CN104017806B

CN104017806B - microRNA及其在制备活动性结核病检测试剂中的应用

Info

Publication number: CN104017806B
Application number: CN201410192946.2A
Authority: CN
Inventors: 张文宏; 吴晶; 陈嘉臻; 王森
Original assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2017-11-10
Anticipated expiration: 2034-05-08
Also published as: CN104017806A

Abstract

本发明还公开了序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、以及SEQ ID No.4的microRNA以及所述的microRNA在制备活动性结核检测试剂中的应用：所述的活动性结核检测试剂盒包括扩增特异性引物、real‑time PCR试剂盒和内参引物，还可以包括microRNA反转录体系、缓冲液。本发明通过real‑time PCR相对定量方法特异性地检测所述mircoRNA的含量并与内参microRNA进行比较，从而用于检测结核病，本发明所述的microRNA对于活动性结核病检测的灵敏度高和准确度较高，检测速度快，可以大大提高活动性结核病的诊断效率。

Description

microRNA及其在制备活动性结核病检测试剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物治疗领域，尤其涉及一种与结核感染相关的microRNA及其在制备活动性结核病检测试剂中的应用。

背景技术

结核病仍然是威胁人类健康的主要传染病之一，每年全世界依然有几百万的新发结核病例。我国在结核病的预防和控制上投入了大量人力物力，尽管我国广泛接种卡介苗(BCG)，并依照WHO的标准来治疗结核病患者，但每年死于结核的人数依然徘徊于主要传染病的前三位。特别是近年来，随着耐药结核以及耐多药结核菌株的流行，以及结核与艾滋合并感染的增多，使得结核问题变得更为复杂。持续升温的结核问题使得发达国家也加强了结核基础研究和应用研究方面的投入，包括临床快速诊断，改良或研发新疫苗，研发新型抗结核药物，以及研究结核杆菌同宿主免疫系统之间的相互作用机制。

结核感染机体后，免疫反应中的调节子，比如细胞因子，细胞表面受体等等，一直是研究的重点。关注这些免疫调节子，不仅可以了解结核感染的具体致病机制，更可以利用相关因子作为诊断或治疗的靶标，来开发新型诊断技术或治疗手段。比如IFN-γ主要由CD4和CD8T细胞分泌，是指导TH1型细胞免疫的主要细胞因子。目前基于IFN-γ释放试验诊断结核感染的方法，就是利用血液中特异性T淋巴细胞来识别TB抗原，释放IFN-γ的原理。在已有研究中发现，潜伏结核感染者血里IFN-γ含量高于活动性结核病人，另外一些炎症因子，比如TNF-α，IL-6，IP-10和MIP-1等等，也随着TB发病呈现不同的表达谱。而另一些特征性因子，比如细胞表面受体TLR2，TLR4等的表达也与结核发病相关。

此外，结核病发生与否，主要受两种因素的影响，一为感染菌量及结核杆菌毒力的大小，另一为机体免疫抵抗力的高低。所以老年人与儿童等机体免疫抵抗力较低的人群较容易发生结核病。这与活动性结核患者体内调控系统可能存在着失调的情况有关，这其中可能包含一类特殊的调节子，microRNA，在结核感染中表达情况与调节作用都并不清楚，尚在研究中。

MicroRNA是一种内源非编码的小RNA，在生物体内起着重要调控作用。它主要在转录后水平通过降解mRNA或抑制翻译的方式，抑制靶基因的表达。这种调控作用贯穿于细胞生长，分化，信号转导的各个环节。自microRNA被发现以来，研究日新月异，越来越多的研究发现microRNA在人类各种疾病中都具有特征表达谱，对于发病或疾病的进程具有预示作用。

现有技术中，已经可以通过建立microRNA特征表达谱，来揭示microRNA与相关疾病之间的联系；更多的研究者希望能找到疾病特征的microRNA，用来为疾病诊断服务；还有研究者把特殊的microRNA作为治疗的靶点，进行药物开发。

