CN109593130A - 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用 - Google Patents

乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109593130A
CN109593130A CN201811476110.XA CN201811476110A CN109593130A CN 109593130 A CN109593130 A CN 109593130A CN 201811476110 A CN201811476110 A CN 201811476110A CN 109593130 A CN109593130 A CN 109593130A
Authority
CN
China
Prior art keywords
variable region
chain antibody
chain variable
seq
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811476110.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109593130B (zh
Inventor
陈安
王治恒
杨明珍
胡川闽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Army Medical University
Original Assignee
Army Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Army Medical University filed Critical Army Medical University
Priority to CN201811476110.XA priority Critical patent/CN109593130B/zh
Publication of CN109593130A publication Critical patent/CN109593130A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109593130B publication Critical patent/CN109593130B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生物制品检测技术领域，公开了一种乙型肝炎病毒前S1抗原（HBV preS1）特异性单链抗体及其应用，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区、连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头以及任选的标签，其中，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1‑117位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130‑262位氨基酸所示。本发明还公开了上述单链抗体的相关应用。本发明的单链抗体为全人源单链抗体，能和乙型肝炎病毒前S1抗原特异性结合。

Description

乙型肝炎病毒前S1抗原特异性单链抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物制品检测技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒前S1抗原特异性单链抗体及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的急、慢性肝炎给人类健康带来了严重的威胁，目前全球范围内约有4亿人感染 HBV，每年约有100万人死于HBV感染相关的疾病。
乙型肝炎病毒前S1抗原（HBV preS1，preS1）是乙肝病毒大蛋白（HBV largesurface protein，LHB）N末端特有的一段结构域。LHB本身存在于感染性病毒颗粒表面，因此，preS1的水平能反映患者体内感染性病毒颗粒的数量，比乙肝表面抗原（HBsAg）能更好地反映HBV的传染性。流行病学调查表明preS1阳性患者比单纯的HBsAg阳性者有更强的传染性，这使得preS1被作为一种直观的HBV传染性评价指标，在乙肝的防控方面具有较大的意义。定量分析HBV感染者血清中LHB水平与HBV DNA的关系，发现LHB水平随着HBV DNA水平变化而变化，二者之间存在很高的相关性，表明血清 LHBs水平可以反映HBV感染者循环系统中的病毒载量。当HBV基因前C区发生突变或者经抗病毒治疗后HBeAg转阴时，会导致HBeAg检测阴性，此时preS1检测可以更准确地反映病毒在体内是否继续复制。HBV preS1常在病毒感染早期出现，1个月左右消失，preS1转阴的时间越早，提示急性肝炎的病程越短，预后越好；若preS1持续存在则预示急性乙型肝炎在向慢性乙型肝炎转变。preS1阳性提示HBV复制活跃，传染性强；preS1阴性可作为HBV被清除和感染趋于恢复病情趋向好转的标志。针对HBV感染者血清中preS1含量的连续监测和动态观察，可以更好地评估患者体内HBV复制状态、抗病毒疗效和患者的预后。
HBV preS1是形成完整HBV病毒颗粒所必需的，其103-119位氨基酸和紧随其后的preS2 的第1-5 位氨基酸对于 HBV 颗粒的形成至关重要。HBV preS1 介导了HBV结合肝细胞表面受体的功能，目前公认preS1(aa21-47)肽段是HBV进入肝细胞必不可少的，而preS1(aa29-34)－QLDPAF motif是肝细胞受体结合区域。在长度仅百余个氨基酸残基的 preS1区域内，有数十个T细胞表位和 B 细胞表位。HBV preS1中的线性B细胞表位主要位于其N端和C端，即preS1(aa21-59)和preS1(aa71-119)，并且有文献报道在preS1(aa34-59)片段内存在构象性B细胞表位，具有很强的免疫原性，能诱发机体产生保护性的抗体，针对preS1(aa37-45)的保护性抗体对黑猩猩HBV感染有很好的预防作用，并证实作用于preS1(aa37-45)的抗体具有良好的体内中和HBV作用。
