合表达
挑取单菌落至6 mL含100 mg/mL Amp的LB中，37℃、250 rpm过夜培养；取5 mL菌液加入500 mL含100 mg/mL Amp的LB中，37℃，250 rpm培养，至OD600=0.6时，加入终浓度为1 mMIPTG（异丙基硫代半乳糖苷），于37℃，180 rpm条件下继续培养诱导4 h，于10000 rpm离心5min，收集菌体。
实施例四：人Ro52融合蛋白的纯化
1. 每1L表达菌加入50ml细菌裂解缓冲液（50 mM Tris（三羟甲基氨基甲烷），10%glycerol（甘油），0.1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），100 ug/mL Lysozyme（溶菌酶），pH 8.0）重悬菌体；
2. 重悬后的菌液于冰上用超声破碎仪超声波破碎（功率325W，超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，）至半透明；
3. 9500 rpm 4°C离心20min，收集沉淀，将沉淀用30ml含有8 M尿素的Binding buffer（20 mM Tris-HCl，10 mM咪唑，pH 8.0）室温搅拌溶解，于冰上超声波破碎至半透明，超声条件：功率325W，超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，然后用Sigma 3K15离心机9500rpm 4°C离心20min。收集上清液进行纯化。
将2ml Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，用10倍柱床体积水、5倍柱床体积Binding Buffer先后洗涤树脂，将上清液直接上Ni柱；
5. 用含有8M尿素的Washing Buffer（20mM Tris-HCl，50 mM咪唑，pH 8.0）洗涤树脂，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平；
6. 用含有8M尿素的Eluting Buffer（20mM Tris-HCl，500 mM咪唑，pH 8.0）将His标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集流出液。重复此步骤，直至流出液的吸光度在平稳280 nm基线处。
实施例五：人Ro52融合蛋白的SDS-PAGE和BCA蛋白浓度检测
分别取上述收集的样品各30 uL与10 uL Bio-Rad 4X Loading buffer混匀，于金属浴中99℃煮沸5 min；10000 rpm离心30 s后，取10ul上清用BioRad TGX Stain-Free™PRotein Gels进行SDS-PAGE，180V运行30min，用BioRad Molecular Imager® Gel Doc™XR System获取图像，结果见图1。
由图1可知，纯化的表达产物在50KDa偏上处有明显的条带，与预计的Ro52分子量大小（57KDa）相符，目的蛋白纯度>90%。
采用Pierce BCA Protein Assay Kit测定纯化后蛋白的浓度，为0.27mg/ml，1L诱导表达量可获得近2.95mg较高纯度的Ro52融合蛋白，其成本为¥1,000，而采用酵母真核表达系统进行Ro52融合蛋白的制备时，获得2.95mg较高纯度的Ro52融合蛋白的成本为¥3,000。
实施例六：人Ro52基因融合蛋白的Western Blot分析
取纯化后的10ugRo52重组蛋白经SDS-PAGE电泳并电转移至PVDF膜，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别取人Ro52阳性抗体血清和阴性抗体血清室温孵育1 h后，TBST清洗3次，每次5 min，然后用AP偶联的鼠抗人IgG的二抗孵育1h后，TBST清洗3次，每次5min，用苏州浩欧博生物医药有限公司产BCIP/NBT显色液显影，检测Ro52融合蛋白的表达，其检测结果参见图2，发现重组制备的Ro52蛋白与阳性抗体血清反应性良好，而与阴性抗体血清不反应，证明Ro52重组蛋白已在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 江苏浩欧博生物医药股份有限公司
<120> 一种人Ro52重组蛋白的制备方法
<130> 2017
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> （rengongxulie）人工合成
<400> 1
atggcttcag cagcacgctt gacaatgatg tgggaggagg tcacatgccc tatctgcctg 60
gaccccttcg tggagcctgt gagcatcgag tgtggccaca gcttctgcca ggaatgcatc 120
tctcaggttg ggaaaggtgg gggcagcgtc tgtcctgtgt gccggcagcg ctttctgctc 180
aagaatctcc ggcccaatcg acagctagcc aacatggtga acaaccttaa agaaatcagc 240
caggaggcca gagagggcac acagggggaa cggtgtgcag tgcatggaga gagacttcac 300
ctgttctgtg agaaagatgg gaaggccctt tgctgggtat gtgcccagtc tcggaaacac 360
cgtgaccacg ccatggtccc tcttgaggag gctgcacagg agtaccagga gaagctccag 420
gtggcattag gggaactgag aagaaagcag gagttggctg agaagttgga agtggaaatt 480
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atactttcag aagatcggag acaagtgagg cttggagaca cccagcagag catacctgga 960
aatgaagaga gatttgatag ttatcctatg gtcctgggtg cccagcactt tcactctgga 1020
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tacaacatca ctgaccatgg ctccctcatc tactccttct ctgaatgtgc ctttacagga 1320
cctctgcggc ccttcttcag tcctggtttc aatgatggag gaaaaaacac agcccctcta 1380
accctctgtc cactgaatat tggatcacaa ggatccactg actattga 1428
<210> 2
<211> 475
<212> PRT
<213> （rengongxulie）人工合成
<400> 2
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Val His
