CN109503711A - 一种用于血凝方法检测pcv2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用 - Google Patents

一种用于血凝方法检测pcv2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用，属于生物技术领域。该双功能纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供所述双功能纳米抗体的应用、编码基因、携带该编码基因的载体、重组菌。本发明还提供所述双功能纳米抗体的制备方法，将所述双功能纳米抗体的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得所述双功能纳米抗体。采用本发明双功能纳米抗体检测PCV2病毒滴度的血凝方法，是国内外首次建立的基于鸡红细胞的PCV2病毒滴度血凝检测方法，灵敏度高、特异性好、耗时短，结果直观。

Description

一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体、编码基 因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是猪圆环病毒病的病原，是目前发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约为17nm，为共价闭合、环状的单股负链DNA病毒，导致猪群免疫抑制，给养猪业造成巨大的经济损失。经实验室研究发现，PCV2病毒侵染细胞后不能产生相应的细胞病变，导致PCV2病毒在增殖过程中，无法利用肉眼直观判断病毒增殖情况。目前，国内外采用的PCV2病毒检测技术主要有：间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等等。这些方法虽然可以检测PCV2病毒，在实践中也取得一定的效果，但存在实验操作复杂，耗时长，需要相互匹配的检测试剂以及相关的仪器设备来进行，且仅限于在实验室内进行，难以普及推广。因此，研制开发快速、简便的PCV2病毒检测方法，对于病毒增殖的实时监测具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体，用于检测PCV2病毒时灵敏度高、特异性好、耗时短，结果直观。
本发明的另一目的是提供上述双功能纳米抗体的编码基因。
本发明的再一目的是提供上述双功能纳米抗体在PCV2病毒检测中的应用，用于检测PCV2病毒时灵敏度高、特异性好、耗时短，结果直观。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供所述双功能纳米抗体的编码基因。
所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供所述编码基因的载体、重组菌。
本发明还提供所述双功能纳米抗体的制备方法，将所述双功能纳米抗体的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得所述双功能纳米抗体。
最后本发明还提供所述双功能纳米抗体在以非诊断为目的的PCV2病毒检测中的应用。
采用所述双功能纳米抗体以血凝方法检测PCV2病毒。
在待检样品中加入所述双功能纳米抗体致敏的鸡红细胞，当发生凝集现象时，表明样品中存在PCV2病毒。
采用55-65ug/ml的双功能纳米抗体加入到体积百分浓度为2％的鸡红细胞悬液中进行致敏，得到双功能纳米抗体致敏的鸡红细胞。
本发明的有益效果在于：本发明通过噬菌体展示技术进行纳米抗体的筛选，分别得到了可以识别PCV2灭活病毒和鸡红血球的纳米抗体，从而设计了用于检测PCV2病毒的双功能纳米抗体。采用该双功能纳米抗体检测PCV2病毒滴度的血凝方法，是国内外首次建立的基于鸡红细胞的PCV2病毒滴度血凝检测方法，灵敏度高、特异性好、耗时短，结果直观。由于本发明所获得的纳米抗体可以通过培养重组菌，原核诱导表达的方法制备，且具有较高的稳定性以及较长的保存期。因此，采用该双功能纳米抗体检测PCV2病毒滴度的血凝方法具有制作成本低廉、稳定性高以及有效期长等特点。
附图说明
图1VHH基因PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，另一泳道为VHH基因片段扩增产物。
图2PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体基因文库单克隆，M：DL2000bp DNA marker。
图3PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库3轮亲和筛选富集过程，每轮筛选中，左侧为：猪PCV2抗原包被组；右侧为：空白对照组。
图4间接ELISA方法检测PCV2灭活病毒纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同PCV2灭活病毒纳米抗体编号，纵坐标表示OD450数值，PCV2Antigens表示样品孔，Control表示对照孔。
图5间接ELISA方法检测PCV2灭活病毒纳米抗体的特异性。横坐标表示不同PCV2灭活病毒纳米抗体编号，纵坐标表示OD450数值，PCV2、FMDV、PEDV、PRRSV、PRV表示包被抗原。
图6VHH基因PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，另一泳道为VHH基因片段扩增产物。
图7天然噬菌体展示纳米抗体文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选的天然噬菌体展示纳米抗体文库中单克隆的菌落PCR扩增产物，M：DL2000bp DNAmarker。
图8天然噬菌体展示纳米抗体文库3轮亲和筛选富集过程，每轮筛选中，左侧为：鸡红血球抗原包被组；右侧为：空白对照组。
