CN109022460A

CN109022460A - 一种bahd酰基转移酶基因及其用途

Info

Publication number: CN109022460A
Application number: CN201811015272.3A
Authority: CN
Inventors: 巴桑玉珍; 王玉林; 原红军; 徐齐君; 曾兴权; 杨春葆; 于明寨; 扎桑; 韦泽秀; 顿珠加布; 尼玛扎西
Original assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry; Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences
Current assignee: Institute Of Agriculture Tibet Autonomous Region Academy Of Agriculture And Animal Husbandry; Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN109022460B

Abstract

本发明提供了一种青稞来源的BAHD酰基转移酶基因HVUL2H29914，本发明还提供了包含该基因的重组载体、重组菌、转基因植物的制备方法，本发明还提供了BAHD酰基转移酶及其制备方法。本发明BAHD酰基转移酶可以用阿魏酰辅酶A作为酰基供体、色氨酸作为酰基受体，合成阿魏酰色胺，应用前景优良。

Description

一种BAHD酰基转移酶基因及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种青稞来源的BAHD酰基转移酶基因的应用。

背景技术

阿魏酰色胺具有抗炎、抗肿瘤和抑菌的作用，在红花等药用植物中有微量的分布。由于药用资源有限，阿魏酰色胺的来源需要进一步开发。

青稞，青稞英文名：hulless barley。是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，因其内外颖壳分离，籽粒裸露，故又称裸大麦、元麦、米大麦。主要产自中国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。

青稞还具有一定的药用价值，而现有技术未见青稞中含有阿魏酰色胺的报道。

发明内容

本发明通过对青稞的研究，发现了一种新的青稞BAHD酰基转移酶基因，其可以有效将阿魏酰基辅酶A和色氨酸转化为阿魏酰色胺。

本发明提供了一种基因(BAHD酰基转移酶基因HVUL2H29914)，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

前述的重组载体，所述重组载体是重组pGEX-6P-1(Novagen)。

前述的重组菌，它包含前述的重组载体。

前述的重组菌，所述重组菌为Transetta(DE3)。

本发明还提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

前述蛋白的方法，它是采用前述重组菌发酵制备。

前述蛋白的方法，步骤如下：

(1)取前述重组菌，活化，得菌液；

(2)将菌液接种到LB培养基中培养，3～4h后，加入IPTG诱导剂诱导培养，收集菌体；

(3)破菌，离心，取上清，纯化，即可。

步骤(1)中，所述菌液的浓度为1×10⁶～10⁷cfu/ml；优选地，所述活化是采用含有Amp的LB培养基培养培养，培养时间是6-10小时，培养温度为37℃；

和/或，步骤(2)中，所述菌液的接种比例为1:50；所述培养的温度是37℃，转速为200rpm；所述IPTG的浓度为1mol/L，加入量为培养液的1/100000；诱导培养的温度是20℃，转速为160rpm；

和/或，步骤(3)中，所述分离纯化的方法为GST标签融合蛋白纯化方法；优选地，所述纯化方法为：取上清，上树脂柱，穿流2次；采用Lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白；进一步优选地，所述树脂是GlutathioneSepharoseTM 4B树脂；所述还原型谷胱甘肽溶液是还原型谷胱甘肽溶于Lysis buffer得到的溶液。

前述的基因片段、重组载体、重组菌、蛋白在制备阿魏酰色胺方面的用途。

本发明还提供了一种制备阿魏酰色胺的方法，它是采用前述的基因片段、重组载体、重组菌、蛋白，以阿魏酰基辅酶A作为酰基供体，色氨酸作为供体，制备阿魏酰色胺。

本发明还提供了一种生产阿魏酰色胺的转基因植物的构建方法，其特征在于：取前述的基因，转入植物中，获得表达前述蛋白的植株，即可。

前述的构建转基因烟草的方法，其特征在于：所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种；本发明转基因植物为转基因烟草。

