CN109053884A

CN109053884A - Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用

Info

Publication number: CN109053884A
Application number: CN201810906228.5A
Authority: CN
Inventors: 李淑锋; 单海涛; 马芳
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2018-12-21
Also published as: CN105399827B; CN105399827A

Abstract

本发明公开了一种Wasabi蛋白纳米抗体在检测Wasabi蛋白中的应用，双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法，从而来定量检测含Wasabi蛋白标签的融合蛋白。首先从骆驼中筛选得到Wasabi蛋白特异性单克隆抗体，将该抗体在大肠杆菌中表达，然后包被Wasabi蛋白纳米抗体，利用酶联免疫吸附的方法检测。同时本发明也公开了一种Wasabi蛋白纳米抗体的核苷酸序列以及氨基酸序列。这一种Wasabi蛋白纳米抗体均可以在大肠杆菌内进行高可溶性表达。本发明用来进行Wasabi蛋白标签融合蛋白的定量检测具有：操作简便、高特异性、高灵敏度等优点。

Description

Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Wasabi蛋白纳米抗体及其在检测Wasabi蛋白中的应用。

背景技术

Wasabi蛋白是一种近年来发现的变体绿色荧光蛋白，它的荧光大约是EGFP的2倍，因为其优异的特性，在未来会替代现在使用较多的EGFP和GFP等绿色荧光蛋白。Wasabi蛋白以其本身所具有的荧光特性而成为用途非常广泛的蛋白标签，为检测或纯化目的蛋白提供了便利。含Wasabi蛋白标签的融合蛋白表达后，可以通过荧光显微镜对其进行定性检测，但是在很多情况下仍然需要对其进行定量检测。如今对含有Wasabi蛋白标签的重组蛋白的定量检测方法主要是针对重组蛋白的免疫印迹，但是免疫印迹属于半定量，并且实验所需时间较长，步骤繁琐。

1993年比利时的Hamers Casterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variable domain ofthe heavy chain of HCAbs,VHH)单结构域形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。由于其在可变区，框架FR2区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中具有良好的稳定性。VHH抗体是目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段，其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故被称为单域抗体或纳米抗体(nanobody)。纳米抗体重要的特征之一是其具有更为伸展的抗原互补决定区(CDR)，可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。纳米抗体，它还具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。

获得纳米抗体的编码序列以及氨基酸序列是通过噬菌体展示技术，对构建的纳米抗体文库进行高效率的筛选，从而使特异结合的克隆得到高度富集。噬菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术，其原理是以噬菌体为载体，将外源核酸片段克隆至噬菌体外壳蛋白基因中，并以外壳蛋白融合蛋白的形式表达于噬菌体表面，组成了噬菌体展示库。然后用固定化的靶分子去筛选与之亲和的噬菌体，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而能结合的噬菌体被保留下来并通过感染大肠杆菌得以扩增和富集，实现高通量筛选。特异性噬菌体得到富集后，对其进行基因测序得到编码序列，进而进行原核表达得到具有活性的纳米抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种针对Wasabi表位的纳米抗体。同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种Wasabi蛋白纳米抗体，所述的Wasabi纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区，

其中，

所述的框架区包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO：1所示的FR1，如SEQ ID NO：2所示的FR2，如SEQ ID NO：3所示的FR3，如SEQ ID NO：4所示的FR4；所述的互补决定区包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO：5所示的CDR1，如SEQ ID NO：6所示的CDR2，如SEQ IDNO：7所示的CDR3；

或者，

所述的框架区包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO：8所示的FR1，如SEQ ID NO：9所示的FR2，如SEQ ID NO：10所示的FR3，如SEQ ID NO：11所示的FR4；所述的互补决定区包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO：12所示的CDR1，如SEQ ID NO：13所示的CDR2，如SEQID NO：14所示的CDR3。

一种Wasabi蛋白纳米抗体，所述Wasabi纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：15或者SEQ ID NO：16所示。

