CN107208094A - 稳定含有核酸分子的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有核酸分子和缓冲液的组合物，所述组合物的特征在于：(a)在常温下以溶液形式存在；和(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的该核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。

Description

稳定含有核酸分子的组合物
技术领域
本发明涉及一种包含具有生物学活性的核酸分子的组合物，例如，控制靶基因表达或靶蛋白功能的核酸分子，所述组合物是显示所述核酸分子改进的稳定性的新组合物，特别是药物组合物，以及其生产方法和液体组合物中核酸分子的稳定化方法。
背景技术
作为具有生物学活性的短链核酸分子，反义核酸、siRNA、shRNA、微小RNA(miRNA)、诱饵核酸(decoy nucleic acid)、核酶、适配子(aptamer)等是已知的，并且利用它们的药物制品的研发正在进行中(例如，专利文献1-3)。
由于这些核酸易在溶液中分解并且是不稳定的，在常温(ambient temperature)下操作是极其困难的。因此，通常已经普遍采用冻干和包括向Tris-EDTA(TE)缓冲液中加入50％乙醇并将其保存而不在-20℃下冷冻的方法。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：特许第2708960号公报
专利文献2：特许第3626503号公报
专利文献3：美国专利第7,511,131号说明书
发明内容
发明要解决的问题
在这种情况下，一直期望研发稳定的核酸制剂，所述核酸制剂在可操作性方面优越并能够在常温下稳定地保持作为活性成分的核酸。
本发明的课题在于提供包含作为活性成分的核酸的药物组合物及其制备方法，所述药物组合物是活性成分的稳定性得到改进的新药物组合物。
用于解决问题的方案
本发明人已经进行了深入的研究试图去解决前述问题，并发现通过使用能够调节核酸分子溶液的pH以落入特定的范围内的缓冲液，核酸的稳定性可以显著且出乎意料地改进，其导致了本发明的完成。
因此，本发明如下。
[1]包括核酸分子和缓冲液的组合物，并具有下列特征：
(a)在常温下以溶液的形式存在；和(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
[2][1]所述的组合物，其中在40℃、相对湿度75％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
[3][1]或[2]所述的组合物，其中在60℃下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上。
[4][1]至[3]任一项所述的组合物，其中缓冲液将组合物的pH调节至4.0以上且9.0以下。
[5][1]至[3]任一项所述的组合物，其中缓冲液将组合物的pH调节至5.5以上且7.5以下。
[6][1]至[3]任一项所述的组合物，其中缓冲液将组合物的pH调节至6.0以上且7.0以下。
[7][1]至[6]任一项所述的组合物，其中缓冲液包括选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、精氨酸盐酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸三钠二水合物、L-谷氨酸一钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乳酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡甲胺、甘氨酸、柠檬酸和乙酸的一种或多种缓冲剂。
[8][1]至[7]任一项所述的组合物，其中缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
[9][1]至[8]任一项所述的组合物，其中前述核酸分子是单链核酸分子或双链核酸分子。
[10][1]至[9]任一项所述的组合物，其中前述核酸分子为DNA分子、RNA分子或DNA和RNA的嵌合核酸分子。
[11][1]至[10]任一项所述的组合物，其中前述核酸分子的核苷酸数为10-300核苷酸。
[12][1]至[11]任一项所述的组合物，其中前述核酸分子包括控制靶基因表达或靶蛋白功能的序列。
[13][1]至[11]任一项所述的组合物，其包括含有控制靶基因表达的序列的核酸分子。
[14][1]至[13]任一项所述的组合物，其中前述核酸分子为反义核酸、siRNA或shRNA、miRNA、核酶、诱饵核酸或适配子。
[15][1]至[14]任一项所述的组合物，其是一种药物组合物。
[16]一种生产[1]至[15]任一项所述的组合物的方法，其包括将所述核酸分子溶于将所述组合物的pH调节至6.0以上且7.0以下的缓冲液，和将所述溶液在常温下保存。
[17]一种稳定组合物中的核酸分子的稳定化方法，其包括将所述核酸分子溶于将所述组合物pH调节至6.0以上且7.0以下的缓冲液，和将所述溶液在常温下保存。
[18][16]或[17]所述的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
[19][16]至[18]任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
发明的效果
根据本发明，可以提供在可操作性方面优越的新组合物，特别是药物组合物，其中作为活性成分的核酸分子具有改进的稳定性。
附图说明
图1示出用各pH的缓冲液制备的PH-0009溶液的25℃的稳定性试验的结果。
图2示出用各pH的缓冲液制备的PH-0009溶液的40℃的稳定性试验的结果。
图3示出用各pH的缓冲液制备的PH-0009溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图4示出用各浓度的柠檬酸缓冲液制备的PH-0009溶液的40℃的稳定性试验的结果。
图5示出用各浓度的柠檬酸缓冲液制备的PH-0009溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图6示出10mg/mL PH-0009溶液的稳定性试验的结果。
图7示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的NK-7006溶液的稳定性试验的结果。
图8示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的NK-7007溶液的稳定性试验的结果。
图9示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的PK-7006溶液的稳定性试验的结果。
图10示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的PK-7015溶液的稳定性试验的结果。
图11示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的PH-7069溶液的稳定性试验的结果。
图12示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的Kynamro-7001溶液的稳定性试验的结果。
图13示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的PH-7081溶液的稳定性试验的结果。
图14示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的NI-7001溶液的稳定性试验的结果。
图15示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的NM-7001溶液的稳定性试验的结果。
图16示出用0.05M柠檬酸缓冲液制备的Macugen-7001溶液的稳定性试验的结果。
图17示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的PK-7006溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图18示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的NK-7006溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图19示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的PH-7069溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图20示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的NI-7001溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图21示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的NM-7001溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图22示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的Kynamro-7001溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图23示出用各pH的0.05M柠檬酸缓冲液、0.05M磷酸缓冲液和0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液制备的Macugen-7001溶液的60℃的稳定性试验的结果。
具体实施方式
本发明提供在常温下以溶液的形式稳定地保存具有生物学活性的核酸分子的包含该核酸分子的组合物(以下也称为“本发明的组合物”)。如本文所使用的，“常温”意指15-30℃的温度范围，并且“稳定地保存”意指保存开始时(组合物制备时)核酸分子的80％以上在(1)4周以上，优选(2)12周(约3个月)以上，更优选(3)200周(约3.7年)以上保存而不分解。这种保存稳定性可以由以下稳定性试验的结果逐个确认或预测。
(1)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
(2)在40℃、相对湿度75％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
(3)在60℃下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上。
如本文所使用的，通过使用将与试样同量的核酸分子溶于注射用水获得的溶液(100％)和通过按9:1、8:2、7:3和6:4(分别为90％、80％、70％和60％)的比例混合所述溶液和注射用水获得的溶液作为校正曲线样品，将每个校正曲线样品进样10μL至HPLC以测定峰面积，绘制各个校正曲线样品的测量值，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积，通过最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，并将在相同条件下由HPLC测得的试样的峰面积应用至校正曲线以给出理论含量(％)，测定组合物中核酸分子的含量。上述HPLC的测定条件如下。
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：254nm)
色谱柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相供给：通过按如下方式改变流动相A和流动相B的混合比例控制浓度梯度。
表1
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
优选地，本发明的组合物具有在60℃下保存4周后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选85％以上，特别优选90％以上。
1.核酸分子
本发明的组合物中包含的核酸分子不特别限定，只要其为包含脱氧核糖核苷酸(DNA)和/或核糖核苷酸(RNA)作为构成单元的寡核苷酸或多核苷酸，以及可以由DNA或RNA单独构成或由DNA和RNA的嵌合核酸构成。核酸分子可以为单链的或双链的。当其为双链的，其可以为DNA双链、RNA双链、DNA-RNA杂交体中的任何一种。此外，其广泛地适用于核酸来源的结构体(由LNA、DNA、RNA等的核酸构成的分子体(molecular corpuscle)，具体为嵌合核酸、异源双链核酸或三链核酸结构体等)。
本发明的组合物中包含的核酸分子的碱基数通常为10-300，优选10-200，更优选10-150，进一步优选15-100，特别优选20-80。在本说明书中，除非另有说明，“siRNA”,“shRNA”,“miRNA”和“核酶”是基于功能的名称，其可以仅由RNA构成，或一个或多个(如1-30个、1-20个、1-10个、1-5(1、2、3、4、5)个)核苷酸任选地被DNA置换。
优选地，本发明的组合物中包含的核酸分子是一种具有生物学活性的分子，例如包含控制靶基因表达或靶蛋白功能等的核苷酸序列的分子。如本文所使用的，“控制”包含上调(表达或功能的促进)和下调(表达或功能的抑制)二者。包含控制靶基因表达的核苷酸序列的核酸分子的实例包括反义核酸、siRNA、shRNA、miRNA、核酶等。抑制靶蛋白功能的核酸分子的实例包括适配子、诱饵核酸等。
反义核酸是指由能够在表达靶mRNA(或其起始转录产物)或靶miRNA的细胞的生理条件下与该靶mRNA(或其起始转录产物)或靶miRNA杂交而得的碱基序列组成，且能够通过空间位阻或靶mRNA的分解(或抑制其起始转录产物的剪接)来抑制向由该mRNA编码的蛋白质的翻译、或能够通过抑制或分解靶miRNA来抑制miRNA对基因表达的控制的核酸。
反义核酸的靶区域的长度不特别限定，只要向蛋白质的翻译和通过miRNA对基因表达的控制可以被反义核酸的杂交抑制即可，并且例如短的长度为约10个碱基，长的长度为mRNA或起始转录产物的完整序列。考虑到合成容易性、抗原性、细胞内转移性等问题，优选约10个至约40个碱基长度，特别优选约15个至约30个碱基长度，虽然长度不限于此。
作为反义核酸，可以使用靶向任何公知的mRNA的核酸。优选的实例是针对编码可能会成为人类疾病的药物发现靶点的蛋白的mRNA的反义核酸。与人类疾病相关的反义核酸的具体实例包括但不限于靶向ApoB100(高胆固醇血症)、抗肌萎缩蛋白(肌肉萎缩症)、STAT3(恶性淋巴瘤)等的mRNA(或其起始转录产物)的反义核酸，以及靶向如miR-122(丙型肝炎)等miRNA等的反义核酸。
反义核酸的更具体的实例包括但不限于SEQ ID NO:1示出的米泊美生(mipomersen)(商品名：Kynamro；条件是，在上市药物中，RNA为2’-O-甲氧基化的并且胞嘧啶和尿嘧啶为5-甲基化的)(针对ApoB100mRNA的反义核酸)。
5’-GCCUCagtctgcttcGCACC-3’(SEQ ID NO:1)
(大写字母表示RNA，小写字母表示DNA)
可以通过基于cDNA序列或基因组DNA序列测定靶序列，并通过使用商购可得的DNA/RNA自动合成仪(Applied Biosystems,Beckman Instruments等)合成与其互补的序列来制备反义核酸。
siRNA是由具有与靶基因的mRNA的核苷酸序列或其部分序列(以下称为靶核苷酸序列)互补的序列的RNA和其互补链构成的双链寡聚RNA。另外，单链RNA也是siRNA的优选的实施方案之一，在所述单链RNA中，与靶核苷酸序列(第一序列)互补的序列和其互补序列(第二序列)通过发夹环部分相连，并且第一序列和第二序列的双链结构由发夹环型结构(小发夹RNA：small hairpin RNA,shRNA)形成。此外，哑铃型核酸也是优选的实施方案中的一种，在所述哑铃型核酸中，第一序列和第二序列的双链结构的两端均由环状结构封闭。
siRNA/shRNA可以在有义链和反义链之一或二者的5’末端或3’末端具有突出端(overhang)。突出端是通过一个至几个(如1、2或3个)碱基加至有义链和/或反义链的末端而形成的。
然而，siRNA/shRNA的碱基长度不特别限定，只要可以诱导RNA干扰即可，例如，一条侧链具有10-50碱基长度，优选15-30碱基长度，更优选21-27碱基长度。
作为siRNA/shRNA，可以使用靶向任何公知的mRNA的siRNA/shRNA，例如，优选针对编码可能会成为人类疾病的药物发现靶点的蛋白的mRNA的siRNA/shRNA。涉及人类疾病的siRNA/shRNA的具体实例包括但不限于，靶向结缔组织生长因子(CTGF)(纤维化)、呼吸道合胞体病毒(RSV)核衣壳(RSV感染)、RTP801(糖尿病性黄斑水肿)、甲状腺素运载蛋白(淀粉样变性)、胶原特异性分子伴侣(HSP47)(肝硬化)等的siRNA/shRNA等。
可以利用常规公知方法通过化学合成或利用基因重组技术生产来获得siRNA。也可适当地使用商购可得的核酸。
例如，可以基于将成为靶点的mRNA的碱基序列信息使用商购可得的软件(如RNAiDesigner；Invitrogen)适当地设计siRNA。其可以通过由商购可得的DNA/RNA自动合成仪(Applied Biosystems,Beckman Instruments等)合成mRNA上的靶序列的每一条有义链和反义链，使它们在适当的退火缓冲液中在约90℃至约95℃下变性约1min并在约30℃至约70℃下退火约1小时至约8小时来制备。
miRNA是基因组上编码的约20-25个碱基的内源性非编码RNA(ncRNA)。它不像siRNA那样切割靶mRNA，但是通过识别靶mRNA的3’非翻译区(UTR)来控制翻译。本发明中的miRNA包括在细胞质中作用于靶mRNA并抑制蛋白质翻译的内源性miRNA和作用于细胞核并通过在两端具有RNA低聚物并在中央区具有DNA低聚物的缺口聚物(gapmer)结构以RNase-H依赖性方式分解mRNA的miRNA。
作为miRNA，可以使用任何公知的miRNA。优选例如靶向编码可能会成为人类疾病的药物发现靶点的蛋白的mRNA的miRNA或其前体。涉及人类疾病的miRNA的具体实例包括但不限于let-7(肺癌)、miR-15a(B-细胞慢性淋巴细胞性白血病)、miR-143(结肠直肠癌)、miR-139(胰腺癌)和其前体等。
miRNA的更具体的实例包括但不限于SEQ ID NO:2示出的人let7a-1前体。
5’-UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3’(SEQ ID NO:2)
通过利用常规公知的方法或化学合成或利用基因重组技术的生产，miRNA可以通过从哺乳动物细胞(人细胞等)中分离而获得。也可适当地使用商购可得的核酸。
至于miRNA，例如，双链miRNA或其单链前体可以通过从miRBase数据库等获取靶miRNA的碱基序列信息并基于该信息以与siRNA的化学合成相同的方式生产。
适配子是具有结合至如蛋白等的靶分子并控制(通常抑制)其功能的活性的核酸分子。
适配子的长度不特别限定，并且通常可以为约16个至约200个核苷酸。例如，它可以为不超过约100个核苷酸，优选不超过约50个核苷酸，更优选不超过约40个核苷酸。
作为适配子，可以使用靶向任何公知的蛋白的适配子。优选例如靶向可能会成为人类疾病的药物发现靶点的蛋白的适配子。涉及人类疾病的蛋白的适配子的具体实例包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)(老年性黄斑变性)、因子IXa(在冠状动脉疾病中凝血的抑制)、神经生长因子(NGF)(疼痛)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)(类风湿性关节炎)等的适配子等。
适配子的更具体的实例包括但不限于SEQ ID NO:3示出的哌加他尼(pegaptanib)(商品名：macugen(注册商标)；所有嘧啶核苷酸为2’-氟化的并且嘌呤核苷酸的一部分为2’-甲氧基化的)(VEGF蛋白的适配子)。5’-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3’(SEQ IDNO:3)(t为3’,3’-dT)
可以例如通过以下步骤获得适配子。即，使用DNA/RNA自动合成仪首先随机地合成寡核苷酸(如约60个碱基)并产生寡核苷酸池。之后，用亲和柱分离结合至靶蛋白的寡核苷酸。分离的寡核苷酸通过PCR扩增，并再次进行前述选择步骤。该步骤重复约5次或更多次以选择对靶蛋白具有强亲和力的适配子。
核酶是具有切割核酸的酶活性的核酸分子。最通用的核酶是在感染性RNA例如类病毒、拟病毒等中发现的自剪接RNA，并且锤头型、发夹型等是公知的。通过形成与两端均各有几个碱基(总共约10个碱基)与具有锤头结构的部分相邻的mRNA的期望切割位点互补的序列，靶mRNA自身可以特异性切割。
核酶可以通过基于cDNA序列或基因组DNA序列测定靶序列并通过使用商购可得的DNA/RNA自动合成仪(Applied Biosystems,Beckman Instruments等)合成与其互补的序列来制备。
诱饵核酸是双链DNA分子，所述双链DNA分子具有约20个碱基的碱基长度且转录因子与之特异性结合并通过捕获转录因子控制(在转录激活因子的情况下抑制，在转录抑制因子的情况下促进)转录因子的靶基因表达的核苷酸序列。
作为诱饵核酸，可以使用靶向任何公知的转录因子的诱饵核酸。优选例如靶向可能会成为人类疾病的药物发现靶点的转录因子的诱饵核酸。涉及人类疾病的转录因子的诱饵核酸的具体示例包括但不限于NFκB(过敏性皮肤炎、血管再狭窄、类风湿性关节炎)等的诱饵核酸等。
可以利用常规公知的方法通过化学合成获得诱饵核酸。
例如，可以基于将成为靶点的转录因子的结合共有序列的碱基序列信息适当地设计诱饵核酸。可以通过由商购可得的DNA/RNA自动合成仪(Applied Biosystems,BeckmanInstruments等)合成每一条有义链和反义链，使它们在适当的退火缓冲液中在约90℃至约95℃下变性约1min并在约30℃至约70℃下退火约1小时至约8小时来制备所述诱饵核酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物中包含的核酸分子可以是WO 2012/017919,WO 2013/103146,WO 2012/005368,WO 2013/077446,WO 2013/133393等所述的单链核酸分子。
这些单链核酸分子是其中包含控制靶基因表达的序列的区域与包含与所述序列互补的序列的区域直接连接或经连接子连接的核酸分子。连接子的具体实例包括但不限于具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中至少一种的非核苷酸结构的连接子，由核苷酸残基和/或非核苷酸残基构成的连接子，具有非核苷酸结构例如氨基酸残基、多胺残基、多羧酸残基等的连接子等。前述包含连接子的单链核酸分子的具体实例包括但不限于下述实例。
I.包含控制靶基因表达的序列的单链核酸分子(以下有时也简称为表达控制序列)，其包含具有包含吡咯烷骨架和哌啶骨架中至少一种的非核苷酸结构的连接子。
(1)ssPN分子
作为前述单链核酸分子的一个实施方案，可以提及如WO 2012/017919中所述的具有区域(X)、连接子区域(Lx)和区域(Xc)的单链核酸分子(以下也称为“ssPN分子”)，其中，前述连接子区域(Lx)连接于前述区域(X)和前述区域(Xc)之间，
前述区域(Xc)与前述区域(X)互补，
前述区域(X)和前述区域(Xc)的至少一者包含前述表达控制序列，并且前述连接子区域(Lx)包含含有吡咯烷骨架和哌啶骨架中至少一种的非核苷酸结构。
在前述ssPN分子中，前述表达控制序列是表现出例如当ssPN分子在体内或在体外引入细胞时控制前述靶基因表达的活性的序列。前述表达控制序列不特别限定，并可以根据靶基因的种类而适当地设置。作为前述表达控制序列，例如，可以适当地使用参与由siRNA引起的RNA干扰的序列。即，结合至靶mRNA的前述siRNA链的RNA序列可以用作前述表达控制序列。
前述表达控制序列与前述靶基因的预设区域例如优选至少90％互补，更优选95％互补，更加优选98％互补，并特别优选100％互补。当满足这种互补性时，例如，可充分减少脱靶效应(off-target effect)。
作为具体实例，当靶基因为TGF-β1，例如，SEQ ID NO:4示出的18-碱基长度序列可用作上述表达控制序列。
5’-UAUGCUGUGUGUACUCUG-3’(SEQ ID NO:4)
在前述ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)可以具有，例如，包含前述吡咯烷骨架的非核苷酸结构，或包含前述哌啶骨架的非核苷酸结构，或包含前述吡咯烷骨架的非核苷酸结构和包含前述哌啶骨架的非核苷酸结构二者。前述ssPN分子可以抑制，例如，如体内干扰素诱导的副作用并表现出极好的核酸酶耐受性。
在前述ssPN分子中，前述吡咯烷骨架可以是，例如，吡咯烷衍生物的骨架，其中构成吡咯烷的5元环的一个或多个碳原子被取代，并且当被取代时，例如，C-2碳以外的碳原子是优选的。前述碳可以被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。前述吡咯烷骨架可以在吡咯烷的5元环中包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。在前述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的5元环的碳原子和氮原子可以键合至，例如，氢原子或以下提到的取代基。前述连接子区域(Lx)可以经前述吡咯烷骨架的任意基团键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)，所述基团优选地为前述5元环的任一碳原子或任一氮原子，优选地，前述5元环的2-位碳(C-2)原子或氮原子。前述吡咯烷骨架的实例包括脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。由于前述脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等为例如体内物质及其还原形式，它们在安全性方面也是优越的。
在前述ssPN分子中，作为前述哌啶骨架，可以提及例如，哌啶衍生物的骨架，其中构成哌啶的6元环的一个或多个碳原子被取代。当其被取代，例如，C-2碳以外的碳原子是优选的。前述碳原子可以被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。前述哌啶骨架还可以包含，例如，在哌啶的6元环中，例如，碳-碳双键或碳-氮双键。在前述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳原子和氮原子可以键合至例如氢原子或以下提到的取代基。前述连接子区域(Lx)还可以经前述哌啶骨架的任意基团并且优选地为前述6元环的2-位碳(C-2)原子和氮原子键合至例如前述区域(X)和前述区域(Xc)。
前述连接子区域可仅由例如具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基构成，或可包含具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)核苷酸残基。
在前述ssPN分子中，前述连接子区域例如由下式(I)表示：
在前述式(I)中，例如，
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3为氢原子或键合至环A上C-3、C-4、C-5或C-6的取代基，
L1为具有n个原子的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个原子的亚烷基链，且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
在环A中，环A上前述C-2以外的一个碳原子可以被氮原子、氧原子或硫原子取代，并在前述环A中可以包含碳-碳双键或碳-氮双键，并且，
前述区域(Yc)和(Y)各自经-OR1-或-OR2-连接至前述连接子区域(Ly)，
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)。
