CN113234144A - 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞 - Google Patents

一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞。该单链抗体的氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，并且两者通过链接区连接，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：2；编码该单链抗体的基因序列为SEQ I D No：4；本发明的单链抗体是利用基因重组技术获得的乙肝免疫球蛋白，其来源非血源性，有效避免了血液疾病带来的危险；本发明的单链抗体具有良好活性，可在保证安全性的前提下迅速起效，避免乙肝病毒定位感染。

Description

一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载 体质粒及宿主细胞
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起乙型肝炎的病原体。感染HBV会导致多种肝病，包括急性肝炎(AH)、暴发性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)等。乙型肝炎病毒感染呈世界性流行，全球有约2.57亿慢性HBV感染者，非洲区和西太平洋区占68％。全球每年约有88.7万人死于HBV感染。乙肝表面抗体可以与乙肝病毒表面特异性位点结合，并阻止其侵袭肝细胞。
预防乙肝的生物制品有两种，乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白(HBIg)，乙肝疫苗是提纯乙肝表面抗原，是一种灭活疫苗，用于预防乙肝病毒感染的生物制品，乙肝疫苗接种后可刺激机体免疫系统产生乙肝表面抗体，乙肝表面抗体一旦乙肝病毒接触，就会立即与病毒结合并激活补体，清除病毒，防止机体被感染。乙肝免疫球蛋白是一种浓缩的预防乙肝病毒入侵复制的被动免疫制剂。让人体被动地接受这种高效价的外源性抗体，可使机体迅速获得被动保护免疫力，能短期内迅速起效，中和并清除血清中游离的乙肝病毒，避免乙肝病毒定位感染。
HBIg在母婴垂直传播及其它应急情况的预防中起着举足轻重的作用。然而，现有技术中HBIg均为人血源抗体。由于各类肝炎和艾滋病等血源性传染病的蔓延，导致血源性乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的安全性逐渐降低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，并且两者通过链接区连接，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：2。
进一步，所述单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID No：3。
进一步，所述氨基酸序列的羧基末端连接有6His的标签。
进一步，所述单链抗体用于制备预防乙肝的生物制剂。
本发明提供一种预防乙肝的制剂，所述生物制剂中含有如上述的单链抗体。
本发明提供一种用于编码上述的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体的基因，所述基因序列为SEQ ID No：4；其中，用于编码所述重链可变区的基因序列为SEQ ID No：5，用于编码所述轻链可变区的基因序列为SEQ ID No：6。
本发明提供一种载体质粒，所述载体质粒含有上述的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体的基因。
本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有上述的载体质粒。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，是利用基因重组技术获得的乙肝免疫球蛋白，其来源非血源性，有效避免了血液疾病带来的危险；
2)经验证，本发明的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体具有良好活性，可在保证安全性的前提下迅速起效，避免乙肝病毒定位感染。
3)本发明构建的人源性乙肝表面抗原单链抗体，为重组抗体的应用奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中，重链可变区VH和轻链可变区VL基因的PCR产物电泳图；
图2为本发明实施例1中，单链抗体的基因片段PCR产物电泳图；
图3为本发明实施例1中，重组质粒双酶切后的基因片段PCR产物电泳图，其中，泳道1中的特异性条带为EcoRI+AgeI消化后的pPICZαA-HBscFv质粒，泳道2中的特异性条带为pPICZαA-HBscFv质粒；
图4为本发明实施例1中，DNA序列进行测定的序列图；
图5为本发明实施例1中，单链抗体氨基酸序列进行测定的序列图；
图6为本发明实施例2中，菌落PCR鉴定酵母转化子的电泳图；
图7为本发明实施例2中，毕赤酵母培养上清的SDS-PAGE电泳图；
图8为本发明实施例2中，毕赤酵母菌体的SDS-PAGE电泳图；
图9为本发明实施例3中，表达上清Western-blot分析电泳图，其中，泳道1-3的条带分别为上样量10μL、20μL、30μL的特异性条带。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，由重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)以及用于连接所述重链可变区和所述轻链可变区的链接区组成；单链抗体由255个氨基酸组成，其氨基酸序列为SEQ ID No：3(Glu Phe Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly GlyGly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe IlePhe Asp Asp Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu TrpVal Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys GlyArg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn SerLeu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Phe Ala Arg Ala Trp SerGly Pro Gln Phe Thr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr ThrVal Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu ArgAla Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Gln Phe Ala Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Cys Gly Ala Ser Ser Arg AlaThr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu ThrIle Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln His Tyr Gly SerLeu Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn Arg Val Asp)。