一种编码Wasabi蛋白纳米抗体的基因，其核苷酸序列，如SEQ ID NO：17或者SEQID NO：18所示。

一种重组质粒，该重组质粒中包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列。

一种重组细胞，该重组细胞中包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示核苷酸序列。

上述Wasabi蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将Wasabi蛋白纳米抗体的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到重组质粒，将该重组质粒转化宿主菌，诱导表达纳米抗体蛋白；所述的宿主菌包括大肠杆菌、酵母等常用的基因工程表达宿主；

(2)从宿主菌中纯化Wasabi蛋白纳米抗体。

步骤(1)中，所述的表达载体为PET32b，所述的宿主菌优选大肠杆菌。

步骤(2)中，利用Ni-IDA亲和层析的方法纯化Wasabi蛋白纳米抗体。

上述Wasabi蛋白纳米抗体在检测Wasabi蛋白中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的Wasabi蛋白为Wasabi标准蛋白或Wasabi融合蛋白，采用双抗体夹心酶联免疫吸附的方法检测Wasabi蛋白。

具体的方法如下：

将Wasabi蛋白纳米抗体作为包被抗体，用包被缓冲液(50mmol/L Na₂C0₃-NaHCO₃，pH 9.6)稀释至5ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被过夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封闭液，室温封闭一小时。丢弃封闭液并用TBST洗3次，对照孔中加入梯度稀释的Wasabi标准蛋白，实验孔中加入待测样品Wasabi融合蛋白，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入200ul，1：500稀释的检测抗体(兔抗Wasabi多克隆抗体)，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔抗体，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，每孔加入100ul显色液，室温避光反应20分钟，ELISA板置于酶标仪上，测吸光值。

有益效果：

(1)本发明中公开了两种Wasabi蛋白纳米抗体及其基因序列，这两种基因均能在大肠杆菌中表达，得到可溶的蛋白。

(2)利用Ni-IDA亲和层析的方法，从大肠杆菌中纯化得到两种Wasabi蛋白纳米抗体，Western Blot检测结果显示：Wasabi蛋白纳米抗体对Wasabi蛋白有很好的特异性，且具有很高的效价。

(3)将得到的Wasabi蛋白纳米抗体作为包被抗体，用双抗体夹心酶联免疫吸附的方法检测能准确定量检测Wasabi融合蛋白，该方法具有操作简便、高特异性、高灵敏度等优点。

附图说明

图1是Western Blot检测Wasabi蛋白多克隆抗体的特异性图：1为20ug Wasabi蛋白上样量；2为5ug Wasabi蛋白上样量。

图2是nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR1产物。

图3是nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为nest-PCR2产物即扩增所得的VHH片段。

图4是Wasabi蛋白纳米抗体文库的多样性鉴定图：M为DNA分子标准；1-29是Wasabi蛋白纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物。

图5是Wasabi蛋白纳米抗体1诱导表达的SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为未诱导全菌总蛋白；2为诱导全菌总蛋白；3为超声上清；4为镍柱纯化后蛋白。

图6是Wasabi蛋白纳米抗体2诱导表达的SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为诱导菌的超声破碎上清，2为镍柱纯化后蛋白。

图7是Western Blot检测Wasabi蛋白纳米抗体1的特异性图：M为蛋白分子标准；1为5μg Wasabi蛋白上样量；2为1μg Wasabi蛋白上样量；3为0.1μg Wasabi蛋白上样量。

图8是Western Blot检测Wasabi蛋白纳米抗体2的特异性图：M为蛋白分子标准；1为5μg Wasabi蛋白上样量；2为1μg Wasabi蛋白上样量；3为0.1μg Wasabi蛋白上样量。

图9是Wasabi蛋白的Elisa光吸收标准曲线。线性范围是1-100ng/ml。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：Wasabi蛋白的诱导表达及纯化。

(1)Wasabi蛋白的诱导表达：

首先将pNCS-Wasabi中的Wasabi片段亚克隆至pET28a；成功构建好的pET28a-Wasabi载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得pET28a-Wasabi重组菌，挑选单克隆于卡那霉素(50μg/ml)液体LB中，37℃培养过夜；然后以1：100接种于含卡那霉素(50μg/ml)液体LB中，37℃培养1.5～2h，当菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG(工作浓度为1mmol/L)，于恒温摇床中37℃诱导表达4h；4℃，3000g离心菌液获得菌体沉淀，可看到菌体有明显的绿色；菌体用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-Hcl pH7.8，300mmol/L Nacl)重悬，置于冰盒内超声破碎，12000rpm，10min离心收集上清。