图9间接ELISA方法检测鸡红血球纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同鸡红血球纳米抗体编号，纵坐标表示OD450数值，Red Blood Cell表示样品孔，Control表示对照孔。
图10鸡红细胞非凝集型纳米抗体鉴定结果。第1列:Nb13；第2列:Nb24；第3列:Nb26；第4列:Nb31；第5列:Nb35；第6列:Nb43；第7列:Nb45；第8列:Nb56；第9列:Nb57；第10列:Nb58；第11列:Nb72；第12列:Nb89；第13列:PBS组。其中Nb是纳米抗体的缩写。
图11双功能纳米抗体Nb43-57基因片段SOE-PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNAmarker，另一泳道为双功能纳米抗体Nb43-57基因片段扩增产物。
图12纯化后的双功能纳米抗体Nb43-57的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1:纯化后的双功能纳米抗体Nb43-57的Western Blot鉴定结果；泳道2:纯化后的双功能纳米抗体Nb43-57的SDS-PAGE鉴定结果；M:protein standards。
图13双功能纳米抗体Nb43-57血凝试验鉴定结果。第1列:实验组；第2列泳道:对照组1；第3列:对照组2；第4列:对照组3。
图14双功能纳米抗体Nb43-57特异性试验鉴定结果。其中第1列:包被抗原为PCV2病毒；第2列:包被抗原为猪流行性腹泻病毒；第3列:包被抗原为猪口蹄疫灭活病毒；第4列:包被抗原为猪伪狂犬病毒；第5列:包被抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒；第6列:PBS缓冲液。
图15双功能纳米抗体Nb43-57灵敏性试验鉴定结果，以横线为界，横线之上每列孔中PCV2稀释倍数相同，横线之下每列孔中PCV2稀释倍数相同，数字显示了孔的列数；第1列孔中以PBS缓冲液替代病毒液，第2列孔加入的是病毒原液(滴度为1×107TCID50/mL)，第3-11列孔中的病毒液稀释倍数依次为21、22、23、24、25、26、27、28、29。。
图16双功能纳米抗体Nb43-57热稳定性试验鉴定结果。1:Nb43-57在37℃处理0h；2:Nb43-57在37℃处理6h；3:Nb43-57在37℃处理12h；4:Nb43-57在37℃处理24h；5:Nb43-57在37℃处理48h；6:PBS组。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1构建针对PCV2灭活病毒的纳米抗体文库
1.RNA的提取与cDNA的合成
将1mg PCV2灭活病毒与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼进行免疫；1周之后，将1mg PCV2灭活病毒与弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫该双峰驼，每周一次，共免疫6次，刺激机体产生针对PCV2抗原的特异性抗体。免疫结束后，抽取100mL双峰驼外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公司)说明操作，合成cDNA。
2.引物的设计与合成
根据参考文献(Beta-lactamase inhibitors derived from single-domainantibody fragments elicited in the camelidae，Conrath Katja et.al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45,2807-2812.)设计用于扩增双峰驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如表1。
表1PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’)
C1F GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
C1R GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
V<sub>HH</sub>F GATGTGCAG<u>CTGCAG</u>GAGTCTGGRGGAGG(下划线为PstⅠ酶切位点)
V<sub>HH</sub>R CTAGT<u>GCGGCCGC</u>TGAGGAGACGGTGACCTGGGT(下划线为NotⅠ酶切位点)
注：表1中的简并碱基R＝A或G。
3.VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的双峰驼cDNA为模板，PCR扩增VHH片段。首先，以cDNA为模板，利用C1F和C1R为上下游引物，PCR扩增获得大小约为750bp的基因片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，回收大小约为750bp的基因片段。然后，以该大小约为750bp的基因片段为模板，利用VHHF和VHHR为上下游引物，PCR扩增VHH片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图1所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。
4.噬菌体展示基因文库的构建
