CN114231612B - 与活动性肺结核有关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医学技术领域,尤其涉及与活动性肺结核有关的miRNA标志物及其应用,其中,所述与活动性肺结核有关的miRNA标志物包括miR‑451a、miR‑25‑3p、miR‑425‑5p、miR‑1260b、miR‑1273g‑3p、miR‑30e‑5p、miR‑140‑3p、let‑7a‑5p、miR‑1290、miR‑491‑5p、miR‑3615、miR‑15a‑5p、miR‑21‑3p、miR‑424‑5p、miR‑1268a、miR‑1301‑3p、miR‑345‑5p、miR‑572、miR‑375、miR‑151a‑5p中的一个或多个。
Description
技术领域
本申请属于生物医学技术领域,尤其涉及一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物及其应用。
背景技术
确诊活动性肺结核和治疗后的活动性评价的金标准是病原学检查。但对于病原学检查阴性的活动性肺结核患者(菌阴肺结核),却缺乏判断规范,需要结合临床表现、治疗史和影像等多种手段才能做出最终判断;且由于结核疫苗效果的不理想,使得很多菌阴肺结核患者特别是无特殊症状和体征的病人得不到有效治疗,延误了抗结核的最佳治疗时间,增加了社区传播的风险。因此,开发新的活动性结核病的诊断技术,对减少诊断延迟、减轻疾病的传播和最大程度地降低结核病流行率至关重要。
MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,在物种进化中相当保守,在植物、动物和真菌中发现的miRNA只在特定的组织和发育阶段表达,其组织特异性和时序性,决定组织和细胞的功能特异性,表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。研究表明,某些参与调节机体先天性和适应性免疫应答的miRNA可作为肺结核潜在的标志物。
利用人工智能(AI)技术解决医学领域的实际问题已成为工业界和学术界研究的热点之一,AI在诊断学中的应用可能能够为低收入国家或地区提供准确和快速的检测手段。目前暂时没有协同miRNA以及人工智能对活动性肺结核患病风险进行预测的方案。
发明内容
本申请的目的在于提供一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物及其应用,旨在解决现有技术中没有相关的miRNA标志物能够对活动性肺结核患病风险进行准确、快速预测的问题。
为实现上述申请目的,本申请采用的技术方案如下:
第一方面,本申请提供一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物,miRNA标志物包括miR-451a、miR-25-3p、miR-425-5p、miR-1260b、miR-1273g-3p、miR-30e-5p、miR-140-3p、let-7a-5p、miR-1290、miR-491-5p、miR-3615、miR-15a-5p、miR-21-3p、miR-424-5p、miR-1268a、miR-1301-3p、miR-345-5p、miR-572、miR-375、miR-151a-5p中的一个或多个。
第二方面,本申请提供一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,miRNA标志物为与活动性肺结核有关的miRNA标志物。
第三方面,本申请提供一种用于预测活动性肺结核患病风险的试剂盒,试剂盒包括根据miRNA标志物设计的引物。
第四方面,本申请提供一种用于预测活动性肺结核患病风险的系统,系统包括:
数据获取单元:用于将样本进行基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,获取样本中miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值;
数据分析单元:用于将Ct值与内参相减并进行标准化处理,得到ΔCt值,利用SVM模型处理ΔCt值,分析样本的风险概率值;
数据预测单元:用于将风险概率值与阈值进行比较,以预测活动性肺结核患病风险。
本申请第一方面提供的与活动性肺结核有关的17种新的miRNA标志物,由于miRNA标志物含量较稳定且在体外稳定性好,在检测过程中灵敏度更强,且提供的miRNA标志物为活动性肺结核疾病特定的miRNA标志物,提供的17种miRNA标志物具有特定的表达谱并且某些miRNA在疾病早期即可预示疾病的发生,更有利于进行早期的预测实验;在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行PCR检测,在检测过程中,可同时对多个miRNA标志物进行同步分析,提高了检测速率,检测简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测活动性肺结核患病风险。
本申请第二方面提供的与活动性肺结核有关的miRNA标志物在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,采用提供的17种新的与活动性肺结核有关的miRNA标志物进行产品的制备,得到的产品在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行PCR检测,在检测过程中,可同时对多个miRNA标志物进行同步分析,提高了检测速率,检测简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测活动性肺结核患病风险。
