CN117003856B - 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞，属于生物技术领域。本发明提供了一种T细胞受体工程化T细胞，其携带HBs183特异性TCR，HBs183 TCR的α链可变区包括SEQ ID NO.2所示CDR1、SEQ ID NO.3所示CDR2和SEQ ID NO.4所示CDR3，β链可变区包括SEQ ID NO.5所示CDR1、SEQ ID NO.6所示CDR2和SEQ ID NO.7所示CDR3，其可识别HLA‑A02+T2细胞提呈的HBs183‑191抗原肽并分泌IFN‑γ和TNF‑α，可识别并杀伤整合HBV基因组HLA‑A02+HepG2.2.15细胞并分泌IFN‑γ。

Description

一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞
技术领域
本发明涉及一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞，属于生物技术领域。
背景技术
乙型病毒性肝炎（Viral Hepatitis type B, 简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染引起的以肝脏病变为主的一种传染病，其临床表现主要为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状，其病理特征主要为肝大，质地为中等硬度，有轻压痛，病情重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可异常或持续异常。乙肝分为慢性乙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB）和急性病毒型乙型肝炎（AcuteHepatitis B, AHB）两种。其中，慢性乙型病毒性肝炎会在多种因素诱导下向肝癌进展（参见文献：国际肝胆胰协会中国分会, 中国抗癌协会肝癌专业委员会, 中国研究型医院学会肝胆胰外科专业委员会, 中国研究型医院学会病毒肿瘤学专业委员会. 乙肝病毒相关肝细胞癌抗病毒治疗中国专家共识（2023版）. 中华消化外科杂志 2023, 22(1): 29-41.）。
研究表明，乙型肝炎病毒相关肝癌的发生除了受地域的影响外，还与慢性乙型病毒性肝炎患者体内HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平等因素密切相关。慢性乙型病毒性肝炎患者体内固有免疫和适应性免疫功能均低下，不能有效地清除肝细胞内的乙型肝炎病毒产物，同时，乙型肝炎病毒持续复制和炎症通路活化，均会导致慢性肝脏损伤，进而诱发肝癌（参见文献：Iannacone M, Guidotti LG. Immunobiology and pathogenesis of hepatitisB virus infection. NAT REV IMMUNOL 2022, 22(1): 19-32.）。因此，慢性乙型病毒性肝炎患者需要进行长期的抗病毒治疗及慢性乙型病毒性肝炎进展的终末期肝病的综合治疗以避免乙型肝炎病毒相关肝癌的发生。
现阶段，通常使用恩替卡韦（ETV）、富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）和富马酸丙酚替诺福韦（TAF）等核苷(酸)类（nucleos(t)ide analogues，NAs）抗病毒药物控制HBV病毒复制，亦可使用干扰素α（IFN-α）进行抗病毒治疗。但是，这些一线药物并不足以恢复慢性乙型病毒性肝炎患者有效的免疫调节能力，并且，停药后容易复发（参见文献：Yardeni D,Ghany MG. Review article: hepatitis B-current and emerging therapies. ALIMENTPHARM THER 2022, 55(7): 805-819.）。因此，亟需找到能够持续有效的控制乙型肝炎病毒复制的药物，以克服现有一线药物存在的缺陷。
T细胞免疫应答在控制包括乙型肝炎病毒在内的多种病毒感染中发挥关键作用（参见文献：Meidani M, Khorvash F, Hemati S, Ashrafi F, Ataei B, Daneshmand D.The Immune Response of Vaccination Against Hepatitis B virus in IranianPatientsUndergoing Chemotherapy. ADV BIOMED RES-INDIA 2017, 6: 88.）。T细胞识别病毒的关键元件即T细胞抗原受体（TCR）。T细胞通过乙型肝炎病毒特异性的T细胞抗原受体识别被乙型肝炎病毒感染的肝细胞从而清除乙型肝炎病毒病毒进而控制乙型肝炎病毒感染（参见文献：Ye B, Liu X, Li X, Kong H, Tian L, Chen Y. T-cell exhaustion inchronic hepatitis B infection: current knowledge andclinical significance.CELL DEATH DIS 2015, 6(3): e1694.）。而慢性乙型肝炎病毒感染时，广泛存在乙型肝炎病毒特异性T细胞的失能、耗竭或功能失调，进而导致乙型肝炎病毒持续感染（参见文献：Jiang D, Chen C, Yan D, Zhang X, Liu X, Yan D, Cui D, Yang S. Exhaustedphenotype of circulating CD8(+) T cell subsets in hepatitis B virus carriers.BMC IMMUNOL 2022, 23(1): 18.）