纯化回收的VHH基因片段采用Pst I和Not I酶切后，连入pMECS载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli TG1感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃过夜生长之后随机挑选24个单克隆菌落，利用VHHF和VHHR为上下游引物进行菌落PCR鉴定。结果如图2，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，所有单克隆菌落均含有大小约为350bp的目的片段，说明该文库的插入率达到了100％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库。
实施例2针对PCV2灭活病毒的纳米抗体的筛选过程
1.噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库，接种至500mL 2×TY培养基中，37℃、摇床转速为200rpm条件下培养3-5h后，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)，37℃孵育1h，随后37℃、摇床转速为200rpm条件下培养过夜。次日，加入80g的PEG6000(购自上海生工公司)沉淀噬菌体，该沉淀即为扩增后的PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库。将该噬菌体展示文库重悬于5mL 0.1M的PBS缓冲液中，得到其悬液。
2.亲和筛选
将10μg PCV2灭活病毒加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜，设立无抗原包被的空白组作为空白对照；次日，每孔加入1％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；然后，每孔加入100μL扩增后的PCV2灭活病毒纳米抗体噬菌体展示文库悬液，室温作用1h，用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，洗掉不结合的噬菌体，随后用100μL浓度为100mM的三乙胺(购自上海生工公司)溶液将与PCV2灭活病毒特异性结合的噬菌体洗脱下，并感染5倍体积处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)侵染TG1细胞，离心取上清液，即得第一轮筛选到的噬菌体，用于下一轮的筛选。相同筛选过程共进行3轮。每一轮筛选获得的噬菌体各取10μL涂于LB固体培养基上，均在37℃过夜培养，用于观察亲和筛选富集过程。如图3所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。
实施例3酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1.纳米抗体的表达
从实施例2中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选95个单菌落分别接种于96孔板(添加有含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基)的各孔中，并设置一个仅加入了TB培养基的空白对照，在37℃、摇床转速为200rpm条件下培养至对数生长期，各孔均加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃、摇床转速为200rpm条件下过夜培养。次日，利用超声破碎法裂解各菌，离心后取裂解液，分别获得各重组菌表达的、针对PCV2灭活病毒的纳米抗体，各PCV2灭活病毒纳米抗体编号依次为1～95。
2.间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应鉴定编号为1～95的各PCV2灭活病毒纳米抗体与PCV2灭活病毒的结合活性。将10μg PCV2灭活病毒加入到10mL浓度为100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入到96孔酶标板的每个样品孔中，在4℃包被过夜，对照孔中以猪肾细胞系PK-15细胞破碎产物替代PCV2灭活病毒进行包被；次日，弃掉板内液体，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，将各纳米抗体依次加入ELISA板的各孔中，室温下孵育1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的纳米抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRP labeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液(购自上海生工公司)，37℃孵育15min，每孔各加2M的硫酸溶液50μL终止反应，使用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光值OD450。当样品孔OD450值大于对照孔OD450值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔。结果如图4所示，共有13个纳米抗体可与PCV2灭活病毒发生结合反应。其中PCV2灭活病毒纳米抗体43和88与PCV2灭活病毒发生结合反应后的OD450值较大。
3.特异性的鉴定
按照本实施例标题2中间接ELISA检测方法，分别检测PCV2灭活病毒纳米抗体43和纳米抗体88与猪FMDV病毒、PEDV病毒、PRRSV病毒和PRV病毒之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD450，不同之处在于ELISA板的包被抗原分别采用猪FMDV病毒、PEDV病毒、PRRSV病毒和PRV病毒替代猪PCV2病毒。结果如图5所示，本发明获得的PCV2灭活病毒纳米抗体43和纳米抗体88对猪FMDV病毒、PEDV病毒、PRRSV病毒和PRV病毒交叉反应性极低，说明PCV2灭活病毒纳米抗体43和纳米抗体88是针对猪PCV2病毒的特异性纳米抗体。