本申请第三方面提供的用于预测活动性肺结核患病风险的试剂盒,该试剂盒中包括根据miRNA标志物设计的引物,根据提供的引物可快速检测相应的miRNA标志物,无需提取核酸,简单快速、减少污染、避免丢失、成本降低、技术门槛低;节省样本,检测一个miRNA最多不超过1μL样本;同时可根据得到的结果进一步进行分析,得到的结果更可靠,可广泛使用。
本申请第四方面提供的用于预测活动性肺结核患病风险的系统,提供的系统包括数据获取单元、数据分析单元、数据预测单元;该系统将基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应分析得到的样本的miRNA标志物的Ct值先进行标准化处理,确保误差范围更小,结果更可靠;再利用SVM模型分析样本的风险概率值并与阈值比对,将实时荧光定量反应结合AI诊断模型,准确快速预测活动性肺结核患病风险,预测结果准确度较高,可信度较高,可广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的活动性肺结核分别与健康人群差异miRNA热图。
图2是本申请实施例提供的非结核性肺炎病人差异miRNA热图。
图3是本申请实施例提供的活动性肺结核与健康人群特征选择miRNA组合图。
图4是本申请实施例提供的活动性肺结核与非结核性肺炎病人特征选择miRNA组合图。
图5是本申请实施例提供的活动性肺结核与非活动性肺结核受试者特征选择miRNA组合图。
图6是本申请实施例提供的基于图3~5特征选择miRNA组合的韦恩图。
图7是本申请实施例提供的17个miRNA在区分活动性肺结核与非活动性结核的ROC图。
图8是本申请实施例提供的SVM模型训练数据的ROC曲线图。
图9是本申请实施例提供的SVM模型测试数据的ROC曲线图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
本申请中所用术语“预测值”、“阈值”指的是经SVM算法中计算得出的数学分数;“预测值”为受试者样本17个miRNA数据输入SVM模型后计算出的数学分数,范围0~1;“阈值”指的是评价模型诊断能力的计算方法,本申请使用约登指数(Youden index)计算阈值,当样本“预测值”大于“阈值”,模型判断为活动性肺结核患病风险高;当样本“预测值”小于“阈值”,模型判断为活动性肺结核患病风险低。
本申请所用的术语“差异表达”是指特定miRNA在靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的,具有统计学意义;对照样本可以是健康人群或是非结核性肺炎病人的样本,其可以是上调(即在靶样本中miRNA Ct值降低)或下调(即在靶样本中miRNA Ct值升高)。换句话说,miRNA在靶样本中被激活至比在对照样本中更高或更低的水平。
本申请的Ct值反映特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度。
本申请实施例第一方面提供一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物,miRNA标志物包括miR-451a、miR-25-3p、miR-425-5p、miR-1260b、miR-1273g-3p、miR-30e-5p、miR-140-3p、let-7a-5p、miR-1290、miR-491-5p、miR-3615、miR-15a-5p、miR-21-3p、miR-424-5p、miR-1268a、miR-1301-3p、miR-345-5p、miR-572、miR-375、miR-151a-5p中的一个或多个。
本申请实施例第一方面提供与活动性肺结核有关的miRNA标志物,包括17种新的miRNA标志物,由于miRNA标志物含量较稳定且在体外稳定性好,在检测过程中灵敏度更强,且提供的miRNA标志物为活动性肺结核疾病特定的miRNA标志物,提供的17种miRNA标志物具有特定的表达谱并且某些miRNA在疾病早期即可预示疾病的发生,更有利于进行早期的预测实验;在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行PCR检测,在检测过程中,可同时对多个miRNA标志物进行同步分析,提高了检测速率,检测方法简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测活动性肺结核患病风险。
在一些实施例中,提供的17种miRNA标志物中,其中,miR-451a的登记号为MI0001729,标志符号为MIR451A,序列如Seq.ID No.1所示,为AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
miR-425-5p的登记号为MI0001448,标志符号为MIR425,序列如Seq.ID No.2所示,为AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA。
miR-1273g-3p的登记号为MI0018003,标志符号为Mir1273G,序列如Seq.ID No.3所示,为ACCACUGCACUCCAGCCUGAG。
miR-140-3p的登记号为MI0000456,标志符号为MIR140,序列如Seq.ID No.4所示,为UACCACAGGGUAGAACCACGG。
miR-1290的登记号为MI0006352,标志符号为MIR1290,序列如Seq.ID No.5所示,为UGGAUUUUUGGAUCAGGGA。
miR-491-5p的登记号为MI0003126,标志符号为MIR491,序列如Seq.ID No.6所示,为AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG。
miR-3615的登记号为MI0020829,标志符号为MIR15A,序列如Seq.ID No.7所示,为UCUCUCCGCUCCUCGCGGCUCGC。