。可见，恢复乙型肝炎病毒特异性T细胞对于持续有效的控制乙型肝炎病毒病毒复制，进而预防和/或治疗乙肝和乙型肝炎病毒相关肝癌至关重要。但是，目前尚未有基于T细胞抗原受体的能够持续有效的抑制乙型肝炎病毒复制的药物上市。因此，亟需找到基于乙型肝炎病毒特异性T细胞抗原受体的能够持续有效的治疗乙型肝炎病毒感染的药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种特异性识别HBsAg183-191肽段（HBsAg183-191肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）的HLA-A02限制性T细胞抗原受体（HBs183TCR），所述T细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR3，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示的CDR3。
T细胞抗原受体是T细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子，由α链和β链（分别由TRA和TRB编码）或者γ链和δ链（分别由TRG和TRD编码）构成的异二聚体，主要是以α链和β链构成的异二聚体为主，α链和β链或者γ链和δ链之间由二硫键连接，α链由V区（可变区）、J区和C区3个基因片段重组的基因进行编码，β链由V区（可变区）、D区、J区和C区4个基因片段重组的基因进行编码。T细胞抗原受体α链和β链的V区（可变区）包含互补决定区（complement-determiningregions, CDRs）和抗体骨架区（Framework region, FR），其中，CDRs的氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性，FR的主要作用是稳定CDRs的空间构型，以利于CDRs与抗原决定簇间的结合。
在本发明的一种实施方式中，所述T细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的FR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示的FR3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的FR4，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示的FR3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR4。
在本发明的一种实施方式中，所述T细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的FR2和氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示的FR3和氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的FR4，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示的FR3和氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR4。
在本发明的一种实施方式中，所述T细胞抗原受体的α链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述HLA-A02限制性T细胞抗原受体。
在本发明的一种实施方式中，编码所述T细胞抗原受体的α链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，编码所述T细胞抗原受体的β链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体或腺病毒表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pCDH-EF1α慢病毒表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有上述重组质粒；或者，所述宿主细胞的基因组整合有上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞共转染有上述重组质粒以及慢病毒包装质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为HEK-293T细胞、Jurkat细胞、NK细胞或原代人T细胞。
本发明还提供了一种重组病毒，所述重组病毒的基因组携带上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组病毒以慢病毒为载体表达上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组病毒的制备方法包括：将共转染有上述重组质粒以及慢病毒包装质粒的宿主细胞进行培养，得到培养液；从培养液中分离得到上述重组病毒。
本发明还提供了一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞（HBs183TCR-T细胞），所述T细胞受体工程化T细胞携带上述基因，或者，所述T细胞受体工程化T细胞携带上述T细胞抗原受体。
