WO2021106453A1 - 組換えc反応性タンパク質 - Google Patents
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- G01N2333/4737—C-reactive protein
Definitions
- CRP is a protein that shows a precipitation reaction with C-polysaccharide in the capsule of Streptococcus pneumoniae, and is also known as a typical inflammatory marker because it is a kind of acute phase protein.
- infectious diseases and inflammatory diseases the blood concentration of CRP increases remarkably, and the condition rapidly decreases as the condition recovers. Therefore, the quantification of CRP is used when determining the severity of various diseases and observing the course of treatment. It becomes an index of.
- the blood CRP concentration of a healthy person is generally 0.3 mg / dL or less, but in the case of a patient with inflammation or an inflammatory disease, the CRP concentration rapidly increases hundreds to thousands of times in a short time. Therefore, in the measurement of CRP in a sample, it is required to accurately measure CRP having a wide range of concentrations from low concentration to high concentration.
- Natural CRP purified from human body fluids such as ascites is used for the above-mentioned calibrator and controlled serum, but there is a risk that serum components other than CRP may be mixed in and affect the measurement of blood CRP concentration. ..
- human body fluids which are raw materials for living organisms, are handled at the stage of isolation and purification of CRP, there is a risk of pathogenic secondary infection, and there is also a problem in manufacturing safety.
- the CRP content in human body fluids varies, and there is a problem from the aspect of stable supply.
- recombinant CRP using microorganisms does not use human body fluid as a raw material, so there is no risk of contamination with human-derived serum components or secondary infection. Therefore, stable expression of recombinant protein by genetic engineering technology If a system can be constructed, the target protein can be stably supplied.
- Patent Document 1 Non-Patent Document 1
- the measured value is detected at a lower value than the actual CRP concentration in the CRP high concentration range. Therefore, in order to use recombinant CRP as a diagnostic agent raw material for calibrators, controlled sera, etc., it is necessary to improve the accuracy of measurement in the high concentration range of CRP.
- Non-Patent Document 1 TOSHIO TANAKA et al. , BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN. , 295 (2002), p163-166
- Non-Patent Document 2 Clinical Examination, Vol. 46, No. 9, p973-981 (September 2002)
- An object of the present invention is to improve the accuracy of measurement in a high CRP concentration range, particularly when the latex immunoturbidimetry method is used.
- Item 1 A C-reactive protein produced by genetic recombination, wherein 55% or more of the N-terminal of the C-reactive protein is pyroglutamylated.
- Item 2. The recombinant C-reactive protein according to Item 1, wherein 65% or more of the C-reactive protein has an N-terminal pyroglutamylated.
- Item 3. The recombinant C-reactive protein according to Item 1, wherein the N-terminal of 75% or more of the C-reactive protein is polyglutamylated.
- Item 4. Item 2.
- the recombinant C-reactive protein according to Item 1 wherein 85% or more of the C-reactive protein has the N-terminal pyroglutamylated.
- Item 5. Item 2. The recombinant C-reactive protein according to any one of Items 1 to 4, wherein the recombinant C-reactive protein is a recombinant protein produced by a bacterium.
- Item 6. Item 5. The recombinant C-reactive protein according to Item 5, wherein the bacterium is Escherichia coli.
- Item 8. Item 4.
- the recombinant C-reactive protein according to any one of Items 1 to 7, wherein the C-reactive protein comprises any of the following polypeptides (a) to (c).
- an amino acid sequence consisting of an added amino acid sequence and having antigenicity to an anti-C reactive protein antibody (c) having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- Polypeptide consisting of and having antigenicity to an anti-C reactive protein antibody is described in any one of Items 1 to 7, wherein the C-reactive protein comprises any of the following polypeptides (a) to (c).
- the recombinant CRP of the present invention can improve the accuracy of measurement in a high concentration range of CRP by the latex immunoturbidimetry method, and is useful as a raw material for a diagnostic agent used for controlled serum or a calibrator.
- One of the embodiments of the present invention is a CRP composed of any of the following polypeptides (a) to (c).
- A The polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- B An anti-C reactive protein antibody consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- C A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and having antigenicity to an anti-C reactive protein antibody.
- SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence of mature CRP consisting of 206 amino acids.
- an appropriate secretory signal suitable for the host may be given, and the amino acid sequence in that case is SEQ ID NO: 3 or the sequence. As shown in number 4, it consists of 227 amino acids in total length.
- the 206 amino acids from the 22nd position to the 227th position correspond to the mature CRP of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the amino acids from the methionine to the 21st position are the amino acid sequences of the secretory signal.
- the secretory signal may be deleted.
- the recombinant CRP of the present invention is not limited to (a) above.
- B An anti-C reactive protein antibody consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
- C A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and having antigenicity to an anti-C reactive protein antibody. It may be.
- the lower limit of "several" is two.
- the upper limit is not limited as long as the antigenicity to the anti-C reactive protein antibody is maintained, but it must be within a range that does not significantly impair the protein conformation of the amino acid residue and the antigenicity to the anti-C reactive protein antibody. ..
- a number corresponding to less than 20% of the total amino acids preferably a number corresponding to less than 15%, more preferably a number corresponding to less than 10%, still more preferably a number corresponding to less than 5%, still more preferably. It is a number corresponding to less than 1%.
- the number is, for example, 41 or less, preferably 31 or less, more preferably 21 or less, still more preferably 10 or less, still more preferably 5 or less, still more preferably 4 or less, still more preferably. 3 or less.
- Amino acid sequence identity can be calculated using commercially available or analysis tools available through telecommunication lines (Internet).
- the identity is calculated by selecting blastp on the website of BLAST, which is a homology search program published by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and using the default parameters. ..
- Whether or not a certain polypeptide has antigenicity to an anti-C-reactive protein antibody is determined by whether or not the latex particle agglutination reaction occurs in the "method for measuring the concentration of C-reactive protein" described later and the CRP concentration can be measured. ..
- Variants of proteins having antigenicity to anti-C reactive protein antibodies and their genes are described, for example, in Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; Stratagen, QuickChangeSiteProcess Mutagenesis Kit; It can be obtained by modifying the base sequence encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by using a commercially available kit such as Toyo Boseki or a PCR method.
- the antigenicity of the protein encoded by the obtained gene is, for example, the obtained gene is introduced into Escherichia coli to prepare a transformant, and this transformant is cultured to generate a protein, and this transformant is produced.
- the cell disruption solution of this transformant or the purified protein can be confirmed by measuring with the "C-reactive protein concentration measuring method" described later.
- DNA of C-reactive protein examples include DNA encoding CRP derived from mammals such as humans, dogs, cats, mice, rats, rabbits, and goats. Among them, DNA encoding CRP derived from humans, dogs or cats is more preferable, and DNA encoding CRP derived from humans is more preferable.
- One of the embodiments of the present invention is a CRP composed of any of the following DNAs (d) to (f).
- D DNA encoding the amino acid sequence of any of the above CRPs (a) to (c)
- E DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6
- F In the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, one or several bases consist of a base sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and an antigen against an anti-C reactive protein antibody.
- DNA encoding a polypeptide having sex A DNA encoding a polypeptide having a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 and having antigenicity to an anti-C reactive protein antibody.
- the amino acid sequence of CRP of the present invention is the amino acid sequence of CRP shown in any of the above (a) to (c).
- the selection thereof is not particularly limited.
- SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 is the total length of CRP represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 described above, in which 206 amino acids from position 22 to position 227 are mature CRP and from methionine to position 21. It encodes the part corresponding to the secretory signal.
- the lower limit of "several" is two.
- the upper limit is not limited as long as the antigenicity of the polypeptide encoded by the DNA to the anti-C reactive protein antibody is maintained, but the three-dimensional structure of the protein of the amino acid residue and the antigenicity to the anti-C reactive protein antibody are limited.
- the number is, for example, 124 or less (the number of bases corresponding to 20% of all amino acids), preferably 93 or less (15%), more preferably 62 or less (10%), and more preferably. 31 or less (5%), more preferably 20 or less, more preferably 15 or less, more preferably 10 or less, more preferably 5 or less, more preferably 4 or less, still more preferably 3 or less. ..
- the identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 is preferably 80% or more. It is more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more.
