CN103898141B - 人源化抗体表达载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人源化抗体表达载体及其构建方法，是通过将含有2A序列的轻链的恒定区基因序列CL-2A和重链的恒定区基因序列CH，分别与pMD18-T载体连接得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒，将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体双酶切后连接得到含CL-2A的真核表达载体，再与pMD18-T-CH质粒连接而得到含CL-2A-CH的真核表达载体。本发明的表达载体构建方法只需要将鼠源或者人源抗体的可变区序列插入到相应的位点就能快速构建全长的完整抗体序列，简单实用，用于快速构建嵌合抗体，人源化抗体等。
Description
技术领域
本发明属于载体构建领域，具体地说，本发明涉及一种人源化抗体表达载体及其构建方法。
背景技术
由于单克隆抗体的高度特异性，使其在细胞生物学、基础医学、临床诊断、治疗等领域得到了广泛的应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷，鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA)等,会妨碍其在临床上的应用。为了克服单克隆抗体的缺点，利用基因工程技术制备嵌合抗体，人源化抗体等，在尽量保留原有抗体的特异性的前提下减少了抗体中的鼠源成分。
目前构建嵌合抗体，完整的人源化抗体等一般需要先扩增出人源性抗体的轻重链恒定区基因，然后通过重叠PCR的方法与所需表达抗体的可变区相连后再构建至表达载体中，该过程比较费时、费力。
另外目前常用的噬菌体抗体库等筛选方法所筛选出来的抗体一般为ScFv，Fab等，还需要进一步构建全长的完整抗体。
发明内容
基于此，本发明克服了上述现有技术的缺陷，提供了一种完整的人源化抗体的表达载体的快速构建方法。
一种人源化抗体表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将碱基组成如SEQIDNO:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQIDNO:7所示的重链γ1的恒定区基因序列CH分别与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒；
(2)将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体；
(3)将步骤(2)的含CL-2A的真核表达载体和步骤(1)的pMD18-T-CH质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。
在其中一个实施例中，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的：
将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQIDNO:1和SEQIDNO:3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。其中，
CL上游引物：AAGCTTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT(SEQIDNO:1)，含有HindIII酶切位点；
CL下游引物1：
CCAACTTGAGCAGGTCAAAGTTCAAAAGCTGCTATGAACATTCTGTAGG(SEQIDNO:2)
CL下游引物2：
GGATCCGGGCCCAGGATTGGACTCAACGTCCCCCGCCAACTTGAGCAGGTCAA(SEQIDNO:3)，含有BamHI酶切位点；
CL下游引物1、2中包含了2A的序列，由于2A的序列较长，因此使用两次PCR反应以便把完整的2A的基因序列添加到CL链的末端。
在其中一个实施例中，所述第一次PCR扩增的反应体系为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。
在其中一个实施例中，所述第二次PCR扩增的反应体系为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。
在其中一个实施例中，所述重链γ1的恒定区基因序列CH是通过以下步骤制备得到的：
以全长人源性质粒H为模板，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为扩增引物，进行PCR扩增，得到重链γ1的恒定区基因序列CH。其中：
CH上游引物：CTCGAGGCCTCCACCAAGGGCCCAT(SEQIDNO:4)
CH下游引物：TCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGGA(SEQIDNO:5)。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，30个循环后，72℃延伸10min。
在其中一个实施例中，所述连接体系为：
pMD18-T载体0.5μL
CL-2A/CH4.5μL
SolutionⅠ5μL
所述连接条件为22℃连接5h。
在其中一个实施例中，步骤(1)-步骤(3)中所述转化包括以下步骤：
(a)于30μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入2μL连接产物，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min；
(b)42℃水浴热激90s；
(c)迅速转移到冰浴中放置2min；
(d)加入1mLLB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；
(e)取100μL培养液涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。
在其中一个实施例中，步骤(2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1。
本发明还提供了上述构建方法构建得到的人源化抗体表达载体。
本发明的人源化抗体表达载体是通过在人源性抗体的轻重链恒定区基因末端添加具有自我裂解功能的口蹄疫病毒(FMDV)2A肽段构建而得的。由于口蹄疫病毒(FMDV)2A具有剪切效率高，上下游基因表达平衡性好，以及结构短小等优点，使2A蛋白成为构建串联表达多蛋白的理想工具。本发明的表达载体构建方法只需要将人源抗体的可变区序列插入到相应的位点就能快速构建全长的完整抗体序列，简单实用，用于快速构建嵌合抗体，人源化抗体等。
附图说明
图1为本发明实施例1中经两次PCR扩增后得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱；
图2为本发明实施例1中经PCR扩增后得到重链γ1的恒定区基因序列CH的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱；
图3为构建的表达载体pcDNA3.1-CL-2A-CH的酶切的鉴定图谱；
图4为本发明实施例1构建的表达载体的图谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1人源化抗体表达载体的构建
包括以下步骤：
1、扩增含2A的轻链λ的恒定区基因CL-2A
(1)根据轻链λ的恒定区基因序列来设计引物，引物序列如下：
CL上游引物：AAGCTTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT(SEQIDNO:1)，含有HindIII酶切位点(斜体碱基)
CL下游引物1：
CCAACTTGAGCAGGTCAAAGTTCAAAAGCTGCTATGAACATTCTGTAGG(SEQIDNO:2)
CL下游引物2：
GGATCCGGGCCCAGGATTGGACTCAACGTCCCCCGCCAACTTGAGCAGGTCAA(SEQIDNO:3)，含有BamHI酶切位点(斜体碱基)；
CL下游引物1、2中包含了2A的序列，由于2A的序列较长，因此使用两次PCR反应以便把2A的基因序列添加到CL链的末端。
(2)按照说明书，利用淋巴细胞分离液(invitrogen)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(灏洋生物)提取总RNA，利用反转录试剂盒(invitrogen)将RNA反转录成单链cDNA，反应分两步进行：
1)在PCR管中，RNA10μl，DEPC水21μl，枪头吹打均匀，70℃保温5min，立即冰上放置，防止RNA复性。
2)在以上体系中加入以下试剂，进行RT-PCR反应，反应体系如表1：
表1RT-PCR反应体系
合成程序：37℃保温60min，72℃保温10min，合成得到单链cDNA。
以单链cDNA为模板为模板，进行第一次PCR扩增，反应体系如表2所示。
第一次PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后，胶回收PCR产物。
(3)以第一次PCR扩增的PCR产物为模板进行第二次PCR反应以合成完整的2A序列，扩增体系如表3所示。
第二次PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后，胶回收PCR产物。电泳图谱如图1所示，从图1可以看出，在400bp左右具有明显条带，与目的片段大小（378bp）一致，表明成功扩增出了CL-2A基因。经测序，确认得到的序列为CL-2A基因序列，其碱基组成如SEQIDNO:6所示。
2、扩增重链γ1的恒定区基因CH
(1)根据重链γ1的恒定区基因序列来设计引物，引物序列如下：
CH上游引物：CTCGAGGCCTCCACCAAGGGCCCAT(SEQIDNO:4)
CH下游引物：TCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGGA(SEQIDNO:5)
(2)以全长人源性质粒H(可于暨南大学购买得到)为模板扩增重链γ1恒定区基因，扩增体系如表4。
PCR扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，30个循环后,72℃延伸10min。取5μL反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后，胶回收PCR产物。电泳图谱如图2所示，从附图中可以看出，在1000bp左右具有明显条带，与目的片段大小（993bp）一致，表明成功扩增出了CH基因。经测序，确认得到的序列为CH基因序列，其碱基组成如SEQIDNO:7所示。
3、与pMD18-TVector连接得到pMD18-T-CL-2A和pMD18-T-CH
(1)将鉴定正确的轻重链恒定区分别于同pMD18-TVector进行连接，22℃连接5h，连接反应体系如表5。得到连接产物pMD18-T-CL-2A和pMD18-T-CH。
表5连接体系
(2)连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆摇菌培养，克隆载体利用试剂盒小量提取后37℃酶切过夜验证，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定并将鉴定的阳性克隆送进行测序。转化包括以下步骤：
a)于30μLDH5α感受态细胞中加入2μL连接产物，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min；
b)42℃水浴热激90s；
c)迅速将管转移到冰浴中放置2min；
d)每管加入1mLLB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；
e)取100μL培养液涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。
酶切体系如表6，表7。
4、CL-2A与表达载体pcDNA3.1连接得到pcDNA3.1-CL-2A
将CL-2A与表达载体pcDNA3.1进行连接得到连接产物pcDNA3.1-CL-2A，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。连接反应如表8。
酶切体系如表9。
5、pcDNA3.1-CL-2A与CH连接得到pcDNA3.1-CL-2A-CH
将pcDNA3.1-CL-2A与CH双酶切后进行连接得到连接产物pcDNA3.1-CL-2A-CH，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。连接反应如表10。
酶切体系如表11。
图3为构建的表达载体pcDNA3.1-CL-2A-CH的酶切（HindIII、XbaI和XhoI）鉴定图谱，从图3可以看出，在1000bp和400bp左右具有明显条带，与CL-2A和CH的大小一致，表明CL-2A和CH成功构建到pcDNA3.1载体上。
鉴定正确后对得到的目的产物pcDNA3.1-CL-2A-CH(人源化抗体表达载体)进行测序，该表达载体的序列如SEQIDNO:8所示，该表达载体的图谱如图4所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将碱基组成如SEQIDNO:6所示的含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A与碱基组成如SEQIDNO:7所示的重链γ1的恒定区基因序列CH分别与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到pMD18-T-CL-2A质粒和pMD18-T-CH质粒；
(2)将pMD18-T-CL-2A质粒和真核表达载体分别用HindIII和BamHI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含CL-2A的真核表达载体；
(3)将步骤(2)的含CL-2A的真核表达载体和步骤(1)的pMD18-T-CH质粒分别用XhoI和XbaI进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得人源化抗体表达载体。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A是通过以下步骤制备得到的：
将健康人淋巴细胞的总RNA，反转录成单链cDNA，以单链cDNA为模板，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为扩增引物，进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；以所述PCR产物为模板，SEQIDNO:1和SEQIDNO:3为扩增引物，进行第二次PCR扩增，得到含有2A序列的轻链λ的恒定区基因序列CL-2A。
3.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应体系为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。
4.根据权利要求2所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，所述第二次PCR扩增的反应体系为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。
5.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，
步骤(1)中所述连接体系为：
pMD18-T载体0.5μL
CL-2A/CH4.5μL
SolutionⅠ5μL
所述连接条件为22℃连接5h。
6.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，
步骤(1)-步骤(3)中所述转化包括以下步骤：
(a)于30μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入2μL连接产物，轻轻旋动以混匀，冰中放置30min；
(b)42℃水浴热激90s；
(c)迅速转移到冰浴中放置2min；
(d)加入1mLLB培养基，于37℃，160rpm振荡培养1h；
(e)取100μL培养液涂布到含有Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培养过夜。
7.根据权利要求1所述的人源化抗体表达载体的构建方法，其特征在于，
步骤(2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1。
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