CN1589403A - 测定结缔组织生长因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测和测量结缔组织生长因子(CTGF)的方法以及诊断和检测多种CTGF相关疾病和紊乱。

Description

测定结缔组织生长因子的方法

本申请要求2001年9月18日提交的美国临时申请序列号60/323,305的权利，此临时申请全部纳入本文供参考。

                            发明领域

本发明涉及结缔组织生长因子(CTGF)的检测和测量以及各种CTGF相关疾病和紊乱的诊断和检测。

                            发明背景

结缔组织生长因子(CTGF)是有丝分裂、趋化和胞外基质诱导因子用于成纤维细胞和其它结缔组织细胞或其它能产生胞外基质的细胞。CTGF多肽和基因序列鉴定自一些种类，包括人。(参见例如Ryseck等，(1991)Cell Growth Differ 2：225-233；国际出版号WO 00/27868，2000年5月18日出版；Bradham等，(1991)J Cell Biol114：1285-1294)。人CTGF是1047个核苷的可读框编码的349个残基多肽，相对全长cDNA，起始位点在约核苷130且TGA终止位点在约核苷1177。(参见例如，美国专利号5,408,040；GenBank登录号NP001892)

病理上，CTGF参与的情况中结缔组织过度生长且胞外基质过度沉积，包括疾病如纤维化和皮肤及主要器官的过度创伤、癌症、全身硬化症、血管发生、动脉硬化、动脉粥样硬化症、糖尿病肾病和肾高血压。(参见例如，美国专利号5,408,040；国际出版号WO 01/15729，2001年3月8日出版)此外，CTGF片段与一些生物活性相关。(参见例如，国际出版号WO 00/36939，2000年10月12日出版；国际出版号WO 00/36936，2000年6月22日出版；美国专利号5,876,730；Brigstock等，(1997)J Biol Chem 272：20275-20282；Ball等，(1998)Biol Reprod59：828-835)

尽管存在关于CTGF及其不同生物活性和疾病相关联的知识，没有可靠检测区别和不同于CTGF片段的CTGF的方法和测量确定生物样品中CTGF和CTGF片段水平的方法。例如，目前检测CTGF的方法依赖肝素分离和浓缩CTGF多肽，或包括不区分多种CTGF片段的ELISA试验。(参见例如，Sato等，(2000)J Rheumatology27：149-153；Tamanti等，(1998)Biochem Biophys Res Commun 251：748-752；和Riser等，(2000)J Am Soc Nephrol 11：25-38)

因此，需要有助于检测、测量和测量生物样品中CTGF和多种CTGF形式如CTGF片段水平的试验系统。具体的是，需要选择性鉴定不同于CTGF的具体CTGF片段的方法，可鉴定和测量不同疾病状态中包含的具体CTGF片段。

                             发明概述

本文描述了检测CTGF和CTGF片段的方法，测量CTGF和CTGF片段水平的方法，诊断、确定预测和监控多种CTGF相关情况、疾病或紊乱疗效的方法。

一方面，本发明提供了检测CTGF的方法。在一个实施方案中，所述方法包括检测样品中CTGF N-末端片段的存在，其中CTGF N-末端片段不同于CTGF C-末端片段和CTGF。在另一个实施方案中，所述方法包括检测样品中CTGF C-末端片段的存在，其中CTGF C-末端片段不同于CTGF N-末端片段和CTGF。在另外一个实施方案中，在另一个实施方案中，所述方法包括检测样品中CTGF的存在，其中CTGF不同于CTGF N-末端和C-末端片段。

发明进一步提供测量CTGF水平的方法。一方面，所述方法包括测量样品中CTGFN-末端片段的水平，其中CTGF N-末端片段不同于CTGF C-末端片段和CTGF。另一方面，所述方法包括测量样品中CTGF C-末端片段的水平，其中CTGF C-末端片段不同于CTGF N-末端片段和CTGF。另外一方面，所述方法包括测量样品中CTGF的水平，其中CTGF不同于CTGF N-末端和C-末端片段。

在一些实施方案中，所述方法包括使样品接触第一种特异性结合CTGF区域的试剂、分离试剂、测量结合的CTGF的水平。此外，所述方法可进一步包括加入第二试剂，它选自特异性结合第一试剂的第二试剂或特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF区域的第二试剂、除去未结合的第二试剂、测量结合的第二试剂的量。在具体实施方案中，第一和第二试剂是抗CTGF抗体，结合CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的不同区域。在其它具体实施方案中，第一或第二试剂是任选连接载体的肝素。

本发明还涉及诊断CTGF相关疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括获得样品、测量样品中CTGF N-末端片段的水平并与CTGF N-末端片段的标准水平比较，其中样品中CTGF N-末端片段量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。在另一个实施方案中，所述方法包括获得样品、测量样品中CTGF C-末端片段的水平并与CTGF C-末端片段的标准水平比较，其中样品中CTGF C-末端片段量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。在另外一个实施方案中，所述方法包括获得样品、测量样品中CTGF的水平并与CTGF的标准水平比较，其中样品中CTGF量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。例如，样品中CTGF N-末端片段增加也许指示纤维化疾病如肾纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、硬皮病和炎性关节疾病。

还提供了预测CTGF相关疾病的方法。一方面，所述方法包括获得样品、检测样品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的水平，与标准水平比较，其中确定水平和标准水平间的差异指示CTGF相关疾病的预测。例如，样品中相较标准更高水平的CTGF N-末端片段可指示情况较差的预测，如癌症、糖尿病、器官移植、腹膜透析或心肌梗塞。

还提供了监控CTGF相关疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在时间第一点从受试者中获得第一个样品，在时间第二点从受试者中获得第二个样品，比较第一个样品中CTGF N-末端片段的水平和第二个样品中CTGF N-末端片段的水平，其中第一个样品中CTGF N-末端片段水平和第二个样品中CTGF N-末端片段水平间的差异指示CTGF相关疾病的进展。同样考虑类似的方法，其中比较第一个和第二个样品中CTGF C-末端片段的水平或CTGF的水平。

本发明还涉及监控治疗CTGF相关疾病的疗法功效的方法。在多种实施方案中，所述方法包括从受试者获得样品，受试者患CTGF相关疾病并接受对此疾病的`治疗；测量样品中CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平和标准水平，其中样品中确定的水平和标准水平间的差异指示CTGF相关疾病疗法的疗效。另一方面，标准水平通过测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平来确定，样品在较早时间点或治疗开始前从相同受试者获得。

在任何前述方法中，样品可获自任何来源。一方面，样品获自哺乳动物，在一个具体实施方案中哺乳动物是人。在一个实施方案中，样品可以是体液如尿或血浆。此外，检测或测量CTGF的方法可结合另外标记的检测和测量以进一步确定对受试者情况的诊断、预测等。例如，测量尿中清蛋白分泌率与测量CTGF N-末端片段结合，可进一步确定肾疾病。

发明进一步提供用于检测CTGF的存在或测量CTGF水平的试剂盒。所述试剂盒可用于例如诊断CTGF相关疾病。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种第一试剂和至少一种第二试剂，第一试剂与CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段特异反应，第二试剂被标记且能形成与CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或第一试剂的复合体。在一些具体实施方案中，第一和第二试剂是抗CTGF抗体，结合CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的不同区域。在其它具体实施方案中，第一或第二试剂是任选连接载体的肝素。在一个具体实施方案中，第二试剂与CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段竞争结合第一试剂。

发明还试剂筛选化合物的方法，该化合物影响CTGF或CTGF N-末端片段或CTGFC-末端片段的水平。在一些方面，所述方法包括获得样品、测量样品中CTGF或CTGFN-末端片段或CTGF C-末端片段的第一种水平、使样品与化合物接触、测量CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的第二种水平；比较第一种和第二种水平，其中第一种水平和第二种水平间的差异指示化合物，化合物影响CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平。

本发明进一步涉及方法用于鉴定CTGF相关疾病的诱因。在一些方面，所述方法包括获得样品、测量样品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的第一种水平、比较样品中N-末端片段、C-末端片段或CTGF的水平和标准水平，其中样品中CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF量增加或减少指示CTGF相关疾病的诱因。

本发明进一步涉及方法用于确定具体疾病是否与CTGF相关，即鉴定CTGF相关疾病。在一些实施方案中，所述方法包括从患具体疾病的受试者中获得样品、测量样品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的水平、比较此水平和标准非疾病水平，其中第一个样品中水平和标准非疾病水平间的差异指示CTGF相关疾病疗法的存在。疾病可与CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF水平增加相关联；或与CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF水平减少相关联。

                              附图简述

图1A、1B和1C列出CTGF分子结构、具体试验的描述和本发明的示范试剂。图1A显示编码CTGF的多核苷酸转录物的外显子结构、CTGF蛋白质的结构域结构、特异性结合CTGF N-末端或C-末端片段上抗原表位的示范抗体试剂。图1B显示蛋白质印迹，证明试剂特异性结合CTGF N-末端片段或C-末端片段的特异性。图1C显示本发明考虑的不同双重试剂“夹层(sandwich)”试验模式和可用于各试验的示范试剂。

图2列出的数据显示ELISA(酶联免疫吸附)测定的特异性，此测定检测与CTGFN-末端片段和C-末端片段不同的CTGF(N-C夹层试验)水平。

图3列出的数据显示ELISA测定的特异性，此测定检测与CTGF C-末端片段不同的CTGF和CTGF N-末端片段(N-N夹层试验)水平。

图4列出的数据显示ELISA测定的特异性，此测定检测与CTGF N-末端片段不同的CTGF和CTGF C-末端片段(C-C夹层试验)水平。

图5A、5B和5C通过蛋白质印迹分析列出数据显示细胞培养物上清中CTGF和CTGF片段的水平。

图6列出的结果证明正常人中CTGF N-末端片段的稳定性高于CTGF。

图7A和7B列出的数据显示透析液中CTGF N-末端片段的水平，透析液获自进行腹膜透析的受试者。患者诊断为患1型糖尿病、肾小球肾炎或多囊纤维化。

图8列出的数据显示与正常、健康个体相比，获自肾纤维化患者血清样品中CTGF和CTGF片段的水平。纤维化的主要原因诊断为移植排斥、化学毒性或自身免疫纤维化。

图9列出的数据显示血清样品中CTGF和CTGF片段的水平，样品获自器官移植患者和慢性器官移植排斥的患者。

图10列出数据显示与正常、健康个体相比，心肌梗塞或进行性肝纤维化患者血清中CTGF和CTGF片段的水平。

图11列出数据显示与正常血清相比，炎性关节疾病个体的滑液中CTGF和CTGF片段的水平。

图12A和12B列出数据显示玻璃状液中CTGF和CTGF片段的水平，玻璃状液来自患多种眼病的受试者。

图13列出数据显示血清样品中CTGF N-末端片段的水平，样品获自患多种癌症的个体。

图14A和14B列出数据显示1型糖尿病个体的尿中CTGF N-末端片段的水平。图12A显示1型糖尿病患者中CTGF N-末端片段的水平，患者无蛋白尿、少量蛋白尿或大量蛋白尿。图12B显示示1型糖尿病患者中尿CTGF N-末端片段水平和白蛋白分泌到尿中速度间的相互关系。

图15显示人CTGF的核酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。结构域用方框和阴影表示，且鉴定如下：IGF-BP(胰岛素样生长因子结合蛋白基序)、VWC(Von Willebrand C型结构域)和TSP1(1型血小板反应蛋白结构域)。还显示了相邻外显子的边界。

图16显示人CTGF的氨基酸序列(hCTGF；SEQ ID NO：2)和直向同源的母牛(bCTGF)、猪(pCTGF)、大鼠(rCTGF)和小鼠(FISP12)CTGF序列间的对比。序列对比用CLUSTALW多序列对比程序进行(v.1.74；Thompson等，(1994)Nucleic Acids Res22：4673-4680)。

                           发明的描述

在描述本发明的组合物和方法前，要理解本发明不限于所述具体方法、操作、细胞系、试验和试剂，因为这些可以变化。也要理解本文所用术语旨在描述本发明具体实施方案，附加权利要求中所列的不想限制本发明范围。

必须指出，除非上下文另有明确说明，本文和附加权利要求中使用的单数形式包括复数。因此，例如“一种片段”包括这种片段的复数，“抗体”指一种或更多抗体和本领域技术人员已知的其等价物等。

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的意义与此发明所属领域普通技术人员普遍理解的相同。尽管与本文所述类似或相同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，现在描述优选方法、装置和材料。本文所引用的所有出版物全部纳入供参考，用于描述和揭示出版物中报导的方法、试剂和工具，出版物可用与发明相关使用。本文不允许发明由于以前的发明而不能使此公告提前。

除非另有说明，本发明会使用化学、生物化学、分子生物、细胞生物、遗传学、免疫学和药理学的常规方法，在本领域技术范围内。这些技术在文献中充分得到解释。参见例如Gennaro(1990) Remington药物科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第18版，Mack Publishing公司；Colowick等， 酶学中的方法(MethodsIn Enzymology)，Academic Press有限公司；Weir和Blackwell(1986) 实验免疫 学手册(Handbook of Experimental Immunology)，I-IV卷，Blackwell ScientificPublications：Maniatis等，(1989) 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第2版，I-III卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等，(1999) 分子生物简短操作(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版，John Wiley&Sons；Ream等，(1988) 分子生物技术：强化实验室课程(Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course)，AcademicPress；Newton和Graham(1997) PCR(PCR)(生物技术入门系列)，第2版，SpringerVerlag)。

定义

“结缔组织生长因子”或“CTGF”指充分纯化的CTGF的氨基酸序列，纯化CTGF获自任何种类，具体是哺乳动物包括大鼠、兔、牛、绵羊、猪、鼠、马，特别是人类，且来自任何来源，天然、合成、半合成或重组。

一方面，“结缔组织生长因子”或“CTGF”之多肽序列，包括至少部分CTGF N-末端片段和至少部分CTGF C-末端片段。

涉及CTGF或任何变体或其片段中所用术语“N-末端片段”和“N-片段”指任何含序列的多肽，序列获自CTGF多肽氨基末端部分。CTGF N-末端片段可包括所有、没有或部分从起始甲硫氨酸残基到无半胱氨酸“铰链”区域的CTGF。此外，CTGF N-末端片段可包括所有、没有或部分胰岛素生长因子-结合蛋白基序和/或von Willebrand C型结构域。CTGF N-末端片段可包括所有、没有或部分无半胱氨酸的区域。另外，CTGF N-末端片段可以是15个或更多任何上述定义CTGF N-末端片段中包含的连续氨基酸。

