CN101780067A - 一种治疗糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提取自桑白皮的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯在制备治疗糖尿病肾病药物的应用，该治疗糖尿病肾病的药物组合物其由作为活性成分的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯，以及常规的药物载体组成，所述活性成分的含量为0.1-99.5wt％。该药物组合物主要应用于制备治疗糖尿病肾病药物中。本发明的药物组合物对糖尿病肾病有显著的防治作用，使用方便，为患者提供了新的治疗候选药物。

Description

一种治疗糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药制药领域，具体地说，涉及一种以化合物二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(4，4′-diphenylmethane-bis(methyl)carbamates，DPMC)为活性成分的药物组合物及其在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

背景技术

糖尿病及其慢性并发症已严重影响人类健康和生活质量。近年来，糖尿病发病人数呈上升趋势。全世界各年龄组的糖尿病发病率，在2000年约为2.8％，到2030年预计为4.4％。患糖尿病人数将从2000年的1.71亿增加到2030年3.33亿。中国每年糖尿病的发病率在不断上升，患病人数仅次于印度，居世界第二位。糖尿病及其慢性并发症的防治是当今面临的重要课题。糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病的重要并发症之一，在西方国家已成为导致终末期肾衰竭的首位疾病。2003年世界卫生组织资料显示，如果不控制血糖，大约有30％的1型糖尿病患者和25％～40％的2型糖尿病患者发展成为糖尿病肾病。糖尿病肾病发病隐匿，早期不易被发现，出现症状时肾脏的病变已经不可逆转。长年糖尿病导致肾脏的滤过功能被破坏，最初表现为微量白蛋白尿。随着病程延长，尿蛋白增加，肾脏排除血中毒素的能力逐渐减退，最终发展为终末期肾病(ESRD)，只能依靠血液透析或肾移植来维持生命。

糖基化终末产物(AGEs)，是蛋白质和脂质等大分子物质与还原糖羰基非酶催化的共价结合产物。在无酶催化条件下，葡萄糖分子游离醛与蛋白质氨基首先形成可逆的希夫碱，后者经结构重排形成较稳定的酮胺化合物(Amadori产物)，再经过脱水、氧化和缩合等反应，最后形成稳定的、不可逆的AGEs。AGEs极易与蛋白质、核酸、脂类等生物大分子形成交联物，在细胞内沉积，干扰细胞正常功能，与糖尿病并发症密切相关。AGEs与RAGE(AGEs受体)相互作用，诱导产生或激活大量包括前致炎因子和前致纤维化因子等在内的多种细胞因子，导致细胞肥大，基质增生，肾小球纤维化等病理改变，在糖尿病肾病发生发展中起重要作用，是主要致病因素之一。

干预AGEs的形成、消除已形成的AGEs、改善AGEs所诱发的各种肾病症状可以预防和治疗糖尿病肾病(Bohlender JM，Franke S，Stein G，et al.Advancedglycation end products and the kidney.Am J Physiol Renal Physiol，2005，289(4)：645-659)。

桑白皮(Cortex Mori)为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，性甘、寒，具有泻肺平喘、利水消肿的功能，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿，近年的药理学研究表明桑白皮具有降血糖血压、利尿、镇咳平喘、抗HIV抗肿瘤等方面的活性。自20世纪70年代有学者从桑白皮中分离并证实了降血糖成分1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)和桑糖苷元(Moran A)以来，从桑白皮中分离更多更具活性的化学成分包括降血糖成分得到越来越多人的关注。DPMC为首次从桑白皮水提物中分离得到的新的天然产物，以往的人工合成品仅局限于化工领域，用于制备二苯甲烷二异氰酸酯(MDI)，后者是合成聚氨酯的主要原料。目前DPMC在医药领域的应用国内外鲜有文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法，该药物组合物的活性成分是提取自桑白皮的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯。

解决上述问题的技术方案如下：

一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，其由作为活性成分的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯，以及常规的药物载体组成，所述活性成分的重量百分比含量为0.1-99.5％。

优选地，所述活性成分的重量百分比含量为5-70％。

本发明药物组合物所述常规的药用载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖或乳糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物可以通过常规制剂方法制备成常规的剂型，常规剂型主要为口服制剂，如固体制剂片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、粒剂、胶囊等，液体制剂水或油悬浮剂或其它液体制剂如酏剂等。