抽提表达PCV2灭活病毒纳米抗体43重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得PCV2灭活病毒纳米抗体43的基因序列和氨基酸序列。PCV2灭活病毒纳米抗体43的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
实施例4天然噬菌体展示纳米抗体文库的构建
1.RNA的提取与cDNA的合成
抽取100mL未经任何抗原免疫的双峰驼外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公司)说明操作，合成cDNA。
2.引物的设计与合成
根据参考文献(Beta-lactamase inhibitors derived from single-domainantibody fragments elicited in the camelidae，Conrath Katja et.al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45,2807-2812.)设计用于扩增双峰驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物C1F、C1R、VHHF和VHHR。各引物的具体序列如实施例1中表1所示。
3.VHH片段的扩增
利用本实施例标题1中合成的双峰驼cDNA为模板，PCR扩增VHH片段。首先，以cDNA为模板，利用C1F和C1R为上下游引物，PCR扩增获得大小约为750bp的基因片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，回收大小约为750bp的基因片段。然后，以该大小约为750bp的基因片段为模板，利用VHHF和VHHR为上下游引物，PCR扩增VHH片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图6所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。
4.噬菌体展示基因文库的构建
将纯化回收的本实施例标题3中VHH基因片段采用Pst I和Not I酶切后，连入pMECS载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli TG1感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃过夜生长之后随机挑选24个单克隆菌落，利用VHHF和VHHR为上下游引物进行菌落PCR鉴定。结果如图7，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，有23个单克隆菌落含有大小约为350bp的目的片段，说明该文库的插入率达到了95.8％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为天然噬菌体展示纳米抗体文库。
实施例5针对鸡红血球的纳米抗体的筛选过程
1.噬菌体展示文库的扩增
取200μL于-80℃冻存的天然噬菌体展示纳米抗体文库，接种至500mL2×TY培养基中，37℃、摇床转速为200rpm条件下培养3-5h后，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)，37℃孵育1h，随后37℃、摇床转速为200rpm条件下培养过夜。次日，加入80g的PEG6000(购自上海生工公司)沉淀噬菌体，该沉淀即为扩增后的天然噬菌体展示纳米抗体文库。将该噬菌体展示纳米抗体文库重悬于5mL 0.1M PBS缓冲液中，得到其悬液。
2.亲和筛选
将100μL 1％的新鲜鸡红血球悬浮液加入到10mL、100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜，设立无抗原包被的空白组作为空白对照；次日，每孔加入1％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；然后，每孔加入100μL扩增后的天然噬菌体展示纳米抗体文库悬液，室温作用1h，用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，洗掉不结合的噬菌体，随后用100μL浓度为100mM的三乙胺(购自上海生工公司)溶液将与鸡红血球特异性结合的噬菌体洗脱下，并感染5倍体积处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)侵染TG1细胞，离心取上清液，即得第一轮筛选到的噬菌体，用于下一轮的筛选。相同筛选过程共进行3轮。每一轮筛选获得的噬菌体各取10μL涂于LB固体培养基上，均在37℃过夜培养，用于观察亲和筛选富集过程。如图8所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。
实施例6酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆
1.纳米抗体的表达
从实施例5中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选95个单菌落分别接种于96孔板(添加有含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基)的各孔中，并设置一个仅加入了TB培养基的空白对照，在37℃、摇床转速为200rpm条件下培养至对数生长期，各孔均加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃、摇床转速为200rpm条件下过夜培养。次日，利用超声破碎法裂解各菌，离心后取裂解液，分别获得各重组菌表达的、针对鸡红血球的纳米抗体，各鸡红血球纳米抗体编号依次为1～95。
2.间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性