一方面，CTGF的“N-末端片段”或“N-片段”指获自人CTGF氨基末端部分的多肽序列。这种片段可包括从SEQ ID NO：2的氨基酸残基1到约氨基酸残基198的全部区域，或从SEQ ID NO：2的约氨基酸23到约氨基酸198。铰链区域中N-末端片段的边界可任选由SEQ ID NO：2中定义的一些蛋白酶之一来确定，如SEQ IDNO：2的残基179和180间、残基182和183间、残基188和189间的胰凝乳蛋白酶切割位点；SEQ ID NO：2的残基183和184间、残基196和197间的纤溶酶切割位点；SEQ ID NO：2的残基169和170间的骨形态发生蛋白-1切割位点。此外，人CTGF的N-末端片段可包括所有、没有或部分从SEQ ID NO：2的氨基酸27到氨基酸97、SEQ ID NO：2的氨基酸103到氨基酸166或SEQ ID NO：2的氨基酸167到氨基酸198的区域。另外，人CTGF的N-末端片段可以是15个或更多任何上述定义CTGF N-末端片段中包含的连续氨基酸。

在具体实施方案中，本发明的CTGF N-末端片段包括的序列选自下列人CTGF(SEQ ID NO：2)区域和其获自不同种类的直向同源片段，具体是哺乳动物种类包括大鼠、兔、牛、绵羊、猪、鼠和马：氨基酸残基23到氨基酸残基96(外显子2编码)；氨基酸残基27到氨基酸残基97(IGF-BP基序)；氨基酸残基97到氨基酸残基180(外显子3编码)；氨基酸残基103到氨基酸残基166(VWC结构域)；氨基酸残基167到氨基酸残基198(无半胱氨酸的铰链)，不被相应CTGF C-末端片段包括；氨基酸残基23到氨基酸残基180(外显子2和3编码)；氨基酸残基27到氨基酸残基166(IGF-BP和VWC结构域)；氨基酸残基23到氨基酸残基198。

CTGF的“C-末端片段”和“C-片段”是指包含CTGF多肽羧基末端部分序列的任何多肽或其任何变体或片段。C-末端片段可包括所有、没有或部分从无半胱氨酸铰链区域到蛋白质末端的CTGF。此外，C-末端片段可包括所有、没有或部分1型血小板反应蛋白结构域和/或半胱氨酸-结基序。另外，CTGF C-末端片段可以是15个或更多任何上述定义CTGF C-末端片段中包含的连续氨基酸。

一方面，CTGF的“C-末端片段”和“C-片段”指获自人CTGF羧基末端部分的多肽序列。这种片段可包括从SEQ ID NO：2的氨基酸残基181到约氨基酸残基349的全部区域。铰链区域中C-末端片段的边界可任选由SEQ ID NO：2中定义的一些蛋白酶之一来确定，如上面定义的胰凝乳蛋白酶、纤溶酶和骨形态发生蛋白-1切割位点。此外，人CTGF C-末端片段可包括所有、没有或部分从SEQ ID NO：2的氨基酸201到氨基酸242、SEQ ID NO：2的氨基酸247到氨基酸349、SEQ ID NO：2的氨基酸248到氨基酸349或SEQ ID NO：2的氨基酸249到氨基酸346的区域。另外，人CTGF C-末端片段可以是15个或更多任何上述定义CTGF C-末端片段中包含的连续氨基酸。

在具体实施方案中，本发明的CTGF C-末端片段包括的序列选自下列人CTGF(SEQ ID NO：2)区域和其获自不同种类的直向同源片段，具体是哺乳动物种类包括大鼠、兔、牛、绵羊、猪、鼠和马：氨基酸残基181到氨基酸残基251(外显子4编码)；氨基酸残基201到氨基酸残基242(1型血小板反应蛋白基序)；氨基酸残基252到氨基酸残基349(外显子5编码)；氨基酸残基249到氨基酸残基346(半胱氨酸结结构域)；氨基酸残基167到氨基酸残基198部分(无半胱氨酸的铰链)，不被相应CTGF N-末端片段包括；氨基酸残基201到氨基酸残基346(TP1和CK结构域)；氨基酸残基247到氨基酸残基348；氨基酸残基248到氨基酸残基348。

术语CTGF的“无半胱氨酸区域”或“铰链区域”指任何获自人CTGF(SEQ ID NO：2)约氨基酸残基167到约氨基酸残基198的多肽和获自不同种类的直向同源片段，具体是哺乳动物种类包括大鼠、兔、牛、绵羊、猪、鼠和马。

术语“氨基酸序列”或“多肽”或“几种多肽”在本文中指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列以及它们的片段，指天然产生或合成的分子。多肽或氨基酸片段是任何多肽部分，保持至少一种多肽结构和/或功能特征。CTGF片段包括任何CTGF多肽序列部分，保持至少一种CTGF结构或功能特征。“氨基酸序列”指天然产生蛋白质分子的多肽序列，“氨基酸序列”和类似术语不打算将氨基酸序列限于所讨论蛋白质分子相关的完整天然序列。

术语“核酸”或“多肽”或“几种多肽”指寡核苷酸、核苷序列或多核苷酸或它们的任何片段，指天然或合成来源的DNA或RNA，DNA或RNA可以是单或双链且可代表正义和反义链，指肽核酸(PNA)，或指天然或合成来源的任何DNA-类似或RNA-类似物质。多核苷酸片段是任何多核苷酸序列部分，保持至少一种多核苷酸结构或功能特征。多核苷酸片段可以有不同长度，例如大于60个核苷长度、至少100个核苷长度、至少1000个核苷长度或至少10,000个核苷长度。

“改变的”多核苷酸包括不同核苷酸的缺失、插入或取代，这将产生编码相同或功能相等多肽的多核苷酸。该定义包括具有多态性的序列，此多态性容易或不容易用特定的寡核苷酸探针检测，或通过不合适或不需要的等位基因与不同于受试者多核苷酸序列正常染色体基因座的基因座的杂交的缺失来检测。

“改变的”多肽可包含缺失、插入或取代氨基酸残基，产生沉默变化且导致功能相等多肽。只要保持编码多肽的生物或免疫活性，仔细考虑的氨基酸取代可在残基极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质相似性基础上进行。例如，负电荷氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；有类似亲水值的具无电荷极性头部基团的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。

多肽或氨基酸“变体”是从具体氨基酸序列改变一个或更多氨基酸的氨基酸序列。多肽变体可以有保守性变化，其中取代氨基酸结构或化学性质类似被取代氨基酸，如用异亮氨酸取代亮氨酸。变体也可有保守性变化，其中取代氨基酸物理性质不同于被取代氨基酸，如用色氨酸取代甘氨酸。类似的小变化也可包括氨基酸缺失或插入或两者都有。优选的是，氨基酸变体保持特定多肽的一些结构或功能特征。可发现确定取代、插入或缺失哪些氨基酸残基的指南，例如使用本领域熟知的计算机程序，如LASERGENE软件(DNASTAR有限公司，Madison，WI)。

多核苷酸变体是特定多核苷酸序列的变体，优选与特定多核苷酸序列有至少约80％的多核苷酸序列相似性，更优选至少90％，最优选至少95％。本领域技术人员赞同遗传密码简并性的结果是可产生多种编码具体蛋白质的不同多核苷酸序列，一些携带与任何已知和天然产生基因的多核苷酸序列最小同源性。因此，发明考虑各个可能的多核苷酸序列变化，变化可在可能的密码子选择基础上通过选择组合来产生。这些组合是根据标准三密码子遗传密码，且所有这些变化被具体揭示。

“缺失”是氨基酸或核苷序列中的变化，导致一个或更多氨基酸残基或核苷的缺乏。

术语“插入”或“加入”指多肽或多核苷酸序列中的变化，与天然产生分子相比，分别导致一个或更多氨基酸残基或核苷的加入。

术语“功能等价物”在本文中指拥有至少一种特定多肽或多核苷酸的功能和/或结构特征的多肽或多核苷酸。功能等价物可包含能行使具体功能的修饰。术语“功能等价物”确定为包括分子的片段、突变体、杂合体、变体、类似物或化学衍生物。

术语“微阵列”指任何分子排列，如底物上的核酸、氨基酸、抗体等。底物可以是任何适当载体，如珠、玻璃、纸、硝化纤维、尼龙或任意合适的膜等。底物可以是任何刚性或半刚性载体，包括但不限于膜、过滤器、干胶片、芯片、载玻片、纤维、珠，包括磁性或非磁性珠、胶、管、平板、聚合物、微粒、毛细管等。底物可提供包被表面和/或具有多种表面形式，如核酸、氨基酸等可结合的孔、钉、渠、通道和孔隙。

“抗原性”是指当底物被引入体内时刺激免疫应答和生成抗体的能力。表现抗原性特征的试剂被称为抗原的。抗原试剂可包括但不限于多种大分子，例如蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、细菌和细菌成分以及病毒和病毒成分。抗原片段指CTGF多肽片段，优选约五到十五个氨基酸长度的片段，此片段保持至少一种CTGF多肽活性的生物或免疫方面。

“免疫原性”指引起生物体免疫应答的能力。表现免疫原性特征的试剂被称为免疫原性的。免疫试剂可包括但不限于多种大分子，例如蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、细菌和细菌成分以及病毒和病毒成分。免疫原试剂通常有相当高的分子量(常大于10kDa)。免疫原片段指CTGF多肽片段，优选约五到十五个氨基酸长度的片段，此片段保持至少一种CTGF多肽活性的生物或免疫方面。

术语“抗体”指获自任何来源的免疫球蛋白或抗体，包括细胞系活动物如小鼠、大鼠、兔、鸡、火鸡、山羊、马、人等。抗体也可获自遗传改变的细胞或转基因植物或改造以产生非宿主内源抗体的动物。抗体可以是任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4或IgM。此外，术语“抗体”包括完整分子和其片段，如能结合抗原决定簇的Fab、F(ab’)₂和Fv片段，且包括多克隆或单克隆抗体。抗体也可指嵌合抗体，如结合一个或更多独特抗原的二价和三价抗体。

结合CTGF或CTGF片段的抗体可用完整多肽或含感兴趣小肽的片段作为免疫抗原来制备。用于免疫动物的多肽或寡肽可获自RNA翻译或化学合成，如需要可结合载体蛋白质。普遍使用的载体化学偶联肽，肽包括例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白(KLH)。

术语“紊乱”和“疾病”都可以使用且指任何偏离正常的情况。

本文所用短语“CTGF相关疾病”指与CTGF异常或不适当表达或活性相关的情况和疾病。CTGF异常表达与细胞增殖疾病相连，如由内皮细胞增殖或移动引起的疾病、肿瘤类似生长、总组织创伤以及以胞外基质不适当沉积为特征的不同疾病。

CTGF相关疾病包括但不限于含血管发生和其它增殖过程的疾病，这些增殖过程在例如动脉硬化症、青光眼等情况中发挥关键作用；癌症，包括急性成淋巴细胞白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、乳腺癌结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织癌以及前列腺、卵巢、结肠直肠、胰腺、胃肠和肝癌及其它肿瘤和转移。

此外，CTGF相关疾病包括但不限于来自局部或全身纤维化的过多创伤，包括慢性或急性器官纤维化如肾、肺、肝、眼、心脏、皮肤等。这种CTGF疾病包括多种纤维化疾病，例如心脏纤维化，包含心肌梗塞或心脏充血衰竭后的心脏反应纤维化或心脏改造；肺病，包括间质性肺纤维化等；透析相关纤维化，包括腹膜透析如连续移动腹膜透析(CAPD)；硬膜外纤维化；肾纤维化；肺纤维化；间质纤维化；皮肤纤维化；急性或重复损伤导致的纤维化，包括手术、化疗、放疗、同种异体移植排斥、慢性和急性移植排斥(如肾、肝或其它器官)；闭塞性细支气管炎，如肺移植后；炎症和感染，如由于疾病或损伤引起。

另外，CTGF相关疾病包括但不限于硬化情况，包含全身硬化症、硬皮病、瘢痕瘤、肥大性创伤、其它皮肤病和情况；动脉硬化症，如含动脉粥样硬化斑的情况和糖尿病相关的动脉硬化症，包括腹膜透析相关的动脉硬化症；动脉硬化；关节炎，包括风湿性关节炎、骨关节炎和其它关节发炎情况等；间质疾病，包括间质纤维化；克罗恩氏病；肠发炎病；视网膜病，包括例如增殖性玻璃体视网膜病、非增殖性糖尿病视网膜病、增殖性糖尿病视网膜病和斑状降解(包括年龄相关和青少年疾病(斯塔加特病)和猪上皮细胞分离)；肾病，包括糖尿病肾病、IgA-相关肾病、毒性引起的肾病等；化学毒性小管破坏相关的情况。

本文所指“增殖性”过程和疾病包括以细胞连续增殖为特征的病理状态，导致组织中细胞群过度生长。细胞群不必须是转化、肿瘤或恶性细胞，但也可包括正常细胞。例如，CTGF可参与病态，通过诱导动脉壁内膜层中的增殖性损伤或通过刺激新血管形成来导致动脉硬化症。

“癌”指任何组织的自发生长，包括不受控制、异常的细胞生长，或指任何不限制生长的恶性肿瘤，通过侵入局部扩增且通过转移全身扩增。癌也指癌引起的任何异常状态。

术语“纤维化”指纤维状组织的异常加工、或纤维瘤或纤维状降解。纤维化可来自不同损伤和疾病，常可来自涉及不同器官移植的慢性移植排斥。纤维化一般包括胞外基质成分的异常产生、积聚或沉积，含例如胶原和纤连蛋白的过度产生和沉积增加。本文所用最广泛意义的“纤维化”指任何胞外基质蛋白质的过度产生或沉积。有许多纤维化例子，包括心脏病发作后形成创伤组织，损害心脏泵的能力。糖尿病常引起肾中的损伤/创伤，导致肾功能逐渐损失。甚至手术后，创伤组织可形成内部器官，引起挛缩、疼痛和一些情况中的不育。主要器官如心脏、肾、肝、眼和皮肤易受慢性创伤，通常与其它疾病相关。肥大性创伤(非恶性组织块)是烧伤和其它损伤引起的普通纤维化形式。此外，一些其它纤维增殖疾病包括硬皮病、瘢痕瘤和动脉粥样硬化症，分别与总组织创伤、皮肤中肿瘤类似生长或持续的血管创伤相关，血管创伤损害血液携带能力。

本文所用术语“样品”具最广泛的意义。样品可获自任何来源，来自体液、分泌、组织、细胞或培养的细胞，培养细胞包括但不限于唾液、血、尿、血清、血浆、玻璃体、滑液、脑脊液、羊水和器官组织(如活组织切片检查的组织)；来自染色体、细胞器官或其它分离自细胞的膜；来自基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA等；来自清除的细胞或组织，或来自这种细胞或组织的印迹或特征。样品可获自任何来源，例如人类受试者、非人的哺乳动物试验品等。同样考虑获自任何动物疾病模型的样品。样品可指任意适于测试CTGF或CTGF片段存在的方法，或适于筛选结合CTGF或其片段的分子的方法。获得这些样品的方法在本领域技术水平内。

