CN109402127A - 一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用 - Google Patents

一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及眼科学和生物技术领域，具体是一组与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的高亲和力核酸适配体。本发明是基于SELEX技术筛选得到的一条特异性识别CTGF的高亲和力核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的性能。所述的该组核酸适配体具有广阔的应用前景，可用于复杂体系中CTGF的捕获、体内外CTGF的检测以及在相关疾病中CTGF治疗药物的开发和靶向给药系统的构建等。本发明的核酸适配体面向实际应用具有巨大的潜力。

Description

一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体 及其应用
技术领域
本发明涉及眼科学和生物技术领域，具体地说，是一组与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用。
背景技术
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年来新发现的一种细胞因子，是高度保守的CCN家族成员之一。CTGF在人类多种组织器官中广泛表达，其在促进细胞增殖、刺激细胞迁移、介导细胞粘附、血管生成、软骨形成、骨骼发育、肿瘤的发生发展、组织修复和器官纤维化等生理和病理活动中发挥着非常重要的生物学功能。CTGF的表达水平与许多疾病相关，现已经成为多种疾病重要的诊断和治疗靶点。因此，迫切需要发展特异性识别CTGF的配体分子，从而为临床疾病中CTGF诊断试剂的制备、中和药物的开发和靶向给药系统的构建奠定基础，以及为基础研究中CTGF的捕获、富集和纯化提供有效的工具。
核酸适配体作为一种新型的生物识别分子，能够高特异识别并结合靶分子。它是通过指数富集性配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)从体外构建的随机核酸文库中筛选获得的ssDNA或者RNA分子。核酸适配体由于可化学合成、易于标记和修饰、识别靶标广泛、不受免疫原性和免疫条件的限制、高亲和力和强特异性等优点，可用于特定靶分子的分离、检测、活体内传递、中和药物开发等，在分析诊断和医药研究等领域中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体。本发明的另一目的是提供该组核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中；在制备CTGF捕获、富集和纯化的制剂中；在制备CTGF相关临床疾病的诊断试剂、靶向传递系统、中和或阻断药物中等多方面的应用。
本发明通过SELEX技术筛选得到了与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的亲和力、特异性、结构稳定性等性能，为复杂体系中CTGF的捕获和体内外CTGF检测试剂的制备及相关疾病中CTGF靶向给药系统构建和治疗药物的开发提供了一组特异性强、稳定性高、易于制备和修饰的高亲和力的生物识别分子。
本发明的主要技术方案是：1)通过磁珠SELEX技术筛选获得了一条与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体；2)通过突变优化提高了该核酸适配体的亲和力；3)通过截短优化获得了该核酸适配体的核心序列，并进一步提高了其靶向亲和力；4)通过锁核酸替代显著改善了该核酸适配体的结构稳定性等。为CTGF相关的实验室技术的开发、临床诊断方法的发展和核酸药物的挖掘提供了有效的工具。
本发明的第一方面，提供了一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，其序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.11(表1)所示。
表1
本发明的第二方面，提供一组如上所述的核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。
进一步的，所述的试剂、试剂盒或传感器可用于快速检测体内外的CTGF。
本发明的第三方面，提供了一组如上所述的核酸适配体在制备CTGF捕获、富集和纯化制剂中的应用。
进一步的，所述的制剂可以用于识别和捕获复杂样品中的CTGF，也可用于复杂体系中CTGF的富集和纯化。
本发明的第四方面，提供一组如上所述的核酸适配体在开发CTGF相关临床疾病早期诊断新方法中的应用。
进一步的，所述的早期诊断新方法可用于CTGF相关疾病的早期快速诊断。
本发明的第五方面，提供一组如上所述的核酸适配体在构建相关临床疾病靶向给药系统中的应用。
进一步的，所述的靶向给药系统是基于上述核酸适配体与CTGF特异性识别、结合和解离的作用，可用于药物的靶向运输和定点释放等。
本发明的第六方面，提供一组如上所述的核酸适配体在制备中和或阻断CTGF的药物中的应用。
进一步的，所述的核酸适配体在制备用于治疗或者缓解CTGF介导的恶性肿瘤、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、椎间盘退化、动脉粥样硬化、心血管疾病及器官纤维化等疾病药物中的应用。
本发明优点在于：
本发明通过将CTGF蛋白固定在磁珠表面，基于磁珠SELEX技术进行核酸适配体的筛选。获得了一条与CTGF高亲和力、强特异结合的核酸适配体，并通过突变、截短和锁核酸替代等一系列的优化策略进一步改善核酸适配体的亲和力、特异性和结构稳定性等性能。该组核酸适配体作为特异性识别并结合CTGF的生物识别分子，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、免疫原性低、制备成本低、易修饰和标记等优势。该组核酸适配体具有广阔的应用前景，可用于复杂体系中CTGF的捕获、体内外CTGF的检测以及在相关疾病中CTGF治疗药物的开发和靶向给药系统的构建等。