miR-15a-5p的登记号为MI0000069,标志符号为MIR15A,序列如Seq.ID No.8所示,为UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG。
miR-25-3p的登记号为MI0000082,标志符号为MIR25,序列如Seq.ID No.9所示,为CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA。
miR-1260b的登记号为MI0014197,标志符号为MIR1260B,序列如Seq.ID No.10所示,为AUCCCACCACUGCCACCAU。
miR-30e-5p的登记号为MI0000749,标志符号为MIR30E,序列如Seq.ID No.11所示,为UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG。
let-7a-5p的登记号为MI0000060,标志符号为MIRLET7A1,序列如Seq.ID No.12所示,为UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU。
miR-424-5p的登记号为MI0001446,标志符号为MIR424,序列如Seq.ID No.13所示,为CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA。
miR-1268a的登记号为MI0006405,标志符号为MIR1268A,序列如Seq.ID No.14所示,为CGGGCGUGGUGGUGGGGG。
miR-1301-3p的登记号为MI0003815,标志符号为MIR1301,序列如Seq.ID No.15所示,为UUGCAGCUGCCUGGGAGUGACUUC。
miR-345-5p的登记号为MI0000825,标志符号为MIR345,序列如Seq.ID No.16所示,为GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC。
miR-21-3p的登记号为MI0000077,标志符号为MIR21,序列如Seq.ID No.17所示,为CAACACCAGUCGAUGGGCUGU。
本申请实施例第二方面提供的与活动性肺结核有关的miRNA标志物在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,miRNA标志物为与活动性肺结核有关的miRNA标志物。
本申请第二方面提供的与活动性肺结核有关的miRNA标志物在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,采用提供的17种新的与活动性肺结核有关的miRNA标志物进行产品的制备,得到的产品在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行PCR检测,在检测过程中,可同时对多个miRNA标志物进行同步分析,提高了检测速率,检测简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测活动性肺结核患病风险。
在一些实施例中,产品包括试剂盒、芯片、系统中的至少一种。由于提供的miRNA标志物检测方面,特异性较强,灵敏度较高,应用于试剂盒、芯片或系统的制备,可提高活动性肺结核患病风险的预测准确度及可信度。
本申请实施例第三方面提供的用于预测活动性肺结核患病风险的试剂盒,试剂盒包括根据miRNA标志物设计的引物。
本申请实施例第三方面提供的用于预测活动性肺结核患病风险的试剂盒,该试剂盒中包括根据miRNA标志物设计的引物,根据提供的引物可快速检测相应的miRNA标志物,无需提取核酸,简单快速、减少污染、避免丢失、成本降低、技术门槛低;节省样本,检测一个miRNA最多不超过1μL样本;同时可根据得到的结果进一步进行分析,得到的结果更可靠,可广泛使用。
在一些实施例中,引物包括根据每个miRNA标志物设计的通用逆转录引物、荧光定量反应的特异上游引物以及特异性下游引物。
在一些实施例中,提供的通用逆转录引物用于将从样本中得到的总RNA进行PolyA加尾和逆转录反应,生成cDNA,通用逆转录引物使用由5~7个特异碱基和11个 dT组成的,对添加了poly(A) 尾的miRNA进行特异性逆转录,显著增强了添加了poly(A) 尾的miRNA与实时荧光定量PCR的特异下游引物之间的结合力,使后续qPCR检测的灵敏度提高至少一个数量级,从而大幅度提高cDNA的合成效率及其特异性。
在一些实施例中,miRNA标志物的通用逆转录引物如Seq.ID No.18所示,为CAGTGCAGGGTCCGAGGT。
在一些实施例中,提供的荧光定量反应的特异上游引物以及特异性下游引物用于将cDNA进行荧光定量PCR检测,以反应得到实时荧光定量Ct值以进行后续数据分析。其中,每一种荧光定量反应的特异性上游引物和特异下游引物均做了优化设计,有利于扩增的灵敏度更高。
在一些实施例中, miR-451a的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.19所示,为CTGGGAAACCGTTACCATTAC;荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.36所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACTCA;
miR-425-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.20所示,为CTGGGAATGACACGATCACTC;荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.37所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTCAACGG;