现有的采用microRNA对疾病进行诊断或治疗的技术有：如由丹麦制药公司Santaris Pharma开发的LNA-antimiRTM-122已经进入了临床试验，是世界上首个在人体中试验的micro RNA药物；又如Hoekstra等找到miR-135a在冠状动脉疾病(CAD)患者中上调，而miR-147却在CAD患者中明显下调表达。MiR-146a，miR-155，miR-132和miR-16被报道在风湿病人PBMC中呈不同程度的上调表达。Dai等发现有16个microRNA是在系统性红斑狼疮患者的PBMC中差异表达。Voellenkle等对缺血性慢性心衰患者(ICM)、非缺血性心肌扩张型心衰患者(NIDCM)以及对照组PBMC中microRNA表达进行分析，发现miR-107，miR-139和miR-142-5p在两组患者中都是下调表达，而miR-142-3p和miR-29b仅在NIDCM患者中上调，同时miR-125b和miR-497仅在ICM患者中下调。

由于microRNA检测技术复杂，不同的microRNA对疾病的表达差异较大，因此，亟待对与结核感染相关的microRNA进一步的研究。

发明内容

本发明旨在对与结核感染相关的microRNA进一步的研究，并提供了一种与结核感染有关的microRNA及其应用。

本发明的第一方面提供了一种microRNA，所述的microRNA中包括序列为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、以及SEQ ID No.4的microRNA中的一种或几种。

所述的microRNA为与结核感染有关的microRNA。

在本发明一个较为优选的实施例中，所述的SEQ ID No.1(本发明下文也称为“miR-132*”)，其序列优选为accguggcuuucgauuguuacu；

所述的SEQ ID No.2(本发明下文也称为“miR-630”)，其序列优选为aguauucuguaccagggaaggu；

所述的SEQ ID No.3(本发明下文也称为“miR-572”)，其序列优选为guccgcucggcgguggccca；

所述的SEQ ID No.4(本发明下文也称为“miR-362-3p”)，其序列优选为aacacaccuauucaaggauuca。

本发明的第二方面提供了一种所述的microRNA在制备活动性结核病血液检测试剂中的应用；

其中，所述的活动性结核病检测试剂为试剂盒，所述试剂盒包括针对SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、以及SEQ ID No.4中的任意一种或几种microRNA序列所设计的PCR扩增引物。

在本发明一个较为优选的实施例中，所述的活动性结核病血液检测试剂包括PCR扩增特异性引物，其中，所述的PCR扩增特异性引物包括针对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、以及SEQ ID No.4中的任意一种或几种microRNA序列所设计的引物；

优选地，所述的PCR扩增特异性引物可为其所针对的microRNA本身序列。

优选地，所述的PCR扩增特异性引物的序列可包括SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8中的任意一种或几种的引物。

在本发明一个较为优选的实施例中，所述的活动性结核病血液检测试剂及其所包含的PCR扩增特异性引物还可包括序列SEQ ID No.9。优选地，序列SEQ ID No.9为本发明中所需使用计算microRNA相对表达倍数的内参基因U6的PCR扩增特异性引物。U6为U6snRNA的简称，是一种人体内源表达的核酸小RNA，在人体血细胞中表达量稳定，可作为microRNA表达相对倍数计算的重要的内源参比基因。

在本发明一个较为优选的实施例中，所述的活动性结核病血液检测试剂还包括real-time PCR试剂盒和内参引物，以及microRNA反转录体系、缓冲液中的一种或两种；优选为包括real-time PCR试剂盒、内参引物、microRNA反转录体系和缓冲液。

在本发明一个较为优选的实施例中，所述的PCR扩增特异性引物的序列包括SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9中的一种或几种。