在本发明的一种实施方式中，所述T细胞受体工程化T细胞的制备方法包括：使用上述重组病毒感染T细胞，得到T细胞受体工程化T细胞。
本发明还提供了上述HLA-A02限制性T细胞抗原受体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述重组病毒或上述T细胞受体工程化T细胞在制备TCR药物，制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物，制备预防和/或治疗乙肝的药物，或者，制备预防和/或治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关肝癌的药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述TCR药物包括TCR-T细胞、TCR-NK细胞和/或可溶性TCR蛋白。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞（HBs183TCR-T细胞），HBs183TCR-T细胞携带特异性识别HBsAg183-191肽段的HLA-A02限制性T细胞抗原受体（HBs183TCR），HBs183TCR的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR3，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR3。研究发现，HBs183TCR-T细胞可特异性识别HLA-A02+T2细胞提呈的HBs183-191抗原肽并分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α，并且，HBs183TCR-T细胞可特异性识别并杀伤整合HBV基因组HLA-A02+HepG2.2.15细胞并分泌细胞因子IFN-γ。因此，HBs183TCR-T细胞在制备TCR药物，制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物，制备预防和/或治疗乙肝的药物，或者，制备预防和/或治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关肝癌的药物中的极具应用前景。
附图说明
图1：慢病毒联合多肽疫苗诱导HBs183-191特异性CD8+T细胞免疫反应的验证结果。
图2：HBs183TCR重组表达载体的结构示意图。
图3：HBs183 TCR-T细胞中TCR Vβ的表达水平。
图4：HBs183TCR-T细胞与负载HBs183-191肽段的T2细胞共孵育后CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的分泌水平（流式检测）。
图5：HBs183 TCR-T细胞正确组装及表达TCR的验证结果。图5中，A为经慢病毒转导后CD8+T细胞中TCR Vβ的表达水平，B为经慢病毒转导后CD8+T细胞中HBs183-191四聚体（HBs183-191Tetramer）的表达水平。
图6：HBs183TCR-T细胞与HepG2.2.15细胞分别以不同的效靶比共培养后T细胞对HepG2.2.15细胞的杀伤效果（白光拍摄）。
图7：HBs183 TCR-T细胞与HepG2.2.15细胞分别以不同的效靶比共培养后T细胞对HepG2.2.15细胞的杀伤功能（LDH检测）。
图8：HBs183 TCR-T细胞与HepG2.2.15细胞分别以不同的效靶比共培养后共培养上清中IFN-γ的表达水平（ELISA检测）。
图9：HBs183 TCR-T细胞的体内抗肿瘤效应（在NPG小鼠中建立HepG2.2.15细胞荷瘤模型，过继输注HBs183 TCR-T细胞，连续检测肿瘤生长）。
图10：HBs183 TCR-T细胞过继输注NPG小鼠治疗后的肿瘤重量。
图11：HBs183TCR-T细胞与不同T2细胞共孵育后共培养上清中IL-2的分泌水平。图11中，A为HBs183 TCR-T与负载HBs183-191肽或经Ala替换的突变肽的T2细胞共孵育后共培养上清中IL-2的分泌水平及其与WT对照的比值（ELISA检测）；B为HBs183 TCR-T与负载HBs183-191肽或经Gly替换的突变肽的T2细胞共孵育后共培养上中清IL-2的分泌水平及其与WT对照的比值（ELISA检测）。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞（HBs183TCR-T细胞）的获取及验证
1、实验方法
1.1、HBs183TCR的获取
通过利用表达HBsAg重组载体和第三代慢病毒包装系统，通过PEI共转染HEK293T细胞进行病毒包装，经超高速离心及超滤浓缩，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示表达HBsAg的慢病毒；以表达HBsAg的慢病毒作为抗原，参照文献“Wu S, Zhu W, Peng Y, WangL, Hong Y, Huang L, Dong D, Xie J, Merchen T, Kruse E, Guo ZS, Bartlett D, FuN, He Y. The Antitumor Effects of Vaccine-Activated CD8(+) T Cells Associatewith Weak TCRSignaling and Induction of Stem-Like Memory T Cells. CANCERIMMUNOL RES 2017, 5(10): 908-919.”