鼠源性单克隆抗体存在制备成本较高、周期较长、存在一定程度的产品批间差异和应用于人体的异源性的问题。通过建立全人源抗体库，淘选针对preS1表位肽特异性的全人源抗体，可以有效克服传统鼠源性单克隆抗体的上述问题，更加经济地建立HBV preS1免疫检测试剂盒，制备更加适用的HBV感染预防性产品，为HBV感染的诊断和预防提供重要的新手段和新工具。
因此，开发能够更有效地结合HBV preS1的HBV preS1特异性全人源单链抗体具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有产品存在的上述不足，提供一种HBV preS1特异性单链抗体及其应用。
本发明的发明人在前期研究中发现了preS1中的B细胞表位区域preS1(aa91-107)特异性的抗体结合HBV活性更强。以这些单克隆抗体作为捕获抗体，抗HBsAg多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA法，能够准确检测标本中的HBV，而且其检出率较高。在体外原代人肝细胞HBV感染模型上初步验证了该抗体具有阻断HBV感染作用。鉴于此，本发明的发明人进一步建立了全人源抗体库，淘选针对preS1(aa91-107)表位肽特异性的全人源抗体。因此，本发明第一方面提供了一种单链抗体，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区、连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头以及任选的标签，其中，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-117位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-262位氨基酸所示。
本发明第二方面提供了编码第一方面所述的单链抗体的基因。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体包括第二方面所述的基因。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有第三方面所述的表达载体。
本发明第五方面提供了一种HBV preS1检测用试剂盒，该试剂盒包括：第一方面所述的单链抗体。
本发明第六方面提供了一种（非诊断目的）的检测样本HBV preS1的方法，该方法包括使用第一方面所述的单链抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。
本发明第七方面提供了第一方面所述的单链抗体、第二方面所述的基因、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于预防乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
本发明中，通过收集人外周血，分离外周血单个核细胞（PBMC），提取总RNA，构建超大容量全人源抗体库，通过噬菌体展示和淘选技术，制备了能和preS1(aa91-107)特异性结合的单链抗体。应用制备的原核表达质粒转化表达宿主（如大肠杆菌），就可以实现抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，为制备更加质优价廉的HBV preS1免疫检测试剂和HBV感染预防性制剂奠定了核心原料基础。本发明获得的单链抗体能够有效地结合HBV preS1，可以应用于HBV的预防和定量检测。
附图说明
图1为双抗体夹心ELISA法检测HBV preS1的结果（抗体相对含量与450nm处的P/N值）。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供的单链抗体包括轻链可变区、重链可变区、连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头（linker）以及任选的标签，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-117位氨基酸（大写正体部分）所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-262位氨基酸（大写斜体部分）所示。
本发明中，所述接头可以为任意的用于连接单链抗体的轻链可变区和重链可变区的接头。在本发明的优选实施方式中，所述接头序列如SEQ ID NO：1的第118-129位氨基酸（小写带下划线部分）所示。
因此，本发明提供的单链抗体的序列优选如SEQ ID NO：1所示：
aqsvltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggynfvswyrqhpgkapklmiydvtrrpsgvsnrfsgsksgntasltisrlqaedeadyycssytsrstwvfgggtkltvlgsggstitsynvyytkls ssgtevqlvqsgaevkkpg ssvkvscrasagtfssrginwvrqapgqglewmgwisayngktdlaqkfqgrltmttdtststaqlelrslgsddt amyycardivyctntvctlhdafdiwgqgtmvtvssas （SEQ ID NO：1）
本发明中，所述抗体还可以连接有标签，以便于分离纯化等，所述标签可以为各种常见的蛋白标签，根据本发明的另一种优选实施方式，所述单链抗体的序列由SEQ ID NO：1以及依次连接于SEQ ID NO：1的C端的V5标签和His标签组成（如SEQ ID NO：3所示）。