在前述式(I)中，例如，X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH。在前述式(I)中，“X1为H2”意指X1和X1键合至的碳原子共同形成CH2(亚甲基基团)。这同样适用于X2。
在前述式(I)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S。
在前述式(I)中，在环A中，l为1或2；当l＝1，环A为5元环，例如，前述吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架为例如脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，并示例为其二价结构。当l＝2，环A为6元环，例如，前述哌啶骨架。在环A中，环A上C-2以外的一个碳原子可以被氮原子、氧原子或硫原子取代。在环A中，环A可以包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A可以为例如L型或D型。
在前述式(I)中，R3为氢原子或键合至环A上C-3、C-4、C-5或C-6的取代基。当R3为前述取代基，取代基R3可以是一个或多个，或可以不存在。当R3以多个存在，它们可以是相同的或不同的。
取代基R3为例如卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4、氧基(＝O)等。
R4和R5各自独立地为例如取代基或保护基，并且可以是相同的或不同的。前述取代基的实例包括卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。下文同样适用。取代基R3可以选自上述列举的取代基。
前述保护基是使例如高反应活性官能团失活的官能团。保护基的实例包括公知的保护基。关于前述保护基，例如，文献中的记载(J.F.W.McOmie,"Protecting Groups inOrganic Chemistry",Plenum Press,London和New York,1973)可包括于此。前述保护基不特别限定，并且其实例包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)和二甲氧基三苯甲基(DMTr)。当R3为OR4时，前述保护基不特别限定，并且其实例包括TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基。保护基的其他实例包括稍后将示出的含甲硅烷基的基团。下文同样适用。
在前述式(I)中，L1是由n个原子构成的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可以被或可以不被例如OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代。可选地，L1可以是通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。前述聚醚链为，例如聚乙二醇。当Y1为NH、O或S，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，并且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y1为O，该氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻，并且OR1中的氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻。
在前述式(I)中，L2为由m个原子构成的亚烷基链。一个(或多个)前述亚烷基碳原子上的一个(或多个)氢原子可以被或可以不被例如OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代。可选地，L2可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。当Y2为NH、O或S，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，并且氧原子彼此不相邻。即，例如，当Y2为O，该氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻，并且OR2中的氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻。
L1的n和L2的m不特别限定，并且例如它们各自的下限可为0，其上限不特别限定。例如，n和m可根据前述连接子区域(Lx)的期望长度适当地设定。例如，从制造成本和产量等的观点，n和m各自优选0至30，更优选0至20，并更加优选0至15。n和m可相同(n＝m)或不同。n+m为例如0至30，优选0至20，更优选0至15。
例如，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基。前述取代基和前述保护基的实例与上述相同。
在前述式(I)中，氢原子可以各自独立地被例如卤素如Cl、Br、F或I取代。
前述区域(Xc)和(X)各自经-OR1-或-OR2-连接至例如前述连接子区域(Lx)。R1和R2可以存在或可以不存在。当R1和R2存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或由前述式(I)表示的结构。当R1和/或R2为前述核苷酸残基时，前述连接子区域(Lx)由例如具有不包括核苷酸残基R1和/或R2的前述式(I)结构的前述非核苷酸残基、和一个(或多个)前述核苷酸残基构成。当R1和/或R2为由前述式(I)表示的结构时，前述连接子区域(Xc)的结构为例如两个以上具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基彼此连接这样的结构。前述式(I)的结构数可为例如1、2、3或4。当连接子区域(Lx)包括多个前述结构时，前述(I)的结构可例如直接或经一个(或多个)前述核苷酸残基连接。另一方面，当R1和R2不存在时，前述连接子区域(Lx)仅由例如具有前述式(I)的结构的前述非核苷酸残基构成。
前述区域(Xc)和(X)与-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，并且可为例如下列条件中的任一种。
条件(1)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
前述式(I)的结构的实例包括下式(I-1)至(I-9)的结构。在下式中，n和m与前述式(I)相同。在下式中，q为0-10的整数。
在前述式(I-1)至(I-9)中，n、m和q不特别限定，且如上所述。其具体实例为前述式(I-1)，其中n＝8，在前述(I-2)中n＝3，在前述式(I-3)中n＝4或8，在前述(I-4)中n＝7或8，在前述式(I-5)中n＝3和m＝4，在前述(I-6)中n＝8和m＝4，在前述式(I-7)中n＝8和m＝4，在前述(I-8)中n＝5和m＝4，和在前述式(I-9)中q＝1和m＝4。下式(I-4a)示出前述式(I-4)的一个实施方案(n＝8)，和下式(I-8a)示出前述式(I-8)的一个实施方案(n＝5,m＝4)。
在前述ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。因此，在前述ssPN分子中，双链可以通过前述区域(Xc)向区域(X)的折回和前述区域(Xc)和(X)的自退火形成。
在前述ssPN分子中，例如，仅前述区域(Xc)可折回从而与前述区域(X)形成双链，或另一双链可在另一区域形成。下文中，前一种ssPN分子，即其中双链形成发生在一个位点的ssPN分子，称作"第一ssPN分子"，后一种ssPN分子，即其中双链形成发生在两个位点的ssPN分子，称作"第二ssPN分子"。下面给出前述第一和第二ssPN分子的实例。然而，应注意，本发明不限于这些示例性实例。
(1-1)第一ssPN分子
前述第一ssPN分子为，例如包括前述区域(X)、前述区域(Xc)和前述连接子区域(Lx)的分子。
前述第一ssPN分子可从例如5’侧至3’侧以该顺序包括前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)，或者可从3’侧至5’侧以该顺序包括前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(X)。
在前述第一ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。唯一必要的是前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列。优选地，前述区域(Xc)包括与区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列或由该序列构成。前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补，或者区域(Xc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选地，区域(Xc)与其完全互补。前述表达"一个或几个碱基"意指例如1至3个碱基，优选地，1个碱基或2个碱基。
在前述第一ssPN分子中，前述表达控制序列如上所述包括在前述区域(Xc)和(X)的至少之一。前述第一ssPN分子可包括例如一条上述表达控制序列或两条以上的上述表达控制序列。
在后一种情况下，前述第一ssPN分子可包括例如：针对同一靶基因的两个以上的相同表达控制序列；针对同一靶基因的两个以上的不同表达控制序列；或者针对不同靶基因的两个以上的不同表达控制序列。当前述第一ssPN分子包括两个以上的上述表达控制序列时，各表达控制序列的位置不特别限定，并且它们可在选自前述区域(X)和(Xc)的一个区域或不同区域。当前述第一ssPN分子包括针对不同靶基因的两个以上的上述表达控制序列，例如前述第一ssPN分子可控制两种以上的不同靶基因的表达。
前述第一ssPN分子的一个实施方案在WO 2012/017919图1中示出，并可以参考。
在前述第一ssPN分子中，各前述区域(Xc)和(X)中的碱基数不特别限定。下面给出各区域的长度的实例。然而，要注意的是，本发明绝不意欲受限于此。在本发明中，"碱基数"意指例如"长度"，且其还可称作"碱基长度"。在本发明中，例如，关于碱基数的数值范围公开了落入该范围内的所有正整数。例如，"1至4个碱基"的描述公开了所有"1、2、3和4个碱基"(下文同样适用)。
前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域完全互补。在该情况下，意指例如前述区域(Xc)由与从前述区域(X)的5’端向3’端延伸的整个区域互补的碱基序列构成。换言之，意指前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)中的所有碱基互补。
此外，前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的部分区域完全互补。在该情况下，意指例如前述区域(Xc)由与前述区域(X)的部分区域互补的碱基序列构成。换言之，意指前述区域(Xc)由其碱基长度比前述区域(X)的碱基长度短1个或多个碱基的碱基序列构成，且前述区域(Xc)中的所有碱基与前述区域(X)的部分区域中的所有碱基互补。前述区域(X)的部分区域优选为前述区域(X)中具有由例如从前述区域(Xc)侧的末端的碱基(第一个碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
在前述第一ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之间的关系满足例如下列条件(3)或(5)。例如，在前一种情况中，具体地满足下列条件(11)：
X>Xc···(3)
X-Xc＝1至10，优选1、2或3，
更优选1或2···(11)
X＝Xc···(5)
当前述区域(X)和/或前述区域(Xc)包括前述表达控制序列时，前述区域可为例如仅由前述表达控制序列构成的区域或包括前述表达控制序列的区域。前述表达控制序列的碱基数为例如19-30、优选19、20或21。在包括前述表达控制序列的区域中，例如前述表达控制序列可在其5’侧和/或3’侧进一步具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至31，优选1至21，更优选1至11。
前述区域(X)的碱基数不特别限定。当前述区域(X)包括前述表达控制序列时，前述区域(X)的碱基数的下限为例如19，其上限为例如50，优选30，更优选25。具体地，前述区域(X)的碱基数为例如19-50，优选19-30，更优选19-25。
前述区域(Xc)的碱基数不特别限定。前述区域(Xc)的碱基数的下限为例如19，优选20，更优选21，其上限为例如50，更优选40，更加优选30。
在前述ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)的长度优选例如前述区域(X)和(Xc)可形成双链这样的长度。当前述连接子区域(Lx)包括除了一个(或多个)前述非核苷酸残基以外的一个(或多个)前述核苷酸残基时，前述连接子区域(Lx)的碱基数的下限为例如1，优选2，更优选3，且其上限为例如100，优选80，更优选50。
前述第一ssPN分子的全长不特别限定。在前述第一ssPN分子中，总碱基数(全长ssPN分子中的碱基数)的下限为例如38，优选42，更优选50，更加优选51，特别优选52，且其上限为例如300，优选200，更优选150，更加优选100，特别优选80。在前述第一ssPN分子中，不包括前述连接子区域(Lx)的总碱基数的下限为例如38，优选42，更优选50，更加优选51，特别优选52，且其上限为例如300，优选200，更优选150，更加优选100，特别优选80。
(1-2)第二ssPN分子
前述第二ssPN分子为除了例如前述区域(X)、前述连接子区域(Lx)和前述区域(Xc)以外，进一步包括区域(Y)和与前述区域(Y)互补的区域(Yc)的分子。在前述第二ssPN分子中，内部区域(Z)由彼此连接的前述区域(X)和前述区域(Y)构成。除非另有说明，否则关于前述第一ssPN分子的描述也适用于前述第二ssPN分子。
前述第二ssPN分子可从5’侧至3’侧以该顺序包括例如前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)。在该情况下，前述区域(Xc)还称作“5’侧区域(Xc)”；前述内部区域(Z)中的前述区域(X)还称作“内部5’侧区域(X)”；前述内部区域(Z)中的前述区域(Y)还称作“内部3’区域(Y)”；以及前述区域(Yc)还称作“3’侧区域(Yc)”。可选地，前述第二ssPN分子可从3’侧至5’侧以该顺序包括例如前述区域(Xc)、前述连接子区域(Lx)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)。在该情况下，前述区域(Xc)还称作“3’侧区域(Xc)”；前述内部区域(Z)中的前述区域(X)还称作“内部3’侧区域(X)”；前述内部区域(Z)中的前述区域(Y)还称作“内部5’区域(Y)”；以及前述区域(Yc)还称作“5’侧区域(Yc)”。
如上所述，前述内部区域(Z)由例如彼此连接的前述区域(X)和(Y)构成。例如，前述区域(X)和(Y)彼此直接连接，之间没有嵌入序列。前述内部区域(Z)定义为“由彼此连接的前述区域(X)和(Y)构成”，仅表明前述区域(Xc)和(Yc)之间的序列关系。该定义不意欲限定在前述ssPN分子的使用中，前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)为离散独立区域。即，例如，当前述表达控制序列包括在前述内部区域(Z)中时，前述表达控制序列可横跨前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)而设置。
在前述第二ssPN分子中，前述区域(Xc)与前述区域(X)互补。唯一必须的是，前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列。优选地，前述区域(Xc)包括与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列或由其构成。前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补，或者前述区域(Xc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选地，前述区域(Xc)与其完全互补。前述表达“一个或几个碱基”意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述第二ssPN分子中，前述区域(Yc)与前述区域(Y)互补。唯一必须的是，前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列。优选地，前述区域(Yc)包括与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列或由其构成。前述区域(Yc)可例如与前述区域(Y)的整个区域或部分区域完全互补，或者前述区域(Yc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选地，前述区域(Yc)与其完全互补。前述表达“一个或几个碱基”意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述第二ssPN分子中，由前述区域(X)和(Y)构成的前述内部区域(Z)与前述区域(Xc)的至少之一包括例如前述表达控制序列。此外，前述区域(Yc)还可包括前述表达控制序列。当前述内部区域(Z)包括前述表达控制序列，例如前述区域(X)和(Y)中的任一个可包括前述表达控制序列，或者可包括前述表达控制序列以横跨前述区域(X)和(Y)。前述第二ssPN分子可包括例如一个上述表达控制序列，或者两个以上的上述表达控制序列。
当前述第二ssPN分子包括两个以上的上述表达控制序列时，各表达控制序列的位置不特别限定。它们可在前述内部区域(Z)和前述区域(Xc)中的任一个位置，或者可在前述内部区域(Z)和前述区域(Xc)中的一个位置，和除了这些区域的任何区域。
在前述第二ssPN分子中，例如前述区域(Yc)和(Y)可彼此直接或间接连接。在前一种情况下，例如，前述区域(Yc)和(Y)可通过磷酸二酯键等直接连接。在后一种情况下，例如，前述第二ssPN分子可如此构造，使其在前述区域(Yc)和(Y)之间具有连接子区域(Ly)，且前述区域(Yc)和(Y)经前述连接子区域(Ly)连接。
当前述第二ssPN分子具有前述连接子区域(Ly)时，例如前述连接子区域(Ly)可为由一个(或多个)前述核苷酸残基构成的连接子，或具有包含诸如上述的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少之一的非核苷酸结构的连接子。在后一种情况下，例如前述连接子区域(Ly)可由前述式(I)表示，并且关于与前述连接子区域(Lx)有关的前述式(I)的所有记载也适用于前述连接子区域(Ly)。
前述区域(Yc)和(Y)例如经-OR1-或-OR2-各自连接至前述连接子区域(Ly)。在前述连接子区域(Ly)中，R1和R2如上述连接子区域(Lx)中的，可以存在或可以不存在。
前述区域(Xc)和(X)与前述-OR1-和-OR2-的组合，以及前述区域(Yc)和(Y)与前述-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，且可为例如下列条件中的任一项：
条件(1)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(3)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
条件(4)：
前述区域(Xc)和(X)分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构；和
前述区域(Yc)和(Y)分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
关于前述第二ssPN分子，具有前述连接子区域(Ly)的ssPN分子的一个实施方案在WO 2012/017919图2中示出，并可以参考。
在前述第二ssPN分子中，各前述区域(Xc)、(X)、(Y)和(Yc)中的碱基数不特别限定。下面给出各区域的长度的实例。然而，要注意的是，本发明绝不意欲受限于此。
如上所述，例如，前述区域(Xc)可与前述区域(X)的整个区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且由与前述区域(X)的整个区域互补的碱基序列构成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)相同的碱基长度，且前述区域(Xc)的所有碱基与前述区域(X)的所有碱基互补，即，例如区域(Xc)与区域(X)完全互补。然而，要注意的是，区域(Xc)的构造不限于此，并且例如如上所述，区域(Xc)中的一个或几个碱基可与区域(X)中相对应的碱基是非互补的。
此外，如上所述，前述区域(Xc)可与例如前述区域(X)的部分区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，即前述区域(Xc)由其碱基长度比前述区域(X)的碱基长度短一个或多个碱基的碱基序列构成。更优选前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的部分区域相同的碱基长度，且前述区域(Xc)的所有碱基与前述区域(X)的部分区域的所有碱基互补，即，例如区域(Xc)与区域(X)的部分区域完全互补。前述区域(X)的部分区域优选为前述区域(X)中具有由例如从前述区域(Xc)侧的末端的碱基(第一碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
如上所述，前述区域(Yc)可与例如前述区域(Y)的整个区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且由与前述区域(Y)的整个区域互补的碱基序列构成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)相同的碱基长度，且前述区域(Yc)的所有碱基与前述区域(Y)的所有碱基互补，即，例如区域(Yc)与区域(Y)完全互补。然而，要注意的是，区域(Yc)的构造不限于此，并且例如如上所述，区域(Yc)中的一个或几个碱基可与区域(Y)中相对应的碱基是非互补的。
此外，如上所述，前述区域(Yc)可与例如前述区域(Y)的部分区域互补。在该情况下，优选例如前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，即前述区域(Yc)由其碱基长度比前述区域(Y)的碱基长度短一个或多个碱基的碱基序列构成。更优选前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的部分区域相同的碱基长度，且前述区域(Yc)的所有碱基与前述区域(Y)的部分区域的所有碱基互补，即，例如区域(Yc)与区域(Y)的部分区域完全互补。前述区域(Y)的部分区域优选为前述区域(Y)中具有由例如从前述区域(Yc)侧的末端的碱基(第一碱基)开始的连续碱基构成的碱基序列的区域。
在前述第二ssPN分子中，前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Y)的碱基数(Y)的关系以及前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Xc)的碱基数(Xc)的关系满足例如下列表达式(1)和(2)的条件。
Z＝X+Y···(1)
Z≥Xc+Yc···(2)
在前述第二ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)和前述区域(Y)的碱基数(Y)的关系不特别限定，并满足例如下列表达式的条件的任一项：
X＝Y···(19)
X<Y···(20)
X>Y···(21)。
在第二ssPN分子中，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之间的关系，以及前述区域(Y)的碱基数(Y)与前述区域(Yc)的碱基数(Yc)之间的关系满足例如下列条件(a)至(d)的任一项：
(a)满足下列表达式(3)和(4)的条件。
X>Xc···(3)
Y＝Yc···(4)
(b)满足下列表达式(5)和(6)的条件。
X＝Xc···(5)
Y>Yc···(6)
(c)满足下列表达式(7)和(8)的条件。
X>Xc···(7)
Y>Yc···(8)
(d)满足下列表达式(9)和(10)的条件。
X＝Xc···(9)
Y＝Yc···(10)
在上述条件(a)至(d)中，例如，前述区域(X)的碱基数(X)与前述区域(Xc)的碱基数(Xc)之差，以及前述区域(Y)的碱基数(Y)与前述区域(Yc)的碱基数(Yc)之差优选地满足下列条件。
(a)满足下列表达式(11)和(12)的条件。
X-Xc＝1至10，优选1、2、3或4，
更优选1、2或3···(11)
Y-Yc＝0···(12)
(b)满足下列表达式(13)和(14)的条件。
X-Xc＝0···(13)
Y-Yc＝1至10，优选1、2、3或4，
更优选1、2或3···(14)
(c)满足下列表达式(15)和(16)的条件。
X-Xc＝1至10，优选1、2或3，
更优选1或2···(15)
Y-Yc＝1至10，优选1、2或3，
更优选1或2···(16)
(d)满足下列表达式(17)和(18)的条件。
X-Xc＝0···(17)
Y-Yc＝0···(18)
关于前述(a)-(d)的第二ssPN分子，每个结构的一个实施方案在WO2012/017919图3中示出，并可以参考。
上述(a)至(c)的ssPN分子为具有不与前述内部区域(Z)中的前述区域(Xc)和(Yc)二者对齐的碱基的构造，这是由于例如前述区域(Xc)和(X)，以及区域(Yc)和(Y)各自形成双链。它们还可为具有不形成双链的碱基的所述构造。在前述内部区域(Z)中，不对齐的前述碱基(也称作不形成双链的碱基)在下文中称作“未配对碱基”。在WO 2012/017919的图3中，前述未配对碱基的区域由“F”示出。前述区域(F)的碱基数不特别限定。例如，对于前述(a)的ssPN分子，前述区域(F)的碱基数(F)为“X-Xc”的碱基数；对于上述(b)的ssPN分子为“Y-Yc”的碱基数；对于前述(c)的ssPN分子为"X-Xc"的碱基数与"Y-Yc"的碱基数的合计。
另一方面，将满足前述条件(d)的ssPN分子构建成以使例如前述内部区域(Z)的整个区域与前述区域(Xc)和(Yc)对齐，换言之，前述内部区域(Z)的整个区域形成双链。在满足前述条件(d)的ssPN分子中，前述区域(Xc)的5’端和前述区域(Yc)的3’端彼此不连接。
前述内部区域(Z)的前述区域(Xc)的碱基、前述区域(Yc)的碱基和前述未配对碱基(F)的总数等于前述内部区域(Z)的碱基数。因此，前述区域(Xc)的长度和前述区域(Yc)的长度可根据例如前述内部区域(Z)的长度、前述未配对碱基数和未配对碱基的位置而适当地确定。
前述内部区域(Z)的碱基数为例如19以上。碱基数的下限为例如19、优选20、更优选21。前述碱基数的上限为例如50、优选40、更优选30。前述内部区域(Z)的碱基数的具体实例为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。当前述内部区域(Z)包括前述表达控制序列时，例如优选这些条件。
当前述内部区域(Z)包括前述表达控制序列时，前述内部区域(Z)可为例如仅由前述表达控制序列构成的区域或包括前述表达控制序列的区域。前述表达控制序列的碱基数为例如19至30，优选19、20或21。当前述内部区域(Z)包括前述表达控制序列时，前述表达控制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至31、优选1至21、更优选1至11、更加优选1至7。
前述区域(Xc)的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，更加优选1至4，特别优选1、2或3。当前述内部区域(Z)或前述区域(Yc)包括前述表达控制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)的碱基数为19至30(如19)，前述区域(Xc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1至4，更加优选1、2或3。