以及文献“Hong Y , Peng Y , Mi M , Xiao H ,Munn DH , Wang GQ , He Y . Lentivector expressing HBsAg and immunoglobulin Fcfusion antigen induces potent immune responses and results in seroconversionin HBsAg transgenic mice. Vaccine 2011, 17;29(22):3909-16.”对5~6周龄的HLA-A02雌性转基因小鼠（参见文献“Epstein H, Hardy R, May JS, Johnson MH, Holmes N.Expression and function of HLA-A2.1 in transgenic mice. EUR J IMMUNOL 1989,19(9): 1575-1583.”）进行初次免疫，免疫计量为2×107Tu，注射方式为足垫注射；完成初次免疫5天后，流式检测所有经初次免疫小鼠外周血中CD8+T细胞对HBsAg183-191表位肽的反应；
化学合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HBsAg183-191肽段作为HBs183-191多肽疫苗；完成初次免疫14天后，以HBs183-191多肽疫苗作为抗原，对经初次免疫的小鼠进行加强免疫，免疫计量为0.1mg，注射方式为尾静脉注射；完成加强免疫4天后，流式检测所有经加强免疫小鼠外周血及脾脏中CD8+T细胞对HBsAg183-191表位肽的反应（检测结果见图1）；
利用磁珠分选获取经加强免疫小鼠脾脏中CD8+T细胞，并对获取的CD8+T细胞进行TCR测序；根据TCR测序结果，筛选并获取HBs183特异性TRAV和TRBV的CDR1、CDR2、CDR3序列，以及，α链和β链V(D)J基因信息；在获得的HBs183特异性TRAV和TRBV的CDR1、CDR2、CDR3序列，以及，α链和β链V(D)J基因信息中引入小鼠TRAC和TRBC基因序列，复原完整的TCR的α链及β链，即得特异性识别HBsAg183-191肽段（HBsAg183-191肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）的HLA-A02限制性T细胞抗原受体（HBs183TCR）。所得HBs183TCR的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的CDR3，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR3，α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的FR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示的FR3和氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的FR4，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2、氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示的FR3和氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR4，α链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示（编码α链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示），β链的氨基酸序列如SEQID NO.17所示（编码β链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示）。
1.2、表达HBs183TCR的慢病毒颗粒的构建
取4μg慢病毒载体pCDH-EF1α（Addgene #72266）、0.5μL内切酶BamH Ⅰ（购自NEB）和0.5μL内切酶Sal（购自NEB）添加至20μL酶切缓冲液（购自NEB）中，置于37℃水浴锅中反应60min后，跑胶回收线性DNA，得到经双酶切的慢病毒载体pCDH-EF1α；通过核苷酸序列如SEQID NO.22所示的编码P2A连接肽（氨基酸序列如SEQ ID NO.23）的基因连接编码α链的基因和编码β链的基因，得到HBs183TCR目的基因序列；利用T4 DNA连接酶（购自NEB）将HBs183TCR目的基因序列与经双酶切的慢病毒载体pCDH-EF1α连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞HB101（购自Takara），得到转化产物；将转化产物在含50μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板培养基（购自Thermo Fisher）上划线，于37℃培养24h，挑取单菌落；将单菌落接种至3mL LB液体培养基（购自Thermo Fisher），于37℃培养24h，得到菌液；抽提菌液中的重组质粒进行测序，测序成功即得核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的HBs183TCR慢病毒载体pCDH-EF1α-HBs183TCR（HBs183TCR慢病毒载体pCDH-EF1α-HBs183TCR的结构见图2）；