- Nucleotide sequence identity can be calculated using commercially available or analysis tools available through telecommunication lines (Internet). In the present invention, the identity is calculated by selecting blastn on the website of BLAST, which is a homology search program published by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and using the default (default setting) parameters. To do.
- BLAST is a homology search program published by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and using the default (default setting) parameters. To do.
- Whether or not a DNA encodes a polypeptide having antigenicity against an anti-C-reactive protein antibody can be determined by incorporating the DNA into a commercially available expression vector and expressing it in a suitable host.
- the antigenicity to the anti-C-reactive protein antibody can be determined by whether or not the agglutination reaction of latex particles occurs in the "method for measuring the concentration of C-reactive protein" described later and the CRP concentration can be measured.
- Another embodiment of the present invention is a method for producing a vector incorporating the above-mentioned DNA, a transformant containing the vector, or a recombinant CRP comprising culturing the transformant.
- the gene is inserted into an appropriate vector to prepare a recombinant vector, and an appropriate host cell is transformed with this recombinant vector to prepare a transformant, and this transformant is prepared. Can be easily carried out by culturing.
- the host cell is not particularly limited as long as it has an established recombinant expression system, but is preferably a microorganism such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycete, aspergillus, yeast, insect cell, animal cell, higher plant, etc. Can be mentioned. Microorganisms are more preferable, and Escherichia coli (for example, K12 strain, B strain, etc.) is particularly preferable.
- the preparation of the transformant is not particularly limited, but may be carried out according to a conventional method.
- Escherichia coli Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli JM109, Escherichia coli BL21, etc. are used, and as vectors, pBR322, pUC19, pBluescript, pQE, pET, etc. are examples. Is listed as.
- yeast Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Candida utilis, Pichia pastoris, etc.
- Examples of the vector include pAUR101, pAUR224, pYE32.
- the host is a filamentous fungus, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, and the like can be exemplified.
- Methods that utilize differences in molecular weight such as gel electrophoresis (SDS-PAGE), methods that utilize charges such as ion exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography, and specific affinitys such as affinity chromatography using a phosphorylcholine-immobilized column.
- SDS-PAGE gel electrophoresis
- methods that utilize charges such as ion exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography, and specific affinitys such as affinity chromatography using a phosphorylcholine-immobilized column.
- Examples include, but are not limited to, a method utilizing sex, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse-phase high-speed liquid chromatography, and a method utilizing a difference in isoelectric focusing such as isoelectric focusing.
- the recombinant CRP of the present invention is a recombinant CRP in which 55% or more of the entire N-terminal is pyroglutamylated, and specifically, the recombinant CRP calculated to have an N-terminal cyclization rate of 55% or more. Is.
- the "N-terminal cyclization rate” is an index indicating the ratio of recombinant CRP in which the N-terminal of the recombinant CRP is pyroglutamylated, and is described later as "N-terminal of C-reactive protein". It is calculated according to the cyclization rate measurement method.
- the N-terminal cyclization rate is 55% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, and more of the recombinant CRP when measured by the "method for measuring the N-terminal cyclization rate of C-reactive protein" described later.
- Retaining preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more. It is desirable to be there.
- the "N-terminal” is the N-terminal of the mature CRP from which the secretory signal sequence has been removed, and specifically, the 1-position (specifically, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2). Or, glutamine at the 22nd position of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4) or glutamine at the 1st position after causing an intramolecular condensation reaction. Glutamine at the 1-position is converted to pyroglutamic acid by subjecting it to a cyclization treatment.
- the non-enzymatic method it is necessary to set the type of buffer solution, pH, treatment temperature, treatment time, CRP concentration, etc., but it does not adversely affect CRP, uncyclized CRP and cyclized CRP.
- the conditions may be sufficient, and the conditions are not particularly limited. An example is shown below.
- the buffer solution used for the cyclization treatment examples include good buffer solutions such as acetate buffer solution, MES buffer solution and PIPES buffer solution, phosphate buffer solution, Tris-HCl buffer solution, borate buffer solution and glycine buffer solution. Will be done.
- the pH condition is preferably in the range of pH 7 to pH 12, and more preferably pH 7 to pH 10.
- the temperature condition is preferably 4 ° C. to 55 ° C., more preferably 37 ° C. to 50 ° C.
- the CRP concentration is preferably 0.1 mg / dL to 500 mg / dL, more preferably 10 mg / dL to 300 mg / dL.
- the reaction time is preferably 30 minutes to 4 weeks, more preferably 16 hours to 3 weeks.
- the CRP concentration measurement is performed under the following conditions.
- the latex particles on which the anti-C reactive protein antibody is immobilized and the CRP (test substance) in the test sample cause an antigen-antibody reaction, and the CRP concentration is determined from the degree of agglutination reaction of the latex particles. Is a method of measuring.
- the term "CRP concentration" in the present invention specifically means a value measured by the following method unless otherwise specified.
- ⁇ Reagent> ⁇ Denka Seiken CRP Latex X2 "Seiken” R1 reagent (buffer) ⁇ Denka Seiken CRP Latex X2 "Seken” R2 Reagent (Latex (anti-human CRP polyclonal antibody (rabbit) bound latex) suspension) ⁇ CRPX2 standard solution H manufactured by Denka Seiken Co., Ltd.
- the dilution ratio is determined based on the protein concentration priced in the Bradford protein assay.
- the CRP concentration (mg / dL) in the sample is measured using the Hitachi 7180 automatic analyzer under the following conditions for the above-mentioned measurement sample, the above-mentioned R1 reagent, and the above-mentioned R2 reagent.
- the CRP concentration is calculated by the formula (I).
- Measurement method 2-point end method (18-34) Main wavelength: 546 nm
- Sub-wavelength 800 nm
- the N-terminal cyclization rate of recombinant CRP is measured under the following conditions.
- the ten-valent ionic strengths of the spectrum of uncyclized CRP and the spectrum of cyclized CRP are measured by mass spectrometry, and the ratio of uncyclized CRP to cyclized CRP is calculated from each ionic strength. It is a calculation method.
- the “spectrum of uncyclized CRP” refers to the spectrum corresponding to the molecular weight 23045
- the “spectrum of the cyclized CRP” refers to the spectrum corresponding to the molecular weight 23027.
- the term "N-terminal cyclization rate of CRP" specifically means a value measured by the following method unless otherwise specified.
- the measurement sample is a CRP solution, which is used after being diluted with ultrapure water if necessary.
- ⁇ Measurement method> The spectrum of uncyclized CRP and the spectrum of cyclized CRP in the sample are measured using an LC / MS apparatus under the following conditions.
- Example 1 Introduction of mutation and acquisition of transformant
- SEQ ID NO: 7 in which an Escherichia coli-derived alkaline phosphatase secretion signal sequence (ATGAAACAAAAGCACTATTTGCACTGGCACTCTTACGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC) and a human-derived mature CRP sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 are ligated.
- the CRP gene was amplified using the artificially synthesized gene of SEQ ID NO: 8 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10.
- SEQ ID NO: 9 is a forward primer
- SEQ ID NO: 10 is a reverse primer.
- restriction enzyme site NdeI and the restriction enzyme site BamHI are added to this primer, respectively.
- a plasmid was constructed by incubating the amplified gene fragment with the vector plasmids pBluescript KSN (+) and In-Fusion Reaction Mix (manufactured by Takara Bio Inc.) cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI. In this way, a recombinant plasmid pBKSN_CRP1 containing SEQ ID NO: 7 and a recombinant plasmid pBKSN_CRP2 containing SEQ ID NO: 8 were obtained, which were designed so that the CRP gene could be expressed in a large amount.
- Example 2 Expression of CRP gene in Escherichia collie
- the colony of the transformant Escherichia collie JM109 (pBKSN_CRP1) obtained in Example 1 was sterilized in vitro in 5 mL of LB liquid medium (glucose 1.0%, Ampicillin (containing 100 ⁇ g / mL) was inoculated and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
- the obtained culture broth was used as a seed culture broth and contained 500 mL of LB liquid medium (0.5% glycerol, 0.05% calcium chloride, 1 mM IPTG, 50 ⁇ g / mL ampicillin) in 10 2 L Sakaguchi flasks. ), And cultured at 30 ° C.
