CN112608944B - 一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用 - Google Patents

一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种人源化抗体表达载体的构建方法，将碱基组成如SEQ ID NO:2所示的人源抗体Kappa的轻链恒定区基因序列CL在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H‑Kappa‑CL质粒；将碱基组成如SEQ ID NO:1所示的人源抗体Gamma1的重链恒定区基因序列在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H‑Gamma1‑CH质粒；本发明还公开了一种人源化抗体表达载体的应用方法。该方法实验操作简单，可缩短产品的研发周期，适用于大多数抗体的人源化改造。

Description

一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及人源化抗体的载体构建领域，具体为一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用。
背景技术
由于单克隆抗体的高度特异性，使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断、治疗等领域得到了广泛的应用。基因工程抗体因为其成本低，产量高和易纯化等特点，现已广泛应用于生物制药和体外诊断领域。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷，鼠源性抗体应用于体外诊断时会产生抗鼠抗体反应（HAMA）。为了克服单克隆抗体的这一缺点，利用基因工程技术制备嵌合抗体，人源化抗体等，在尽量保留原有抗体的特异性的前提下减少了抗体中的鼠源成分。
现有技术的人源化抗体表达载体的构建方法实验操作简单一般操作复杂，如中国专利（专利号为ZL201310737306.0）的人源化抗体表达载体及其构建方法，该方法实验操作复杂，还涉及引物的设计和PCR程序设计与操作，一方面对实验室的设备有要求，另一方面，也增加了人源化抗体表达载体的构建难度，不利于产品的降低研发周期时间，因此降低了该方法的适用范围，并且该方法只能适用于有限的抗体的人源化改造。
综上，本领域技术人员亟需一种实验操作简单的人源化抗体表达载体的构建方法，可缩短产品的研发周期，且适用于大多数抗体的人源化改造。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的是开发一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用，为方便鼠源抗体的结构改造，制备了一个含人源Gamma1恒定区基因序列真核表达质粒H-Gamma1-CH，和人源Kappa恒定区基因序列质粒H-Kappa-CL，用于快速进行基因工程抗体的人源化改造。
以解决上述一方面的问题，本发明的技术方案是：
一种人源化抗体表达载体的构建方法，将碱基组成如SEQ ID NO:2所示的人源抗体Kappa的轻链恒定区基因序列CL在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H-Kappa-CL质粒。
优选的，人源抗体Kappa的轻链可变区序列CL编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质。
以解决上述又一方面的问题，本发明的技术方案是：
一种人源化抗体表达载体的构建方法，将碱基组成如SEQ ID NO:1所示的人源抗体Gamma1的重链恒定区基因序列在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H-Gamma1-CH质粒。
优选的，人源抗体Gamma1的重链可变区序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的蛋白质。
以解决上述又一方面的问题，本发明的技术方案是：
一种上述的人源化抗体表达载体的应用方法，将H-Kappa-CL质粒和H-Gamma1-CH质粒转入哺乳动物细胞进行人源化抗体的生产。
优选的，将人源化抗体的轻链可变区和重链可变区使用同源重组的方法分别插入进H-Kappa-CL质粒和H-Gamma1-CH质粒中，然后共同转染进哺乳动物的表达细胞，得到人源化抗体。
进一步，将H-Kappa-CL质粒和H-Gamma1-CH质粒共同转染进哺乳动物表达细胞，培养7天后进行离心，收集细胞上清液，得到人源化抗体。
进一步，使用protein A对所述细胞上清液进行纯化，SDS-PAGE检测人源化抗体的蛋白质结构完整性。
进一步，使用Elisa法检测人源化抗体的效价。
本发明有以下有益效果：
在本发明为方便鼠源抗体的人源化改造，制备了一组含人源抗体Gamma1的重链恒定区基因序列CH和轻链Kappa恒定区基因序列CL两个真核表达质粒H-Gamma1-CH和H-Kappa-CL，用于快速进行基因工程抗体的人源化改造。本发明的方法成功表达得到了人源化抗体，经ELISA检测，也确认本发明得到的人源化抗体的效价正常，可以用于常规检测。本发明的人源化抗体表达载体的构建方法实验操作简单，可缩短产品的研发周期，适用于大多数抗体的人源化改造。
附图说明
图1为本发明的一种人源化抗体表达载体的构建方法构建的人源化抗体转染进哺乳动物表达细胞，得到的人源化抗体蛋白，使用SDS-PAGE得到的凝胶电泳图，目的在于检测抗体蛋白质结构的完整性，其中左边为本发明得到的人源化抗体，右边为蛋白质marker，得到的G-17抗体的重轻链分别在55KD和25KD左右，表明抗体的结构完整。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在实施例1中，选用的人源化抗体是胃泌素17(G-17)单克隆抗体，即G-17单克隆抗体。显而易见的，实施例1的方法，也适用于其他的人源化抗体，并得到与之相关的质粒。
包括以下步骤：
碱基组成如SEQ ID NO:2所示的人源抗体Kappa的轻链恒定区基因序列CL，人源抗体Kappa的轻链可变区序列CL编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质，在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与H-Gamma1-CL真核表达载体使用同源重组法连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到G-17-H-Gamma1-CL质粒。
实施例2
在实施例2中，选用的人源化抗体是胃泌素17(G-17)单克隆抗体。显而易见的，实施例2的方法，也适用于其他的人源化抗体，并得到与之相关的质粒。
碱基组成如SEQ ID NO:1所示的人源抗体Gamma1的重链恒定区基因序列，人源抗体Gamma1的重链可变区序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的蛋白质，在人源抗体Gamma1的DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，然后与H-Gamma1-CH真核表达载体使用同源重组法连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到G-17-H-Gamma1-CH质粒。
实施例3
在实施例3中，将实施例1和实施例2得到两个质粒后进行哺乳动物表达。
包括以下步骤，将质粒共同转染进HEK293哺乳动物表达细胞，培养7天后，进行离心操作，收集细胞上清液。
使用protein A 对细胞上清进行纯化，SDS-PAGE检测抗体蛋白质结构完整性。结果参见图1。
使用Elisa法检测人源化抗体的效价，Elisa法检测人源化抗体的效价实验方法如下：
1）包板：用包被缓冲液将G-17抗原稀释至2μg/ml， ELSIA板的96孔板中加100 μl/well，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xPBS洗涤，拍干；
2）封闭：每孔加200 μl的1% BSA进行封闭，置37℃孵育2 h或4℃过夜。之后弃封闭液；
