CN111995680B - 一种针对egfp标签的纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种针对egfp标签的纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程抗体技术，具体为针对EGFP标签的单域重链抗体，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白，可应用于检测抗体、富集纯化目的蛋白、靶向纳米材料等领域。

Description

一种针对EGFP标签的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程抗体技术，特别是针对增强型绿色荧光蛋白单域重链抗体及其应用。
背景技术
1962年Shimomure等人首次从维多利亚多管发光水母分离出分子量约为27KD的绿色荧光蛋白，其晶体结构显示，它由11个β-折叠链形成一个β桶状结构，两端被短段的a螺旋所覆盖，发色团位于中心同轴的a螺旋上并与α-螺旋通过共价键连接，β桶和α-螺旋形成致密的结构域，完全包裹发色团，阻止其它蛋白进入发色团并使其不受溶剂猝灭效应的影响，因此，其发光性质稳定，热稳定性好，对一些还原剂、氧化剂、有机溶剂甚至蛋白酶等具有显著抗性。绿色荧光蛋白作为当前生命科学研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究与应用价值。还因其自主发光无毒性等特点，在分子标记和示踪成像技术方面有着独特优势。
作为已知的具有最小结合活性的纳米抗体，只有天然的重链可变区区域，与传统的抗体相比，其分子量较小，约为15KD；具有稳定可溶、易表达、免疫原性低、能够很好的识别隐藏表位等优点，在检测、诊断、治疗等领域应用广泛。因此，发展EGFP纳米抗体在基础研究中具有广泛应用。
本发明公开了一种可以与EGFP标签特异性结合的单域重链抗体，可以与HRP酶偶联作为检测抗体并用于对EGFP标签融合蛋白的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够与EGFP标签特异性结合的纳米抗体，可以被用于检测抗体从而检测EGFP标签的工具。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种EGFP纳米抗体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。以及提供了一种还有如SEQ ID NO.2所示核酸序列的载体，和含有该载体的宿主细胞。
本发明提供了EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)表达载体的构建：表达载体pET-25b用NotI、NocI进行双酶切，以F-long与R-long为引物进行PCR扩增获得PCR产物，使用割胶回收试剂盒对目的基因和载体进行回收；按照EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明书构建表达载体，载体与各个片段的摩尔比例在1:2-1:3之间，并将连接产物钙转化至Rosseta感受态细胞中，37℃倒置培养过夜，菌落PCR验证插入片段；
(2)EGFP纳米抗体表达：将pET-25b-EGFP表达菌接种于培养基中培养，当OD600＝0.5左右时，向培养物中加入IPTG诱导剂于20℃进行诱导培养；收集菌体，用PBS重悬沉淀，超声破碎后收集上清，用Ni柱纯化获得EGFP纳米抗体。
本发明还提供了HRP酶偶联EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)HRP酶氧化：将HRP酶溶于HAc-NaAC溶液中，加入NaIO4溶液，4℃避光反应20min；加入乙二醇，4℃避光终止反应20min，离心取上清进行透析；
(2)HRP酶标记：加入待标记抗体，4℃避光旋转混匀4h；加入CH3BHNa，室温反应2h；再加入乙醇胺封闭未结合位点，室温反应30min；
(3)加入终饱和度45％的硫酸铵粉末，4℃静置2h；离心后弃上清用PBS重悬沉淀得到HRP酶标记抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用基因工程技术，将EGFP作为标签与其它蛋白融合，同时将筛选得到的EGFP纳米抗体与HRP酶偶联作为检测抗体对带有EGFP标签的蛋白进行检测，相比于传统的抗体，纳米抗体具有高亲和力、高特异性、高表达性等优点，可以和EGFP标签融合蛋白高效特异性结合，同时又避免了载体本身自带标签影响检测结果。
附图说明
图1为纳米抗体原核表达SDS-PAGE结果；
图2为纳米抗体特异性验证；
图3为融合蛋白SDS-PAGE结果。
图4为HRP检测二抗检测EGFP标签蛋白(间接检测)
具体实施方式
本发明采用固体亲和筛选方法，从EGFP免疫性的纳米抗体基因库中筛选得到高效表达的纳米抗体，与HRP酶偶联检测EGFP标签融合表达蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
本发明筛选得到了一种抗EGFP纳米抗体基因序列，根据序列比对软件Vector NTI分析该克隆株的基因序列，最终得到氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的纳米抗体。
(1)将EGFP抗原用1×CBS稀释，100ul/孔加入酶标板中，4℃过夜；
(2)PBS洗涤3次，加入4％脱脂乳，300μL/孔，37℃恒温培养箱中封闭1h；