本发明还提供了前述的基因片段、重组载体、重组菌在制备高产阿魏酰色胺的青稞品种的用途。

本发明发现了青稞中的一种新的基因：青稞BAHD酰基转移酶基因，该基因表达的蛋白——青稞BAHD酰基转移酶，可以将阿魏酰基辅酶A转化为阿魏酰色胺，提高青稞的保健价值；本发明还以该基因片段进行体外表达，获得了青稞BAHD酰基转移酶，在体外反应中，成功地将以阿魏酰基辅酶A作为酰基供体，色氨酸作为供体，制备得到了阿魏酰色胺；本发明还将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中也表达BAHD酰基转移酶，进一步产生阿魏酰色胺，提高其价值。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。

本发明的基因片段和重组载体，可以用来提高青稞对阿魏酰色胺的合成，实现青稞的定向改良。

本发明的转基因烟草构建方法，为青稞的定向改良提供了重要的参考。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为HVUL2H29914蛋白的SDS-PAGE电泳图，Marker：100,70,55,40,35,25KDa。

图2为体外催化反应的LC-MS图：agmatine，丁胺；tryptamine，色胺；feruoyltryptamine，阿魏酰色胺。

图3为转基因植物提取物中阿魏酰色胺的质谱图。

具体实施方式

实施例1 HVUL2H29914基因的分离以及原核表达

本实施例主要是HVUL2H29914基因获得、载体构建及原核表达的方法。

(1)基因片段和载体的构建

称取1克青稞新鲜叶片，提取青稞RNA，用Thermo Fisher公司的M-MLV ReverseTranscriptase合成cDNA，设计引物，如下：

F:CCGAGATCTATGAAGATCACCGTGCACTCTTC

R:CCGGAATTCCTAAAGAGTGGCACGTAGGCGTCC

进行PCR扩增，得到目的条带大小的片段(结果如图1所示)。PCR产物用胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit D2500-02，OMEGA)纯化。

扩增得到的目的片段HVUL2H29914基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

ATGAAGATCACCGTGCACTCTTCCAAGGCCGTCAAGCCCGAGTACGGCGCCTGCGGCCTCGCTCCGGGGTGTACCGCCGACGTCGTCCCGCTCACCGTGCTCGACAAGGCCAACTTCGACACGTACATCTCGGTGATCTACGCCTTCCACGCGCCGGCGCCGCCCAACGCCGTTCTCGAGGCCGGGCTGGGCAGAGCGCTGGTGGACTACCGCGAGTGGGCCGGGCGGCTCGGCGTCGACGCCAGCGGCGGCCGCGCGATCCTGCTCAACGACGCCGGCGCCCGGTTCGTGGAGGCGACGGCCGACGTGGCGCTCGACAGCGTCATGCCGCTCAAGCCCACGTCGGAGGTTCTCAGCCTGCACCCCAGCGGCGACGACGGGCCAGAGGAGCTCATGCTAATCCAGGTCACGCGGTTCGCGTGCGGGTCGCTCGTCGTGGGGTTCACCACGCAGCACATCGTGTCCGACGGCCGCTCCACCGGCAACTTCTTCGTCGCGTGGAGCCAGGCCACCCGCGGCGCCGCCATCGACCCCGTCCCGGTGCACGACCGTGCTTCCTTCTTCCATCCCCGCGAACCGCTGCACGTCGAGTACGAGCACCGTGGCGTCGAGTTCAAGCCCTACGAGAAGGCACACGACGTTGTCTGTGGTGCGGACGGCGACGAGGACGAGGTGGTGGTGAACAAGGTGCACTTCAGCCGGGAGTTCATCTCCAAGCTCAAGGCGCAGGCGTCGGCTGGCGCGCCCAGACCCTGCAGCACCCTGCAGTGCGTGGTGGCACACCTGTGGCGGAGCATGACGATGGCGCGCGGGCTCGACGGCGGGGAGACCACCAGCGTCGCCATCGCCGTGGACGGGAGAGCGCGGATGAGCCCGCAGGTGCCGGACGGATACACCGGCAACGTCATCCTCTGGGCGCGGCCAACCACCACGGCGGGGGAGCTCGTGACCAGGCCGGTGAAGCACGCCGTGGAGCTCATCAGCAGGGAGGTGGCCCGGATCAACGATGGCTACTTCAAGTCCTTCATCGACTTCGCCAACTCCGGCGCGGTGGAGAAGGAGCGGCTGGTGGCGACGGCCGACGCGGCGGACATGGTGCTGAGCCCCAACATCGAGGTGGACAGCTGGCTGCGGATCCCGTTCTACGACATGGACTTCGGCGGCGGGCGGCCATTCTTCTTCATGCCCAGCTACCTGCCGGTGGAGGGTCTGCTCATCCTGCTGCCGTCTTTCTTGGGCGACGGCAGCGTGGACGCCTACGTGCCACTCTTTAGCCGCGACATGAACACCTTCAAGAACTGCTGCTACAGCCTCGACTAG

