CN112521492A - 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备 - Google Patents

乙肝表面抗原单克隆抗体的制备 Download PDF

Info

Publication number
CN112521492A
CN112521492A CN202011500694.7A CN202011500694A CN112521492A CN 112521492 A CN112521492 A CN 112521492A CN 202011500694 A CN202011500694 A CN 202011500694A CN 112521492 A CN112521492 A CN 112521492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant protein
variable region
hepatitis
chain variable
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011500694.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112521492B (zh
Inventor
吴静
李小平
洪淑凡
朱伟
余铭恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN202011500694.7A priority Critical patent/CN112521492B/zh
Publication of CN112521492A publication Critical patent/CN112521492A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112521492B publication Critical patent/CN112521492B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域。本发明涉及一种乙肝表面抗原(HBsAg)重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由HBsAg的两个优势抗原表位串联组成，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。本发明还涉及用该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应重组蛋白单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，对乙型肝炎的早期诊断和防治有重要意义。

Description

乙肝表面抗原单克隆抗体的制备
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。具体的说，本发明涉及一种新的乙肝表面抗原重组蛋白，使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达HBsAg单克隆抗体，并应用于乙肝疾病早期的诊断。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种世界范围的流行性传染病，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌，而我国是乙型肝炎的高发区。自从1965年乙肝病毒被发现以来，乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)就被作为HBV感染的定性诊断标志之一，它本身没有传染性但有抗原性，因此HBsAg的检查往往是体检的项目之一，对乙肝的预防和治疗具有重要的意义。
目前，对乙肝表面抗原检测已建立了放射免疫法(RIA)、胶体金联免疫吸附(GCISA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、血细胞凝集法等。其中放射免疫法虽灵敏度高，但因同位素半衰期短并有放射污染问题，临床检测已很少使用；血细胞凝集法可以对表面抗原作相对定量，但操作繁复；实验室使用ELISA检测HBsAg时，其操作程序较复杂、时间长，给快速检测带来不便。近年来，以胶体金为标记物的检测技术已经逐步成为检测HBsAg的手段，由于GCISA不需要专业仪器，操作简单便捷，结果观察直接、可靠，因此，适于血站筛查及基层医院实验室等病例的筛查。
常规乙肝表面抗原重组蛋白单克隆抗体制备是利用HBsAg单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的抗乙肝表面抗原单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。
发明内容
设计目的：为解决传统制备单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成重组乙肝表面抗原并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。
设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以HBsAg蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位串联，形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加卡那青霉素抗性筛选培养基，筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)重组HBsAg蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfv噬菌体库，使用重组HBsAg蛋白进行多轮淘选筛选，最终得到能与重组HBsAg结合的单链抗体scfv序列。(8)将scfv序列构建成完整鼠IgG1表达载体并使用HEK293细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)利用胶体金免疫层析筛选平台显示4E5单抗包被与1C3胶体金标记单抗配对检测HBsAg蛋白为最佳组合。
具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：HBsAg蛋白优势抗原表位选择
以HBsAg蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。
实施例2：HBsAg蛋白优势抗原表位串联
为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将HBsAg蛋白的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，得到重组蛋白氨基酸序列。
实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列
为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，由通用生物系统安徽有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建重组蛋白表达载体
用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(爱思进生物技术杭州有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(爱思进生物技术杭州有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建重组HBsAg抗原表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1mL保存，剩余加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。9％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例6：纯化重组HBsAg蛋白
接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。
实施例7：单链抗体scfv噬菌体库构建