miR-1273g-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.21所示,为CTGGGACCACTGCACTCCAG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.38所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCTCAGG;
miR-140-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.22所示,为CTGGGTACCACAGGGTAGAA,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.39所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCGTGG;
miR-1290的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.23所示,为CTGGGTGGATTTTTGGAT,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.40所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTCCCTG;
miR-491-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.24所示,为CTGGGAGTGGGGAACCCTTCC,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.41所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTCAT;
miR-3615的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.25所示,为CTGGGTCTCTCCGCTCCTCGC;荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.42所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGAGCC;
miR-15a-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.26所示,为CTGGGTAGCAGCACATAATGG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.43所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACAAA;
miR-25-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.27所示,为CTGGGCATTGCACTTGTCTCG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.44所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTCAGAC;
miR-1260b的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.28所示,为CTGGGATCCCACCACTGC,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.45所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTATGGTG;
miR-30e-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.29所示,为CTGGGTGTAAACATCCTTGAC,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.46所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCTTCCA;
let-7a-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.30所示,为CTGGGTGAGGTAGTAGGTTGT,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.47所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACTAT;
miR-424-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.31所示,为CTGGGCAGCAGCAATTCATGT,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.48所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTTCAAA;
miR-1268a的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.32所示,为CTGGGCGGGCGTGGTGG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.49所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCCCA;