优选的，氨基酸序列的羧基末端连接有6His的标签，便于乙肝表面抗原单链抗体的纯化。
重链可变区的氨基酸序列为自N末端第1-130位，其氨基酸序列为SEQ ID No：1(Glu Phe Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Phe Gly Met Thr TrpVal Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn GlyGly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp AspAla Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala LeuTyr Tyr Cys Ala Lys Phe Ala Arg Ala Trp Ser Gly Pro Gln Phe Thr Asp Tyr TyrTyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser )，轻链可变区的氨基酸序列为自N末端第146-255位，其氨基酸序列为SEQ ID No：2(Asp Ile Glu LeuThr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser CysArg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Gln Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro GlyGln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Cys Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro AspArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln His Tyr Gly Ser Leu Gly Thr Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn Arg Val Asp)。
优选的，该单链抗体用于制备预防乙肝的生物制剂，该生物制剂包括但不限于药物或疫苗。
本发明的预防乙肝的制剂，含有上述单链抗体。
本发明的单链抗体通过核苷酸序列为SEQ ID No： 4(gaattccaag tgcagctgttggagtctggg ggaggtgtgg tacggcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcatctttgatgatt ttggcatgac gtgggtccgc caagttccag ggaaggggct ggagtgggtc tctggtattaattggaatgg tggtagaaca ggttatgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgccaagaactcc ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccttgtacta ctgtgcgaaattcgctagag cgtggagtgg ccctcaattc accgactact actactacat ggacgtgtgg ggcaaagggaccacggtcac cgtctcctca ggtggcggag ggagcggtgg agggggcagt ggcggaggag gtagcgacatcgagctgacc cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggccagtcagagtg ttagcagcag ccagtttgcc tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctcatctgtggtgc atccagcagg gccactggca tcccagacag gttcagtggc agtgggtctg ggacagacttcactctcacc atcagcagac tggagcctga agattttgca gtgtatcact gtcagcacta tggtagcttggggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaatcgag tcgac)的基因进行编码，该基因由765个核苷酸组成；其中，用于编码重链可变区的基因为，自5'末端第1-390位核苷酸，序列为SEQ ID No：5(gaattccaag tgcagctgtt ggagtctggg ggaggtgtgg tacggcctgg ggggtccctgagactctcct gtgcagcctc tggattcatc tttgatgatt ttggcatgac gtgggtccgc caagttccagggaaggggct ggagtgggtc tctggtatta attggaatgg tggtagaaca ggttatgcag actctgtgaagggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactcc ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagccgaggacacgg ccttgtacta ctgtgcgaaa ttcgctagag cgtggagtgg ccctcaattc accgactactactactacat ggacgtgtgg ggcaaaggga ccacggtcac cgtctcctca)，用于编码轻链可变区的基因为，自5'末端第436-765位核苷酸，序列为SEQ ID No：6(gacatcgagc tgacccagtctccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagcagcagccagt ttgcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctgt ggtgcatccagcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcagcagactggag cctgaagatt ttgcagtgta tcactgtcag cactatggta gcttggggac gttcggccaagggaccaagg tggaaatcaa tcgagtcgac)。
另外，上述基因序列SEQ ID No：4中，自5'末端第391-435位的核苷酸用于编码链接区的氨基酸序列。
本发明通过以下实施例制备和验证该单链抗体；实施例使用的实验材料中，质粒DNA快速抽提试剂盒、割胶纯化回收试剂盒均购自于上海生工生物工程公司；采用的菌株及质粒均为实验室保藏；实验中所有酶试剂均购自TAKARA公司。
实施例1
构建重组质粒，包括以下步骤：
1)高乙肝表面抗体滴度健康人外周血中淋巴细胞的分离：抽取高乙肝表面抗体滴度健康人的外周血(肝素预处理)，等量PBS液稀释，加人淋巴细胞分离液，离心20min。吸取中间白色细胞层置于另一个离心管中，用PBS等量稀释，再离心10min.小心弃去上清，再用PBS液洗2遍后用3mL PBS重悬沉淀。