本发明还提供了编码上述单链抗体的基因。
根据本发明的一种优选实施方式，所述基因的序列可以如SEQ ID NO：2的第1-786位碱基所示，也可以如SEQ ID NO：2（含V5标签编码序列和His标签编码序列）所示。在该优选的实施方式中，SEQ ID NO：2的第1-351位（5’端大写部分）示出的是轻链可变区编码序列；SEQ ID NO：2第352-387位（中间大写带下划线部分，或SEQ ID NO：5）示出的是接头编码序列；SEQ ID NO：2第388-786位（3’端大写部分）示出的是重链可变区编码序列；SEQ IDNO：2第787-828位（3’端小写部分）示出的是V5标签的编码序列；SEQ ID NO：2第829-846位（3’端小写带下划线部分）示出的是His标签的编码序列。
5’-GCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCGCCAACACCCCGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCACTAGGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTCGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTAGCTCATATACATCCAGGAGCACTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCTAGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTA TACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAGGGCTTCAGCAGGCACCTTCAGCAGCCGTGGTATCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAAAACAGACCTTGCACAGAAGTTCCAGGGCAGACTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACCGCCCAGCTGGAGTTGAGGAGTCTGGGATCTGACGACACGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGATATTGTGTATTGCACTAATACTGTATGCACTCTTCATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCAGCTAGCggcaaaccaatcccaaacccactgctgggcctggatagtactcaccatcaccatcaccat-3’ （SEQ ID NO：2）
本发明提供的表达载体包括如上所述的基因。所述表达载体可以为插入有上述基因的pET22b。
本发明提供的宿主细胞转化有如上所述的表达载体。所述宿主细胞可以是重组菌。所述重组菌可以为含有本发明的表达载体的菌株，例如，可以通过将本发明的表达载体转入感受态菌株（如大肠杆菌感受态菌株BL21（DE3））中而获得。
本发明提供的HBV preS1检测用试剂盒包括：如上所述的单链抗体。所述试剂盒为基于双抗体夹心ELISA原理的HBV preS1的检测用试剂盒，因此可以含有实施双抗体夹心ELISA所需的各种试剂，例如，所述试剂盒还可以包括洗液、稀释液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗HBsAg多克隆抗体、HRP的显色底物TMB、反应终止液等。
本发明提供的（非诊断目的地）检测样本中HBV preS1的方法包括使用如上所述的单链抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。
根据更具体的实施方式，上述检测方法包括：应用上述单链抗体包被酶标板孔；将待测样本加入孔中；孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的HBsAg特异性多克隆抗体；孵育后洗涤，加入HRP的显色底物（TMB）；孵育后终止反应，酶标仪450nm比色，吸光度的大小与样本中的HBV preS1浓度正相关。
本发明还提供了如上所述的单链抗体、基因、表达载体或宿主细胞在制备用于预防乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
一般地，本发明提供的单链抗体的制备方法包括：
（1）从人外周血中分离单个核细胞并提取总RNA，应用反转录技术制备cDNA；
（2）以cDNA为模板，分别合成人IgG重链编码序列和轻链编码序列，应用重叠延伸PCR技术连接重链编码序列和轻链编码序列；
（3）将步骤（2）连接后获得的编码序列插入噬菌粒载体pDF中，构建全人源抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，得到特异性结合HBV preS1(aa91-107)的单链抗体；
（4）任选地，将编码上述单链抗体的DNA片段亚克隆入原核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌中，诱导表达，亲和纯化即可得到单链抗体。步骤（4）为选择性进行的步骤，为了获得大量的单链抗体，优选进行步骤（4）。
根据更具体的实施方式，上述制备方法包括：从人外周血中分离单个核细胞，Trizol法提取细胞总RNA，反转录成cDNA，分别应用人免疫球蛋白IgG重链特异性引物和轻链（包括κ链和λ链）特异性引物进行PCR，扩增出人IgG重链和轻链的编码片段，应用重叠PCR技术通过恰当的接头将重链编码片段和轻链编码片段连接起来，并插入噬菌粒载体pDF中，构建全人源抗体库；通过噬菌体展示和HBV preS1(aa91-107)抗原表位肽特异性淘选，获得能特异性结合HBV preS1的单链抗体；将编码该单链抗体的DNA片段亚克隆入原核表达载体pET22b中，构建质粒pET22b-preS1-ScFv；将质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并镍柱亲和纯化，得到单链抗体preS1-ScFv。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，本发明中涉及的外周血来源的健康人和HBsAg阳性病人均已签署知情同意书；室温指“25℃”。