(2)通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的Wasabi蛋白：

层析柱首先用菌体缓冲液清洗，加入Ni-IDA填充层析柱；将上述菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。

实施例2：Wasabi蛋白多克隆抗体的制备。

(1)Wasabi蛋白免疫新西兰大白兔：

将1mg的Wasabi蛋白与等体积的弗氏佐剂混合均匀，免疫新西兰大白兔(皮下注射8-10点，每点0.1ml)，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐剂，其余用不完全弗氏佐剂)；免疫结束后，取免疫后新西兰大白兔血液，制备血清。

(2)Western Blot检测Wasabi蛋白多克隆抗体的特异性：

制备12％SDS-PAGE凝胶，上样顺序分别为：marker，20ug Wasabi，5ug Wasabi；电泳结束后，用湿转法将Wasabi蛋白转到PVDF膜上；用5％脱脂奶粉室温封闭1小时；一抗孵育：稀释后的兔抗wasabi多克隆抗体，室温孵育一小时，TBST洗膜3次；二抗孵育：稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育一小时，TBST洗膜3次；运用Thermo SuperSignal West Pico化学发光底物对其进行显影。(见图1)显影结果显示，制备的Wasabi蛋白多克隆抗体具有很强的特异性。

实施例3：Wasabi蛋白纳米抗体文库的构建。

(1)Wasabi蛋白免疫新疆双峰骆驼：

将1mg的wasabi蛋白与等体积的弗氏佐剂混合均匀，免疫新疆双峰骆驼(皮下注射3-5点)，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐剂，其余用不完全弗氏佐剂)；免疫结束后，取免疫后骆驼的外周血200ml,分离获得外周血淋巴细胞。

(2)外周血淋巴细胞的分离及其总RNA的提取：

采用淋巴细胞分离液分离纯化骆驼外周血淋巴细胞。然后将淋巴细胞用生理盐水清洗几次后，加入Trizol,室温静置10min，加入氯仿剧烈震荡，室温静置15min；4℃，12000rpm，15min离心，上层水相加入异丙醇混匀，室温静置10min；4℃，12000rpm，10min离心，去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。

(3)逆转录PCR扩增VHH基因和酶切：

I、采用invitrogen公司的SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，通过nest-PCR扩增得到骆驼重链抗体的VHH片段。

表1 nest-PCR引物序列

引物	引物序列
		nest-PCR1 up	5′>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3′
nest-PCR1 down	5′>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3′
		nest-PCR2 up	5′>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3′
nest-PCR2 down	5′>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3′

Ⅱ、nest-PCR1 25ul体系：

以上述所得的cDNA为模板，以表1中nest-PCR1up(SEQ ID NO：19)和nest-PCR1down(SEQ ID NO：20)为引物，根据abm bestaq DNA polymerase说明书进行PCR扩增反应。

PCR反应体系如下：

PCR条件如下：

PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带(见图2)。切胶回收目的条带。

Ⅲ.nest-PCR2，25ul体系：

以nest PCR1DNA回收产物为模板，nest-PCR2up(SEQ ID NO：21)和nest-PCR2down(SEQ ID NO：22)为引物，进行PCR扩增反应。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR反应结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在500bp处有特异性条带(见图3)。切胶回收目的条带，即为VHH片段。

IV、VHH片段的双酶切：

使用TAKARA公司的EcoRⅠ和HindⅢ内切酶进行双酶切，反应体系如下：

37℃水浴3小时，琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。

(4)Wasabi蛋白免疫的纳米抗体库的构建：

选用Novagen公司的T7Select试剂盒构建T7纳米抗体库。依据说明书将VHH片段和T7载体进行连接和T7噬菌体的包装。通过噬菌斑滴度测定，构建的Wasabi纳米抗体库滴度大约为4×10⁷pfu/ml。

