CN111454171A

CN111454171A - 一种百草枯半抗原ph-a、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN111454171A
Application number: CN202010152117.7A
Authority: CN
Inventors: 沈玉栋; 张咏仪; 徐振林; 王弘; 杨金易; 孙远明; 肖治理; 雷红涛
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-03-06
Also published as: CN111454171B

Abstract

本发明公开了一种百草枯半抗原PH‑A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种百草枯半抗原PH‑A，所述半抗原PH‑A的结构式如式(I)所示：

该半抗原PH‑A与待测物百草枯的骨架结构重叠度高，有效地提高了半抗原PH‑A的免疫原性；进一步利用该半抗原PH‑A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼，筛选得到了能够特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2‑23；并利用该纳米抗体Nb2‑23建立了一种检测百草枯的方法，该方法的检测限为0.54ng/mL～3.86ng/mL，半抑制浓度(IC50)为1.44ng/mL，最低检测限(LOD)为0.34ng/mL，具有检测灵敏度高、特异性强、操作简单且耗时短的优点，在百草枯的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

百草枯是一种联吡啶类的灭生性除草剂，因其具有活性佳、杀草谱广、防效好、见效快等特点广泛应用于农田间除草，药液接触土壤后能被土壤胶体迅速、强烈吸附，并完全钝化而不影响作物根部。但是，百草枯在土壤中有极强的吸附作用而在土壤中产生残留，并对水资源产生严重污染，且百草枯对人毒性极大；研究表明，百草枯的残留可能会导致肺纤维化，皮肤若长时间接触百草枯，或短时间接触高浓度百草枯，特别是破损的皮肤等均可导致全身中毒。这就要求对除草剂生产以及食品中百草枯残留量进行严格监测，以保护消费者的身心健康。

目前，百草枯已被多个国家禁止或者严格限制使用，最新《农药管理条例》规定百草枯可溶胶剂从2020年9月26日起禁止使用，百草枯全面禁止使用；最新国标GB2763-2019限量要求更为苛刻，提升至0.005mg/kg。因此，需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对百草枯的快速检测。现有常见的检测百草枯的方法有：气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法、紫外分光光度法、以及其他定量检测方法。高效液相色谱分析法、气相色谱等仪器分析方法其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。因此，提供一种抗原结构稳定，制备得到的抗体对百草枯的特异性强，能够快速、灵敏、准确的检测百草枯的方法具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测百草枯的方法的缺陷和不足，提供一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

本发明的目的是提供一种百草枯半抗原PH-A。

本发明另一目的是提供一种百草枯人工抗原。

本发明又一目的是提供所述人工抗原的制备方法。

本发明再一目的是提供所述半抗原PH-A或所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用。

本发明再一目的是提供一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23。

本发明再一目的是提供一种编码所述纳米抗体Nb2-23的基因。

本发明再一目的是提供一种重组载体。

本发明再一目的是提供一种重组细胞。

本发明再一目的是提供所述纳米抗体Nb2-23、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测百草枯中的应用。

本发明再一目的是提供一种检测百草枯的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种百草枯半抗原PH-A，所述半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：

优选地，所述半抗原PH-A的制备方法为：将4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛与具有式(III)所示结构式的羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应而得到。

所述4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛与羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应后，得到的半抗原PH-A与百草枯分子骨架结构重叠度高，有利于进行免疫诱导，有效地提高了半抗原PH-A的免疫原性。

所述带羧基的羧甲基羟胺半盐酸盐的结构式如式(III)所示：

本发明还提供了一种百草枯人工抗原，所述人工抗原的结构式如式(II)所示：

本发明还提供了所述人工抗原的制备方法，采用活泼酯法将所述的半抗原PH-A与载体蛋白偶联制备得到；所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。

所述半抗原PH-A与载体蛋白偶联时，半抗原PH-A的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的纳米抗体奠定了基础。

另外，所述半抗原PH-A或所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23，是由所述半抗原PH-A或所述人工抗原制备而得到；所述纳米抗体Nb2-23的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述纳米抗体Nb2-23的制备方法为：将所述人工抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫羊驼，在驼源免疫的纳米抗体库中筛选出能够与百草枯特异性结合的纳米抗体，通过基因工程重组表达的方式进行大量制备而得到。

本发明还提供了一种编码所述纳米抗体Nb2-23的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体连接有所述基因。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为携带有所述重组载体的细胞或能够表达所述纳米抗体Nb2-23的细胞。

所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测百草枯中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