275 280 285
Ile Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Pro Trp Leu Ile Leu Ser Glu
290 295 300
Asp Arg Arg Gln Val Arg Leu Gly Asp Thr Gln Gln Ser Ile Pro Gly
305 310 315 320
Asn Glu Glu Arg Phe Asp Ser Tyr Pro Met Val Leu Gly Ala Gln His
325 330 335
Phe His Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Thr Gly Lys Glu
340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Arg Arg Lys Gly His
355 360 365
Phe Leu Leu Ser Ser Lys Ser Gly Phe Trp Thr Ile Trp Leu Trp Asn
370 375 380
Lys Gln Lys Tyr Glu Ala Gly Thr Tyr Pro Gln Thr Pro Leu His Leu
385 390 395 400
Gln Val Pro Pro Cys Gln Val Gly Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly
405 410 415
Met Val Ser Phe Tyr Asn Ile Thr Asp His Gly Ser Leu Ile Tyr Ser
420 425 430
Phe Ser Glu Cys Ala Phe Thr Gly Pro Leu Arg Pro Phe Phe Ser Pro
435 440 445
Gly Phe Asn Asp Gly Gly Lys Asn Thr Ala Pro Leu Thr Leu Cys Pro
450 455 460
Leu Asn Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr Asp Tyr
465 470 475

Claims (10)

1.一种人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；
步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；
步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；
步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达载体为pET-28a (+)载体。
3.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达系统为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用化学转染或物理转染将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。
5.根据权利要求4所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用热激法将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。
6.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：采用镍柱进行所述的亲和层析。
7.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体实施方式为：根据人Homo sapiens tripartite motif containing 21的mRNA序列，对Ro52全长基因进行原核表达系统密码子优化后由人工直接合成，并亚克隆至原核表达载体得到重组载体。
8.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）的具体实施方式为：将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞冰浴至融化，然后加入所述的重组载体，混合均匀后在冰上放置30min；然后在42℃的水浴中热激90s；再转移至冰浴，放置2min；然后加入LB培养基，在37℃、180 rpm摇床温育1h，使细菌复苏，然后以4000rpm的转速离心3 min，弃去上清得到重组质粒转化产物；将所述的重组质粒转化产物均匀涂布于含有100 µg/mL氨苄西林的LB平板上，倒置培养皿，于37℃培养过夜，得到所述的转化子，其中，所述的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、所述的重组载体和所述的LB培养基的投料体积比为100：10：500。
9.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）的具体实施方式为：挑取所述的培养皿中的单菌落至含100 mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250rpm过夜培养；然后取培养后的菌液至含100 mg/mL 氨苄西林的LB培养基中，在37℃、250rpm的条件下扩大培养至OD600=0.6~1时，加入终浓度为0.05~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18~37℃、180 rpm的条件下继续培养诱导3~5h，于10000rpm离心10min，收集菌体得到表达菌。
10.根据权利要求1所述的人Ro52重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（4）的具体实施方式为：将所述的表达菌用细菌裂解缓冲液重悬，重悬后的菌液于冰上用超声破碎仪超声波破碎至半透明；在 9500 rpm、 4℃下离心20min，收集沉淀，将所述的沉淀用含有8M尿素的Binding buffer搅拌溶解，于冰上超声波破碎至半透明，然后用Sigma 3K15离心机以9500 rpm、4℃下离心20min，收集上清液；将Ni-NTA Agarose加入到多聚色谱柱中，用10倍柱床体积的水、5倍柱床体积的Binding Buffer先后洗涤树脂，然后将所述的上清液直接上经处理后的所述的多聚色谱柱；用含有8M的尿素的Washing Buffer洗涤树脂，洗至核酸蛋白检测仪显示蛋白峰降至水平；然后用含有8M的尿素的Eluting Buffer多次将His标签蛋白从树脂上洗脱下来并收集流出液，直至流出液的吸光度在平稳280 nm基线处，得到所述的人Ro52重组蛋白；其中，所述的表达菌、所述的细菌裂解缓冲液、所述的含有8M尿素的Binding buffer的投料体积比为1000：50：30。
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