(5)Wasabi纳米抗体库的扩增

在50ml TB培养基中加入1ml培养过夜的宿主BLT5403菌液，37℃，培养至OD₆₀₀为0.6～1.0；加入构建的wasabi免疫纳米抗体库，37℃，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；13000rpm,10min离心，上清为扩增的wasabi免疫纳米抗体库；对其进行噬菌斑滴度测定，其滴度为5.6×10¹⁰pfu/ml。

(6)检测Wasabi纳米抗体文库的多样性

随机挑选噬菌体抗体库中的噬菌斑于50ul 10mM EDTA中，剧烈震荡混匀，65℃水浴15min，13000rpm离心10min，上清为粗提的噬菌体DNA；以其为模板，进行PCR反应，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(见图4)，并对其进行测序，分析Wasabi纳米抗体文库的多样性。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

测序结果显示，20个单克隆噬菌斑，有18种核酸序列，并且这些序列翻译成的氨基酸序列也不相同，说明构建的Wasabi蛋白纳米抗体文库有很好的多样性。

实施例4：运用镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA淘选Wasabi纳米抗体。

(1)Ni-NTA介质的清洗：

取100ulNi-NTA介质于1.5mlEP管中，加1ml灭菌水，涡旋震荡仪混匀；3000rpm，30s离心，弃上清；共洗5次，最后一次用0.05％TBST代替灭菌水。

(2)封闭：

洗好的Ni-NTA介质加入1ml封闭液(0.5％BSA)，翻转摇匀1h；封闭结束后，1mlTBST洗4次。

(3)负筛去除非特异结合的噬菌体：

Wasabi VHH-T7噬菌体库用TBST稀释至1ml，加入到封闭后的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；3000rpm，30s离心，上清即为负筛后的T7噬菌体库。

(4)与Wasabi特异结合的噬菌体的筛选：

负筛后的Wasabi噬菌体库加入20ug Wasabi蛋白(1ug/ul)，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min。然后将混合物加入到封闭好的Ni-NTA介质中，置于翻转摇匀仪上，室温结合30min；3000rpm，30s离心，弃上清。1ml TBST洗获得的沉淀，置于翻转摇匀仪上洗5min，共洗5次；3000rpm，30s离心，弃上清；加入400ul TB培养基混匀，平均分为两份，一份用来测定筛选后的噬菌体的滴度，一份用来扩增筛选后的噬菌体。

(5)筛选后的噬菌体的扩增：

将筛选后的噬菌体加入到50ml OD₆₀₀＝0.6的BLT5403宿主菌中，37℃震荡培养，培养至有白色絮状沉淀出现时，停止培养；13000rpm,10min离心，上清即为扩增的第一轮筛选后的噬菌体，置于4℃保存，并用于下一轮的筛选；按相同筛选步骤，筛选3～4轮。

实施例5：ELISA鉴定特异性的Wasabi纳米抗体噬菌体克隆。

上述最后一轮筛选所得的噬菌体，在150mm的TB固体培养基上培养，并挑选70个单克隆噬菌斑于3ml OD₆₀₀＝0.6的BLT5403宿主菌中进行液体裂解法扩增，离心，上清于4℃保存，即为单克隆噬菌体；

ELISA板每孔加入2ug Wasabi蛋白包被，置于4℃过夜，第二天0.5％BSA室温封闭1h；实验组每孔加入单克隆噬菌体，对照组加入等量的野生型T7噬菌体，室温孵育1～2h；200ul TBST洗去未结合的噬菌体，共洗5次，然后加入兔抗T7噬菌体10A抗体，室温孵育1～2h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1h；TBST洗ELISA板3～5次，然后加入显色液，避光反应10min，ELISA板置于酶标仪上，测吸光值，当实验孔与对照孔吸光值比值大于2时，判定其为阳性克隆；提取阳性克隆噬菌体的DNA进行测序。

ELISA鉴定结果显示，获得30个阳性克隆。然后对其进行DNA测序，获得2种核苷酸序列；对其氨基酸序列进行分析，这两种序列均具有典型的纳米抗体结构，由框架区(FR1，FR2，FR4，FR4)和互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)构成。这两株单克隆噬菌体的核苷酸序列、氨基酸序列如下：

Wasabi蛋白纳米抗体1

核苷酸序列(SEQ ID NO：17)

gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcatgtgcagcctctggatacacctacagtagcaactgcattggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgaggtggtcgcagttatttatactagtgatggtagcacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcaggtgaaggcgccgatctatatggttactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：

DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSSNCIGWFRQAPGKEREVVAVIYTSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGEGADLYGYWGQGTQVTVSS

框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：

FR1(SEQ ID NO：1):DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAAS

CDR1(SEQ ID NO：5)：GYTYSSNC

FR2(SEQ ID NO：2)：IGWFRQAPGKEREVVAV

CDR2(SEQ ID NO：6)：IYTSDGST

FR3(SEQ ID NO：3)：YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC

CDR3(SEQ ID NO：7)：AAGEGADLYGY

FR4(SEQ ID NO：4)：WGQGTQVTVSS

Wasabi蛋白纳米抗体2

核苷酸序列(SEQ ID NO：18)：

caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagtttctggatacacctacagtagcaactacatggcctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggagtcgcagctatttatactggtggtggtactacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagactacgccaagaacacggtttatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagacgggcttgggctggtcgaacggacctttcgttactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

氨基酸序列(SEQ ID NO：16)：

QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGYTYSSNYMAWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGTTYYADSVKGRFTISQDYAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADGLGLVERTFRYWGQGTQVTVSS

框架区(FR1-FR4)和互补决定区(CDR1-CDR3)氨基酸序列：

FR1(SEQ ID NO：8)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVS

CDR1(SEQ ID NO：12)：GYTYSSNY

FR2(SEQ ID NO：9)：MAWFRQAPGKEREGVAA

CDR2(SEQ ID NO：13):IYTGGGTT

FR3(SEQ ID NO：10):YYADSVKGRFTISQDYAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYC

CDR3(SEQ ID NO：14):AADGLGLVERTFRY

FR4(SEQ ID NO：11):WGQGTQVTVSS

实施例6：Wasabi蛋白纳米抗体的诱导表达和纯化。

(1)Wasabi蛋白纳米抗体的诱导表达：

将上面测序分析所获得的两种纳米抗体基因亚克隆至表达载体PET32b，挑单克隆菌株，37℃，培养过夜。以1:100的比例将Wasabi蛋白纳米抗体表达菌加入到扩大培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加IPTG诱导表达。4℃，3000g离心菌液获得菌体沉淀，菌体用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-Hcl PH7.8，300mmol/L Nacl)重悬，置于冰盒内超声破碎，12000rpm，10min离心收集上清。然后用12％SDS-PAGE电泳检测Wasabi蛋白纳米抗体1和2的表达情况(见图5，图6)。SDS-PAGE电泳检测结果显示，诱导后的Wasabi蛋白纳米抗体1和2都具有较好的可溶性表达。

(2)Wasabi蛋白纳米抗体的纯化：

通过Ni-IDA亲和层析的方法获得纯化的wasabi蛋白纳米抗体：将上述Wasabi蛋白纳米抗体表达菌菌体超声上清加入镍柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床体积的清洗缓冲液(40mmol/L咪唑，菌体缓冲液)洗掉杂蛋白；用等体积的洗脱缓冲液(250mmol/L咪唑，)洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。

实施例7：Western Blot检测Wasabi蛋白纳米抗体的特异性。

制备12％SDS-PAGE凝胶，上样顺序分别为：marker，5ug Wasabi，1ug Wasabi，0.1ug Wasabi；电泳结束后，用湿转法将Wasabi蛋白转到PVDF膜上；用5％脱脂奶粉室温封闭1小时；封闭后，1：2 000加入纯化的纳米抗体，室温孵育1小时，TBST洗膜3次；然后加入1：1000稀释的兔抗HA抗体，室温孵育一小时，TBST洗膜3次；再加入1：3000稀释的HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育一小时，TBST洗膜3次；用Thermo SuperSignal West Pico化学发光底物对其进行显影。图7和图8Western Blot检测结果显示：Wasabi蛋白纳米抗体对Wasabi蛋白有很好的特异性，且具有很高的效价。

实施例8：定量检测Wasabi蛋白及Wasabi融合蛋白的方法。

将Wasabi蛋白纳米抗体作为包被抗体，用包被缓冲液(50mmol/L Na₂C0₃-NaHCO₃pH 9.6)稀释至5ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被过夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封闭液，室温封闭一小时。丢弃封闭液并用TBST洗3次，对照孔中加入梯度稀释的Wasabi标准蛋白，实验孔中加入待测样品Wasabi融合蛋白，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入200ul，1：500稀释的检测抗体(兔抗Wasabi多克隆抗体)，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔抗体，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，每孔加入100ul显色液，室温避光反应20分钟，ELISA板置于酶标仪上，测吸光值。以Wasabi标准蛋白的相应浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，作标准曲线。根据待测样品Wasabi融合蛋白的吸光值，经分子量换算后计算，即可得出待测样品浓度，见图9。

序列表

<110> 东南大学

<120> Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Gly Thr Pro Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gly Val Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Thr Ala Ala Ser Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ala Leu Ala Thr Val Thr Leu Gly Met Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala

20 25 30

Thr Ala Met Thr Thr Cys

35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ile Tyr Thr Ser Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ala Gly Glu Gly Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser

20 25

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 10

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Tyr

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Ala Asp Gly Leu Gly Leu Val Glu Arg Thr Phe Arg Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn

20 25 30

Cys Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Thr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Glu Gly Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gly Leu Gly Leu Val Glu Arg Thr Phe Arg Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcatgtgcag cctctggata cacctacagt agcaactgca ttggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggt ggtcgcagtt atttatacta gtgatggtag cacatactat 180

gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcaggtgaa 300

ggcgccgatc tatatggtta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354

<210> 18

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag tttctggata cacctacagt agcaactaca tggcctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgcgaggg agtcgcagct atttatactg gtggtggtac tacatactat 180

gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagact acgccaagaa cacggtttat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcagacggg 300

cttgggctgg tcgaacggac ctttcgttac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccggaattct caggtgcagc tggtggagtc tgg 33

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcccaagctt tgaggagacg gtgacctggg t 31

Claims

1.一种Wasabi蛋白纳米抗体，其特征在于，所述的Wasabi纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区，

其中，

所述的框架区包括以下4段氨基酸序列：如SEQ ID NO：8所示的FR1，如SEQ ID NO：9所示的FR2，如SEQ ID NO：10所示的FR3，如SEQ ID NO：11所示的FR4；所述的互补决定区包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO：12所示的CDR1，如SEQ ID NO：13所示的CDR2，如SEQ IDNO：14所示的CDR3。

2.一种Wasabi蛋白纳米抗体，其特征在于，所述Wasabi纳米抗体的氨基酸序列如SEQID NO：16所示。

3.一种编码Wasabi蛋白纳米抗体的基因，其特征在于，其核苷酸序列，如SEQ ID NO：18所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒中包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列。

5.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞中包含SEQ ID NO：18所示核苷酸序列。

6.权利要求1～2中任一项所述Wasabi蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Wasabi蛋白纳米抗体的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到重组质粒，将该重组质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体蛋白；

(2)从宿主细胞中纯化Wasabi蛋白纳米抗体。

7.根据权利要求6所述的Wasabi蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为PET32b，所述的宿主菌为大肠杆菌。

8.根据权利要求6所述的Wasabi蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，利用Ni-IDA亲和层析的方法纯化Wasabi蛋白纳米抗体。

9.权利要求1～2中任一项所述Wasabi蛋白纳米抗体在检测Wasabi蛋白中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Wasabi蛋白为Wasabi标准蛋白或Wasabi融合蛋白，采用双抗体夹心酶联免疫吸附的方法检测Wasabi蛋白。