采用间接ELISA反应分别鉴定鸡红血球纳米抗体1～95与鸡红血球的结合活性。将100μL 1％的新鲜鸡红血球悬液加入到10mL浓度为100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入到96孔酶标板的每个样品孔中，在4℃包被过夜，对照孔中以100mM的NaHCO3溶液(pH8.2)替代鸡红血球进行包被；次日，弃掉板内液体，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，将各纳米抗体依次加入ELISA板的各孔中，室温下孵育1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的纳米抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRPlabeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液(购自上海生工公司)，37℃孵育15min，每孔各加2M的硫酸溶液50μL终止反应，使用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光值OD450。当样品孔OD450值大于对照孔OD450值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔。结果如图9所示，共有12个纳米抗体可与鸡红血球发生结合反应，其中纳米抗体57、72与鸡红血球反应后的OD450较高。利用这12个纳米抗体与鸡红血球在室温下孵育1h，结果如图10所示，发现鸡红血球纳米抗体57等均不能引起鸡红血球的凝集，属于红细胞非凝集型抗体，是可用于构建PCV2病毒血凝检测方法的双功能纳米抗体。
3.纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达鸡红血球纳米抗体57重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，获得鸡红血球纳米抗体57的基因序列和氨基酸序列。鸡红血球纳米抗体57的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
实施例7双功能纳米抗体的串联表达及纯化
1.双功能纳米抗体基因片段的构建
抽提表达PCV2灭活病毒纳米抗体43重组菌中的质粒，利用表2所示的引物NbF和NbLR PCR扩增获得PCV2灭活病毒纳米抗体43的基因片段，并进行纯化回收。
抽提表达鸡红血球纳米抗体57重组菌中的质粒，利用表2所示的引物NbLF和NbRPCR扩增获得鸡红血球纳米抗体57的基因片段，并进行纯化回收。
设计由上述两种抗体拼接而成的双功能纳米抗体Nb43-57，其基因序列如SEQ IDNO:2，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。利用纯化回收的两个纳米抗体基因片段为模板，通过重叠延伸拼接(Splicing by Overlap Extension,SOE)PCR方法获得双功能纳米抗体Nb43-57基因片段，反应分两步进行。
第一步反应：将上述两个纳米抗体基因片段扩增产物混合，在不加引物的条件下进行PCR反应，反应条件为：95℃3min；95℃30s，62℃30s，72℃2min，共8个循环；72℃10min。
第二步反应：在第一步反应结束后的PCR管内加入引物NbF和NbR进行PCR反应，反应条件为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，共25个循环；72℃10min。
重叠延伸拼接PCR反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图11所示，可见大约900bp的基因片段，与预期片段大小相一致，随后插入pMECS载体(购自Novagen公司)的Pst I和Xba I酶切位点之间，于42℃转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)，37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养1h，离心浓缩菌液，并将其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时；挑选单个菌落，得到表达双功能纳米抗体Nb43-57的重组菌A；或者将PCV2灭活病毒纳米抗体43和鸡红血球纳米抗体57的基因序列送至华大、生工等生物技术公司进行合成，采用重叠延伸拼接PCR方法获得双功能纳米抗体Nb43-57基因片段，然后插入pMECS载体(购自Novagen公司)的Pst I和Not I酶切位点之间，随后在42℃转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)，也可以得到重组菌A。各引物的具体序列如表2。
表2SOE-PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’)
NbF CAGGTGCAG<u>CTGCAG</u>GAGT(下划线为PstⅠ酶切位点)
NbLR GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGGGAGACGGTGACCTG
NbLF CCCAGCTCCAAAGCTCCCAAAGCTCCCGATGTTCAACTGG
NbR CCC<u>TCTAGA</u>TTCTGACCCCAATAGA(下划线为XbaⅠ酶切位点)
2.双功能纳米抗体基因序列的鉴定
抽提表达双功能纳米抗体Nb43-57的重组菌A的质粒，送上海生工公司进行序列测定，发现双功能纳米抗体Nb43-57的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：1所示，与预期一致。
3.双功能纳米抗体的表达与纯化鉴定