前述核苷酸序列所述的HVUL2H29914基因可以通过采用上述方法获得，也可以直接合成。

得到的基因片段转入载体pGEX-6P-1中，后重组载体转入Transetta(DE3)菌株中，得到含有目的片段的重组菌株。

(2)基因的表达

1.PCR检测阳性克隆，抽提质粒测序。

2.将测序正确的质粒载体热击转化大肠杆菌transeta(DE3)，抗性CN。

3.早上9点随机挑取2个正常大小克隆于5mL含有Amp的LB培养基中，37℃摇至下午4点。选其中一个，将4mL活化菌液(浓度为1×10⁶～10⁷cfu/ml)按照1:50比例转接到200mL大瓶LB培养基中，大摇床37℃培养，转速200rpm。3～4小时后，200mL培养基中加入2uL 1MIPTG诱导剂。20℃，160rpm条件下诱导过夜。剩余1mL菌液用来保菌。

4.第二天早上8点收集菌体。500mL离心瓶，4000rpm离心10min即可。

5.50mL Lysis buffer重悬菌体，涡旋混匀，转入50mL离心管中，分别加入50uLPMSF,10uLβ-巯基乙醇，混匀放置冰上。

6.采用高压破碎仪进行大肠杆菌细胞破碎实验。

7.破碎完成后样品，取20ul作为总蛋白样品。再取1mL样品4℃，13000rpm离心10min，取20uL上清作为上清液样品。加入等体积2*Loading buffer，煮沸5min,SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。剩余上清可暂冻存于-20℃冰箱。剩余未离心样品可冻存于-80℃冰箱。

8.SDS-PAGE电泳完毕，加入考马斯亮蓝染色液，微波炉煮沸1min后染色半小时，加入脱色液脱色。每隔1h换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，转至清水中。

9.GST标签融合蛋白纯化。将破碎未离心的所有样品离心，上清与1mL树脂在4℃混匀仪上混合3h。混匀结束后，将混合液穿过层析柱，穿流2次效果更佳。先用预冷的Lysisbuffer冲洗树脂(Glutathione SepharoseTM 4B，GE公司)，同时流出液用Bradford Assay检测，直至不变蓝色表示杂蛋白冲洗干净。然后，用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液(0.09g溶解于20mL lysis buffer)洗脱目的蛋白，每次加入1mL,层析柱底部用1.5mL的离心管收集，每管约1mL，分别记为E1、E2、E3、E4、E5、E6，直至Bradford Assay检测洗脱液中不含蛋白。未用完的还原型谷胱甘肽溶液继续全部洗脱树脂，然后分别用Lysis buffer，ddH2O 20％乙醇冲洗，保存于20％乙醇中。

10.收集的蛋白用SDS-PAGE检测，得到73kDa的条带(图1)，GST标签的分子量为26kDa，剩余目的蛋白的分子量为47kDa，与氨基酸计算的分子量相同，说明本发明制备得到了带有GST标签的目的蛋白。

