CN108484764B

CN108484764B - 一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体及其编码序列

Info

Publication number: CN108484764B
Application number: CN201810384867.XA
Authority: CN
Inventors: 唐子执; 张臣良; 曾鸣; 王小军; 姜长安
Original assignee: Chengdu Jiluokelin Biology Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Jiluokelin Biology Technology Co ltd
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-04-26
Also published as: CN108484764A

Abstract

本发明公开了针对绿色荧光蛋白(EGFP)的纳米抗体及其决定抗体特异性的互补决定区(CDR)编码序列。所述抗体是含有SEQ ID NO:1所示互补决定区1氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示互补决定区2氨基酸序列及SEQ ID NO:3所示互补决定区3氨基酸序列。本发明的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白。

Description

一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体及其编码序列

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及针对绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体的氨基酸序列、编码纳米抗体的核苷酸序列、能够表达所述纳米抗体的表达载体及宿主细胞。

背景技术

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reporter gene)。EGFP(enhanced green fluorescent protein),即增强绿色荧光蛋白。EGFP是GFP突变系，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。在生物学研究中，EGFP不仅只是光学上的指示蛋白，在蛋白纯化、外源基因在哺乳动物细胞中表达等方面，EGFP已成为重要的标签蛋白。这就使得针对EGFP的特异性抗体对基础生物医学研究十分重要。

纳米抗体(variable domain ofthe heavy chain of HCAbs,VHH)是一种天然缺失轻链的重链抗体可变区构成的小分子抗体(晶体结构直径2.5纳米，长度4纳米)，其最初是由比利时科学家在骆驼科动物体内发现。纳米抗体因其分子量小，具有亲和力高、稳定性强、组织相容性好及易筛选、易制备等特点，近年来在治疗型药物抗体、临床检测型抗体、科研运用型抗体等方面得到了广泛的研究与发展。纳米抗体的结构主要分为骨架区和互补决定区，前者在同源纳米抗体氨基酸序列中高度保守；主要负责纳米抗体基本结构的完整，后者主要针对不同的抗原出现复杂多样，其是抗原-抗体结合的决定区域。所以成功筛选的纳米抗体在于获得可以介导与抗原特异性结合的互补决定区。纳米抗体中的互补决定区(CDR)根据其在整个抗体中的位置不同，分为三个独立区域，即互补决定区1、互补决定区域2和互补决定区3。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，也可描述为针对EGFP的纳米抗体。

本发明的第二个目的是提供一种EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列。

本发明的第三个目的是提供一种EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列的表达载体的宿主细胞。

为实现本发明的目的，提供如下的技术方案：

本发明的一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，所述抗体在其互补决定区(CDR)1、互补决定区2及互补决定区3分别是含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明的一种增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码序列，其特征在于所述纳米抗体，在其互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

具体来说，本发明的一种能够编码所述EGFP纳米抗体的CDR1-3区域的DNA序列，所述核苷酸序列为分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的序列。

本发明的一种表达载体，其特征在于所述载体含增强绿色荧光蛋白纳米抗体的CDR1-3区域的编码序列，所述CDR1-3区域的编码序列分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的一种大肠杆菌宿主细胞，它含有一种表达载体，所述载体含增强绿色荧光蛋白纳米抗体的CDR1-3区域的编码序列，所述CDR1-3区域的编码序列分别含有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的EGFP纳米抗体互补决定区能够致使所构成的纳米抗体与EGFP蛋白发生良好的特异性结合。

附图说明：

图1表达载体pET28a-EGFP-FLAG构建流程图。

图2含有空载体pET28a或重组质粒pET28a-EGFP-FLAG的表达菌株诱导表达蛋白后，先用结合FLAG标签蛋白磁珠纯化，再经FLAG多肽洗脱，最后用SDS-PAGE蛋白电泳分析。