利用重组菌A制备双功能纳米抗体Nb43-57。具体方法如下：将重组菌A接种到5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃摇床中培养至OD600＝0.6～0.9，取1mL菌液转接至500mL TB培养液中，在37℃摇床中培养，当OD600值达到0.6～0.9时，加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃摇床中培养12～16小时诱导重组菌表达目的蛋白，离心收集菌体沉淀，利用超声破碎菌体，取裂解液作为双功能纳米抗体Nb43-57粗提液，采用镍柱(购自GE Healthcare公司)亲和层析法进行纯化。取纯化后的双功能纳米抗体Nb43-57进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。其中Western blot鉴定中使用鼠抗His标签抗体和HRP标记的羊抗鼠二抗。从图12可以看到双功能纳米抗体Nb43-57在大约35kD处均有明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度达90％以上，说明获得了高纯度的双功能纳米抗体。
实施例8双功能纳米抗体血凝试验的鉴定
1.双功能纳米抗体致敏鸡红细胞的制备
将新鲜的鸡红细胞用0.1M、pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次后重悬制成体积百分浓度为10％的悬液，取此悬液缓慢加入到等体积的体积百分浓度为1％的戊二醛水溶液中，50rpm、37℃条件下作用1h，然后再用0.1M、pH7.4的PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.1M、pH7.4的PBS缓冲液重悬配成体积百分浓度为20％的鸡红细胞悬液，加入终浓度为1g/L的NaN3防腐，得到醛化鸡红细胞母液，4℃冰箱保存备用。将醛化鸡红细胞母液离心取沉淀，用0.1M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至体积百分浓度为2％后，与纯化后的双功能纳米抗体Nb43-57(60μg/mL)等体积混合，37℃作用1h，其间每隔10min轻轻摇晃，保持红细胞悬浮，最终得到初步致敏鸡红细胞。将初步致敏鸡红细胞在0.1M、pH7.4的PBS缓冲液中洗涤3次，每次1500rpm离心5min，最后用0.1M，pH7.4的PBS缓冲液重悬，得到体积百分浓度为1％的致敏鸡红细胞悬浮液。
2.双功能纳米抗体血凝试验
设置实验组、对照组1、对照组2和对照组3，每组3个重复。实验组中滴加50μL PCV2抗原和50μL的致敏鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)；对照组1中滴加50μL PCV2抗原和50μL醛化鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)；对照组2中滴加50μL致敏鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)和50μL PBS缓冲液；对照组3中滴加50μL醛化鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)和50μL PBS缓冲液。室温静置30min后观察各孔状态。结果如图13所示，实验组出现强烈凝集现象，而其它三组对照均未观察到凝集现象。经红细胞凝集试验证实，双功能纳米抗体Nb43-57既能够与鸡红细胞结合，又能够与PCV2抗原反应，具有双功能性，且同时与鸡红细胞和PCV2抗原作用时，会发生肉眼可见的、强烈的凝集现象。
3.双功能纳米抗体特异性试验的鉴定
分别将猪流行性腹泻病毒、猪口蹄疫灭活病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、PCV2病毒各50μL滴加于血凝板中，再滴加50μL致敏鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)进行红细胞凝集试验(参照本实施例中的标题2进行)，对照组中以PBS缓冲液替代PCV2病毒。结果如图14所示，仅加入PCV2病毒的孔出现凝集现象，加入其余病毒的孔均未观察到凝集现象。结果表明：双功能纳米抗体Nb43-57的特异性强，只有同时与鸡红细胞和PCV2抗原作用时，才会发生肉眼可见的、强烈的凝集现象，与其它病毒无交叉反应性。
4.双功能纳米抗体灵敏性试验的鉴定
在血凝板第1列的每孔中加入0.1M、pH7.4的PBS缓冲液50μL，第2列的每孔中加入100μL PCV2病毒原液(滴度为1×107TCID50/mL)，然后从第2列的每孔中吸走50μL的PCV2病毒原液加入第3列的对应孔中，同时在第3列的每个孔中加入50μL 0.1M、pH7.4的PBS缓冲液，按照相同方法对PCV2病毒液依次进行2倍倍比稀释直至第11列，最后一列的每孔弃去50μL液体，混匀后每孔滴加50μL致敏鸡红细胞悬浮液(体积百分浓度为1％)进行红细胞凝集试验，每个稀释度的PCV2病毒共有3个平行实验。结果如图15所示，将滴度为1×107TCID50/mL的PCV2病毒原液稀释128倍(第9列孔)后仍可以出现肉眼可见的、强凝集现象，经过计算得出，该方法所能检测到的最低PCV2病毒量约为3.9×103TCID50/mL，说明利用该双功能纳米抗体所建立的血凝方法具有较高的灵敏度。
5.双功能纳米抗体热稳定性试验的鉴定
用PBS缓冲液将双功能纳米抗体Nb43-57稀释到60μg/mL，37℃分别静置0、6、12、24和48h；将静置处理不同时间的双功能纳米抗体Nb43-57分别进行红细胞凝集试验。结果如图16所示，双功能纳米抗体Nb43-57在37℃处理不同时间后，仍保持较好的反应活性，说明双功能纳米抗体具有较好的热稳定性，与传统抗体相比，本发明所获得的双功能纳米抗体用作检测试剂可以提高检测诊断的稳定性、延长检测诊断试剂盒的有效期。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用