(3)PBS洗涤3次，加入噬菌体文库，100μL/孔，于37℃恒温培养箱中孵育1h；
(4)先用PBST洗涤5次，再用PBS洗5次，加入100μL pH 4.0Gly-HCl洗脱液，37℃恒温培养箱中洗脱5min，丢弃洗脱液，再加入100μL pH 2.2Gly-HCl洗脱液，37℃恒温培养箱中洗脱10min；
(5)取洗脱液于1.5mL离心管中，加入15μL Tris-HCl中和，混匀后取10μL洗脱物测洗脱量，其余进行扩增。
DNA序列(SEQ ID NO.2)
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCACCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACCTTCAGTAGGTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGTGAGTTGGTCGCAACTATTAGTCGTCTTCTGACCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGAACATGAACCGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAAAGCCAGTGCGGTGGCGGACCTCGATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGACGGCCAGGCCGGCCAG
编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGSTFSRYAMGWYRQAPGKQRELVATISRLLTTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLNMNRLKPEDTAVYYCKASAVADLDDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAGQ
实施例2
EGFP纳米抗体表达纯化
(1)表达载体的构建：表达载体pET-25b用NotI、NocI进行双酶切，以F-long与R-long为引物进行PCR扩增获得PCR产物，PCR反应50uL体系为：ddH2O 37.5uL，模板1uL，dNTP(2.5mM)4uL，5×PS Buffer 5uL，F-long与R-long引物1uL；反应条件：94℃3min(98℃10s，55℃15s，72℃1min)25cycles，72℃5min，4℃，∞。，共经25个循环。使用割胶回收试剂盒对目的基因和载体进行回收；按照EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明书构建表达载体，载体与各个片段的摩尔比例在1:2-1:3之间，并将连接产物钙转化至Rosseta感受态细胞中，37℃倒置培养过夜，菌落PCR验证插入片段；
(2)挑选单菌落接种于5mL含有氨苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养过夜。次日1％转接至300mL 2YT/Amp培养基中，37℃摇床培养，培养到OD600值达到0.6-1时，加入0.1mM IPTG，30℃摇床培养6h，离心收集菌体。
(3)将菌体破碎以获得抗体粗提液，经镍柱离子亲和层析纯化得到纳米抗体蛋白，SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，结果如图1所示。
表1 PCR引物
Figure BDA0002663298910000051
实施例3
纳米抗体特异性验证
(1)将EGFP、GFP、YFP、BSA、OVA分别稀释至1μg/mL包被于酶标板中，4℃过夜，同时设立阴性对照；次日，4％脱脂牛奶室温封闭1小时；
(2)PBST洗板3次，加入EGFP纳米抗体，于37℃恒温培养箱中孵育30min；
(3)PBST洗板3次，加入HRP酶标二抗，37℃孵育30min；
(4)PBST洗板6次，加入TMB显色液，37℃孵育10min，最后加入终止液终止反应，测OD450。
结果如图2所示，该抗体可以和EGFP、GFP蛋白结合，和YFP、BSA、OVA结合很弱或不结合，表明该抗体特异性良好。
实施例4
HRP酶偶联EGFP纳米抗体
(1)HRP酶氧化：
①将HRP酶溶于HAc-NaAC溶液中(pH5.6)，轻轻混匀，加入10uL NaIO4溶液，4℃避光反应20min；
②加入50uL乙二醇，4℃避光终止反应20min；
③4℃2000r离心5min，取上清，用pH4.4的醋酸钠溶液进行透析；
(2)HRP酶标记：
①将透析好的溶液用0.2M碳酸盐缓冲液调至pH9.5左右；
②加入待标记抗体，4℃避光旋转混匀4h；
③向混合液中加入CH3BHNa，室温反应2h；
④再加入乙醇胺封闭未结合位点，室温反应30min；然后用磷酸盐缓冲液调节至pH7.4左右；
(3)最后加入终饱和度45％的硫酸铵粉末，4℃静置2h；4℃离心后弃上清，用PBS重悬沉淀后即得到HRP酶标记抗体。
实施例5
EGFP标签融合蛋白的制备
(1)EGFP标签表达载体的构建：以pET25b-B13为模板，以PF与PR为引物进行PCR扩增EGFP目的基因，PCR体系为：5×PS Buffer 10μL，DNTP Mix 4μL，PF 0.5μL，PR 0.5μL，Primer star0.5μL，EGFP<100ng，ddH2O Up to 50μL；反应条件为：94℃3min(98℃10s，60℃15s，72℃1min)25cycles，72℃5min，4℃，∞。获得PCR产物，用HindIII和NheI对模板目的基因进行双酶切，使用割胶回收试剂盒回收进行回收；将得到的目的基因与载体按摩尔比3：1体系进行连接，并将连接后的产物钙转化至Rosseta感受态细胞中，菌落PCR验证插入目的片段；