3）一抗孵育：将抗体稀释20 μg/ml作为起始浓度，再依次5倍梯度稀释（20 μg/ml，4 μg/ml，0.8 μg/ml，0.16 μg/ml，0.032 μg/ml，0.0064 μg/ml），每个梯度加100 μl/well于上述已封闭的反应孔。同时设置好阴性对照孔（加1% BSA）。置37 ℃ 孵育30 min，拍干，用1xPBST洗涤缓冲液以每孔180 μl洗5次，拍干；
4）二抗孵育：加稀释的鼠抗人二抗-HRP(用1% BSA进行稀释)，以100 μl/well加入酶标板孔中，置37 ℃孵育30 min，之后弃液，用1xPBST洗涤缓冲液以每孔180 μl洗5次，拍干；
5）显色反应：于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100 μl（A、B液以1:1现配现用），置37 ℃反应10 min；
6）终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50 μl/well，终止反应；
7）读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中进行450nm/630nm双波长读数，保存数据，进行分析。
结果见表1。
表1 纯化人源化抗体的效价检测
Figure 500128DEST_PATH_IMAGE001
参见图1，图1为本发明得到的人源化抗体的SDS-PAGE凝胶电泳图，从图1中，55KD标样处于G17单克隆抗体重链处，25KD标样处于G17单克隆抗体重链处，可以看出，本发明得到的人源化抗体在55KD和25KD左右均具有典型的条带，表明使用本发明的方法成功表达得到了G-17单克隆抗体。
参见表1，经ELISA检测，确认本发明得到的人源化抗体的效价正常，可以用于常规检测。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或更替，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 杭州博岳生物技术有限公司
<120> 一种人源化抗体表达载体的构建方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccagcacta agggtccgtc ggtgtttcct ctggccccta gcagcaagag cactagcggc 60
ggcactgccg ccctgggctg tttagtcaag gattacttcc ctgagcctgt gactgtcagt 120
tggaatagcg gcgccctgac tagcggcgtg cacactttcc ctgccgtgct gcagagcagc 180
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgact gtgcctagca gcagcctggg cactcagact 240
tacatctgta atgtgaatca caagcctagc aatactaagg tggataagaa ggtggagcct 300
aagagctgtg ataagactca cacttgtcct ccttgtcctg cccctgagct gctgggcggc 360
ccaagcgtat ttctgtttcc tcctaagcct aaggatactc tgatgatcag caggactcct 420
gaggtgactt gtgtggtggt ggatgtgagc cacgaggatc ctgaggtgaa gttcaattgg 480
tacgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagactaagc ctagggagga gcagtacaat 540
agcacttaca gggtggtgag cgtgctgact gtgctgcacc aggattggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gtaaggtgag caataaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa gactatcagc 660
aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag gtgtacactc tgcctcctag cagggatgag 720
ctgactaaga atcaggtgag cctgacttgt ctggtaaagg ggttctaccc tagcgatatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaataatt acaagactac tcctcctgtg 840
ctggatagcg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga ctgtggataa gagcaggtgg 900
cagcagggca atgtgttcag ctgtagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacact 960
cagaagagcc tgagcctgag ccctggcaag tga 993
<210> 2
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggactgtg gccgccccta gcgtgttcat cttccctcct agcgatgagc agctgaagag 60
cggcactgcc agcgtggtgt gtctgctgaa taatttctac cctagggagg ccaaggtgca 120
gtggaaggtg gataatgccc tgcagagcgg caatagccag gagagcgtga ctgagcagga 180
tagcaaggat agcacttaca gcctgagcag cactctgact ctgagcaagg ccgattacga 240
gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac tcaccagggc ctgagcagcc ctgtgactaa 300
gagcttcaat aggggcgagt gttga 325
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Asp Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn
20 25 30
Asn Gly Gly Thr Tyr Leu His Trp Asn His Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Asn Leu Leu Ile Glu Lys Val Ser Asn Arg Phe Ala Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ile Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Thr Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Glu Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu His His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val Tyr Gly Leu Glu Glu Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Gly Gly Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Thr Gly Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Asp Phe Ala Leu Gly Tyr Trp Gly Glu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
His Val Ser Ser
115