优选地，所述药物组合物为片剂、颗粒剂、丸剂或胶囊。

本发明所述药物组合物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，临床口服使用的参考剂量是20-120mg/d。

本发明的另一目的是提供上述药物组合物的制备方法。采用了以下技术方案：

一种治疗糖尿病肾病的药物组合物的制备方法，将活性成分二苯甲烷二氨基甲酸甲酯与常规的药用载体混合即得。

A.取桑白皮切碎磨成粉，加水回流提取后合并提取液，减压浓缩至一定的体积；

B.将步骤A得到的提取液置于树脂中，经水和95％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩得浸膏；

C.浸膏以硅胶层析柱分离，分别以石油醚、石油醚-乙酸乙酯100∶1，石油醚-乙酸乙酯50∶1洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯50∶1洗脱部分得无色片状晶体。

本发明药物组合物可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如活性成分与多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明还提供了二苯甲烷二氨基甲酸甲酯在制备治疗糖尿病并发症的药物中的应用，优选地，所述应用为该药物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

本发明药物组合物具有以下有益效果：

1.本发明首次从桑白皮中提取得到二苯甲烷二氨基甲酸甲酯，并证明了其具有降血糖的功能，为糖尿病及其并发症患者提供了新的治疗候选药物。

2.本发明的药物组合物可加工成口服剂型如颗粒剂、滴丸、冲剂、片剂等，使用方便。

3.本发明的药物组合物具有显著治疗和预防糖尿病时肾小球损害的作用，由于可显著预防糖尿病时血肌酐的升高、显著降低糖尿病大鼠的尿量和尿蛋白，降低肾指数，表明对糖尿病肾病有显著的防治作用。

4.本发明的药物组合物对糖尿病肾病的治疗效果明显优于桑白皮水提物，并且活性成分明确，质量易于控制，克服了传统中药中有效成分不明确、质量控制难、有一定的毒副作用等缺点。

附图说明

图1是DPMC对AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞外TGFβ-1表达的影响(200×)；

其中：A：正常对照组；B：AGEs(5mM/L)；C：阴性对照组；D：桑白皮水提物(0.1mg/mL)；E：DPMC(0.5nM/L)；F：DPMC(5nM/L)；G：DPMC(25nM/L)；H：DPMC(125nM/L)。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。

实施例1：制备二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(DPMC)

取桑白皮(Cotex Mori)10kg，切碎磨成粉，加100L水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至一定的体积，置D101大孔树脂中，先用水洗脱，再用95％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩得浸膏，浸膏以硅胶层析柱分离，分别以石油醚、石油醚-乙酸乙酯100∶1，石油醚-乙酸乙酯50∶1洗脱，石油醚-乙酸乙酯(50∶1)洗脱部分有无色片状晶体析出，经红外、紫外、核磁共振和质谱等分析确定其结构为二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(4，4′-diphenylmethane-bis(methyl)carbamates，DPMC)，分子式：C₁₇H₁₈N₂O₄，分子量：314，其结构如下：

实施例2：本发明药物组合物片剂的制备

每片含有下述成分：

二苯甲烷二氨基甲酸甲酯    12mg

乳糖                      175mg

玉米淀粉                  50mg

硬脂酸镁                  3mg

制备方法：将二苯甲烷二氨基甲酸甲酯、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重240mg，活性成分含量为12mg。该片剂用于高尿蛋白症、糖尿病肾病的治疗，具有良好的效果。

实施例3：本发明药物组合物胶囊的制备

步骤如下：

A.取蜂蜡4.2g，加月见草油125g，80℃水浴下熔融混匀，冷却至室温(25℃)后加入叔丁基对羟基茴香醚和枸椽酸适量，充分混匀；

B.加入过100目筛的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯0.25g、卵磷脂5g，加月见草油至250g，充分混匀，作为囊心液，压制成1000粒胶囊。