图3为纳米抗体表达载体pET28a-NB101-His和pET28a-NB control-His构建流程图。

图4为含有空载体pET28a及构建的pET28a-NB101-His和pET28a-NB control-His重组质粒的表达菌株表达蛋白后，经His标签蛋白纯化磁珠纯化，SDS-PAGE蛋白电泳分析后的结果。

图5为免疫共沉淀法分析纳米抗体NB101-His、NB control-His与EGFP结合能力的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实例只用于解释或理解本发明的实质，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

羧基端带有FLAG标签的EGFP重组蛋白的制备过程：

(1)根据编码EGFP的基因序列(参照美国Clontech质粒pEGFP-C1中编码EGFP蛋白的核苷酸序列)，及FLAG标签序列(美国Sigma公司)，人工合成5’端和3’端分别带有Nco1和HindⅢ酶切位点的表达EGFP-FLAG重组蛋白的基因(苏州金唯智生物科技有限公司)，DNA序列如SEQ ID NO:9所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

(2)利用Nco1和HindⅢ双酶(购买于英国New England Biolabs)切获得酶切后的EGFP-FLAGDNA片段和pET28a DNA片段，将EGFP-FLAGDNA片段用T4连接酶(购买于英国NewEngland Biolabs)连接至pET28a表达载体，经过基因序列测定，最终获得正确的pET28a-EGFP-FLAG表达载体。(见图1)

(3)将表达载体pET28a-EGFP-FLAG和对照表达载体pET28a分别转入基因工程菌BL21(购自中国天根公司)，获得表达EGFP-FLAG重组蛋白的工程菌和对照菌，并分别接种至100ml LB培养基中，37℃，250转/分钟摇晃培养至培养液OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG(工作浓度为1mM)，然后在18℃，200转/分钟摇晃培养12h。培养结束后，收集细菌，按照FLAG标签蛋白纯化磁珠(美国Sigma公司)使用说明书，裂解细菌并纯化EGFP-FLAG。

(4)将结合EGFP-FLAG磁珠至于含有FALG多肽(100ug/ml)的PBS溶液中，室温静置10min，进行EGFP-FLAG洗脱。然后收集洗脱液，用10Kda蛋白质超滤管过滤，去除FALG多肽。最后将EGFP-FLAG蛋白溶于PBS溶液。取5μl EGFP-FLAG蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析。(见图2)

实施例2

针对EGFP的纳米抗体筛选过程：

(1)包被抗原：按照PureCube NHS Activated MagBeads(德国cube bioteach公司)说明书，分别制备EGFP-FLAG蛋白和FALG多肽包被的磁珠。

(2)纳米抗体库的预处理：取500μl含有2％(g/ml)脱脂奶粉PBS缓冲溶液(pH7.4)，加入非免疫美国骆驼(llama)纳米抗体噬菌体展示基因库(纳米抗体噬菌体展示基因库构建参照文献：Goldman E R,Anderson G P,Liu J L,et al.Facile generation ofheat-stable antiviral and antitoxin single domain antibodies from asemisynthetic llama library.[J].Analytical Chemistry,2006,78(24):8245-55.)，使溶液中纳米抗体量达到1x 10¹¹pfu，并加入Tween-20(终体积比为0.1％)。混匀后加入20μl经FLAG多肽包被的磁珠，然后室温旋转孵育30min；

(3)含有纳米抗体的噬菌体与EGFP的结合：将上述预处理后的纳米抗体噬菌体溶液转移至新的离心管中，加入20μl包被有EGFP-FLAG的磁珠(EGFP-FALG蛋白量约2μg左右)，然后室温旋转孵育90min；

(4)洗涤：弃去上述纳米抗体噬菌体溶液，用含有0.1％Tween-20PBS溶液洗涤磁珠20次；

(5)洗脱：向含有洗涤后磁珠的离心管中加入100μl 0.1M三乙胺溶液，常温下温和振荡5min，然后加入100μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)，振荡混匀，室温静置5min；