当前述区域(Xc)包括前述表达控制序列时，前述区域(Xc)可为例如仅由前述表达控制序列构成的区域或包括前述表达控制序列的区域。例如，前述表达控制序列的长度如上所述。当前述区域(Xc)包括前述表达控制序列时，前述表达控制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至11，优选1至7。
前述区域(Yc)的碱基数为例如1至29，优选1至11，更优选1至7，更加优选1至4，特别优选1、2或3。当前述内部区域(Z)或前述区域(Xc)包括前述表达控制序列时，例如优选如上所述的碱基数。具体实例如下：当前述内部区域(Z)的碱基数为19至30(如19)时，前述区域(Yc)的碱基数为例如1至11，优选1至7，更优选1、2、3或4，更加优选1、2或3。
当前述区域(Yc)包括前述表达控制序列时，前述区域(Yc)可为例如仅由前述表达控制序列构成的区域或包括前述表达控制序列的区域。前述表达控制序列的长度为例如如上所述。当前述区域(Yc)包括前述表达控制序列时，前述表达控制序列进一步可在其5’侧和/或3’侧具有另外的序列。前述另外的序列的碱基数为例如1至11，优选1至7。
如上所述，前述内部区域(Z)的碱基数、前述区域(Xc)的碱基数和前述区域(Yc)的碱基数之间的关系可由例如前述表达式(2)：“Z≥Xc+Yc”表示。具体地，由“Xc+Yc”表示的碱基数例如等于前述内部区域(Z)的碱基数，或低于前述内部区域(Z)的碱基数。在后一种情况下，“Z-(Xc+Yc)”为例如1至10，优选1至4，更优选1、2或3。前述“Z-(Xc+Yc)”对应于例如前述内部区域(Z)中未配对碱基区域(F)的碱基数(F)。
在前述第二ssPN分子中，前述连接子区域(Lx)和(Ly)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)如上所述。当前述连接子区域(Ly)的构成单元包括一个(或多个)碱基时，前述连接子区域(Ly)碱基数的下限为例如1、优选2、更优选3，并且其上限为例如100、优选80、更优选50。各前述连接子区域的碱基数具体为1至50、1至30、1至20、1至10、1至7或1至4，例如但不限于这些实例。
前述连接子区域(Ly)可例如与前述连接子区域(Lx)相同或不同。
前述第二ssPN分子的全长不特别限定。在前述第二ssPN分子中，总碱基数(全长ssPN分子的碱基数)的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，并且其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。在前述第二ssPN分子中，不包括前述连接子区域(Lx)和(Ly)的碱基数的总碱基数的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，并且其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。
在前述ssPN分子中，唯一必须的是前述连接子区域(Lx)如上所述具有前述非核苷酸结构，并且其他构成单元不特别限定。前述构成单元的实例包括核苷酸残基。前述核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如不被修饰的核苷酸残基(未修饰的核苷酸残基)或已被修饰的核苷酸残基(修饰的核苷酸残基)。通过构造前述ssPN分子以包括前述修饰的核苷酸残基，例如可改进ssPN分子对核酸酶的抗性，从而使ssPN分子的稳定性得到改进。此外，前述ssPN分子进一步可包括例如除前述核苷酸残基以外的非核苷酸残基。
前述核苷酸残基作为前述区域(Xc)、前述区域(X)、前述区域(Y)和前述区域(Yc)各自的构成单元是优选的。各前述区域由例如下列残基(1)至(3)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
前述连接子区域(Lx)可仅由例如一个(或多个)前述非核苷酸残基构成，或可由一个(或多个)前述非核苷酸和一个(或多个)前述核苷酸残基构成。前述连接子区域(Lx)由例如下列残基(4)至(7)的任一项构成：
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
前述连接子区域(Ly)的构成单元不特别限定，并且其实例如上所述包括前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基。各前述连接子区域(Ly)可由例如仅一个(或多个)前述核苷酸残基、仅一个(或多个)前述非核苷酸残基、或者一个(或多个)前述核苷酸残基和一个(或多个)前述非核苷酸残基二者构成。各前述连接子区域(Ly)由例如下列残基(1)至(7)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
不包括前述连接子区域(Lx)的前述ssPN分子的实例包括仅由前述核苷酸残基构成的分子；和除前述核苷酸残基以外包括一个(或多个)前述非核苷酸残基的分子。在前述ssPN分子中，如上所述，例如前述核苷酸残基可为仅前述未修饰的核苷酸残基；仅前述修饰的核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者。当前述ssPN分子包括前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者时，前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。当前述ssPN分子包括一个(或多个)前述非核苷酸残基时，一个(或多个)前述非核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1或2个。
在前述ssPN分子中，例如前述核苷酸残基优选核糖核苷酸残基。在该情况下，例如，前述ssPN分子还称作“ssRNA分子”或“P-ssRNA分子”。不包括前述连接子区域(Lx)的前述ssRNA分子的实例包括仅由前述核糖核苷酸残基构成的分子；和除前述核糖核苷酸残基以外包括一个(或多个)前述非核苷酸残基的分子。如上所述，作为前述核糖核苷酸残基，例如前述ssRNA分子可包括：仅前述未修饰的核糖核苷酸残基；仅前述修饰的核糖核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基二者。
当前述ssRNA分子除了前述未修饰的核糖核苷酸残基以外包括例如前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基时，前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。与前述未修饰的核糖核苷酸残基相反的前述修饰的核糖核苷酸残基可为例如通过用脱氧核糖残基取代核糖残基获得的前述脱氧核糖核苷酸残基。当前述ssRNA分子除前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基以外包括例如一个(或多个)前述脱氧核糖核苷酸残基时，一个(或多个)前述脱氧核糖核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。
前述ssPN分子可包括例如标记物质，并可用前述标记物质标记。前述标记物质不特别限定，并可为例如荧光物质、染料、同位素等。前述标记物质的实例包括：荧光团如芘、TAMRA、荧光素、Cy3染料和Cy5染料。前述染料的实例包括Alexa染料如Alexa 488。前述同位素的实例包括稳定同位素和放射性同位素。其中，优选稳定同位素。例如，前述稳定同位素具有低辐射暴露风险且它们不需要专用设备。因此，稳定同位素的可操作性优异，并可有助于成本降低。此外，例如前述稳定同位素不改变被其标记的化合物的物理性质，并且因而具有作为示踪物的优异性质。前述稳定同位素不特别限定，且其实例包括2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
本发明中，术语“烷基”包括例如直链和支化的烷基。前述烷基的碳原子数不特别限定，并为例如1至30、优选1至6或1至4。前述烷基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。其中，例如优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基和异己基等。
本发明中，术语“烯基”包括例如直链或支化的烯基。前述烯基的实例包括具有一个或多个双键的前述烷基。前述烯基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基和3-甲基-2-丁烯基。
本发明中，术语“炔基”包括例如直链或支化的炔基。前述炔基的实例包括具有一个或多个三键的前述烷基。前述炔基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述炔基的实例包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。前述炔基可进一步包括例如一个或多个双键。
本发明中，术语“芳基”包括例如单环芳族烃基和多环芳族烃基。前述单环芳族烃基的实例包括苯基。前述多环芳族烃基的实例包括1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基和9-菲基。其中，例如优选苯基、萘基如1-萘基和2-萘基等。
本发明中，术语“杂芳基”包括例如单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述杂芳基的实例包括呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(如1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(如1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咕基(furazanyl)(如3-呋咕基)、吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(如2-苯并[b]呋喃基、-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(如2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(如1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(如2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(如1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(如1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(如1-吩嗪基、2-吩嗪基)和吩噻嗪基(如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)。
本发明中，例如，术语“环烷基”是指环状饱和烃基，并且环烷基的碳原子数为例如3至15，前述环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接环烃基和螺环烃基。其中，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基、桥接环烃基等。
本发明中，“桥接环烃基”的实例包括二环[2.1.0]戊基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.2]辛基和二环[3.2.1]辛基，三环[2.2.1.0]庚基，二环[3.3.1]壬烷，1-金刚烷基和2-金刚烷基。
本发明中，“螺环烃基”的实例包括螺[3.4]辛基。
本发明中，术语“环烯基”包括例如不饱和环状脂族烃基，并且环烯基的碳原子数为例如3至7。前述基团的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和环庚烯基。其中，优选环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基等。前述术语“环烯基”还包括例如在其环中具有不饱和键的桥接环烃基和螺环烃基。
本发明中，“芳烷基”的实例包括苯甲基、2-苯乙基和萘甲基。“环烷基烷基”和“环基烷基”的实例包括环己基甲基和金刚烷基甲基。“羟烷基”的实例包括羟基甲基和2-羟基乙基。
本发明中，“烷氧基”包括例如由任意前述烷基和氧构成的基团(烷基-O-基团)，且其实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。“烷氧基烷基”的实例包括甲氧基甲基。“氨烷基”的实例包括2-氨基乙基。
本发明中，“杂环基”的实例包括1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基和四氢呋喃基。
本发明中，“杂环基烷基”的实例包括哌啶基甲基和哌嗪基甲基。“杂环基烯基”的实例包括2-哌啶基乙烯基。“杂芳烷基”的实例包括吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基。
本发明中，术语"甲硅烷基"包括由式R3Si-表示的基团，其中R独立地可选自前述烷基、芳基和环烷基。甲硅烷基的实例包括三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基。“甲硅烷氧基”的实例包括三甲基甲硅烷氧基。“甲硅烷氧基烷基”的实例包括三甲基甲硅烷氧基甲基。
本发明中，“亚烷基”的实例包括亚甲基、亚乙基和亚丙基。
本发明中，上述各种基团可被取代。前述取代基的实例包括羟基、羧基、卤素、卤化烷基(如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、芳基(如苯基、萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷氧基(如苯甲基氧基)、氨基[烷基氨基(如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、烷基氨基烷基(如二乙基氨基甲基)、氨磺酰基、氧基等。
(2)核苷酸残基
构成包含于本发明的组合物的前述核酸分子的核苷酸残基包括例如糖、碱基和磷酸作为其组分。如上所述，前述核苷酸残基可为例如核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖；以及腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖；以及腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述核苷酸残基可为例如未修饰的核苷酸残基或修饰的核苷酸残基。前述未修饰的核苷酸残基的前述组分与例如天然存在的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。优选地，组分与人体内天然存在的核苷酸残基的组分相同或基本上相同。
前述修饰的核苷酸残基为例如通过修饰前述未修饰的核苷酸残基获得的核苷酸残基。例如，前述修饰的核苷酸可为修饰前述未修饰的核苷酸残基的任意组分的修饰的核苷酸。本发明中，“修饰”意指例如任意前述组分的取代、添加和/或缺失；和一种(或多种)前述组分中的一个(或多个)原子和/或一个(或多个)官能团的取代、添加和/或缺失。还可称作“改变”。前述修饰的核苷酸残基的实例包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。关于前述天然来源的修饰的核苷酸残基，可查阅例如Limbach等人(Limbach等人，1994,Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic Acids Res.22:pp.2183至2196)。前述修饰的核苷酸残基可为例如前述核苷酸的代替物的残基。
前述核苷酸残基的修饰的实例包括核糖-磷酸骨架(下文中称作“核糖磷酸(ribophosphate)骨架”)的修饰。
在前述核糖磷酸骨架中，例如核糖残基可被修饰。在前述核糖残基中，例如，2’-位碳可被修饰。具体地，结合至例如2’-位碳的羟基可被氢或氟取代。通过用氢取代结合至前述2’-位碳的羟基，可用脱氧核糖取代核糖残基。例如前述核糖残基可被其立体异构体取代，并可用例如阿拉伯糖残基取代。
前述核糖磷酸骨架可被例如具有非核糖残基和/或非磷酸的非核糖磷酸骨架取代。前述非核糖磷酸骨架可为例如被修饰为不带电的前述核糖磷酸骨架。在前述核苷酸中通过用前述非核糖磷酸骨架取代核糖磷酸骨架获得的代替物的实例包括吗啉代、环丁基和吡咯烷。前述代替物的其他实例包括人工核酸单体残基。其具体实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)(Locked Nucleic Acid)和ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥接核酸)。其中，优选PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，磷酸基可被修饰。在前述核糖磷酸骨架中，与糖残基距离最近的磷酸基称为“α-磷酸基”。前述α-磷酸基带负电，且电荷均匀分布在不与糖残基相连的两个氧原子上。在前述α-磷酸基的四个氧原子中，核苷酸残基之间的磷酸二酯键中不与糖残基相连的两个氧原子在下文中称作“非结合(non-linking)氧”。另一方面，与前述核苷酸残基之间的磷酸二酯键中糖残基相连的两个氧原子在下文中称作“结合氧”。例如，前述α-磷酸基优选被修饰为不带电，或者使前述非结合原子之间的电荷分布不对称。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述非结合氧可被取代。一个(或多个)前述氧可被例如选自S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氢)、N(氮)和OR(R为例如烷基或芳基)的任意原子取代，并优选被S取代。优选例如两个前述非结合氧都被取代，并更优选两个非结合氧都被S取代。前述修饰的磷酸基的实例包括硫代磷酸基(phosphorothioate)、二硫代磷酸基、硒酸磷酸基(phosphoroselenates)、硼酸磷酸基(boranophosphates)、硼酸磷酸酯基、氢膦酸基(hydrogen phosphonates)、氨基磷酸基、烷基或芳基膦酸基和磷酸三酯基。特别地，优选其中前述两个非结合氧均被S取代的二硫代磷酸基。
在前述磷酸基中，例如一个(或多个)前述结合氧可被取代。一个(或多个)前述氧可被例如选自S(硫)、C(碳)和N(氮)的任意原子取代。前述修饰的磷酸基的实例包括：由N取代产生的桥接的氨基磷酸基；由S取代产生的桥接的硫代磷酸基；和由C取代产生的桥接的亚甲基膦酸基。优选地，前述结合氧的取代在例如前述ssPN分子的5’末端核苷酸残基和3’末端核苷酸残基的至少之一中进行。当取代在5’侧进行时，优选用C取代。当取代在3’侧进行时，优选用N取代。
前述磷酸基可被例如前述无磷酸基的连接子取代。前述连接子可包含硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺胺、硫甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼或亚甲氧基甲基亚氨基等。优选地，连接子可包含亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
在前述ssPN分子中，例如，3’末端核苷酸残基和5’末端核苷酸残基的至少之一可被修饰。例如，3’末端和5’末端任一处的核苷酸残基可被修饰，或3’末端和5’末端两处的核苷酸残基均可被修饰。前述修饰可为例如如上所述，并优选修饰一个(或两个)末端的一个(或多个)磷酸基。例如，整个前述磷酸基可被修饰，或者前述磷酸基的一个或多个原子可被修饰。在前一种情况下，例如整个磷酸基可被取代或删除。
前述一端(或两端)的一个(或多个)核苷酸残基的修饰可为例如任何其他分子的添加。前述其他分子的实例包括功能性分子例如如上所述的标记物质和保护基。前述保护基的实例包括S(硫)、Si(硅)、B(硼)和含酯基团。功能性分子如前述标记物质可用于例如前述ssPN分子的检测等。
前述其他分子可例如添加至前述核苷酸残基的磷酸基或可经间隔子添加至前述磷酸基或前述糖残基。例如，前述间隔子的末端原子可添加至或取代前述磷酸基的前述结合氧之一，或者糖残基的O、N、S或C。前述糖残基的结合位点优选为例如3’-位C、5’-位C或与之结合的任意原子。例如，前述间隔子还可添加至或取代前述核苷酸代替物如PNA的末端原子。
前述间隔子不特别限定，其实例包括-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、脱碱基糖(abasic sugars)、酰胺、羧基、胺、羟基胺(oxyamine)、羟基亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺胺和吗啉代，以及生物素试剂和荧光素试剂。在前述式中，n为正整数，优选n＝3或6。
要添加至末端的前述分子的其他实例包括染料、嵌入剂(如吖啶)、交联剂(如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、赛普弗林(sapphyrin))、多环芳烃(如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切酶(如EDTA)、亲脂性载体(如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油、茨醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或噻吩嗪、肽复合物(如触足(Antennapedia)肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(如生物素)、转运/吸收促进剂(如阿司匹林、维生素E、叶酸)、和合成核糖核酸酶(如咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑复合物、四氮杂大环(tetraazamacrocycles)的Eu3+复合物)。
在前述ssPN分子中，例如前述5’末端可被磷酸基或磷酸基类似物修饰。前述磷酸化作用的实例包括：
5’-单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)；任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸(硫代磷酸：(HO)2(S)P-O-5’)；5’-二硫代磷酸(二硫代磷酸：(HO)(HS)(S)P-O-5’)；5’-硫代磷酸((HO)2(O)P-S-5’)；硫取代的单磷酸、二磷酸和三磷酸(如5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)；5’-氨基磷酸((HO)2(O)P-NH-5’,(HO)(NH2)(O)P-O-5’)；5’-烷基磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2，其中R为烷基(如甲基、乙基、异丙基或丙基等))；和5’-烷基醚磷酸(如RP(OH)(O)-O-5’，其中R为烷基醚(如甲氧基甲基或乙氧基甲基等))。
在前述核苷酸残基中，前述碱基不特别限定。前述碱基可为例如天然碱基或非天然碱基。前述碱基可为例如天然来源的碱基或合成碱基。作为前述碱基，例如可使用常用碱基和其修饰类似物等。
前述碱基的实例包括：嘌呤碱基如腺嘌呤和鸟嘌呤；和嘧啶碱基如胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。前述碱基的其他实例包括肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷(isoguanisine)和杀结核菌素(tubercidine)。前述碱基的实例还包括：2-氨基腺嘌呤、烷基衍生物如6-甲基化嘌呤；烷基衍生物如2-丙基化嘌呤；5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶；8-卤化、胺化、硫醇化、硫代烷基化、羟基化和其他8-取代嘌呤；5-三氟甲基化和其他5-取代嘧啶；7-甲基鸟嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮嘧啶；N-2、N-6和O-6取代嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；二氢尿嘧啶；3-脱氮-5-氮胞嘧啶；2-氨基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鸟嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-脱氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二氨基嘌呤；5-氨基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代的1,2,4-三唑；2-吡咯烷酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶；5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙酰胞嘧啶；2-硫代胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-异戊基腺嘌呤；2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤；N-甲基鸟嘌呤；和O-烷基化碱基。嘌呤和嘧啶的实例包括美国专利3,687,808号、Kroschwitz J.I,John Wiley&Sons编辑的“Concise Encyclopedia of Polymer Science andEngineering",pp.858-859,1990和Englisch等人的Angewandte Chemie,国际版,1991,vol.30,p.613中公开的那些。
将用于本发明的前述ssPN分子的具体实例包括但不限于由下述PH-0009、PK-7006、PK-7015、PH-7069和PH-7081示出的ssPN分子。
II.包含控制靶基因表达的序列的单链核酸分子，其包含由核苷酸残基和/或非核苷酸残基构成的连接子。
(1)ssNc分子
作为前述单链核酸分子，可提及包含由一个(或多个)核苷酸残基和/或一个(或多个)非核苷酸残基构成的连接子的单链核酸分子。其一个实施方案为例如WO 2012/005368中描述的单链核酸分子，所述单链核酸分子从5’侧至3’侧以该顺序包括5’侧区域(Xc)、内部区域(Z)和3’侧区域(Yc)，其中
前述内部区域(Z)由内部5’侧区域(X)和内部3’侧区域(Y)的连接构成，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补，
前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补，并且
前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)中的至少一者包括前述表达控制序列(以下也称为“ssNc分子”)。不必说，这仅仅是一个实例，并且本领域普通技术人员显然知晓任何核酸分子可以适用。因此，本领域普通技术人员可以基于本领域公知技术和技术常识适当地制备期望的核酸分子。
在前述ssNc分子中，前述表达控制序列是当本发明的ssNc分子在体内或在体外引入细胞时表现出抑制前述靶基因表达的能力的序列。前述表达控制序列不特别限定，并且可以根据靶基因的种类而适当地设定。作为前述表达控制序列，例如可以适当地使用参与由siRNA引起的RNA干扰的序列。即，结合至靶mRNA的前述siRNA链的RNA序列可以用作前述表达控制序列。
