CN117700539A - 抗犬瘟热病毒单克隆抗体、质粒载体及制备方法 - Google Patents
抗犬瘟热病毒单克隆抗体、质粒载体及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域。本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由犬瘟热病毒H蛋白的两个优势抗原表位串联组成，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。本发明还涉及用该重组蛋白免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与重组蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR扩增B淋巴细胞抗体重链及轻链可变区序列，将得到的序列构建完整鼠IgG抗体序列重组表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，对犬瘟热病毒的早期诊断和防治有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体的说，本发明涉及一种新的犬瘟热病毒重组蛋白H蛋白单克隆抗体，通过流式细胞仪分选出与重组蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR扩增B淋巴细胞抗体重链及轻链可变区序列，还涉及将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体序列表达载体表达犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体，并应用于犬瘟热病毒的早期诊断。
背景技术
犬瘟热(CanineDistemper)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)感染，会导致一种伴有免疫抑制和全身性感染的疾病。犬只感染后会引起呼吸道消化道以及中枢神经的症状，其感染数组相当广泛，包括熊猫，狗，水貂，狐狸，狼等，陆生肉食兽，以及鲸鱼海豹等水生哺乳类。犬瘟热病毒属于副粘病毒科，麻疹病毒属成员，具有囊膜结构，不分节段的负链RNA病毒。病毒基因组全长约15690bp，病毒颗粒多以球状存在，位于蛋白囊膜内的核蛋白长度为600～800纳米，直径为18纳米，早在1995年已有报道指出麻疹病毒与犬瘟热病毒在宿主身上造成持续性感染的原因，与病毒复制时，装配和病毒出芽释放有关，尤其是F蛋白和H蛋白扮演着重要的角色。以PAGE进行电泳分析F蛋白大小约为63kDa，F蛋白和H蛋白除了可自行组装成病毒囊膜外，还介导病毒的细胞受体侵入细胞内进行复制。犬瘟热的临床症状取决于病毒的毒性、环境、宿主年龄与免疫状况，超过50％的感染为亚临床型，常见的症状包括精神萎靡，发热，上呼吸道感染，且双侧眼鼻分泌物，会由浆液型转化为粘液型溶性病，水咳嗽及呼吸困难；感染犬只可发生角膜结膜炎。有报道指出患病耐过的犬只，可造成持续性嗅觉丧失症，所有年龄的犬只皆易感犬瘟热病毒，尤其是在3～6个月的幼犬，由于缺乏母源抗体，感染初期症状温和，出现食厌食症，食欲减退，呕吐腹泻，粪便会呈水样，接着会有里急后重与肠套叠现象发生，液体流失会造成严重的脱水和消瘦，因此感染全身性症状的犬只经常突然死亡。
国内外对犬瘟热病毒感染的病原学检查方法主要包括琼脂糖电泳、PCR技术、分子探针技术等基因检测技术除了可以定性检测犬瘟热病毒还能对样本中犬瘟热病毒进行定量分析，但是RNA提取较难成功且操作繁琐耗时，PCR虽然特异性强、灵敏度高、定量准确，但是操作复杂、需要专门培训的技术人员和特殊的仪器设备；以ELISA双抗体夹心法、单克隆抗体技术、固相免疫分析技术等方法为代表的免疫检测技术在快速诊断犬瘟热病毒方面表现得尤为突出，不仅简化了检测步骤，而且提高了检测犬瘟热病毒的特异性和灵敏度。
因此制备犬瘟热病毒单克隆抗体成为犬瘟热病毒特异性检测诊断的主要方式。常规犬瘟热病毒单克隆抗体制备是将犬瘟热病毒蛋白单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定且个体差异大，得到的单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。
发明内容
设计目的：为解决传统制备单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成重组犬瘟热病毒H蛋白并通过流式细胞仪和单细胞PCR筛选出与重组蛋白H特异性结合的淋巴B细胞抗体序列，通过瞬转表达制备其单克隆抗体，比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。
设计方案：为实现上述设计目的。本申请：(1)以犬瘟热病毒H蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位串联，并在序列碳端加His标签形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加卡那青霉素抗性筛选培养基，筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)重组蛋白H蛋白多次免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，利用BD FACS流式细胞仪对B淋巴细胞悬液进行分选，并收集在含适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的96孔PCR板中，针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区，将mRNA逆转录为cDNA，通过RT-PCR克隆出对应的抗体核苷酸序列，凝胶电泳分析纯化、测序，最终得到能与重组蛋白结合的抗体核苷酸序列。(8)将重链和轻链可变区序列构建成完整鼠IgG表达载体并使用HEK293细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)利用胶体金免疫层析筛选平台显示7F3单抗包被与2B5胶体金标记单抗配对为检测犬瘟热病毒的最佳组合。
具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：犬瘟热病毒H蛋白优势抗原表位选择
以H蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。
实施例2：H蛋白优势抗原表位串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将H蛋白的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，并在序列碳端加His标签得到重组蛋白氨基酸序列。
实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列
为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，由通用生物系统安徽有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建重组蛋白表达载体
用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)
12小时，酶切产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(爱思进生物技术杭州有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(爱思进生物技术杭州有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建重组H抗原表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1mL保存，剩余加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例6：纯化犬瘟热病毒重组蛋白