(6)侵染:将洗脱液加入1ml大肠杆菌SS320(美国Lucigen公司)培养液(OD₆₀₀值为0.6)，37℃孵育45min；

(7)加入辅助噬菌体M13K07(购买于英国New England Biolabs)，侵染大肠杆菌SS320(美国Lucigen公司)，37℃孵育45min，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。

(8)将经(7)收集的噬菌体纳米抗体文库按照实施例2的步骤再进行2轮的筛选。

实施例3

纳米抗体的制备

实施例2中，完成第三轮筛选噬菌体侵染后，将大肠杆菌SS320(美国Lucigen公司)涂平板，挑取100个含噬菌体质粒的单克隆进行测序。根据测序结果，选取重复率最高的单克隆(标记为NB101)，所示序列如SEQ ID NO:8，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。通过PCR法和T4连接酶连接法将所选编码纳米抗体的核苷酸序列连接至表达载体pET28a中，具体过程如下：

(1)依据上述测序结果设计用于编码纳米抗体的核苷酸序列的PCR引物：

上游引物GATCCCATGGGC CAA GGT GTC CAG GCT GAG GTG CAG CTC(SEQ ID NO:11)

下游引物GATC CTCGAGGTC TTC GCT GTG GTG CGC TGA GGA G(SEQ ID NO:12)

(2)在上述引物下划线部分引入Nco1和Xho1的限制性酶切位点，以实施列3(1)中所选噬菌体质粒为模板，PCR扩增纳米抗体的DNA片段，然后通过Nco1和Xho1限制性内切酶(购买于英国New England Biolabs)酶切，用T4连接酶(购买于英国New England Biolabs)连接至表达载体pET28a中，经过基因序列测定，获得正确的含有编码纳米抗体核苷酸序列的重组质粒pET28a-NB101-His。(见图3)

(3)随机挑取一个未经过任何筛选的纳米抗体噬菌体基因库侵染大肠杆菌SS320后的单克隆菌株，将其所表达的纳米抗体作为对照抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，并依据实施例3的(1)和实施例3的(2)构建对照纳米抗体表达载体pET28a-NB control-His。(见图3)

(4)将重组质粒pET28a-NB101-His和pET28a-NB control-His分别转化至基因工程菌BL21(中国天根公司)，获得表达融合His标签的纳米抗体的工程菌，并分别接种至100ml LB培养基中，37℃，250转/分钟摇晃培养至培养液OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG(工作浓度为1mM)，然后在18℃，200转/分钟摇晃培养12h。培养结束后，收集细菌，按照His标签蛋白纯化磁珠(购买于中国苏州海狸生物医学工程有限公司)使用说明书，裂解细菌并纯化融合蛋白NB101-His和NB101-control-His。取2μl结合后磁珠进行SDS-PAGE电泳，检测纳米抗体纯化结合效率。(见图2)

实施例4

EGFP细胞裂解液的制备，其步骤如下：

(1)HEK293T细胞转染pEGFP-C1质粒后，培养48h；

(2)细胞经胰酶消化、计数，收集300万细胞，并用PBS缓冲液洗涤3次；

(2)PBS第三次洗涤后，500g离心5min，弃去PBS溶液，将细胞重悬于500μl 1％NP-40裂解液中(50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1％NP-40,1mM EDTA，蛋白酶抑制剂cocktail)，冰浴裂解30min；

(3)将细胞裂解混合物14000g，4℃离心15min；

(4)收集离心后上清溶液，作为EGFP细胞裂解液。

实施例5

免疫共沉淀法检测纳米抗体与EGFP结合能力

(1)依据实施例3获得成功结合了NB101-His和NB control-His的磁珠，各取5μl磁珠，分别置于A管和B管；

(2)向A、B管中分别加入500μl实施例4中所得EGFP细胞裂解液，4℃旋转结合2h；

(3)弃去EGFP细胞裂解液，1％NP-40细胞裂解液洗涤磁珠3次；

(4)弃去洗涤溶液，每管加入20μl SDS上样缓冲液，振荡混匀，沸煮5min；

(5)用蛋白免疫印迹法检测免疫共沉淀后样品中EGFP和纳米抗体蛋白量。(见图5)