- Example 3 Purification of recombinant CRP
- the crude purified solution 1 obtained in Example 2 was subjected to affinity purification using PierceTM p-Aminophenyl Phospholine Agarose (manufactured by Thermo SCIENTIFIC).
- the resin equilibrated with the buffer solution 20 mM Tris-HCl buffer (0.14 M sodium chloride, 2 mM calcium chloride, pH 7.5) used in Example 2 was mixed with a crude solution and adsorbed.
- Recombinant CRP solution 1 was obtained by washing with the above buffer and eluting with 20 mM Tris-HCl buffer (0.14 M sodium chloride, 2 mM EDTA 2 mM, pH 7.5).
- This solution was further replaced with the buffer solution 20 mM Tris-HCl buffer (0.14 M sodium chloride, 2 mM calcium chloride, pH 7.5) used in Example 2 while removing EDTA by water concentration using a hollow fiber membrane. Then, it was further concentrated to an appropriate concentration with a centrifugal ultrafiltration filter (manufactured by Merck) to obtain a highly pure recombinant CRP1.
- the result of performing SDS-PAGE using the obtained recombinant CRP1 is shown in FIG.
- a highly pure recombinant CRP2 was also obtained from the crude purified solution 2 by the same method as described above.
- the results of SDS-PAGE of the obtained CRP2 are shown in FIG. Similar to CRP1, we succeeded in improving the purity of impure protein to a level undetectable by SDS-PAGE.
- Example 4 N-terminal cyclization treatment of recombinant CRP
- the recombinant CRP1 obtained in Example 3 was heated at 37 ° C. for 8 days, and the N-terminal of the recombinant CRP was cyclized by pyroglutamylation.
- a modified recombinant CRP1 was obtained.
- the buffer solution 20 mM Tris-HCl buffer (0.14 M sodium chloride, 2 mM calcium chloride, pH 7.5) used in Example 2 was used, and the CRP concentration was 300 mg / dL.
- the cyclized recombinant CRP2 was obtained from the recombinant CRP2 by the same method as described above.
- Example 5 Measurement of N-terminal cyclization rate Recombinant CRP1 and recombinant CRP2 obtained in Example 3, cyclized recombinant CRP1 and cyclized recombinant CRP2 obtained in Example 4, and as a positive control.
- Table 1 In the mass spectrum of each sample of the recombinant CRP1, an enlarged version of the average 10-valent ion having an elution time of 1.7 to 2.0 minutes is shown in FIG.
- M / z 2305.45 shows the spectrum of uncyclized CRP
- m / z 2303.74 shows the spectrum of cyclized CRP.
- the spectrum of cyclized CRP was prominently shown.
- the spectrum of the uncyclized CRP was higher than the spectrum of the cyclized CRP.
- the cyclized recombinant CRP1 obtained in Example 4 it was shown that the spectrum of the cyclized CRP was clearly higher than the spectrum of the uncyclized CRP. It was shown that the N-terminal cyclization treatment of Example 4 promoted the pyroglutamylation of CRP. Similar results were obtained with recombinant CRP2 and cyclized recombinant CRP2 as shown in FIG.
- Table 2 shows the N-terminal cyclization rates of recombinant CRP1, cyclized recombinant CRP1 and natural human CRP.
- the N-terminal cyclization rate is 95%, and it is shown that 95% of the total is cyclized CRP.
- the N-terminal cyclization rate is 40% and the cyclized CRP is less than half of the total.
- the cyclized recombinant CRP1 and the cyclized recombinant CRP2 obtained in Example 4 had an N-terminal cyclization rate of 42% on the first day of heating and an N-terminal ring on the third day of heating.
- the cyclization rate was 54%, the N-terminal cyclization rate was 67% on the 6th day of heating, and the N-terminal cyclization rate was 78% on the 8th day of heating. It was shown that the proportion tends to increase.
- Example 6 Measurement of CRP concentration with latex reagent
- Bovine serum albumin (manufactured by Sigma) was diluted with ultrapure water to 0.1, 0.2, 0.4, and 0.75 mg / mL to prepare a standard solution. .. 600 ⁇ L of protein assay concentrated dye reagent (manufactured by BioRad) and 2.4 mL of ultrapure water were added to 60 ⁇ L of each standard solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then the absorbance at 595 nm was measured. A calibration curve was prepared from the above-mentioned measured absorbance at 595 nm and bovine serum albumin concentration.
- the recombinant CRP1 and the recombinant CRP2 obtained in Example 3, the cyclized recombinant CRP1 and the cyclized recombinant CRP2 obtained in Example 4, and the natural human CRP are placed in ultrapure water and are suitable. It was diluted to a concentration, prepared under the same reagents and conditions as the standard solution, and the absorbance at 595 nm was measured. From the measured values of various CRPs, the protein concentration was calculated from the above-mentioned calibration curve.
- the buffer solution of CRP-latex X2 manufactured by Denka Seiken was used as the first reagent, and the anti-human CRP polyclonal antibody (rabbit) -bound latex suspension solution was used as the second reagent, and the first reagent and the second reagent were used.
- the reagents were combined and the formation of CRP concentration-dependent particle agglomerates was measured using a Hitachi 7180 automatic analyzer. Specifically, 120 ⁇ L of the first reagent was added to 2.2 ⁇ L of each of the CRP solutions, the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 120 ⁇ L of the second reagent was added and stirred. After that, the change in absorbance ( ⁇ mAbs) accompanying the formation of agglutination for 5 minutes was measured at a main wavelength of 546 nm and a sub-wavelength of 800 nm.
- the CRP of the present invention is particularly useful in the fields of medicine and diagnosis as a diagnostic agent raw material used for a latex reagent in which CRP has excellent reactivity in a high concentration range.
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Abstract