目的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

MKITVHSSKAVKPEYGACGLAPGCTADVVPLTVLDKANFDTYISVIYAFHAPAPPNAVLEAGLGRALVDYREWAGRLGVDASGGRAILLNDAGARFVEATADVALDSVMPLKPTSEVLSLHPSGDDGPEELMLIQVTRFACGSLVVGFTTQHIVSDGRSTGNFFVAWSQATRGAAIDPVPVHDRASFFHPREPLHVEYEHRGVEFKPYEKAHDVVCGADGDEDEVVVNKVHFSREFISKLKAQASAGAPRPCSTLQCVVAHLWRSMTMARGLDGGETTSVAIAVDGRARMSPQVPDGYTGNVILWARPTTTAGELVTRPVKHAVELISREVARINDGYFKSFIDFANSGAVEKERLVATADAADMVLSPNIEVDSWLRIPFYDMDFGGGRPFFFMPSYLPVEGLLILLPSFLGDGSVDAYVPLFSRDMNTFKNCCYSLD

实施例2转基因烟草的构建

①将含有目标基因的瞬时表达载体(瞬时表达载体pEAQ，来自John InnesCentre)转化农杆菌(EHA105)；

②挑取阳性农杆菌克隆于500ul含有相应抗生素(kn)的LB中，培养20-24小时；

③转接200ul于5ml含有相应抗生素(kn)的LB中，28℃摇床220rpm至OD＝2.0左右。

④10000rpm常温离心2min收集菌体，用提前配制转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；缓冲液工作液成分以及浓度如下：10mM MES(pH5.7)，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)。

⑤拿准备好的1ml的注射器，去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取叶片长至眼镜片大小的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射，使农杆菌渗透进去。给每株打过的烟草做好标记，可在叶片上圈出农杆菌渗透的区域，并选取转化缓冲液打烟草做对照。

⑥注射了农杆菌的烟草黑暗培养24h，然后移至烟草培养箱中光照培养24-48小时即可取样(注意打过的烟草不可直接在叶片上喷洒水)。

以下通过试验例的方式来说明本发明的有益效果：

试验例1 HVUL2H29914蛋白的酶活检测

1.方法

1.1 HVUL2H29914蛋白的获取

实施例1方法制备得到的分子量73kDa的、带有GST标签的目的蛋白。

1.2酶活检测

在Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 7.4)中，以含有50μM阿魏酰基辅酶A作为酰基供体、100μM色氨酸为酰基受体和500ng纯化蛋白的总体积100μl进行体外酰基转移酶测定。孵育10min后，加入300μL冰冷甲醇，停止反应。然后将反应混合物通过0.2μm的过滤器(微孔)过滤，然后用于LC-MS分析。

2.结果

经过上述催化反应后，我们将产物通过LC-MS/MS，显示生成的物质是阿魏酰色胺(图2)。说明本发明HVUL2H29914蛋白具有催化阿魏酰辅酶A作为酰基供体、色氨酸作为酰基受体生成阿魏酰色胺的能力，应用前景良好。

试验例2转基因烟草生产阿魏酰色胺

1.方法

1.1转基因烟草的构建

按照实施例2构建。

1.2产物收集和纯化

剪取农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的EP管中，做好标记，迅速放置液氮中，进行冻干。冻干后的样本，利用研磨仪(MM 400,Retsch)在30Hz条件下研磨60s，将研磨好的样本粉末装入2mlEP管内。用电子天平称取每个EP管的重量并记录；将已研磨好的样本取适量(范围30-60mg)于EP管中，称量并记录，算出所有EP管中样本的净重。已知每份样本的净重，按体积V＝样本净重(mg)*12μL/mg在4℃冰上操作加入70％MeOH溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上。后离心。先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心，使用离心机注意对称平衡，离心后吸取上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μm pore size)过滤，装入上样瓶中，准备LC-MS检测。

1.3目的产物检测

将装有样本提取液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件Analyst Software，双击Hardware Configuration，选择LCMS-V(有切换阀模式)，点击Activate Profile，并选择Acquire Mode模式，点击Acquire，点击图上方的Equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态Ready后，功能区Start Sample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击Start Sample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。

2.结果

阿魏酰色胺的峰度值为1.2E+05(图3)，表明HVUL2H29914蛋白的活性高。

实验结果说明，本发明将基因HVUL2H29914转移到烟草中，使得烟草植株可以表达BAHD酰基转移酶，并诱导烟草积累阿魏酰色胺，提高烟草的应用价值，同时为高产阿魏酰色胺的青稞的品种制备提供依据。