序列表

<110> 成都吉罗克林生物科技有限公司

<120> 一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体及其编码序列

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Leu Arg Arg Tyr Met Ser Met

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ser Ser Phe Met Lys Trp Phe

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Leu Arg Thr Ser Phe Ser Thr Ala Pro Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtcttcggc gttatatgag tatg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttcgagtt ttatgaagtg gttt 24

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacttacgga caagtttctc cacggcccca ttg 33

<210> 7

<211> 131

<212> PRT

<213> 美洲驼(Lama glama)

<400> 7

Met Gly Gln Gly Val Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser

20 25 30

Arg Leu Arg Arg Tyr Met Ser Met Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro

35 40 45

Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Gly Ser Ser Phe Met Lys

50 55 60

Trp Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Ser Asp

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Pro Gln Met Asn Arg Met Arg Pro Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Leu Arg Thr Ser Phe Ser Thr Ala

100 105 110

Pro Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His

115 120 125

Ser Glu Asp

130

<210> 8

<211> 393

<212> DNA

<213> 美洲驼(Lama glama)

<400> 8

atgggccaag gtgtccaggc tgaggtgcag ctcgtggagt ctgggggagg cttggtgcag 60

gctggggggt ctctgagact ctcctgtcaa gcctctcgtc ttcggcgtta tatgagtatg 120

ataggctggt tccgccaggc cccagggaag gagcgtgagg gggtcgcgac tattggttcg 180

agttttatga agtggtttta tgcagactcc gtgaaggggc gattcaccgt ctccagtgac 240

aacgccaaga acacggtgta tccgcaaatg aacagaatga gacctgagga cacggccgtt 300

tattactgtt acttacggac aagtttctcc acggccccat tgtggggcca ggggacccag 360

gtcaccgtct cctcagcgca ccacagcgaa gac 393

<210> 9

<211> 752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 60

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 120

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 180

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 240

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 300

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 360

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 420

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 480

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 540

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 600

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 660

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 720

ggtccgatta taaagatgac gacgataaat aa 752

<210> 10

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

245

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatcccatgg gccaaggtgt ccaggctgag gtgcagctc 39

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatcctcgag gtcttcgctg tggtgcgctg aggag 35

<210> 13

<211> 426

<212> DNA

<213> 美洲驼(Lama glama)

<400> 13

atgggccaag gtgtccaggc tgaggtgcag ctcgtggagt ctgggggagg cttggtgcag 60

gctggggggt ctctgagact ctcctgtcaa gcctctggat tcactttcga cgatcctgcc 120

ataggctggt tccgccaggc cccagggaag gagcgtgagg gggtcgcgac tattagtatg 180

agtgatggta gcacattgta tgcagactcc gtgaaggggc gattcaccgt ctccagtgac 240

aacgccaaga acacggtgta tccgcaaatg aacagaatga gacctgagga cacggccgtt 300

tattactgtg cagcatctac tatagcgccc actctattgc gcggggccta tatcttccgc 360

ggggcctata tcttctgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctcagc gcaccacagc 420

gaagac 426

Claims

1.一种增强绿色荧光蛋白（EGFP）的纳米抗体，其特征在于所述纳米抗体的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ IDNO: 3所示。

2.一种编码权利要求1的增强绿色荧光蛋白纳米抗体的核苷酸，其特征在于编码所述纳米抗体的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3的核苷酸分别如SEQ ID NO: 4、SEQID NO: 5及SEQ ID NO: 6所示的序列。

3.一种含有权利要求2所述核苷酸的表达载体。

4.一种含有权利要求3的表达载体的宿主细胞。