ラテックス試薬を用いた免疫測定において、CRP高濃度域における免疫測定の正確性を向上させる。 遺伝子組換えにより生産されたC反応性タンパク質であって、該C反応性タンパク質の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えC反応性タンパク質。
Description
本発明は、遺伝子組換え技術により生産されたC反応性タンパク質(C-reactive protein;以下、「CRP」とも示す。)及びその用途に関する。より詳細には、CRPのN末端構造を変換された組換えCRP、及び、当該組換えCRPを用いたキャリブレーター、管理血清、及び、抗体抗原反応によるCRPの定量方法に関する。
CRPは肺炎球菌の莢膜のC多糖体と沈降反応を示すタンパク質であり、また急性期タンパク質の一種であることから代表的な炎症マーカーとしても知られている。感染症や炎症性疾患において、CRPの血中濃度は著しく増加し、また病状が回復に伴い急激に減少することから、CRPの定量は種々の疾患の重症度の判定、治療経過の観察の際の指標となる。健常人の血中のCRP濃度は、一般に0.3mg/dL以下であるが、炎症や炎症性疾患の患者の場合は、短時間で数百から数千倍にも急増する。このため、検体中のCRP測定において、低濃度から高濃度まで広範囲の濃度のCRPを正確に測定することが求められている。
臨床検査分野における血中CRP濃度の定量法として、抗原抗体反応を利用した測定方法があり、酵素免疫測定法、発光免疫測定法、ラテックス免疫比濁法、イムノクロマトグラフィー法等が知られている。特に、これらの測定方法のうち、ラテックス免疫比濁法が、操作が簡便かつ分析装置による測定の自動化が可能なことから日常検査に広く利用されている。ラテックス免疫比濁法では、濃度既知のキャリブレーターを用いた検量線から血中CRP濃度を定量し、またその検量線の正確性は管理血清の測定により担保される。
上述のキャリブレーター及び管理血清には、腹水等のヒト体液から精製された天然型CRPが使用されているが、CRP以外の血清成分が混入し、血中CRP濃度の測定に影響を及ぼすリスクがある。また、CRPの単離、精製の段階で、生体原料となるヒト体液を取り扱うことから、病原性の二次感染のリスクもあり、製造における安全性にも課題がある。さらには、ヒト体液中のCRP含有量にはバラつきがあり、安定供給の側面からも問題がある。一方、微生物等を利用した組換えCRPは、ヒト体液を原料としないため、ヒト由来の血清成分の混入や二次感染のリスクがないことから、遺伝子工学技術による組換えタンパク質の安定的な発現システムを構築することができれば、目的のタンパク質を安定供給することができる。
微生物による組換えCRPの発現に関しては、大腸菌や酵母等で成功例が既に報告されている(特許文献1,非特許文献1)。しかし、ラテックス免疫比濁法による組換えCRP濃度の測定において、CRP高濃度域で実際のCRP濃度より測定値が低値で検出されるという問題があった。従って、キャリブレーターや管理血清等に組換えCRPを診断薬原料として使用するには、CRP高濃度域における測定の正確性を向上させる必要がある。
多くのタンパク質は翻訳後修飾により、化学的特性または構造的変換が起こる。翻訳後修飾の一つとして、グルタミンもしくはグルタミン酸のカルボキシル基とアミノ基が分子内縮合反応を起こすことによりピログルタミン酸に変換される、ピログルタミル化がある。動植物はピログルタミル化により修飾されたピログルタミルペプチドを多数保有しており、β―アミロイドやコラーゲン、IgG2等のタンパク質が存在する。CRPもピログルタミルペプチドである。しかしながら、組換えCRPにはN末端がグルタミンのままのものと、ピログルタミル酸に変換されたものが混在していることが報告されている(非特許文献2)。このようなCRPのN末端構造とラテックス免疫比濁法における抗体抗原反応との関係性については、これまでに報告されていない。
特許文献1:特開2000-14388号公報
非特許文献1:TOSHIO TANAKA et al.,BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN.,295(2002),p163-166
非特許文献2:臨床検査,Vol.46,No.9,p973-981(2002年9月)
非特許文献2:臨床検査,Vol.46,No.9,p973-981(2002年9月)
本発明の課題は、特にラテックス免疫比濁法を用いた場合に、CRP高濃度域における測定の正確性を向上させることにある。
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、組換えCRPのN末端構造を変換することによって、上記課題を克服する方法を見出した。具体的には、インタクトMSにより測定して、全体の55%以上のN末端がピログルタミル化された組換えCRPを用いることで、CRP高濃度域におけるCRP濃度を正確に測定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の具体的な態様としては、以下に示す通りである。
項1.遺伝子組換えにより生産されたC反応性タンパク質であって、該C反応性タンパク質の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えC反応性タンパク質。
項2.該C反応性タンパク質の65%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項3.該C反応性タンパク質の75%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項4.該C反応性タンパク質の85%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項5.組換えC反応性タンパク質が、細菌による組換えタンパク質である、項1から4のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
項6.細菌が大腸菌である項5に記載の組換えC反応性タンパク質。
項7.C反応性タンパク質がヒト由来である、項1から6のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
項8.C反応性タンパク質が、下記の(a)から(c)のいずれかのポリペプチドからなる、項1から7のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
(a)配列番号1または配列番号2に記載されたポリペプチド
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド
項9.項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーター。
項10.項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含む管理血清項11.項9に記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーターを用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
項12.項10に記載のC反応性タンパク質を含む管理血清を用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
項13.抗C反応性タンパク質抗体が固定化されたラテックス粒子を用いた、ラテックス免疫比濁法により、項11または12に記載の検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
項1.遺伝子組換えにより生産されたC反応性タンパク質であって、該C反応性タンパク質の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えC反応性タンパク質。
項2.該C反応性タンパク質の65%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項3.該C反応性タンパク質の75%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項4.該C反応性タンパク質の85%以上のN末端がピログルタミル化されている、項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
項5.組換えC反応性タンパク質が、細菌による組換えタンパク質である、項1から4のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
項6.細菌が大腸菌である項5に記載の組換えC反応性タンパク質。
項7.C反応性タンパク質がヒト由来である、項1から6のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
項8.C反応性タンパク質が、下記の(a)から(c)のいずれかのポリペプチドからなる、項1から7のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
(a)配列番号1または配列番号2に記載されたポリペプチド
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド
項9.項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーター。
項10.項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含む管理血清項11.項9に記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーターを用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
項12.項10に記載のC反応性タンパク質を含む管理血清を用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
項13.抗C反応性タンパク質抗体が固定化されたラテックス粒子を用いた、ラテックス免疫比濁法により、項11または12に記載の検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
本発明の組換えCRPは、ラテックス免疫比濁法によるCRP高濃度域における測定の正確性を向上させることができ、管理血清あるいはキャリブレーターに用いる診断薬用原料として有用である。
(C反応性タンパク質のポリペプチド)
本発明の組換えCRPは、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどに哺乳類に由来するCRPが挙げられる。その中でも、ヒト、イヌ又はネコ由来のCRPがより好ましく、さらにはヒト由来のCRPが特に好ましい。
本発明の組換えCRPは、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどに哺乳類に由来するCRPが挙げられる。その中でも、ヒト、イヌ又はネコ由来のCRPがより好ましく、さらにはヒト由来のCRPが特に好ましい。
本発明の実施形態の一つは、下記の(a)~(c)のいずれかのポリペプチドからなるCRPである。
(a)配列番号1または配列番号2に記載されたポリペプチド。
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
(a)配列番号1または配列番号2に記載されたポリペプチド。
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド。
上記(a)のポリペプチドにおいて、配列番号1または配列番号2は206アミノ酸からなる成熟型CRPのアミノ酸配列である。本発明の組換えCRPを、グラム陰性菌等で菌体外に発現させる場合には、宿主に合わせた適当な分泌シグナルを付与してもよく、その場合のアミノ酸配列は、配列番号3または配列番号4に示すように、全長で227アミノ酸からなる。この中で、22位から227位までの206アミノ酸は配列番号1または配列番号2の成熟型CRPに相当し、メチオニンから21位までは分泌シグナルのアミノ酸配列である。本発明の組換えCRPを菌体内で発現させる場合には、分泌シグナルを削除してもよい。
本発明の組換えCRPは、上記(a)に限定されるのではなく、
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド、または、
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド、
であってもよい。
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド、または、
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド、
であってもよい。
上記(b)のポリペプチドにおいて「数個」の下限は2個である。上限は抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性が維持される限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を大きく損なわない範囲である必要がある。例えば、全アミノ酸の20%未満に相当する数であり、好ましくは15%未満に相当する数、さらに好ましくは10%未満に相当する数、さらに好ましくは5%未満に相当する数、さらに好ましくは1%未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、41個以下、好ましくは31個以下、さらに好ましくは21個以下、さらに好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下、さらに好ましくは4個以下、さらに好ましく3個以下である。