(2)EGFP标签蛋白融合表达：
①将pET25b-B13-EGFP重组表达菌接种于5mL含有氨苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养过夜；
②1％接种过夜菌种至300mL 2YT/Amp培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入0.1mM IPTG，20℃摇床培养12h，离心收集菌体；
③将菌体破碎以获得抗体粗提液；
④经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱，低浓度咪唑洗脱液(20mM)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(200mM)洗脱得到目的蛋白。SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，结果如图3所示，经过洗涤洗脱后，得到分子量约为45KD的蛋白，但有少量的杂蛋白。
实施例6
HRP酶标抗体检测EGFP融合蛋白(直接检测)
(1)将得到的EGFP融合蛋白用CBS稀释至1μg/mL，100μL/孔，包被于酶标板中，4℃过夜，同时设立阴性对照；
(2)PBST洗板3次，4％脱脂牛奶室温封闭1小时；
(3)PBST洗板3次，加入HRP酶标记抗体，于37℃恒温培养箱中孵育30min；
(4)PBST洗板6次，加入TMB显色液，37℃孵育10min，最后加入终止液终止反应，测OD450。
实施例7
HRP酶标抗体检测EGFP融合蛋白(间接检测)
(1)将cry1ac抗原用1×CBS稀释至1μg/mL包被于酶标板中，100μl/孔，4℃过夜；
(2)PBST洗涤3次，加入4％脱脂乳，300μL/孔，37℃恒温培养箱中封闭1h；
(3)PBST洗涤3次，加入EGFP融合蛋白，100μL/孔，于37℃恒温培养箱中孵育30min；
(4)PBST洗涤3次，加入HRP酶标记二抗，100μL/孔，于37℃恒温培养箱中孵育30min；
(5)PBST洗涤6次，加入TMB显色液，100μL/孔，于37℃恒温培养箱中孵育10min；
(6)加入2mol/L H2SO4终止液，50μL/孔，终止反应，酶标仪检测OD450。
序列表
<110> 南昌大佳科技有限公司
<120> 一种针对EGFP标签的纳米抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Arg Leu Leu Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Asn Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Ser Ala Val Ala Asp Leu Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln
115 120 125
Ala Gly Gln
130
<210> 2
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
acctgtgcag cctctggaag caccttcagt aggtatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgtgagtt ggtcgcaact attagtcgtc ttctgaccac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
aacatgaacc gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaaagc cagtgcggtg 300
gcggacctcg atgactactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc ggaacccaag 360
acaccaaaac cacaagacgg ccaggccggc cag 393

Claims (6)

1.一种针对EGFP标签的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。
4.一种包含权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的纳米抗体用于制备针对EGFP标签的检测抗体的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）HRP酶氧化：将HRP酶溶于HAc-NaAC溶液中，加入NaIO4溶液，4℃避光反应20min；加入乙二醇，4℃避光终止反应20min，离心取上清进行透析；
（2）HRP酶标记：加入待标记纳米抗体，4℃避光旋转混匀4h；加入CH3BHNa，室温反应2h；再加入乙醇胺封闭未结合位点，室温反应30min；
（3）加入终饱和度45%的硫酸铵粉末，4℃静置2 h；离心后弃上清用PBS重悬沉淀即得到HRP酶标记抗体。
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