在前述ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补且前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补。因此，在5’侧，双链可以通过前述区域(Xc)向区域(X)的折回和前述区域(Xc)和(X)的自退火形成，并且在3’侧，双链可以通过前述区域(Yc)向区域(Y)的折回和前述区域(Yc)和(Y)的自退火形成。因此，前述ssNc分子可以在分子中形成双链且所述ssNc分子是明显不同于其中两个单独的单链RNA通过退火形成双链RNA的例如用于常规RNA干扰的siRNA的结构。
前述表达控制序列与前述靶基因的预设区域例如优选至少90％互补，更优选95％互补，更加优选98％互补，并特别优选100％互补。当满足这种互补性时，例如，可充分减少脱靶效应。
作为具体实例，当靶基因为荧光素酶基因，例如，SEQ ID NO:5示出的序列可用作前述表达控制序列，并且当靶基因为小鼠GAPDH基因时，SEQ ID NO:6示出的序列可用作前述表达控制序列。
5’-UCGAAGUACUCGGCGUAGG-3’(SEQ ID NO:5)
5’-GUUGUCAUAUUUCUCGUGG-3’(SEQ ID NO:6)
在前述ssNc分子中，前述表达控制序列如上所述包括在前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的至少一者中。前述ssNc分子可包括例如一个上述表达控制序列或两个以上的上述表达控制序列。
在后一种情况下，前述ssNc分子可包括例如：针对同一靶基因的两个以上的相同表达控制序列；针对同一靶基因的两个以上的不同表达控制序列；或者针对不同靶基因的两个以上的不同表达控制序列。当前述ssNc分子包括两个以上的上述表达控制序列，各表达控制序列的位置不特别限定，并且它们可在选自前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)的一个区域或不同区域。当前述ssNc分子包括例如针对不同靶基因的两个以上的上述表达控制序列，前述ssNc分子可控制两种以上的不同靶基因的表达。
如上所述，前述内部区域(Z)由彼此连接的前述内部5’区域(X)和前述内部3’区域(Y)构成。例如，前述区域(X)和(Y)彼此直接连接，之间没有嵌入序列。前述内部区域(Z)表示为“由彼此连接的前述内部5’侧区域(X)和前述内部3’侧区域(Y)构成”，仅表明前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)之间的序列顺序。该定义不意欲限定在例如前述ssNc分子的使用中，前述内部区域(Z)中的前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Xc)为离散独立区域。即，例如，当前述表达控制序列包括在前述内部区域(Z)中时，前述表达控制序列可横跨前述内部区域(Z)中的前述区域(X)和(Y)而设置。
在前述ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)与前述内部5’侧区域(X)互补。唯一必须的是，前述区域(Xc)具有与前述区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列。具体地，例如，前述区域(Xc)包括或优选地由与区域(X)的整个区域或部分区域互补的序列构成。前述区域(Xc)可例如与前述区域(X)的整个区域或部分区域完全互补，或者区域(Xc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选地，区域(Xc)与其完全互补。在前述ssNc分子中，前述3’侧区域(Yc)与前述内部3’侧区域(Y)互补。唯一必须的是，前述区域(Yc)具有与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列。具体地，例如，前述区域(Yc)包括与前述区域(Y)的整个区域或部分区域互补的序列或优选由其构成。前述区域(Yc)可例如与前述区域(Y)的整个区域或部分区域完全互补，或者区域(Yc)中的一个或几个碱基可与其是非互补的。优选地，前述区域(Yc)与其完全互补。前述表达“一个或几个碱基”意指例如1至3个碱基，优选1个碱基或2个碱基。
在前述ssNc分子中，例如前述5’侧区域(Xc)和前述内部5’侧区域(X)可彼此直接或间接连接。在前一种情况下，例如，前述区域(Xc)和(X)可通过磷酸二酯键等直接连接。在后一种情况下，例如，可提及一个实施方案，在所述实施方案中，连接子区域(Lx)在前述区域(Xc)和前述区域(X)之间构造，并且前述区域(Xc)和(X)经前述连接子区域(Lx)连接。
在前述ssNc分子中，例如前述3’侧区域(Yc)和前述内部3’侧区域(Y)可彼此直接或间接连接。在前一种情况下，例如，前述区域(Yc)和(Y)可通过磷酸二酯键等直接连接。在后一种情况下，例如，连接子区域(Ly)存在于前述区域(Yc)和(Y)之间，并且前述区域(Yc)和(Y)经前述连接子区域(Ly)连接。
前述ssNc分子可具有例如前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)中的二者或之一。在后一种情况下，例如可提及的构造为在前述5’侧区域(Xc)和前述内部5’侧区域(X)之间具有前述连接子区域(Lx)，并且在前述3’侧区域(Yc)和前述内部3’侧区域(Y)之间无前述连接子区域(Ly)，其中前述区域(Yc)和前述区域(Y)直接连接。在后一种情况下，例如可提及的构造为在前述3’侧区域(Yc)和前述内部3’侧区域(Y)之间具有前述连接子区域(Ly)，并且在前述5’侧区域(Xc)和前述内部5’侧区域(X)之间无前述连接子区域(Lx)，其中前述区域(Xc)和前述区域(X)直接连接。
前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)各自优选在该区域内具有不自退火的结构。
关于前述ssNc分子，不含前述连接子区域的ssNc分子的一个实施方案在WO 2012/005368图1中示出，并可以参考。
关于前述ssNc分子，具有前述连接子区域的ssNc分子的一个实施方案在WO 2012/005368图2中示出，并可以参考。
在前述ssNc分子中，前述5’侧区域(Xc)、前述内部5’侧区域(X)、前述内部3’侧区域(Y)和前述3’侧区域(Yc)的碱基数不特别限定，并且例如如下所述。本发明中，“碱基数”意指例如“长度”，且其还可称作“碱基长度”。
如上所述，例如，前述5’侧区域(Xc)可与前述内部5’侧区域(X)的整个区域互补。在该情况下，前述区域(Xc)如对前述第二ssPN分子的解释。
此外，如上所述，前述5’侧区域(Xc)可与例如前述内部5’侧区域(X)的部分区域互补。在该情况下，前述区域(Xc)如对前述第二ssPN分子的解释。
如上所述，前述3’侧区域(Yc)可与例如前述内部3’侧区域(Y)的整个区域互补。在该情况下，前述区域(Yc)如对前述第二ssPN分子的解释。
此外，如上所述，前述3’侧区域(Yc)可与例如前述内部3’侧区域(Y)的部分区域互补。在该情况下，前述区域(Yc)如对前述第二ssPN分子的解释。
在前述ssNc分子中，前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和前述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)的关系以及前述内部区域(Z)的碱基数(Z)与前述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)和前述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)的关系如对前述第二ssPN分子的解释。
在前述ssNc分子中，前述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与前述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)之间的关系如对前述第二ssPN分子的解释。
在前述ssNc分子中，前述内部5’侧区域(X)的碱基数(X)与前述5’侧区域(Xc)的碱基数(Xc)之间的关系、前述内部3’侧区域(Y)的碱基数(Y)与前述3’侧区域(Yc)的碱基数(Yc)之间的关系如对前述第二ssPN分子的描述。
在前述ssNc分子中，虽然各区域的长度如对前述第二ssPN分子的解释，但本发明不限于此。本发明中，例如碱基数的数值范围公开了落入该范围内的所有正整数，并且例如“1至4个碱基”意指所有“1、2、3和4个碱基”(下文同样适用)。
在前述ssNc分子中，前述连接子区域(Lx)和(Ly)的长度不特别限定。前述连接子区域(Lx)优选具有例如允许前述内部5’侧区域(X)和前述5’侧区域(Xc)形成双链的长度，并且前述连接子区域(Ly)优选具有例如允许前述内部3’侧区域(Y)和前述3’侧区域(Yc)形成双链的长度。当前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的构成单元包括一个(或多个)碱基时，前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的碱基数可以是相同的或不同的，并且，其碱基序列可以是相同的或不同的。前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的碱基数的下限为例如1、优选2、更优选3，且其上限为例如100、优选80、更优选50。各前述连接子区域的碱基数具体为例如1至50、1至30、1至20、1至10、1至7或1至4，但不限于此。
前述ssNc分子的全长不特别限定。在前述ssNc分子中，总碱基数(全长ssPN分子的碱基数)的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，并且其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。在前述ssNc分子中，不包括前述连接子区域(Lx)和(Ly)的碱基数的总碱基数的下限为例如38、优选42、更优选50、更加优选51、特别优选52，并且其上限为例如300、优选200、更优选150、更加优选100、特别优选80。
前述ssNc分子的构成单元的实例不特别限定并包括例如核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如不被修饰的核苷酸残基(未修饰的核苷酸残基)或已被修饰的核苷酸残基(修饰的核苷酸残基)。通过构造前述ssNc以包括前述修饰的核苷酸残基，例如可改进前述ssNc分子对核酸酶的抗性，从而使ssPN分子的稳定性得以改进。此外，前述ssNc分子进一步可包括例如除前述核苷酸残基以外的非核苷酸残基。
在前述ssNc分子中，前述核苷酸残基作为前述内部区域(Z)、前述5’侧区域(Xc)和前述3’侧区域(Yc)各自的构成单元是优选的。各前述区域由例如下列残基(1)至(3)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
在前述ssNc分子中，前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的构成单元不特别限定，并且其实例包括前述核苷酸残基和前述非核苷酸残基。各前述连接子区域可由例如仅一个(或多个)前述核苷酸残基、仅一个(或多个)前述非核苷酸残基或一个(或多个)前述核苷酸残基和一个(或多个)前述非核苷酸残基二者构成。各前述连接子区域由例如下列残基(1)至(7)的任一项构成：
(1)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(2)修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(3)未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(4)一个(或多个)非核苷酸残基
(5)一个(或多个)非核苷酸残基和未修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(6)一个(或多个)非核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基
(7)一个(或多个)非核苷酸残基、未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和修饰的一个(或多个)核苷酸残基。
当前述ssNc分子具有例如前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)二者时，二者的构成单元均可以是相同的或不同的。其具体实例包括其中两种连接子区域的构成单元均为前述核苷酸残基的形式、其中两种连接子区域的构成单元均为前述非核苷酸残基的形式、其中一个区域的构成单元为前述核苷酸残基且另一个连接子区域的构成单元为非核苷酸残基的形式等。
前述ssNc分子的实例包括仅由前述核苷酸残基构成的分子；和除前述核苷酸残基以外包括前述一个或(多个)非核苷酸残基的分子。在前述ssNc分子中，如上所述，前述核苷酸残基可为例如仅前述未修饰的核苷酸残基；仅前述修饰的核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者。当前述ssNc分子包括前述未修饰的一个(或多个)核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基二者时，前述修饰的一个(或多个)核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至5个、优选1至4个、更优选1至3个、最优选1或2个。当前述ssNc分子包括前述一个(或多个)非核苷酸残基时，前述一个(或多个)非核苷酸残基的个数不特别限定，并为例如“1个至几个”，具体例如1至8个、1至6个、1至4个、1、2或3个。
在前述ssNc分子中，前述核苷酸残基优选例如核糖核苷酸残基。在该情况下，前述ssNc分子还称作“RNA分子”或“ssRNA分子”。前述ssRNA分子的实例包括仅由前述核糖核苷酸残基构成的分子；和除前述核糖核苷酸残基以外包括前述一个(或多个)非核苷酸残基的分子。如上所述，作为前述核糖核苷酸残基，例如前述ssRNA分子可包括：仅前述未修饰的核糖核苷酸残基；仅前述修饰的核糖核苷酸残基；或前述未修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基和前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基二者。
当前述ssRNA分子除前述未修饰的核糖核苷酸残基以外包括例如前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基时，前述修饰的一个(或多个)核糖核苷酸残基的个数如对前述第二ssPN分子的解释。
前述ssNc分子可包括例如标记物质，并可用前述标记物质标记。前述标记物质如对前述第二ssPN分子的解释。
(2)核苷酸残基
前述核苷酸残基如对前述ssPN分子的解释。
(3)非核苷酸残基
前述非核苷酸残基不特别限定。前述ssNc分子可具有例如包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸结构作为前述非核苷酸残基。前述一个(或多个)非核苷酸残基优选存在于例如前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)的至少之一。前述一个(或多个)非核苷酸残基可存在于例如前述连接子区域(Lx)或前述连接子区域(Ly)或前述连接子区域二者。前述连接子区域(Lx)和前述连接子区域(Ly)可例如为相同的或不同的。
前述吡咯烷骨架如对前述ssPN分子中吡咯烷骨架的解释。
前述哌啶骨架如对前述ssPN分子中哌啶骨架的解释。
前述连接子区域可例如仅由具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基构成，或可包含具有前述非核苷酸结构的一个(或多个)非核苷酸残基和一个(或多个)核苷酸残基。
前述连接子区域例如由下式(I)表示。前述连接子区域如对前述ssPN分子中连接子区域的解释。
当前述连接子区域(Ly)例如由前述式(I)表示，前述连接子区域(Ly)如对前述连接子区域(Lx)的解释。
在前述ssNc分子中，前述连接子区域(Lx)可包含选自由氨基酸残基、多胺残基和多羧酸残基组成的组中的至少一种。前述连接子区域可包含或可不包含除氨基酸残基、多胺残基和多羧酸残基以外的残基。例如，前述连接子区域可包含多羧酸残基、对苯二甲酸残基和氨基酸残基中的任意残基。
本发明中，所述“多胺”意指包含多个(2个、3个或更多)氨基的任何化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。本发明中，前述多胺不特别限定，并且其实例包括1,4-苯二胺、1,3-苯二胺、1,2-苯二胺等。此外，本发明中，所述“多羧酸”意指包含多个(2个、3个或更多)羧基的任何化合物。本发明中，前述多羧酸不特别限定，并且其实例包括1,4-二羧基苯(对苯二甲酸)、1,3-二羧基苯(间苯二甲酸)、1,2-二羧基苯(邻苯二甲酸)等。此外，本发明中，如下所述，所述“氨基酸”意指在分子中包含一个或多个氨基和一个或多个羧基的任何有机化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。
在前述ssNc分子中，前述氨基酸残基可为多个相互连接的氨基酸残基。本发明中，为多个相互连接的氨基酸残基的氨基酸残基例如为包含肽结构的残基。更具体地，前述为多个相互连接的氨基酸残基的氨基酸残基例如为下述化学式(I)的氨基酸残基，其中下述化学式(Ia)为肽(如甘氨酸二聚体或甘氨酸三聚体等)。
在前述ssNc分子中，前述氨基酸残基可为甘氨酸残基、对苯二甲酰胺残基、脯氨酸残基或赖氨酸残基。此外，前述氨基酸残基可为修饰的氨基酸残基或氨基酸衍生物。
在前述ssNc分子中，前述连接子区域残基由例如以下化学式(I-0)表示。
在前述化学式(I-0)中，
Q11和Q12各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S(硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S，
Q1和Q2各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S(硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O或S，
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，并且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或者，
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，并且亚烷基碳原子上的氢原子可以被或可以不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或者，
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
前述X区域和前述Y区域各自经-OR1-或-OR2-连接至前述连接子残基，
其中R1和R2可以存在或可以不存在，并且当R1和R2存在时，它们各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I-0)，并且
A为任意原子团。
前述X区域和前述Y区域与-OR1-和-OR2-的组合不特别限定，并且可为例如下列条件中的任一种。
条件(1)：
前述X区域经-OR2-连接至前述式(I)的结构，且前述Y区域经-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述X区域经-OR1-连接至前述式(I)的结构，且前述Y区域经-OR2-连接至前述式(I)的结构。
在前述化学式(I-0)中，例如，Q11可为C＝O(羰基)，且Q1可为NH(亚氨基)。此外，例如，Q11可为NH(亚氨基)，且Q1可为C＝O(羰基)。此外，例如，Q12可为C＝O(羰基)，且Q2可为NH(亚氨基)。此外，例如，Q12可为NH(亚氨基)，且Q2可为C＝O(羰基)。
在前述化学式(I-0)中，Q11和Q12各自可为例如羰基。在该情况下，Q1和Q2各自优选为亚氨基。此外，在该情况下，下列化学式(Iα)的结构更优选地由下列化学式(Iα2)表示。
在前述化学式(Iα2)中，R100为任意取代基，其可以存在或可以不存在。当其存在时，其可以单个地或以多个存在。当其以多个存在时，它们可以彼此相同或不同。前述R100的任意取代基的实例包括下述作为前述Ra、Rb、Rc和Rd而示例的取代基。更多其具体实例包括卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述化学式(Iα2)的结构更优选地由下列化学式(Iα3)表示。
当Q11和Q12为羰基，且Q1和Q2为亚氨基，前述化学式(I-0)的连接子残基可为羧酸酰胺残基或羧酸残基。例如，“TPA”结构可为对苯二甲酰胺残基或由前述化学式(Iα3)表示的对苯二甲酸残基。
在前述化学式(I-0)中，Q11和Q12各自可为亚氨基。在该情况下，Q1和Q2各自优选为羰基。在该情况下，下列化学式(Iβ)的结构更优选由下列化学式(Iβ2)表示。
在前述化学式(Iβ2)中，R100为任意取代基，其可以存在或可以不存在。当其存在时，其可以单个地或以多个存在。当其以多个存在时，它们可以彼此相同或不同。具体例如，其与前述化学式(Iα2)中的R100相同。此外，前述化学式(Iβ2)的结构更优选由下列化学式(Iβ3)表示。
在前述ssNc分子中，当前述连接子残基为氨基酸残基，前述氨基酸残基由例如下列化学式(I)表示。下列化学式(I)的结构为由前述化学式(I-0)表示的结构的一个实例。
在前述式(I)中，例如X1、X2、Y1、Y2、L1和L2如上所定义。
与表达控制序列互补的序列经-OR1-或OR2-各自键合至前述氨基酸残基，
R1和R2可以存在或可以不存在，并且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)，并且
A为任意原子团，下列化学式(Ia)为氨基酸或肽。
前述化学式(I)、(Iα)或(Ia)中的原子团A可以包含或可以不包含例如选自由链式原子团(chain atomic group)、脂环式原子团、芳香族性原子团、杂芳香族性原子团和杂脂环式原子团组成的组中的至少之一。虽然前述链式原子团不特别限定，可以提及例如烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。虽然前述脂环族原子团不特别限定，可提及例如环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等。虽然前述芳香族性原子团不特别限定，可提及例如芳基、芳基烷基、烷基芳基、稠环芳基、稠环芳基烷基、稠环烷基芳基等。虽然前述杂芳香族性原子团不特别限定，可提及例如杂芳基、杂芳基烷基、烷基杂芳基、稠环系杂芳基、稠环系杂芳基烷基、稠环系烷基杂芳基等。在前述化学式(I)、(Iα)或(Ia)中的原子团A中，前述原子团各自可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。当前述取代基或保护基以多个存在时，它们可以是相同的或不同的。前述取代基为例如为前述Ra、Rb、Rc和Rd示例的那些，更具体地，例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基例如与为前述Ra、Rb、Rc和Rd示例的那些相同。
本发明中，如上所述，所述“氨基酸”是指在分子中包含至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。例如，脯氨酸、羟基脯氨酸等在分子中不包含-NH2基团，但包含亚氨基(-NH-)，并且包括在本发明中“氨基酸”的定义中。本发明中，如下所述，前述“氨基酸”可为天然氨基酸或人工氨基酸。例如，由下述化学式(Ia2)或(Ia3)表示的化合物在分子中还包含氨基和羧基，因此，其包括在本发明中“氨基酸”的定义中。因此，例如其中原子团A由下述化学式(A2)或化学式(A2a)表示的前述化学式(I)的结构包括在本发明中“氨基酸残基”的定义中。此外，例如下述实施例中的“TPA”结构也包括在本发明中“氨基酸残基”的定义中。另外，本发明中，所述“肽”是指具有2分子以上的氨基酸经肽键键合的结构的有机化合物。前述肽键可为酰胺结构或酰亚胺结构。当多个氨基存在于由前述化学式(Ia)表示的氨基酸或肽分子中时，在前述化学式(Ia)中清楚示出的氨基可为任何氨基。此外，当多个羧基存在于由前述化学式(Ia)表示的氨基酸或肽分子中时，在前述化学式(Ia)中清楚示出的羧基可为任何羧基。
在前述ssNc分子的前述氨基酸残基中，如上所述，前述氨基酸可为例如天然氨基酸或人工氨基酸。本发明中，所述“天然氨基酸”是指具有天然存在的结构的氨基酸或其光学异构体。前述天然氨基酸的生产方法不特别限定，并且例如，其可从自然中提取或可以合成。另外，本发明中，“人工氨基酸”是指具有非天然存在的结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸是一种氨基酸，也即包含氨基的羧酸衍生物(在分子中包含至少一个氨基和至少一个羧基的有机化合物)，和具有非天然存在的结构的羧酸衍生物。前述人工氨基酸优选不包含例如杂环。前述氨基酸可为构成例如蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可为例如选自由甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和由下列化学式(Ia2)表示的氨基酸组成的组中的至少一种，并且可以进一步具有或可以不进一步具有取代基或保护基。前述取代基的实例包括为前述Ra、Rb、Rc和Rd示例的取代基。更具体地，可提及例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。前述保护基与例如为前述Ra、Rb、Rc和Rd示例的保护基相同。当不是肽的前述式(Ia)的氨基酸包含异构体例如光学异构体、几何异构体、立体异构体等，可使用任何异构体。
在前述化学式(Ia2)中，R100为任意取代基，并可以存在或可以不存在。当其存在时，其可以单个地或以多个存在。当其以多个存在时，它们可以彼此相同或不同。前述R100的任意取代基的实例包括作为前述Ra、Rb、Rc和Rd而示例的那些。更多其具体实例包括卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。此外，前述化学式(Iα2)的结构可为例如下列化学式(Iα3)。
当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia2)，前述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2)表示。下述化学式(A2)中的R100与前述化学式(Ia2)中的R100相同。此外，当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia3)，前述化学式(I)中原子团A的结构由下列化学式(A2a)表示。
前述化学式(I)的结构的实例包括下列化学式(I-1)-(I-7)。在下列(I-1)-(I-7)中，n和m与前述化学式(I)中相同。
在前述化学式(I-1)至(I-7)中，n和m不特别限定，并如上所述。其具体实例包括在前述化学式(I-1)中n＝11和m＝12或n＝5和m＝4，在前述化学式(I-4)中n＝5和m＝4，在前述化学式(I-6)中n＝4和m＝4，以及在前述化学式(I-7)中n＝5和m＝4。所述结构由下列化学式(I-1a)、(I-1b)、(I-4a)、(I-6a)和(I-7a)示出。
将用于本发明中的前述ssNc分子的实例包括由下述NK-7006和NK-7007示出的ssNc分子。
将包含于本发明的组合物中的核酸分子可通过本身已知的方法生产。例如，可根据在WO 2012/017919、WO 2013/103146、WO 2012/005368或WO 2013/077446中所述的方法生产。
虽然本发明的组合物中的核酸分子的含量不特别限定，当组合物为药物组合物时，相对于整个药物组合物，核酸分子的含量通常为0.0001-60重量％，优选0.001-15重量％，进一步优选0.01-1重量％。
2.缓冲液