上記(c)のポリペプチドにおいて、上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性は80%以上であることが好ましい。この同一性は、好ましくは85%以上であり、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が公開している相同性検索プログラムであるBLASTのウェブサイトにおいてblastpを選択しデフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
あるポリペプチドが抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するかどうかは、後述の「C反応性タンパク質の濃度測定方法」においてラテックス粒子の凝集反応が起こり、CRP濃度が測定できるかどうかで判断する。
抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するタンパク質の改変体及びその遺伝子は、例えばTransformerMutagenesis Kit;Clonetech製、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製、KOD-Plus-Mutagenesis Kit;東洋紡製などの市販のキットやPCR法を利用して、配列番号1または配列番号2に記載のアミノ酸をコードする塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養してタンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製したタンパク質を、後述の「C反応性タンパク質の濃度測定方法」で測定することによって確認することができる。
(C反応性タンパク質のDNA)
本発明の組換えCRPをコードするDNAは、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどに哺乳類に由来するCRPをコードするDNAが挙げられる。その中でも、ヒト、イヌ又はネコ由来のCRPをコードするDNAがより好ましく、さらにはヒト由来のCRPをコードするDNAが好ましい。
本発明の組換えCRPをコードするDNAは、例えばヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどに哺乳類に由来するCRPをコードするDNAが挙げられる。その中でも、ヒト、イヌ又はネコ由来のCRPをコードするDNAがより好ましく、さらにはヒト由来のCRPをコードするDNAが好ましい。
本発明の実施形態の一つは、下記の(d)~(f)のいずれかのDNAからなるCRPである。
(d)上記(a)から(c)のいずれかのCRPのアミノ酸配列をコードするDNA
(e)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(f)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA
(g)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(d)上記(a)から(c)のいずれかのCRPのアミノ酸配列をコードするDNA
(e)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列からなるDNA
(f)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA
(g)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA。
上記(d)のDNAにおいて、本発明のCRPのアミノ酸配列は、上記の(a)~(c)のいずれかに示されるCRPのアミノ酸配列である。本発明のDNAでは、前記アミノ酸配列における各アミノ酸に対応するコドンが複数ある場合は、その選択には特に制限はない。具体的には、(e)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列からなるDNAが例示される。
なお、上述したように分泌シグナル配列を付与させる場合には、配列番号7または配列番号8に示されるDNAを用いるのがよい。配列番号7または配列番号8は、上述の配列番号3または配列番号4のアミノ酸配列で示されるCRPの全長における、22位から227位までの206アミノ酸は成熟型CRPと、メチオニンから21位までの分泌シグナルに相当する部分をコードしている。
また、本発明のDNAは、上記のものに限定されるのではなく、
(f)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA、または、
(g)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA、
であってもよい。
(f)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加した塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA、または、
(g)配列番号5または配列番号6に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA、
であってもよい。
また、本発明のCRPをコードするDNAを、大腸菌等の由来生物以外の宿主に組込んで、本発明のCRPを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更してもよい。
上記(f)のDNAにおいて、「数個」の下限は2個である。上限は、そのDNAがコードするポリペプチドの抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性が維持されている限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を大きく損なわない範囲である必要がある。例えば、改変前のポリペプチドの全アミノ酸の20%未満に相当する数であり、好ましくは15%未満に相当する数、さらに好ましくは10%未満に相当する数、さらに好ましくは5%未満に相当する数、さらに好ましくは1%未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、124個以下(全アミノ酸の20%に相当する塩基数)、好ましくは93個以下(15%)、より好ましくは62個以下(10%)、より好ましくは31個以下(5%)、より好ましくは20個以下、より好ましくは15個以下、より好ましくは10個以下、より好ましくは5個以下、より好ましくは4個以下、さらに好ましく3個以下である。
上記(g)のDNAにおいて、配列番号5または配列番号6に示される塩基配列との同一性は80%以上であることが好ましい。より好ましくは85%以上であり、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上である。
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が公開している相同性検索プログラムであるBLASTのウェブサイトにおいてblastnを選択し、デフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
あるDNAが、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチドをコードしているかどうかは、そのDNAを、市販の発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、得られたポリペプチドの抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を後述の「C反応性タンパク質の濃度測定方法」においてラテックス粒子の凝集反応が起こり、CRP濃度が測定できるかどうかにより判断することができる。
(C反応性タンパク質の製造方法)
本発明の別の実施形態は、上記のDNAを組み込んだベクター、該ベクターを含む形質転換体、または、該形質転換体を培養することを含む組換えCRPを製造する方法である。本発明の組換えCRPは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
本発明の別の実施形態は、上記のDNAを組み込んだベクター、該ベクターを含む形質転換体、または、該形質転換体を培養することを含む組換えCRPを製造する方法である。本発明の組換えCRPは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
ベクターとしては、原核細胞および/または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、特に限定されないが常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のCRPの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じて、さらにリンカーもしくはアダプターDNAを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Taq DNAポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなDNAポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、TAクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられる。より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌(例えば、K12株、B株など)が挙げられる。形質転換体の調製は、特に限定されないが、常法に従って行えばよい。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21などが用いられ、ベクターとしてはpBR322、pUC19、pBluescript、pQE、pETなどが例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、キャンデイダ・ウチリス(Candida utilis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが好適な例として挙げられる。ベクターとしてはpAUR101、pAUR224、pYE32などが挙げられる。宿主が糸状菌である場合は、例えば、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae),アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)等を例示することができる。
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子により本発明の組換えCRPが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
形質転換体中に蓄積した本発明の組換えCRPは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用するのが好ましい。この精製方法としては、特に限定されないが、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、ホスホリルコリン固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、セファデックス(Sephadex)ゲル(GEヘルスケアバイオサイエンス製)などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B (GEヘルスケアバイオサイエンス製)、オクチルセファロースCL-6B(GEヘルスケアバイオサイエンス製)等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製標品を得ることができる。
(C反応性タンパク質のN末端環化方法)
本発明の組換えCRPは、全体の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えCRPであり、具体的には、N末端環化率が55%以上と算出された組換えCRPである。
本発明の組換えCRPは、全体の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えCRPであり、具体的には、N末端環化率が55%以上と算出された組換えCRPである。