将HEK293T细胞（来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库）以5×106个的接种量接种至添加有20mL含10%（v/v）胎牛血清和1%（w/v，g/100mL）盘尼西林-链霉素双抗的DMEM培养基（购自gibico）的15cm细胞培养皿中，利用PEI将第三代慢病毒包装质粒（购自Addgene）和pCDH-EF1α-HBs183TCR共转染至HEK293T细胞中；于37℃转染8h后，更换新鲜培养基，于37℃继续培养48h；培养结束后，收集培养上清，于10000g下超高速离心6小时进行浓缩；取沉淀，即得表达HBs183TCR的慢病毒颗粒。
1.3、HBs183TCR-T细胞的构建
用PBS缓冲液（购自Gibico）以体积比1：1稀释健康人全血（取自南方医院志愿者），得到经稀释的全血；将经稀释的全血和淋巴细胞分离液Percol（购自Stemcell）按照体积比2：1混合后，于800g下离心25min；离心结束后，用巴氏管吸取白沫层，即得外周血单核细胞（PBMC）；用PBS缓冲液洗涤外周血单核细胞两次后，利用磁珠分选外周血单核细胞中的T细胞；将T细胞以2×106个的接种量至2mL含10%（v/v）胎牛血清、10%（w/v，g/100mL）盘尼西林-链霉素双抗、10ng/mL细胞因子IL-2（购自PEPROTECH）、10ng/mL细胞因子IL-7（购自PEPROTECH）、10ng/mL细胞因子IL-15（购自PEPROTECH）和200ng/mL anti-CD3/CD2（购自Stemcell）的RPMI1640培养基（购自gibico）中，于37℃培养48h；培养结束后，取含2×106个T细胞的细胞培养液，将表达HBs183TCR的慢病毒颗粒以MOI=1的感染复数接种至细胞培养液中进行感染；于37℃感染72h后，离心清洗细胞，更换新鲜培养基，于37℃继续感染7d，其中，新鲜培养基在原培养基的基础上，额外添加有10ng/mL细胞因子IL-2（购自PEPROTECH）；感染结束后，取1μg流式抗体FITC-TCR Vβ（购自Biolegend）和1μg PE-HBs183-191四聚体（PE-HBs183-191Tetramer，购自MBL）添加至细胞培养液中，于37℃孵育30min，得到靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞（HBs183TCR-T细胞，编号为TCR11）。
在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.24，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.25，得到TCR1；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ IDNO.26，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.27，得到TCR2；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.28，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.29，得到TCR3；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.30，将β链的氨基酸序列替换为SEQID NO.31，得到TCR4；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.32，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.33，得到TCR5；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.34，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.35，得到TCR6；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.36，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.37，得到TCR7；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.38，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.39，得到TCR8；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ IDNO.40，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.41，得到TCR9；在TCR11的基础上，将α链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.42，将β链的氨基酸序列替换为SEQ ID NO.43，得到TCR10（TCR1~TCR10中α链和β链的氨基酸序列的获得方法与TCR11相同，为不同小鼠脾脏细胞所得）。
通过流式细胞术检测TCR1~TCR11中TCR Vβ的表达水平，检测结果见图3。通过流式细胞术检测TCR1~TCR11中IFN-γ和TNF-α的分泌水平，检测结果见图4。通过流式细胞术检测TCR11中HBs183-191四聚体的表达水平，检测结果见图5。