本发明的组合物包含缓冲液。本发明中，缓冲液是指具有缓冲功能的溶液(特别是水溶液)，并通过包含缓冲剂构成。本发明中的缓冲剂意指水溶液的pH的稳定剂，并且可以选择通常用于药物生产领域中的稳定剂。
本发明中，通过使用缓冲液可以防止组合物中核酸分子的降解。
作为将用于本发明的缓冲液，可提及调节组合物的pH至不低于4.0且不高于9.0的缓冲液。优选调节组合物的pH至不低于5.5且不高于7.5的缓冲液，并更优选调节组合物的pH至不低于6.0且不高于7.0的缓冲液。此外，优选调节组合物的pH至不低于6.1且不高于6.9的缓冲液，优选调节组合物的pH至不低于6.2且不高于6.8的缓冲液，更优选调节组合物的pH至不低于6.3且不高于6.7的缓冲液，进一步优选调节组合物的pH至不低于6.4且不高于6.6的缓冲液，并特别优选将组合物的pH设定至6.5的缓冲液。
作为将用于本发明的缓冲剂，具体地，可提及选自抗坏血酸、L-天冬氨酸镁、亚硫酸钠、L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、苯甲酸、苯甲酸钠、ε-氨基己酸、氯化铵、氯化钾、氯化钠、氯化氨基葡萄糖、盐酸三乙醇胺、稀盐酸、柠檬酸、无水柠檬酸、无水柠檬酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠水合物、柠檬酸二氢钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸钾、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸、葡萄糖酸-σ-内酯、葡萄糖酸、葡萄糖酸钙水合物、L-谷氨酸、L-谷氨酸一钠、肌酸酐、氯丁醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琥珀酸、琥珀酸二钠六水合物、乙酸、乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠水合物、二异丙胺、二乙醇胺、酒石酸、L-酒石酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、牛磺酸、碳酸钠、碳酸钠水合物、碳酸氢钠、三异丙胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、二氧化碳、乳酸、乳酸钙水合物、乳酸钠溶液、L-组氨酸、4-(2-羟乙基)、冰醋酸、葡萄糖、富马酸一钠、丙酸钠、苯扎氯铵、芳香烃混合溶剂、硼酸铵、马来酸、无水乙酸钠、无水碳酸钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸三钠、无水磷酸二氢钠、偏磷酸钠、甲基磺酸、硫酸、硫酸铝钾水合物、磷酸、磷酸一氢钠七水合物、磷酸三钠、磷酸氢钠水合物、磷酸氢二钠水合物、磷酸二氢钠水合物、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠一水合物的一种以上的缓冲剂。其中，优选柠檬酸。
因此，作为将用于本发明的组合物的缓冲液，可优选提及包含柠檬酸的缓冲液。
本发明中，缓冲液优选包含作为上述缓冲剂而示例的酸及其盐，或者作为上述缓冲剂而示例的两种以上的酸的盐。更优选地，可提及包含柠檬酸及其盐(如柠檬酸和柠檬酸钠、柠檬酸和柠檬酸三钠等)的缓冲液、包含磷酸及其盐(如磷酸、磷酸二氢钠等)的缓冲液和包含两种磷酸盐(如磷酸氢二钠和磷酸二氢钠)的缓冲液。特别优选包含柠檬酸及其盐的缓冲液。
将用于本发明的组合物的缓冲液的量可以是任意的，只要其可调节至期望的pH范围。例如，可以适当地确定以使组合物中缓冲剂的含量落入以下范围内。即，相对于整个组合物，本发明的组合物中缓冲剂的含量通常为0.0001-40重量％，优选0.0005-20重量％，进一步优选0.001-10重量％。
3.其他添加剂
本发明的组合物可以进一步包含溶剂。溶剂的实例包括药学上可接受的有机溶剂(如乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、水、注射用水、生理盐水、葡萄糖溶液等。可以在组合物中使用一种以上的溶剂。
本发明中，由于核酸分子可在短时间内溶解，核酸分子优选地溶于溶剂中并与缓冲液混合。作为溶剂，水是优选的。本说明书中，除非另有说明，所述“核酸分子溶于缓冲液中”意指不仅作为固体的核酸分子直接溶于缓冲液中，而且如上所述，核酸分子一次性溶于例如水等的溶剂中，且得到的溶液与缓冲液混合。
本发明中，溶剂的含量通常不低于0.0001重量％且低于100重量％，优选不低于0.001重量％且低于100重量％，进一步优选不低于0.005重量％且低于100重量％，作为相对于整个组合物的总量。
当本发明的组合物为药物组合物，组合物可通过公知的方法配制为例如吸入液剂、注射剂、液剂等，并通过肠胃外给药(如经鼻给药、静脉内给药、滴注、肌内给药、皮下给药等)施用。此外，其可以以适当的剂型(如胶囊剂等)口服给药。
除上述组分，本发明的药物组合物必要时还可以包含药学上可接受的添加剂。当本发明的药物组合物为注射剂时，添加剂的实例包括等渗剂(如葡萄糖、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇等)、舒缓剂(如苯甲醇等)、防腐剂(如苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇等)等。优选的添加剂为苯甲酸甲酯。
当本发明的药物组合物为注射剂时，其还可以通过将核酸分子溶于缓冲液中并将得到的溶液与脂质膜的构成分子接触而生产为包封核酸分子的脂质体制剂。脂质体制剂可优选用作用于全身给药例如静脉内注射、肌内注射等的注射剂。
当本发明的药物组合物制备为吸入剂，例如，通过将核酸分子溶于例如水等的溶剂中获得的溶液与加入缓冲剂(如柠檬酸及其盐、磷酸及其盐)的水溶液混合，混合物过滤以除去细菌，且得到的药物溶液灌装至密封容器例如小瓶、安瓿等以生产吸入剂。例如，核酸分子与包含水和缓冲剂(如柠檬酸及其盐、磷酸及其盐)的水溶液混合，通过超声波处理等溶解，过滤以除去细菌，并将得到的药物溶液灌装至密封容器例如小瓶、安瓿等以生产吸入剂。虽然将使用的密封容器通常为无色且透明的硼硅酸盐玻璃容器，也可使用其中玻璃内部的液体接触部分具有石英样表面性质的容器。
本发明的药物组合物中，作为活性成分的核酸分子对于多种疾病的治疗或预防是有用的。
例如，对患有由基因引起的疾病的患者的施用可以控制前述基因的表达，从而治疗前述疾病。本发明中，术语“治疗”包括，如上所述，例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善且其可意指它们中的任意一个。
具体实例如下。通过将TGF-β1基因设定为前述靶基因并将针对前述基因的表达抑制序列(如SEQ ID NO:4示出的核苷酸序列)引入前述ssPN分子，其可用于针对通过抑制TGF-β1可期望治疗效果的疾病或病理的治疗。
使用本发明的药物组合物的方法不特别限定。例如，前述药物组合物可以施用至具有前述靶基因的受试者。
本发明的药物组合物施用的前述受试者的实例包括细胞、组织、器官等。前述受试者的实例还包括人类、非人类动物等例如非人类哺乳动物，也即除人类以外的哺乳动物。前述施用可以例如在体内或在体外进行。前述细胞不特别限定，并且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞；干细胞例如ES细胞和造血干细胞；以及从活有机体分离出的细胞，例如原代培养细胞。
由于本发明的药物组合物是低毒的，其可以安全地施用至哺乳动物(如人类、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪、猴)，特别是人类。
本发明的药物组合物的剂量也依据给药对象、给药途径、疾病等而变化。例如，当其以吸入液剂作为用于特发性肺纤维化的治疗剂施用至成人时，作为活性成分的核酸分子的剂量为约0.001至约20mg/kg体重、优选约0.005至约5mg/kg体重、更优选约0.01至约1mg/kg体重，所述核酸分子可以每天以1份至几份给药。
本发明还涉及用于稳定组合物中的核酸分子的方法，该方法包括向核酸分子中加入缓冲液，或者包含核酸分子的稳定组合物的制备方法。作为用于该方法的缓冲液，可提及与本发明的组合物的前述实例相似的那些，且优选相似的。
在本发明的稳定/制备方法中，只要pH可以调节至期望的范围，将加入的缓冲液的量可以是任意的。例如，缓冲剂的量可以适当地设定以落入以下范围内。即，相对于由所述方法得到的整个组合物，将在本发明的稳定/制备方法中加入的缓冲剂的量通常为0.0001-40重量％、优选0.0005-20重量％、进一步优选0.001-10重量％。
具体实施方式
下文中，将参考实施例等详细描述本发明，其不能认为是限制性的。
[实施例]
制造例1(单链核酸分子的合成)
以下所示的单链核酸分子通过核酸合成仪(商品名：ABI Expedite(注册商标)8909核酸合成系统，Applied Biosystems)基于亚磷酰胺法(phosphoramidites method)合成。对于前述合成，RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)用作RNA酰胺(下文相同)。前述亚酰胺(amidite)通过常规方法脱保护，合成的RNA通过HPLC纯化。纯化后的各RNA冷冻干燥。
作为实施例1-4的单链核酸分子，PH-0009(PshRNA)的合成如上述。在PshRNA中，Lx为连接子区域Lx，下述结构式通过L-脯氨酸二酰胺亚酰胺(L-propline diamide amidite)合成。下划线显示人类TGF-β1基因的表达抑制序列。
PshRNA(PH-0009)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Lx-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’(SEQ ID NO：7)
实施例1(pH对保存温度的影响评价)
实施例1-1(试验组合物的准备)
评价核酸吸入(inhalation)原型的含PH-0009组合物的热稳定性。通过本领域通用方法配制以下试验组合物1-12。
试验组合物1：PH-0009配方19(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 2.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物2：PH-0009配方20(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 3.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物3：PH-0009配方21(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物4：PH-0009配方22(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物5：PH-0009配方23(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物6：PH-0009配方24(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物7：PH-0009配方25(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物8：PH-0009配方26(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 9.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物9：PH-0009配方27(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 10.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物10：PH-0009配方28(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 11.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物11：PH-0009配方29(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 12.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物12：PH-0009配方30(0.04M盐酸-氯化钾缓冲液(pH 1.5))，(0.1mg/mL)
实施例1-2(试验方法和判断标准)
试验组合物1-12各自以25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃保存在稳定性试验器中。各个保存品每周取出，其含量通过离子交换HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。保存时间和保存品的数量在表2-表5中示出。
在各个保存条件下确定至4周的相对于保存开始时的含量的含量比(％)的改变，并且对判断为稳定性优良的配方持续评价。
分别在25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃保存1周、2周、3周和4周的试验组合物1-12用作保存样品。
单独地，PH-0009使用注射用水配制为0.1mg/mL，用作校正曲线样品(100％)。取90μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(10μL)至100μL，作为校正曲线样品(90％)。取80μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(20μL)至100μL，作为校正曲线样品(80％)。取70μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(30μL)至100μL，作为校正曲线样品(70％)。取60μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(40μL)至100μL，作为校正曲线样品(60％)。
通过HPLC测量各个校正曲线样品(60％-100％)和各个保存样品(每个10μL)。对于校正曲线样品(60％-100％)得到的峰面积，通过以理论含量(％)为横轴(X)和峰面积为纵轴(Y)的最小二乘法确定其回归线(Y＝aX+b)和相关系数(r)，并且计算各个样品相对于保存开始时的含量的含量比(％)(excel2013)。
表2
保存时间和保存品数量
表3
保存时间和保存品数量
表4
保存时间和保存品数量
表5
保存时间和保存品数量
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和相应样品。
检测器：紫外吸收仪(测量波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温度：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相进料：流动相A和流动相B的混合比按如下改变以控制浓度梯度(表6)。
表6
注射后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
实施例1-3(结果)
结果在图1-图3中示出。因为在pH范围5-7内在60℃、4周保存的最苛刻条件下未观察到相对于保存开始时的含量的含量比(％)的明显减少，设置含PH-0009组合物的pH范围为5-7。
总体上，核酸易受温度和其在常温或高于常温下的长时间保存影响。结果显示单链核酸可以通过控制溶液的pH在常温或高于常温下长期保存。
实施例2(柠檬酸缓冲液和在其浓度下的稳定性评价)
实施例2-1(试验组合物)
评价核酸吸入(inhalation)原型的含PH-0009组合物的热稳定性。
用0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8)和0.005M柠檬酸缓冲液(pH 6.8)作为基础配方，评价以下试验组合物13和14在各个溶液中的热稳定性。
试验组合物13如下配制。
将柠檬酸水合物(21.0g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸溶液。相同地，将柠檬酸三钠二水合物(29.4g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将所述0.1M柠檬酸溶液加入所述0.1M柠檬酸钠溶液以调节pH至6.8，该混合物用作0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.8)。
单独地，将核酸(PH-0009)(10mg)溶于注射用水(0.5mL)。将该溶液(0.2mL)与注射用水(20mL)混合。向其中加入0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.8)(20mL)，搅拌混合物，并将混合物通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到4mg/40mL(0.1mg/mL)含PH-0009组合物。
试验组合物14如下配制。
将柠檬酸水合物(21.0g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸溶液。相同地，将柠檬酸三钠二水合物(29.4g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将所述0.1M柠檬酸溶液加入所述0.1M柠檬酸钠溶液以调节pH至6.8，该混合物用作0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.8)。将0.1M柠檬酸溶液(18mL)、0.1M柠檬酸钠溶液(82mL)、和注射用水(900mL)混合，并用1N NaOH调节至pH6.8从而得到0.01M柠檬酸溶液(pH 6.8)。
单独地，将核酸(PH-0009)(13.9mg)溶于注射用水(1mL)。将该溶液(0.0719mL)与注射用水(4.9281mL)混合。向其中加入0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.8)(5mL)，搅拌混合物，并将混合物通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到1mg/10mL(0.1mg/mL)含PH-0009组合物。
试验组合物13：PH-0009配方3(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物14：PH-0009配方7(0.005M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
实施例2-2(试验方法和判断标准)
试验组合物13和14各自以40℃/75％RH和60℃保存在稳定性试验器中。各个保存品每周取出，其含量通过离子交换HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。保存时间和保存品的数量在表7中示出。
在各个保存条件下确定至4周的相对于保存开始时的含量的含量比(％)的改变，并且对判断为稳定性优良的配方持续评价。
分别在40℃/75％RH和60℃保存1周、2周、3周和4周的试验组合物13和14用作保存样品。
单独地，PH-0009使用注射用水配制为0.1mg/mL，用作校正曲线样品(100％)。取90μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(10μL)至100μL，作为校正曲线样品(90％)。取80μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(20μL)至100μL，作为校正曲线样品(80％)。取70μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(30μL)至100μL，作为校正曲线样品(70％)。取60μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(40μL)至100μL，作为校正曲线样品(60％)。
通过HPLC测量各个校正曲线样品(60％-100％)和各个保存样品(每个10μL)。对于校正曲线样品(60％-100％)得到的峰面积，通过以理论含量(％)为横轴(X)和峰面积为纵轴(Y)的最小二乘法确定其回归线(Y＝aX+b)和相关系数(r)，并且计算各个样品相对于保存开始时的含量的含量比(％)(excel2013)。
表7
保存时间和保存品数量
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和相应样品。
检测器：紫外吸收仪(测量波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温度：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相进料：流动相A和流动相B的混合比按如下改变以控制浓度梯度(表8)。
表8
注射后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
实施例2-3(结果)
结果在图4和图5中示出。结果显示即使当单链核酸以0.1mg/mL配制时在柠檬酸缓冲液浓度在0.005M-0.05M的范围下，60℃、4周间也未观察到相对于保存开始时的含量的含量比(％)的明显变化。因此暗示了即使单链核酸的浓度增加，也可通过控制柠檬酸缓冲液的浓度来维持核酸稳定的效果。
实施例3(含PH-0009组合物(10mg/mL)的配制)
实施10mg/mL含PH-0009组合物的配制方法。1mg/mL含PH-0009组合物可以通过将加入的核酸标准量变为1.0g来配制。在0.1mg/mL的情况下，所述量变为0.10g。
将柠檬酸水合物(21.0g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸溶液。相同地，将柠檬酸三钠二水合物(29.4g)溶于注射用水(1L)从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将所述0.1M柠檬酸溶液加入所述0.1M柠檬酸钠溶液以调节pH至6.5，该混合物用作0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)。
单独地，将核酸(PH-0009)(10g)溶于注射用水(500mL)。向该溶液加入0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)，将混合物搅拌并通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到10g/L(10mg/mL)含PH-0009组合物。该组合物可用作IPF吸入制剂等。
表9
组分名称(商品名或级别) 标准加入量
PH-0009(单链核酸) 10.0g
柠檬酸水合物(the Japanese Pharmacopoeia) 0.914g
柠檬酸三钠二水合物(JIS standard) 29.4g
注射用水(the Japanese Pharmacopoeia) 1L
实施例4(含PH-0009组合物温度稳定性的评价)
实施例4-1(试验组合物)
在开发单链核酸的制备中，为含PH-0009组合物的稳定性评价多种配方。结果，判断试验组合物15和16为作为核酸药物产品的最优配方，并评价其热稳定性。
试验组合物15和16以实施例3和试验组合物13、14相同方法得到。
试验组合物15：PH-0009配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)，(1mg/mL)
试验组合物16：PH-0009配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)，(10mg/mL)
实施例4-2(试验方法和判断标准)
试验组合物15和16各自以25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃保存在稳定性试验器中。各个保存品每周取出，其含量通过离子交换HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。保存时间和保存品的数量在表10中示出。
在各个保存条件下确定至4周的相对于保存开始时的含量的含量比(％)的改变，并且对判断为稳定性优良的配方持续评价。
分别在40℃/75％RH和60℃保存1周、2周、3周和4周的试验组合物15和16用作保存样品。
单独地，PH-0009使用注射用水配制为1mg/mL，用作校正曲线样品(100％)。取90μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(10μL)至100μL，作为校正曲线样品(90％)。取80μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(20μL)至100μL，作为校正曲线样品(80％)。取70μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(30μL)至100μL，作为校正曲线样品(70％)。取60μL校正曲线样品(100％)，加注射用水(40μL)至100μL，作为校正曲线样品(60％)。
通过HPLC测量各个校正曲线样品(60％-100％)和各个保存样品(每个10μL)。对于10mg/mL样品，通过HPLC测量1μL。对于校正曲线样品(60％-100％)得到的峰面积，通过以理论含量(％)为横轴(X)和以峰面积为纵轴(Y)的最小二乘法确定其回归线(Y＝aX+b)和相关系数(r)，并且计算各个样品相对于保存开始时的含量的含量比(％)(excel 2013)。
表10
保存时间和保存品数量
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和相应样品。
检测器：紫外吸收仪(测量波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温度：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相进料：流动相A和流动相B的混合比按如下改变以控制浓度梯度(表11)。
表11
注射后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
实施例4-3(结果)
试验组合物16的结果在图6中示出。结果显示10mg/mL含PH-0009组合物即使在60℃、4周间仍未观察到相对于保存开始时的含量的含量比(％)的明显变化。试验组合物15(1mg/mL含PH-0009组合物)得到相同结果。因此显示根据该配方配制的含PH-0009组合物(单链核酸吸入液剂等)具有高保存稳定性。
制造例2
作为实施例5的核酸分子，以下所示的链核酸分子通过核酸合成仪(商品名：ABIExpedite(注册商标)8909核酸合成系统，Applied Biosystems)基于亚磷酰胺法合成。对于前述合成，RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)用作RNA酰胺。前述亚酰胺通过常规方法脱保护，合成的RNA通过HPLC纯化。纯化后的各RNA冷冻干燥。
实施例5的单链核酸分子和双链核酸分子(siRNA)如上述合成。在NK-7006和NK-7007中，圆括号内的部分为连接子区域。NK-7006、NK-7007、PK-7006、PK-7015、PH-7069、和PH-7081中的下划线显示相应靶基因表达抑制序列，Lx为连接子区域。具有下述结构式的连接子区域Lx使用L-脯氨酸二酰胺亚酰胺合成。
NkRNA(NK-7006)(靶基因：荧光素酶)
5’-ACCUACGCCGAGUACUUCGAUUCC(CCACACC)GGAAUCGAAGUACUCGGCGUAGGUUC(UUCG)G-3’(SEQ ID NO：8)
NkRNA(NK-7007)(靶基因：小鼠GAPDH)
5’-ACCACGAGAAAUAUGACAACUCCC(CCACACC)GGGAGUUGUCAUAUUUCUCGUGGUUC(UUCG)G-3’(SEQ ID NO：9)
PnkRNA(PK-7006)(靶基因：小鼠TGF-β1)