本発明において、「N末端環化率」とは、組換えCRPのうちのN末端がピログルタミル化されている組換えCRPの比率を示す指標であり、後述の「C反応性タンパク質のN末端環化率測定方法」にしたがって算出される。N末端環化率は、後述の「C反応性タンパク質のN末端環化率測定方法」で測定した場合、組換えCRPの55%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上保持していることが望ましい。
本発明では、「N末端」とは、分泌シグナル配列が除去された成熟型CRPのN末端のことであり、具体的には、配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において1位(又は配列番号3または配列番号4の22位)のグルタミン、又は1位のグルタミンが分子内縮合反応を起こした後のピログルタミル酸をいう。1位のグルタミンは環化処理を施すことでピログルタミン酸に変換される。
本発明では、「環化処理」とは、上記N末端がグルタミンの状態(以下、「未環化型」という。)から上記N末端がピログルタミル酸の状態(以下、「環化型」という。)にCRPの変換が促進される処理のことであり、酵素学的または非酵素学的な手法のどちらを選択しても良い。酵素学的手法としては、例えば、グルタミニルシクラーゼ等の酵素を適温で反応させることにより行うことができるが、酵素や温度条件はこれらに限定されない。非酵素学的手法は、緩衝液の種類、pH、処理温度、処理時間、CRP濃度等を設定する必要があるが、CRP、未環化型CRP及び環化型CRPに悪影響を与えないような条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。
環化処理に用いられる緩衝液としては、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッド緩衝液、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH7~pH12の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH7~pH10である。温度条件は、4℃~55℃が好ましく、さらに好ましくは37℃~50℃である。CRP濃度は、0.1mg/dL~500mg/dLが好ましく、さらに好ましくは10mg/dL~300mg/dLである。反応時間は、30分~4週間が好ましく、さらに好ましくは16時間~3週間である。
(C反応性タンパク質の濃度測定方法)
本発明において、CRP濃度測定は以下の条件で行う。該CRP濃度測定方法は、抗C反応性タンパク質抗体が固定化されたラテックス粒子と被検試料中のCRP(被検物質)が抗原抗体反応を起こし、当該ラテックス粒子の凝集反応の程度からCRP濃度を測定する方法である。なお、本発明で「CRP濃度」という場合は、具体的には、特に記載のない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
本発明において、CRP濃度測定は以下の条件で行う。該CRP濃度測定方法は、抗C反応性タンパク質抗体が固定化されたラテックス粒子と被検試料中のCRP(被検物質)が抗原抗体反応を起こし、当該ラテックス粒子の凝集反応の程度からCRP濃度を測定する方法である。なお、本発明で「CRP濃度」という場合は、具体的には、特に記載のない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
<試薬>
・デンカ生研社製CRPラテックスX2「生研」R1試薬(緩衝液)
・デンカ生研社製CRPラテックスX2「生研」R2試薬(ラテックス(抗ヒトCRPポリクローナル抗体(ウサギ)結合ラテックス)浮遊液)
・デンカ生研社製CRPX2標準液H
<測定試料>
測定試料は、CRP溶液であり、必要に応じて20mM Tris-HCl緩衝溶液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム;pH7.5)で希釈された後、使用する。また特定のCRP濃度に調製する場合は、ブラッドフォードプロテインアッセイにおいて値付けされたタンパク質濃度を基準として、希釈倍率を決定する。
<測定方法>
上記の測定試料、上記のR1試薬及び上記R2試薬を下記条件で日立7180形自動分析装置を用いて、試料中のCRP濃度(mg/dL)を測定する。CRP濃度は、式(I)により算出される。
試料: 2.2μL
R1試薬: 120μL
R2試薬: 120μL
測定方法: 2ポイントエンド法(18-34)
主波長: 546nm
副波長: 800nm
・デンカ生研社製CRPラテックスX2「生研」R1試薬(緩衝液)
・デンカ生研社製CRPラテックスX2「生研」R2試薬(ラテックス(抗ヒトCRPポリクローナル抗体(ウサギ)結合ラテックス)浮遊液)
・デンカ生研社製CRPX2標準液H
<測定試料>
測定試料は、CRP溶液であり、必要に応じて20mM Tris-HCl緩衝溶液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム;pH7.5)で希釈された後、使用する。また特定のCRP濃度に調製する場合は、ブラッドフォードプロテインアッセイにおいて値付けされたタンパク質濃度を基準として、希釈倍率を決定する。
<測定方法>
上記の測定試料、上記のR1試薬及び上記R2試薬を下記条件で日立7180形自動分析装置を用いて、試料中のCRP濃度(mg/dL)を測定する。CRP濃度は、式(I)により算出される。
試料: 2.2μL
R1試薬: 120μL
R2試薬: 120μL
測定方法: 2ポイントエンド法(18-34)
主波長: 546nm
副波長: 800nm
本発明において、CRP高濃度域での組換えCRPのラテックス試薬への反応性が改善されたかどうかを判断する方法は、上記方法で測定された天然型ヒトCRPのCRP高濃度域でのCRP濃度値と、各種組換えCRPにおいて、CRP高濃度域でのCRP濃度値の乖離が5%以下である場合は、反応性が改善されたものと判断する。本発明における、CRP高濃度域とは、CRP濃度10~30mg/dLの範囲をいうが、特にこれに限定されない。
(C反応性タンパク質のN末端環化率測定方法)
本発明において、組換えCRPのN末端環化率測定は、以下の条件で行う。本測定方法は、質量分析により未環化型CRPのスペクトルと環化型CRPのスペクトルの10価の各イオン強度を測定し、各イオン強度から未環化型CRPと環化型CRPの比率を算出する方法である。本発明で「未環化型CRPのスペクトル」とは、分子量23045に該当するスペクトルのことをいい、また「環化型CRPのスペクトル」とは、分子量23027に該当するスペクトルのことをいう。なお、本発明で「CRPのN末端環化率」という場合は、具体的には、特に記載がない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
本発明において、組換えCRPのN末端環化率測定は、以下の条件で行う。本測定方法は、質量分析により未環化型CRPのスペクトルと環化型CRPのスペクトルの10価の各イオン強度を測定し、各イオン強度から未環化型CRPと環化型CRPの比率を算出する方法である。本発明で「未環化型CRPのスペクトル」とは、分子量23045に該当するスペクトルのことをいい、また「環化型CRPのスペクトル」とは、分子量23027に該当するスペクトルのことをいう。なお、本発明で「CRPのN末端環化率」という場合は、具体的には、特に記載がない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
<測定試料>
測定試料は、CRP溶液であり、必要に応じて超純水で希釈された後に使用する。
<測定方法>
上記の測定試料を、下記条件でLC/MS装置を用いて、試料中の未環化型CRPのスペクトルと環化型CRPのスペクトルを測定する。
LC条件
装置:Waters製 ACQUITY UPLC
カラム:Waters製 Mass PREP Micro Desalting Column 20μm,2.1×5mm
移動相:A 水/ギ酸混液(1000:1),B IPA/ACN/メタノール/ギ酸混液(500:300:200:1)
カラム温度:50℃
注入量:5μL
MS条件
装置:BRUKERDALTONICS製 microOTOF
イオン化法:ESIポジティブ
測定試料は、CRP溶液であり、必要に応じて超純水で希釈された後に使用する。
<測定方法>
上記の測定試料を、下記条件でLC/MS装置を用いて、試料中の未環化型CRPのスペクトルと環化型CRPのスペクトルを測定する。
LC条件
装置:Waters製 ACQUITY UPLC
カラム:Waters製 Mass PREP Micro Desalting Column 20μm,2.1×5mm
移動相:A 水/ギ酸混液(1000:1),B IPA/ACN/メタノール/ギ酸混液(500:300:200:1)
カラム温度:50℃
注入量:5μL
MS条件
装置:BRUKERDALTONICS製 microOTOF
イオン化法:ESIポジティブ
<N末端環化率の算出方法>
上記測定方法で得られた各CRPスペクトルの溶出時間1.7~2.0分の平均スペクトルの10価の各イオン強度(intensity)を用いて、未環化型CRPと環化型CRPの比率を算出する方法による。本発明の「比率」とは、未環化型CRPと環化型CRPの2つのイオン強度の合計を100とした場合の、環化型CRPのイオン強度の比率をいい、下記の式(II)により算出される。
上記測定方法で得られた各CRPスペクトルの溶出時間1.7~2.0分の平均スペクトルの10価の各イオン強度(intensity)を用いて、未環化型CRPと環化型CRPの比率を算出する方法による。本発明の「比率」とは、未環化型CRPと環化型CRPの2つのイオン強度の合計を100とした場合の、環化型CRPのイオン強度の比率をいい、下記の式(II)により算出される。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、実施例により、本発明が特に限定されるものではない。
実施例1 変異の導入および形質転換体の取得
(1)変異の導入
大腸菌由来アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列(ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC)と配列番号5または配列番号6のヒト由来成熟型CRP配列を連結させた配列番号7または配列番号8の人工合成遺伝子を鋳型とし、配列番号9,10のプライマーを用いて、CRP遺伝子を増幅した。配列番号9はフォワードプライマー、配列番号10はリバースプライマーである。本プライマーには制限酵素サイトNdeI、または制限酵素サイトBamHIがそれぞれ付加されている。増幅した遺伝子断片と、制限酵素NdeIとBamHIで切断されたベクタープラスミドpBluescript KSN(+)、In-Fusion Reaction Mix(タカラバイオ製)を加えてインキュベーションすることにより、プラスミドを構築した。このようにして、CRP遺伝子を大量に発現できるように設計された、配列番号7を含む組換えプラスミドpBKSN_CRP1と、配列番号8を含む組換えプラスミドpBKSN_CRP2を取得した。
(1)変異の導入
大腸菌由来アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列(ATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC)と配列番号5または配列番号6のヒト由来成熟型CRP配列を連結させた配列番号7または配列番号8の人工合成遺伝子を鋳型とし、配列番号9,10のプライマーを用いて、CRP遺伝子を増幅した。配列番号9はフォワードプライマー、配列番号10はリバースプライマーである。本プライマーには制限酵素サイトNdeI、または制限酵素サイトBamHIがそれぞれ付加されている。増幅した遺伝子断片と、制限酵素NdeIとBamHIで切断されたベクタープラスミドpBluescript KSN(+)、In-Fusion Reaction Mix(タカラバイオ製)を加えてインキュベーションすることにより、プラスミドを構築した。このようにして、CRP遺伝子を大量に発現できるように設計された、配列番号7を含む組換えプラスミドpBKSN_CRP1と、配列番号8を含む組換えプラスミドpBKSN_CRP2を取得した。
(2)形質転換体の取得
(1)で構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、SOC培地中で1hr、37℃で培養後、LB寒天培地(グルコース1.0%、アンピシリン50μg/mLを含む)に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。pBKSN_CRP1の導入で得られた形質転換体をエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP1)と命名した。また上記と同様の方法でpBKSN_CRP2の導入で得られた形質転換体をエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP2)と命名した。