因此，本发明的核酸适配体面向实际应用具有巨大的潜力。
附图说明
图1.CTGF蛋白核酸适配体筛选示意图。
图2.结合CTGF蛋白的ssDNA回收率。
图3.核酸适配体APT1与CTGF的结合解离曲线。
图4.核酸适配体APT1与生物标志物结合的相对信号图。
图5.核酸适配体APT1M6与CTGF的结合解离曲线。
图6.核酸适配体APT1M6T与CTGF的结合解离曲线。
图7.核酸适配体APT1M6TL与CTGF的结合解离曲线。
图8.核酸适配体APT1M6TL与生物标志物结合的相对信号图。
图9.核酸适配体在97％人血清中的半衰期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.CTGF在羧基修饰的磁珠表面的固定
CTGF蛋白被固定在磁珠表面主要是基于蛋白N端的氨基与磁珠表面羧基的酰胺化反应，其具体过程为：(a)取400μL(10mg/mL)的磁珠用1mL的耦合缓冲液(25mM MES,pH＝5)冲洗3遍。再分别称取25mg的EDC和NHS，溶于600μL的耦合缓冲液后，并立刻加入到清洗好的磁珠中，充分混匀，室温旋转孵育60min后，用1mL的耦合缓冲液漂洗三次，得到活化的磁珠。(b)取200μL活化的磁珠，加入10μg的CTGF蛋白，室温旋转孵育30min。孵育结束后，用200μL的耦合缓冲液漂洗二次后，加入1M乙醇胺封闭10min，再用筛选缓冲液(含5mM MgCl2,0.01％Tween-20的D-PBS)漂洗三次后，重悬于200μL的筛选缓冲液中，4℃保存，作为正向筛选的磁珠。(c)在剩余的200μL活化的磁珠中加入乙醇胺溶液，室温旋转孵育60min。反应结束后，用筛选缓冲液漂洗数次，也重悬于200μL的筛选缓冲液中，4℃保存，用作反向筛选。
实施例2.随机ssDNA文库及其引物的构建
1.构建长度为80个核苷酸的随机ssDNA文库
5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-(N)40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40个核苷酸的随机序列(SEQ ID No.12)。
2.引物的构建
上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′(SEQ ID No.13)
下游引物1：5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ ID No.14)
下游引物2：5′-poly(dA20)-Spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(SEQ IDNo.15)。
实施例3.CTGF核酸适配体的筛选
如图1所示，为了获得与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，共进行了10轮筛选。为了提高筛选的效率，从第5轮开始引入反向磁珠进行负筛选。同时，为了提高筛选的特异性，在正向孵育的体系中逐步加入游离的反向靶分子(如表2所示)进行共孵育。每一轮筛选过程中的核酸适配体与CTGF蛋白结合的回收率如图2所示，从而有效的监控筛选的进展。
具体筛选过程为：(1)取50μL CTGF磁珠，用筛选缓冲液漂洗3次，加入封闭缓冲液(含0.1mg/ml yeast tRNA,1mg/mL BSA的筛选缓冲液)室温旋转孵育30min。(2)将ssDNA文库溶解于筛选缓冲液，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min后，加入到已封闭的磁珠中，室温低速旋转孵育。(3)孵育结束后，用筛选缓冲液漂洗数次，磁性分离，去除未结合的ssDNA，再加入100μL的无菌水，95℃水浴10min后，回收与CTGF特异性结合的ssDNA。(4)将洗脱下来的ssDNA作为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：10μL的Hot start premix(5x)；2.5μL的上、下游引物(10μM)；5μL的模板；最后加入无菌水，补充体系至50μL，共40管。扩增条件为：94℃，预变性1min；95℃，变性30s；60℃，退火30s；72℃，延伸30s；最后72℃，再延伸2min；共20个循环。(5)向扩增好的PCR文库中加入尿素变性的上样缓冲液，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min后，上样至12％尿素变性的聚丙烯酰氨凝胶孔中，在300V恒定电压下电泳。(6)电泳结束后，在干净的平皿中加入20ml ddH2O和5μL核酸荧光染料，充分混匀后将凝胶放置其中，在水平摇床上轻轻震荡，染色20min。(7)将聚丙烯酰胺凝胶放置在凝胶成像系统上成像，切胶回收下端ssDNA文库至2mL的试管中，加入1.5mL的ddH2O，沸水煮胶30min，离心回收上清液。(8)通过 II试剂盒回收纯化上清液中的ssDNA，并重溶于筛选缓冲液中进行下一轮筛选。
根据上面的筛选过程和表2的协议重复进行，至第10轮时，停止筛选，将富集的文库进行测序，获得了核酸适配体APT1。
表2
实施例4.生物膜干涉技术测定分子间相互作用
生物膜干涉技术是一种免标记的分子间相互作用的分析方法。其原理是仪器发射白光到传感器表面，光通过传感器的生物膜层后会发生透射与反射，反射光的频率会受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光与入射光会产生相长干涉，而另一些受到了相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到，形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相对位移强度显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度。即当固定在传感器生物膜上的核酸适配体与溶液中的CTGF结合时，引起生物膜层厚度增加，因而产生相对位移，这个相对位移随着CTGF蛋白结合量的增加而增加，最后达到一个平衡状态并实时给出相应的结合或者解离曲线。
(1)将生物素标记的核酸适配体用筛选缓冲液溶解并稀释至2.5μM，95℃水浴10min，冰浴猝冷5min，室温放置5min，以促使其重新折叠成最佳的空间结构。
(2)将200μL筛选缓冲液、核酸适配体和CTGF蛋白分别加入到96孔板中，链霉亲和素芯片按照仪器设定的程序依次浸入到各反应孔中，经过平衡1.5min，核酸适配体固化5min，漂洗2min，再次平衡1.5min，结合5min和解离5min六个步骤。
(3)各核酸适配体传感器分别与靶蛋白CTGF和非特异性靶分子thrombin,TNF-α,LCN 1,LCN 2,SEMA 3A及BSA进行相互作用。结果如图3所示，核酸适配体APT1与CTGF结合的亲和力常数为233nM。同时，核酸适配体APT1与其他生物标志物几乎不结合(图4)，表明了APT1是CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体分子。
实施例5.核酸适配体优化与鉴定
为了能够进一步改善核酸适配体的性能，位点突变、序列截短和锁核酸替代等优化策略分别被引进。基于QGRS Mapper的预测，我们发现核酸适配体APT1能够折叠成G-四聚体结构。为了进一步提高该结构的稳定性，我们首先对APT1序列进行了突变优化。如表1所示，APT1M1–APT1M8均显示它们具有更高的结构稳定性。然而，亲和力结合实验表明，仅有APT1M6显示出更高的靶向亲和力(图5，KD＝13.4nM)，APT1M2和APT1M3几乎没有改变，而APT1M1、APT1M4、APT1M5、APT1M7和APT1M8的结合亲和力发生了显著降低。为了进一步获得核酸适配体APT1M6的核心序列，我们对其进行了截短优化，获得了核酸适配体APT1M6T。亲和力结合实验显示，APT1M6T的靶向亲和力被进一步提高至1.14nM(图6)，这可能是由于降低了其空间位阻效应，导致结合位点被充分暴露，进而能够与靶分子更加紧密的结合。
锁核酸一种类寡核苷酸衍生物，其结构中β-D-呋喃核糖的2'-O和4'-C位通过缩水作用形成刚性的结构，从而增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。为了进一步提高该核酸适配体的稳定性，我们将锁核酸引入APT1M6T的序列中，获得了核酸适配体APT1M6TL。如图7所示，APT1M6TL不仅与靶蛋白CTGF保持着高强度的结合亲和力(KD＝1.52nM)，而且显示出更好的靶向特异性(图8)。同时，我们又进一步检测这些核酸适配体在97％人血清中的抗核酸酶的降解能力。首先，将核酸适配体与人血清混合，于37℃孵育，并在不同的时间节点分别取出20μL与尿素变性的上样缓冲液混匀，于-20℃保存。待所有的样本收集结束后，95℃水浴5min，室温放置5min。随后，取10μL的样品加入到15％尿素变性的聚丙烯酰氨凝胶孔中，在80V恒定电压下电泳2.5h。电泳结束后，凝胶染色20min，并于凝胶成像仪上进行成像和定量。最终，将每个时间节点的核酸适配体的残留量以0小时含量为100％进行归一化处理。如图9所示，尽管最初的核酸适配体APT1具有较强的抗酶降解能力(t1/2＝13h)，而突变和截短优化策略进一步延长了APT1M6(t1/2＝20h)和APT1M6T(t1/2＝28h)在血清中的半衰期，这可能是由于它们折叠成的G-四聚体结构越来越稳定。随着锁核酸的引入，核酸适配体APT1M6TL在血清中的半衰期又被显著延长至60h，这可能是因为锁核酸能够稳定核酸适配体的高级结构，即形成相对刚性化的结构；同时，锁核酸也能够封闭核酸酶切割的位点，从而使APT1M6TL的结构稳定性被显著增加。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
<120> 一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用
<130> /
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
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Claims (8)

1.一组与CTGF特异性结合的高亲和力核酸适配体，其序列分别如SEQ ID No.1～SEQID No.11所示。
2.一组如权利要求1所述的核酸适配体在制备CTGF检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。
3.一组如权利要求1所述的核酸适配体在制备CTGF捕获、富集和纯化制剂中的应用。
4.一组如权利要求1所述的核酸适配体在开发CTGF相关临床疾病的早期快速诊断新方法中的应用。
5.一组如权利要求1所述的核酸适配体在构建相关临床疾病靶向给药系统中的应用。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体在构建相关临床疾病靶向给药系统中的应用，其特征在于，所述的靶向给药系统是基于所述的核酸适配体与CTGF特异性识别、结合与解离的作用，用于药物的靶向运输和定点释放。
7.一组如权利要求1所述的核酸适配体在制备中和或阻断CTGF的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的核酸适配体在制备用于治疗或者缓解CTGF介导的恶性肿瘤、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎、椎间盘退化、动脉粥样硬化、心血管疾病及器官纤维化疾病药物中的应用。
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