5’-GGAACUCUACCAGAAAUAUAGCCC-Lx-GGGCUAUAUUUCUGGUAGAGUUCCAC-Lx-G-3’(SEQID NO：10)
PnkRNA(PK-7015)(靶基因：小鼠CCR3)
5’-AGCCUUGUACAGCGAGAUCUUUCC-Lx-GGAAAGAUCUCGCUGUACAAGGCUUC-Lx-G-3’(SEQID NO：11)
PshRNA(PH-7069)(靶基因：小鼠Smad3)
5’-GGUGCUCCAUCUCCUACUACGACC-Lx-GGUCGUAGUAGGAGAUGGAGCACCA-3’(SEQ IDNO：12)
反义核酸(Kynamro-7001)(ApoB100mRNA的反义DNA)
5’-GCCUCagtctgcttcGCACC-3’(SEQ ID NO：1)(小写字母表示DNA)
PshRNA(PH-7081)(靶基因：萤火虫荧光素酶)
5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAAACC-Lx-GGUUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUG-3’(SEQ ID NO：13)
siRNA(NI-7001)(小鼠CTGF)
5’-GUGUGACCAAAAGUUACAUGU-3’(SEQ ID NO：14)
5’-AUGUAACUUUUGGUCACACUC-3’(SEQ ID NO：15)
miRNA(NM-7001)(人类let7a-1前体)
5’-UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3’(SEQ ID NO：2)
适配子(Macugen-7001)(VEGF蛋白的适配子)
5’-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3’(SEQ ID NO：3)(t为3’3’-dT)
实施例5(通过柠檬酸缓冲液的多种核酸的稳定性评价)
实施例5-1(试验组合物的配制)
下述试验组合物17-36以实施例3和试验组合物13、14相同方法得到。
试验组合物17：NK-7006配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物18：NK-7006注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物19：NK-7007配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物20：NK-7007注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物21：PK-7006配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物22：PK-7006注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物23：PK-7015配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物24：PK-7015注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物25：PH-7069配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物26：PH-7069注射用水,(0.1mg/mL)
试验组合物27：Kynamro-7001配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物28：Kynamro-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物29：PH-7081配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物30：PH-7081注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物31：NI-7001配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物32：NI-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物33：NM-7001配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物34：NM-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物35：Macugen-7001配方44(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物36：Macugen-7001注射用水，(0.1mg/mL)
实施例5-2(试验方法和判断标准)
试验组合物17-36各自以60℃保存在稳定性试验器中。各个保存品每周取出，其含量通过离子交换HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。保存时间和保存品的数量在表12中示出。
各自在60℃保存1周、2周、3周和4周的试验组合物17-36用作保存样品。
单独地，将4℃保存的试验组合物17-36产品用作校正曲线样品(100％)。取90μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(10μL)至100μL，作为校正曲线样品(90％)。取80μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(20μL)至100μL，作为校正曲线样品(80％)。取70μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(30μL)至100μL，作为校正曲线样品(70％)。取60μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(40μL)至100μL，作为校正曲线样品(60％)。校正曲线样品的配制在表13中示出。
通过HPLC测量各个校正曲线样品(60％-100％)和各个保存样品(每个10μL)。对于校正曲线样品(60％-100％)得到的峰面积，通过以理论含量(％)为横轴(X)和以峰面积为纵轴(Y)的最小二乘法确定其回归线(Y＝aX+b)和相关系数(r)，并且计算各个样品相对于保存开始时的含量的含量比(％)。
表12
保存时间和保存品数量
表13
分析曲线样品配制
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和相应样品。
检测器：紫外吸收仪(测量波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温度：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相进料：流动相A和流动相B的混合比按如下改变以控制浓度梯度。
表14
注射后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
实施例5-3(结果)
结果在图7-16中示出。
结果显示，与注射用水(WFI)对比，无论核酸的种类如何，0.05M柠檬酸缓冲液的配方(pH 6.5)对热稳定性有利。
制造例3
作为实施例6的核酸分子，以下所示的链核酸分子通过核酸合成仪(商品名：ABIExpedite(注册商标)8909核酸合成系统，Applied Biosystems)基于亚磷酰胺法合成。对于前述合成，RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)用作RNA酰胺。前述亚酰胺通过常规方法脱保护，合成的RNA通过HPLC纯化。纯化后的各RNA冷冻干燥。
实施例6的单链核酸分子和双链核酸分子(siRNA)如上述合成。在NK-7006和NK-7007中，圆括号内的部分为连接子区域。NK-7006、NK-7007、PK-7006、PK-7015、PH-7069、和PH-7081中的下划线显示相应靶基因表达抑制序列，Lx为连接子区域。具有下述结构式的连接子区域Lx使用L-脯氨酸二酰胺亚酰胺合成。
NkRNA(NK-7006)(靶基因：荧光素酶)
5’-ACCUACGCCGAGUACUUCGAUUCC(CCACACC)GGAAUCGAAGUACUCGGCGUAGGUUC(UUCG)G-3’(SEQ ID NO：8)
NkRNA(NK-7007)(靶基因：小鼠GAPDH)
5’-ACCACGAGAAAUAUGACAACUCCC(CCACACC)GGGAGUUGUCAUAUUUCUCGUGGUUC(UUCG)G-3’(SEQ ID NO：9)
PnkRNA(PK-7006)(靶基因：小鼠TGF-β1)
5’-GGAACUCUACCAGAAAUAUAGCCC-Lx-GGGCUAUAUUUCUGGUAGAGUUCCAC-Lx-G-3’(SEQID NO：10)
PnkRNA(PK-7015)(靶基因：小鼠CCR3)
5’-AGCCUUGUACAGCGAGAUCUUUCC-Lx-GGAAAGAUCUCGCUGUACAAGGCUUC-Lx-G-3’(SEQID NO：11)
PshRNA(PH-7069)(靶基因：小鼠Smad3)
5’-GGUGCUCCAUCUCCUACUACGACC-Lx-GGUCGUAGUAGGAGAUGGAGCACCA-3’(SEQ IDNO：12)
反义核酸(Kynamro-7001)(ApoB100mRNA的反义DNA)
5’-GCCUCagtctgcttcGCACC-3’(SEQ ID NO：1)(小写字母表示DNA)
PshRNA(PH-7081)(靶基因：萤火虫荧光素酶)
5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAAACC-Lx-GGUUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUG-3’(SEQ ID NO：13)
siRNA(NI-7001)(小鼠CTGF)
5’-GUGUGACCAAAAGUUACAUGU-3’(SEQ ID NO：14)
5’-AUGUAACUUUUGGUCACACUC-3’(SEQ ID NO：15)
miRNA(NM-7001)(人类let7a-1前体)
5’-UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCUA-3’(SEQ ID NO：2)
适配子(Macugen-7001)(VEGF蛋白的适配子)
5’-CGGAAUCAGUGAAUGCUUAUACAUCCGt-3’(SEQ ID NO：3)(t为3’3’-dT)
实施例6(通过磷酸缓冲液的多种核酸的稳定性评价)
实施例6-1(试验组合物的配制)
下述试验组合物37-56如下合成。
0.1M磷酸缓冲液(pH 6.5)通过混合磷酸二氢钠二水合物(13.006g)和磷酸氢二钠十二水合物(6.017g)，稀释至1L来配制。
将核酸(0.1g)溶于注射用水(500mL)。向其中加入0.1M磷酸缓冲液(pH 6.5)(500mL)，搅拌混合物并将其通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到0.1g/L(0.1mg/mL)含核酸组合物。
试验组合物37：NK-7006配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物38：NK-7006注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物39：NK-7007配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物40：NK-7007注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物41：PK-7006配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物42：PK-7006注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物43：PK-7015配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物44：PK-7015注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物45：PH-7069配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物46：PH-7069注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物47：Kynamro-7001配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物48：Kynamro-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物49：PH-7081配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物50：PH-7081注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物51：NI-7001配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物52：NI-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物53：NM-7001配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物54：NM-7001注射用水，(0.1mg/mL)
试验组合物55：Macugen-7001配方44(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物56：Macugen-7001注射用水，(0.1mg/mL)
实施例6-2(试验方法和判断标准)
试验组合物37-56以60℃保存在稳定性试验器中。各个保存品每周取出，其含量通过反相HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。保存时间和保存品的数量在表中示出。
分别在60℃保存1周、2周、3周和4周的试验组合物37-56用作保存样品。
单独地，将4℃保存的试验组合物37-56产品用作校正曲线样品(100％)。取90μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(10μL)至100μL，作为校正曲线样品(90％)。取80μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(20μL)至100μL，作为校正曲线样品(80％)。取70μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(30μL)至100μL，作为校正曲线样品(70％)。取60μL各校正曲线样品(100％)，加注射用水(40μL)至100μL，作为校正曲线样品(60％)。
通过HPLC测量各个校正曲线样品(60％-100％)和各个保存样品(每个10μL)。对于校正曲线样品(60％-100％)得到的峰面积，通过以理论含量(％)为横轴(X)和峰面积为纵轴(Y)的最小二乘法确定其回归线(Y＝aX+b)和相关系数(r)，并且计算各个样品相对于保存开始时的含量的含量比(％)(excel2013)。
表15
表15保存时间和保存品数量
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和相应样品。
检测器：紫外吸收仪(测量波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm,4.6×50mM)
柱温度：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相进料：流动相A和流动相B的混合比按如下改变以控制浓度梯度。
表16
注射后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
制造例4
作为实施例7的核酸分子，PK-7006、NK-7006、PH-7069、NI-7001、NM-7001、Kynamro-7001和Macugen-7001由与制造例2相同的方法合成。
实施例7(通过柠檬酸缓冲液和/或磷酸缓冲液多种核酸的稳定性评价)
实施例7-1(试验组合物的配制)
试验组合物57-74、105-122、153-170如下配制。
将0.1M柠檬酸水溶液和0.1M柠檬酸三钠二水合物溶液混合，调节至pH4.0-8.0从而得到各pH的0.1M柠檬酸缓冲液。
将用注射用水配制的25mg/mL试验组合物(0.02mL)、注射用水(2.48mL)、和各pH的0.1M柠檬酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物201-218如下配制。
通过如上方法，配制0.1M柠檬酸缓冲液。将用注射用水配制的10mg/mL试验组合物(0.05mL)、注射用水(2.45mL)、和各pH的0.1M柠檬酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物249-266、297-314、345-362如下配制。
通过如上方法，配制0.1M柠檬酸缓冲液。将用注射用水配制的20mg/mL试验组合物(0.025mL)、注射用水(2.475mL)、和各pH的0.1M柠檬酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物75-95、123-143、171-191如下配制。
将0.1M磷酸二氢钠水溶液和0.1M磷酸氢二钠溶液混合，调节至pH4.0-8.0从而得到各pH的0.1M磷酸缓冲液。
将用注射用水配制的25mg/mL试验组合物(0.02mL)、注射用水(2.48mL)、和各pH的0.1M磷酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物219-239如下配制。
通过如上方法，配制0.1M磷酸缓冲液。将用注射用水配制的10mg/mL试验组合物(0.05mL)、注射用水(2.45mL)、和各pH的0.1M磷酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物267-287、315-335、363-383如下配制。
通过如上方法，配制0.1M磷酸缓冲液。将用注射用水配制的20mg/mL试验组合物(0.025mL)、注射用水(2.475mL)、和各pH的0.1M磷酸缓冲液(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物96-104、144-152、192-200如下配制。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合，调节至pH 4.2-7.6从而得到各pH的0.1M柠檬酸缓冲液。相同地，将0.1M磷酸二氢钠水溶液和0.1M磷酸氢二钠溶液混合，调节至pH 4.2-7.6从而得到各pH的0.1M磷酸缓冲液。将相同pH的0.1M柠檬酸缓冲液和0.1M磷酸缓冲液以5:5(3mL:3mL)混合从而得到各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)。
将用注射用水配制的25mg/mL试验组合物(0.02mL)、注射用水(2.48mL)、和各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物240-248如下配制。
通过如上方法，配制0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)。将用注射用水配制的10mg/mL试验组合物(0.05mL)、注射用水(2.45mL)、和各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
试验组合物288-296、336-344、384-392如下配制。
通过如上方法，配制0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)。将用注射用水配制的20mg/mL试验组合物(0.025mL)、注射用水(2.475mL)、和各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)(2.50mL)混合从而得到0.1mg/mL的各试验组合物各5mL。
核酸分子：PK-7006
试验组合物57：PK-7006配方199(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物58：PK-7006配方200(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物59：PK-7006配方201(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物60：PK-7006配方202(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物61：PK-7006配方203(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物62：PK-7006配方204(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物63：PK-7006配方205(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物64：PK-7006配方206(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物65：PK-7006配方207(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物66：PK-7006配方208(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物67：PK-7006配方209(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物68：PK-7006配方210(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物69：PK-7006配方211(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物70：PK-7006配方212(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物71：PK-7006配方213(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物72：PK-7006配方214(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物73：PK-7006配方215(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物74：PK-7006配方216(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物75：PK-7006配方217(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物76：PK-7006配方218(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物77：PK-7006配方219(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物78：PK-7006配方220(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物79：PK-7006配方221(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物80：PK-7006配方222(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物81：PK-7006配方223(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物82：PK-7006配方224(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物83：PK-7006配方225(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物84：PK-7006配方226(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物85：PK-7006配方227(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物86：PK-7006配方228(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物87：PK-7006配方229(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物88：PK-7006配方230(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物89：PK-7006配方231(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物90：PK-7006配方232(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物91：PK-7006配方233(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物92：PK-7006配方234(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物93：PK-7006配方235(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物94：PK-7006配方236(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物95：PK-7006配方237(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物96：PK-7006配方238(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物97：PK-7006配方239(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物98：PK-7006配方240(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物99：PK-7006配方241(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物100：PK-7006配方242(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物101：PK-7006配方243(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物102：PK-7006配方244(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物103：PK-7006配方245(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物104：PK-7006配方246(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：NK-7006