(1)で構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)JM109株コンピテントセル(東洋紡製)を形質転換し、SOC培地中で1hr、37℃で培養後、LB寒天培地(グルコース1.0%、アンピシリン50μg/mLを含む)に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。pBKSN_CRP1の導入で得られた形質転換体をエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP1)と命名した。また上記と同様の方法でpBKSN_CRP2の導入で得られた形質転換体をエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP2)と命名した。
実施例2 エシェリヒア・コリーにおけるCRP遺伝子の発現
実施例1にて取得した形質転換体エシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP1)のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(グルコース1.0%、アンピシリン100μg/mLを含む)へ植菌し、37℃で16時間培養した。得られた培養液を種培養液とし、10本の2L容の坂口フラスコに入った500mLのLB液体培地(グリセロール0.5%、塩化カルシウム0.05%、IPTG 1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、24時間培養した。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレス(Niro Soavi製)にて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗精製液1として得た。また上記と同様の方法でエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP2)から粗精製液2も取得した。
実施例1にて取得した形質転換体エシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP1)のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(グルコース1.0%、アンピシリン100μg/mLを含む)へ植菌し、37℃で16時間培養した。得られた培養液を種培養液とし、10本の2L容の坂口フラスコに入った500mLのLB液体培地(グリセロール0.5%、塩化カルシウム0.05%、IPTG 1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、24時間培養した。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)に懸濁した後、フレンチプレス(Niro Soavi製)にて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗精製液1として得た。また上記と同様の方法でエシェリヒア・コリーJM109(pBKSN_CRP2)から粗精製液2も取得した。
実施例3 組換えCRPの精製
実施例2にて取得した粗精製液1に対し、PierceTM p-Aminophenyl Phosphoryl Choline Agarose(Thermo SCIENTIFIC製)を用いたアフィニティー精製を行った。実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)で平衡化した前記樹脂を、粗精製液と混合して吸着させた樹脂を、前記緩衝液で洗浄し、20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM EDTA2mM、pH7.5)で溶出させた、組換えCRP溶液1を取得した。この溶液はさらに、中空糸膜を用いた加水濃縮によりEDTAを除きつつ、実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)へ置換され、さらに遠心式限外ろ過フィルター(メルク製)で適当な濃度まで濃縮して、純度の高い組換えCRP1を得た。取得した組換えCRP1を用いてSDS-PAGEを行った結果を図1に示す。その結果、不純タンパク質がSDS-PAGEでは検出できないレベルにまで、純度を向上させることに成功した。また上記と同様の方法で粗精製液2から純度の高い組換えCRP2も得た。得られたCRP2について、SDS-PAGEを行った結果を図2に示す。CRP1と同様に、不純タンパク質がSDS-PAGEでは検出できないレベルにまで、純度を向上させることに成功した。
実施例2にて取得した粗精製液1に対し、PierceTM p-Aminophenyl Phosphoryl Choline Agarose(Thermo SCIENTIFIC製)を用いたアフィニティー精製を行った。実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)で平衡化した前記樹脂を、粗精製液と混合して吸着させた樹脂を、前記緩衝液で洗浄し、20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM EDTA2mM、pH7.5)で溶出させた、組換えCRP溶液1を取得した。この溶液はさらに、中空糸膜を用いた加水濃縮によりEDTAを除きつつ、実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)へ置換され、さらに遠心式限外ろ過フィルター(メルク製)で適当な濃度まで濃縮して、純度の高い組換えCRP1を得た。取得した組換えCRP1を用いてSDS-PAGEを行った結果を図1に示す。その結果、不純タンパク質がSDS-PAGEでは検出できないレベルにまで、純度を向上させることに成功した。また上記と同様の方法で粗精製液2から純度の高い組換えCRP2も得た。得られたCRP2について、SDS-PAGEを行った結果を図2に示す。CRP1と同様に、不純タンパク質がSDS-PAGEでは検出できないレベルにまで、純度を向上させることに成功した。
実施例4 組換えCRPのN末端環化処理
実施例3にて取得した組換えCRP1を、37℃で8日間加温し、組換えCRPのN末端がピログルタミル化により環化された、環化型組換えCRP1を取得した。環化処理では実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)を使用し、CRP濃度は300mg/dLで実施した。また上記と同様の方法で組換えCRP2から環化型組換えCRP2を取得した。
実施例3にて取得した組換えCRP1を、37℃で8日間加温し、組換えCRPのN末端がピログルタミル化により環化された、環化型組換えCRP1を取得した。環化処理では実施例2で使用した緩衝液20mM Tris-HCl緩衝液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)を使用し、CRP濃度は300mg/dLで実施した。また上記と同様の方法で組換えCRP2から環化型組換えCRP2を取得した。
実施例5 N末端環化率の測定
実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2、及びポジティブコントロールとして天然型ヒトCRP(Yashraj製)を、超純水にてCRP濃度150mg/dLに調製したCRP溶液を上述した通りのLC/MS条件で測定した(表1参照)。組換えCRP1の各サンプルの質量スペクトルにおいて、溶出時間1.7~2.0分の平均の10価のイオンを拡大したものを図3に示す。
実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2、及びポジティブコントロールとして天然型ヒトCRP(Yashraj製)を、超純水にてCRP濃度150mg/dLに調製したCRP溶液を上述した通りのLC/MS条件で測定した(表1参照)。組換えCRP1の各サンプルの質量スペクトルにおいて、溶出時間1.7~2.0分の平均の10価のイオンを拡大したものを図3に示す。
m/z 2305.45は未環化型CRPのスペクトルを示し、またm/z 2303.74は環化型CRPのスペクトルを示す。天然型ヒトCRPにおいて、環化型CRPのスペクトルが顕著に示された。一方、実施例3にて取得した組換えCRP1において、未環化型CRPのスペクトルの方が環化型CRPのスペクトルより高いことが示された。これに対して、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1は、環化型CRPのスペクトルの方が未環化型CRPのスペクトルより明らかに高いことが示された。実施例4のN末端環化処理により、CRPのピログルタミル化が促進されたことが示された。また組換えCRP2と環化型組換えCRP2においても、図4に示すように同様の結果が得られた。
実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2、及び天然型ヒトCRPにおいて、CRPのN末端環化率は、上述のLC/MS条件で測定された未環化型CRPのスペクトルと環化型CRPのスペクトルの10価の各イオン強度をもとに、各イオン強度から未環化型CRPと環化型CRPの比率から上述の式(II)で算出した。組換えCRP1、環化型組換えCRP1及び天然型ヒトCRPのN末端環化率を表2に示す。実施例4にて取得した環化型組換えCRP1は、加温1日目、3日目、6日目、8日目に取得した環化型組換えCRP1を、上述の式(II)により、N末端環化率を算出した。また組換えCRP2、環化型組換えCRP2及び天然型ヒトCRPのN末端環化率を表3に示す。実施例4にて取得した環化型組換えCRP2は、加温1日目、3日目、6日目、8日目に取得した環化型組換えCRP2を、上述の式(II)により、N末端環化率を算出した。
天然型ヒトCRPにおいて、N末端環化率は95%であり、全体の95%が環化型CRPであることが示される。一方、実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2においては、N末端環化率40%と環化型CRPが全体の半分以下しか存在しないことが示される。これに対して、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2は、加温1日目にN末端環化率42%、加温3日目にN末端環化率54%、加温6日目にN末端環化率67%、加温8日目にN末端環化率78%と、加温時間が長くなるに伴い、環化型組換えCRPの割合が増加する傾向にあることが示された。
実施例6 ラテックス試薬によるCRP濃度測定
ウシ血清アルブミン(シグマ製)を超純水にて、0.1、0.2、0.4、及び0.75mg/mLに希釈して標準液を調製した。各標準液60μLにプロテインアッセイ濃縮色素試薬(BioRad製)600μLと超純水2.4mLを添加し、室温にて5分間静置後に595nmの吸光度を測定した。上述の595nmの吸光度の測定値とウシ血清アルブミン濃度から検量線を作成した。実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2、実施例4取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2、及び天然型ヒトCRPを超純水にておいて、適当な濃度になるよう希釈し、標準液と同様な試薬、条件で調製し、595nmの吸光度を測定した。各種CRPの測定値から、上述の検量線よりタンパク質濃度を算出した。上述のタンパク質濃度をもとに、タンパク質濃度1mg/dL、5mg/dL、10mg/dL、30mg/dLになるように20mM Tris-HCl緩衝溶液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)で希釈してCRP溶液を調製した。
ウシ血清アルブミン(シグマ製)を超純水にて、0.1、0.2、0.4、及び0.75mg/mLに希釈して標準液を調製した。各標準液60μLにプロテインアッセイ濃縮色素試薬(BioRad製)600μLと超純水2.4mLを添加し、室温にて5分間静置後に595nmの吸光度を測定した。上述の595nmの吸光度の測定値とウシ血清アルブミン濃度から検量線を作成した。実施例3にて取得した組換えCRP1と組換えCRP2、実施例4取得した環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2、及び天然型ヒトCRPを超純水にておいて、適当な濃度になるよう希釈し、標準液と同様な試薬、条件で調製し、595nmの吸光度を測定した。各種CRPの測定値から、上述の検量線よりタンパク質濃度を算出した。上述のタンパク質濃度をもとに、タンパク質濃度1mg/dL、5mg/dL、10mg/dL、30mg/dLになるように20mM Tris-HCl緩衝溶液(0.14M 塩化ナトリウム、2mM 塩化カルシウム、pH7.5)で希釈してCRP溶液を調製した。
上述の各CRP溶液のCRP濃度は、デンカ生研製CRP―ラテックスX2の緩衝液を第1試薬、抗ヒトCRPポリクローナル抗体(ウサギ)結合ラテックス浮遊液を第2試薬とし、前記第1試薬と第2試薬を組合せ、日立7180形自動分析装置を用いてCRP濃度に依存的な粒子凝集塊の形成を測定した。具体的には、前記各CRP溶液2.2μLに、第1試薬120μLを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬120μLを加えて攪拌した。その後5分間の凝集形成に伴う吸光度変化(ΔmAbs)を、主波長546nm、副波長800nmにて測定した。