miR-1301-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.33所示,为CTGGGTTGCAGCTGCCTGGGAG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.50所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGAAGTCA;
miR-345-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.34所示,为CTGGGGCTGACTCCTAGTCCA,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.51所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGAGCCC;
miR-21-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.35所示为CTGGGCAACACCAGTCGATG,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.52所示,为GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACAGCC。
在一些实施例中,基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应使用的试剂。基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应中使用的试剂以及用于预测活动性肺结核患病风险的SVM模型;采用基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应进行试验,其在反应过程中无需提取核酸,简单快速、减少污染、避免丢失、成本降低、技术门槛低;节省样本,检测一个miRNA最多不超过1μL样本;并且,在反应过程中使用特异的S-Poly(T) 引物进行逆转录反应,最大程度的提高cDNA合成的特异性,同时,实时荧光定量反应过程使用特异的miRNA上游引物及与每一种RT引物对应的特异下游引物,进一步保证PCR扩增的特异性且灵敏度平均提高20倍以上。
在一些实施例中,基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,还包括探针,探针如Seq.ID No.53所示,为:CAGAGCCACCTGGGCAATTT。
在一些实施例中,试剂包括针对每个miRNA标志物的引物以及反应过程中需要使用的酶、缓冲液。基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量RT-qPCR,是一种不需提取核酸,直接以经简单处理的血清或血浆(S/P)为模板检测循环microRNA (miRNA)的实时荧光定量PCR。
在一些实施例中,试剂盒还包括:用于预测活动性肺结核患病风险的SVM模型,SVM是一种常规的算法,本申请实施例提供的SVM模型是采用常规的算法,输入17种miRNA数据本和样本值参数构建一个适用于该样本的模型,用于对样本得到的Ct值进行分析。
本申请实施例第四方面提供的一种用于预测活动性肺结核患病风险的系统,系统包括:
数据获取单元:用于将样本进行基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,获取样本中miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值;
数据分析单元:用于将Ct值与内参相减并进行标准化处理,得到ΔCt值,利用SVM模型处理ΔCt值,分析样本的风险概率值;
数据预测单元:用于将风险概率值与阈值进行比较,以预测活动性肺结核患病风险。
本申请实施例第四方面提供的用于预测活动性肺结核患病风险的系统,提供的系统包括数据获取单元、数据分析单元、数据预测单元;该系统将基于Direct S-Poly(T)Plus的实时荧光定量反应分析得到的样本的miRNA标志物的Ct值先进行标准化处理,确保误差范围更小,结果更可靠;再利用SVM模型分析样本的风险概率值并与阈值比对,将实时荧光定量反应结合AI诊断模型,准确快速预测活动性肺结核患病风险,预测结果准确度较高,可信度较高,可广泛应用。
具体的,用于预测活动性肺结核患病风险的系统包括数据获取单元,数据获取单元主要用于将样本进行基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,获取样本中miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值。
在一些实施例中,获取样本中miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值的步骤中,包括:
S01. 采集样本,将样本进行预处理得到上清液粗制RNA;
S02. 将上清液粗制RNA与PolyA加尾和逆转录试剂混匀进行反应得到cDNA;
S03. 将cDNA进行荧光定量PCR检测,获取样本中每个miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值。
步骤S01中,样本包括组织样本、体液样本和细胞外液样本中的至少一种。在一些具体实施例中,样本包括但不限于血浆、全血、血清、间质液、腹膜液、唾液、尿液、精液、泪液。
在一些实施例中,将收集得到的样本进行预处理得到上清液粗制RNA,预处理包括除杂等处理。
在一些实施例中,将得到的20 μl样本与含有1 μl溶菌酶以及20 μl溶菌酶缓冲液进行混合后,于50~51℃孵育 15~17分钟,95~96 ℃孵育5~6分钟;4 °C下13000 rpm离心5分钟,取得上清液粗制RNA。
步骤S02中,将上清液粗制RNA与PolyA加尾和逆转录试剂混匀进行反应得到cDNA。其中,由于包括17种不同的miRNA,因此选择提供的17个不同的miRNA标志物的通用逆转录引物分别进行17管不同的反应。