具体地：

本发明所述SEQ ID No.5(本发明下文也称为“hsa-miR-132*”)的序列优选为5’-accgtggctttcgattgttact-3’；

本发明所述的SEQ ID No.6(本发明下文也称为“hsa-miR-630”)的序列优选为5’-agtattctgtaccagggaaggt-3’；

本发明所述的SEQ ID No.7(本发明下文也称为“hsa-miR-572”)的序列优选为5’-gtccgctcggcggtggccca-3’；

本发明所述的SEQ ID No.8(本发明下文也称为“hsa-miR-362-3p”)的序列优选为5’-aacacacctattcaaggattca-3’；

本发明所述的SEQ ID No.9(本发明下文也称为“U6-part”)的序列优选为5’-ctcgcttcggcagcacatatac-3’。

本发明所述的microRNA及其应用具有以下的优选或有益效果：

1)采用本发明所述的microRNA，可用于活动性结核病血液的检测，为活动性结核病的快速诊断提供新的技术基础；

2)以本发明所述的microRNA为基础制备的活动性结核病血液检测试剂，对活动性结核病检测均具有较高的灵敏度和准确度；

3)本发明所述的microRNA及含有所述microRNA的活动性结核病检测试剂，操作快速、合理可行，可以提高活动性结核病的诊断效率。

附图说明

图1A为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、健康对照者血液中miR-132*相对值散点图；

图1B为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、健康对照者血液中miR-630相对值散点图；

图1C为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、健康对照者血液中miR-572相对值散点图；

图1D为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、健康对照者血液中miR-362-3p相对值散点图；

图2A为miR-630与miR-132*联用的决策树分析示意图；

图2B为miR-362-3p与miR-630联用的决策树分析示意图；

图2C为miR-362-3p与miR-572联用的决策树分析示意图；

附图说明：

HC为健康对照，ATB或TB为活动性结核患者。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明中所述的microRNA及其相对表达倍数检测及其具体应用做进一步说明，但不作为本发明的限定。

本实施例中所述的microRNA包括miR-132*、miR-630、miR-572以及miR-362-3p。

所述的miR-132*的序列为accguggcuuucgauuguuacu；

所述的miR-630的序列aguauucuguaccagggaaggu；

所述的miR-572的序列为guccgcucggcgguggccca；

所述的miR-362-3p的序列为aacacaccuauucaaggauuca。

本实施例中还包含U6snRNA参比基因表达的检测，所述的U6snRNA用于计算特异性microRNA的相对表达变化倍数。

本实施例中所述的microRNA来源于人体细胞，其抽提方法为本领域技术人员常用的RNA分离及提取方法。

本实施例中所述microRNA相对表达倍数的检测方法，具体包括以下步骤：步骤1，从外周血中分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)：

采集受试者样本，包括活动性结核患者和健康对照者血液样本：

其中所述患者诊断为活动性肺结核的依据为：患者有痰涂片阳性结果或痰培养阳性结果，X射线胸片异常或抗结核治疗少于30天。

从活动性结核患者与健康对照者外周血中采静脉血5-10ml至真空采血管中；

将真空采血管进行离心，离心的速度为2800-3000rpm，离心时间为10min；离心完成后吸取中间层白色细胞，重悬于细胞培养基RPMI1640中，补平至8ml；上层为血浆，可分离冻存于-80℃备用；

在15ml离心管中加入4ml Ficoll淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液轻轻加入淋巴细胞分离液上层，3000rpm室温离心20min；

吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min；

弃上清，加入5ml红细胞裂解液，室温孵育10min；

加入RPMI1640重悬至12ml，混匀，2000rpm离心5min，弃上清；

重悬细胞于1ml1640培养基中，取细胞与typan blue1：1混合，加入血细胞计数板进行计数；

根据计数结果，1640培养基稀释细胞至一定浓度备用。

其中，在进行T-SPOT.TB实验时，用AIM-V无血清培养基进行重悬，计数和稀释。

步骤2，从单个核细胞中抽提RNA：

培养和刺激步骤1中获得的核细胞后，收集细胞。吸去培养液上清。每孔加入700μlQIAzol Lysis Reagent，用1ml移液器反复吹打，转移至1.5ml EP管中；