另外，本发明还提供了一种检测百草枯的方法，用所述半抗原PH-A与卵清白蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，用所述纳米抗体Nb2-23作为检测抗体进行检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种百草枯半抗原PH-A，该半抗原PH-A与待测物百草枯的骨架结构重叠度高，有效地提高了半抗原PH-A的免疫原性；进一步利用该半抗原PH-A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼，筛选得到了能够特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23；

该纳米抗体Nb2-23与百草枯其他结构及功能类似物均无交叉，利用其所建立的检测百草枯的方法的检测限为0.54ng/mL～3.86ng/mL，半抑制浓度为1.44ng/mL，最低检测限为0.34ng/mL，具有简便快速、特异性强、灵敏度高的特点；另外，该纳米抗体Nb2-23的制备方法简单，可用于环境和食品样品中百草枯的快速有效检测；因此，所述纳米抗体Nb2-23在检测百草枯中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是百草枯半抗原PH-A的质谱图。

图2是纳米抗体Nb2-23的氨基酸编号及结构域示意图。

图3是基于纳米抗体Nb2-23建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1羊驼免疫抗体文库的构建

(1)百草枯半抗原PH-A的制备

由于百草枯是小分子不具有免疫原性，不能刺激羊驼产生免疫应答，进而产生抗体，故需要通过蛋白连接技术将百草枯半抗原偶联到载体蛋白上，使其获得免疫原性。蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基、羧基、羟基、疏基等，鉴于分子结构式中没有这些活泼基团且不容易连接手臂；因此，采用以4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛与羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应得到半抗原，记为半抗原PH-A。百草枯半抗原PH-A的制备方法具体如下：

100mg 4'-(4-甲基苯基)-苯甲醛、74mg羧甲基羟胺半盐酸盐，在5～10mL的乙醇溶液中，40℃回流过夜。乙酸乙酯和饱和NaCl萃取，得到黄色浓稠液体，滤液通过减压蒸馏除溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化获得白色固体，即为百草枯半抗原PH-A。

百草枯半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：

百草枯半抗原PH-A的质谱图如图1所示，由质谱图可以看出，267.9为半抗原PH-A的负离子分子峰，计算得其相对分子质量为269，与实际的相对分子质量相符，说明成功制备得到了百草枯半抗原PH-A。

(2)百草枯完全抗原PH-A-LF和PH-A-OVA(人工抗原)的制备

将步骤(1)得到的百草枯半抗原PH-A通过活泼酯法偶联卵清白蛋白OVA(albumin)和乳铁蛋白LF(lactoferrin)，将百草枯半抗原PH-A溶于DMF中，添加1.5eq NHS和EDC于溶液中在4℃反应过夜，记为A液，将A液逐滴加入到载体蛋白的PBS缓冲溶液中，于4℃下继续反应8h；将反应液于4℃下透析3天，每天换两次透析液，即得百草枯完全抗原PH-A-LF和PH-A-OVA。

百草枯人工抗原的结构式如式(II)所示：

(3)羊驼的免疫

用健康的羊驼作为实验动物，以完全抗原PH-A-LF作为免疫原，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每间隔2周加强免疫一次。免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。当出现较好的免疫应答效果时，取血100mL外周血进行淋巴细胞的分离，用于构建纳米抗体文库。

(4)羊驼淋巴细胞的分离

取羊驼全血与等体积生理盐水混合成1:1稀释血液，常温放置。在无菌的50mL离心管中加入20mL的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入20mL的稀释血液。500g离心30min。取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下2000g离心10min，弃上清。用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次2000g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，1mL一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用。

(5)总RNA的提取

总RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。具体方法如下：

将上述裂解液每1mL加入0.2mL的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5min。室温下12000rpm离心10min。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向GBC吸附柱中加入500μL Wash Buffer I离心1min，弃废液；向GBC吸附柱中加入600μL Wash Buffer II，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1min，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μL ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心1min。收集管内液体，于-80℃保存。

(6)cDNA的合成

以RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：

A.按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；

表1 cDNA合成的第一步反应体系

B.上述反应体系65℃孵育5min，冰浴冷却2min；

C.按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；

表2 cDNA合成的第二步反应体系

步骤A反应后的体系	12μL
		5×Reaction Buffer	4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)	1μL
		10mM dNTP Mix	2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL)	1μL
		Total	20μL