在一些实施例中,将上清液粗制RNA按照以下体系进行混匀:4μl上清液粗制RNA、2.5μl 4×混合反应缓冲液、1μl PolyA/RT混合酶、1μl通用逆转录引物(0.5 μM)、1μl对照Cel-54 (50 μM) ,用未含有RNA酶的无菌水补充至10μl体系,并进行混匀,于37~38℃保温20~22分钟,42~43℃保温20~22分钟,75~76℃加热5~6分钟,冰上放置5分钟,得到cDNA。
步骤S03中,将cDNA进行荧光定量PCR检测,获取样本中每个miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值。其中,由于包括17种不同的miRNA,因此将得到的不同的cDNA,对应选择表3提供的17个不同的miRNA标志物的荧光定量反应的特异上游引物以及特异性下游引物分别进行17管不同的反应。
在一些实施例中,进行荧光定量PCR检测,荧光定量PCR反应体系按照以下体系进行混匀: 2μl 10 × PCR 缓冲液、0.5μl 10 mM dNTP 、0.2μl HS-Taq(5U/μl)、0.02μl参比染料Rox Reference Dye (100×)、0.5μl 10 μM 探针、4μl特异上游引物、 4μl特异下游引物、1μl cDNA 、补充无菌水至20μl;进行混合均匀后,按照以下反应程序进行反应,反应程序为:95~96℃ 10~11分钟;循环程序:95~96℃ 10~11秒、60~61℃ 30~31秒,反应40个循环,得到对应的Ct值。其中,Ct值反映特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度。
具体的,用于预测活动性肺结核患病风险的系统,包括数据分析单元,数据分析单元用于将Ct值与内参相减并进行标准化处理,得到ΔCt值,利用SVM模型处理ΔCt值,分析样本的风险概率值。
在一些实施例中,将数据输入单元输入的Ct值与内参相减并进行scale归一标准化处理得到ΔCt值,数据归一化简单:误差范围更小,结果更可靠。
在一些实施例中,利用SVM模型处理ΔCt值,分析样本的风险概率值。
具体的,用于预测活动性肺结核患病风险的系统,包括数据预测单元,数据预测单元用于将风险概率值与阈值进行比较,以预测活动性肺结核患病风险。
在一些实施例中,数据预测单元还包括活动性肺结核患病风险的阈值,当风险概率值高于阈值时,判断患活动性肺结核的风险高;当风险概率值低于阈值时,判断患活动性肺结核的风险低。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其中,产品选自用于预测活动性肺结核患病风险的系统。
系统包括:
(1)数据获取单元:用于将样本进行基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,获取表1提供的17种不同的miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值。
具体步骤如下:包括:
①受试者血浆样本的收集与处理:本实施例纳入活动性肺结核患者335例、健康人群260例、非结核性肺炎病人245例。样本以每5个混合1份进行检测,即活动性肺结核患者67份、健康人群52份及非结核性肺炎病人49份。所有样本检测miRNA初始数量均为264个。
受试者血浆样本的收集与处理:采集受试者空腹静脉血,所用采血管为EDTA抗凝管;4 ℃下1600g离心10分钟,分离上层血浆,重复一次,分装于2mL EP管,-80℃冰箱保存;
②血浆样本预处理:将血浆样本按照20 μl样本、20 μl溶菌酶缓冲液以及1μl溶菌酶进行混合处理,混合均匀后50℃孵育 15分钟,95 ℃孵育5分钟;4℃下13000 rpm离心5分钟,取得上清液粗制RNA。
③一步PolyA加尾和逆转录反应:将上清液粗制RNA按照以下体系将 2μl 10 ×PCR 缓冲液、0.5μl 10 mM dNTP 、0.2μl HS-Taq(5U/μl)、0.02μl参比染料Rox ReferenceDye (100×)、0.5μl 10 μM 探针、4μl特异上游引物、 4μl特异下游引物、1μl cDNA 、补充无菌水至20μl混合均匀;于37 ℃保温20分钟,42 ℃保温20分钟,75 ℃加热5分钟,冰上放置5分钟。
④进行荧光定量PCR检测:荧光定量PCR反应体系按照以下体系进行混匀: 2μl 10× PCR 缓冲液、0.5μl 10 mM dNTP 、0.2μl HS-Taq(5U/μl)、0.02μl参比染料RoxReference Dye (100×)、0.5μl 10 μM 探针、4μl特异上游引物、 4μl特异下游引物、1μlcDNA 、补充无菌水至20μl;反应程序为:95℃ 10分钟;循环程序:95℃ 10秒、60℃ 30秒,反应40个循环,得到Ct值。
数据分析单元:用于将Ct值与内参相减并进行标准化处理,得到ΔCt值,利用SVM模型处理ΔCt值,分析样本的风险概率值。
①将实时荧光定量RT-qPCR下机数据预处理:将Ct值超出40的数据(“Undetermined”)采用knn最近邻算法进行填补(k=20);填补后数据每个miRNA分别减去内参,并进行scale归一化处理,得到ΔCt值。
②建立SVM模型:模型的建立基于Python scikit-learn模块,混合样本以4:1比例随机分为训练数据(train)和测试数据(test)。自动参数调优方法选取GridSearchCV,并设定7倍交叉验证,以拟合出模型对该数据的最佳性能,根据GridSearchCV选出的最优参数进行最终建模。然后根据训练数据和测试数据的预测值,利用约登指数计算模型最佳阈值。
(2)数据预测单元:用于将风险概率值与阈值进行比较,预测活动性肺结核患病风险。