接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。
实施例7：犬瘟热病毒重组蛋白单克隆抗体制备
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白，共400μl/只。20天后进行加强免疫，方法为取80μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg重组蛋白腹腔加强注射，于72小时后处死小鼠，用剪刀取出小鼠脾脏并剪碎，加入胰蛋白酶将脾脏组织消化分离成单细胞。利用不同荧光标记抗体对不同的淋巴细胞进行染色标记，同时加入重组蛋白制备的荧光标记探针对目标B淋巴细胞进行染色，借助流式细胞荧光分选技术FACS从中分离出能表达特异性抗体的单个B细胞。提取单个B细胞的mRNA，进行RT-PCR合成cDNA，以cDNA为模板，采用鼠源单链抗体scfv通用简并引物分别扩增出编码抗体轻重链的核酸序列，将编码序列酶切插入pcDNA3.1(+)载体中构建出表达特定抗体轻重链的重组质粒。将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1：1质量比混合后转染进HEK293F细胞中进行单克隆抗体轻重链的表达和组装,收集细胞培养液并用Protein A亲和纯化出单克隆抗体。SDS-PAGE电泳后用银染方法检测其纯度。第二天进行单克隆ELISA筛选，筛选步骤如下：
包被：用包被液稀释犬瘟热病毒H重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；
封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；
加样：加过夜诱导表达的细菌培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；
加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释HRP酶标二抗(北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；
加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；
终止反应：以50μL/孔加入2M H2SO4；
结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示有4个阳性克隆OD值较高，经测序得到4株序列，分别为4A1，2B5，3E9，7F3。
相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH2O定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加ddH2O定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％ H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加ddH2O定容至1000mL。
实施例8：制备胶体金垫
取5ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液10μL，充分混匀后加入50μg单抗，混匀，室温静置2小时后，加入100μl 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，封闭处理2小时后，离心(10000rpm/min、20min)，弃上清后，沉淀用500μl复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照6μl/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥1小时。
相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：AuCL3.HCl.4H2O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。
0.2mol/L碳酸钾溶液：碳酸钾27.64克，加超纯水溶解并定容至1000ml。复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容到1000ml。
实施例9：硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
犬瘟热病毒单克隆抗体(4A1，2B5，3E9，7F3)分别经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1μl/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃干燥12小时。
实施例10：胶体金免疫检测卡的制备
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)喷涂犬瘟热病毒单克隆抗体(4A1，2B5，3E9，7F3)作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有胶体金标记抗犬瘟热病毒单克隆抗体(4A1，2B5，3E9，7F3)的金垫；(3)样本垫为一种经过2％ Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得胶体金免疫层析检测卡。
实施例11：配对单抗筛选
将犬瘟热病毒阳性样本与阴性样本按一定比例加入测定稀释液中混匀，80μL/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金层析读数仪(杭州唯赞科技有限公司)分别读取NC膜上T、C线信号并计算测量值T/(T+C)，详见表1、表2。
通过上表可知7F3单抗包被与2B5单抗标记胶体金配对为检测犬瘟热病毒的最佳抗体配对。
Claims (7)
1.一种抗犬瘟热病毒重组蛋白特异性单链抗体scfv-2B5，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种抗犬瘟热病毒重组蛋白特异性单链抗体scfv-7F3，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种编码如权利要求1所述抗犬瘟热病毒重组蛋白特异性单链抗体scfv-2B5的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种编码如权利要求2所述抗犬瘟热病毒重组蛋白特异性单链抗体scfv-7F3的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。
6.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。
7.一种如权利要求1或2所述的抗犬瘟热病毒重组蛋白特异性单链抗体的制备方法，包括:
(a)通过PCR将述轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG1轻链恒定区和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
(b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到犬瘟热病毒重组蛋白单克隆抗体；
(c)纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合；
所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
或者，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
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