Claims (5)

1.一种人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，
将碱基组成如SEQ ID NO:2所示 的人源抗体Kappa的轻链恒定区基因序列CL在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上 HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H-Kappa-CL质粒；
所述人源抗体Kappa的轻链可变区序列CL 编码具有SEQ ID NO .3所示的氨基酸序列的蛋白质；
将碱基组成如SEQ ID NO:1所示 的人源抗体Gamma1的重链恒定区基因序列在DNA序列5’端加上EcoRⅠ酶切位点，3’端加上 HindⅢ酶切位点，然后与真核表达载体连接，得到H-Gamma1-CH质粒；
所述人源抗体Gamma1的重链可变区序列编 码具有SEQ ID NO .4所示的氨基酸序列的蛋白质。
2.一种以权利要求1所述方法构建的人源化抗体表达载体的应用方法，其特征在于，
将H-Kappa-C质粒和H-Gramma1- CH质粒转入哺乳动物细胞进行人源化抗体生产；
将人源化抗体的轻链可变区使用同源重组的方法插入进H-Kappa-CL质粒中，将人源化抗体的重链可变区使用同源重组的方法插 入H-Gamma1-CH质粒中，然后共同转染进哺乳动物的表达细胞，得到人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将H-Kappa-CL质粒和H-Gamma1-CH质粒共同转染进哺乳动物表达细胞，培养7天后进行离心，收集细胞上清液，得到人源化抗体。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，使用protein A对所述细胞上清液进行纯化，SDS-PAGE检测人源化抗体的蛋白质结构完整性。
5.根据权利要求3或4所述的应用方法，其特征在于，使用Elisa法检测人源化抗体的效价。
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