预测活动性肺结核患病风险:将得到的训练数据和测试数据的曲线下面积(AUC)进行描绘,得到的最佳临界点为确定阈值;当风险概率值高于阈值时,患活动性肺结核的风险高;当风险概率值低于阈值时,患活动性肺结核的风险低。
结果分析
(一)活动性肺结核特异性相关miRNA筛选
①在混合样本中对活动性肺结核患者与健康人群和非结核性肺炎病人的miRNA表达进行差异分析,以伪发现率FDR<0.1为阈值,从264个miRNA中分别鉴定出46、93个差异表达miRNA。如图1所示,为基于两比较组差异miRNA表达水平的无监督层次聚类分析图,其中,图1为活动性肺结核分别与健康人群差异miRNA热图,图2为活动性肺结核分别与非结核性肺炎病人差异miRNA热图,从图1和图2中可以看出,经归一化处理后各组中miRNA表达水平变化差异不大。
进一步,通过韦恩图对两比较组差异miRNA取交集,得到27个miRNA,从得到的27个miRNA中求出对区分活动性肺结核识别最有效的特征miRNA,实现特征空间维数的压缩:多重共线性分析:去掉相关性大于0.8的miRNA,共8个。
②如图3~5及表1~3所示,分别在活动性肺结核与健康人群、非结核性肺炎病人和非活动性结核受试者(即包括健康人群、非结核性肺炎病人)的比较中,对剩余19个miRNA进行递归特征选择。表4所示分别为特征选择计算的所有的miRNA在3个比较组中的重要性指数。根据图3~5和表1~4结果显示,当按miRNA重要性指数向后递增组合时,区分活动性肺结核与健康人群的最佳miRNA组合数为14个,此时模型准确率和一致性最高;区分活动性肺结核与非结核性肺炎病人的最佳miRNA组合数为16个,此时模型准确率和一致性最高;而区分活动性肺结核与非活动性结核受试者的最佳miRNA组合数为14个,此时模型准确率和一致性最高。
表1
表2
表3
表4
③对基于图3~5的结果,对3个组合作韦恩图如图6所示,并取3者并集(即17个miRNA)作为候选建模组合,得到的17个miRNA在区分活动性肺结核与非活动性结核的ROC如图7所示。从图中可以看出,各miRNA区分两者的AUC范围为0.5~0.77,表明单一miRNA不具有很好的区分两者的能力。
(二)SVM模型的测试及分析
①利用SVM模型对得到Ct值进行训练数据和测试数据的分析,基于训练数据的ROC曲线(如图8)和基于测试数据的ROC曲线(如图9)。训练数据和测试数据的曲线下面积(AUC)分别为0.98和0.88,最佳临界点(“阈值”)为0.5,此时模型对测试数据的 SVM模型对测试数据的诊断效能如表5所示,敏感性是0.93(95% CI:0.76,0.99)、特异性是0.71(95% CI:0.29,0.96)、准确率为0.88(95% CI:0.73,0.97)、召回率F1为0.93,阳性预测值和阴性预测值分别为0.93(95% CI:0.76,0.99)和0.71(95% CI:0.29,0.96)。
表5
综上,本申请提供的用于预测活动性肺结核患病风险的17种新的miRNA标志物,由于miRNA标志物含量较稳定且在体外稳定性好,在检测过程中灵敏度更强,且针对活动性肺结核疾病,提供的17种miRNA标志物具有特定的表达谱并且某些miRNA在疾病早期即可预示疾病的发生,更有利于进行早期的预测实验;在检测分析过程中,不需要筛选和制备特异性抗体,可直接进行PCR检测,检测方法简单快速,不会造成假阳性,更有利于全面、准确用于预测活动性肺结核患病风险。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 与活动性肺结核有关的miRNA标志物及其应用
<130> 2021-11-24
<160> 53
<170> PatentIn version 3.3
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<212> RNA
<213> 人工合成
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Claims (6)
1.一种与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述miRNA标志物为miR-451a、miR-25-3p、miR-425-5p、miR-1260b、miR-1273g-3p、miR-30e-5p、miR-140-3p、let-7a-5p、miR-1290、miR-491-5p、miR-3615、miR-15a-5p、miR-21-3p、miR-424-5p、miR-1268a、miR-1301-3p、miR-345-5p、miR-572、miR-375和miR-151a-5p的组合物。
2.根据权利要求1所述的与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述产品为用于活动性肺结核早期诊断有关的试剂盒,其中,所述试剂盒包括检测所述miRNA标志物的引物。
3.根据权利要求2所述的与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述引物包括检测每个miRNA标志物的通用逆转录引物、荧光定量反应的特异上游引物以及特异性下游引物。
4.根据权利要求3所述的与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述miRNA标志物的通用逆转录引物如Seq.ID No.18所示,
所述miR-451a的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.19所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.36所示;
所述miR-425-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.20所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.37所示;