术语“杂交”指核酸序列通过碱基配对结合互补序列的过程。确定杂交条件可通过例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺浓度或通过杂交温度，这些条件在本领域熟知。杂交可在不同严格条件下发生。

具体的是，降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或提高杂交温度可增强严格性。例如为了本发明目的，高严格条件下的杂交可在约50％甲酰胺中在约37℃到42℃发生，和在严格性降低条件下在约35％到25％甲酰胺中约30℃(2到35℃发生。具体是，杂交一般在最高严格性条件中42℃发生，在50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切和变性鲑精DNA中。

对应于具体严格性水平的温度范围可进一步由本领域一直方法限制，例如通过计算感兴趣核酸的嘌呤和嘧啶比例和相应调节温度。为除去非特异信号，可连续洗印迹，例如在室温或至60℃，包括60℃，在严格性增加条件下至0.1 X SSPE和0.5％SDS。上述范围和条件上的变化在本领域熟知。

发明

本文发现可检测和进一步测量CTGF具体片段，不取决于CTGF或其它CTGF片段。本发明提供方法可靠检测和测量生物样品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平。此外，诊断、预测和确定不同疾病和情况的进展，例如糖尿病；纤维化包括肝、肾和肺纤维化；心肌梗塞；炎性关节疾病；癌症；全身硬化症；血管发生；动脉硬化、动脉粥样硬化；移植排斥；不同眼病，包括糖尿病视网膜病；限制和扩散的硬皮病；肾高血压；和腹膜透析相关情况等，也可用本文所述组合物和方法完成。

结缔组织生长因子

先前报导和描述结缔组织生长因子(CTGF)。(参见例如，美国专利号5,408,040；Bradham等，(1991)J Cell Biol 114：1285-1294)。CTGF是单体多肽，分子量约为36到38kDa。CTGF是最近描述的半胱氨酸-丰富分泌蛋白质家族成员，此家族称为CCN生长因子家族(CTGF，Cyr-61，nov)，特征是不同模块结构域中存在高度保守的半胱氨酸残基。这些结构域各自由单独外显子编码，表现出与多种胞外基质蛋白质中所发现保守区域的同源性。具体是，这些CTGF中的模块结构类似胰岛素类似生长因子结合蛋白N-末端半胱氨酸-丰富区域(CTGF结构域1，外显子2编码)；寡聚化中包含的Von Willebrand C型结构域(CTGF结构域2，外显子3编码)；1型血小板反应蛋白基序，可包含细胞附着区域且认为参与结合胞外基质和硫酸化糖缀合物(CTGF结构域3，外显子4编码)；C-末端半胱氨酸节基序，类似参与受体结合的神经生长因子、转化生长因子-β(TGF-β)和血小板获得生长因子(PDGF)(CTGF结构域4，外显子5编码)。(Bork(1993)FEBS Lett 327：125-130)

CTGF不同片段显示表现出生物活性。(参见例如美国专利号5,876,730；Brigstock等，(1997)J Biol Chem 272：20275-20282；Ball等，(1998)Biol Reprod59：828-835；Steffen等，(1998)Growth Factors 15：199-213；国际申请号WO00/35939和国际申请号WO 00/35936)CTGF片段也在人生物液体以及培养牛内皮细胞的条件培养基中被检测到，人生物液体例如获自怀孕血清、羊水和腹膜液。(Yang等，(1998)J Clin Endocrinol Metab 83：2593-2596；Boes等，(1999)Endocrinology 140：1575-1580)。

CTGF作用于促进成纤维细胞和其它结缔组织细胞增殖、趋化现象、移动、粘附和胞外基质形成。证据表明CTGF的异常表达或过度生成在导致纤维化疾病途径中发挥主要作用，包括主要器官纤维化、纤维增殖疾病和创伤。CTGF在多种细胞类型中产生效果，包括例如结缔组织细胞(如成纤维细胞、肌成纤维细胞等)、血管内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、血管平滑肌细胞和更特化的结缔组织细胞，如骨、软骨和其它支持骨骼组织。(参见例如Moussad和Brigstock(2000)MolGenet Metab 71：276-292)

本说明涉及发现一些CTGF片段水平在某些情况中增加。在一个具体方面，本发明证明在某些情况中CTGF N-末端片段比CTGF或CTGF C-末端片段更容易检测，如在生物液体中等。尽管发明不限于任何具体CTGF片段积聚的机制，N-末端片段也许更稳定，因为它们更不易被蛋白水解、更不易清除或除去、和/或更不倾于非特异性结合或吸收。因此，检测CTGF N-末端片段可提供更好的特异性和重复性用于阐明此多肽的作用机制和位点。此外，本说明确定CTGF的异常水平，具体是CTGFN-末端片段，可与疾病存在和疾病严重性相关。

因此，一方面，本发明涉及使用CTGF多肽N-末端片段以检测(定性或定量)CTGF和预测、诊断及治疗监控CTGF相关疾病。另一方面，本发明涉及使用CTGF多肽C-末端片段以检测(定性或测量)CTGF和预测、诊断及治疗监控CTGF相关疾病。CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段可以本发明提供的一些方式检测、鉴定和测量。

在一些实施方案中，本发明考虑CTGF C-末端片段和N-末端片段是具体CTGF C-末端和N-末端片段的变体，它们可通过突变编码感兴趣片段的多核苷酸序列来构建以产生自然中不出现的氨基酸序列。氨基酸改变可在不同种类(可变位置)亚基或高度保守区域(恒定区)中不同位点进行。这些位置的位点通常被连续修饰，如首先通过保守取代(如疏水性氨基酸到不同的疏水性氨基酸)且随后用更远的取代(如疏水性氨基酸到带电氨基酸)，接着可在靶位点进行缺失或插入。

本文所述多肽，例如用于产生CTGF N-末端或CTGF C-末端特异抗体的多太，可用任何本领域已知的许多方法来合成至少部分所需CTGF氨基酸序列N-末端或C-末端片段。例如肽可通过固相技术合成、从树脂裂开并通过制备的高效液相色谱来纯化。合成肽的组成可通过例如氨基酸分析、质谱或测序来确定。

聚合酶链式反应(PCR)也可用于产生CTGF和其片段的氨基酸序列变体。当少量模板DNA用作起始物质时，与模板DNA相应区域序列稍微不同的一种或几种引物可生成所需氨基酸变体。PCR扩增产生DNA片段产物群，在引物特异位置与编码CTGF或其片段的多核苷酸模板不同。DNA片段产物取代质粒中相应区域且产生所需氨基酸变体。产生氨基酸变体的进一步技术包括Well等，(1985，Gene 34：315)描述的盒突变技术和其它本领域熟知的突变技术，例如Maniatis，T等，同上和Ausubel，F.M等，同上所述技术。

在发明的另外实施方案中，本发明的CTGF多肽的编码序列可用本领域熟知化学方法全部或部分合成。(参见例如Caruthers等，(1980)Nucleic Acids Symp Ser7：215-223；Crea和Horn(1980)Nucleic Acids Res 9：2331；Matteucci和Caruthers(1980)Tetrahedron Letters 21：719；Chow和Kempe(1981)NucleicAcids Res 9：2807-2817)

CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的检测

本发明提供检测和/或测量样品中CTGF多肽水平(如CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)的方法。提供的方法不限于检测和测量人CTGF多肽，但可用于检测其它种类的CTGF，例如检测和测量非人的哺乳动物CTGF。(见图16)例如，检测和测量CTGF，包括来自相同和不同种类的内源CTGF和外源CTGF，可用于CTGF相关疾病和其它不同疾病的动物模型。一方面，提供检测生物样品中CTGF的方法，所述方法包括获得样品和检测样品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段。另一方面，提供测量生物样品中CTGF水平的方法，所述方法包括获得样品和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平(参见例如图1C)。

一方面，试验是在检测CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的基础上，使用抗这些多肽的抗体。(参见例如图1A)试验也包括以核酸为基础的试验(通常在杂交基础上)，或任何其它本领域已知的多种分析技术。在一个较佳实施方案中，本方法特征是本发明多肽(CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)被多肽特异抗体结合的能力和产生抗本发明蛋白质的抗体结合CTGF多肽的能力。本文考虑领域中检测CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的其它标准方法。例如，可使用任何与CTGF或CTGF片段结合或相互作用的试剂，如肝素、CTGF或CTGF片段的受体、或任何其它CTGF结合剂。

根据本发明，多种免疫测定技术可用于检测和测量样品中CTGF和CTGF片段的水平。在一个实施方案中，ELISA测定用于鉴定和区分CTGF和不同CTGF片段的水平并比较具体样品中CTGF和不同CTGF片段的量。在一些实施方案中，ELISA测定可用于检测、测量和比较CTGF和CTGF片段的水平，CTGF和CTGF片段发现于培养细胞的条件培养基中以及血、血清、血浆、腹膜流出物、尿、玻璃体、滑液、脑脊液、唾液和其它需要检测和测量CTGF和CTGF片段的生物样品。

在一些方面，改进和更敏感的检测和测量CTGF通过与CTGF C-末端片段或CTGF检测相比的CTGF N-末端片段检测来获得。使用CTGF N-末端片段可检测疾病严重性，可更精确的诊断、预测和监控CTGF相关疾病的疗效。

本发明提供的方法也用于检测和测量任何CCN多肽家族成员(例如CTGF、CYR61、Nov、Elm1/WISP-1、HICP/rCOP-1、CTGF-3/WISP-2和WISP-3)和其片段，检测、诊断、预测和监控CCN多肽家族成员相关多种疾病和紊乱的疗效。(参见例如Brigstock(1999)Endocrine Reviews 20：189-206；Perbal(2001)Mol.Pathol.54：57-79)。

抗体

在本发明较佳实施方案中，检测、测量、诊断、预测、监控和评估疾病和紊乱的方法和其与CTGF或其片段表达或活性增加或减少相关的治疗处理包括使用与CTGF抗原表位或抗原表位特异反应的抗体。

用于产生适当抗体的多肽可以多种方式生成，例如通过生成合成肽、酶裂解CTGF(如用胰凝乳蛋白酶处理)、化学裂解CTGF、重组表达CTGF或其片段、或从人或其它哺乳动物来源分离。因此，表达CTGF的细胞(如MG-63细胞)、用CTGF编码序列转染的宿主细胞、纯化CTGF、CTGF C-末端片段、CTGF N-末端片段或其抗原表位可用作免疫原引起动物宿主中的免疫应答已产生所需CTGF区域的特异抗体。对于重组生成的多肽，适当表达载体和系统是本领域技术人员已知的且包括真核和原核表达系统，例如Maniatis等，同上和Ausubel等，同上所述。

可评估靶多肽例如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段以确定高免疫原性区域。分析和抗原表位选择的方法在本领域熟知。(参见例如Ausubel等，同上)分析和选择也可通过例如多种软件包完成，如LASERGENE NAVIGATOR软件。(DNASTAR；Madison，WI)用于诱导抗体生成的肽或片段应该是抗原性，但不必须是生物活性。优选的是，抗原片段或肽至少五个氨基酸长度，更优选至少十个氨基酸长度，最优选至少十五个氨基酸长度。优选的是，抗体-诱导片段或肽与至少部分靶多肽的氨基酸序列相同，如CTGF N-末端区域或结构域或CTGF C-末端区域或结构域。模拟至少部分天然产生靶多肽序列的肽或片段也可融合其它蛋白质，如匙孔血蓝蛋白(KLH)，且可产生抗嵌合分子的抗体。

生成抗体的方法在本领域熟知。例如多种宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、鸡、火鸡、人和其它，可通过注射靶多肽或任何免疫原性片段或其肽来免疫。取决于宿主种类，多种佐剂可用于提高免疫应答。这种佐剂包括但不限于弗氏佐剂、无机物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳胶和KLH。在用于人的佐剂中，尤其优选铝水凝胶、BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

单克隆抗体可用任何通过连续培养细胞系产生抗体分子的技术来制备。体内和体外生成单克隆或多克隆抗体的技术在本领域熟知。(参见例如Pound(1998) 免疫 化学操作(Immunochemical Protocols)，Human Press，Totowa NJ；Harlow和Lane(1998) 抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，New York；Goding(1986) 单克隆抗体：原理和实践(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)，第2版，Academic Press；Schook(1987)单克隆抗体生成技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques andApplications)，Marcel Dekker有限公司)如单链抗体的生成，嵌合抗体的生成也在本领域熟知。(参见例如，Morrison等，(1984)Proc Natl Acad Sci81：6851-6855；Neuberger等，(1984)Nature 312：604-608；Takeda等，(1985)Nature 314：452-454)可产生具相关特异性但不同个体基因型组成的抗体，例如通过随机组合免疫球蛋白库的链改组。(参见例如，Burton(1991)Proc Natl Acad Sci88：11120-11123)

产生抗体也可通过诱导淋巴细胞群中的体内生成或通过筛选高特异性结合试剂的免疫球蛋白库或组。(参见例如，Orlandi等，(1989)Proc Natl Acad Sci86：3833-3837；Winter和Milstein(1991)Nature 349：293-299)也可产生含靶多肽特异性结合位点的抗体片段。这种抗体片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)₂片段、可通过还原F(ab’)₂片段二硫桥产生的Fab片段。另外，可构建Fab表达库以迅速和容易鉴定具所需特异性的单克隆Fab片段。(参见例如，Huse等，(1989)Science 254：1275-1281)

另外，能产生抗体的人体细胞适于和骨髓瘤细胞系融合，具体是B淋巴细胞。可使用的B淋巴细胞来自外周血或来自活组织切片检查的脾、扁桃腺、或个体淋巴结。此外，人B细胞可直接用埃-巴二氏病毒无限增殖化。(Cole等，(1995) 单 克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss有限公司，77-96页)

适用于产生杂交瘤融合过程的骨髓瘤细胞系优选是不生成抗体，具有高融合效率且酶缺陷使它们不能在支持所需杂交瘤生长的特定选择性培养基中生长。可用于生成本发明融合细胞系的骨髓瘤细胞系例子包括获自小鼠的P3X63Ag8、P3X63Ag8-653、NS1/1.Ag 4.1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、S194/5XXO Bul；获自人的U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6(参见例如，Goding同上，65-66页；Campbell(1984) 单克隆抗体技术：实验室生化 和分子生物技术(Monoc lonal Antibodies Technology：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)，第13卷(Bruden和Von Knippenberg编)，Elsevier，Amsterdam，75-83页)

在本发明中，也可使用针对CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗体。人源化抗体是有与亲代抗体相同或类似结合特异性(如小鼠来源)和增加人特征的抗体或抗体片段。人源化抗体可以通过例如链改组或用噬菌体展示技术来获得。例如，抗体包括CTGF或其片段特异非人抗体的重或轻链可变区，此抗体结合人互补(轻或重)链可变区所有组成。选择感兴趣抗原特异的杂合配对。随后来自选择配对的人链可结合人互补可变区(重或轻)且可选择人抗体多肽二聚体用于抗原的结合特异性。所述用于产生本发明方法中所用人源化抗体的技术揭示于美国专利号5,565,332；5,585,089；5,649,761和5,693,762。此外，所述用于生成转基因小鼠中人抗体的技术描述于美国专利号5,545,806和5,569,825。