表4に、実施例3にて取得した組換えCRP1、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1の測定値と、天然型ヒトCRPの測定値に対する、各濃度における相対値を示す。また、表4には、実施例5で算出した各種CRPのN末端環化率も示す。さらに、実施例3にて取得した組換えCRP1、実施例4にて取得した環化型組換えCRP1及び天然型ヒトCRPの測定値を表5に示す。上記と同様に、表6に、実施例3にて取得した組換えCRP2、実施例4にて取得した環化型組換えCRP2の測定値と、天然型ヒトCRPの測定値に対する、各濃度における相対値を示す。また、表6には、実施例5で算出した各種CRPのN末端環化率も示す。さらに、実施例3にて取得した組換えCRP2、実施例4にて取得した環化型組換えCRP2及び天然型ヒトCRPの測定値を表7に示す。
表4と表6より、N末端環化率40%、42%の組換えCRP1と組換えCRP2において、10mg/dLと30mg/dLのポイントにおける天然型ヒトCRPの測定値との相対値が89~94%と、測定値に6~11%の乖離があることが確認された。一方、N末端環化率54%、67%、78%の環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2において、10mg/dLと30mg/dLのポイントにおける天然型ヒトCRPの測定値との相対値が95~104%と、測定値との乖離が5%以内に抑えられていた。本結果より、N末端環化率が55%以上の環化型組換えCRP1と環化型組換えCRP2では10mg/dLと30mg/dLのCRP高濃度域でも、天然型ヒトCRPとの乖離が5%以内に抑えることができることが示された。
本発明のCRPは、CRPが高濃度域での反応性に優れたラテックス試薬に用いる診断薬原料として、医療、診断の分野において特に有用なものである。
Claims (13)
- 遺伝子組換えにより生産されたC反応性タンパク質であって、該C反応性タンパク質の55%以上のN末端がピログルタミル化されている組換えC反応性タンパク質。
- 該C反応性タンパク質の65%以上のN末端がピログルタミル化されている、請求項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
- 該C反応性タンパク質の75%以上のN末端がピログルタミル化されている、請求項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
- 該C反応性タンパク質の85%以上のN末端がピログルタミル化されている、請求項1に記載の組換えC反応性タンパク質。
- 組換えC反応性タンパク質が、細菌による組換えタンパク質である、請求項1から4のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
- 細菌が大腸菌である請求項5に記載の組換えC反応性タンパク質。
- C反応性タンパク質がヒト由来である、請求項1から6のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
- C反応性タンパク質が、下記の(a)から(c)のいずれかのポリペプチドからなる、請求項1から7のいずれかに記載の組換えC反応性タンパク質。
(a)配列番号1または配列番号2に記載されたポリペプチド
(b)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド
(c)配列番号1または配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗C反応性タンパク質抗体に対する抗原性を有するポリペプチド - 請求項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーター。
- 請求項1から8のいずれかに記載のC反応性タンパク質を含む管理血清。
- 請求項9に記載のC反応性タンパク質を含むキャリブレーターを用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
- 請求項10に記載のC反応性タンパク質を含む管理血清を用いて検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
- 抗C反応性タンパク質抗体が固定化されたラテックス粒子を用いた、ラテックス免疫比濁法により、請求項11または12に記載の検体中のC反応性タンパク質を定量する方法。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06311884A (ja) * | 1993-04-27 | 1994-11-08 | Oriental Yeast Co Ltd | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ |
JPH08233816A (ja) * | 1995-02-27 | 1996-09-13 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫学的測定法 |
JP2000014388A (ja) * | 1998-07-03 | 2000-01-18 | Oriental Yeast Co Ltd | 組換えcrpおよびその製造方法 |
JP2006300758A (ja) * | 2005-04-21 | 2006-11-02 | Apro Life Science Institute Inc | 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法 |
WO2011155358A1 (ja) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | 日東紡績株式会社 | 5量体crpの製造方法、5量体crpを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌcrpをコードするdna及びそのdnaを含む発現ベクター |
JP2011257243A (ja) * | 2010-06-08 | 2011-12-22 | Shino-Test Corp | 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 |
JP2018535394A (ja) * | 2015-09-17 | 2018-11-29 | アムジェン インコーポレイテッド | Il23経路バイオマーカーを使用するil23アンタゴニストに対する臨床応答の予測 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110076700A1 (en) * | 2008-02-29 | 2011-03-31 | Nihon University | Anti-crp antibody and utilization of the same |
JP5798720B2 (ja) * | 2010-03-30 | 2015-10-21 | 積水メディカル株式会社 | ヒトc反応性タンパク質(crp)測定用イムノクロマト試薬 |
CN101974556B (zh) * | 2010-11-11 | 2015-02-11 | 中国计量科学研究院 | 一种同位素标记的重组c反应蛋白的制备方法 |
CN103185798A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-07-03 | 苏州德沃生物技术有限公司 | 一种心肌梗塞纳米免疫增强比浊快速检测试剂盒及使用方法 |
CN106153933B (zh) * | 2015-03-26 | 2018-09-04 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | 一种高效定量检测c反应蛋白的免疫学试剂盒 |
CN105158476A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-12-16 | 南京闻智生物科技有限公司 | 一种全量程c反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 |
CN106699884B (zh) * | 2017-01-19 | 2020-04-17 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 抗人c-反应蛋白抗体及其应用 |
CN107022527B (zh) * | 2017-03-24 | 2019-12-27 | 菲鹏生物股份有限公司 | 可分泌抗c反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、c反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用 |
-
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06311884A (ja) * | 1993-04-27 | 1994-11-08 | Oriental Yeast Co Ltd | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ |
JPH08233816A (ja) * | 1995-02-27 | 1996-09-13 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 免疫学的測定法 |
JP2000014388A (ja) * | 1998-07-03 | 2000-01-18 | Oriental Yeast Co Ltd | 組換えcrpおよびその製造方法 |
JP2006300758A (ja) * | 2005-04-21 | 2006-11-02 | Apro Life Science Institute Inc | 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法 |
JP2011257243A (ja) * | 2010-06-08 | 2011-12-22 | Shino-Test Corp | 試料中のc反応性蛋白質の測定試薬、測定方法及び測定範囲の拡大方法 |
WO2011155358A1 (ja) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | 日東紡績株式会社 | 5量体crpの製造方法、5量体crpを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌcrpをコードするdna及びそのdnaを含む発現ベクター |
JP2018535394A (ja) * | 2015-09-17 | 2018-11-29 | アムジェン インコーポレイテッド | Il23経路バイオマーカーを使用するil23アンタゴニストに対する臨床応答の予測 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
E. B. OLIVEIRA, E. C. GOTSCHLICH, T. Y. LIU: "Primary structure of human C-reactive protein.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 74, no. 8, 1 August 1977 (1977-08-01), US, pages 3148 - 3151, XP055325302, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.74.8.3148 * |
JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY MEDICINE, vol. 46, no. 9, September 2002 (2002-09-01), pages 973 - 981 |
See also references of EP4067372A4 |
TOSHIO TANAKA ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 295, 2002, pages 163 - 166 |
XIA DONG YUAN, YAO REN JIE, ZHANG LONG XIANG: "Primary Structure of Anodonta C-reactive Protein", CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 16, no. 2, 30 November 1999 (1999-11-30), pages 215 - 223, XP009529336, ISSN: 1007-7626 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20230039528A1 (en) | 2023-02-09 |
CN114761561A (zh) | 2022-07-15 |
EP4067372A1 (en) | 2022-10-05 |
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