1.4、HBs183TCR-T细胞抗HBV及HBV相关肝癌的功能的验证
实验一：取T2细胞（购自iCell Bioscience）以5×105个/mL的接种量接种至含1μg/mL HBs183-191肽段的二甲基亚砜（DMSO）中后，于37℃孵育60min，得到负载HBs183-191肽段的HLA-A02+T2细胞（负载HBs183-191肽段的浓度为1μg/mL）；取2.5×105个HBs183TCR-T细胞（TCR11）和2.5×105个负载HBs183-191肽段的HLA-A02+T2细胞接种于500μL含1μg/mL高尔基复合物阻断剂（购自Biolegend）的RPMI1640培养基（购自Gibico）中，于37℃共孵育6h（每组设置3个复孔）；孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞，并取50μL PBS缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液；取1μg流式抗体CD8（购自Biolegend）添加至细胞悬液中，于4℃共孵育30min；孵育结束后，先加入2mL PBS缓冲液终止染色，再于450g离心5min；离心结束后，在细胞悬液中加入300μL 4%（w/v，g/100mL）多聚甲醛，于37℃孵育20min固定细胞；固定结束后，在细胞悬液中加入1mL破膜剂（Perm/Wash buffer，购自Biolegend），于37℃孵育20min进行破膜；破膜结束后，在细胞悬液中加入1μg流式抗体IFN-γ（购自Biolegend）和1μg流式抗体TNF-α（购自Biolegend），于4℃孵育30min标记胞内因子；标记结束后，先使用1mL破膜剂（Perm/Washbuffer，购自Biolegend）洗涤细胞，再通过流式细胞术检测细胞因子IFN-γ的分泌水平来验证HBs183TCR-T细胞识别特异性抗原肽的能力，检测结果见图4。
实验二：参见文献“Production of hepatitis B virus particles in Hep G2cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. PNAS, PMID: 3029758,DOI:10.1073/pnas.84.4.1005”，取HepG2.2.15细胞（购自iCell Bioscience），通过慢病毒转导将HBV基因组整合至HepG2.2.15细胞中，得到整合HBV基因组肝癌细胞系HLA-A02+HepG2.2.15细胞；将整合HBV基因组肝癌细胞系HLA-A02+HepG2.2.15细胞以每孔5×104个的接种量接种至每孔添加有100μL DMEM培养基（购自Gibico）的96孔培养板中，于37℃培养12h（每组设置3个复孔）；培养结束后，按照不同效靶比（效应细胞：靶细胞=0：1、0.5：1、1：1、2：1，其中，HBs183 TCR-T细胞为效应细胞，整合HBV基因组肝癌细胞系HLA-A02+HepG2.2.15细胞为靶细胞）比例，加入HBs183 TCR-T细胞（TCR11），继续于37℃培养12h；培养结束后，白光观察HepG2.2.15细胞被杀伤情况（观察结果见图6），使用LDH检测试剂盒（购自Promega）检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的分泌水平，并计算HepG2.2.15细胞死亡比例（检测结果见图7），使用IFN-γ的ELISA试剂盒（购自Biolegend）检测培养上清中细胞因子IFN-γ的分泌水平（检测结果见图8）。
实验三：取HepG2.2.15细胞（购自iCell Bioscience）以5×106个的接种量接种于NPG（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Vst/Vst）小鼠（购自北京维通达生物技术有限公司）皮下；接种肿瘤细胞第2天，以转染外源性TCR的T细胞（Mock-T细胞）为对照，对小鼠经尾静脉输注5×106个HBs183 TCR-T细胞（TCR11）；静脉注射后，每隔一天对小鼠体内肿瘤的体积进行测量（测量结果见图9），于接种肿瘤细胞第35天，处死小鼠，分离小鼠皮下肿瘤，测量肿瘤重量（测量结果见图10）。
1.5、评估HBs183TCR-T细胞安全性
利用Ala或Gly对HBs183-191多肽上每一个氨基酸进行突变，得到HBs183-191突变肽；使用二甲基亚砜（DMSO）将HBs183-191突变肽稀释至浓度为1μg/mL，得到经稀释的HBs183-191突变肽；在1.4的实验一的基础上，以HBs183-191肽段为WT对照，将含1μg/mL HBs183-191肽段的二甲基亚砜（DMSO）分别替换为经稀释的HBs183-191突变肽，并在孵育结束后，取出每孔培养上清，使用IL-2的ELISA试剂盒（购自Biolegend）检测培养上清中细胞因子IL-2的分泌水平，并计算突变肽IL-2水平与WT对照的比值（Mut：WT），比值大于1则考虑该TCR特异性较差，检测结果见图11。
2、实验结果
图1的结果表明：慢病毒联合多肽疫苗成功诱导HBs183-191特异性CD8+T细胞免疫反应。经HBs183-191多肽疫苗加强免疫小鼠后第5天，处死小鼠获取脾细胞，加入HBs183-191进行孵育，胞内因子染色及流式检测证实小鼠脾脏中CD8+T细胞可对HBs183-191肽产生特异性应答，分泌效应因子IFN-γ。
图2的结果表明：构建HBs183TCR重组表达载体。该TCR重组载体包含HBs183TRAV及TRBV序列及引入的鼠源TRAC和TRBC序列。