2)提取总细胞RNA和cDNA的合成：向淋巴细胞中加入等体积RNAiso Plus向匀浆裂解液中加入1/5体积氯仿，混匀后室温放置5min,4℃离心15min,将上层水相移至另一个离心管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀10min,再4℃离心15min后弃去上清，加入75％乙醇洗涤2遍后室温蒸发残存乙醇，将总RNA溶于50μL DEPC水中，-80℃保存备用。取1μL样品测定A260和A280计算其纯度，A280/A280＝1.7～2.0表示纯度合格。再以总RNA样品进行逆转录反应合成cDNA。
3)PCR扩增VH及VL基因：分别采用针对VH及VL的多对引物进行PCR扩增，以cDNA为模板扩增全套VH及VL基因，反应体系为50μL,反应条件为：以94℃1min,52℃1min,72℃2min的顺序循环扩增35个循环。72℃延伸10min后进行检测。每个反应管取10μL在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳，看到VH在380bp处有目的条带，VL在330bp处有目的带。再分别以设计带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的连接引物，利用上述PCR体系为模板进行扩增，为scFv的拼接做准备。具体的，VH及VL的引物序列如下：
VH重链可变区引物：
5'端：
VH1f如序列SEQ ID No：7：5'-GACATTGTGTTGACCCAGTCTCC-3'；
VH2f如序列SEQ ID No：8：5'-GACATCGAGCTGACCCAGTCT-3'；
VH3f如序列SEQ ID No：9：5'-GACATCGAGTTGACCCAGTCTCC-3'；
VH4f如序列SEQ ID No：10：5'-GACATCGAGTTGACCCAGTCTCC-3'；
3'端：
VH1r如序列SEQ ID No：11：5'-TGAGGAGACGGTGACCAGGG-3'；
VH2r如序列SEQ ID No：12：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGG-3'；
VL轻链可变区引物：
5'端：
VL1f如序列SEQ ID No：13：5'-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3；
VL2f如序列SEQ ID No：14：5'-CAAGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'；
VL3f如序列SEQ ID No：15：5'-CAGATCCAGCTGGTGCAGTCT-3'；
VL4f如序列SEQ ID No：16：5'-CAGGTGCAGCTGTTGGAGTC-3'；
3'端：
VL1r如序列SEQ ID No：17：5'-TCGATTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'；
VL2r如序列SEQ ID No：18：5'-TCGTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3'；
VL3r如序列SEQ ID No：19：5'-TCGTTTGATCTCCACCCTGGTCC-3'；
VL4r如序列SEQ ID No：20：5'-TCGTTTGATCTCCACCTTGGTCC-3'。
如图1所示，根据DNA Marker，得到的两条特异性条带可以确定分别为的VH和VL，证明扩增产物为VH和VL基因。
4)构建单链抗体(scFv)基因序列：分别以步骤3)中得到的VH和VL基因为模板，加入两端引物配置PCR扩增体系，利用设计好的Linker以及T4 DNA连接酶建立连接体系，以94℃1min,52℃1min,72℃2min的顺序循环扩增35个循环。72℃延伸10min后收集PCR产物电泳验证，切胶纯化作为模板，加入VH5'引物和VL3'引物用同样的配置及条件再次进行PCR，取扩增产物10μL在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳，可以看到750bp左右的条带，证明拼接成功，回收scFv基因产物。
设计SOEing PCR引物：
SOEing PCR VH 5'第一引物如序列SEQ ID No：21：
5'-TTGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3'；
SOEing PCR VH 3'第一引物如序列SEQ ID No：22：
5'-CCGCCACTGCCCCCTCCACCGCTCCCTCCGCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'；其中，下划线的部分序列为Linker序列(CCGCCACTGCCCCCTCCACCGCTCCCTCCGCCACC)。
SOEing PCR VH 5'第二引物如序列SEQ ID No：23：
5'-GGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCGACATTGTGTTGACCCAGTCT-3'；其中，下划线的部分序列为Linker序列(GGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGT)。
SOEing PCR VH 3'第二引物如序列SEQ ID No：24：
5'-GTCGACTCGATTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'。
如图2所示，根据DNA Marker可以鉴定得出，泳道1中的特异性条带为单链抗体基因片段。
5)重组质粒pPICZαA-HBscFv的构建：利用回收的ScFv基因产物为模板，设计分别带有EcoRⅠ和SalⅠ位点的引物，建立PCR体系，将回收后的产物与已经经过EcoRⅠ和SalⅠ酶切好的pPICZαA建立连接体系，16℃水浴连接16h。
6)重组质粒pPICZαA-HBscFv的序列测定：连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α，并涂于含50mg/L Zeocin的低盐LB平板上，37℃保温16h后，挑取10个克隆于LB培养基中培养后提取重组质粒，再用EcoRI+Age I进行双酶切鉴定。用质粒快速提取试剂盒提取重组质粒并测序。
图3为双酶切的鉴定结果，其中，泳道1的特异性条带为EcoRI+Age I消化后的pPICZαA-HBscFv重组质粒，长度为3501bp+757bp，泳道2的特异性条带为pPICZαA-HBscFv重组质粒，长度为4258bp。
图4为编码单链抗体的DNA序列，图5单链抗体的氨基酸序列。
实施例2
毕赤酵母表达重组质粒，包括以下步骤：
1)pPICZαA-HBscFv重组质粒转化毕赤酵母X-33：将实施例1中得到的重组质粒定量后，经Sac I酶线性化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于10μL水中。LiCl法转化毕赤酵母X-33，于含ZeocinTM的YPD平板上筛选，30℃培养2～3d至转化子出现。
图6为菌落PCR鉴定毕赤酵母转化子结果，可以看出，1～7泳道中的条带中，1～5和7条带均在750bp左右，可以认为转化子出现。
2)菌落PCR检测目的基因整合：取适量转化子菌落，悬于10μL无菌水中，加入1UZymolase消化10min，冷冻30min，融化后作为模板，PCR扩增酵母基因组中的目的基因。
3)毕赤酵母培养上清的SDS-PAGE分析：取适量菌液涂于含100mg/LZeocin的YPD平板上，28℃保温48-72h使转化子单菌落长出，接种单菌落至25mL BMGY培养基，30℃振荡培养至OD600为2～6，离心收集细胞，接种到BMMY中，在pH6.0，28℃，甲醇补给量为1％的条件下诱导表达重组菌株，分别在24h，48h，60h，72h，84h分别取少量的培养液使用SDS-PAGE法测定发酵液中蛋白质含量。