继续Vortex1分钟使细胞充分裂解，然后把EP管放室温(15-25℃)静置5min；

每管加入140μl的氯仿，摇晃约15s，充分混合。然后室温静置2-3分钟12,000×g4℃离心15min；

吸取离心后最上面水相液体到新的收集管中，加入约1.5倍体积(约525μl)100％乙醇，充分混合；

把上述混合液体(700μl)转移到RNeasy Mini spin柱内，在25℃温度下>8000×g离心15s，舍去滤过液，再把剩余液体加入重复一遍；

加入700μl Buffer RWT到柱内，在25℃温度下>8000×g15秒离心洗涤，弃去滤过液；

加入500μl Buffer RPE到柱内，在25℃温度下>8000×g离心2分钟；

把离心柱转移到新的收集管里，用离心机最大转速(约17,000rpm)离心1分钟，使柱内液体完全离干；

把离心柱转移到无RNA酶污染的干净1.5EP管中，在柱内膜中加入40μlRNase-freewater，>8000×g离心1min，洗脱总RNA。

其中，所述的洗脱总RNA中包括了本发明做检测的MciroRNA。

步骤3，采用定时定量荧光PCR检测mciroRNA的含量：

1)采用反转录酶将MciroRNA反转录为cDNA，反应体系如表1中所示；

表1，MciroRNA逆转录反应体系

试剂	体积
		miScript RT Buffer，5×	4ul
RNase-free water	(15-X)ul
		miScript Reverse Transcriptase Mix	1ul
Template RNA	X ul(0.25ug)
		总体积	20ul

其中，所述的mciroRNA的反转录由多聚酶在小RNA上接上一段polyA的尾巴，以利于后续Real-time检测；

具体的反应程序为：37℃孵育60分钟，然后95℃孵育5分钟使逆转录酶失活。反转结束后将cDNA保存于4℃备用；

基于上述检测成熟microRNA，PCR扩增特异性引物即为microRNA本身序列：

表2，本实施例中所述PCR扩增特异性引物及其序列

PCR扩增特异性引物名称	PCR扩增特异性引物序列(5'to3')
		hsa-miR-132*	accgtggctttcgattgttact
hsa-miR-630	agtattctgtaccagggaaggt
		hsa-miR-572	gtccgctcggcggtggccca
hsa-miR-362-3p	aacacacctattcaaggattca
		U6-part	ctcgcttcggcagcacatatac

其中，U6-part即为U6snRNA，U6-part为本实施例中重要的参比基因，U6-part也为PCR扩增参比基因的特异性引物部分，用于计算microRNA的相对表达倍数；

2)采用实时荧光定量PCR检测本实施例中所述的microRNA在受试者中的相对表达倍数。

采用miScript SYBR Green PCR Kit对成熟的microRNA和内参U6进行PCR检测。

首先，冰上融化2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix,10×miScriptUniversal Primer,RNase-free Water等溶剂，然后，按如表3中所述的反应体系进行配制，样本配置独立的反应体系：

表3，特异性microRNA的PCR检测反应体系

试剂	每孔体积(96孔板)
		2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix	10ul
10×miScript Universal Primer	2ul
		Specific microRNA	1ul
RNase-free water	7ul
		Template cDNA	1ul
总体积	20ul

其中，上述反应的具体的反应程序为95℃酶的启动15min，3步法循环步骤如下：在94℃下变形15s，在55℃下退火30s后，在70℃下延伸30s；上述的3步法循环的循环次数为40次。