试验组合物105：NK-7006配方247(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物106：NK-7006配方248(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物107：NK-7006配方249(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物108：NK-7006配方250(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物109：NK-7006配方251(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物110：NK-7006配方252(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物111：NK-7006配方253(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物112：NK-7006配方254(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物113：NK-7006配方255(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物114：NK-7006配方256(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物115：NK-7006配方257(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物116：NK-7006配方258(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物117：NK-7006配方259(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物118：NK-7006配方260(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物119：NK-7006配方261(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物120：NK-7006配方262(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物121：NK-7006配方263(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物122：NK-7006配方264(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物123：NK-7006配方265(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物124：NK-7006配方266(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物125：NK-7006配方267(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物126：NK-7006配方268(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物127：NK-7006配方269(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物128：NK-7006配方270(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物129：NK-7006配方271(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物130：NK-7006配方272(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物131：NK-7006配方273(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物132：NK-7006配方274(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物133：NK-7006配方275(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物134：NK-7006配方276(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物135：NK-7006配方277(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物136：NK-7006配方278(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物137：NK-7006配方279(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物138：NK-7006配方280(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物139：NK-7006配方281(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物140：NK-7006配方282(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物141：NK-7006配方283(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物142：NK-7006配方284(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物143：NK-7006配方285(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物144：NK-7006配方286(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物145：NK-7006配方287(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物146：NK-7006配方288(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物147：NK-7006配方289(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物148：NK-7006配方290(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物149：NK-7006配方291(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物150：NK-7006配方292(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物151：NK-7006配方293(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物152：NK-7006配方294(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：PH-7069
试验组合物153：PH-7069配方295(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物154：PH-7069配方296(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物155：PH-7069配方297(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物156：PH-7069配方298(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物157：PH-7069配方299(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物158：PH-7069配方300(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物159：PH-7069配方301(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物160：PH-7069配方302(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物161：PH-7069配方303(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物162：PH-7069配方304(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物163：PH-7069配方305(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物164：PH-7069配方306(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物165：PH-7069配方307(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物166：PH-7069配方308(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物167：PH-7069配方309(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物168：PH-7069配方310(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物169：PH-7069配方311(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物170：PH-7069配方312(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物171：PH-7069配方313(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物172：PH-7069配方314(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物173：PH-7069配方315(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物174：PH-7069配方316(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物175：PH-7069配方317(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物176：PH-7069配方318(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物177：PH-7069配方319(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物178：PH-7069配方320(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物179：PH-7069配方321(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物180：PH-7069配方322(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物181：PH-7069配方323(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物182：PH-7069配方324(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物183：PH-7069配方325(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物184：PH-7069配方326(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物185：PH-7069配方327(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物186：PH-7069配方328(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物187：PH-7069配方329(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物188：PH-7069配方330(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物189：PH-7069配方331(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物190：PH-7069配方332(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物191：PH-7069配方333(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物192：PH-7069配方334(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物193：PH-7069配方335(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物194：PH-7069配方336(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物195：PH-7069配方337(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物196：PH-7069配方338(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物197：PH-7069配方339(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物198：PH-7069配方340(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物199：PH-7069配方341(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物200：PH-7069配方342(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：NI-7001
试验组合物201：NI-7001配方343(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物202：NI-7001配方344(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物203：NI-7001配方345(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物204：NI-7001配方346(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物205：NI-7001配方347(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物206：NI-7001配方348(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物207：NI-7001配方349(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物208：NI-7001配方350(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物209：NI-7001配方351(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物210：NI-7001配方352(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物211：NI-7001配方353(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物212：NI-7001配方354(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物213：NI-7001配方355(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物214：NI-7001配方356(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物215：NI-7001配方357(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物216：NI-7001配方358(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物217：NI-7001配方359(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物218：NI-7001配方360(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物219：NI-7001配方361(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物220：NI-7001配方362(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物221：NI-7001配方363(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物222：NI-7001配方364(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物2223：NI-7001配方365(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物224：NI-7001配方366(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物225：NI-7001配方367(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物226：NI-7001配方368(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物227：NI-7001配方369(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物228：NI-7001配方370(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物229：NI-7001配方371(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物230：NI-7001配方372(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物231：NI-7001配方373(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物232：NI-7001配方374(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物233：NI-7001配方375(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物234：NI-7001配方376(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物235：NI-7001配方377(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物236：NI-7001配方378(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物237：NI-7001配方379(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物238：NI-7001配方380(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物239：NI-7001配方381(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物240：NI-7001配方382(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物241：NI-7001配方383(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物242：NI-7001配方384(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物243：NI-7001配方385(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物244：NI-7001配方386(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物245：NI-7001配方387(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物246：NI-7001配方388(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物247：NI-7001配方389(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物248：NI-7001配方390(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：NM-7001
试验组合物249：NM-7001配方391(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物250：NM-7001配方392(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物251：NM-7001配方393(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物252：NM-7001配方394(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物253：NM-7001配方395(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物254：NM-7001配方396(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物255：NM-7001配方397(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物256：NM-7001配方398(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物257：NM-7001配方399(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物258：NM-7001配方400(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物259：NM-7001配方401(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物260：NM-7001配方402(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物261：NM-7001配方403(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物262：NM-7001配方404(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物263：NM-7001配方405(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物264：NM-7001配方406(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物265：NM-7001配方407(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物266：NM-7001配方408(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物267：NM-7001配方409(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物268：NM-7001配方410(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物269：NM-7001配方411(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物270：NM-7001配方412(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物271：NM-7001配方413(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物272：NM-7001配方414(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物273：NM-7001配方415(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物274：NM-7001配方416(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物275：NM-7001配方417(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物276：NM-7001配方418(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物277：NM-7001配方419(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物278：NM-7001配方420(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物279：NM-7001配方421(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物280：NM-7001配方422(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物281：NM-7001配方423(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物282：NM-7001配方424(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物283：NM-7001配方425(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物284：NM-7001配方426(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物285：NM-7001配方427(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物286：NM-7001配方428(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物287：NM-7001配方429(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物288：NM-7001配方430(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物289：NM-7001配方431(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物290：NM-7001配方432(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物291：NM-7001配方433(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物292：NM-7001配方434(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物293：NM-7001配方435(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物294：NM-7001配方436(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物295：NM-7001配方437(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物296：NM-7001配方438(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：Kynamro-7001