图7为毕赤酵母培养上清的SDS-PAGE分析结果，可以看出，诱导表达后在28kd处出现一条特异性蛋白条带，与理论值相符，初步认为HBscFv已经在毕赤酵母菌株中表达，分子量为28kD。
4)酵母菌体蛋白SDS-PAGE分析：取菌体沉淀加上样缓冲液煮沸，12％的SDS-PAGE分析如图8所示，可以看出，菌体中在28kD处没有表达，因此发现在菌体总蛋白中没有HBscFv样蛋白带。说明工程菌合成的HBscFv已在α前导肽的引导下分泌至胞外。
实施例3
人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体的活性分析，包括以下步骤：
1)Western-blot分析：取上清液进行Western-blot，以能特异性识别HBscFv N末端融合表位的His-Tag(27E8)Mouse mAb(HRP Conjugate)作为第一抗体，羊抗鼠IgG-AP作为第二抗体进行Western-blot分析；图9中，泳道1-3分别为上样量10μL、20μL、30μL，可以明显看出在28kD有特异性条带，表明HBscFv抗体在胞外表达。
2)间接ELISA分析：将上清液进行间接Elisa测定，结合HBsAg活性。HBscFv复性产物及对照品(DHFR)的间接ELISA结果用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。参考值cut-off value(COV)＝阴性对照平均OD值x2.1，阴性对照OD值低于0.050作0.050计算，0.050≤OD<0.100的按实际OD值计算。当阴性对照OD值>0.100时，结果无效，需重复试验。HBscFv吸收值高于临界值，说明重组产物具有HBsAg抗原结合活性；间接Elisa活性测定结果如表1所示：
表1人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体间接Elisa活性测定结果
Figure BDA0003085053240000111
通过以上实施例可以证明，本发明的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体具有良好的活性。
在实际使用中，通过人工合成的方式合成核苷酸序列SEQ ID No：4，并构建质粒、宿主细胞，使该核苷酸序列表达即得到该单链抗体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉工程大学
<120> 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞
<141> 2021-05-11
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Phe Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp
20 25 30
Asp Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Phe Ala Arg Ala Trp Ser Gly Pro Gln Phe Thr Asp
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Gln Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Cys Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln His Tyr Gly Ser Leu Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn Arg Val Asp
100 105 110
<210> 3
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Phe Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp
20 25 30
Asp Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Phe Ala Arg Ala Trp Ser Gly Pro Gln Phe Thr Asp
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
145 150 155 160
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
165 170 175
Ser Gln Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
180 185 190
Leu Ile Cys Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
210 215 220
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gln His Tyr Gly Ser Leu
225 230 235 240
Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asn Arg Val Asp
245 250 255
<210> 4
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaattccaag tgcagctgtt ggagtctggg ggaggtgtgg tacggcctgg ggggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcatc tttgatgatt ttggcatgac gtgggtccgc 120
caagttccag ggaaggggct ggagtgggtc tctggtatta attggaatgg tggtagaaca 180
ggttatgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactcc 240
ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccttgtacta ctgtgcgaaa 300
ttcgctagag cgtggagtgg ccctcaattc accgactact actactacat ggacgtgtgg 360
ggcaaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggcggag ggagcggtgg agggggcagt 420
ggcggaggag gtagcgacat cgagctgacc cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca 480
ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc agtcagagtg ttagcagcag ccagtttgcc 540
tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc aggctcctca tctgtggtgc atccagcagg 600
gccactggca tcccagacag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt cactctcacc 660