实施例1
该实施例用来说明大容量全人源抗体库的制备。
(1) 人外周血单个核细胞的分离
收集健康人抗凝外周血标本200人份，每份约1mL，应用人外周血淋巴细胞分离液（购自天津灏洋华科生物科技有限公司）分离淋巴细胞。
①在离心管中加入与抗凝血等体积分离液，再用移液器小心吸取血液样本缓慢加于分离液液面之上，700g离心30 min。
②用移液枪小心移取离心管中第二层的环状乳白色单核细胞层到另一个离心管中。
③加入10mL PBS清洗，250g离心10min，弃上清，重复此步骤2次。
④用2mL PBS重悬细胞，倒置显微镜下观察细胞大小形态并用血球计数板进行细胞计数。
⑤将单个核细胞按照每份107个细胞分装后于-80℃冷冻保存。
(2) 人外周血单个核细胞总RNA的提取
①每份单个核细胞样本（含107个细胞）中加入1mL Trizol试剂（购自碧云天生物），震荡混匀，室温放置10min。
②加入200μL氯仿（常规分析纯），剧烈震荡30s，室温放置3min。
③12 000g，4℃，离心15min，将上清移至新的1.5mL离心管内，加入500μL预冷的异丙醇（常规分析纯），颠倒混匀，室温放置10min。
④12 000g，4℃，离心10min，弃上清，加入1mL 75%乙醇（常规分析纯），重悬沉淀。
⑤8 000g，4℃，离心10min，弃上清，加入40μL RNase-free水（购自碧云天生物）溶解沉淀。
⑥琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量并通过A260比色测定RNA浓度。
(3) 全人源抗体库的制备
①应用反转录（RT，试剂购自碧云天生物）技术，制备cDNA；以cDNA为模板，分别应用人IgG轻链特异性引物（包括κ链和λ链，下同）和重链特异性引物（上海英骏生物技术有限公司合成，序列参见文献：Antibody Engineering Methods and Protocols, Second Edition,Patrick Chames, Springer, Heidelberg, Germany (2012) pp. 85-108），PCR分别合成人IgG重链编码序列和轻链编码序列（RT和PCR试剂盒购自NEB公司）；应用重叠延伸PCR技术（splicing by overlap extension PCR，SOE PCR），将二者连接起来，中间带上接头，两端分别带上BSSHⅡ和NheⅠ酶切位点，最终形成的PCR产物序列模式如下：BSSHⅡ酶切位点（gcgcgc，SEQ ID NO：4）-VL编码片段-接头编码片段（ataacttcgtataatgtatactatacgaagttatcc，SEQ ID NO：5）-VH编码片段- NheⅠ酶切位点（gctagc，SEQ ID NO：6）。
②将PCR产物用BSSHⅡ和NheⅠ（NEB公司）双酶切，回收后，与同样双酶切的噬菌粒载体pDF（购自淼灵生物）进行连接反应，并将连接反应的产物电转入感受态大肠杆菌OMNImax（购自北京华越洋生物，下同），过夜培养，此为原始抗体库。在该细菌培养体系中加入辅助噬菌体M13K07（购自NEB公司）共培养，收集培养上清，过滤除菌后即为全人源噬菌体抗体库。
实施例2
该实施例用来说明HBV preS1(aa91-107)（HBV preS1的氨基酸序列如NCBI蛋白数据库：CAA66700.1所示）特异性ScFv的制备
(1) HBV preS1(aa91-107)抗原表位肽特异性ScFv的淘选
①应用HBV preS1(aa91-107) 抗原表位肽包被免疫管，4℃静置或振荡过夜。封闭洗涤后加入培养的噬菌体，孵育后洗涤除去未结合成分，用0.1M HCl溶解特异性结合的噬菌体，接种于感受态大肠杆菌OMNImax培养物中，37℃过夜培养，收集培养上清，应用PEG-NaCl沉淀，离心后用PBS重悬沉淀，以此为样本进行下一轮淘选，总共进行4轮淘选，淘选产物铺平板（2YT/Tet/carb）培养。
②应用preS1重组蛋白（来自质粒pET22b-preS1转化大肠杆菌BL21经镍柱亲和层析纯化而得，5μg/mL，50μL/孔，参见CN101863975A的实施例2）4℃过夜包被酶标板，封闭后洗涤，加入过夜培养的单克隆噬菌体培养物（第4轮淘选产物）孵育后洗涤，加入HRP标记的噬菌体特异性抗体（购自Abcam公司），孵育后洗涤，加入HRP底物TMB（购自Sigma公司）显色（此为噬菌体ELISA），H2SO4终止反应后450nm处比色。挑取呈强阳性反应的克隆进行DNA测序验证（上海英骏生物技术有限公司）。
(2) HBV preS1特异性单链抗体的表达和纯化
①根据单链抗体的DNA测序结果，合成相应的DNA片段（上海英骏生物技术有限公司），通过DNA连接反应（DNA连接酶试剂购自NEB公司），将目标ScFv编码片段亚克隆入原核表达载体pET22b（购自淼灵生物），并带上V5标签，制备原核表达质粒pET22b-preS1-ScFv，经DNA双酶切和DNA测序鉴定，选取正确的克隆。该质粒中蛋白编码片段模式为：ScFv编码片段-V5标签编码片段-His标签编码片段，DNA序列（5’-3’）如SEQ ID NO：2所示。翻译后的蛋白氨基酸序列模式为ScFv-V5 Tag-His Tag，其氨基酸序列（N端-C端）如SEQ ID NO：3所示：第1-117位氨基酸（大写正体部分）为轻链可变区，第118-129位氨基酸（小写带下划线部分）为接头序列，第130-262位氨基酸（大写斜体部分）为重链可变区，第263-276位氨基酸（大写正体带下划线部分）为V5标签，第277-282位氨基酸（大写斜体带下划线部分）为His标签。
aqsvltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggynfvswyrqhpgkapklmiydvtrrpsgvsnrfsgsksgntasltisrlqaedeadyycssytsrstwvfgggtkltvlgsggstitsynvyytkls ssgtevqlvqsgaev kkpgssvkvscrasagtfssrginwvrqapgqglewmgwisayngktdlaqkfqgrltmttdtststaqlelrslg sddtamyycardivyctntvctlhdafdiwgqgtmvtvssas GKPIPNPLLGLDSTHHHHHH （SEQ ID NO：3）
(3) HBV preS1特异性ScFv的表达、纯化与鉴定
将原核表达质粒pET22b- preS1-ScFv转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）（NEB公司）培养，600mg/mL IPTG，28℃震荡培养，诱导蛋白表达；收集细菌培养上清，镍柱亲和层析纯化得到单链抗体preS1-ScFv，纯化过程如下：
①转化重组质粒pET22b-preS1-ScFv的大肠杆菌BL21（DE3）经600mg/mL IPTG（Sigma公司）诱导表达后，6 000rpm离心，收集菌体沉淀。
②使用阳离子层析柱HiTrap SP.F.F 的结合缓冲液（20mmol/L 磷酸二氢钠，pH5.8，分析纯）重悬菌体沉淀后冰浴中超声破菌（功率300W，工作10s，间隙10s，重复15次，总循环3轮）。
③收集超声破碎产物，4℃，10 000rpm，离心15分钟，收集上清以0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
④将滤液上柱AKTAprime层析柱（Amersham公司），结合缓冲液平衡后用洗脱液（20mmol/L磷酸二氢钠，1M NaCl，pH 5.8，分析纯）线性洗脱，收集主洗脱峰。
⑤将含目的蛋白的洗脱峰用 His-结合缓冲液（20mmol/L磷酸二氢钠，0.5M NaCl，pH 7.4，分析纯）按1:9的体积比稀释后上HisTrap HP 柱再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱液（B缓冲液，20mmol/L磷酸二氢钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.4，分析纯）进行洗脱：先用 10% B缓冲液+90%的His-结合缓冲液洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用 100% B缓冲液将目的蛋白洗下。
⑥用BCA（碧云天生物）法进行蛋白定量测定，SDS-PAGE法鉴定产品的纯度。
⑦间接ELISA法鉴定HBV preS1特异性单链抗体：将纯化的重组HBV preS1蛋白用包被稀释液稀释，往酶标板每孔加入100μL，4℃包被过夜。次日取出酶标板，弃抗原，洗板。将待鉴定单链抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000等稀释，按100μL/孔加入对应条孔中，另作空白及阴性、阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗板，加入小鼠抗V5单克隆抗体（购自Invitrogen公司，1:2000稀释），37℃孵育1小时，洗板，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（购自Invitrogen公司，1:3000），按100μL/孔加入对应条孔中，37℃孵育40分钟。弃液，洗板，拍干，加入TMB底物显色液（购自Sigma公司）100μL/孔，避光显色10分钟，加入终止液（2MH2SO4，分析纯）50μL/孔。在450nm处测定吸光度值，判断单链抗体的滴度（呈现阳性结果的最大稀释倍数）。
实施例3
本实施例用来说明基于本发明的单链抗体的HBV preS1免疫检测方法
(1) HBV preS1特异性单链抗体preS1-ScFv包被酶标板
①用包被缓冲液（NaHCO3 2.93g，Na2CO3 1.59g，双蒸水溶解，总体积1L，pH 9.6，分析纯）稀释preS1-ScFv至浓度为5μg/mL，每孔加200 μL，贴上封条4℃包被过夜。
②甩掉抗原，干净自来水清洗酶标板5次，洗涤完成后在吸水纸上轻敲数下至无明显液体残留。
③每孔加封闭液（1% BSA，碧云天生物）350μL，37℃孵育1h，洗涤3遍，甩干备用。
(2) 基于双抗体夹心ELISA原理的HBV preS1的检测
①取包被有preS1-ScFv的酶标板，平衡至室温备用。
②收集临床HBsAg阳性病人血清，用生理盐水按照1:50、1:100、1:150、1:200和1:250的比例进行稀释，将100μL适当稀释的临床血清样本、阳性对照样本、阴性对照样本加入酶标板中，37℃孵育1小时。
③用洗液（Na2HPO4 0.14g，Tween-20 1mL，双蒸水定容至1L，分析纯）洗板5次，拍干，每孔加入HRP标记的HBsAg特异性多克隆抗体（1:2000，购自上海叶氏公司）200μL，室温孵育1小时。
④用洗液洗板5次，拍干，每孔加入TMB显色剂混合物（购自Sigma公司）100μL，室温避光孵育10分钟；每孔加入反应终止液（2M H2SO4，分析纯）50μL。
⑤在450nm处，酶标仪读取并记录各孔的吸光度值。图1是不同稀释比例下的检测孔和阴性对照孔450nm处吸光度的比值（P/N值），从图1可以看出，本发明的单链抗体能够有效地结合HBV preS1，可以应用于HBV的定量检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 乙型肝炎病毒前S1抗原特异性单链抗体及其应用
<141> 2018-12-04
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly
20 25 30
Tyr Asn Phe Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Met Ile Tyr Asp Val Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Arg Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Gly Thr Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Ala Gly
145 150 155 160
Thr Phe Ser Ser Arg Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asp
180 185 190
Leu Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser
195 200 205
Thr Ser Thr Ala Gln Leu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Val Tyr Cys Thr Asn Thr Val
225 230 235 240
Cys Thr Leu His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser
260
<210> 2
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccagtctg tgttgacgca gcctccctcc gcgtccgggt ctcctggaca gtcagtcacc 60
atctcctgca ctggaaccag cagtgacgtt ggtggttata actttgtctc ctggtaccgc 120
caacaccccg gcaaagcccc caaactcatg atttatgatg tcactaggcg gccctcaggg 180
gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct ggcaacacgg cctccctgac catctctcgg 240
ctccaggctg aggacgaggc tgactactac tgtagctcat atacatccag gagcacttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctcaccgtc ctaggttccg gagggtcgac cataacttcg 360
tataatgtat actatacgaa gttatcctcg agcggtaccg aggtccagct ggtacagtct 420
ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg gtgaaggtct cctgcagggc ttcagcaggc 480
accttcagca gccgtggtat caactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gctcgagtgg 540
atgggatgga tcagcgctta caatggtaaa acagaccttg cacagaagtt ccagggcaga 600
ctcaccatga ccacagacac atccacgagc accgcccagc tggagttgag gagtctggga 660
tctgacgaca cggccatgta ttactgtgcg agagatattg tgtattgcac taatactgta 720
tgcactcttc atgatgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac tgtctcctca 780
gctagcggca aaccaatccc aaacccactg ctgggcctgg atagtactca ccatcaccat 840
caccat 846
<210> 3
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly
20 25 30
Tyr Asn Phe Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Met Ile Tyr Asp Val Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Arg Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Gly Thr Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Ala Gly
145 150 155 160
Thr Phe Ser Ser Arg Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Lys Thr Asp
180 185 190
Leu Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser
195 200 205
Thr Ser Thr Ala Gln Leu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Val Tyr Cys Thr Asn Thr Val
225 230 235 240
Cys Thr Leu His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly
260 265 270
Leu Asp Ser Thr His His His His His His
275 280
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcgc 6