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组蛋白，共400μl/只。20天后进行加强免疫，方法为取80μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg重组HBsAg抗原腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏，用鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离鼠脾脏淋巴细胞。用RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从分离的淋巴细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒(Takara)反转录合成cDNA，用鼠源单链抗体scfv通用简并引物扩增重链可变区以及轻链可变区基因，PCR产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因，回收的目的基因通过overlap PCR链接成scfv，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的基因经NotI和SfiI酶切后使用T4连接酶和pCANTAB5e(北京宝科维食安生物技术有限公司)载体按一定比例于4℃连接12小时后，经胶回收试剂盒回收，去除里面的酶及缓冲物质，回收产物用细菌电转化仪(biorad)分多次电转入大肠杆菌TG1电转感受态，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及2％葡萄糖的2×YT-AG平板，于30℃恒温培养12小时之后，取适量的2×YT培养基用无菌玻璃棒将平板上的菌落全部刮取下来并收集菌体悬液，此为构建好的噬菌体抗体库。
实施例8：单链抗体scfv的淘选及筛选
从噬菌体抗体库中取一定量的菌液接种到2×YT-AG培养液中使OD600＝0.3。37℃，250rpm振荡1h左右，使OD600达0.5后加入辅助噬菌体M13K07超感染，感染比例为M13K07/TG1＝20:1。37℃，250rpm振荡1h，3300g，4℃离心10min沉淀细菌，小心移弃上清。重悬细菌到含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及卡那青霉素抗性(50μg/mL)的2×YT-AK培养基中，30℃，250rpm振荡培养过夜。次日，10800g，4℃离心20min沉淀细菌。上清移入干净离心管中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混合后冰浴2h。10800g，4℃离心20min沉淀细胞，小心移弃上清，扣干，将沉淀重悬于PBS中，用0.45μm膜过滤去除细菌碎片用于淘选步骤。将纯化的重组HBsAg抗原用包被液稀释至8μg/mL包被免疫管(Thermo)，每个免疫管4ml，4℃过夜包被。次日，弃去包被液和未吸附的抗原，无菌PBST洗涤3次，每个免疫管加入封闭液5ml，37℃孵育2h。弃去封闭液，无菌PBST洗涤3次后将经PEG沉淀获得的噬菌体加入到免疫管中，每个免疫管加入4ml，37℃孵育1h。弃去免疫管中的液体，用无菌PBST洗涤10次再用无菌PBS洗涤10次后加入1ml 100mM三乙胺将结合的噬菌体洗脱下来，再立即加入500μl 1M Tris-HCl，pH7.4进行中和。将中和后的噬菌体加入到一定量的处于对数生长期的TG1大肠杆菌中进行超感染，此为第一轮淘选富集过程。经过3轮淘选，HBsAg特异性scfv得以富集。将最后一轮洗脱中和后的噬菌体侵染TG1大肠杆菌后涂布于2×YT-AG平板上，于30℃恒温培养12小时之后随机挑取400-600个单克隆菌落于96孔深孔板中，用2×YT-AG培养基37℃，250rpm振荡2h后加入一定量M13K07辅助噬菌体进行超感染，37℃，250rpm振荡1h后离心去掉上清加入含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及卡那青霉素抗性(50μg/mL)的2×YT-AK培养基30℃，250rpm过夜培养。第二天进行单克隆ELISA筛选，筛选步骤如下：
包被：用包被液稀释HBsAg重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；
封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；
加样：加过夜诱导表达的细菌培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；
加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释兔抗M13噬菌体HRP酶标二抗(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；
加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；
终止反应：以50μL/孔加入2M H2SO4；
结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示有8个阳性克隆OD值较高，经测序得到4株scfv序列，分别为1A5，1C3，4G6，4E5。
相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH2O定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加ddH2O定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加ddH2O定容至1000mL。
实施例9：真核表达载体构建及HEK293F细胞瞬转表达和纯化
将4株HBsAg单链抗体scfv序列分别构建成完整鼠IgG1抗体序列，即将scfv中重链可变区与轻链可变区通过PCR分别与鼠IgG1重链恒定区和轻链恒定区桥接，再分别插入到pcDNA3.1(德国Novagen公司)质粒中。分别通过PEI将构建好的重链质粒与轻链质粒共转染HEK293F细胞，37℃，5％二氧化碳，120rpm细胞摇床表达7天后离心沉淀，收集上清过0.45μm滤器。用50mL平衡缓冲液PBS(pH7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度为0。上清上样后加PBS洗涤至吸光度为0，然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱，收集流出液并加入500mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中和至pH 7.0左右，得到纯化的单克隆抗体1A5，1C3，4G6，4E5。
实施例10：制备胶体金垫
取5ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液10μL，充分混匀后加入50μg单抗，混匀，室温静置2小时后，加入500μl 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，封闭处理2小时后，离心(10000rpm/min、20min)，弃上清后，沉淀用500μl复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将按照6μl/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥1小时。
相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：AuCL3.HCl.4H2O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。
0.2mol/L碳酸钾溶液：碳酸钾27.64克，加超纯水溶解并定容至1000ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容到1000ml。
实施例11：硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
HBsAg单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)分别经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1μl/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃干燥12小时。