D.42℃孵育60min，70℃孵育5min。反转录产物cDNA于-80℃保存。

(7)纳米抗体VHH目的基因的扩增

第一轮PCR：将步骤(5)得到的反转录产物cDNA作为模板，利用引物Q1/Q2进行第一轮PCR反应，引物Q1/Q2的核苷酸序列如表5中的SEQ ID NO.10～11所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。

表3第一轮PCR的反应体系

第一轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min30cycle；72℃10min。

第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Q3/Q4或引物Q3/Q5进行第二轮PCR反应，引物Q3/Q4的核苷酸序列如表5中的SEQ ID NO.12～13所示，引物Q3/Q5的核苷酸序列如表5中的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。

表4第二轮PCR的反应体系

第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min30cycle；72℃10min。

表5纳米抗体VHH目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列

Q1(SEQ ID NO.10)	5′-gtcctggctgctcttctacaagg-3＇
		Q2(SEQ ID NO.11)	5′-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3＇
Q3(SEQ ID NO.12)	5′-catgccatgactgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc-3＇
		Q4(SEQ ID NO.13)	5′-catgccatgactcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg-3＇
Q5(SEQ ID NO.14)	5′-catgccatgactcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg-3＇

(8)文库构建

A.VHH目的基因及载体的酶切

采用Sfi I酶对VHH目的基因及pComb3xss载体进行酶切。酶切条件：50℃水浴锅反应16h。

B.酶切产物的连接

将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1∶3)，于16℃连接反应16h后用试剂盒清洁回收。

C.电转化

取5μL连接产物加至50μL电转感受态E.coil TG1中，轻轻混匀后转入0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，立即向电转杯加入950μL SOC培养基，37℃，250rpm培养1h，将菌液涂布于LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。

(9)文库的救援

接种超过10倍库容量的细胞于200mL LB(Amp)中37℃，250rpm培养至OD600约0.4～0.6；加入辅助噬菌体M13K07(20:1感染复数)，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm4℃15min离心，取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，冰浴2～3h。12000rpm 4℃15min离心，弃上清，沉淀用1mL TBS重悬，转移到2mL离心管，12000rpm 4℃5min离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。

实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

(1)纳米抗体的亲和淘选

首先，以PH-A-OVA作为包被原，用包被液将PH-A-OVA包被原稀释至终浓度10μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入1％鱼胶蛋白37℃封闭2h。甩干孔内液体并拍干，每孔加入100μL噬菌体文库(文库滴度约为10¹³cfu/mL)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次，PBS(pH7.0)洗涤15次，加入Gly-HCl(0.2M，pH 2.2)37℃洗脱10min，立即用10μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染4mL生长至对数期的E.coil TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、三、四轮的淘选过程中，包被的PH-A-OVA包被原浓度为2μg/mL、0.4μg/mL、0.25μg/mL，加入噬菌体孵育1h，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。其余步骤同上。药物洗脱浓度分别1000ng/mL、400ng/mL、100ng/mL。

(2)阳性噬菌体克隆的鉴定

采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：

A.包板：用包被液将PH-A-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。

B.从第三、四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选30个克隆于加有Amp抗性的LB培养基的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃培养过夜。第二天从96孔深孔板中取出10μL菌液加入到另一块96孔深孔板，37℃，180rpm培养2h，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。第三天4000rpm离心取上清100μL，加入到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

(3)纳米抗体的鉴定

采用间接竞争ELISA的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：

用包被液将PH-A-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的百草枯标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。

结果显示：获得了一株能够特异性识别百草枯的纳米抗体，命名为Nb2-23。

实施例3纳米抗体Nb2-23编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

1、实验方法

将经过间接竞争ELISA鉴定获得的纳米抗体Nb2-23的菌株送到测序公司进行测序，获得纳米抗体Nb2-23的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得纳米抗体Nb2-23的氨基酸序列。

2、实验结果

纳米抗体Nb2-23的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述纳米抗体Nb2-23的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

纳米抗体Nb2-23的氨基酸编号及结构域示意图如图2所示，可以看出，该纳米抗体Nb2-23包括4个框架区(Framework region,FR)和3个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)；框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6；互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ IDNO.9。

其中，第1-25位氨基酸序列为FR1，其氨基酸如SEQ ID NO.3所示；第26-33位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸如SEQ ID NO.7所示；第34-49位氨基酸序列为FR2，其氨基酸如SEQID NO.4所示；第50-58位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸如SEQ ID NO.8所示；第59-96位氨基酸序列为FR3，其氨基酸如SEQ ID NO.5所示；第97-110位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸如SEQ ID NO.9所示；第111-129位氨基酸序列为FR4，其氨基酸如SEQ ID NO.6所示。