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataacttcgt ataatgtata ctatacgaag ttatcc 36
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctagc 6

Claims (10)

1.一种单链抗体，该单链抗体包括轻链可变区、重链可变区、连接所述轻链可变区与所述重链可变区的接头以及任选的标签，其特征在于，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第1-117位氨基酸所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO：1的第130-262位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其中，所述接头的序列如SEQ ID NO：1的第118-129位氨基酸所示。
3.根据权利要求1所述的单链抗体，其中，所述单链抗体的序列由SEQ ID NO：1以及依次连接于SEQ ID NO：1的C端的V5标签和His标签组成。
4.编码权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体包括权利要求4或5所述的基因。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞转化有权利要求6所述的表达载体。
8.一种乙型肝炎病毒前S1抗原检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体。
9.一种非诊断目的的检测样本中乙型肝炎病毒前S1抗原的方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。
10.权利要求1-3中任意一项所述的单链抗体、权利要求4或5所述的基因、权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于预防乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
CN201811476110.XA 2018-12-04 2018-12-04 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用 Active CN109593130B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811476110.XA CN109593130B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811476110.XA CN109593130B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109593130A true CN109593130A (zh) 2019-04-09
CN109593130B CN109593130B (zh) 2021-09-17

Family

ID=65962044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811476110.XA Active CN109593130B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109593130B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848787A (zh) * 2020-08-21 2020-10-30 北京安必奇生物科技有限公司 preS1抗体、乙型肝炎病毒前S1抗体酶免检测试剂盒、制备方法、使用方法
CN113234144A (zh) * 2021-05-26 2021-08-10 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104744589A (zh) * 2013-12-25 2015-07-01 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 抗-preS1抗体、其与干扰素的融合蛋白及用途
WO2016085289A1 (ko) * 2014-11-27 2016-06-02 강원대학교산학협력단 B형 간염 바이러스의 pres1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104744589A (zh) * 2013-12-25 2015-07-01 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 抗-preS1抗体、其与干扰素的融合蛋白及用途
WO2016085289A1 (ko) * 2014-11-27 2016-06-02 강원대학교산학협력단 B형 간염 바이러스의 pres1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAE-GWANGPARK等: "Hepatitis B virus-neutralizing anti-pre-S1 human antibody fragments from large naïve antibody phage library", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *
ZHIHENG WANG等: "A Highly Sensitive Detection System based on Proximity-dependent Hybridization with Computer-aided Affinity Maturation of a scFv Antibody", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