3)为了进一步的验证分析本实施例中所述的microRNA对活动性结核病的表达效果，对照活动性结核患者与健康对照者表达差异的相对倍数变化进行分析，具体如下：

选取30例活动性结核患者(ATB)以及30例健康志愿者(HC)，利用实时荧光定量PCR技术，检测miR-132*、miR-630、miR-572和miR-362-3p在HC和ATB全血分离单个核细胞当中的表达，并与样本的内参基因的表达做比较，其中实时荧光定量PCR方法中Ct差1即表达量相差2倍进行换算，对每个miRNA的相对表达倍数进行计算和统计，按组别绘制含误差线的散点图，如图1A-1D中所示。其中，横线为平均值±标准误。

4)诊断结果的判定：

本发明实施例中具体提供了3种独立的诊断判定方法，分别是联合使用miR-630与miR-132*的相对表达倍数或miR-362-3p与miR-630的相对表达倍数或miR-362-3p与miR-572的相对表达倍数。具体方法可参见(图2A-2C)：

如联用miR-630和miR-132*的相对表达倍数时，若miR-630的相对表达倍数小于4.74×10^-5时，检测结果为阴性，即判断为非活动性结核，若miR-630的相对表达倍数大于等于4.74×10^-5时，使用miR-132*的相对表达倍数作为判定依据，若miR-630的相对表达倍数小于6.38×10^-4时，检测结果为阴性，若大于等于该阈值即为阳性，即判断为活动性结核。在本实施例的60例样本(包括30例活动性结核患者以及30例健康志愿者)中使用该判定方法的诊断敏感性达73.3％，特异性达93.3％，区分正确度为83.3％。

如联用miR-362-3p和miR-630的相对表达倍数时，若miR-362-3p相对表达倍数小于2×10^-4时，检测结果为阴性，即判断为非活动性结核，若miR-362-3p相对表达倍数大于等于2×10^-4时，使用miR-630的相对表达倍数作为判定依据，若miR-630的相对表达倍数小于4.74×10^-5时，检测结果为阴性，若大于等于该阈值即为阳性，即判断为活动性结核。在本实施例的60例样本(包括30例活动性结核患者以及30例健康志愿者)中使用该判定方法的诊断敏感性达80％，特异性90％，区分正确度为85％。

如联用miR-362-3p和miR-572的相对表达倍数时，若miR-362-3p相对表达倍数小于2×10^-4时，检测结果为阴性，即判断为非活动性结核，若miR-362-3p相对表达倍数大于等于2×10^-4时，使用miR-630的相对表达倍数作为判定依据，若miR-572的相对表达倍数小于3.57×10^-3时，检测结果为阴性，若大于等于该阈值即为阳性，即判断为活动性结核。在本实施例的60例样本(包括30例活动性结核患者以及30例健康志愿者)中使用该判定方法的诊断能达到敏感性93.3％，特异性80％，区分正确度为86.7％。

为了使本实施例中所述的microRNA可以得到更广泛的应用，可将本实施例中所述的microRNA制备活动性结核病血液检测试剂。

所述的活动性结核病血液检测试剂可以为试剂盒，所述试剂盒包括针对SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、以及SEQ ID No.4中的microRNA序列所设计的PCR扩增引物。

此外，所述的活动性结核病血液检测试剂还包括RNA提取试剂、microRNA反转录体系、SYBR Green PCR扩增酶和染料、缓冲液；

而其中，所述的PCR扩增特异性引物的序列包括SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9。

所述的PCR扩增特异性引物可为其所针对的microRNA本身序列。

所述的活动性结核病血液检测试剂也可包括序列为SEQ ID No.9的引物。

本实施例筛选出在活动性结核(ATB)患者和健康对照(HC)之间PBMC细胞中差异表达的microRNA。以所述mircoRNA为模板设计引物进行相对定量实时荧光PCR检测，可用于活动性结核病血液的快速检测中，具有较高的灵敏度高和准确度，简单易操作，可以大大提高活动性结核病的诊断效率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示的特异性扩增引物在制备检测活动性结核病的检测试剂盒中的应用。