atcagcagac tggagcctga agattttgca gtgtatcact gtcagcacta tggtagcttg 720
gggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaatcgag tcgac 765
<210> 5
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaattccaag tgcagctgtt ggagtctggg ggaggtgtgg tacggcctgg ggggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcatc tttgatgatt ttggcatgac gtgggtccgc 120
caagttccag ggaaggggct ggagtgggtc tctggtatta attggaatgg tggtagaaca 180
ggttatgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactcc 240
ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccttgtacta ctgtgcgaaa 300
ttcgctagag cgtggagtgg ccctcaattc accgactact actactacat ggacgtgtgg 360
ggcaaaggga ccacggtcac cgtctcctca 390
<210> 6
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gacatcgagc tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagccagt ttgcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctgt ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta tcactgtcag cactatggta gcttggggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa tcgagtcgac 330
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gacattgtgt tgacccagtc tcc 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gacatcgagc tgacccagtc t 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gacatcgagt tgacccagtc tcc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gacatcgagt tgacccagtc tcc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgaggagacg gtgaccaggg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tgaggagacg gtgaccgtgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
caggtgcagc tggtggagtc 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
caagtgcagc tgttggagtc tg 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cagatccagc tggtgcagtc t 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
caggtgcagc tgttggagtc 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tcgattgatt tccaccttgg tccc 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tcgtttgatt tccaccttgg tcc 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
tcgtttgatc tccaccctgg tcc 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tcgtttgatc tccaccttgg tcc 23
<210> 21
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ttggatccca ggtgcagctg gtggagtct 29
<210> 22
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ccgccactgc cccctccacc gctccctccg ccacctgagg agacggtgac cagggt 56
<210> 23
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ggagcggtgg agggggcagt ggcggaggag gtagcgacat tgtgttgacc cagtct 56
<210> 24
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gtcgactcga ttgatttcca ccttggtccc 30

Claims (8)

1.一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，并且两者通过链接区连接，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No：2。
2.根据权利要求1所述一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID No：3。
3.根据权利要求2所述一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，其特征在于，所述氨基酸序列的羧基末端连接有6His的标签。
4.根据权利要求1～3任意一项所述一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体用于制备预防乙肝的生物制剂。
5.一种预防乙肝的制剂，其特征在于，所述制剂中含有如权利要求1～3任意一项所述的单链抗体。
6.一种用于编码权利要求2所述人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体的基因，其特征在于，所述基因序列为SEQ ID No：4；其中，用于编码所述重链可变区的基因序列为SEQ IDNo：5，用于编码所述轻链可变区的基因序列为SEQ ID No：6。
7.一种载体质粒，其特征在于，所述载体质粒含有如权利要求6所述的人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体的基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求7所述的载体质粒。
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