实施例12：胶体金免疫检测卡的制备
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)喷涂HBsAg单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有胶体金标记HBsAg蛋白单克隆抗体(1A5，1C3，4G6，4E5)的金垫；(3)样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得胶体金免疫层析检测卡。
实施例13：配对单抗筛选
HBV阳性血清样本和正常人血清样本，80μL/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金层析读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)分别读值并计算P/N值(阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值)，详见表1。
表1配对单抗P/N值统计
Figure BDA0002843526520000111
通过上表可知4E5单抗包被与1C3单抗标记胶体金配对为检测HBsAg的最佳抗体配对。
SEQ ID NO1：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO2：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO3：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO4：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO5：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3轻链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO6：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3重链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO7：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5轻链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO8：抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5重链可变区核苷酸序列；
序列表
Figure BDA0002843526520000121
Figure BDA0002843526520000131
Figure BDA0002843526520000141
Figure BDA0002843526520000151
Figure BDA0002843526520000161
Figure BDA0002843526520000171
Figure BDA0002843526520000181
Figure BDA0002843526520000191
Figure BDA0002843526520000201
序列表
<110> 杭州贤至生物科技有限公司
<120> 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Asn His Phe Gly Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Arg Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Gln Leu Arg Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Met Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Arg Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu
35 40 45
Ile His Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Pro Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Glu Arg Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gaccaagtga gaatatttac agttctttag cttggtttca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcaactcct ggtctatagt gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaaaat cattttggtg ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagctgaa acgt 324
<210> 6
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag gtggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaaga cttctggcta cacctttagt agttattgga ttcagtgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattgggtct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180
actcagaggt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata agtcctccag cacagcctac 240
atacaactcc gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgttc acaactacgt 300
ggtcactggg gccaggggac tctggtcact gtctctgcg 339
<210> 7
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacattcaga tgatgcagtc cccagcaata atggctgcct ctctggggca gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccagttatt tgtactggta ccagcggaag 120
tcaggcgctt cccccaaacc cttgattcat aagacatcca acctggcttc tggagtccca 180
cctcgcttca gtggcagtgg gtctgggact tcttactctc tcacaatcag cagcgtggag 240
gctgaagatg atgcaactta ttactgccag cagtggagtg gttacccatg gacgttcggc 300
ggaggcacca agctggaaat caaacgt 327
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ccggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gcctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtgg tactaactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240
atggaactgc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagacggt 300
actacctacg agaggggtgg tttggactat tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tcg 363