序列表

<110> 西藏自治区农牧科学院农业研究所

西藏自治区农牧科学院

<120> 一种BAHD酰基转移酶基因及其用途

<130> GY462-18P1458

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1320

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<400> 1

atgaagatca ccgtgcactc ttccaaggcc gtcaagcccg agtacggcgc ctgcggcctc 60

gctccggggt gtaccgccga cgtcgtcccg ctcaccgtgc tcgacaaggc caacttcgac 120

acgtacatct cggtgatcta cgccttccac gcgccggcgc cgcccaacgc cgttctcgag 180

gccgggctgg gcagagcgct ggtggactac cgcgagtggg ccgggcggct cggcgtcgac 240

gccagcggcg gccgcgcgat cctgctcaac gacgccggcg cccggttcgt ggaggcgacg 300

gccgacgtgg cgctcgacag cgtcatgccg ctcaagccca cgtcggaggt tctcagcctg 360

caccccagcg gcgacgacgg gccagaggag ctcatgctaa tccaggtcac gcggttcgcg 420

tgcgggtcgc tcgtcgtggg gttcaccacg cagcacatcg tgtccgacgg ccgctccacc 480

ggcaacttct tcgtcgcgtg gagccaggcc acccgcggcg ccgccatcga ccccgtcccg 540

gtgcacgacc gtgcttcctt cttccatccc cgcgaaccgc tgcacgtcga gtacgagcac 600

cgtggcgtcg agttcaagcc ctacgagaag gcacacgacg ttgtctgtgg tgcggacggc 660

gacgaggacg aggtggtggt gaacaaggtg cacttcagcc gggagttcat ctccaagctc 720

aaggcgcagg cgtcggctgg cgcgcccaga ccctgcagca ccctgcagtg cgtggtggca 780

cacctgtggc ggagcatgac gatggcgcgc gggctcgacg gcggggagac caccagcgtc 840

gccatcgccg tggacgggag agcgcggatg agcccgcagg tgccggacgg atacaccggc 900

aacgtcatcc tctgggcgcg gccaaccacc acggcggggg agctcgtgac caggccggtg 960

aagcacgccg tggagctcat cagcagggag gtggcccgga tcaacgatgg ctacttcaag 1020

tccttcatcg acttcgccaa ctccggcgcg gtggagaagg agcggctggt ggcgacggcc 1080

gacgcggcgg acatggtgct gagccccaac atcgaggtgg acagctggct gcggatcccg 1140

ttctacgaca tggacttcgg cggcgggcgg ccattcttct tcatgcccag ctacctgccg 1200

gtggagggtc tgctcatcct gctgccgtct ttcttgggcg acggcagcgt ggacgcctac 1260

gtgccactct ttagccgcga catgaacacc ttcaagaact gctgctacag cctcgactag 1320

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 2

Met Lys Ile Thr Val His Ser Ser Lys Ala Val Lys Pro Glu Tyr Gly

1 5 10 15

Ala Cys Gly Leu Ala Pro Gly Cys Thr Ala Asp Val Val Pro Leu Thr

20 25 30

Val Leu Asp Lys Ala Asn Phe Asp Thr Tyr Ile Ser Val Ile Tyr Ala

35 40 45

Phe His Ala Pro Ala Pro Pro Asn Ala Val Leu Glu Ala Gly Leu Gly

50 55 60

Arg Ala Leu Val Asp Tyr Arg Glu Trp Ala Gly Arg Leu Gly Val Asp

65 70 75 80

Ala Ser Gly Gly Arg Ala Ile Leu Leu Asn Asp Ala Gly Ala Arg Phe

85 90 95

Val Glu Ala Thr Ala Asp Val Ala Leu Asp Ser Val Met Pro Leu Lys

100 105 110

Pro Thr Ser Glu Val Leu Ser Leu His Pro Ser Gly Asp Asp Gly Pro

115 120 125

Glu Glu Leu Met Leu Ile Gln Val Thr Arg Phe Ala Cys Gly Ser Leu

130 135 140

Val Val Gly Phe Thr Thr Gln His Ile Val Ser Asp Gly Arg Ser Thr

145 150 155 160

Gly Asn Phe Phe Val Ala Trp Ser Gln Ala Thr Arg Gly Ala Ala Ile

165 170 175

Asp Pro Val Pro Val His Asp Arg Ala Ser Phe Phe His Pro Arg Glu

180 185 190

Pro Leu His Val Glu Tyr Glu His Arg Gly Val Glu Phe Lys Pro Tyr

195 200 205

Glu Lys Ala His Asp Val Val Cys Gly Ala Asp Gly Asp Glu Asp Glu

210 215 220

Val Val Val Asn Lys Val His Phe Ser Arg Glu Phe Ile Ser Lys Leu

225 230 235 240

Lys Ala Gln Ala Ser Ala Gly Ala Pro Arg Pro Cys Ser Thr Leu Gln

245 250 255

Cys Val Val Ala His Leu Trp Arg Ser Met Thr Met Ala Arg Gly Leu

260 265 270

Asp Gly Gly Glu Thr Thr Ser Val Ala Ile Ala Val Asp Gly Arg Ala

275 280 285

Arg Met Ser Pro Gln Val Pro Asp Gly Tyr Thr Gly Asn Val Ile Leu

290 295 300

Trp Ala Arg Pro Thr Thr Thr Ala Gly Glu Leu Val Thr Arg Pro Val

305 310 315 320

Lys His Ala Val Glu Leu Ile Ser Arg Glu Val Ala Arg Ile Asn Asp

325 330 335

Gly Tyr Phe Lys Ser Phe Ile Asp Phe Ala Asn Ser Gly Ala Val Glu

340 345 350

Lys Glu Arg Leu Val Ala Thr Ala Asp Ala Ala Asp Met Val Leu Ser

355 360 365

Pro Asn Ile Glu Val Asp Ser Trp Leu Arg Ile Pro Phe Tyr Asp Met

370 375 380

Asp Phe Gly Gly Gly Arg Pro Phe Phe Phe Met Pro Ser Tyr Leu Pro

385 390 395 400

Val Glu Gly Leu Leu Ile Leu Leu Pro Ser Phe Leu Gly Asp Gly Ser

405 410 415

Val Asp Ala Tyr Val Pro Leu Phe Ser Arg Asp Met Asn Thr Phe Lys

420 425 430

Asn Cys Cys Tyr Ser Leu Asp

435

Claims

1.一种基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；优选地，所述重组载体是重组pGEX-6P-1。

3.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2所述的重组载体；优选地，所述重组菌为Transetta(DE3)。

4.一种蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种制备权利要求4所述蛋白的方法，其特征在于：它是采用权利要求4所述重组菌发酵制备。

6.根据权利要求5所述的的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取权利要求3所述重组菌，活化，得菌液；

(3)破菌，离心，取上清，纯化，即可。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：步骤(1)中，所述菌液的浓度为1×10⁶～10⁷cfu/ml；优选地，所述活化是采用含有Amp的LB培养基培养培养，培养时间是6-10小时，培养温度为37℃；

和/或，步骤(3)中，所述分离纯化的方法为GST标签融合蛋白纯化方法；优选地，所述纯化方法为：取上清，上树脂柱，穿流2次；采用Lysis buffer冲洗树脂去除杂蛋白；用15mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脱，得蛋白；进一步优选地，所述树脂是Glutathione SepharoseTM4B树脂；所述还原型谷胱甘肽溶液是还原型谷胱甘肽溶于Lysis buffer得到的溶液。

8.一种生产阿魏酰色胺的转基因植物的构建方法，其特征在于：取权利要求1所述的基因片段，转入植物中，获得表达权利要求4所述蛋白的植株，即可。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种；所述植物为烟草。

10.权利要求1～3所述的基因片段、重组载体、重组菌在制备高产阿魏酰色胺青稞品种的用途。