如本文所述生成的抗体可用于鉴定CTGF或其片段，如在血液、血浆、尿、玻璃体、滑液、脑脊液、唾液、来自具体组织的活组织切片检查等，或其它生物样品、细胞培养样品或试验样品中。存在的特定多肽的量可通过如测量显象分析确定。另外，可确定靶多肽的mRNA，如通过使用生物样品的反转录酶聚合酶链式反应(PCR)。具体是，在此方法中mRNA可反转录成DNA并随后用特异引物序列通过PCR扩增，mRNA来自如总组织样品或编码靶多肽或其片段的样品。可测量确定mRNA，例如通过竞争反应，使用等体积患者样品和一系列如模拟或突变cDNA片段的已知减少浓度。

CTGF试验

检测CTGF多肽的优选试验用单克隆或多克隆抗体进行，CTGF多肽具体是CTGF、CTGF多肽N-末端片段或CTGF多肽C-末端片段。可使用多种试验以检测特异性结合来自样品的所需蛋白质的抗体或检测结合一种或更多来自样品抗体的所需蛋白质。示范试验详述于Harlow和Lane同上；Burtis和Ashwood(1999) Tietz临床 化学教程(Tietz Textbook of Clinical Chemistry)，第3版，W.B.Saunders，Phiadelphia；Kaplan，Pesce和Kazmierczak(1996) 临床化学：理论、分析、相关(Clinical Chemistry：Theory，Analysis，Correlation)，第3版，Mosby，St.Louis。这种试验的代表例子包括：逆气流免疫电泳(CLEP)试验、放射性免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹试验、抑制或竞争试验、夹层试验、免疫粘附(量油计)测定、同时测定、免疫层析测定、免疫过滤测定、乳珠粘附测定、免疫荧光测定、生物传感器测定和低光检测试验(参见例如美国专利号4,376,110、4,486,530；也参见Goding同上)

荧光抗体试验(FA-试验)使用能结合一种蛋白质的荧光标记抗体(如针对CTGFN-末端区域的抗体)。检测可用荧光显微镜和目测完成，产生定性结果。在一个实施方案中，此试验用于检测组织样品或组织分泌。

在乳珠粘附测定中，抗体结合乳珠。随后结合乳珠的抗体在允许抗体结合样品中所需蛋白质的条件下与样品接触。可确定定性或测量结果。

酶免疫吸附测定(EIA)包括一些能使用抗体和检测CTGF的不同测定。例如，异源间接EIA使用的固相偶联CTGF抗体和亲和纯化的抗IgG免疫球蛋白制备。固相优选是聚苯乙烯微量滴定板。抗体和免疫球蛋白制备随后在允许抗体结合的条件下接触样品，此条件在本领域熟知。这种测定的结果可目测，但优选用分光光度计确定以产生测量结果，如ELISA板读数器。另外的固相EIA模式包括塑料包被的黑色金属珠，在测定过程中能用磁铁移动。而另一种是低光检测免疫测定模式。在此高敏感模式中，自动测量合适标记的结合抗体产生的光发射。优选的是，反应用微量滴定板进行。

在另一个实施方案中，放射性追踪物代替EIA中酶调节的检测以用本领域技术人员已知的方法产生免疫测定(RIA)。

也可进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一个实施方案中，ELISA包括下列步骤：(1)在固相上包被本发明的CTGF多肽(如CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段)；(2)用固相上包被的多肽在可形成抗原-抗体复合物的条件下培养预计含CTGF抗体的样品；(3)加入结合标记的抗抗体(如抗IgG)以被所得结合固相的抗原-抗体复合物捕获；(4)测量捕获的标记并由此确定样品是否有CTGF抗体。

在捕获-抗体夹层酶试验中，所需蛋白质在附于固相的抗体和标记抗体间结合，固相优选聚苯乙烯微量滴定板。优选的是，结果用分光光度计测量，如ELISA板读数器。在连续试验模式中，试剂可以分步方式用捕获抗体培养。测试样品首先用捕获抗体培养。洗脱步骤后，用标记抗体培养。在同步试验中，结合连续试验中所述的两个培养段。这除去了一个培养期和一个洗脱步骤。

量油计/免疫粘附模式本质上是免疫测定，除了固相是聚苯乙烯桨或量油计而不是聚苯乙烯微量滴定板。试剂相同且模式可以是同时或连续。

在层析带试验模式中，捕获抗体和标记抗体在层析带上干燥，层析带通常是结合醋酸纤维素的多孔性硝化纤维或尼龙。捕获抗体常喷射干燥为带一个末端的线。在此末端，有接触带的吸收物质。在带的另一个末端，标记抗体以防止其被吸收入膜的方式沉积。通常，附于抗体的标记是乳珠或胶态金。试验可开始于直接在标记抗体前应用样品。

免疫过滤/免疫浓缩模式结合大固相表面和样品/试剂的定向流，集中和加速抗原结合抗体。在优选模式中，测试样品用标记抗体预培养，随后应用于固相如纤维过滤器或硝化纤维膜等。固相也可用包被捕获抗体的乳或玻璃珠预包被。分析物检测与标准免疫测定相同。样品/试剂流可通过真空或下面吸收物质的毛细作用来调节。

开始的生物传感器测定是敏感的测量试验，能以低成本筛选大量样品。在一个实施方案中，这种测定包括使用光可及的电势传感器，其中反应包括检测pH变化，pH变化由所需蛋白质被捕获抗体结合、跨抗体和尿素酶-结合的抗体引起。结合时，pH变化通过转化成电位来测量。测定通常在很小的反应体积中发生，且很敏感。此外，报导的测试检测限制可以是1000个尿素酶分子每分钟。

诊断、预测、预防和治疗的方法

本发明提供了诊断、预测和监控治疗处理和功效的方法，这是在检测和/或测量CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平基础上。在一些情况中，CTGFN-末端片段比CTGF或CTGF C-末端片段更稳定，在一些情况中可用于更敏感和精确的检测和测量样品中CTGF和CTGF片段水平。

一方面，本发明提供了诊断CTGF相关疾病的方法。在一个实施方案中，诊断CTGF相关疾病的方法包括获得样品及检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或任何CTGF片段的水平和标准量CTGF或CTGF片段的水平，其中样品中CTGF或任何CTGF片段量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。与CTGF或CTGF片段水平异常(如增加或减少)相关疾病包括但不限于增殖性疾病和与胞外基质相联蛋白质表达改变和沉积相关疾病。这种疾病包括例如，癌症如乳腺、前列腺、卵巢、结肠直肠、胰腺和胃肠癌；动脉粥样硬化、关节炎、视网膜病如糖尿病视网膜病；肾病如糖尿病肾病；心脏、肺、肝和肾纤维化以及慢性炎症和/或感染相关疾病。CTGF相关疾病也与一些情况相联，如心肌梗塞、糖尿病、腹膜透析、慢性和急性移植排斥、化疗、放疗和手术。其它CTGF相关疾病描述同上。

还提供了鉴定个体是否倾向于发展CTGF相关疾病的方法。在一个实施方案中，鉴定CTGF相关疾病倾向性的方法包括获得样品及检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或任何CTGF片段的水平和标准量CTGF或CTGF片段的水平，其中样品中CTGF或任何CTGF片段量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。

另一方面，本发明提供了监控CTGF相关疾病进展的方法，所述方法包括获得样品；检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或CTGF片段的水平和CTGF或CTGF片段的标准量，或者与获自相同个体或来源样品中CTGF或CTGF片段在较早或前面时间或疾病发展较早期的第一个水平相比，其中样品中CTGF或CTGF片段的水平和标准或第一个水平间的差异指示CTGF相关疾病的进展。

又一方面，本发明提供了确定CTGF相关疾病进程的预测，所述方法包括获得样品；检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或CTGF片段的水平和前面时间或疾病发展较早期从个体获得样品的测量值，其中样品在一个时间中CTGF或CTGF片段水平和另一个时间取的CTGF或CTGF片段水平间的差异指示CTGF相关疾病的预测。

另外一方面，本发明提供了监控CTGF相关疾病治疗疗效的方法，所述方法包括从患CTGF相关疾病和接受此病治疗的受试者中获得样品；检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或CTGF片段的水平和CTGF或CTGF片段的标准水平，其中样品中CTGF或CTGF片段的水平和标准水平间的差异指示CTGF相关疾病疗法的疗效。

另一方面，本发明提供了监控CTGF相关疾病治疗疗效的方法，所述方法包括获得样品；检测和测量样品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比较样品中CTGF或CTGF片段的水平和前面时间取自个体的样品或连续时间获得的一个或几个样品或疾病发展较早期的水平，样品在一个时间中CTGF或CTGF片段水平和另一个时间取的CTGF或CTGF片段水平间的差异指示CTGF相关疾病疗法的疗效。

又一方面，提供了鉴定与CTGF或CTGF片段水平增加相关的疾病的方法，所述方法包括从患具体疾病的受试者中获得第一个样品；从没有具体疾病的受试者中获得第二个样品；检测和测量第一个样品中CTGF或CTGF片段的水平；检测和测量第二个样品中CTGF或CTGF片段的水平；比较第一个样品中CTGF或CTGF片段的水平和第二个样品中CTGF或CTGF片段的水平，其中第一个样品中CTGF或CTGF片段水平增加指示与CTGF水平和活性增加相关疾病。

另一方面，提供了鉴定与CTGF或CTGF片段水平增减少相关的疾病的方法，所述方法包括从患具体疾病的受试者中获得第一个样品；从没有具体疾病的受试者中获得第二个样品；检测和测量第二个样品中CTGF或CTGF片段的水平；比较第一个样品中CTGF或CTGF片段的水平和第二个样品中CTGF或CTGF片段的水平，其中第一个样品中CTGF或CTGF片段水平减少指示与CTGF水平和活性降低相关疾病。

化合物筛选和鉴定

本发明进一步提供了筛选和鉴定可减少或增加CTGF或CTGF片段的表达、水平或活性(如CTGF N-末端片段等)的化合物的方法。

一方面，提供了筛选可增加CTGF片段的表达、水平或活性(如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段等)的化合物的方法，所述方法包括获得样品；使样品接触化合物；检测和测量样品中CTGF或CTGF片段的表达、水平或活性，其中CTGF片段表达、水平或活性增加指示的化合物具有提高CTGF片段表达、水平或活性的性质。

另一方面，提供了筛选可减少CTGF片段的表达、水平或活性(如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段)的化合物的方法，所述方法包括获得样品；使样品接触化合物；检测和测量样品中CTGF或CTGF片段的表达、水平或活性，其中CTGF片段表达、水平或活性减少指示的化合物具有降低CTGF片段表达、水平或活性的性质。

可用多种本领域已知的筛选技术之一来鉴定化合物。这些筛选方法可使CTGF多肽或化合物在溶液中游离、附于固体支持物、携带在细胞表面上、与胞外基质相联或位于胞内。例如，携带测试化合物的微阵列可用本领域有用方法制备、使用和分析。(参见例如，Shalon等，(1995)PCT申请号WO95/35505；Baldeschweiler等，(1995)PCT申请号WO95/251116；Brennan等，(1995)美国专利号5,474,796；Heller等，(1997)美国专利号5,605,662)

多种测定和筛选技术可用于鉴定小分子，小分子调节(如增加或减少)CTGF或CTGF片段(如CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段等)的表达、水平或活性。这些方法也可用于鉴定与CTGF或CTGF片段表达、水平或活性相互作用或影响的抗体和其它化合物，因此可用作本方法中的药物和治疗(参见例如Enna等，(1998) 药 理学现状(Current Protocols in Pharmacology)，John Wiley和Sons)测定通常提供可检测信号，信号与化合物结合蛋白质或细胞靶相关。结合可通过例如荧光团、酶缀合物和其它本领域熟知的可检测标记来检测。结果可以是定性或测量。

在本文所述任何方法中，样品可获自培养细胞，或来自哺乳动物，优选来自人。样品可获自例如培养细胞的条件培养基，或来自血、尿、血清、血浆、玻璃体、滑液、脑脊液、唾液、羊水，或获自组织活组织切片检查。任何一种本领域已知多种方法可用于检测和测量CTGF或片段的水平。这种方法包括但不限于例如使用针对CTGF N-末端或C-末端片段的抗体；分离CTGF N-末端或C-末端片段(如用质谱、液相质谱、聚丙烯酰胺胶电泳、蛋白质印迹分析或其它常规化学分析等)；或任何其它本领域技术人员已知的方法和过程。在一些方面，所述方法包括检测CTGF内的CTGF N-末端区域/结构域或CTGF C-末端区域/结构域。另一方面，所述方法包括测量CTGF N-末端片段水平，此片段被分离(如裂开)且不同于CTGF C-末端区域或CTGF，或者测量CTGF C-末端片段水平，此片段被分离(如裂开)且不同于CTGFN-末端区域或CTGF。

这些和其它本发明实施方案通过本文说明为本领域普通技术人员掌握。

实施例

可通过下列实施例进一步理解本发明，这些实施例仅仅是为了例证本发明。提供这些实施例仅用于阐述权利要求的发明。本发明范围不受示范实施方案限制，实施方案仅用于阐述发明的单方面。任何功能相当的方法在发明范围内。除了本文所述的多种发明修改根据前述和附图对于本领域技术人员是显然的。这些修改在附加权利要求范围内。

实施例1：重组人CTGF的制备

重组人CTGF(rhCTGF)制备如下。全长的人CTGF cDNA(DB60R32)获自GaryGrotendorst博士(迈阿密医学院(University of Miami Medical School))。(Bradham等，(1991)J Cell Biol 114：1285-1294)仅包括可读框的CTGF cDNA通过聚合酶链式反应用DB60R32 DNA作为模板和下列引物(5’-gctccgcccgcagtg ggatccatgaccgccgcc-3’(SEQ ID NO：3)和5’-ggatccggatcc.tcatgccatgtctccgta-3’(SEQ ID NO：4)来产生，在扩增产物任一末端加入BamHI限制性酶切位点(下划线)。所得扩增DNA片段用BamHI消化，在琼脂糖胶上纯化，直接亚克隆到杆状病毒(供体)表达质粒pFastBac1(Invitrogen，Carlsbad CA)的BamHI位点。pFastBac1/CTGF cDNA载体构建转位到杆粒DNA且重组杆状病毒由下列概括在BAC-TO-BA杆状病毒表达系统手册(Invitrogen)中的厂商操作产生。Sf9昆虫细胞中重组杆状病毒滴度扩增用本领域标准过程进行。(Murphy和Piwnica-Worms，(1984) 分子生物现状(Current Protocols inMolecular Biology)，第2卷(Ausubel等编)John Wiley&Sons有限公司)

rhCTGF的表达和制备如下进行。适于悬浮生长的HIGH FIVE昆虫细胞在SF900II培养基(Invitrogen)中生长到1.0×10⁶个细胞/ml的细胞密度。细胞随后用含CTGF的杆状病毒以感染复数10∶1感染。感染后，细胞27℃培养40小时。细胞随后用离心沉淀，收集含CTGF的条件培养基并通过0.22μm滤器过滤。然后条件培养基直接应用于5ml Hi-Trap肝素柱(Amersham Biosciences公司，Piscataway NJ)，柱用50mM Tris，pH7.2预平衡。接着肝素柱用100ml 350mMNaCl/50mM Tris，pH7.2洗，结合的CTGF用350mM NaCl到1200mM NaCl的线性梯度超过15个柱体积洗脱。各部分通过SDS-PAGE分析CTGF的存在。

收集含CTGF的部分并用50mM Tris，pH7.5 1∶4稀释。CTGF收集物加入羧甲基(CM)离子交换柱(POROS CM柱，PerSeptive生物系统，Framingham，MA)，柱用10个柱体积的50mM Tris，pH7.5预平衡。CM柱用350mM NaCl/50mM Tris，pH7.5洗，结合的CTGF用350mM NaCl到1200mM NaCl的线性梯度超过15个柱体积洗脱。各部分通过SDS-PAGE分析CTGF的存在。收集含CTGF的部分并用作CTGF材料。

实施例2：CTGF N-末端和C-末端片段的制备

CTGF N-末端和C-末端片段如下制备。重组人CTGF如上所述制备和纯化，用胰凝乳蛋白酶珠(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)处理消化，每单位胰凝乳蛋白酶用1.5mg CTGF。胰凝乳蛋白酶处理rhCTGF可室温进行6小时。离心消化产物和胰凝乳蛋白酶珠，弃去胰凝乳蛋白酶珠，含酶裂解rhCTGF的上清用50mM Tris，pH7.5 1∶5稀释。稀释的上清应用于Hi-Trap肝素柱。收集通过流且包含CTGF N-末端片段。肝素柱用350mM NaCl洗，结合的CTGF C-末端片段和未消化CTGF如上所述用350mM到1200mM NaCl的线性梯度洗脱。各部分通过SDS-PAGE分析CTGF C-末端片段的存在。含CTGF C-末端片段的部分根据观测CTGF C-末端纯度来收集。

含CTGF N-末端片段的肝素柱通过流调节至含0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5。含CTGF N-末端片段的样品随后加到15ml苯基琼脂糖HP柱(Amersham PharmaciaBiotech)，柱用0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5预平衡。然后苯基琼脂糖HP柱用15个柱体积的0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5洗。结合的CTGF N-末端片段用0.5M到OM硫酸铵/50mM Tris，pH7.5的线性梯度超过约15个柱体积洗脱。各部分通过SDS-PAGE分析CTGF N-末端片段的存在。收集含CTGF N-末端片段的部分。使用Amicon超滤YM10膜浓缩此含CTGF N-末端片段的收集物，缓冲液与50mM Tris、400mM NaCl，pH7.2交换。

实施例3：抗CTGF和CTGF片段抗体的制备

制备抗纯化rhCTGF的单克隆和多克隆抗体。重组人CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段如上所述制备和纯化。特异于人CTGF或CTGF片段的单克隆和多克隆抗体用标准方法制成。(参见例如Goding同上；Schook同上)

人CTGF的单克隆抗体一般如下制备。健康成年小鼠用50到100μg CTGF、CTGFN-末端片段或CTGF C-末端片段皮下免疫。6到10周后，小鼠用不完全弗氏佐剂中制成的另外抗原强化。各强化注射后一周，通过ELISA分析确定来评估免疫小鼠血清中CTGF抗体的存在。选择产生最强CTGF或其片段抗体反应(即最高滴度)的小鼠用于制备杂交瘤。来自这些小鼠的分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，例如P3X63Ag8-653，使用下列本领域熟知的过程。产生与CTGF反应的抗体的杂交瘤由ELISA鉴定并随后通过限制稀释至少两次来克隆。

另外，人CTGF的人单克隆抗体用下列方法制成。HUMAB小鼠同龄组(Medarex有限公司，Princeton NJ)用不同CTGF免疫原免疫，包括a)杆状病毒制备的纯化rhCTGF，b)CTGF N-和C-末端半片段通过胰凝乳蛋白酶裂解全rhCTGF产生和c)多种合成CTGF肽。HUMAB小鼠(Medarex)是遗传工程转基因小鼠，通过产生全人抗体响应免疫原。筛选产生自25个脾融合的杂交瘤并确定约140个克隆选择的单克隆抗体-制备细胞系。各抗体群的亲和性用RIA测量，其中全rhCTGF被放射性碘标记并加入孔，孔含固定的单克隆抗体和不同量的未标记CTGF。

实施例4：抗体特征

如实施例3所述制备生成人CTGF的杂交瘤。克隆的杂交瘤细胞生长于Dulbecco’s Modified Eagle培养基-高葡萄糖/RPMI 1640(50∶50)与8mM L-谷氨酸、1/2x非必须氨基酸和10％胎牛血清。扩增用于抗体制备的细胞在有1.5％低IgG胎牛血清的相同培养基中37℃6％CO₂生长4-9天。所得条件培养基清除细胞并用切向流过滤/浓缩系统浓缩。浓缩物通过蛋白质-A柱且结合的单克隆抗体用100mM甘氨酸，pH3洗脱。洗脱液用1M Tris，pH8.0中和，相对PBS透析。

各所得单克隆抗体用标准结合和阻断实验作图并分配到其结合的特异CTGF区域。(Harlow和Lane同上；Burtis和Ashwood同上；Kaplan、Pesce和Kazmierczak同上，第10章(免疫化学技术)和11章(竞争结合试验)例如，相同结构域的抗体或抗原表位特异性会阻断任何其它相同结构域抗体结合或抗原表位特异性，具体是以连续方式加入。结合单克隆抗体的CTGF上抗原表位的更精确作图用重组表达CTGF的具体片段通过ELISA分析进行。例如，识别CTGF N-末端结构域或区域的单克隆抗体用ELISA分析鉴定，ELISA分析抗固定的重组表达CTGF外显子2。单克隆抗体作图成重组表达的CTGF结构域，如CTGF多核苷酸序列外显子2、外显子3、外显子4或外显子5编码的结构域。

以此方式选择和确定抗体，抗体特异识别CTGF N-末端结构域或N-末端片段(如N1，对第一个N-末端片段抗原表位或几个抗原表位有特异性；N2，对第二个N-末端片段抗原表位或几个抗原表位有特异性)或CTGF C-末端结构域或C-末端片段(如C-末端片段抗原表位C1、C2、C4、C5或CK)。(参见例如图1A和1B)

实施例5：CTGF和CTGF片段测定

发展免疫测定以检测和精确测量CTGF多肽。具体发展方法以检测和测量CTGF(称为N-C试验)、CTGF N-末端片段(称为N-N试验)和CTGF C-末端片段(称为C-C试验)。图1C阐述了不同的夹层试验模式。

CTGF

用一个识别CTGF N-末端结构域(如上述N1和N2并示于图1A)的抗体和第二个识别CTGF C-末端结构域(如上述C1-C5并示于图1A)的抗体检测和测量完整CTGF。此试验称为N-C试验(图1C)。N-末端结构域特异抗体(结合N2的单克隆抗体(mAb)19)用于捕获CTGF，而C-末端结构域特异抗体(结合C4的mAb25)用于检测捕获的CTGF多肽。另外，识别CTGF C-末端结构域的抗体或任选连接载体的肝素如BSA可用于捕获CTGF，识别CTGF N-末端结构域的抗体可用于检测捕获的CTGF多肽。以任一方法使用两种试剂可检测CTGF但不能检测CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段，两种试剂是识别CTGF N-末端结构域的试剂和另一个识别CTGF C-末端结构域的试剂(图2)。

CTGF N-末端片段

用两个识别CTGF N-末端结构域的抗体来检测和测量CTGF N-末端片段(如上述N1和N2并示于图1A)。此试验称为N-N试验(图1C)。N-末端结构域特异抗体之一作为捕获抗体(如结合N2的mAb19)，另一个作为检测抗体(如结合N1的mAb6)。由于CTGF含抗体识别的CTGF N-末端结构域，CTGF也用N-N试验检测。

为确定样品中CTGF N-末端片段量，确定样品中CTGF水平(用N-C试验，同上)，确定样品中CTGF N-末端片段水平(用N-N试验)。随后确定的CTGF量减去确定的N-末端片段量，产生样品中存在的CTGF N-末端片段水平。除非另有说明，用N-N试验获得的数据检测和测量CTGF和CTGF N-末端片段水平(图3)，调节数据显示各样品中CTGF N-末端片段的具体水平(即样品中CTGF水平减去此样品用N-N试验获得的值)。另外，样品可在进行N-N试验前用肝素亲和柱清除CTGF。

CTGF C-末端片段

用两个识别CTGF C-末端结构域的抗体来检测和测量CTGF C-末端片段(如上述C1和C4并示于图1A)。此试验称为C-C试验(图1C)。C-末端结构域特异抗体之一作为捕获抗体(如结合C4的mAb51)，另一个作为检测抗体(如结合C1的mAb51)。另外，连接载体的肝素如BSA可用于捕获CTGF C-末端结构域。由于CTGF含CTGFC-末端结构域，CTGF也用此试验检测。

为确定样品中CTGF C-末端片段量，因此确定样品中CTGF水平(用N-C试验，同上)，确定样品中CTGF C-末端片段水平(用C-C试验)。随后确定的CTGF量减去确定的C-末端片段量，产生样品中存在的C-末端片段水平。除非另有说明，用C-C试验获得的数据检测和测量CTGF和CTGF C-末端片段水平(图4)，调节数据显示各样品中CTGF C-末端片段的具体水平(即样品中CTGF水平减去此样品用C-C试验获得的值)。另外，样品可在进行C-C试验前用N-末端片段特异试剂N清除CTGF。

确定样品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段水平的量是通过将各所述ELISA测定(即检测CTGF的N-C试验；检测CTGF加CTGF N-末端片段的N-N试验；检测CTGF加CTGF C-末端片段的C-C试验)获得的吸光度值外推到已知浓度CTGF标准获得的值。数据用二次非线性回归(SOFTMAX PRO软件，MolecularDevices，Sunnyvale，CA)分析，提供最优方程式描述标准曲线和在摩尔基础上使吸光度涉及CTGF浓度。

实施例6：CTGF和CTGF片段的检测和测量

低蛋白质含量的样品

进行CTGF测定的过程描述于上面的实施例5。可对这些方法进行修改用于检测和测量不同样品或样品种类中CTGF和CTGF片段。例如，为检测和测量人低蛋白质含量样品中CTGF和CTGF片段(如尿、滑液、腹膜透析液、CSF液、唾液、细胞培养基)，发展了用抗人CTGF单克隆抗体的夹层ELISA。CTGF测定建立如下。微量滴定板的孔首先用识别CTGF区域或结构域的捕获抗体包被。为用于ELISA，捕获抗体在50mM碳酸氢钠，pH8.5中稀释到10μg/ml的终浓度，50微滴的稀释捕获抗体溶液加入96孔MAXISORB微量滴定板(Nalge Nunc International，Rochester NY)各孔。板随后被覆盖并在2到8℃保存过夜以使抗体结合板。捕获抗体溶液从板中除去，然后各孔的未结合位点用150μl封闭缓冲液封闭，缓冲液含1％无钙无镁PBS中的BSA，有0.05％叠氮化钠。板随后被覆盖并在2到8℃保存1到14天。用于CTGF检测和测量测定前，封闭缓冲液从孔中除去，各板的孔用洗涤缓冲液(无钙无镁的PBS，含0.1％Tween 20)洗一次。

用于ELISA测定的CTGF标准溶液如下制备。如上所述的冷冻rhCTGF等分样品被溶解并在肝素试验缓冲液(0.45μm过滤)中稀释到1.1μg/ml的终浓度，缓冲液含无钙无镁的PBS、50mM Tris(pH7.8)、1mg/ml BSA、4mM MgCl₂、0.2mM Zn Cl₂、0.05％叠氮化钠、50μg/ml肝素钠和1％TRITON X-100去垢剂。rhCTGF标准贮存液等分保存于-70℃。随后制备rhCTGF贮存液稀释以获得从0ng/ml到15ng/ml的rhCTGF标准浓度范围，稀释是在肝素试验缓冲液中。在所有描述的ELISA测定中，CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在与CTGF标准相比基础上确定。

生物样品在肝素试验缓冲液中稀释(通常稀释是在1∶2和1∶20间，取决于具体样品种类)，50μl稀释样品应用于包被和封闭的微量滴定孔，做两组或三组。

为确定CTGF或CTGF片段的检测，可使用来自包被的不同CTGF抗原表位特异性的生物素酰化单克隆抗体或CTGF捕获抗体。生物素酰化抗体加入微量滴定板孔中的上述样品和CTGF标准，含CTGF的样品和CTGF标准与生物素酰化抗CTGF抗体在捕获抗体包被的微量滴定板中同时培养。用于检测的单克隆抗体用生物素：DNP试剂生物素酰化，遵循厂商(Molecular Probes，Eugene，OR)所述操作。通常可接受5∶1到12∶1的生物素：mAb比例。50微滴的生物素酰化单克隆抗体(1000ng/ml)加入已含上述样品的各孔。板随后被覆盖并在板旋转器上以100到130rpm在2到8℃培养90分钟。

然后，板用洗涤缓冲液洗三次。接着孔用50μl链霉抗生物素-碱性磷酸酶缀合物(Jackson ImmunoResearch Labs，West Grove PA)培养，缀合物在试验缓冲液中稀释(通常1∶10,000)到根据经验确定的各缀合物组浓度，这是在CTGF标准曲线所需信号水平发展基础上。板被覆盖并在板旋转器上以100到130rpm在2到8℃培养90分钟。之后，板如上所述洗三次，加入100μl碱性磷酸酶底物(SigmaChemical Co.)到各孔。用视觉和微量滴定板读数器监控颜色发展。一旦标准和样品颜色发展达到最佳信号水平，通过加入50μl 4N氢氧化钠到各孔来终止颜色进一步发展。随后微量滴定板置于微量滴定板读数器中，在405nm波长测量吸光度单位来确定颜色发展。

高蛋白质含量的样品

当测量高蛋白质含量的样品(如血、血清、血浆等)中CTGF水平时，对上面和实施例5中所述CTGF测定进行修改。为提供标准和此测定中所用样品内蛋白质浓度或水平的一致性，肝素试验缓冲液添加10％除去CTGF的大鼠血清，此试验检测高蛋白质含量样品中的CTGF和CTGF片段。

CTGF如下从大鼠血清中除去以用于此试验。大鼠血清用2％(v/v)肝素-琼脂糖珠过夜培养，从大鼠血清中除去CTGF和CTGF C-末端片段。CTGF N-末端片段不通过此方法从大鼠血清中除去，因为CTGF N-末端片段不结合肝素。仍存在于肝素-琼脂糖处理大鼠血清中的N-末端片段不干扰随后的CTGF测定，因为用于检测人CTGF的测定不检测大鼠CTGF N-末端片段。另外，抗体亲和层析柱可用于从哺乳动物血清中除去CTGF和CTGF片段以产生除去CTGF和CTGF片段的血清。

如上所述制备的CTGF标准溶液掺加10％(v/v)大鼠血清，大鼠血清如上所述用肝素-琼脂糖珠处理。稀释在肝素试验缓冲液中的生物素酰化抗CTGF抗体(用于检测)也掺加10％肝素-琼脂糖珠处理的大鼠血清。高蛋白质含量的样品用肝素试验缓冲液1∶10稀释；因此所有用于测定的溶液(即CTGF标准，生物样品等)包含10％(v/v)终浓度的血清。随后上述夹层ELISA测定用于检测和测量稀释的高蛋白质含量样品中CTGF和CTGF片段的水平。

实施例7：CTGF测定特异性

检测上述实施例5和实施例6中CTGF ELISA测定的特异性和可靠性。表1显示用rhCTGF标准进行的ELISA测定结果，使用上述测定以检测和测量CTGF(N-C试验)、CTGF N-末端片段(N-N试验)和CTGF C-末端片段(C-C试验)。

示于表1的测定结果是405nm的吸光度，由ELISA板测量。不同rhCTGF浓度(0到11ng/ml)用于建立各CTGF ELISA测定的标准曲线。测定在各CTGF浓度进行三次，用于ELISA测定的吸光度的统计平均值和变异系数(％CV)包括在表1中。

表1：CTGF ELISA测定的代表性标准曲线

CTGF浓度	N-C试验	％CV	N-N试验	％CV	C-C试验	％CV
							0.0ng/ml	0.383	4.6％	0.480	0.6％	0.299	1.9％
0.33ng/ml	0.440	5.8％	0.579	3.4％	0.315	2.6％
							1.1ng/ml	0.611	0.5％	0.758	6.1％	0.379	3.6％
3.0ng/ml	1.130	1.3％	1.217	5.6％	0.623	2.4％
							6.6ng/ml	1.975	1.1％	2.126	4.2％	1.193	3.0％
11.0ng/ml	2.817	0.9％	3.109	5.0％	2.091	6.9％

测定根据实施例5和实施例6所述操作进行。测定特异性通过选择用于各测定的捕获和标记(检测)抗体来控制。结果显示此例子中进行的用于CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的CTGF ELISA测定有检测低于1ng/ml浓度CTGF多肽的敏感性。因此，发现特测量CTGF测定的变异系数(CV)正常是在约0到6％范围中。

进一步检测各CTGF ELISA测定的特异性。获自杆状病毒的rhCTGF如上所述生成和纯化。CTGF N-末端片段和C-末端片段如实施例2所述通过胰凝乳蛋白酶裂解rhCTGF产生和纯化。检测和测量CTGF(N-C试验)、CTGF N-末端片段(N-N试验)和CTGF C-末端片段(C-C试验)的CTGF ELLSA测定用这些CTGF多肽进行。结果示于图2(N-C试验)、图3(N-N试验)和图4(C-C试验)。

如上述和图2、3和4所示，所有三种CTGF测定描述CTGF(图2、3和4中的实心正方形)。CTGF测定仅检测CTGF(即含CTGF N-末端结构域和CTGF C-末端结构域)。CTGF测定不检测CTGF N-末端片段(图2、3和4中的实心三角形)或CTGF C-末端片段(图2、3和4中的实心圆)。N-末端结构域测定检测CTGF(图3中的实心正方形)和CTGF N-末端片段(图3中的实心三角形)。C-末端结构域测定检测CTGF(图4中的实心正方形)和CTGF C-末端片段(图4中的实心圆)，但不检测CTGFN-末端片段(图4中的实心三角形)。

本发明的CTGF和CTGF片段测定特异于CTGF多肽。结构相关的CCN家族成员NOV和CYR61(用高至0.5mg/ml的浓度)不用所述CTGF测定检测(数据没有显示)。

实施例8：缺乏或存在肝素时的CTGF检测

CTGF是肝素-结合生长因子，取决于位于CTGF C-末端区域的肝素结合结构域。CTGF稳定性、检测和回收在不同保存温度存在和缺乏肝素时测量和评估。重组人CTGF(10ng/ml)在存在和缺乏肝素(来自Porcine，Sigma Chemical Co.；加至10μg/ml的浓度)时加入试验缓冲液。含CTGF的样品随后在下列温度培养10天：-80℃、-20℃、4℃或25℃。

随后如实施例5所述用ELISA测定来确定样品中保留的CTGF量。缺乏或存在肝素时的CTGF检测结果示于表2。

表2：肝素对CTGF检测的效果

温度	-80℃	-20℃	+4℃	+25℃
					+肝素	8.9ng/ml	9.1ng/ml	5.3ng/ml	5.3ng/ml
％回收	89％	91％	53％	53％
					-肝素	2.7ng/ml	5.0ng/ml	1.0ng/ml	0.38ng/ml
％回收	27％	50％	10％	8％

如表2所示，缺乏肝素时检测到少量CTGF，甚至当样品保存在-80℃时也如此。在4℃或25℃缺乏肝素后10天，检测到的样品加入约1ng/ml原始10ng/ml CTGF。这表明CTGF多肽不稳定或者也许是粘性，特别是在冷冻温度之上培养时。当CTGF在肝素存在时培养，4℃或25℃后10天可检测CTGF水平约为5ng/ml，对应于约一半加入试验缓冲液的原始CTGF量，是缺乏肝素时获得水平的5倍。加入肝素促进在所有检测温度时的CTGF回收。这表明肝素提供稳定CTGF效果，维持水溶液中CTGF溶解度，或保护CTGF不被蛋白质水解、吸收于塑料，或结合溶液中其它大分子。

实施例9：细胞培养条件培养基中CTGF和CTGF片段的检测和稳定性

已知人骨肉瘤细胞系MG-63细胞生成和分泌CTGF。此外，TGFβ刺激这些细胞中的CTGF表达。MG-63细胞从ATCC(CRL-1427)中获得。细胞在极限必需培养基(MEM)中平板培养于12孔组织培养板(27,000个细胞每孔)，MEM含10％胎牛血清、谷氨酸、青霉素和非必须氨基酸。48小时后，除去培养基并用新鲜培养基(无胎牛血清且含磷酸抗坏血酸(30μg/ml)和牛血清白蛋白(1mg/ml)的MEM)替换，含肝素(10μg/ml)，有活没有TGFβ(5ng/ml)。随后在0、24、92和120小时后从细胞中收集条件培养基并分析CTGF和CTGF片段水平。MG-63细胞条件培养基中CTGF、CTGFN-末端片段和C-末端片段水平的结果示于下表3。

表3：细胞条件培养基中CTGF和CTGF片段的水平

ELISA+/-TGFβ	24小时	92小时	120小时
				CTGF(-TGFβ)	40ng/ml	55ng/ml	35ng/ml
CTGF(+TGFβ)	150ng/ml	33ng/ml	26ng/ml
				N-末端片段(-TGFβ)	157ng/ml	＞401ng/ml	＞498ng/ml
N-末端片段(+TGFβ)	181ng/ml	＞507ng/ml	＞534ng/ml
				C-末端片段(-TGFβ)	7ng/ml	未检测到	未检测到
C-末端片段(+TGFβ)	未检测到	1ng/ml	未检测到

如表3所示，TGFβ处理24小时后，MG-63细胞条件培养基中检测到的CTGF水平从40ng/ml增加到150ng/ml。然而TGFβ处理92或120小时后，细胞条件培养基中检测到的CTGF水平比处理24小时后所观察到的大幅减少。

CTGF C-末端片段水平观察到类似的结果。TGFβ存在24小时后，细胞条件培养基中CTGF C-末端片段水平从7ng/ml减少到不能检测的水平。TGFβ处理92或120小时后，条件培养基中CTGF C-末端片段水平保持较低或不能检测。因此，尽管用TGFβ刺激CTGF表达，MG-63细胞条件培养基中CTGF和CTGF C-末端片段可检测的水平随着时间降低或不能检测。

相反，CTGF N-末端片段的检测和测量显示CTGF N-末端片段随着时间积聚在MG-63细胞条件培养基中。存在或缺乏TGFβ刺激CTGF表达时都发现N-末端片段积聚在条件培养基中。尽管观察到TGFβ处理24小时后CTGF水平增加约4倍(相较未处理细胞)，在TGFβ处理细胞中观察到CTGF N-末端片段水平比未刺激细胞仅少量增加(没有TGFβ处理时的157ng/ml相较TGFβ处理时的1581ng/ml)。在此具体情况中，单独测量CTGF N-末端片段水平不指示TGFβ处理24小时后任何CTGF水平增加。因此检测和区分CTGF、CTGF N-末端片段和C-末端片段水平的能力是一种敏感和可靠的方法，用于确定CTGF和其片段的存在和水平以及不同条件下CTGF和CTGF片段表达的任何变化。

这些结果表明在一些情况中，CTGF N-末端片段可随着时间积聚。CTGF N-末端片段积聚与CTGF可检测水平降低相一致，表明CTGF N-末端片段在生物液体中稳定(即更少受影响或抗蛋白质水、清除、除去或吸收)，如细胞条件培养基、血和尿；因此可提供CTGF表达的可检测和稳定指示。

另外，此数据表明在一些情况中，CTGF和CTGF C-末端片段可通过降解、分泌或组织除去而失去。此数据也显示检测和区分细胞培养基中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在确定CTGF表达水平和CTGF裂解、加工、除去、清除等程度或范围中的价值和好处。

实施例10：CTGF和CTGF片段的蛋白质印迹分析

MG-63细胞在Dulbecco’s Eagle修饰培养基中培养(CELLGRO培养基；Mediatech，Herndon VA)，培养基含50μg/ml肝素钠(Sigma Chemical Co.)、50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.)且没有血清。在第1、2、3和6天，从细胞中收集条件培养基，1200rpm离心5分钟以沉淀碎片，上清冷冻保存。

CTGF水平的分析如下完成。CTGF N-末端片段通过单克隆抗体免疫沉淀从条件培养基中分离，单克隆抗体定向抗CTGF N-末端结构域。免疫沉淀通过10μg/ml浓度单克隆抗体培养MG-63细胞条件培养基1小时来进行，单克隆抗体特异于CTGFN-末端区域。加入2％(w/w)蛋白质-A(Sigma Chemical Co.)悬浮液且样品再培养1小时。非特异性结合对照可用蛋白质-A单独沉淀，不包括任何CTGF特异抗体。免疫沉淀/蛋白质-A复合物用缓冲液洗两次，缓冲液含150mM NaCl、1％TRITON X-100去垢剂、1％脱氧胆酸、1％SDS、50mM Tris(pH7.5)和2mM EDTA。样品随后用Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2X)(Invitrogen)溶解制备用于电泳分离沉淀的蛋白质。CTGF和CTGF C-末端片段通过肝素-琼脂糖沉淀从条件培养基分离。完成肝素-琼脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)沉淀是通过4℃混合细胞条件培养基和2％肝素-琼脂糖悬浮液(用PBS 1∶1(w/w))2小时)。沉淀复合物用PBS洗两次，随后如上所述溶解。

电泳(4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE胶(Invitrogen))后，样品转移到硝化纤维膜(Invitrogen)上用于蛋白质印迹分析。膜随后用5％牛奶在缓冲液中封闭，缓冲液含24.8mM TRIS碱、2.7mM氯化钾、137mM氯化钠、0.05％Tween 20，pH7.4。

通过蛋白质印迹分析检测MG-63细胞条件培养基中CTGF和CTGF片段，结果示于图5A、5B和5C。含CTGF(图5A)和CTGF C-末端片段(图5C)的膜用肝素-琼脂糖珠沉淀，用识别CTGF C-末端片段的单克隆抗体探测，接着用结合辣根过氧化物酶的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)检测。含CTGF N-末端片段(图5B)的膜用抗CTGF抗体免疫沉淀，用抗CTGF鸡多克隆抗体探测，接着用结合辣根过氧化物酶的兔抗鸡IgY(Zymed，South San Francisco CA)检测。蛋白质印迹发展用SUPERSIGNAL化学发光试剂(Pierce Chemical Co.，Rockford IL)显现。

测量MG-63细胞条件培养基中CTGF和CTGF片段水平的相对变化通过光密度测量上述蛋白质印迹来进行。CTGF和CTGF片段蛋白质印迹的光密度测量结果示于下表4。

表4：细胞条件培养基中CTGF和CTGF片段水平的变化

	第1天	第2天	第3天	第6天
					CTGF	1	1.17	1.99	0.43
N-末端片段	1	0.4	3.03	2.35
					C-末端片段	1	1.08	0.53	0

CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的检测和测量通过蛋白质印迹证明。如图5A所示，积聚在MG-63细胞条件培养基中的CTGF在约第3天达到最大水平。在培养第6天，MG-63细胞条件培养基中的CTGF水平低于培养第1天后确定的一半，仅约第3天确定水平的20％，第3天有CTGF测量的最高水平。这表明CTGF在MG-63细胞条件培养基中不稳定。观察到CTGF N-末端片段水平随着时间在MG-63细胞条件培养基中积聚(图5B)。CTGF C-末端片段水平不在MG-63细胞条件培养基中积聚；而在条件培养基中第6天，蛋白质印迹分析不能检测CTGF C-末端片段(图5C)。

如上面实施例9所示，这些观察与ELISA测定获得结果一致。CTGF和CTGF C-末端片段可检测水平的减少表明CTGF和CTGF C-末端片段比CTGF N-末端片段更不稳定，因此也许不提供在具体时间样品中CTGF表达或水平的可靠指示。CTGF N-末端片段积聚表明CTGF N-末端片段在生物液体中比CTGF或CTGF C-末端片段更稳定(即更少受影响或抗蛋白质水、清除、除去或吸收)，例如细胞条件培养基。因此，如蛋白质印迹分析所测量，CTGF N-末端片段提供CTGF表达的可检测和稳定指示。数据也显示检测和区分细胞培养基中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在确定CTGF表达水平和CTGF裂解、加工、除去、清除等程度或范围中的价值和好处。

实施例11：加入尿的CTGF和CTGF片段的稳定性

使用与上述实施例8类似的方法，在健康个体的人尿样品加入10ng/mlrhCTGF，通过检测和测量CTGF和CTGF片段水平来分析人尿样品。对于这些实验，CTGF检测和测量用实施例5和实施例6所述CTGF ELISA测定进行。人尿中CTGF N-末端片段的正常浓度先前确定为约1到2ng/ml。

图6显示CTGF加入尿样品后在4℃保存0、1、2、3、4和5天时尿中CTGF和CTGF N-末端片段的水平。如图6所示，添加CTGF的尿在4℃保存3天后仅检测到CTGF N-末端片段。3天后，在这些保存条件下尿中不能检测到CTGF。因此，检测和测量CTGF N-末端片段改进和更可靠检测和测量加入尿的CTGF原始量。这些结果表明CTGF在尿中比N-末端片段更不稳定。

实施例12：尿中CTGF的蛋白质水解

尿中CTGF的较低稳定性(相较CTGF N-末端片段)或缺乏检测和测量尿中CTGF的能力可能是由于CTGF在人尿中的不稳定性和蛋白质水解。为检测此方面，对人尿样品进行与实施例11所述类似的实验，人尿样品加入rhCTGF和多种蛋白酶抑制剂。在此研究中，10ng/ml rhCTGF加入正常人尿，人尿随后在存在或没有蛋白酶抑制剂情况下4℃保存1到7天。对于这些实验，CTGF检测和测量用上述CTGFELISA测定进行。所用蛋白酶抑制剂是蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemical Co.批号P-8340)、N-羟基-2[N’-(4-甲氧基-苯磺酰)-N’(4-氯苯甲基)氨基]-乙酰胺(金属蛋白酶抑制剂)或乙二胺四乙酸(EDTA)。尿中CTGF蛋白质水解的结果示于下表5。

表5：尿中CTGF的蛋白质水解

	对照尿	蛋白酶抑制剂混合物	金属蛋白酶抑制剂	EDTA
					N-C试验(CTGF)第1天第7天	2.2ng/ml0.0ng/ml	3.5ng/ml0.0ng/ml	4.6ng/ml0.5ng/ml	3.5ng/ml0.0ng/ml
N-N试验(N-末端和CTGF)第1天第7天	10ng/ml8ng/ml	12ng/ml14ng/ml	14ng/ml13ng/ml	12ng/ml7ng/ml

上表5显示保存1天或7天后，在没有加入任何蛋白酶抑制剂时不能检测到大部分加入尿的CTGF。与缺乏蛋白酶抑制剂相比，包含蛋白酶抑制剂导致保存1天后可检测的CTGF水平更高。用蛋白酶抑制剂混合物、金属蛋白酶抑制剂以及金属离子螯合剂EDTA发生类似程度的可检测CTGF损失。这些数据表明蛋白酶至少部分造成4℃保存的正常人尿中可检测CTGF的降解、除去或损失。这些数据也表明样品中可检测CTGF的水平通过加入蛋白酶抑制剂来维持。

相反，存在或没有加入蛋白酶抑制剂时可检测和测量这些样品中的CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平与外源加入尿的rhCTGF量(10ng/ml)一致。表5显示用N-N试验确定的数据，N-N试验检测CTGF和CTGF N-末端片段。由于正常尿中约为1到2ng/ml的外源CTGF水平(即CTGF N-末端片段)，CTGF N-末端片段水平高于外源加入的10ng/ml rhCTGF。在正常尿中，CTGF和CTGF C-末端片段不能检测，而1到2ng/ml CTGF N-末端片段可检测(数据没有显示)。这些结果表明CTGF对蛋白酶活性敏感，至少部分导致不能检测和测量尿中的CTGF，如检测和测量尿中CTGF N-末端片段的能力所测，CTGF N-末端片段似乎抗蛋白酶降解。

实施例13：腹膜透析患者中的CTGF

腹膜透析患者中的CTGF和CTGF片段水平在透析液中测量，透析液从进行肾功能缺陷腹膜透析的患者的腹膜腔回收。透析液从进行2个月腹膜透析或更短的患者腹膜中获得和取出(图7A中的样品号1、2、3、6和7)，或来自进行50到100个月腹膜透析的患者(图7A中的样品号4、5、8、9和10)。五个患者诊断为1型糖尿病，四个患者患肾小球肾炎且一个患者由于多囊肾疾病做透析。在一些情况中，腹膜透析液获自患者，患者在接受腹膜透析时发展出短瞬腹膜炎。样品号4、8和10来自以前曾患细菌腹膜炎的患者，样品号9是以前四次患细菌腹膜炎的患者。

在所有检测的透析液中发现CTGF N-末端片段的可检测水平(图7A和7B)。检测、测量和比较腹膜透析患者透析液中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段显示CTGF N-末端片段的最高水平(没有显示CTGF和CTGF C-末端片段的数据)。

实施例14：肾纤维化受试者血清中的CTGF

前面检查了肾透析患者尿中CTGF的存在(Riser等，(2000)J Am Soc Nephrol11：25-38：国际专利申请WO 00/13706)。为检测CTGF，这些前面的研究使用肝素-琼脂糖吸收CTGF(由于CTGF N-末端片段不吸收到肝素-琼脂糖珠上，因此导致没有N-末端片段检测)，使用不区分全CTGF、N-末端片段或C-末端片段的CTGF ELISA，也许没有检测各CTGF种类(即CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)的相同敏感性。

在本研究中，确定肾纤维化患者血清中CTGF和CTGF片段的水平。来自正常供体和肾纤维化患者的血清获自Intergen公司(Purchase，NY)。患者有异常肾功能和肾纤维化，这些来自肾移植、化学毒性或IgA-相关肾病的临床显示。

如图8所示，肾纤维化患者血清中CTGF和CTGF C-末端片段的水平与正常个体血清中发现的水平相同或稍低。这些对应于正常个体或肾纤维化患者血清中CTGF或CTGF C-末端片段水平的值约为0-20ng/ml。然而，在肾纤维化患者血清中可检测到CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平高于这些患者血清中的CTGF和CTGF C-末端片段水平。因此，检测、测量和比较这些患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段显示诊断为肾纤维化的患者中CTGF N-末端片段显著增加。

实施例15：器官移植受试者血清中的CTGF

检测器官移植患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。来自功能器官移植(肝或肾)患者的血清以及来自慢性器官移植排斥患者的血清从Intergen公司获得。在临床检测患者加上测量肌氨酸酐清除的基础上区分功能器官移植的患者和经历慢性排斥的患者。慢性器官移植排斥估定在移植后一年以上。

如图9所示，正常器官移植患者或器官移植后慢性排斥患者的血清中CTGF和CTGF C-末端片段水平与正常个体(没有经历器官移植的个体)血清中发现的水平相同。对应于正常个体或器官移植患者血清中CTGF或CTGF C-末端片段水平的值被确定，CTGF和CTGF C-末端片段约为0-20ng/ml。

相反，如图9所示，器官移植患者血清中可检测到CTGF N-末端片段。此外，与健康非移植个体血清中所检测的相比，正常器官移植和慢性移植排斥患者血清中的CTGF N-末端片段水平大幅提高。肝移植或肾移植个体血清中检测到CTGF N-末端片段水平提高。这些结果表明检测、测量和比较器官移植患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平显示经历器官移植患者的CTGF N-末端片段水平高于非移植个体。此外，结果显示相较正常器官移植中观察到的水平，与慢性器官移植排斥相关的CTGF N-末端片段水平进一步提高。

实施例16：心肌梗塞受试者血清中的CTGF

检测心肌梗塞患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。来自正常供体和心肌梗塞患者的血清获自Intergen公司。患者的心肌梗塞进行症状诊断并进一步通过评估患者血清中肌钙蛋白I的水平来确定。在10个检测的患者中，肌钙蛋白I水平的范围从14.1到103ng/ml。所用肌钙蛋白I试验方法是AXSYM免疫测定系统(AbbottLaboratories，Abbott Park IL)，相应参考范围是0.0到0.5ng/ml。

如图10所示，心肌梗塞患者血清中的CTGF水平仅稍高于正常个体血清中确定的水平。心肌梗塞受试者血清中CTGF C-末端片段水平与正常个体血清中发现的水平相同或稍低。然而，在心肌梗塞患者血清中可检测到CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平高于这些患者血清中的CTGF和CTGF C-末端片段水平。因此，检测、测量和比较这些患者血清中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平显示最近证明为心肌梗塞的患者中CTGF N-末端片段显著增加。

实施例17：肝纤维化受试者血清中的CTGF

检测诊断为进行性肝纤维化患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。来自正常供体和肝纤维化患者的血清获自Intergen公司。如图10所示，在获自正常个体的血清中检测到低水平CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段。这些结果表明在正常血清中，CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段范围为约0到20ng/ml。肝纤维化患者血清中的CTGF C-末端片段水平与正常个体血清中发现的水平相同。

然而，进行性肝纤维化患者血清中CTGF和CTGF N-末端片段的水平高于正常个体血清中的水平。检测、测量和比较这些患者血清中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平揭示肝纤维化患者中存在CTGF N-末端片段水平提高。

实施例18：关节炎滑液中的CTGF

确定关节炎滑液中CTGF和CTGF片段的水平。来自正常供体的血清获自Intergen公司。来自炎性关节疾病患者滑液的样品取自患者膝盖，获自VitalProducts(Delray Beach FL)。如图11所示，在关节炎滑液中不能检测到CTGF和CTGF C-末端片段水平。相反，在关节炎滑液中检测到CTGF N-末端片段且N-末端片段水平提高(相较CTGF和CTGF C-末端片段)。检测、测量和比较这些患者关节炎滑液中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平揭示诊断为炎性关节疾病患者中存在CTGF N-末端片段水平提高。

实施例19：玻璃状液中的CTGF

检测诊断为眼病患者死后玻璃状液中CTGF和CTGF片段的水平。玻璃状液购买自Lions Eye Bank of Oregon(Portland OR)。图12A显示对取自受试者的玻璃状液进行CTGF测定的结果，受试者有或没有临床诊断的眼病。眼病包括1型糖尿病视网膜病诱导的失明、白内障和轻微斑点降解的2型糖尿病和非糖尿病双侧白内障。如图12A所示，临床诊断为眼病患者玻璃状液中CTGF N-末端片段水平高于没有临床诊断为眼病患者玻璃状液中的水平。

CTGF片段表达水平获得的数据可表示为样品中CTGF N-末端片段水平和相同样品中CTGF水平的比例，或表示为样品中CTGF C-末端片段水平和相同样品中CTGF水平的比例。数学转换用玻璃状液中CTGF和CTGF N-末端片段水平获得的数据来进行(图12A)。用上述数据(样品来自玻璃状液)检测CTGF C-末端片段和CTGF水平的比例，结果示于图12B(N-末端片段/CTGF)。CTGF N-末端片段和CTGF水平的比例显示进一步的证据确定CTGF N-末端片段水平提供生物样品中CTGF表达的更敏感和更可靠评估。

进一步分析数据以确定样品间CTGF和其片段水平获得值的统计显著性，样品来自正常和患病受试者。对图12所示数据进行T-试验分析。使用CTGF测定(N-C试验)，如T-试验所确定(P＝0.150)，与疾病玻璃状液相比获自正常样品的CTGF水平差异统计不显著。

此外，同样用CTGF兔多克隆抗体对CTGF进行ELISA测定。此抗体制备在CTGF免疫兔中生成(用本领域已知的标准过程)，因此包含多种识别CTGF多肽内多种抗原表位的抗体。用此兔多克隆抗体进行检测和测量CTGF的ELISA测定，使用本领域已知过程。CTGF的兔多克隆抗体实验不能区分CTGF、CTGF N-末端片段或CTGFC-末端片段。用兔多克隆抗体的ELISA测定结果示于图12A(兔多克隆)。分析用CTGF兔多克隆抗体获得的CTGF水平数据表明如T-试验所确定(P＝0.317)，与疾病玻璃状液相比获自正常样品的CTGF水平统计不显著。这表明此区分CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的方法不能可靠比较正常和疾病状态的CTGF水平。

相反，T-试验分析测定获得值显示与疾病个体相比来自正常样品玻璃状液的CTGF N-末端片段量有统计显著的差异(P＝0.007)，测定测量CTGF N-末端片段水平。对CTGF N-末端片段和CTGF水平的比例进行的T-试验表明与疾病个体相比来自正常样品玻璃状液的CTGF N-末端片段量有显著差异(P＝0.003)。因此，单独检测和测量CTGF水平不提供区分正常和疾病状态CTGF水平的统计显著数据。然而如本发明所述，检测和测量CTGF N-末端片段水平不提供区分正常和疾病状态CTGF N-末端片段水平的统计显著数据。

实施例20：癌症患者血清中的CTGF

检测癌症患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。来自正常供体和癌症患者的血清获自Intergen公司。下列癌症标记的检测和测量由Intergen公司进行。

CA 15-3是肿瘤细胞流入血流的粘液素-类似的膜糖蛋白。CA 15-3是用于调控乳腺癌患者的血清癌症抗原。CA 15-3水平用来自Bayer Diagnostics(TarrytownNY)的异源夹层磁性分离试剂盒和试剂确定。如果血清中获得的值大于30U/ml，认为患者CA 15-3阳性。试验标准参考范围是0到30U/ml。所有CA 15-3患者是女性。年龄范围从45到88岁，CA 15-3水平范围从32到1,292 U/ml。这些样品定义为“乳和卵巢”癌样品(图13中的样品组CA 15-3)。所有测试的CA 15-3阳性患者有三分之一CA 15-3水平比30U/ml的标准临床参考水平高10倍。

发现属于细胞表面糖蛋白家族的癌胚抗原(CEA)在多种恶性肿瘤中表达增加。CEA是用于监控胃肠道和乳腺癌的癌抗原。CEA水平用自Bayer Diagnostics的异源夹层磁性分离试剂盒和试剂确定。如果血清中获得的值大于5ng/ml，认为患者CEA阳性。试验标准参考范围是从0.1到4.9ng/ml。CEA阳性患者包括男性和女性，从30到79岁，CEA水平在5.5和2,950ng/ml间。这些患者样品定义为“结肠直肠、GI和乳”癌样品(图13中的样品组CEA)。所有测试的CEA阳性患者有三分之一CEA水平比标准临床参考范围高10倍。

前列腺特异抗原(PSA)是主要由上皮细胞生成的糖蛋白，上皮细胞邻接腺泡和前列腺管。血清PSA水平提高是前列腺病理的重要标记，且用做早期检测前列腺癌的肿瘤标记。PSA水平用自Bayer Diagnostics的异源夹层磁性分离试剂盒和试剂确定。如果血清中获得的值大于8.0ng/ml，认为患者PSA阳性。试验标准参考范围是从0到4ng/ml。所有PSA阳性患者是男性。年龄范围从55到96岁，PSA水平范围从8.3到1,919.0ng/ml。这些样品定义为“前列腺”癌样品(图13中的样品组PSA)。所有测试的PSA阳性患者有三分之一PSA水平比标准临床参考范围高10倍。

CA 19-9是肿瘤相关的粘液素，包含唾液酸化的路易斯-A五糖抗原表位、乳酸-N-岩藻戊糖(fucopentaose)II。CA 19-9由胰腺、胃、胆囊、结肠、卵巢和肺的腺癌生成并流入循环。CA 19-9水平由Bayer Diagnostics确定。这些样品定义为“胰腺、GI和肝”癌样品(图13中的样品组CA 19-9)。

如图13所示，如一些癌标记水平提高所确定(如上面图13所述和显示)，不同癌症种类的癌症患者血清中CTGF N-末端片段水平高于正常个体血清中的CTGF N-末端片段水平。检测、测量和比较这些患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段水平显示诊断为多种癌症形式的患者中存在CTGF N-末端片段水平增加。

实施例21：I型糖尿病受试者尿中的CTGF N-末端片段

诊断为I型糖尿病受试者尿中的CTGF N-末端片段水平用上述CTCF ELISA测定检测和测量。I型糖尿病患者的肾管损坏程度通过测量他们尿中白蛋白的量(蛋白尿)来评估，白蛋白通常用于指示高级肾病如糖尿病肾病。尿蛋白(白蛋白)分泌水平为20到200μg/分钟，则认为患者少量蛋白尿试验结果阳性。大量蛋白尿定义为超过200μg/分钟的尿蛋白(白蛋白)分泌水平。尿蛋白(白蛋白)分泌水平小于20μg/分钟则认为患者正常。因此在进行蛋白尿试验的结果基础上，I型糖尿病患者归类为正常、少量蛋白尿或大量蛋白尿。

测量I型糖尿病患者尿中的CTGF N-末端片段水平，并与测量的尿肌氨酸酐水平相比。如图14A所示，这些个体中CTGF N-末端片段水平获得的值转换(数学转换)成对数标度。结果表示为纳克CTGF N-末端片段每毫克肌氨酸酐。如图14A所示，有少量蛋白尿和大量蛋白尿的I型糖尿病患者尿中CTGF N-末端片段水平高于无蛋白尿的I型糖尿病患者。在这些样品中没有检测到CTGF或CTGF C-末端片段(数据没有显示)。每毫克尿肌氨酸酐的CTGF N-末端片段水平(纳克)在有大量蛋白尿的患者尿中最高。

数学转换数据后对数标度图表结果揭示尿中测量的CTGF N-末端片段水平与测量组(即有正常蛋白尿、少量蛋白尿或大量蛋白尿的患者)中肾管损坏程度(通过蛋白尿/肌氨酸酐水平测量)相关。(见图14A)

I型糖尿病患者尿中CTGF N-末端片段水平也与分泌到这些个体尿中的白蛋白比例相比。测量分泌到尿中的白蛋白比例(表示为微克白蛋白每分钟)常用于指示肾损坏程度或肾病严重性。随着肾损坏增加，肾的适当或正常功能进一步被削弱，观察到分泌入尿中的白蛋白比例高于正常肾。如图14B所示，CTGF N-末端片段水平增加(表示为纳克CTGF N-末端片段每毫克肌氨酸酐)与I型糖尿病患者尿中白蛋白分泌比例增加非常相关。图14B中的箭头指示正常个体中白蛋白分泌比例的最上限。

实施例22：硬皮病患者血浆中的CTGF

硬皮病是结缔组织疾病，特征为皮肤、血管、骨骼肌和内脏的纤维化、变性和炎症变化。邻接小动脉壁细胞的损伤和皮肤中硬创伤类似纤维组织的异常累积是此疾病的特点。硬皮病患者可能发展出局部或全身形式的疾病。在局部硬皮病中，通常手和脸皮肤区域最受影响。在全身性硬皮病中，身体器官、皮肤的普遍区域或两者都参与。全身性硬皮病也称为全身性硬化症，它有两个主要变体，称为限制性和扩散性硬皮病，两种形式都是累积型。限制性硬皮病的效果可以是普遍的，但通常不影响内脏。扩散性硬皮病可影响皮肤、结缔组织和其它器官的广泛区域。受影响个体的死亡可能来自胃肠、心脏或肺的包含。

用上述方法测量患扩散性或限制性硬皮病个体血浆中的CTGF和CTGF片段水平，并与正常个体血浆中所见的水平相比。在正常个体和患扩散性或限制性硬皮病个体间没有观察到CTGF或CTGF C-末端片段水平的显著差异。然而，与正常个体相比，在患扩散性或限制性硬皮病个体血浆中发现不同的CTGF N-末端片段水平。因此，检测、测量和比较这些个体血浆中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段显示患扩散性或限制性硬皮病个体血浆中CTGF N-末端片段水平提高，而通过确定CTGF或CTGF C-末端片段水平没有观察到此增加的水平。

实施例23：肺纤维化中的CTGF

肺损伤是抗癌治疗中常观察到的副作用。认为应用高剂量电离辐射引起有害的肺炎和肺纤维化。辐射性肺炎最终导致肺纤维化，被认为由辐射诱导的限于辐射区域的局部细胞因子生成引起。当辐射结合放射敏化细胞毒性药物时，随即的纤维化似乎比单独辐射治疗所观察到的更明显且开始更迅速。没有充分确定与从肺炎发展到纤维化相关的具体病理变化。目前这些患者中肺功能损失的测量和确定用于测定纤维化的程度和进展。

实验证据表明肺损伤后CTGF表达提高。例如，小鼠中显示CTGF水平在博来霉素-诱导的肺纤维化中提高。(Lasky等，(1998)Am J Physiol 275：365-371)此外，与来自健康、不吸烟对照无肺纤维化患者的BAL液中存在的相比，CTGF mRNA水平在间质性肺炎纤维化(IPF)患者的气管泡灌洗(BAL)液中增加超过10倍，在结节病患者阶段I/II中增加超过40倍，在结节病患者阶段III/IV中增加超过90倍。(Allen等，(1999)Am J Respair Cell Mol Biol 21：693-700)因此，预期有或没有结合含放射敏化细胞毒性药物治疗时，CTGF和CTGF片段在接受辐射暴露的患者血浆和BAL液中增加。因此血浆、唾液或肺灌洗中CTGF或CTGF片段水平的变化作为接受放疗患者中肺病理变化的诊断测量。因而，用本发明方法监控这些治疗处理后的CTGF和CTGF片段水平提供具体治疗发生后纤维化反应的诊断预测。

实施例24：血吸虫病中的CTGF

血吸虫病高级病例的特征是肝中存在血吸虫卵。在未治疗患者中，卵的肉芽肿反应后发展广泛的肝纤维化和肝肿大。门管周纤维化伴随着脾肿大、门静脉膨胀和发展间接门体静脉。(Kardorff等，(1999)Acta Tropica 73：153-164)这些变化与纤维化标记血清水平增加正相关，如羧基末端原胶原IV肽(NC1)和类透明质酸。(Kardorff等，(1999)同上和Richard-Blum等，(1999)Am J Trop Med Hyg60：658-663)

血浆、尿或组织活组织切片检查中的CTGF或CTGF片段水平变化用作患血吸虫病个体中产生的肝病理变化的诊断测量。因此，用本发明方法监控这些个体中CTGF和CTGF片段水平提供感染和发展血吸虫病后肝中纤维化反应的诊断预测。

实施例25：炎症和感染疾病中的CTGF

狭窄性细支气管炎也在肺移植患者中称为闭塞性细支气管炎，包括主要在膜壁和相邻组织和腔变窄所得呼吸细支气管中发生的炎症和纤维化。缩窄性细支气管炎通常是肺和心-肺移植并发症，但也与骨髓移植相关。缩窄性细支气管炎也与风湿性关节炎、吸入毒性剂后、消化一些药物后相关，并作为儿童中腺病毒、A型流感、囊尾蚴和支原体肺炎感染的罕见并发症。目前，由于损伤的斑点分布、获得广泛性纤维化晚期损伤组织的技术困难和不能识别损伤，难以作出肺移植和其他患者中缩窄性细支气管炎的组织病理诊断。在疾病的早期阶段，缩窄性细支气管炎可能在常规苏木精-曙红-染色标本中稀薄且易错过，而在高级阶段，如果肺中斑点创伤确定为非特异性，疾病可能同样难诊断。

炎症和感染疾病的其它例子与纤维化反应相关，其中CTGF和CTGF片段水平的检测和测量在这些疾病的诊断和预测中有用，包括下列：初级胆硬化、主要影响女性的自身免疫疾病，特征是具炎症和最终纤维化入口的小肝内胆汁管发生慢性破坏；先天性肺纤维化，最近确定特征为有腺病毒参与先天性肺纤维化或胶原维管疾病相关间质性肺炎的发病；肾肝细胞感染，如肾盂肾炎(即肾实质和肾盂内层发炎，通常由于细菌感染导致)，认为是获得性(出生后)肾创伤的先决条件。

血浆、尿或组织活组织切片检查中的CTGF或CTGF片段水平变化用作感染和炎症后组织纤维化反应起始和发展的诊断测量。因此，用本发明方法监控这些个体中CTGF和CTGF片段水平提供感染多种疾病相关炎症后的诊断预测和监控纤维化反应的方法。

除了本文所示和所述的，通过上面的描述，本发明的多种修改对于精通本领域技术人员是显然的。这些修改在附加权力要求范围内。

所有本文所引用的参考文献全部纳入供参考。

                          序列表

<110>S.L.维茨(eitz，Stephen L)

     W.R.尤辛格(Usinger，William R)

<120>测定结缔组织生长因子的方法

<130>FP0812 US

<150>US 60/323,305

<151>2001-09-18

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1050

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgaccgccg ccagtatggg ccccgtccgc gtcgccttcg tggtcctcct cgccctctgc  60

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tacaggaaga tgtacggaga catggcatga                                   1050

<210>2

<211>349

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu

1               5                   10                  15

Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro

            20                  25                  30

Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser

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Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu

    50                  55                  60

Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu

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Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr

                85                  90                  95

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            100                 105                 110

Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp

        115                 120                 125

Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro

    130                 135                 140

Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys

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Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly

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Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp

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Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg

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Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe

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<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

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<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

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<210>5

<211>349

<212>PRT

<213>Bos taurus

<400>5

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1               5                   10                  15

Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Ser Ser Gln Asp Cys Ser Ala Pro

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Cys Gln Cys Pro Ala Gly Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser

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Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu

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Ser Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu

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<210>6

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<213>猪(Sus scrofa)

<400>6

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Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys

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Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp

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        275                 280                 285

Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu

    290                 295                 300

Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Ser Met Met Phe Ile

305                 310                 315                 320

Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe

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<210>7

<211>347

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>7

Met Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Val Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu

1               5                   10                  15

Leu Cys Thr Arg Pro Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys Gln

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Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu Val

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Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly Ala

        115                 120                 125

Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro

    130                 135                 140

Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu

145                 150                 155                 160

Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Arg Thr Val Val Gly Pro Ala

                165                 170                 175

Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr Met

            180                 185                 190

Met Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser

        195                 200                 205

Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Thr

    210                 215                 220

Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys

225                 230                 235                 240

Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile Arg

                245                 250                 255

Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys Thr

            260                 265                 270

Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp Gly

        275                 280                 285

Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe Lys

    290                 295                 300

Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys Thr

305                 310                 315                 320

Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu Ser

                325                 330                 335

Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala

            340                 345

<210>8

<211>348

<212>PRT

<2 13>小鼠(Mus musculus)

<400>8

Met Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Ile Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu

1               5                   10                  15

Ala Leu Cys Thr Arg Pro Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys

            20                  25                  30

Gln Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro His Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu

        35                  40                  45

Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly

    50                  55                  60

Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe

65                  70                  75                  80

Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr Ala

                85                  90                  95

Lys Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ser Gly

            100                 105                 110

Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly

        115                 120                 125

Ala Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser

    130                 135                 140

Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys

145                 150                 155                 160

Lys Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Arg Thr Ala Val Gly Pro

                 165                 170                175

Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr

            180                 185                 190

Met Met Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys

        195                 200                 205

Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn

    210                 215                 220

Thr Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro

225                 230                 235                 240

Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys

            260                 265                 270

Thr Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp

        275                 280                 285

Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe

    290                 295                 300

Lys Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys

305                 310                 315                 320

Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu

                325                 330                 335

Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala

            340                 345

Claims (22)

1.一种测量样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在适于结合的条件下使样品接触特异性结合CTGF N-末端片段区域的第一试剂；

(b)分离第一试剂；和

(c)测量结合第一试剂的多肽水平。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一试剂与底物结合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是抗体或其功能片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

(a)在适于结合的条件下加入第二试剂，第二试剂选自特异性结合第一试剂的试剂和特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF区域的试剂；

(b)除去未结合的第二试剂；

(c)测量结合的第二试剂的量，其中结合的第二试剂的量对应于样品中含CTGFN-末端片段的多肽的水平。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二试剂附于可检测标记。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述可检测标记选自荧光团、放射性同位素和酶缀合物。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二试剂特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF区域，且其中所述第二试剂进一步特异性结合CTGF N-末端片段区域。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二试剂特异性结合第一试剂，且其中所述第二试剂进一步与含CTGF N-末端片段的多肽竞争结合第一试剂。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二试剂特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF区域，且其中所述第二试剂进一步特异性结合CTGF C-末端片段区域。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二试剂是抗体或其功能片段。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二试剂是任选连接载体的肝素。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品获自哺乳动物。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品选自尿或血浆。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括比较样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和CTGF N-末端片段的标准水平，其中，样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和CTGF N-末端片段标准水平间的差异指示CTGF相关疾病的存在。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述CTGF相关疾病选自肾纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、炎性关节疾病、癌症、糖尿病、硬皮病、器官移植、腹膜透析或心肌梗塞。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括比较第二个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第一个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平，其中，第一个和第二个样品在不同时间段获自相同来源，第二个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第一个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平间的差异指示含CTGF N-末端片段的多肽水平随着时间的变化。

18.一种诊断CTGF相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)测量受试者样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；

(b)比较样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和标准水平，其中，样品中含CTGF N-末端片段的多肽量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。

19.一种预测CTGF相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)测量受试者样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；

(b)比较样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和标准水平，其中，样品中含CTGF N-末端片段的多肽量增加或减少指示CTGF相关疾病的存在。

20.一种监控受试者中CTGF相关疾病进展的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在第一个时间点从受试者中获得第一个样品；

(b)在第二个时间点从受试者中获得第二个样品；

(c)测量第一个和第二个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；

(d)比较第一个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第二个样品中含CTGFN-末端片段的多肽水平，其中，第一个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第二个样品中含CTGF N-末端片段的多肽水平间的差异指示CTGF相关疾病的进展。

21.一种测量样品中含CTGF C-末端片段的多肽水平的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在适于结合的条件下使样品接触特异性结合CTGF C-末端片段区域的第一试剂；

(b)分离第一试剂；

(c)加入特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF C-末端片段区域的第二试剂；

(d)除去未结合的第二试剂；

(e)测量结合的第二试剂的量。

22.一种检测和测量样品中CTGF的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

(a)特异性结合CTGF区域的第一试剂；

(b)特异性结合与第一试剂结合区域不同的CTGF区域的第二试剂。

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