Claims (9)

1.抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种编码权利要求1所述的抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-1C3的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种编码权利要求2所述的抗乙肝表面抗原重组蛋白特异性单链抗体scfv-4E5的基因，其特征在于：
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的轻链可变区核苷酸序列。
6.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的重链可变区核苷酸序列。
7.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求4所述的轻链可变区核苷酸序列。
8.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求4所述的重链可变区核苷酸序列。
9.权利要求5、6、7、8所述的质粒载体用于真核表达抗乙肝表面抗原重组蛋白单克隆抗体，包括:
(a)通过PCR将权利要求3、4中所述轻链和重链核苷酸序列分别与鼠IgG1轻链恒定区和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
(b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗乙肝表面抗原重组蛋白单克隆抗体；
(c)纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合。
CN202011500694.7A 2020-12-18 2020-12-18 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备 Active CN112521492B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011500694.7A CN112521492B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011500694.7A CN112521492B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112521492A true CN112521492A (zh) 2021-03-19
CN112521492B CN112521492B (zh) 2022-05-20

Family

ID=75001389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011500694.7A Active CN112521492B (zh) 2020-12-18 2020-12-18 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112521492B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234144A (zh) * 2021-05-26 2021-08-10 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞
CN115060904A (zh) * 2022-08-16 2022-09-16 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒
CN115283690A (zh) * 2022-08-16 2022-11-04 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种乙肝表面抗体检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒
CN117003856A (zh) * 2023-09-27 2023-11-07 南方医科大学南方医院 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞
CN117659171A (zh) * 2022-09-07 2024-03-08 东莞市朋志生物科技有限公司 抗HBeAg抗体或其功能性片段、检测HBeAg的试剂和试剂盒
CN117659171B (zh) * 2022-09-07 2024-10-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗HBeAg抗体或其功能性片段、检测HBeAg的试剂和试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994007922A1 (en) * 1992-09-30 1994-04-14 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
WO1994012617A1 (en) * 1992-11-25 1994-06-09 International Biotechnology Laboratories, Inc. Hepatitis b virus vaccines
US20020061581A1 (en) * 2000-05-29 2002-05-23 Lee Jong Wook Variable region of the monoclonal antibody against the HBV S-surface antigen and a gene encoding the same
US20120264921A1 (en) * 2009-12-24 2012-10-18 Green Cross Corporation Human antibodies specifically binding to the hepatitis b virus surface antigen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994007922A1 (en) * 1992-09-30 1994-04-14 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
WO1994012617A1 (en) * 1992-11-25 1994-06-09 International Biotechnology Laboratories, Inc. Hepatitis b virus vaccines
US20020061581A1 (en) * 2000-05-29 2002-05-23 Lee Jong Wook Variable region of the monoclonal antibody against the HBV S-surface antigen and a gene encoding the same
US20120264921A1 (en) * 2009-12-24 2012-10-18 Green Cross Corporation Human antibodies specifically binding to the hepatitis b virus surface antigen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李特特等: "利用单个细胞RT-PCR法克隆全人源性HBV单克隆抗体的探讨", 《临床肝胆病杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234144A (zh) * 2021-05-26 2021-08-10 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞
CN113234144B (zh) * 2021-05-26 2022-02-25 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞
CN115060904A (zh) * 2022-08-16 2022-09-16 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种乙肝表面抗原检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒
CN115283690A (zh) * 2022-08-16 2022-11-04 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种乙肝表面抗体检测试剂盒用胶体金溶液的制备方法及试剂条、试剂盒
CN117659171A (zh) * 2022-09-07 2024-03-08 东莞市朋志生物科技有限公司 抗HBeAg抗体或其功能性片段、检测HBeAg的试剂和试剂盒
CN117659171B (zh) * 2022-09-07 2024-10-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗HBeAg抗体或其功能性片段、检测HBeAg的试剂和试剂盒
CN117003856A (zh) * 2023-09-27 2023-11-07 南方医科大学南方医院 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞
CN117003856B (zh) * 2023-09-27 2023-12-01 南方医科大学南方医院 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞

Also Published As

Publication number Publication date
CN112521492B (zh) 2022-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112521492B (zh) 乙肝表面抗原单克隆抗体的制备
CN113150136B (zh) 新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备
CN112661849B (zh) 一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用
CN108084255B (zh) 一种重组犬c反应蛋白及其单克隆抗体的制备
CN110845582B (zh) 一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN116355091A (zh) 一种抗人神经丝轻链的单克隆抗体21d2-30d3及其产品和应用
CN112500479B (zh) 一种犬ⅱ型腺病毒重组蛋白单克隆抗体的制备
CN114276445B (zh) 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法
CN112521497B (zh) 肌红蛋白单克隆抗体的制备和应用
CN110078821B (zh) 肠道病毒d组68型vp1单克隆抗体的序列及其应用
CN105524173B (zh) 一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体及其应用
CN112608385B (zh) 一种犬脑钠肽(bnp)单克隆抗体的制备
CN113045666B (zh) 胃蛋白酶原ii单克隆抗体及其应用
CN106854244B (zh) 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用
CN114456262A (zh) 抗h1n1流感病毒核蛋白单克隆抗体zju-np-a1及其在检测中的应用
CN112812190B (zh) 一种抗小鼠和家兔IgG的羊驼单重链纳米抗体及应用
CN116041526B (zh) 一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114213543B (zh) 抗犬胰脂肪酶特异性单链抗体、质粒载体及方法
CN111606994A (zh) 非融合型抗桥粒芯糖蛋白dsg3兔源单克隆抗体的制备方法
JP7245373B2 (ja) 抗体の抗原に対する親和性を制御する方法、抗原に対する親和性が改変された抗体及びその製造方法
CN110903359B (zh) 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN112250765A (zh) 一种针对her2的纳米抗体及其应用
CN116987194B (zh) 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用
CN113512119B (zh) 一种抗ca125的纳米抗体5d2及其应用
CN110054675B (zh) 免疫原性多肽以及抗ttc36抗体cp4-3及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant