CN106990252A

CN106990252A - 用于诊断活动性结核的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN106990252A
Application number: CN201710032710.6A
Authority: CN
Inventors: 葛胜祥; 刘永亮; 陈梦媛; 张军; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2016-01-20
Filing date: 2017-01-18
Publication date: 2017-07-28
Also published as: US20190025301A1; EP3407071A4; JP2019508684A; KR20180104038A; WO2017125007A1; AU2017209240A1; HK1258504A1; EP3407071A1

Abstract

本发明属于分子生物学、免疫学以及疾病诊断领域。具体而言，本发明涉及，用于诊断受试者是否患有活动性结核的方法，用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果的方法，以及用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物的方法。本发明还涉及含有特异性刺激原和检测IL‑6水平的试剂的试剂盒。

Description

用于诊断活动性结核的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学、免疫学以及疾病诊断领域。具体而言，本发明涉及，用于诊断受试者是否患有活动性结核的方法，用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果的方法，以及用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物的方法。本发明还涉及含有特异性刺激原和检测IL-6水平的试剂的试剂盒。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是一种非常严重的全球性健康问题，全球每年新增结核病人约有900万，因结核病死亡的人数高达170万。此外，据估计全球约有1/3人口为结核分枝杆菌潜伏感染者，这类人群为潜在的活动性结核病人来源。

控制结核病，首要是发现并治愈传染性结核病病人。X射线应用于临床检测后，为发现结核病病人提供了一种简便、易行、快速、敏感性高的方法；然而，X射线检测设备要求高，特异性低，过诊、漏诊、误诊率较高；此外X射线检测只能发现肺部可疑阴影，达不到检测出传染性病人的目的，因此1974年WHO第9次结核病专家委员会报告明确指出采取团体胸部X射线主动发现病人的方法，不仅在发达国家，在发展中国家都是不可取的，必须废止。

痰涂片检测可以检出传染性肺结核病病人，特异性高，设备要求简单，费用低，技术要求不高。但也存在取痰不易的问题，不少患者干咳无痰，或微量排菌不易检出。广泛应用的痰涂片检测灵敏度在34–80％之间，虽然痰培养检测灵敏度高于痰涂片，但是耗时长，对诊断实验室的要求高，在很多高结核负担国家无法满足该方法对实验室条件的要求。免疫检测技术在结核诊断上可能有很大的应用价值，尤其在实现快速诊断和床边诊断以后。

IFN-γ释放实验(IGRAs)是一种广泛应用的TB免疫诊断方法，在结核分支杆菌感染检测上已经被证明具有应用价值，检测效果比TST(tuberculin skin test)有显著的优势。但是，IGRAs和TST方法均不能区分结核潜伏性感染(LTBI)和活动性结核；在高结核负担国家因有很高比例潜伏感染人群，IGRAs的应用价值受到限制，其仍然只能作为一种辅助诊断手段。目前临床普遍采用的结核诊断仍然主要依赖临床症状、影像学诊断和病原学诊断。如果能够在结核发病早期准确快速确诊并进行适当的化疗，对减轻结核病人的危害及结核传染的控制将有重要价值。

因此，本领域需要简单、方便、快速且具有高准确性和特异性的活动性结核诊断方法。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“RV0183”或“RV0183蛋白”是指，天然存在于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的一种蛋白，属于单酰基甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)或溶血磷脂酶(lysophospholipase)。RV0183蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号CP009480.1,AIR12906.1,CCP42909.1,NP_214697.2，或WP_003401112.1)。

在本发明中，当提及RV0183的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。然而，本领域技术人员理解，结核分枝杆菌既包括标准株H37Rv，也可包括多种分离株，并且各种分离株的RV0183蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是结核分枝杆菌的不同分离株的RV0183蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性，并且具有实质上相同的生物学功能。同时，本领域技术人员理解，在RV0183蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“RV0183”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种结核分枝杆菌分离株的RV0183蛋白(例如BAL64025.1,AOE34503.1,EGE52872.1，或CDM08372.1所示的RV0183蛋白)，以及其天然或人工的变体。并且，当描述RV0183蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种结核分枝杆菌分离株的RV0183蛋白中的相应序列片段，以及SEQ ID NO：1的天然或人工变体中的相应序列片段。因此，表述“RV0183蛋白的第1-20位氨基酸残基”包括，SEQID NO：1的第1-20位氨基酸残基，以及各种结核分枝杆菌分离株的RV0183蛋白中的相应片段，以及RV0183蛋白的变体(天然或人工)中的相应片段。在本发明中，表述“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

在本发明中，术语“RV0183”或“RV0183蛋白”不受任何特定的合成蛋白的方法限制，可通过本领域技术人员已知的常规技术产生，例如DNA重组技术或化学合成技术。

如本文中所使用的，术语“PlcD”或“PlcD蛋白”是指，天然存在于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的一种蛋白，属于磷脂酶C(phospholipase C)家族。PlcD蛋白的序列是本领域公知的，参见例如Andersen ST,et al.，Nature,1998.393(6685):537-44(其通过引用并入本文)，以及NCBI数据库登录号CCP44521.1。

在本发明中，当提及PlcD的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。然而，本领域技术人员理解，结核分枝杆菌既包括标准株H37Rv，也可包括多种分离株，并且各种分离株的PlcD蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是结核分枝杆菌的不同分离株的PlcD蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性，并且具有实质上相同的生物学功能。同时，本领域技术人员理解，在PlcD蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PlcD”不仅包括SEQ IDNO:3所示的蛋白，而且应包括各种结核分枝杆菌分离株的PlcD蛋白，以及其天然或人工的变体。并且，当描述PlcD蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括各种结核分枝杆菌分离株的PlcD蛋白中的相应序列片段，以及SEQ ID NO：3的天然或人工变体中的相应序列片段。在本发明中，表述“相应序列片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

在本发明中，术语“PlcD”或“PlcD蛋白”不受任何特定的合成蛋白的方法限制，可通过本领域技术人员已知的常规技术产生，例如DNA重组技术或化学合成技术。

如本文中所使用的，表述“RV0183或PlcD的抗原性片段”是指，RV0183或PlcD蛋白经过截短后得到的氨基酸序列片段(即，多肽)，该片段具有与相应的全长蛋白相同的生物学活性，即，可刺激活动性结核患者的外周血产生IL-6，从而区分活动性结核和非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者)。例如本发明中SEQ IDNO:5-25所示的氨基酸序列片段即为RV0183的抗原性片段。在本发明中，该抗原性片段不受任何特定的合成多肽的方法限制，可通过本领域技术人员已知的常规技术产生，例如DNA重组技术或化学合成技术。

在本发明中，RV0183、PlcD或其抗原性片段(即，多肽)可以通过DNA重组技术获得，例如通过使用无细胞表达系统从编码这些蛋白或多肽的多核苷酸获得(无细胞表达系统包括例如基于网织红细胞裂解物的表达系统、基于麦胚提取物的表达系统以及基于大肠杆菌提取物的表达系统)；或通过使用体内表达系统(例如，大肠杆菌原核表达系统、酵母真核表达系统)从编码这些蛋白或多肽的多核苷酸获得。作为另外一种选择，RV0183、PlcD或其抗原性片段(即，多肽)可以通过化学合成产生。蛋白或多肽化学全合成的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Raibaut L,et al.,Top Curr Chem.2015；363:103-54；Thapa P,etal.Molecules.2014；19(9):14461-83；Dawson PE,et al.,Science,1994；266(5186):776-9；和Wang P,et al.,Tetrahedron Lett,1998,39(47):88711-14；其通过引用并入本文)，并且包括但不限于：固相肽合成技术(Solid Phase Peptide Synthesis，SPPS)或液相分段合成技术(例如，天然化学连接法(Native Chemical Ligation，NCL)、叠氮法(Azidemethod)、转移活化酯法(Transfer Active Ester Condensation，TAEC))。

如本文中所使用的，表述“分别具有如SEQ ID NO:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段”是指，具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的抗原性片段、具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的抗原性片段、和具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的抗原性片段的组合。其他类似的表述具有类似的含义。

如本文中所使用的，术语“能够检测IL-6的试剂”是指，能够和IL-6特异性结合的物质。这类物质是本领域所公知的，或者可以利用本领域公知的方法制备得到，例如为抗体、靶向多肽或核酸适体等。通常而言，特别优选的是，此类试剂能够通过免疫学检测来确定样品中IL-6的水平。免疫学检测的使用是特别有利的，因为其利用了抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力。因此，只要试剂保留了与IL-6特异性结合的反应性，那么该试剂即可以通过免疫学检测来确定样品中IL-6的水平(也即，该试剂即可用作能够检测IL-6的试剂)。保留与IL-6特异性结合的反应性的各种试剂是本领域技术人员容易想到并且可容易获得的，其包括但不限于，抗IL-6的抗体或其抗原结合片段，例如抗IL-6的多克隆抗体或单克隆抗体，例如IgG抗体或IgM抗体。作为另一种选择，所述能够检测IL-6的试剂也可以为结合IL-6的核酸适体，其包括但不限于描述于PCT国际申请WO2014159669中以及“GuptaS,et al.,J Biol Chem.2014；289(12):8706-19”中的核酸适体，其全部通过引用并入本文。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用K_D值描述。K_D值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。K_D值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。K_D值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“免疫学检测”是指，利用抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定，其一般可用于检测特定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学测定是本领域技术人员公知的，包括但不限于，ELISA检测，Elispot检测，Western印迹，表面等离子共振法等。关于免疫学测定的详细描述，可参见例如，Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.，第2版，Raven Press,N.Y.(1989)。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，抗体的“抗原结合片段”是指，全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，IL-6)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.，第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性结合抗原能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“核酸适体(Aptamer)”是指，能够高亲和性和高特异性地结合目的靶蛋白或其它生物靶分子的单链寡核苷酸，其可折叠形成例如茎环(Stem-Loop)、发夹(Hairpin)、假结(Pseudoknot)或G-四聚体(G-tetramer)的热力学稳定的三维空间结构，通过例如结构互补、碱基堆积力、范德华力、氢键或静电作用与目的靶蛋白或其它生物靶分子特异性结合。核酸适体可以为DNA或RNA，也可以包含核酸类似物(例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、二醇核酸(GNA)或苏糖核酸(TNA))。获得结合特定靶蛋白的核酸适体的方法是本领域公知的，例如SELEX(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment)筛选技术。

如本文中所使用的，术语“靶向多肽”是指，可以特异性结合目的靶蛋白的多肽分子。在本发明中，该靶向多肽可包含天然氨基酸、合成的氨基酸或采用与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物(mimetics)。天然存在的氨基酸为通过遗传密码来编码的那些以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羟基谷氨酸盐、O-磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸。在本发明中，可基于亲和力来确定靶向多肽与其目的靶蛋白之间的“特异性”，该亲和力可用靶向多肽与其所结合的目的靶蛋白的解离平衡常数(即，K_D值)进行描述。K_D值越低，靶向多肽与其所结合的目的靶蛋白之间的结合强度越强。在本领域中通常已知，大于约10^-3M的K_D值通常被认为表示非结合或非特异性结合。取决于具体的目的靶蛋白，可以通过本领域技术人员已知的方法获得特异性结合该靶蛋白的靶向多肽，例如通过噬菌体展示技术或蛋白质微阵列技术进行筛选。

如本文中所使用的，术语“可检测的标记”是指，可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。在本发明中，特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。

如本文中所使用的，术语“特异性刺激原”是指，能够仅刺激活动性结核患者的PBMC产生IL-6，而不能刺激非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者(IGRA检测阴性))的PBMC产生IL-6的物质；或者是指这样的物质，其刺激活动性结核患者的PBMC产生的IL-6分泌量显著高于非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者(IGRA检测阴性))。本发明的特异性刺激原包括RV0183、PlcD或其抗原性片段。在本发明的优选实施方案中，所述特异性刺激原不含有或几乎不含有内毒素。去除上述特异性刺激原中的内毒素的方法为本领域所公知，例如离子交换层析法、亲和层析法或萃取法。

如本文中所使用的，术语“非特异性刺激源”是指，能够激活多数或全部淋巴细胞，而不受TCR或BCR特异性限制的物质。淋巴细胞活化后，可大量分泌细胞因子(例如，IL-6)。可用作非特异性刺激源的物质是本领域熟知的，包括但不限于有丝分裂原，植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆丝裂原(PWM)、脂多糖(LPS)或葡萄球菌蛋白A(SPA)。在某些实施方案中，所述非特异性刺激原可包含在培养基(例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基和DMEM培养基)中。

如本文中所使用的，术语“统计分析值”是指，对通过各种检测方法得到的检测结果进行统计分析后得到的值。各种统计分析方法是本领域公知的(参见，例如PCT国际申请WO2009064901)，并且包括但不限于检测结果的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)。通常而言，特别优选的是，所述统计分析值为通过Logistic回归模型进行统计分析得到的值。Logistic回归模型具体描述于例如“胡春艳.四种肿瘤标志物在卵巢癌血清中的联合检测[D].广州：中山大学,2008：1-39”。

如本文中所使用的，术语“参考值”(也称为最佳诊断界值)是指能够反映非活动性结核人群的状况的值。在本发明中，参考值包括例如，根据特异性刺激原刺激前后非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者(IGRA检测阴性)样品中的IL-6水平的差值，所确定的一个正常数值或数值范围；以及，对从非活动性结核人群的样品获得的检测值(例如，前文所述的IL-6水平的差值)进行统计分析而得到的值(统计分析值)。确定最佳诊断界值的方法是本领域熟知的，包括但不限于受试者工作特征曲线分析(Receiver Operating Characteristic(ROC)curve analysis)，其详细描述于例如“Habibzadeh F,et al.,Biochem Med(Zagreb).2016；26(3):297-307”和“陈卫中等.ROC曲线中最佳工作点的选择[J].中国卫生统计,2006,23:157-158”。

如本文中所使用的，术语“外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC)”是指，外周血中具有单个细胞核的细胞的总称，包括但不限于淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞或树突状细胞。从外周血中获得PBMC的方法是本领域熟知的，包括但不限于Ficoll分层液法或Percoll分层液法。

如本文中所使用的，术语“外周血白膜层”是指，外周抗凝血经过自然沉降、离心或密度梯度离心后形成的一个组分，主要由白细胞(包括外周血单个核细胞)和血小板组成。抗凝血经过离心以后会形成上层的血浆、下层的红细胞以及二者之间薄薄的一层白色膜状物，约占血液总体积的1％，被称为白膜层。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“抗凝剂”是指，能够阻止血液凝固的试剂或物质，这类物质是本领域熟知的，包括但不限于肝素、EDTA、草酸盐(例如，草酸钠、草酸钾、草酸铵)、枸橼酸钠(柠檬酸钠)。

在本发明中，术语“稀释液”优选为能够维持细胞渗透压的电解质溶液，必要时该溶液也具备保持生理pH值的作用。这类溶液是本领域熟知的，包括但不限于阿氏液(Alsever's solution)、Earle's平衡盐溶液(EBSS)、Gey's平衡盐溶液(GBSS)、Hanks'平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)、Puck's平衡盐溶液、Ringer's平衡盐溶液(RBSS)、Simm's平衡盐溶液(SBSS)、TRIS缓冲液(TBS)、Tyrode's平衡盐溶液(TBSS)、生理盐水或林格氏液(Ringer's Solution)。

如本文中所使用的，术语“培养液”或“培养基”是指，能够维持细胞活性的养料。通常所述养料含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等。这类养料是本领域熟知的，包括但不限于RPMI-1640培养基或DMEM培养基。在本发明中，在来自所述受试者的样品中加入培养液或培养基的目的是为了在刺激原刺激的过程中维持样品中的细胞特别是PBMC的活性。维持血液成分中细胞的活性的方法为本领域所公知，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。在某些实施方案中，当样品为全血时，可以加入培养液，所述培养液例如为在磷酸盐缓冲液或生理盐水中添加适量的葡萄糖、氯化钠和氯化钾等；在某些实施方案中，所述培养液为在磷酸盐缓冲液中添加适量的葡萄糖和氯化钾。在某些实施方案中，当样品为外周血单个核细胞(PBMC)、外周血白膜层或其它含有PBMC的血液成分时，可以加入培养基，例如细胞培养基，例如适合维持血细胞特别是PBMC活性的细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基。

如本文中所使用的，术语“活动性结核”是指，结核病灶处于活动期，例如痰涂片阳性，或者同时伴有相关症状，如低热、咳嗽、消瘦、乏力、食欲差等。在本发明中，结核包括肺结核和肺外结核，所述肺外结核例如包括淋巴结核、结核性脑膜炎、结核性腹膜炎、肠结核、肾结核、附睾结核、女性生殖系统结核(包括输卵管、子宫内膜、卵巢结核)和骨关节结核等。

本申请的发明人筛选了大量结核分枝杆菌RD区抗原，出人意料地发现，RV0183、PlcD或其抗原性片段可刺激活动性结核患者的外周血产生大量IL-6，从而区分活动性结核和非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者)。而在本申请之前，本领域中常用的IGRAs和TST方法均不能区分潜伏性结核感染(LTBI)和活动性结核。基于这一发现，本发明人开发了新的诊断活动性结核的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种，和能够检测IL-6的试剂。

在某些优选的实施方案中，所述RV0183具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或，所述PlcD具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含RV0183和/或PlcD。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种RV0183的抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:5-25。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含分别具有如SEQ ID NO:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任选地，所述试剂盒还包括下列抗原性片段的组合：

1)分别具有如SEQ ID NO:5、11、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分别具有如SEQ ID NO:7-8、11-12所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分别具有如SEQ ID NO:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，或

4)分别具有如SEQ ID NO:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，所述能够检测IL-6的试剂为能够和IL-6特异性结合的物质，例如抗体、靶向多肽或核酸适体。

任选地，所述试剂还带有可检测的标记。

在某些优选的实施方案中，所述试剂通过免疫学检测来测定所述样品中IL-6的水平。进一步，在某些优选的实施方案中，所述免疫学检测选自ELISA检测、Elispot检测、Western印迹或表面等离子共振法。

在某些优选的实施方案中，所述试剂包括抗IL-6的抗体或其抗原结合片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述试剂通过ELISA来测定IL-6的水平。

在某些优选的实施方案中，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，在某些优选的实施方案中，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种选自1)-5)的装置或试剂：

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒用于诊断活动性结核、判断一种疗法对活动性结核的治疗效果或筛选能够治疗活动性结核的候选药物。

在另一个方面，本发明提供了特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断活动性结核；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种。

在某些优选的实施方案中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其组合。

在某些优选的实施方案中，所述特异性刺激原选自一种或多种RV0183的抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQID NO:5-25。

在某些优选的实施方案中，所述特异性刺激原包含分别具有如SEQ ID NO:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任选地，所述特异性刺激原还包括下列抗原性片段的组合：

在某些优选的实施方案中，所述特异性刺激原包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒包括能够检测IL-6的试剂，例如能够和IL-6特异性结合的抗体、靶向多肽或核酸适体。

任选地，所述试剂还带有可检测的标记。

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来诊断所述受试者是否患有活动性结核：

(1)使用特异性刺激原刺激来自所述受试者的至少一份样品作为待测样品，同时将来自所述受试者的未经刺激的样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种；

(2)使用能够检测IL-6的试剂测定步骤(1)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值；和

(3)将所述差值与参考值进行比较，或对所述差值进行统计学分析以获得统计分析值，并将该统计分析值与参考值进行比较，并判断所述受试者是否患有活动性结核；

其中，所述样品包含外周血单个核细胞(PBMC)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血单个核细胞(PBMC)、或外周血白膜层，并且可任选地包含其他组分，例如抗凝剂、稀释液等。

在某些优选的实施方案中，当该差值或由该差值得到的统计分析值大于参考值时，表明提供该样品的受试者患有活动性结核；当该差值或由该差值得到的统计分析值不大于参考值时，表明提供该样品的受试者未患有活动性结核。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，利用选自下列的统计模型对所述差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，使用Logistic回归模型对所述差值进行统计分析。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，使用RV0183和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品。或，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，将所述特异性刺激原置于培养基，例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基，然后用于刺激来自所述受试者的样品，以产生待测样品。

在某些优选的实施方案中，步骤(1)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品。进一步，在某些优选的实施方案中，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，用不含有所述特异性刺激原和非特异性刺激原的培养基(例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基)温育或稀释来自所述受试者的样品，以产生阴性对照样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用采血装置从所述受试者获得样品；(b)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(c)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(d)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，在细胞(例如，PBMC)活性较高的温度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，用刺激原刺激来自所述受试者的样品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一个方面，本发明提供了特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种。

任选地，所述特异性刺激原还包括下列抗原性片段的组合：

任选地，所述试剂还带有可检测的标记。

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水；

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来判断一种疗法对活动性结核的治疗效果：

(1)在对受试者进行所述疗法之前，获得来自所述受试者的至少两份样品，作为治疗前样品；

(2)使用特异性刺激原刺激来自所述受试者的至少一份治疗前样品作为待测样品，同时将来自所述受试者的未经刺激的至少一份治疗前样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种；

(3)使用能够检测IL-6的试剂测定步骤(2)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值，作为第一差值；

(4)对所述受试者进行所述疗法；

(5)在对所述受试者进行所述疗法之后，获得来自所述受试者的至少两份样品，作为治疗后样品；

(6)使用特异性刺激原刺激来自所述受试者的至少一份治疗后样品作为待测样品，同时将来自所述受试者的未经刺激的至少一份治疗后样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种；

(7)使用能够检测IL-6的试剂测定步骤(6)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值，作为第二差值；和

(8)将所述第二差值与第一差值进行比较，或对所述第一差值和第二差值分别进行统计学分析以获得第一差值的统计分析值和第二差值的统计分析值，并将所述第二差值的统计分析值与所述第一差值的统计分析值进行比较，并判断所述疗法对活动性结核的治疗是否有效；

在某些优选的实施方案中，当所述第二差值大于所述第一差值时，或当所述第二差值的统计分析值大于所述第一差值的统计分析值时，表明所述疗法对活动性结核的治疗无效；当所述第二差值小于所述第一差值时，或当所述第二差值的统计分析值小于所述第一差值的统计分析值时，表明所述疗法对活动性结核的治疗有效。

在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，利用选自下列的统计模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使用Logistic回归模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理(例如，在相同的条件下，使用相同的特异性刺激原进行处理)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品。或，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，所述疗法包括对受试者施用抗结核药物，例如异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或其任何组合。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，将所述特异性刺激原置于培养基，例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基，然后用于刺激来自所述受试者的样品，以产生待测样品。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)和(6)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品。进一步，在某些优选的实施方案中，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，用不含有所述特异性刺激原和非特异性刺激原的培养基(例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基)温育或稀释来自所述受试者的样品，以产生阴性对照样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，使用采血装置获得来自所述受试者的治疗前样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(5)中，使用采血装置获得来自所述受试者的治疗后样品。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(5)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，在细胞(例如，PBMC)活性较高的温度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，用刺激原刺激来自所述受试者的样品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一个方面，本发明提供了特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种。

任选地，所述特异性刺激原还包括下列抗原性片段的组合:

任选地，所述试剂还带有可检测的标记。

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来筛选能够治疗活动性结核的候选药物：

(1)在给模型动物施用候选药物之前，获得来自所述动物的至少两份样品，作为治疗前样品；

(2)使用特异性刺激原刺激来自所述动物的至少一份治疗前样品作为待测样品，同时将来自所述动物的未经刺激的至少一份治疗前样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种；

(3)使用检测IL-6的试剂测定步骤(2)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值，作为第一差值；

(4)给所述动物施用候选药物；

(5)在给所述动物施用所述候选药物之后，获得来自所述动物的至少两份样品，作为治疗后样品；

(6)使用特异性刺激原刺激来自所述动物的至少一份治疗后样品作为待测样品，同时将来自所述动物的未经刺激的至少一份治疗后样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种；

在某些优选的实施方案中，当所述第二差值大于所述第一差值时，或当所述第二差值的统计分析值大于所述第一差值的统计分析值时，表明被筛选的药物对治疗活动性结核无效；当所述第二差值小于所述第一差值时，或当所述第二差值的统计分析值小于所述第一差值的统计分析值时，表明被筛选的药物对活动性结核的治疗有效。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理(例如，在相同的条件下，使用相同的特异性刺激原进行处理)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原分别或共同刺激一份或多份来自所述动物的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品。或，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品。

在某些优选的实施方案中，所述模型动物是非人哺乳动物，例如小鼠、豚鼠、兔或非人灵长类动物(例如食蟹猴或猕猴)。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，将所述特异性刺激原置于培养基，例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基，然后用于刺激来自所述动物的样品，以产生待测样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，用不含有所述特异性刺激原和非特异性刺激原的培养基(例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基)温育或稀释来自所述动物的样品，以产生阴性对照样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)中，使用采血装置获得来自所述动物的治疗前样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(5)中，使用采血装置获得来自所述动物的治疗后样品。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述动物的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述动物的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述动物的样品。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(5)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述动物的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述动物的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述动物的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，在细胞(例如，PBMC)活性较高的温度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激来自所述动物的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，用刺激原刺激来自所述动物的样品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一个方面，本发明提供了一种用于诊断受试者是否患有活动性结核的方法，其包括下述步骤：

(1)提供来自所述受试者的至少两份样品；

(2)使用特异性刺激原刺激至少一份样品作为待测样品，并将未经刺激的样品作为阴性对照样品，其中所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种；

(3)测定步骤(2)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值；和

(4)将所述差值与参考值进行比较，或对所述差值进行统计学分析以获得统计分析值，并将该统计分析值与参考值进行比较，并判断所述受试者是否患有活动性结核；

在某些优选的实施方案中，在步骤(4)中，利用选自下列的统计模型对所述差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(4)中，使用Logistic回归模型对所述差值进行统计分析。

在某些优选的实施方案中，所述抗原性片段为RV0183的抗原性片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:5-25。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品。或，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，使用一种或多种抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，使用下列抗原性片段的组合共同刺激至少一份样品作为待测样品：

1)分别具有如SEQ ID NO:13、14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分别具有如SEQ ID NO:5、11、13-14、19、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分别具有如SEQ ID NO:7-8、11-14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

4)分别具有如SEQ ID NO:5-7、11-14、19、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，

5)分别具有如SEQ ID NO:5、8-10、12-15、19、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；或

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，将所述特异性刺激原置于培养基，例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基，然后用于刺激来自所述受试者的样品，以产生待测样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，用不含有所述特异性刺激原和非特异性刺激原的培养基(例如细胞培养基，例如RPMI-1640培养基或DMEM培养基)温育或稀释来自所述受试者的样品，以产生阴性对照样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，通过免疫学检测来测定所述样品中IL-6的水平。进一步，在某些优选的实施方案中，所述免疫学检测选自ELISA检测、Elispot检测、Western印迹或表面等离子共振法。

在某些优选的实施方案中，在步骤(3)中，使用抗IL-6的抗体或其抗原结合片段来检测IL-6的水平，例如通过ELISA来进行测定。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品。进一步，在某些优选的实施方案中，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)从所述受试者获得样品；(b)向样品中加入抗凝剂，例如肝素；(c)从样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(d)向样品中加入培养液或培养基；(e)稀释样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，在细胞(例如，PBMC)活性较高的温度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激来自所述受试者的样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，用刺激原刺激来自所述受试者的样品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一个方面，本发明提供了一种用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果的方法，其包括下述步骤：

(3)测定步骤(2)中各个样品的IL-6水平，并计算所述待测样品与阴性对照样品的IL-6水平的差值，作为第一差值；

(4)对所述受试者进行所述疗法；

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理(例如，在相同的条件下，使用相同的特异性刺激原进行处理)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品。或，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品。进一步，在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用下列抗原性片段的组合共同刺激至少一份样品作为待测样品：

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)和(6)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品。进一步，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)向治疗前样品中加入抗凝剂，例如肝素；(b)从治疗前样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(c)向治疗前样品中加入培养液或培养基；和，(d)稀释治疗前样品。

在某些优选的实施方案中，在步骤(5)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)向治疗后样品中加入抗凝剂，例如肝素；(b)从治疗后样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(c)向治疗后样品中加入培养液或培养基；和，(d)稀释治疗后样品。

在另一个方面，本发明提供了一种用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物的方法，其包括下述步骤：

(4)给所述动物施用候选药物；

在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理(例如，在相同的条件下，使用相同的特异性刺激原进行处理)。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述动物的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段。

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在另一个方面，本发明提供了一种多肽库，其包括：

第一肽，其具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

第二肽，其具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；和

第三肽，其具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

任选地，所述多肽库还包括下列多肽的组合：

1)分别具有如SEQ ID NO:5、11、22所示的氨基酸序列的多肽，

2)分别具有如SEQ ID NO:7-8、11-12所示的氨基酸序列的多肽，

3)分别具有如SEQ ID NO:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的多肽，或

4)分别具有如SEQ ID NO:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的多肽。

在某些优选的实施方案中，所述多肽库包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些优选的实施方案中，所述多肽库能够诱导样品产生IL-6；其中，所述样品包含外周血单个核细胞(PBMC)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血单个核细胞(PBMC)、或外周血白膜层，并且可任选地包含其他组分，例如抗凝剂、稀释液等。

在某些优选的实施方案中，所述多肽库用于诊断活动性结核、判断一种疗法对活动性结核的治疗效果或筛选能够治疗活动性结核的候选药物。

发明的有益效果

本发明通过大量实验和反复摸索发现了特异性刺激原(RV0183、PlcD或其抗原性片段)可刺激活动性结核患者的外周血产生大量IL-6，从而区分活动性结核和非活动性结核人群(例如，潜伏性结核感染者、陈旧性结核患者或非结核感染者)，由此建立了一种简单、方便、快速且具有高准确性和特异性的活动性结核诊断方法。

在某些优选的实施方案中，通过采集全血，并添加特异性刺激原，然后在适当条件下培养，即可完成对来自所述受试者样品的刺激；对实验条件、人员的技术能力、设备和环境的要求不高；与传统的结核诊断手段(如菌培、痰涂、X光检测等)相比，对活动性结核病人的检出具有较高的灵敏度和特异性，而且大大缩短了诊断所需的时间；成本不高，使用范围较广。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了SDS-PAGE分析的结果，其显示大肠杆菌(E.coil)ER2566中高效表达后经Ni-NTA和DEAE柱两步纯化的重组抗原RV0183。其中，泳道1代表蛋白质分子量标准，泳道2代表经两步纯化后的蛋白RV0183。

图2显示了SDS-PAGE分析的结果，其显示大肠杆菌(E.coil)ER2566中高效表达后经Ni-NTA纯化和包涵体复性后的重组抗原Plcd。其中，泳道M代表蛋白质分子量标准，泳道1代表变性后包涵体，泳道2代表经亲和柱层析后的蛋白Plcd，泳道4代表透析复性后的蛋白Plcd。

图3显示了使用重组抗原RV0183刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。1μg重组抗原RV0183刺激500μl全血20±2h后，血浆标本2倍稀释。结果显示活动性结核病人IL-6分泌水平显著高于潜伏感染人群。(注：***表示p<0.001)

图4显示了使用重组抗原RV0183刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。2μg重组抗原RV0183刺激1ml全血20±2h后，血浆标本5倍稀释。结果显示，活动性结核病人(aTB)的IL-6分泌水平显著高于结核分枝杆菌潜伏感染人群(LTBI(IGRA+体检))和非感染人群(IGRA-体检)。(注：***表示p<0.001)

图5显示了使用重组抗原RV0183刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。2μg重组抗原RV0183刺激1ml全血20±2h后，血浆标本5倍稀释。结果显示，临床活动性结核病人IL-6分泌水平显著高于非结核分枝杆菌感染者。(注：***表示p<0.001)

图6显示了使用RV0183的抗原性片段刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。结果显示，RV0183的21条抗原性片段，均能在体外刺激活动性结核病人全血中IL-6分泌水平的升高，而在健康对照中，基本无IL-6应答，绿色到红色表示反应强度增加。

图7A-7B分别显示了使用重组抗原RV0183和重组抗原PlcD分别刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。2μg重组抗原RV0183和2μg重组抗原Plcd分别刺激1ml全血20±2h后，血浆标本5倍稀释。结果显示，重组抗原RV0183和重组抗原PlcD分别刺激后活动性结核病人IL-6分泌水平均显著高于潜伏感染人群和非感染人群，其中aTB代表活动性结核，HC代表健康对照。

图8显示了重组抗原RV0183和重组抗原Plcd联合检测的ROC分析结果。结果显示，重组抗原RV0183和重组抗原Plcd的联合检测能够提高检测活动性结核患者的灵敏度和特异性。

图9显示了使用RV0183多肽库刺激受试者全血的IL-6水平分析结果。21条RV0183的抗原性片段组成的多肽库共同体外刺激临床结核病人、陈旧性结核个体、非结核肺病病例的全血标本。结果显示，在活动性结核病人中，IL-6分泌水平显著高于非活动性结核标本。(注：**表示p<0.01，***表示p<0.001)

序列信息

本发明涉及的序列信息提供于下面的表1中。

表1：序列信息

重组蛋白RV0183的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)

MTTTRTERNFAGIGDVRIVYDVWTPDTAPQAVVVLAHGLGEHARRYDHVAQRLGAAGLVTYALDHRGHGRSGGKRVLVRDISEYTADFDTLVGIATREYPGCKRIVLGHSMGGGIVFAYGVERPDNYDLMVLSAPAVAAQDLVSPVVAVAAKLLGVVVPGLPVQELDFTAISRDPEVVQAYNTDPLVHHGRVPAGIGRALLQVGETMPRRAPALTAPLLVLHGTDDRLIPIEGSRRLVECVGSADVQLKEYPGLYHEVFNEPERNQVLDDVVAWLTERL

重组蛋白RV0183的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)

GGATCCATGACTACCACCCGGACTGAACGGAATTTCGCGGGCATCGGCGATGTGCGCATCGTCTACGACGTCTGGACGCCGGACACCGCGCCGCAAGCGGTGGTCGTGCTGGCCCATGGTCTGGGCGAGCATGCCCGCCGCTACGACCATGTCGCGCAGCGGCTCGGCGCGGCCGGCCTGGTCACCTATGCGCTTGACCACCGCGGGCATGGCCGCTCGGGTGGCAAACGGGTGCTAGTGAGAGACATCTCCGAGTACACCGCTGACTTCGACACCCTCGTTGGGATCGCCACCCGGGAATATCCCGGGTGCAAGCGCATCGTGCTCGGGCACAGCATGGGCGGCGGCATTGTGTTCGCTTACGGTGTCGAACGTCCAGACAACTACGACCTGATGGTGCTTTCGGCGCCGGCGGTGGCGGCACAGGACCTGGTGAGCCCGGTAGTGGCGGTTGCCGCCAAGCTTCTGGGCGTCGTGGTGCCCGGCCTGCCGGTGCAGGAACTGGATTTTACTGCCATCTCTCGCGACCCTGAGGTGGTCCAGGCTTACAACACCGACCCACTCGTGCACCACGGACGGGTTCCGGCCGGGATTGGCCGCGCGCTGCTGCAGGTGGGCGAGACCATGCCGCGGCGAGCACCGGCATTGACCGCGCCGCTGCTAGTGCTGCACGGCACCGATGACCGGCTGATCCCCATCGAGGGCAGCCGTCGCCTGGTCGAATGTGTGGGATCGGCCGACGTGCAGCTGAAGGAGTATCCCGGGCTGTACCACGAGGTGTTCAACGAGCCGGAGCGCAACCAGGTGCTCGACGATGTGGTCGCCTGGCTCACCGAGCGGTTGTAAGAATTC

重组蛋白Plcd的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)

DAGVSWKVYRNKTLGPISSVLTYGSLVTSFKQSADPRSDLVRFGVAPSYPASFAADVLANRLPRVSWVIPNVLESEHPAVPAAAGAFAIVNILRILLANPAVWEKTALIVSYDENGGFFDHVVPATAPAGTPGEYVTVPDIDQVPGSGGIRGPIGLGFRVPCFVISPYSRGPQMVHDTFDHTSQLRLLETRFGVPVPNLTAWRRSVTGDMTSTFNFAVPPNSSWPNLDYPGLHALSTVPQCVPNAALGTINRGIPYRVPDPQIMPTQETTPTRGIPSGPC

重组蛋白Plcd的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)

GATGCCGGCGTCAGCTGGAAGGTGTATCGCAACAAGACACTCGGGCCCATCTCCTCGGTTCTTACTTACGGCTCGCTTGTGACGTCTTTCAAACAGTCAGCCGATCCCAGGTCAGATCTTGTCCGCTTTGGCGTGGCACCAAGCTATCCCGCGAGCTTCGCGGCCGACGTCTTAGCCAATAGACTGCCGCGGGTCTCCTGGGTGATTCCCAATGTTCTCGAATCCGAACATCCTGCGGTTCCAGCCGCGGCCGGGGCTTTCGCAATCGTCAACATCTTAAGAATATTGCTTGCCAATCCTGCGGTGTGGGAAAAGACGGCGCTGATCGTCAGCTACGACGAAAACGGCGGCTTTTTCGACCACGTTGTTCCTGCTACCGCGCCGGCCGGGACTCCCGGCGAATATGTCACGGTGCCTGACATCGATCAGGTGCCGGGCTCCGGCGGAATACGCGGGCCGATCGGTTTGGGCTTTCGCGTTCCCTGCTTCGTCATTTCGCCGTACAGCCGTGGCCCGCAGATGGTTCACGACACGTTTGACCACACCTCACAGCTGAGATTGCTCGAAACTCGGTTCGGGGTGCCAGTTCCCAACCTCACGGCTTGGCGGCGCAGTGTGACCGGCGACATGACGTCAACGTTCAACTTCGCTGTCCCGCCCAACTCATCATGGCCCAACCTGGATTATCCCGGGCTGCACGCGCTATCAACGGTGCCGCAGTGCGTGCCCAACGCGGCGCTGGGCACGATAAACCGTGGAATCCCGTATCGGGTTCCTGATCCACAGATCATGCCCACGCAGGAAACCACGCCTACCCGTGGTATTCCGAGCGGTCCGTGCTAA

RV0183多肽库肽段序列(P1-P21)(SEQ ID NO：5～25)

RV0183-p1:MTTTRTERNFAGIGDVRIVY(SEQ ID NO：5)

RV0183-p2:GDVRIVYDVWTPDTAPQAVV(SEQ ID NO：6)

RV0183-p3:TAPQAVVVLAHGLGEHARRY(SEQ ID NO：7)

RV0183-p4:GEHARRYDHVAQRLGAAGLV(SEQ ID NO：8)

RV0183-p5:LGAAGLVTYALDHRGHGRSG(SEQ ID NO：9)

RV0183-p6:RGHGRSGGKRVLVRDISEYT(SEQ ID NO：10)

RV0183-p7:RDISEYTADFDTLVGIATRE(SEQ ID NO：11)

RV0183-p8:VGIATREYPGCKRIVLGHSM(SEQ ID NO：12)

RV0183-p9:IVLGHSMGGGIVFAYGVERP(SEQ ID NO：13)

RV0183-p10:AYGVERPDNYDLMVLSAPAV(SEQ ID NO：14)

RV0183-p11:VLSAPAVAAQDLVSPVVAVA(SEQ ID NO：15)

RV0183-p12:SPVVAVAAKLLGVVVPGLPV(SEQ ID NO：16)

RV0183-p13:VVPGLPVQELDFTAISRDPE(SEQ ID NO：17)

RV0183-p14:AISRDPEVVQAYNTDPLVHH(SEQ ID NO：18)

RV0183-p15:TDPLVHHGRVPAGIGRALLQ(SEQ ID NO：19)

RV0183-p16:IGRALLQVGETMPRRAPALT(SEQ ID NO：20)

RV0183-p17:RRAPALTAPLLVLHGTDDRL(SEQ ID NO：21)

RV0183-p18:HGTDDRLIPIEGSRRLVECV(SEQ ID NO：22)

RV0183-p19:RRLVECVGSADVQLKEYPGL(SEQ ID NO：23)

RV0183-p20:LKEYPGLYHEVFNEPERNQV(SEQ ID NO：24)

RV0183-p21:EPERNQVLDDVVAWLTERL(SEQ ID NO：25)

引物(5’-3’)(SEQ ID NO：26～29)

plcD-1-F:TTCAACCATCGCCGCCTCTACCA(SEQ ID NO：26)

plcD-1-R:CCATCGCCGCCTCTACCAGT(SEQ ID NO：27)

plcD-2-F:GGATCCATGGATGCCGGCGTCAG(SEQ ID NO：28)

plcD-2-R:AAGCTTTTAGCACGGACCGCTCG(SEQ ID NO：29)

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学实验方法和免疫检测法)。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),其全部通过引用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如在本领域内通常使用的或如本文描述的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.重组蛋白RV0183的克隆、表达和去内毒素纯化

1.包含重组蛋白RV0183的编码序列的表达载体的构建

1.1.1目的基因片段的获得

目的基因片段为人工合成，为了能够方便的引入表达载体，目的基因片段合成时5’端添加BamHI酶切位点，3’端添加EcoRI酶切位点，载体为pMD18T，得到两端含有酶切位点的RV0183质粒。

酶切：使用BamHI/EcoRI双酶切人工构建的RV0183质粒。琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。

1.1.2目的基因片段的融合和表达载体的构建

使用BamHI/EcoRI双酶切的pTO-T7载体(载体信息参见罗文新，张军，杨海杰等，一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用，生物工程学报，2000，16(5)：578-581)和编码RV0183的酶切产物连接，获得含有RV0183基因片段的表达载体pTO-T7-RV0183。

2.重组蛋白RV0183的表达与去内毒素纯化

将构建好的pTO-T7-RV0183表达载体转化入大肠杆菌ER2566(实验室保存)，将其涂布于含卡那霉素(Kan，终浓度100μg/ml)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)上，并在37℃下静置培养至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至液体LB培养基(含100μg/ml卡那霉素)中，在37℃，180rpm下震荡培养8小时。然后将菌液转接至500ml液体LB培养基(含100ug/ml卡那霉素)的培养瓶中，在37℃，180rpm下震荡培养。当培养瓶中液体的OD600达0.6-0.8时，加入IPTG至0.2mM/L的终浓度并在37℃，180rpm下继续诱导培养4小时。然后5000rpm离心培养物10min，收集菌体。

由于重组蛋白RV0183用于刺激全血，因此需要去除蛋白产物中的内毒素。从菌体蛋白中纯化重组蛋白病去除内毒素的方法是本领域技术人员已知的。在本实施例中，使用下列示例性方法。

将收集的菌体用50mM TB8.0的缓冲液悬浮，置于冰浴中并通过超声波进行破碎，然后以12000rpm离心10min，收集包涵体。

Ni-NTA柱纯化：目的蛋白上清表达，利用自组装的Ni-NTA柱(介质厂家：Qiagen)进行纯化。简言之，将样品加载至Ni-NTA柱，用0.2％脱氧胆酸钠，50mMTB8.0洗涤，以去除部分内毒素，然后用200ml 50mMTB8.0洗涤，以去除脱氧胆酸钠；最后用洗脱液100ml(150mM咪唑，50mMTB8.0)洗脱目的蛋白。

DEAE柱纯化：上述洗脱蛋白，继续使用DEAE柱纯化。上柱缓冲液为50mMTB8.0，洗脱液为400mMNaCl，50mMTB8.0。洗脱蛋白透析至50mMTB8.0保存。

在上述蛋白纯化过程中，所使用的缓冲液均由注射用水配制，所用实验容器均经200℃高温干烤2小时以上。

利用SDS-PAGE检测经两步纯化的重组蛋白RV0183，结果示于图1中。结果显示，重组蛋白RV0183分子量约为30KD，并且经过上述两步纯化后，重组蛋白RV0183的纯度达到95％以上。

使用鲎试剂检测经纯化的重组蛋白RV0183中的内毒素。结果显示，经上述两步纯化，重组蛋白RV0183的内毒素含量低于100EU/mg。

实施例2.重组蛋白Plcd的克隆、表达和去内毒素纯化

2.1包含重组蛋白PlcD的编码序列的表达载体的构建

PCR扩增获得目的基因片段

由于结核分枝杆菌基因组片段长，GC碱基含量高，直接扩增目的片段比较困难，因此采用巢式PCR方法，通过两轮PCR，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增获得目的片段。

2.1.1PCR引物的设计

根据NCBI中记录的结核分枝杆菌H37Rv菌种的PlcD蛋白对应的基因序列，使用软件对引物进行评估和筛选，并添加相应的酶切位点。引物设计结果如下：

表2:引物序列(SEQ ID NO:26-29)

2.1.2第一轮PCR扩增反应

按下表在0.5ml Ependorf管中混匀各个成分，建立20μl体积PCR反应体系。

plcD蛋白编码基因第一轮PCR反应体系

扩增程序：95℃预变性10min，热启动后转入95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min,进行30个循环，72℃延伸10分钟。

2.1.3第二轮PCR扩增反应

将第一轮PCR产物作为模板，按下表在0.5ml Ependorf管中混匀各成分，组成50μlPCR反应体系。

plcD蛋白编码基因第二轮PCR反应体系

扩增程序：95℃预变性10min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，进行30个循环后，72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。

2.1.4克隆载体的构建

在0.5mL Ependorf管中加入如下成分混合，16℃条件下反应12小时，获得连接有目的基因片段的pMD18-T克隆载体。

2.1.5克隆载体连接产物转化

取40μL感受态DH5α细胞和10μL克隆载体连接产物混合，冰浴吸附15min。42℃热休克90s，迅速冰浴终止反应。加入200μL无抗生素的LB培养基，37℃振荡培养45min。取200μL培养液涂含有氨苄青霉素的固体培养基，37℃培养12h。

2.1.6克隆载体质粒回收

挑取单克隆菌落接种于5mL加有氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃振荡培养过夜。取1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf管中，12000g离心1min，弃上清。加入250μL溶液I，振荡使沉淀完全悬浮。加入250μL溶液II，轻轻翻转几下，使菌体裂解。加入350μL溶液Ⅲ，充分混匀，置冰浴15min。12000rpm离心10min。吸上清转移到平衡好的质粒回收吸附柱上，室温静置5min，后续回收操作同胶回收步骤。

回收产物进行1％琼脂糖电泳鉴定，确认回收成功。对得到含目的基因片段的pMD18-T载体进行酶切，回收克隆后的目的片段，并取部分克隆载体送测序。

2.1.7PlcD表达克隆构建

pMD-18T酶切的目的基因片段与酶切处理的PTO-T7载体连接，连接体系为PTO-T7载体1μl，目的基因片段6μl，10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，反应总体积10μl。连接时间为2h。

2.2表达克隆质粒的转化与蛋白表达纯化

2.2.1表达载体连接物转化

步骤同上述连接步骤，使用ER2566感受态细胞作为转化对象，转化后将ER2566涂布在含卡那霉素的LB抗性培养基上。

2.2.2Plcd蛋白表达及纯化

目的蛋白的提取

活化在小量表达鉴定有正确目标蛋白表达的菌株。37℃条件培养4h后加入1mmol/L IPTG，保持37℃诱导4h,以9000g离心6min收集菌体。菌体吹洗后重新离心收集沉淀，按每200mL菌液加入5mL的比例加入TB 8.0缓冲液重悬。重悬菌液进行超声破碎处理，处理时间按每500mL菌液3min计算。超声后样品以12000g离心10min收集破碎后的沉淀。破碎产物沉淀用TB 8.0溶液反复吹洗3次，每次重悬后在37℃温箱中震荡15min。沉淀用15mL含6M尿素的TB 8.0溶液重悬后充分吹打，将大部分沉淀吹起后12000g离心10min收集上清进入下一步纯化阶段。

镍离子柱亲和层析

Ni-NTA柱纯化：目的蛋白上清表达，利用自组装的Ni-NTA柱(介质厂家：Qiagen)进行纯化。将样品加载至Ni-NTA柱，用0.2％脱氧胆酸钠，50mMTB8.0+6M尿素洗涤，以去除部分内毒素，然后用200ml 50mMTB8.0+6M尿素洗涤，以去除脱氧胆酸钠；最后用洗脱液100ml(150mM咪唑，50mMTB8.0,6M尿素)洗脱目的蛋白。

蛋白质的复性

由于plcD蛋白属于包涵体表达，本实验使用6M尿素使包涵体变性溶解，亲和层析纯化后采用梯度透析的方法逐步去除变性剂，透析过程中加入二硫苏糖醇(DTT)防止形成错误二硫键，帮助蛋白形成正确折叠，保持可溶状态。透析步骤见下表，结果示于图2。

plcD蛋白质透析复性操作步骤

内毒素的去除和检测

根据Shigui Liu等人的方法(Liu SG,Tobias R.Removal of endotoxin fromrecombinant protein preparations[J].Clinical Biochem,1997,30:455-463)，本实验采用非离子型去垢剂Triton X-114萃取对重组蛋白进行内毒素去除。

向蛋白溶液中加入终浓度为1％(w/v)的Triton X-114，在4℃条件下混匀两相，震荡15min。将含Triton X-114的蛋白溶液置于37℃水浴10min，可见体系浑浊，溶液中有油滴出现。25℃12000g离心10min，小心移出水相。反复以上步骤一次，收集水相。处理过后的蛋白溶液采用鲎试剂凝胶法检测内毒素含量。

实施例3.RV0183特异性T细胞反应标志物的筛选

3.1刺激样品的收集和处理

3.1.1体外刺激样品收集

用肝素抗凝管采集4例IGRAs检测阳性的住院活动性结核病人外周血5ml，采集4例IGRAs检测阳性的无临床症状潜伏感染者外周血5ml。

3.1.2样品刺激处理和收集

样品分装至9个无内毒素2ml EP管中，每个EP管中500μl外周血；EP管已分别添加15μl培养液(培养液配方：30μl PBS中添加133.33mg/ml的D-葡萄糖和166.67mM的KCl；其中PBS配方为：Na₂HPO4·12H₂O 2.9g，KH₂PO4 0.24g，NaCl 8g，KCl 0.2g，补超纯水至1L。)，编号分别为N、Ta、P。其中N管不含刺激抗原，Ta中含1μg刺激抗原RV0183，P管中含PHA 20ug。

外周血加入EP管后，颠倒混匀，至于37℃恒温箱培养20-24h；5000rpm收集血浆样品，检测血浆中细胞因子含量。

3.2血浆中细胞因子含量检测

收集的血浆样品使用商品化的Milliplex试剂盒(Merck Millipore,St.Charles,Missouri,USA)(货号：HCYTMAG-60K-PX38,HCP2MAG-62K-PX23,HCP3MAG-63K-PX11)进行细胞因子定量检测，检测指标包括EGF等69种(见表2)，检测平台为Luminex 200(以下步骤中的洗液、标准品、质控品、磁珠均来自试剂盒中)。

检测步骤包括：1)在96孔检测板上每孔加200μl洗液，室温震荡10min，移除洗液；2)在相应的孔中添加25μl标准品和质控品，双孔重复；3)添加25μl assay buffer到样品孔；4)在标准品孔、质控品孔和空白对照孔中，每孔加25μl血浆基质(基质指试剂盒中一种样品稀释液)；5)每孔加25μl血浆样品；6)每孔加25μl磁珠2-8℃过夜；7)移除孔内液体，200μl/孔洗液，洗两遍；8)每孔加检测抗体25μl，室温孵育1h；9)每孔加25μl Steptavidin-Phycoerythrin，室温反应30min；10)移除孔内液体，洗板两次；11)每孔加150μl鞘液，震荡混匀；11)在Luminex 200平台上读板；12)将每个样品Ta管的实际检测值减去N管的实际检测值而得到的差值作为最终结果(即，细胞因子实际增加值，以Ta-N表示)。(方法为双抗体夹心法)

检测结果见表3。分析细胞因子在活动性结核病人和潜伏感染人群中应答情况的不同，筛选出IL-6能够有效区分结核感染者是处于活动性结核(aTB)状态还是潜伏感染(LTBI)状态(有临床症状的住院结核病人为活动性结核病人，IGRA检测阳性无临床症状的标本为潜伏感染者)。

表3

实施例4.在结核感染人群中利用RV0183筛选活动性结核病人

4.1队列标本信息

4.1.1活动性结核病人：均为临床确诊活动性结核病人，79例；2)结核分枝杆菌潜伏感染人群和健康人群：共37例医护工作者参与到对列中来，其中14例医护结核IGRAs实验结果阳性但是无临床结核症状且无结核病史，判定为潜伏感染者；另外23例IGRAs检测结果阴性的医护工作者判定为无结核分枝杆菌感染的健康者。

4.2样本刺激培养体系

4.2.1全血样本分装到三个2ml EP管中，每管分装500μl，3个EP管分别标记为N、Ta、P；N管中为15μl培养液(配方同实施例4)，不含抗原，Ta管中的15μl培养液含1μg上述重组抗原RV0183，P管中的15μl培养液含20μg PHA。

4.2.2全血分装后轻轻颠倒混匀，至于37℃恒温箱中温育20±2h。

4.2.3培养完成后，5000rpm离心10min收集血浆，检测IL-6水平。

4.3血浆IL-6水平检测

IL-6ELISA检测试剂盒(厦门万泰沧海生物)用来检测血浆中IL-6水平。

1)血浆标本处理，用20％新生牛血清(NBS)2倍稀释；2)加样温育：96孔IL-6检测板上，每孔加处理后的血浆100μl，37℃反应40min，洗板五次，甩干检测板；3)加酶温育：每孔加酶标二抗100μl，37℃恒温箱反应40min，洗板5次，甩干检测板；4)显色：加显色液反应10min，50μl终止液终止反应；5)测定：酶标仪波长与450nm处检测吸光值；6)将每个样品Ta管的实际检测值减去N管的实际检测值而得到的差值作为最终结果(即，细胞因子实际增加值，以Ta-N表示)。

检测结果见图3，1μg重组抗原刺激500μl外周血细胞，在结核分枝杆菌潜伏人群和活动性结核病人中IL-6的分泌水平有显著的差别。

实施例5.利用RV0183在普通人群中筛选活动性结核病人

5.1队列标本信息

5.1.1活动性结核病人：临床确诊活动性结核病人207例；

5.1.2门诊体检者及医护人员：综合科门诊体检者标本65例，其中结核IGRAs阳性标本且无临床症状者为结核分枝杆菌潜伏感染者；其中结核IGRAs阴性标本为非结核分枝杆菌感染者。医护人员82例，其中结核IGRAs阳性标本且无临床症状者为结核分枝杆菌潜伏感染者；其中结核IGRAs阴性标本为非结核分枝杆菌感染者。

5.2样本采集和样本刺激培养体系

5.2.1每位受检者采集3ml外周血，全血分装到3个2ml EP管中，每个EP管中分装1ml；3个EP管分别标为N、Ta、P，每个EP管中添加30μl培养液(配方同实施例4)；其中N管中添加的培养液不含抗原，Ta管中添加的30μl培养液含2μg上述重组抗原RV0183，P管中添加的30μl培养液含40μg PHA；

5.2.2全血分装后，轻轻颠倒混匀，置于37℃恒温箱中静置培养20±2h；

5.2.3培养结束后，将EP管置于离心机，5000rpm离心10min，收集血浆标本，进行IL-6分泌水平检测；

5.3血浆中IL-6分泌水平检测

IL-6检测方法与实施例4中描述的方法相同。

检测结果见图4，RV0183刺激外周血细胞后，IL-6的分泌水平在活动性结核病人和结核分枝杆菌潜伏人群中有显著的差别；同时在活动性结核病人与非分枝结核杆菌感染者中IL-6的水平同样存在显著差别，结果见图5。上述结果表明，RV0183可用于活动性结核病人的检测。

实施例6.利用RV0183的抗原性片段筛选活动性结核病人

6.1队列标本信息

同实施例5。

6.2样本采集和样本刺激培养体系

6.2.1收集临床活动性结核标本，每例标本采集全血15ml，将全血分装至22个EP管中每管500μl全血，其中一个EP管为阴性对照管(N),另外21支EP管编号为P1、P2、P3…P21,在P1管中添加1μg肽段RV0183-p1，P2管中添加1μg肽段RV0183-p2，依次类推，在P21管中添加1μg肽段RV0183-p21。

6.2.2全血分装后，轻轻颠倒混匀，置于37℃恒温箱中静置培养20±2h；

6.2.3培养结束后，将EP管置于离心机，5000rpm离心10min，收集血浆标本，进行IL-6分泌水平检测；

6.3血浆中IL-6分泌水平检测

IL-6检测方法与实施例4中描述的方法相同。

检测结果见图6，RV0183的抗原性片段(p1-p21)刺激的活动性结核病人全血中IL-6分泌水平出现不同程度的升高，而在健康对照中，基本无IL-6应答，结果说明上述抗原性片段可用于诊断活动性结核。

实施例7.利用RV0183和PlcD联合检测筛选活动性结核病人

7.1队列标本信息

aTB(IGRA+)代表TB-IGRA检测阳性的临床确诊活动性结核病人，aTB(IGRA-)代表TB-IGRA检测阴性的临床确诊活动性结核病人。HC(IGRA+)代表TB-IGRA检测阳性的健康体检者，HC(IGRA-)代表TB-IGRA检测阴性的健康体检者。其中aTB(IGRA+)标本55例，aTB(IGRA-)标本9例，HC(IGRA+)标本13例，HC(IGRA-)标本52例。

7.2样本采集和样本刺激培养体系

7.2.1每位受检者采集4ml外周血，全血分装到4个2mlEP管中，每个EP管中分装1ml；4个EP管分别标为N、Ta1、Ta2、P，每个EP管中添加30μl培养液(配方同实施例4)；其中N管中添加的培养液不含抗原，Ta1管中添加的30μl培养液含2μg上述重组抗原RV0183，Ta2中添加的30μl培养液含2μg重组抗原Plcd，P管中添加的30μl培养液含40μg PHA；

7.2.2全血分装后，轻轻颠倒混匀，置于37℃恒温箱中静置培养20±2h；

7.2.3培养结束后，将EP管置于离心机，5000rpm离心10min，收集血浆标本，进行IL-6分泌水平检测；

7.3血浆中IL-6分泌水平检测

IL-6检测方法与实施例4中描述的方法相同。

检测结果见图7A-7B，使用RV0183和Plcd分别刺激受试者全血后得到的IL-6实际变化水平在活动性结核病人筛查中具有互补效果。进一步用ROC分析来检验单独使用RV0183或PlcD以及两者联合检测在活动性结核诊断方面的性能。ROC曲线显示，RV0183和PlcD联合检测可以提高检测的灵敏度和特异性，结果见图8。

由上述结果可知，RV0183和Plcd刺激导致的IL-6实际变化水平可以单独或者联合用于活动性结核病人检测，具有较高的灵敏度和特异性。

实施例8.结核分枝杆菌的其它抗原用于活动性结核筛选诊断的价值探讨

8.1队列标本信息

收集临床诊断确诊活动性结核病人5例，无临床症状的潜伏感染者5例采集全血标本。

8.2样本采集和样本刺激培养体系

8.2.1采集全血标本10ml，分装至9只EP管中，每管1ml全血。其中1只EP管为阴性对照管(N)。其它8只EP管中分别添加2μg表3所列出的7种抗原中的一种；

8.2.2全血分装后，轻轻颠倒混匀，置于37℃恒温箱中静置培养20±2h；

8.2.3培养结束后，将EP管置于离心机，5000rpm离心10min，收集血浆标本，进行IL-6分泌水平检测；

8.3血浆中IL-6分泌水平检测

IL-6检测方法与实施例4中描述的方法相同。

检测结果见表4，ESAT-6、CFP-10、RV1009、RV1884c、RV2389c、RV2450c、RV3097c、RV3542这些抗原刺激后样品中IL-6水平在活动性结核(aTB)和潜伏感染(LTBI)中没有显著性变化，也即，上述抗原不能用于区分活动性结核和潜伏感染。

表4

实施例9.利用RV0183多肽库在不同类型肺病患者标本中筛选活动性结核患者

9.1队列标本信息

9.1.1活动性结核病例：临床确诊活动性结核患者101例；

9.1.2陈旧性结核病例：无临床症状陈旧性结核患者19例；

9.1.3临床非结核肺病病例：其中IGRA检测阳性病例为结核分枝杆菌潜伏性感染者；其中IGRA检测阴性病例为非结核分枝杆菌感染者。

9.2样本采集和样本刺激培养体系

9.2.1样本采集：样本采集处理同实施例5。

9.2.2样本刺激培养：使用含有21条RV0183抗原性片段(SEQ ID NO:5-25)的多肽库作为刺激源标记(Ta),刺激全血。将多肽库中的每种多肽配置成1μg/mL溶液，将各上述溶液等量混合后，取30μL进行试验。其它操作同实施例5。

9.3IL-6水平检测

同实施例5。

检测结果见图9，RV0183多肽库刺激全血标本后，活动性结核患者IL-6水平显著高于陈旧性肺结核和其它肺病患者，表明该多肽库可用于筛选活动性结核病人。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 用于诊断活动性结核的方法和试剂盒

<130> IDC160028

<150> CN201610034476.6

<151> 2016-01-20

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

<400> 1

Met Thr Thr Thr Arg Thr Glu Arg Asn Phe Ala Gly Ile Gly Asp Val

1 5 10 15

Arg Ile Val Tyr Asp Val Trp Thr Pro Asp Thr Ala Pro Gln Ala Val

20 25 30

Val Val Leu Ala His Gly Leu Gly Glu His Ala Arg Arg Tyr Asp His

35 40 45

Val Ala Gln Arg Leu Gly Ala Ala Gly Leu Val Thr Tyr Ala Leu Asp

50 55 60

His Arg Gly His Gly Arg Ser Gly Gly Lys Arg Val Leu Val Arg Asp

65 70 75 80

Ile Ser Glu Tyr Thr Ala Asp Phe Asp Thr Leu Val Gly Ile Ala Thr

85 90 95

Arg Glu Tyr Pro Gly Cys Lys Arg Ile Val Leu Gly His Ser Met Gly

100 105 110

Gly Gly Ile Val Phe Ala Tyr Gly Val Glu Arg Pro Asp Asn Tyr Asp

115 120 125

Leu Met Val Leu Ser Ala Pro Ala Val Ala Ala Gln Asp Leu Val Ser

130 135 140

Pro Val Val Ala Val Ala Ala Lys Leu Leu Gly Val Val Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Pro Val Gln Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ile Ser Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Val Val Gln Ala Tyr Asn Thr Asp Pro Leu Val His His Gly Arg Val

180 185 190

Pro Ala Gly Ile Gly Arg Ala Leu Leu Gln Val Gly Glu Thr Met Pro

195 200 205

Arg Arg Ala Pro Ala Leu Thr Ala Pro Leu Leu Val Leu His Gly Thr

210 215 220

Asp Asp Arg Leu Ile Pro Ile Glu Gly Ser Arg Arg Leu Val Glu Cys

225 230 235 240

Val Gly Ser Ala Asp Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Tyr His

245 250 255

Glu Val Phe Asn Glu Pro Glu Arg Asn Gln Val Leu Asp Asp Val Val

260 265 270

Ala Trp Leu Thr Glu Arg Leu

275

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

<400> 2

ggatccatga ctaccacccg gactgaacgg aatttcgcgg gcatcggcga tgtgcgcatc 60

gtctacgacg tctggacgcc ggacaccgcg ccgcaagcgg tggtcgtgct ggcccatggt 120

ctgggcgagc atgcccgccg ctacgaccat gtcgcgcagc ggctcggcgc ggccggcctg 180

gtcacctatg cgcttgacca ccgcgggcat ggccgctcgg gtggcaaacg ggtgctagtg 240

agagacatct ccgagtacac cgctgacttc gacaccctcg ttgggatcgc cacccgggaa 300

tatcccgggt gcaagcgcat cgtgctcggg cacagcatgg gcggcggcat tgtgttcgct 360

tacggtgtcg aacgtccaga caactacgac ctgatggtgc tttcggcgcc ggcggtggcg 420

gcacaggacc tggtgagccc ggtagtggcg gttgccgcca agcttctggg cgtcgtggtg 480

cccggcctgc cggtgcagga actggatttt actgccatct ctcgcgaccc tgaggtggtc 540

caggcttaca acaccgaccc actcgtgcac cacggacggg ttccggccgg gattggccgc 600

gcgctgctgc aggtgggcga gaccatgccg cggcgagcac cggcattgac cgcgccgctg 660

ctagtgctgc acggcaccga tgaccggctg atccccatcg agggcagccg tcgcctggtc 720

gaatgtgtgg gatcggccga cgtgcagctg aaggagtatc ccgggctgta ccacgaggtg 780

ttcaacgagc cggagcgcaa ccaggtgctc gacgatgtgg tcgcctggct caccgagcgg 840

ttgtaagaat tc 852

<210> 3

<211> 280

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

<400> 3

Asp Ala Gly Val Ser Trp Lys Val Tyr Arg Asn Lys Thr Leu Gly Pro

1 5 10 15

Ile Ser Ser Val Leu Thr Tyr Gly Ser Leu Val Thr Ser Phe Lys Gln

20 25 30

Ser Ala Asp Pro Arg Ser Asp Leu Val Arg Phe Gly Val Ala Pro Ser

35 40 45

Tyr Pro Ala Ser Phe Ala Ala Asp Val Leu Ala Asn Arg Leu Pro Arg

50 55 60

Val Ser Trp Val Ile Pro Asn Val Leu Glu Ser Glu His Pro Ala Val

65 70 75 80

Pro Ala Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ile Val Asn Ile Leu Arg Ile Leu

85 90 95

Leu Ala Asn Pro Ala Val Trp Glu Lys Thr Ala Leu Ile Val Ser Tyr

100 105 110

Asp Glu Asn Gly Gly Phe Phe Asp His Val Val Pro Ala Thr Ala Pro

115 120 125

Ala Gly Thr Pro Gly Glu Tyr Val Thr Val Pro Asp Ile Asp Gln Val

130 135 140

Pro Gly Ser Gly Gly Ile Arg Gly Pro Ile Gly Leu Gly Phe Arg Val

145 150 155 160

Pro Cys Phe Val Ile Ser Pro Tyr Ser Arg Gly Pro Gln Met Val His

165 170 175

Asp Thr Phe Asp His Thr Ser Gln Leu Arg Leu Leu Glu Thr Arg Phe

180 185 190

Gly Val Pro Val Pro Asn Leu Thr Ala Trp Arg Arg Ser Val Thr Gly

195 200 205

Asp Met Thr Ser Thr Phe Asn Phe Ala Val Pro Pro Asn Ser Ser Trp

210 215 220

Pro Asn Leu Asp Tyr Pro Gly Leu His Ala Leu Ser Thr Val Pro Gln

225 230 235 240

Cys Val Pro Asn Ala Ala Leu Gly Thr Ile Asn Arg Gly Ile Pro Tyr

245 250 255

Arg Val Pro Asp Pro Gln Ile Met Pro Thr Gln Glu Thr Thr Pro Thr

260 265 270

Arg Gly Ile Pro Ser Gly Pro Cys

275 280

<210> 4

<211> 843

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

<400> 4

gatgccggcg tcagctggaa ggtgtatcgc aacaagacac tcgggcccat ctcctcggtt 60

cttacttacg gctcgcttgt gacgtctttc aaacagtcag ccgatcccag gtcagatctt 120

gtccgctttg gcgtggcacc aagctatccc gcgagcttcg cggccgacgt cttagccaat 180

agactgccgc gggtctcctg ggtgattccc aatgttctcg aatccgaaca tcctgcggtt 240

ccagccgcgg ccggggcttt cgcaatcgtc aacatcttaa gaatattgct tgccaatcct 300

gcggtgtggg aaaagacggc gctgatcgtc agctacgacg aaaacggcgg ctttttcgac 360

cacgttgttc ctgctaccgc gccggccggg actcccggcg aatatgtcac ggtgcctgac 420

atcgatcagg tgccgggctc cggcggaata cgcgggccga tcggtttggg ctttcgcgtt 480

ccctgcttcg tcatttcgcc gtacagccgt ggcccgcaga tggttcacga cacgtttgac 540

cacacctcac agctgagatt gctcgaaact cggttcgggg tgccagttcc caacctcacg 600

gcttggcggc gcagtgtgac cggcgacatg acgtcaacgt tcaacttcgc tgtcccgccc 660

aactcatcat ggcccaacct ggattatccc gggctgcacg cgctatcaac ggtgccgcag 720

tgcgtgccca acgcggcgct gggcacgata aaccgtggaa tcccgtatcg ggttcctgat 780

ccacagatca tgcccacgca ggaaaccacg cctacccgtg gtattccgag cggtccgtgc 840

taa 843

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p1

<400> 5

Met Thr Thr Thr Arg Thr Glu Arg Asn Phe Ala Gly Ile Gly Asp Val

1 5 10 15

Arg Ile Val Tyr

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p2

<400> 6

Gly Asp Val Arg Ile Val Tyr Asp Val Trp Thr Pro Asp Thr Ala Pro

1 5 10 15

Gln Ala Val Val

20

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p3

<400> 7

Thr Ala Pro Gln Ala Val Val Val Leu Ala His Gly Leu Gly Glu His

1 5 10 15

Ala Arg Arg Tyr

20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p4

<400> 8

Gly Glu His Ala Arg Arg Tyr Asp His Val Ala Gln Arg Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ala Gly Leu Val

20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p5

<400> 9

Leu Gly Ala Ala Gly Leu Val Thr Tyr Ala Leu Asp His Arg Gly His

1 5 10 15

Gly Arg Ser Gly

20

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p6

<400> 10

Arg Gly His Gly Arg Ser Gly Gly Lys Arg Val Leu Val Arg Asp Ile

1 5 10 15

Ser Glu Tyr Thr

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p7

<400> 11

Arg Asp Ile Ser Glu Tyr Thr Ala Asp Phe Asp Thr Leu Val Gly Ile

1 5 10 15

Ala Thr Arg Glu

20

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p8

<400> 12

Val Gly Ile Ala Thr Arg Glu Tyr Pro Gly Cys Lys Arg Ile Val Leu

1 5 10 15

Gly His Ser Met

20

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p9

<400> 13

Ile Val Leu Gly His Ser Met Gly Gly Gly Ile Val Phe Ala Tyr Gly

1 5 10 15

Val Glu Arg Pro

20

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p10

<400> 14

Ala Tyr Gly Val Glu Arg Pro Asp Asn Tyr Asp Leu Met Val Leu Ser

1 5 10 15

Ala Pro Ala Val

20

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p11

<400> 15

Val Leu Ser Ala Pro Ala Val Ala Ala Gln Asp Leu Val Ser Pro Val

1 5 10 15

Val Ala Val Ala

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p12

<400> 16

Ser Pro Val Val Ala Val Ala Ala Lys Leu Leu Gly Val Val Val Pro

1 5 10 15

Gly Leu Pro Val

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p13

<400> 17

Val Val Pro Gly Leu Pro Val Gln Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ile Ser

1 5 10 15

Arg Asp Pro Glu

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p14

<400> 18

Ala Ile Ser Arg Asp Pro Glu Val Val Gln Ala Tyr Asn Thr Asp Pro

1 5 10 15

Leu Val His His

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p15

<400> 19

Thr Asp Pro Leu Val His His Gly Arg Val Pro Ala Gly Ile Gly Arg

1 5 10 15

Ala Leu Leu Gln

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p16

<400> 20

Ile Gly Arg Ala Leu Leu Gln Val Gly Glu Thr Met Pro Arg Arg Ala

1 5 10 15

Pro Ala Leu Thr

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p17

<400> 21

Arg Arg Ala Pro Ala Leu Thr Ala Pro Leu Leu Val Leu His Gly Thr

1 5 10 15

Asp Asp Arg Leu

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p18

<400> 22

His Gly Thr Asp Asp Arg Leu Ile Pro Ile Glu Gly Ser Arg Arg Leu

1 5 10 15

Val Glu Cys Val

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p19

<400> 23

Arg Arg Leu Val Glu Cys Val Gly Ser Ala Asp Val Gln Leu Lys Glu

1 5 10 15

Tyr Pro Gly Leu

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p20

<400> 24

Leu Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Tyr His Glu Val Phe Asn Glu Pro Glu

1 5 10 15

Arg Asn Gln Val

20

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RV0183-p21

<400> 25

Glu Pro Glu Arg Asn Gln Val Leu Asp Asp Val Val Ala Trp Leu Thr

1 5 10 15

Glu Arg Leu

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ttcaaccatc gccgcctcta cca 23

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ccatcgccgc ctctaccagt 20

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ggatccatgg atgccggcgt cag 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

aagcttttag cacggaccgc tcg 23

Claims

1.一种试剂盒，其包括RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或数种，和

能够检测IL-6的试剂；

优选地，所述RV0183具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或，所述PlcD具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

优选地，所述试剂盒包含RV0183和/或PlcD；

优选地，所述试剂盒包含一种或多种RV0183的抗原性片段；更优选地，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:5-25；

优选地，所述试剂盒包含分别具有如SEQ ID NO:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段；任选地，所述试剂盒还包括下列抗原性片段的组合：

4)分别具有如SEQ ID NO:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述试剂盒包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述能够检测IL-6的试剂为能够和IL-6特异性结合的物质，例如抗体、靶向多肽或核酸适体；任选地，所述试剂还带有可检测的标记；

优选地，所述试剂通过免疫学检测来测定所述样品中IL-6的水平；更优选地，所述免疫学检测选自ELISA检测、Elispot检测、Western印迹或表面等离子共振法；

优选地，所述试剂包括抗IL-6的抗体或其抗原结合片段；更优选地，所述试剂通过ELISA来测定IL-6的水平；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

优选地，所述试剂盒还包含一种或多种选自1)-5)的装置或试剂：

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水；

优选地，所述试剂盒用于诊断活动性结核、判断一种疗法对活动性结核的治疗效果或筛选能够治疗活动性结核的候选药物。

2.特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断活动性结核；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种；

优选地，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其组合；

优选地，所述特异性刺激原选自一种或多种RV0183的抗原性片段；更优选地，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:5-25；

优选地，所述特异性刺激原包含分别具有如SEQ ID NO:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段；任选地，所述特异性刺激原还包括下列抗原性片段的组合：

优选地，所述特异性刺激原包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述试剂盒包括能够检测IL-6的试剂，例如能够和IL-6特异性结合的抗体、靶向多肽或核酸适体；任选地，所述试剂还带有可检测的标记；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水；

优选地，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来诊断所述受试者是否患有活动性结核：

其中，所述样品包含外周血单个核细胞(PBMC)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血单个核细胞(PBMC)、或外周血白膜层；

优选地，在步骤(3)中，利用选自下列的统计模型对所述差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)；更优选地，在步骤(3)中，使用Logistic回归模型对所述差值进行统计分析；

优选地，在步骤(1)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段；更优选地，在步骤(1)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品；或，在步骤(1)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品；

优选地，步骤(1)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品；更优选地，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A；

优选地，在步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用采血装置从所述受试者获得样品；(b)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(c)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(d)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品。

3.特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种；

优选地，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其组合；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水；

优选地，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来判断一种疗法对活动性结核的治疗效果：

(4)对所述受试者进行所述疗法；

优选地，在步骤(8)中，利用选自下列的统计模型对所述所述第一差值和第二差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)；更优选地，在步骤(8)中，使用Logistic回归模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析；

优选地，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理；优选地，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段；更优选地，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品；或，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

优选地，所述疗法包括对受试者施用抗结核药物，例如异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或其任何组合；

优选地，步骤(2)和(6)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品；更优选地，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A；

优选地，在步骤(1)中，使用采血装置获得来自所述受试者的治疗前样品；

优选地，在步骤(5)中，使用采血装置获得来自所述受试者的治疗后样品；

优选地，在进行步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品；

优选地，在进行步骤(5)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述受试者的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述受试者的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述受试者的样品。

4.特异性刺激原在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物；其中，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其抗原性片段中的一种或多种；

优选地，所述特异性刺激原选自RV0183、PlcD或其组合；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

1)采血装置，例如无热原真空采血管；

2)抗凝剂，例如肝素；

3)培养液或培养基；

4)非特异性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白A；

5)稀释液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水；

优选地，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法来筛选能够治疗活动性结核的候选药物：

(4)给所述动物施用候选药物；

优选地，在步骤(8)中，利用选自下列的统计模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)；更优选地，在步骤(8)中，使用Logistic回归模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析。

优选地，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理；优选地，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原分别或共同刺激一份或多份来自所述动物的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段；更优选地，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品；或，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种RV0183的抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品；

优选地，所述模型动物是非人哺乳动物，例如小鼠、豚鼠、兔或非人灵长类动物(例如食蟹猴或猕猴)；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

优选地，在步骤(1)中，使用采血装置获得来自所述动物的治疗前样品；

优选地，在步骤(5)中，使用采血装置获得来自所述动物的治疗后样品；

优选地，在进行步骤(1)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述动物的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述动物的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述动物的样品；

优选地，在进行步骤(5)之前，所述方法还包括下列步骤中的一项或多项：(a)使用抗凝剂处理采血装置或来自所述动物的样品；(b)使用培养液或培养基处理来自所述动物的样品；和，(c)使用稀释液稀释来自所述动物的样品。

5.用于诊断受试者是否患有活动性结核的方法，其包括下述步骤：

(1)提供来自所述受试者的至少两份样品；

优选地，在步骤(4)中，利用选自下列的统计模型对所述差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)；更优选地，在步骤(4)中，使用Logistic回归模型对所述差值进行统计分析；

优选地，所述抗原性片段为RV0183的抗原性片段；更优选地，所述抗原性片段具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:5-25；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

优选地，在步骤(2)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段；

优选地，在步骤(2)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品；或，在步骤(2)中，使用一种或多种抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品；进一步优选地，在步骤(2)中，使用下列抗原性片段的组合共同刺激至少一份样品作为待测样品：

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，在步骤(3)中，通过免疫学检测来测定所述样品中IL-6的水平；进一步优选地，所述免疫学检测选自ELISA检测、Elispot检测、Western印迹或表面等离子共振法；

优选地，在步骤(3)中，使用抗IL-6的抗体或其抗原结合片段来检测IL-6的水平，例如通过ELISA来进行测定；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

优选地，步骤(2)还包括使用非特异性刺激原刺激至少一份样品作为阳性对照样品；更优选地，所述非特异性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白A；

优选地，在步骤(1)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)从所述受试者获得样品；(b)向样品中加入抗凝剂，例如肝素；(c)从样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(d)向样品中加入培养液或培养基；(e)稀释样品。

6.用于判断一种疗法对活动性结核的治疗效果的方法，其包括下述步骤：

(4)对所述受试者进行所述疗法；

优选地，在步骤(8)中，利用选自下列的统计模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析：线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型或微阵列预测分析(PAM)；更优选地，在步骤(8)中，使用Logistic回归模型对所述第一差值和第二差值进行统计分析；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

优选地，在步骤(2)和(6)中，对治疗前样品和治疗后样品进行相同的处理；优选地，在步骤(2)和(6)中，使用至少两种特异性刺激原共同或分别刺激一份或多份来自所述受试者的样品作为待测样品，其中所述特异性刺激原各自独立地选自RV0183、PlcD或其抗原性片段；

优选地，在步骤(2)和(6)中，使用RV0183、和PlcD分别刺激至少两份样品作为待测样品；或，在步骤(2)和(6)中，使用一种或多种抗原性片段共同刺激至少一份样品作为待测样品；进一步优选地，在步骤(2)和(6)中，使用下列抗原性片段的组合共同刺激至少一份样品作为待测样品：

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

优选地，在步骤(1)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)向治疗前样品中加入抗凝剂，例如肝素；(b)从治疗前样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(c)向治疗前样品中加入培养液或培养基；和，(d)稀释治疗前样品；

优选地，在步骤(5)之前，还包括下列步骤中的一项或多项：(a)向治疗后样品中加入抗凝剂，例如肝素；(b)从治疗后样品中获取PBMC或含有PBMC的血液成分(例如，外周血白膜层)；(c)向治疗后样品中加入培养液或培养基；和，(d)稀释治疗后样品。

7.用于筛选能够治疗活动性结核的候选药物的方法，其包括下述步骤：

(4)给所述动物施用候选药物；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；

6)分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述抗IL-6的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

优选地，所述抗IL-6的抗体为IgG抗体或IgM抗体；

8.多肽库，其包括：

第一肽，其具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

第二肽，其具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；和

第三肽，其具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；

任选地，所述多肽库还包括下列多肽的组合：

1)分别具有如SEQ ID NO:5、11、22所示的氨基酸序列的多肽，

2)分别具有如SEQ ID NO:7-8、11-12所示的氨基酸序列的多肽，

4)分别具有如SEQ ID NO:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的多肽；

优选地，所述多肽库包含分别具有如SEQ ID NO:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；

优选地，所述多肽库能够诱导样品产生IL-6；其中，所述样品包含外周血单个核细胞(PBMC)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血单个核细胞(PBMC)、或外周血白膜层；

优选地，所述多肽库用于诊断活动性结核、判断一种疗法对活动性结核的治疗效果或筛选能够治疗活动性结核的候选药物。