图3的结果表明：慢病毒转导构建的HBs183 TCR-T细胞可以表达TCR Vβ。
图4的结果表明：筛选对HBs183-191肽段有特异性反应的功能性HBs183TCR细胞。HBs183TCR-T细胞与负载HBs183-191肽的T2细胞共孵育后流式检测CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的分泌。TCR1~TCR11中，TCR11能对HBs183-191肽产生显著应答，因此鉴定TCR11为功能性TCR。
图5的结果表明：构建的HBs183TCR-T细胞（TCR11）可结合相应的四聚体（Tetramer），说明该HBs183TCR-T细胞可特异识别HBs183-191抗原肽。
图6~8的结果表明：HBs183TCR-T细胞与HepG2.2.15细胞分别以不同的效靶比共培养后对HepG2.2.15细胞的杀伤效果。将HBs183TCR-T细胞（TCR11）与HLA-A02+HepG2.2.15细胞共培养12小时，白光可观察到HepG2.2.15细胞被HBs183TCR-T杀伤，形成死细胞聚团集落，而Mock-T共培养组没有此现象。检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）分泌，计算HepG2.2.15细胞死亡比例，与Mock-T共培养组相比，HBs183TCR-T共培养组中HepG2.2.15细胞死亡比例随效靶比梯度依赖升高。HBs183TCR-T共培养组中IFN-γ细胞因子分泌也随效靶比梯度依赖升高。
图9~10的结果表明：将HepG2.2.15细胞接种至NPG小鼠皮下，次日经尾静脉过继输注HBs183 TCR-T细胞（TCR11）或Mock-T细胞，检测肿瘤生长。输注HBs183 TCR-T细胞组的小鼠肿瘤生长较输注Mock-T细胞组的小鼠肿瘤缓慢，肿瘤体积较小。于接种肿瘤后的35天处死小鼠，分离小鼠肿瘤，测量肿瘤重量，输注HBs183 TCR-T细胞组的小鼠肿瘤重量较输注Mock-T细胞组的小鼠肿瘤重量小。
图11的结果表明：HBs183TCR-T细胞安全性评估。HBs183TCR-T细胞（TCR11）与负载HBs183-191肽或经Ala替换的突变肽的T2细胞共孵育后，ELISA检测上清IL-2分泌的水平，ELISA检测上清，Mut:WT比值均小于1；HBs183 TCR-T细胞（TCR11）与负载HBs183-191肽或经Gly替换的突变肽的T2细胞共孵育后，ELISA检测上清IL-2的水平，Mut:WT比值均小于1。上述结果提示HBs183TCR特异性较好，交叉反应性较低或安全性良好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种靶向乙肝表面抗原的HLA-A02限制性T细胞抗原受体，其特征在于，所述T细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR3，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的靶向乙肝表面抗原的HLA-A02限制性T细胞抗原受体，其特征在于，所述T细胞抗原受体的α链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的FR3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的FR4，β链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的FR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的FR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的FR3和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的FR4。
3.如权利要求1或2所述的靶向乙肝表面抗原的HLA-A02限制性T细胞抗原受体，其特征在于，所述T细胞抗原受体的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的HLA-A02限制性T细胞抗原受体。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转染有权利要求5所述的重组质粒；或者，所述宿主细胞的基因组整合有权利要求4所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞共转染有权利要求5所述的重组质粒以及慢病毒包装质粒。
8.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒的基因组携带权利要求4所述的核酸分子。
9.一种靶向乙肝表面抗原的T细胞受体工程化T细胞，其特征在于，所述T细胞受体工程化T细胞携带权利要求4所述的核酸分子，或者，所述T细胞受体工程化T细胞携带权利要求1~3任一项所述的T细胞抗原受体。
10.权利要求1~3任一项所述的靶向乙肝表面抗原的HLA-A02限制性T细胞抗原受体或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组质粒或权利要求6或7所述的宿主细胞或权利要求8所述的重组病毒或权利要求9所述的T细胞受体工程化T细胞在制备治疗乙肝的药物，或者，制备治疗乙型肝炎病毒相关肝癌的药物中的应用。
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