实施例4纳米抗体Nb2-23的大量制备

以蛋白表达的形式进行制备纳米抗体Nb2-23，具体方法为：

将所获得的纳米抗体Nb2-23的菌株，用试剂盒提取其质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coil BL21中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于1000mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD600约为0.4-0.6时，加入IPTG(1:1000比例，v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体Nb2-23。

实施例5纳米抗体Nb2-23的灵敏度测定

1、包被及封闭

用包被液将PH-B-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。

2、标准曲线的建立

(1)实验方法

将包好的酶标板，每孔加入50μL抗百草枯的纳米抗体(纳米抗体Nb2-37)和一系列不同浓度的50μL的百草枯标准品，37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以百草枯标准品浓度对横坐标，B/B₀(加入百草枯的孔的OD₄₅₀/未加入百草枯的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(2)实验结果

基于纳米抗体Nb2-23建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为0.54ng/mL～3.86ng/mL，IC50为1.44ng/mL，最低检测限(LOD)为0.34ng/mL，检测灵敏度高。

实施例6纳米抗体Nb2-23的特异性测定

1、实验方法

以PH-A-OVA为包被原，纳米抗体Nb2-23为检测抗体，采用间接竞争ELISA方法对百草枯类似物农药的特异性进行评价。具体步骤如下：

每孔加入50μL梯度稀释的药物和50μL纳米抗体Nb2-23，每个浓度做三个重复。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以标准品浓度为横坐标，B/B₀为纵坐标，用Origin9.0的四参数拟合模块拟合标准曲线建立间接竞争标准曲线，得出各自的IC50值。用以下公式计算各药物与纳米抗体Nb2-23的交叉反应率：

2、实验结果

结果显示，纳米抗体Nb2-23与敌草快(IC₅₀为2500ng/mL)、联苯菊酯(IC₅₀为5000ng/mL)交叉反应率低于0.1％；说明纳米抗体Nb2-23能够特异性地识别百草枯，本发明所建立的检测方法对于百草枯检测的特异性高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种百草枯半抗原PH-A、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr His Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Trp Ser Ile Arg Lys Arg Phe Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro

115 120 125

His

<210> 2

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

acctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatacca tgaactggta ccgccagact 120

ccagggaagg agcgcgagtt ggtcgcgtct attactcata ctggcggcag cacaaactat 180

gccgactccg tgaacggccg attcaccatc tccagagata ataccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acttgaggac acggccgtgt attactgtaa cggagacccc 300

tggtctatac ggaaacggtt ttatgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tcagcgcacc acagcgaaga cccccat 387

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn Tyr Ala Asp Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Leu Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu

1 5 10 15

Asp Pro His

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Ile Thr His Thr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asn Gly Asp Pro Trp Ser Ile Arg Lys Arg Phe Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgccatga ctgtggccca ggcggcccag ktgcagctcg tggagtc 47

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catgccatga ctcgcggccg gcctggccat gggggtcttc gctgtggtgc g 51

<210> 14

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgccatga ctcgcggccg gcctggccgt cttgtggttt tggtgtcttg gg 52

Claims

1.一种百草枯半抗原PH-A，其特征在于，所述半抗原PH-A的结构式如式(I)所示：

2.一种百草枯人工抗原，其特征在于，所述人工抗原的结构式如式(II)所示：

3.权利要求2所述人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将权利要求1所述的半抗原PH-A与载体蛋白偶联制备得到；所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。

4.权利要求1所述半抗原PH-A或权利要求2所述人工抗原在制备特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23中的应用。

5.一种特异性识别百草枯的纳米抗体Nb2-23，其特征在于，是由权利要求1所述半抗原PH-A或权利要求2所述人工抗原制备而得到；所述纳米抗体Nb2-23的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种编码权利要求5所述纳米抗体Nb2-23的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体连接有权利要求6所述基因。

8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为携带有权利要求7所述重组载体的细胞或能够表达权利要求5所述纳米抗体Nb2-23的细胞。

9.权利要求5所述纳米抗体Nb2-23、权利要求6所述基因、权利要求7所述重组载体或权利要求8所述重组细胞在检测百草枯中的应用。

10.一种检测百草枯的方法，其特征在于，基于间接ELISA方法进行检测，用权利要求1所述半抗原PH-A与卵清白蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，用权利要求5所述纳米抗体Nb2-23作为检测抗体进行检测。