<130> 20181130
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 双功能纳米抗体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Asn Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala Glu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Arg Arg Arg Phe Gly Asp Ile Trp Tyr Thr Gly Arg Asp
100 105 110
Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ala Ala Tyr His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Ala Pro Lys Ala
130 135 140
Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Arg Tyr Ser Trp
165 170 175
Tyr Cys Met Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
180 185 190
Val Ala Ser Ile Ala Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Val Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Leu Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Phe Arg Arg Arg Trp Tyr Ala Ala Arg Cys Glu Ala Ser Thr
245 250 255
Glu Gly Gly Val Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Ala Ala Ala Tyr
275
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 双功能纳米抗体
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ccagggaagg agcgcgagaa ggtcgcagaa atttactctg gtagtactag cacatactat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcaagacgt 300
agacgttttg gtgatatctg gtacacgggg cgtgatgagt ataactattg gggccagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc agcggccgca taccaccaca gcgaagaccc cagctccaaa 420
gctcccaaag ctccccaggt gcagctgcag gagtctggag gaggcttggt gcagcctggg 480
gggtctctga gactctcctg cgcagtttct ggattgaggt atagctggta ctgtatgaac 540
tggttccgcc aggctccagg gaaggagcgc gagggggtcg catctattgc aagcgatggt 600
acgaccacat acgtagactc cgtgaagggc cgtttcacca tctccaaaga caacgctttg 660
aacactctgt atctgcaaat gaacagcctg aaacctgagg acactggcac gtactactgt 720
gcggcatttc gccggcggtg gtacgccgca cggtgcgagg catcgacgga gggaggcgtg 780
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<213> 双峰驼
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Claims (9)

1.一种用于血凝方法检测PCV2病毒的双功能纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述双功能纳米抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因，其特征在于所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
4.携带权利要求2所述编码基因的载体、重组菌。
5.权利要求1所述双功能纳米抗体的制备方法，其特征在于将权利要求2所述双功能纳米抗体的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得所述双功能纳米抗体。
6.权利要求1所述双功能纳米抗体在以非诊断为目的的PCV2病毒检测中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于采用所述双功能纳米抗体以血凝方法检测PCV2病毒。
8.根据权利要求书7所述应用，其特征在于在待检样品中加入所述双功能纳米抗体致敏的鸡红细胞，当发生凝集现象时，表明样品中存在PCV2病毒。
9.根据权利要求书8所述应用，其特征在于采用55-65ug/ml的双功能纳米抗体加入到体积百分浓度为2%的鸡红细胞悬液中进行致敏，得到双功能纳米抗体致敏的鸡红细胞。
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