试验组合物297：Kynamro-7001配方439(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物298：Kynamro-7001配方440(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物299：Kynamro-7001配方441(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物300：Kynamro-7001配方442(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物301：Kynamro-7001配方443(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物302：Kynamro-7001配方444(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物303：Kynamro-7001配方445(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物304：Kynamro-7001配方446(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物305：Kynamro-7001配方447(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物306：Kynamro-7001配方448(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物307：Kynamro-7001配方449(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物308：Kynamro-7001配方450(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物309：Kynamro-7001配方451(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物310：Kynamro-7001配方452(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物311：Kynamro-7001配方453(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物312：Kynamro-7001配方454(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物313：Kynamro-7001配方455(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物314：Kynamro-7001配方456(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物315：Kynamro-7001配方457(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物316：Kynamro-7001配方458(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物317：Kynamro-7001配方459(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物318：Kynamro-7001配方460(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物319：Kynamro-7001配方461(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物320：Kynamro-7001配方462(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物321：Kynamro-7001配方463(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物322：Kynamro-7001配方464(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物323：Kynamro-7001配方465(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物324：Kynamro-7001配方466(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物325：Kynamro-7001配方467(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物326：Kynamro-7001配方468(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物327：Kynamro-7001配方469(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物328：Kynamro-7001配方470(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物329：Kynamro-7001配方471(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物330：Kynamro-7001配方472(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物331：Kynamro-7001配方473(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物332：Kynamro-7001配方474(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物333：Kynamro-7001配方475(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物334：Kynamro-7001配方476(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物335：Kynamro-7001配方477(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物336：Kynamro-7001配方478(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物337：Kynamro-7001配方479(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物338：Kynamro-7001配方480(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物339：Kynamro-7001配方481(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物340：Kynamro-7001配方482(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物341：Kynamro-7001配方483(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物342：Kynamro-7001配方484(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物343：Kynamro-7001配方485(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物344：Kynamro-7001配方486(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.6))，(0.1mg/mL)
核酸分子：Macugen-700
试验组合物345：Macugen-7001配方487(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物346：Macugen-7001配方488(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物347：Macugen-7001配方489(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物348：Macugen-7001配方490(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物349：Macugen-7001配方491(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物350：Macugen-7001配方492(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物351：Macugen-7001配方493(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物352：Macugen-7001配方494(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物353：Macugen-7001配方495(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物354：Macugen-7001配方496(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物355：Macugen-7001配方497(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物356：Macugen-7001配方498(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物357：Macugen-7001配方499(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物358：Macugen-7001配方500(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物359：Macugen-7001配方501(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物360：Macugen-7001配方502(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物361：Macugen-7001配方503(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物362：Macugen-7001配方504(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物363：Macugen-7001配方505(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物364：Macugen-7001配方506(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物365：Macugen-7001配方507(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物366：Macugen-7001配方508(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物367：Macugen-7001配方509(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物368：Macugen-7001配方510(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物369：Macugen-7001配方511(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物370：Macugen-7001配方512(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物371：Macugen-7001配方513(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物372：Macugen-7001配方514(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物373：Macugen-7001配方515(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物374：Macugen-7001配方516(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物375：Macugen-7001配方517(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物376：Macugen-7001配方518(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物377：Macugen-7001配方519(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物378：Macugen-7001配方520(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物379：Macugen-7001配方521(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物380：Macugen-7001配方522(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物381：Macugen-7001配方523(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物382：Macugen-7001配方524(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物383：Macugen-7001配方525(0.05M磷酸缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物384：Macugen-7001配方526(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物385：Macugen-7001配方527(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物386：Macugen-7001配方528(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物387：Macugen-7001配方529(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物388：Macugen-7001配方530(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物389：Macugen-7001配方531(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物390：Macugen-7001配方532(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物391：Macugen-7001配方533(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物392：Macugen-7001配方534(0.05M柠檬酸-磷酸(5:5)缓冲液(pH7.6))，(0.1mg/mL)
实施例7-2(试验方法和判断标准)
试验组合物57-392各一个保存在4℃，各四个保存在60℃的稳定性试验器中。各4℃保存品在开始时取出，各60℃保存品每周取出，其含量通过反相HPLC计算，并且根据相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价其稳定性。
开始时的各试验组合物作为校正曲线样品(100％)，校正曲线样品(60％-100％)通过与实施例1-2中相同的方法配制。根据与实施例1-2中相同的方法通过HPLC测量校正曲线样品(60％-100％)和各保存样品(每个30μL)。
实施例7-3(结果)
结果在图17-23中示出。结果显示PK-7006、NK-7006和PH-7069即使在60℃、4周保存仍有高保存稳定性。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供新型液体含核酸组合物，特别是药物组合物，其显示改进的核酸分子稳定性。因此，能够在常温下保存、运输等，且因为可提供具有优良可操作性的含核酸组合物，所述组合物非常有用。
本申请基于在日本提交的(提交日期：2014年12月29日)第2014-267087号专利申请和在日本提交的(提交日期：2015年4月10日)第2015-081298号专利申请，其内容全部引述在此。
序列表
<110> 株式会社博纳克(BONAC CORPORATION)
<120> 稳定含有核酸分子的组合物
<130> 092374
<150> JP 2014-267087
<151> 2014-12-29
<150> JP 2015-081298
<151> 2015-04-10
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义，1-5和16-20位的核苷酸是RNA.
<400> 1
gccucagtct gcttcgcacc 20
<210> 2
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA
<400> 2
ugggaugagg uaguagguug uauaguuuua gggucacacc caccacuggg agauaacuau 60
acaaucuacu gucuuuccua 80
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适配子, 28位的T为3’-3’连接的脱氧胸腺嘧啶.
<400> 3
cggaaucagu gaaugcuuau acauccgt 28
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达调控区
<400> 4
uaugcugugu guacucug 18
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达调控区
<400> 5
ucgaaguacu cggcguagg 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达调控区
<400> 6
guugucauau uucucgugg 19
<210> 7
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 7
gcagaguaca cacagcauau accgguauau gcugugugua cucugcuu 48
<210> 8
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 8
accuacgccg aguacuucga uuccccacac cggaaucgaa guacucggcg uagguucuuc 60
gg 62
<210> 9
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 9
accacgagaa auaugacaac ucccccacac cgggaguugu cauauuucuc gugguucuuc 60
gg 62
<210> 10
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 10
ggaacucuac cagaaauaua gcccgggcua uauuucuggu agaguuccac g 51
<210> 11
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 11
agccuuguac agcgagaucu uuccggaaag aucucgcugu acaaggcuuc g 51
<210> 12
<211> 49
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 12
ggugcuccau cuccuacuac gaccggucgu aguaggagau ggagcacca 49
<210> 13
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 13
cuuacgcuga guacuucgaa accgguuucg aaguacucag cguaagug 48
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 14
gugugaccaa aaguuacaug u 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 15
auguaacuuu uggucacacu c 21

Claims (19)

1.一种组合物，其包括核酸分子和缓冲液，并且具有如下特征：
(a)在常温下以溶液形式存在；和
(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中在40℃、相对湿度75％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中在60℃下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上。
4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至4.0以上且9.0以下。
5.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至5.5以上且7.5以下。
6.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至6.0以上且7.0以下。
7.根据权利要求1至6任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、精氨酸盐酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸三钠二水合物、L-谷氨酸单钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乳酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡甲胺、甘氨酸、柠檬酸、和乙酸的一种或多种缓冲剂。
8.根据权利要求1至7任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
9.根据权利要求1至8任一项所述的组合物，其中所述核酸分子是单链核酸分子或双链核酸分子。
10.根据权利要求1至9任一项所述的组合物，其中所述核酸分子是DNA分子、RNA分子、或DNA和RNA的嵌合核酸分子。
11.根据权利要求1至10任一项所述的组合物，其中所述核酸分子的核苷酸数为10-300核苷酸。
12.根据权利要求1至11任一项所述的组合物，其中所述核酸分子包括控制靶基因表达或靶蛋白功能的序列。
13.根据权利要求1至11任一项所述的组合物，其包括含有控制靶基因表达的序列的核酸分子。
14.根据权利要求1至13任一项所述的组合物，其中所述核酸分子为反义核酸、siRNA或shRNA、miRNA、核酶、诱饵核酸或适配子。
15.根据权利要求1至14任一项所述的组合物，其是药物组合物。
16.一种生产根据权利要求1至15任一项所述的组合物的方法，其包括将所述核酸分子溶于将所述组合物的pH调节至6.0以上且7.0以下的缓冲液，和将所述溶液在常温下保存。
17.一种组合物中的核酸分子的稳定化方法，其包括将所述核酸分子溶于将所述组合物pH调节至6.0以上且7.0以下的缓冲液，和将所述溶液在常温下保存。
18.根据权利要求16或17的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
19.根据权利要求16至18任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
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