所述miR-1273g-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.21所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.38所示;
所述miR-140-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.22所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.39所示;
所述miR-1290的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.23所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.40所示;
所述miR-491-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.24所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.41所示;
所述miR-3615的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.25所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.42所示;
所述miR-15a-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.26所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.43所示;
所述miR-25-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.27所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.44所示;
所述miR-1260b的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.28所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.45所示;
所述miR-30e-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.29所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.46所示;
所述let-7a-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.30所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.47所示;
所述miR-424-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.31所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.48所示;
所述miR-1268a的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.32所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.49所示;
所述miR-1301-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.33所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.50所示;
所述miR-345-5p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.34所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.51所示;
所述miR-21-3p的荧光定量反应的特异上游引物如Seq.ID No.35所示,荧光定量反应的特异下游引物如Seq.ID No.52所示。
5.根据权利要求2所述的与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应使用的试剂。
6.根据权利要求1所述的与活动性肺结核有关的miRNA标志物的定量检测试剂在制备活动性肺结核早期诊断的产品中的应用,其特征在于,所述产品为用于预测活动性肺结核患病风险的系统,其中,所述系统包括:
数据获取单元:用于将样本进行基于Direct S-Poly(T) Plus的实时荧光定量反应,获取所述样本中权利要求1所述的miRNA标志物进行实时荧光定量反应得到的Ct值;
数据分析单元:用于将所述Ct值与内参相减并进行标准化处理,得到ΔCt值,利用SVM模型处理所述ΔCt值,分析获得样本的风险概率值;所述SVM模型的建立基于Pythonscikit-learn模块,混合样本以4:1比例随机分为训练数据和测试数据,自动参数调优方法选取GridSearchCV,并设定7倍交叉验证,以拟合出模型对该数据的最佳性能,根据GridSearchCV选出的最优参数进行最终建模;根据训练数据和测试数据的风险概率值,利用约登指数计算模型获得确定阈值;
数据预测单元:用于将所述样本的风险概率值与所述确定阈值进行比较,以预测活动性肺结核患病风险;当所述样本的风险概率值高于所述确定阈值时,判断所述样本的患活动性肺结核的风险高;当所述样本的风险概率值低于所述确定阈值时,判断所述样本的患活动性肺结核的风险低。
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