本实施例所得胶囊用于治疗高血糖症、糖尿病肾病等具有良好的效果。

实施例4：本发明药物组合物滴丸的制备

取二苯甲烷二氨基甲酸甲酯15g，经超微粉碎过200目筛后得细粉，加入至熔融的15g聚乙二醇4000基质中，搅匀，以二甲苯硅油为冷却剂，滴制法制丸，干燥，制得二苯甲烷二氨基甲酸甲酯滴丸。该滴丸用于血肌酐增多尿肌酐排出减少症、糖尿病肾病的治疗有着良好的效果。

实施例5：本发明药物组合物分散片的制备

精密称取处方量的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯280g、乳糖40g、微晶纤维素70g、交联聚维酮5.25g、阿斯巴甜2.5g、聚维酮6g、碳酸氢钠4g，按等量递加法将主药混合物与各种辅料先手工混合均匀。过80目筛两遍。混匀后的物料置适当容器中，加入含15％(g/100ml)聚乙二醇6000的75％乙醇溶液适量，制软材。20目挤压过筛制湿颗粒。湿颗粒平摊于搪瓷盘中，置鼓风恒温干燥箱中，70℃干燥2小时。精确称量干燥颗粒的重量，加入2.25g剩余交联聚维酮，按1％的量加入十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀后，7mm圆形冲模压制成1000片。即得二苯甲烷二氨基甲酸甲酯分散片1000片。用于治疗糖尿病肾病及并发病，具有良好的效果。

实施例6：本发明药物组合物片剂的制备

活性成分：    70g

微晶纤维素    0.4g

              制成1000片

制备方法：将活性成分和微晶纤维素混合，用水均匀湿润制成软材，把湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入滑石粉，再过筛，然后将混合物压片，每片重70.4mg，活性成分含量为70mg。本品口服用于治疗糖尿病肾病及并发症，具有良好的效果。

本发明将二苯甲烷二氨基甲酸甲酯用于医药领域，观察了活性成分二苯甲烷二氨基甲酸甲酯对AGEs引起的肾小球系膜细胞外基质增生的影响，和对STZ糖尿病肾病大鼠病变的影响，验证了其防治糖尿病肾病的作用。

试验例1：

二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(DPMC)对AGEs引起的肾小球系膜细胞外基质增生的影响

糖尿病肾病的特定病征为系膜区细胞外基质增多而引起肾小球系膜基质硬化。系膜细胞是肾小球的重要组成细胞，具有收缩、内分泌、分裂增殖、免疫及吞噬作用多种功能，对肾小球生理功能的调解起着重要作用。AGEs可引起肾组织细胞外基质增生，是糖尿病肾病的重要病变。

1实验材料

大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1(武汉细胞生物研究所)；DPMC，桑白皮水提物；牛血清白蛋白，D-葡萄糖(Sigma)；新生牛血清(杭州四季青血清厂)；TGFβ-1抗体(Canta Cruz)；DAB显色系统(Gene Tech Biotechnology CompanyLimited)；羟脯氨酸含量测定试剂盒(南京建成)。

2实验方法

2.1桑白皮水提物及AGEs的制备

桑白皮水提物制备：取桑白皮(Cotex Mori)适量，切碎磨成粉，加10量水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至一定的体积，备用。

AGEs制备：将质量分数为5％的无球蛋白的牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)与0.5mol/L D-葡萄糖共同溶解于0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)中，经0.22μm滤膜过滤除菌后，置37℃培养箱内孵育60d。糖基化产物孵育结束后，未结合的物质通过对磷酸缓冲盐溶液的广泛透析而除去，Folin-酚法测定其浓度，稀释成实验所需浓度，0.22μm滤膜过滤除菌备用。

2.2大鼠肾小球系膜细胞培养液准备

引起系膜细胞病理改变的AGEs最适浓度与作用时间的确定：取对数生长期HBZY-1细胞，以含5％新生牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，以100μl/孔接种于96孔板，细胞数1×10⁴/孔，37℃，5％CO₂培养箱培养24h后，换用100μl无血清的DMEM，再孵育24h使细胞生长同步进入休止期(同步化)。弃细胞上清液，加入90μl 5％新生牛血清的DMEM培养基和10μl梯度稀释AGEs，每组设置6个重复，于培养箱中分别按时间梯度培养。MTT法测定鼠肾小球系膜细胞增殖程度。结果表明，0.25mg/ml AGEs，培养48h为肾小球系膜细胞增殖最适条件。

取24孔板培养的同步化处理的HBZY-1细胞，弃细胞上清液，各药物组每孔均加入含5％新生牛血清的DMEM培养基800μl和100μl葡萄糖(终浓度为25mmol/L)，再向孔内分别加入100μl桑白皮水提物(终浓度为0.1g/L)，各浓度的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯溶液(终浓度分别为0.5nM/L、5nM/L、25nM/L、125nM/L)。正常对照组加1mlDEME培养基，AGEs组加900μl DMEM培养基和100μlAGEs(终浓度为0.25mg/ml)。每组设置六个重复。于37℃，5％CO₂培养箱中再孵育48h，细胞铺满玻片后，吸出细胞上清，作羟脯氨酸含量检测；取出细胞爬片，固定，留作染色和细胞免疫组化染色。

TGFβ-1染色流程如下：4％多聚甲醛固定细胞爬片30min；新配含3％H₂O₂的甲醇溶液灭活内源性辣根过氧化物酶10min，蒸馏水洗3次；5％BSA封闭非特异性抗原20分钟；滴加TGFβ-1一抗(1∶500)，4℃过夜，PBS(pH7.4)洗2min×3次；滴加生物素化山羊抗小鼠抗体(二抗)，37℃30min，PBS(pH 7.4)洗2min×3次；滴加HRP标记的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，37℃30min，PBS(PH 7.4)洗5min×4次；滴加50μ1DAB染色液，室温显色15min，蒸馏水充分洗涤；苏木素轻度复染1min，水洗；酒精梯度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

3统计与分析

测定各组中大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸含量，测定结果用

表示，采用组间t检验进行统计学分析；显微镜下观测大鼠肾小球系膜细胞免疫组化摄片TGFβ-1的表达。

4结果

4.1二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(DPMC)对AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞上清液中羟脯氨酸含量增加的影响

从表1可以看出，桑白皮水提物、不同剂量的DPMC都能显著地降低AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞上清液中羟脯氨酸的含量增加，其中大剂量的DPMC(125nM/L)作用最强，且明显优于水提物组。

表1.DPMC对AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞上清液中羟脯氨酸含量增加的影响(

n＝6)

和AGEs组比较：*p＜0.05 **P＜0.01；和桑白皮水提物组比较：#p＜0.05

4.2DPMC对AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞TGFβ-1的表达的影响

附图1结果表明，AGEs能使大鼠肾小球系膜细胞外TGFβ-1表达增多，桑白皮水提物、不同浓度的DPMC均能对抗AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞外TGFβ-1的表达增多；DPMC大剂量的效果最佳；各浓度DPMC效果和桑白皮水提物相当或优于水提物。

试验例2：

二苯甲烷二氨基甲酸甲酯对STZ糖尿病肾病模型大鼠病变的影响

1材料和试剂

链佐菌素(Streptozotocin STZ，Sigma)；Wistar大鼠(由南方医科大学实验动物中心提供)；BIOBASE-PEARL分立式全自动生化分析仪(山东BIOBASE公司)。

2实验方法

2.1桑白皮水提物的制备

取桑白皮(Cotex Mori)适量，切碎磨成粉，加10量水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至一定的体积，备用。

2.2给药

经STZ小剂量多次给药造模，确认为糖尿病肾病模型的大鼠，随机分为6组，每组10只：模型组，阳性药物对照组(氨基胍，100mg/kg)，桑白皮水提物组(2000mg/kg)，本发明药物二苯甲烷二氨基甲酸甲酯3个剂量组(大剂量组，4mg/kg；中剂量组2mg/kg；低剂量组1mg/kg)，另取Wistar大鼠10只为正常对照组。

每天各组同体积不同浓度灌胃给予相应药物或生理盐水1次，连续给药14周。

3统计与分析

给药结束后，代谢笼收集24小时尿液，计算尿量，并测定尿液中总蛋白、微白蛋白，肌酐含量；眼眶取血，全自动生化仪测定各生化指标；取肾，10％甲醛固定，留做病理组织学检查。所有测定结果用

表示，采用组间t检验进行统计学分析。

4结果

4.1DPMC对STZ诱导的糖尿病肾病动物模型大鼠24小时尿量、尿总蛋白、微白蛋白及尿肌酐的影响

从表2可以看出，模型组动物24小时尿量、总蛋白排出量、微白蛋白排出量增加，尿液中肌酐排出明显减少；桑白皮水提物和不同剂量的DPMC均可明显对抗模型动物的上述变化：减少糖尿病肾病动物24小时尿量，降低24小时尿总蛋白、微白蛋白排出量，增加尿肌酐排出量，其中DPMC随着剂量提高，效果增强，量效关系明显。大剂量DPMC效果明显优于桑白皮水提物。

表2DPMC对糖尿病肾病模型大鼠尿量、尿总蛋白、微白蛋白及尿肌酐的影响(

n＝10)

和模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；和桑白皮组比较：^#p＜0.05^##p＜0.01

4.2二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(DPMC)对糖尿病肾病模型大鼠血清生化指标的影响

从表3可以看出，桑白皮水提物和DPMC均可明显降低糖尿病肾病动物血清中总胆固醇、丙二醛、血肌酐、血尿素氮、AGEs、低密度脂蛋白水平，显著提高血清SOD水平。剂量提高，DPMC效果增强；各剂量DPMC效果优于桑白皮水提物或相当。

表3DPMC对糖尿病肾病模型大鼠血清生化指标的影响(

n＝10)

和模型组比较：*P＜0.05  **P＜0.01；

其中TG：总胆固醇；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；AGEs：糖基化蛋白；LDL：低密度脂蛋白。

4.3二苯甲烷二氨基甲酸甲酯对糖尿病肾病模型大鼠肾小球CTGF表达和病理组织学的影响

从表4可以看出，与正常对照组相比，糖尿病肾病模型肾小球CTGF的表达显著增加(P＜0.01)，病理组织损伤(包括PAS染色)明显增加(P＜0.01)；桑白皮水提物和不同剂量的DPMC均能显著减少由STZ诱发的糖尿病肾病模型大鼠肾小球CTGF的表达，降低损伤病理学评分，其中DPMC剂量提高，效果增强；各剂量DPMC效果优于桑白皮水提物或相当。

表4二苯甲烷二氨基甲酸甲酯对糖尿病肾病模型大鼠肾小球CTGF表达和病理组织学的影响(n＝10)

和模型组比较：*P＜0.05  **P＜0.01；和桑白皮水提物组比较：#p＜0.05

Claims (7)

1.一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于：该药物组合物由作为活性成分的二苯甲烷二氨基甲酸甲酯，以及常规的药物载体组成，所述活性成分的重量百分比含量为0.1-99.5％。

2.根据权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于：所述活性成分的重量百分比含量为5-70％。

3.根据权利要求1或2所述的一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于：所述的常规的药物载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂或甜味剂中的至少一种，其中赋形剂为水，填充剂选自淀粉、蔗糖或乳糖；粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂为甘油；崩解剂选自琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；吸收促进剂为季铵化合物；表面活性剂为十六烷醇；吸附载体为高岭土或皂粘土；润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。

4.根据权利要求1或2所述的一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊或液体制剂。

5.一种制备如权利要求1所述的一种治疗糖尿病肾病的药物组合物的方法，其特征在于：将活性成分二苯甲烷二氨基甲酸甲酯与所述常规的药物载体混合，按照一定的制剂工艺制备，即得。

6.根据权利要求5所述的一种治疗糖尿病肾病的药物组合物的制备方法，其特征在于：所述活性成分二苯甲烷二氨基甲酸甲酯的制备方法为：

A、取桑白皮切碎磨成粉，加水回流提取后合并提取液，减压浓缩至一定的体积；

B、将步骤A得到的提取液置于树脂中，经水和95％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩得浸膏；

C、浸膏以硅胶层析柱分离，分别以石油醚、石油醚-乙酸乙酯100∶1，石油醚-乙酸乙酯50∶1洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯50∶1洗脱部分得无色片状晶体。

7.二苯甲烷二氨基甲酸甲酯在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。

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