ZHUJUN ZHANG等: "A monoclonal antibody specific to the non-epitope region of hepatitis B virus preS1 contributes to more effective HBV detection", 《CLINICAL BIOCHEMISTRY》 *
盛辉等: "大容量天然人源单链抗体库的构建及抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体的淘选", 《吉林大学学报（医学版）》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848787A (zh) * 2020-08-21 2020-10-30 北京安必奇生物科技有限公司 preS1抗体、乙型肝炎病毒前S1抗体酶免检测试剂盒、制备方法、使用方法
CN111848787B (zh) * 2020-08-21 2024-05-17 北京安必奇生物科技有限公司 preS1抗体、乙型肝炎病毒前S1抗体酶免检测试剂盒、制备方法、使用方法
CN113234144A (zh) * 2021-05-26 2021-08-10 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞
CN113234144B (zh) * 2021-05-26 2022-02-25 武汉工程大学 一种人源性抗乙肝表面抗原的单链抗体、制剂、编码基因、载体质粒及宿主细胞

Also Published As

Publication number Publication date
CN109593130B (zh) 2021-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111748032B (zh) 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测
CN111518203B (zh) 用于新型冠状病毒检测的试剂盒
CN104017080B (zh) 一种犬源单链抗体及其构建方法和应用
CN111320694A (zh) 一种由重链抗体的可变区组成的纳米抗体gn2及其制备方法和应用
CN107344968B (zh) 一种用于检测禽流感病毒h7n9的时间分辨荧光免疫分析方法
JP4287280B2 (ja) ＨＣＶＥ２グリコプロテインに対して向けられ、ｉｎｖｉｔｒｏ中和活性を有するヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片
CN111748033B (zh) 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒
CN104650195B (zh) Ev71病毒vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用
KR102671155B1 (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질
CN109336979A (zh) 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用
CN108892723B (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒的单域重链抗体、制备方法及应用
CN109593130A (zh) 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用
CN114702578B (zh) 新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用
CN106885903A (zh) 一种寨卡病毒e抗原及其在检测抗寨卡病毒抗体中的应用
CN106188283B (zh) 甲型禽流感h7n2的纳米抗体及其应用
CN115286712A (zh) 新型冠状病毒Delta突变株特异性抗体及其应用
JP2019508684A (ja) 活動性結核の診断のための方法及びキット
CN109503711A (zh) 一种用于血凝方法检测pcv2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用
CN110066343A (zh) 一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用
CN107098980A (zh) 一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白及其制备方法
CN101538328B (zh) 一种人源中和性抗禽流感病毒h5n1基因工程抗体
CN109206511B (zh) 能够特异结合HPVl6-E6蛋白的纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用
Gupta et al. Recombinant fusion proteins for haemagglutination-based rapid detection of antibodies to HIV in whole blood
Erdag et al. Cloning of anti-HBsAg single-chain variable fragments from hybridoma cells for one-step ELISA
CN101475642B (zh) 一种艾滋病毒重组抗原及其融合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant