DE69732029T2

DE69732029T2 - Dna enthaltende impfstoffen

Info

Publication number: DE69732029T2
Application number: DE69732029T
Authority: DE
Inventors: B. David VOLKIN; K. Robert EVANS; Mark Bruner
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-22
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2017-04-23
Also published as: CA2252565C; ES2234018T3; JP4386965B2; CA2252565A1; JP2002504085A; ATE285239T1; WO1997040839A1; AU727306B2; DE69732029D1; AU2924297A; EP0906110A1; EP0906110B1

Description

Querverweis auf zugehörige Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der vorläufigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/017 049, angemeldet am 26. April 1996.
Erklärung bezüglich staatlich geförderter Forschung und Entwicklung
Nicht zutreffend.
Bezugnahme auf Mikrofiche-Anhang
Nicht zutreffend.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Formulierungen von pharmazeutischen Nukleinsäure-Produkten, insbesondere Formulierungen von Nukleinsäure-Vakzin-Produkten und Nukleinsäure-Gentherapie-Produkten. Die Formulierungen der Offenbarung stabilisieren die Konformation von pharmazeutischen DNA-Produkten. Die Vakzine induzieren bei direkter Einführung in Muskelzellen die Hervorrufung von Immunreaktionen, welche spezifisch Human-Influenzavirus erkennen.
Hintergrund der Offenbarung
Diese Erfindung betrifft neue Formulierungen von pharmazeutischen Nukleinsäure-Produkten, insbesondere Formulierungen von Nukleinsäure-Vakzin-Produkten und Nukleinsäure-Gentherapie-Produkten. Die Formulierungen der Offenbarung stabilisieren die Konformation von pharmazeutischen DNA-Produkten. Die Vakzine induzieren bei direkter Einführung in Muskelzellen die Hervorrufung von Immunreaktionen, welche spezifisch Human-Influenzavirus erkennen.
Während der Lagerung als Pharmazeutikum erfahren DNA-Plasmid-Vakzine eine physikalisch-chemische Veränderung, bei der sich das superspiralisierte („supercoiled") Plasmid in die offen zirkuläre und lineare Form umwandelt. Eine Vielfalt von Lagerungsbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur, niedrige Ionenstärke) kann diesen Prozess beschleunigen. In dieser Erfindung stabilisiert die Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen (mit Bernsteinsäure oder Äpfelsäure oder mit Chelatbildnern, welche mehrere Phosphatliganden enthalten) aus der DNA-Plasmid-Lösung, aus den Formulierungspuffern oder aus den Gefäßen und Verschlüssen das DNA-Plasmid gegenüber diesem Abbauweg während der Lagerung. Darüber hinaus sind nicht-reduzierende Radikalfänger erforderlich, um eine Schädigung des DNA-Plasmids durch die Bildung freier Radikale, welche selbst in anscheinend entmetallisierten Lösungen immer noch auftreten können, zu verhindern. Ferner müssen in der Formulierung der Puffertyp, pH-Wert, die Salzkonzentration, Lichtexposition sowie die Art des zur Präparierung der Gefäße verwendeten Sterilisationsverfahrens alle kontrolliert werden, um die Stabilität des DNA-Vakzins zu optimieren.
Der GIBCO BRL-Katalog (1993–1994, Seiten 8-9, 8-11 und 8-13) gibt DNA-Standards und DNA-Leitern für die Größenbestimmung linearer doppelsträngiger DNA-Fragmente an.
Peak et al., Radiation Research 97: 570–575, 1984, beschreiben ein Wirkungsspektrum für den Schutz gereinigter DNA durch Glycerin gegen die Induktion von Einzelstrangbrüchen in der DNA durch UV-Licht.
WO 94/02639 offenbart die Verwendung von Permeationsverstärkern und Signalverstärkern in in situ-Hybridisierungsassays und Immunoassays.
Gemäß der wissenschaftlichen Literatur wäre zu erwarten, dass die Kettenspaltungsreaktion, welche die Überführung von superspiralisiertem DNA-Plasmid in das offen zirkuläre bis lineare DNA-Plasmid verursacht, über zwei unterschiedliche chemische Mechanismen geschieht (da diese Präparationen von hochgereinigter DNA keine Nukleasen enthalten): (1) Depurinierung, gefolgt von β-Eliminierung, und/oder (2) radikalische Oxidation. Obwohl zu erwarten wäre, dass die Entfernung von Spurenmetallionen den radikalischen Oxidationsmechanismus der DNA-Kettenspaltung unterdrücken würde, weisen unsere Ergebnisse überraschenderweise darauf hin, dass die Entfernung oder Chelierung von Spurenmetallionen aus der DNA-haltigen Lösung die DNA gegen beide Abbaumechanismen stabilisiert, wie beurteilt durch Vergleich unserer Stabilitätsdaten mit den veröffentlichten Raten der Depurinierung und β-Eliminierung (siehe Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3610–3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3618–3623). Auf Grundlage dieser und anderer veröffentlichter Berichte würde man nicht erwartet haben, dass die Entfernung von Spurenmetallionen eine signifikante Auswirkung auf die Raten der Depurinierung oder β-Eliminierung haben würde. Deshalb ist die Erhöhung der DNA-Stabilität, welche sich aus der Entfernung von Spurenmetallionen ergibt, viel größer als erwartet und kann nicht auf Grundlage der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung erklärt werden.
Darüber hinaus weisen unsere Daten darauf hin, dass spezifische Chelatbildner, wie z.B. Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat, Bernsteinsäure und Äpfelsäure, die Stabilität von Plasmid-DNA bei der Lagerung erhöhen, während andere üblicherweise eingesetzte Chelatbildner, wie z.B. EDTA, Desferal, Ethylendiamin-di(o-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) keine signifikante Stabilitätserhöhung ergeben. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass ein beliebiger Chelatbildner mit mehreren Phosphatliganden (beispielsweise Polyphosphorsäure) die DNA-Stabilität erhöhen wird. Aus der veröffentlichten Literatur geht jedoch nicht klar hervor, warum Inositolhexaphosphat DNA stabilisiert, jedoch EDDHA, Desferal und DTPA nicht. Nachdem die veröffentlichte Literatur nahelegt, dass alle vier dieser Chelatbildner die eisen-katalysierte Bildung von Hydroxylradikalen inhibieren, wurde erwartet, dass alle diese Reagenzien eine erhöhte DNA-Stabilität ergeben würden (durch Chelierung von Spurenmetallionen und Inhibierung der Bildung freier Radikale); dies wurde jedoch nicht beobachtet. Darüber hinaus berichtet die Literatur, dass sowohl EDTA als auch ATP die metallionen-katalysierte Hydroxylradikalbildung fördern; wir beobachteten jedoch, dass Tripolyphosphat (die metallbindende Gruppierung von ATP) die DNA-Stabilität erhöht, während EDTA dies nicht tut. Deshalb scheinen die Schutzwirkungen der Metallionenchelatoren nicht direkt mit ihrem Vermögen zur Förderung der Bildung von Hydroxylradikalen korreliert zu sein. Die Identifizierung geeigneter Chelatbildner zur Stabilisierung von DNA-Formulierungen wird empirische Tests erforderlich machen, wie in dieser Arbeit beschrieben.
Neben der Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen ist die Verwendung von nicht-reduzierenden Radikalfängern für die Stabilisierung von DNA-Formulierungen während der Lagerung wichtig. Unsere Ergebnisse zeigen an, dass Ethanol, Methionin, Glycerin und Dimethylsulfoxid die DNA-Stabilität erhöhen, was nahelegt, dass deren Schutzwirkung auf das Abfangen freier Radikale zurückzuführen ist. Ferner zeigen unsere Ergebnisse an, dass Radikalfänger, welche als Reduktionsmittel dienen können, wie z.B. Ascorbinsäure, den DNA-Abbau stark beschleunigen, mutmaßlich durch die Wirkung als Reduktionsmittel, um Spurenmetallionen in ihrem reduzierten (schädlichsten) Zustand zu halten. Unsere Ergebnisse zeigen auch an, dass mehrere Radikalfänger, von denen erwartet wurde, dass sie DNA stabilisieren (basierend auf bekannten Geschwindigkeitskonstanten mit dem Hydroxylradikal), unerwarteterweise den DNA-Abbau beschleunigten oder keine Erhöhung der Stabilität ergaben. Beispielsweise sind Pentoxifyllin und p-Aminobenzoesäure Hydroxylradikalfänger mit großen Geschwindigkeitskonstanten für Hydroxylradikale (k = 1,1 × 10¹⁰ M^–1s^–1; siehe Freitas und Filipe, 1995, Biol. Trace Elem. Res. 47: 307–311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6: 504–508), jedoch erhöhte Pentoxifyllin die Stabilität nicht und p-Aminobenzoesäure beschleunigte tatsächlich den DNA-Abbau. Aufgrund dieser Ergebnisse war das empirische Screenen einer Anzahl von Radikalfängern das wirksamste Mittel zur Identifizierung geeigneter Verbindungen.
Zur Maximierung der DNA-Stabilität in einer pharmazeutischen Formulierung sind die Art des Puffers, die Salzkonzentration, der pH-Wert, die Lichtexposition sowie die Art des angewandten Sterilisierungsverfahrens zur Präparierung der Gefäße alle wichtige Parameter, welche in der Formulierung kontrolliert werden müssen, um die Stabilität weiter zu optimieren. Ferner kann auch eine Lyophilisierung des DNA-Vakzins mit geeigneten Formulierungsexzipienten durchgeführt werden, um die DNA-Stabilität zu erhöhen, mutmaßlich durch Verringerung der Molekülbewegung mittels Entwässerung. Deshalb legen unsere Daten nahe, dass die Formulierung, welche die höchste Stabilität des DNA-Vakzins ergeben wird, eine sein wird, welche eine entmetallisierte Lösung, enthaltend einen Puffer (Phosphat oder Hydrogencarbonat) mit einem pH-Wert im Bereich von 7–8, ein Salz (NaCl, KCl oder LiCl) im Bereich von 100–200 mM, einen Metallionenchelator (Succinat, Malat, Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat oder Polyphosphorsäure), einen nicht-reduzierenden Radikalfänger (Ethanol, Glycerin, Methionin oder Dimethylsulfoxid) und die höchste geeignete DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte, nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, einschließt.
Die vorliegenden Formulierungen und Verfahren werden mit einem DNA-Vakzin gegen Influenza beispielhaft erläutert. Nichts in dieser Offenbarung sollte als Beschränkung der Formulierungen und Verfahren auf das spezielle DNA-Vakzin verstanden werden.
Influenza ist eine akute fiebrige Erkrankung, verursacht durch Infektion der Atemwege mit Influenza A- oder B-Virus. Ausbrüche von Influenza treten nahezu jedes Jahr weltweit mit periodischen Epidemien oder Pandemien auf. Influenza kann erhebliche systemische Symptome verursachen, ein schwere Erkrankung (wie z.B. virale Pneumonie), welche einen Krankenhausaufenthalt erforderlich macht, und Komplikationen wie sekundäre bakterielle Pneumonie. Man nimmt an, dass kürzliche Epidemien in den USA zu mehr als 10.000 (bis zu 40.000) zusätzlichen Todesfällen pro Jahr und 5.000 bis 10.000 Todesfällen pro Jahr in nicht-epidemischen Jahren geführt haben. Die beste Strategie zur Verhinderung der mit Influenza assoziierten Krankheitsfällen und Sterblichkeit ist die Impfung. Die gegenwärtig zugelassenen Vakzine stammen von einem Virus, welches in Eiern gezüchtet und dann inaktiviert wurde, und umfassen drei Virusstämme (zwei A-Stämme und ein B-Stamm). Drei Typen von Vakzinen sind verfügbar: ganzes Virus, Subvirion und gereinigtes Oberflächenantigen. Aufgrund der erhöhten Fieberreaktionen mit dem Ganzvirus-Vakzin werden nur die letzten beiden bei Kindern eingesetzt. Kinder unterhalb eines Alters von 9 Jahren benötigen zwei Immunisierungen, während Erwachsene nur eine einzige Injektion benötigen. Es wurde jedoch vorgeschlagen [siehe Medical Letter 32: 89–90, 17. Sept. 1993], dass „Patienten, welche früh im Herbst geimpft wurden, von einer zweiten Dosis im Winter oder frühen Frühling profitieren könnten", aufgrund der Beobachtung, dass bei einigen älteren Patienten die Antikörpertiter nach einer Impfung innerhalb von vier Monaten oder weniger auf geringere als schützende Niveaus abnehmen können. Diese Vakzine werden jedes Jahr neu formuliert durch Voraussage, welche aktuellen Virusstämme klinisch zirkuliert werden, und Beurteilung, welcher neue virulente Stamm erwartungsgemäß in der kommenden Grippesaison dominieren wird. Eine erneute Impfung wird jährlich empfohlen.
Die Beschränkungen des zugelassenen Vakzins umfassen die folgenden:

1) Antigene Variation, insbesondere in A-Stämmen von Influenza, führt zu Viren, welche durch Antikörper, die von einem früheren Vakzin (oder einer früheren Infektion) erzeugt wurden, nicht neutralisiert werden. Neue Stämme entstehen durch Punktmutationen ("Antigendrift") und durch Umlagerung (Antigenshift") der Gene, welche für die Oberflächenglycoproteine (Hämagglutinin [HA] und Neuramidase) codieren, während die internen Proteine bei „gedrifteten" und „geshifteten" Stämmen hochkonserviert sind. Eine Immunisierung ruft eine „homologe" stammspezifische, antikörpervermittelte Immunität hervor, keine „heterologe" gruppengemeinsame Immunität auf Grundlage zellvermittelter Immunität.
2) Selbst wenn die dominierenden zirkulierenden Stämme des Influenzavirus keine wesentliche Umlagerung oder Drift von einem Jahr zum nächsten erfahren, muss die Immunisierung jedes Jahr verabreicht werden, da die Antikörpertiter abnehmen. Obwohl von einigen berichtet wurde, dass hämagglutinations-inhibierende (HI) und neutralisierende Antikörper für Monate bis Jahre bestehen bleiben, mit einer anschließenden allmählichen Abnahme, nennt das „Advisory Committee on Immunization Practices" die Abnahme der Antikörpertiter im Jahr nach einer Impfung als Grund für eine jährliche Impfung, selbst wenn keine größere Drift oder Umlagerung stattgefunden hat (HI-Antikörper inhibieren das Vermögen des Influenzavirus zur Agglutination von roten Blutkörperchen. Wie neutralisierende Antikörper, sind sie hauptsächlich gegen das HA-Antigen gerichtet. Hämagglutinations-Inhibierungs-Tests sind leichter und weniger kostenaufwendig als Neutralisationsassays durchzuführen und werden somit oft als Mittel eingesetzt, um das Vermögen von Antikörpern, die gegen einen Influenzastamm gebildet wurden, zur Reaktion mit einem unterschiedlichen Stamm zu beurteilen). Wie oben erwähnt, postuliert der Medical Letter, dass bestimmte ältere Personen mit hohem Risiko aufgrund von kurzlebigen schützenden Antikörpertitern zweimal in einer Saison geimpft werden sollten.
(3) Die Wirksamkeit des Vakzins ist suboptimal. Die Entwicklung des Vakzins der nächsten Saison beruht auf der Vorhersage der aufkommenden zirkulierenden Stämme (mittels Kontrollprobennahme in Asien), welche ungenau ist und zu einer schlechten Übereinstimmung zwischen den für das Vakzin verwendeten Stämmen und denjenigen, die tatsächlich im Freiland zirkulieren, führen kann. Darüber hinaus trat, wie während der Grippesaison 1992–1993 vorgekommen, ein neuer H3N2-Stamm (A/Beijing/92) während der letzteren Phase der Grippesaison klinisch auf. Wegen der schlechten Kreuzreaktivität des durch den früheren H3N2-Stamm (A/Beijing/89) induzierten Antikörpers mit A/Beijing/92, aufgrund von Antigenshift, veranlasste dies eine Veränderung der Zusammensetzung des Vakzins von 1993–1994. Jedoch konnte aufgrund der Länge der Zeit, welche erforderlich ist, um das gegenwärtig zugelassene Vakzin herzustellen und zu formulieren, der neue Vakzinstamm trotz der Hinweise auf einen schlechten Schutz durch das existierende Vakzin und die erhöhte Virulenz des neuen zirkulierenden H3N2-Stammes nicht während der Saison von 1992–1993 eingeführt werden.

Die charakteristischen Eigenschaften eines idealen universalen Influenza-Vakzins umfassen die folgenden:

(1) Erzeugung eines gruppengemeinsamen (heterologen) Schutzes
(2) Erhöhte Breite der Antikörperreaktion; nachdem man annimmt, dass CTL eine Rolle bei der Erholung von einer Erkrankung spielen, würde man erwarten, dass ein Vakzin, welches allein auf einer CTL-Reaktion basiert, die Krankheitsdauer verkürzen würde (möglicherweise bis zu dem Punkt, dass die Krankheit subklinisch bleibt), es würde jedoch die Krankheit nicht vollständig verhindern.
(3) Eine erhöhte Dauer der Antikörperreaktionen; nachdem gerade eine derjenigen Gruppen, welche das höchste Risiko für Krankheit und Sterblichkeit bei einer Influenza-Infektion aufweist (ältere Personen), auch die Gruppe ist, bei der die schützenden Antikörpertiter zu schnell für eine wirksame jährliche Immunisierung absinken könnten, sollte ein verbessertes Vakzin schützende Antikörpertiter erzeugen, welche länger bestehen bleiben.

Es wurde gezeigt, dass eine intramuskuläre Impfung von Polynukleotid-Konstrukten, d.h. DNA-Plasmiden, die für Proteine codieren, zu der in situ-Bildung des Proteins in Muskelzellen führt. Durch Verwendung von cDNA-Plasmiden, die für virale Proteine codieren, wurden sowohl Antikörper- als auch CTL-Reaktionen hervorgerufen und ergaben einen homologen und heterologen Schutz gegen eine nachfolgende Herausforderung mit entweder dem homologen oder dem stammübergreifenden Schutz. Jede dieser Arten von Immunreaktionen bietet einen potentiellen Vorteil gegenüber vorhandenen Impfstrategien. Die Verwendung von PNVs (Polynukleotid-Vakzinen) zur Erzeugung von Antikörpern kann zu einer erhöhten Dauer der Antikörperreaktionen sowie zur Bereitstellung eines Antigens führen, welches sowohl die exakte Sequenz des klinisch zirkulierenden Virusstammes haben kann als auch die richtigen post-translationalen Modifikationen und die Konformation des nativen Proteins (gegenüber einem rekombinanten Protein). Die Hervorrufung von CTL-Reaktionen auf diese Weise bietet die Vorteile eines stammübergreifenden Schutzes ohne Verwendung eines lebenden, potentiell pathogenen Vektors oder abgeschwächten Virus.
Deshalb berücksichtigt diese Erfindung jedes der bekannten Verfahren zur Einführung von Nukleinsäuren in lebendes Gewebe, um die Expression von Proteinen zu induzieren. Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Einführung viraler Proteine in den Antigen-Prozessierungsweg bereit, um virus-spezifische CTLs zu erzeugen. Somit wird der Bedarf für spezifische Therapeutika, welche in der Lage sind, gewünschte prophylaktische Immunreaktionen gegen virale Pathogene hervorzurufen, für das Influenzavirus mit dieser Erfindung gestillt. Von besonderer Bedeutung bei diesem therapeutischen Ansatz ist das Vermögen zur Induktion von T-Zell-Immunreaktionen, die Infektionen selbst von Virusstämmen verhindern können, welche heterolog zu dem Stamm sind, von dem das Antigen-Gen erhalten wurde. Deshalb stellt diese Erfindung DNA-Konstrukte bereit, codierend für die viralen Proteine des Human-Influenzavirus Nukleoprotein (NP), Hämagglutinin (HA), Neuramidase (NM), Matrix (M), nichtstrukturelles Protein (NS), Polymerase (PB1 und PB2 = basische Polymerasen 1 und 2; PA = saure Polymerase) oder irgendeines der anderen Influenzagene, welche für Produkte codieren, die spezifische CTLs erzeugen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Formulierungen von pharmazeutischen Nukleinsäure-Produkten, insbesondere Formulierungen von Nukleinsäure-Vakzin-Produkten und Nukleinsäure-Gentherapie-Produkten. Die Formulierungen der Offenbarung stabilisieren die Konformation von pharmazeutischen DNA-Produkten. Die Vakzine induzieren bei direkter Einführung in Muskelzellen die Hervorrufung von Immunreaktionen, welche spezifisch Human-Influenzavirus erkennen.
Während der Lagerung als Pharmazeutikum erfahren DNA-Plasmid-Vakzine eine physikalisch-chemische Veränderung, bei der das superspiralisierte Plasmid in die offen zirkuläre und lineare Form umgewandelt wird. Eine Vielfalt von Lagerungsbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur, niedrige Ionenstärke) kann diesen Prozess beschleunigen. In dieser Erfindung stabilisiert die Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen (mit Bernsteinsäure oder Äpfelsäure, oder mit Chelatbildnern, die mehrere Phosphatliganden enthalten) aus der DNA-Plasmid-Lösung, aus den Formulierungspuffern oder aus den Gefäßen und Verschlüssen das DNA-Plasmid gegenüber diesem Abbauweg während der Lagerung. Darüber hinaus sind nicht-reduzierende Radikalfänger erforderlich, um eine Schädigung des DNA-Plasmids durch Bildung freier Radikale, welche immer noch in sogar anscheinend entmetallisierten Lösungen auftreten können, zu verhindern. Ferner müssen in der Formulierung der Puffertyp, der pH-Wert, die Salzkonzentration, Lichtexposition sowie die Art des verwendeten Sterilisationverfahrens zur Präparation der Gefäße alle kontrolliert werden, um die Stabilität des DNA-Vakzins zu optimieren. Eine Lyophilisierung des DNA-Vakzins in Gegenwart der geeigneten Formulierungsexzipienten kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Plasmid während der Lagerung zu stabilisieren.
Gemäß der wissenschaftlichen Literatur wäre zu erwarten, dass die Kettenspaltungsreaktion, welche die Überführung des superspiralisierten DNA-Plasmids in das offen zirkuläre bis lineare DNA-Plasmid verursacht, über zwei unterschiedliche chemische Mechanismen geschieht (da diese Präparationen von hochgereinigter DNA keine Nukleasen enthalten): (1) Depurinierung, gefolgt von β-Eliminierung, und/oder (2) radikalische Oxidation. Obwohl zu erwarten wäre, dass die Entfernung von Spurenmetallionen den radikalischen Oxidationsmechanismus der DNA-Kettenspaltung unterdrücken würde, weisen unsere Ergebnisse überraschenderweise darauf hin, dass die Entfernung oder Chelierung von Spurenmetallionen aus der DNA-haltigen Lösung die DNA gegen beide Abbaumechanismen stabilisiert, wie beurteilt durch Vergleich unserer Stabilitätsdaten mit den veröffentlichten Raten der Depurinierung und β-Eliminierung (siehe Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3610–3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3619–3623). Auf Grundlage dieser und anderer veröffentlichter Berichte würde man nicht erwartet haben, dass die Entfernung von Spurenmetallionen eine signifikante Auswirkung auf die Raten der Depurinierung oder β-Eliminierung haben würde. Deshalb ist die Erhöhung der DNA-Stabilität, welche sich aus der Entfernung von Spurenmetallionen ergibt, viel größer als erwartet und kann nicht auf Grundlage der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung erklärt werden.
Darüber hinaus zeigen unsere Daten an, dass spezifische Chelatbildner, wie z.B. Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat, Bernsteinsäure und Äpfelsäure, die Stabilität der Plasmid-DNA bei der Lagerung erhöhen, während andere üblicherweise eingesetzte Chelatbildner, wie z.B. EDTA, Desferal, Ethylendiamin-di(o-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) keine signifikante Stabilitätserhöhung ergeben. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass ein beliebiger Chelatbildner mit mehreren Phosphatliganden (beispielsweise Polyphosphorsäure) die DNA-Stabilität erhöhen wird. Aus der veröffentlichten Literatur geht jedoch nicht klar hervor, warum Inositolhexaphosphat DNA stabilisiert, jedoch EDDHA, Desferal und DTPA nicht. Nachdem die veröffentlichte Literatur nahelegt, dass alle vier dieser Chelatbildner die eisen-katalysierte Bildung von Hydroxylradikalen inhibieren, wurde erwartet, dass alle diese Reagenzien eine erhöhte DNA-Stabilität ergeben würden (durch Chelierung von Spurenmetallionen und Inhibierung der Bildung freier Radikale); dies wurde jedoch nicht beobachtet. Darüber hinaus berichtet die Literatur, dass sowohl EDTA als auch ATP die metallionen-katalysierte Hydroxylradikalbildung fördern, wir beobachteten jedoch, dass Tripolyphosphat (die metallbindende Gruppierung von ATP) die DNA-Stabilität erhöht, während EDTA dies nicht tut. Deshalb scheinen die Schutzwirkungen der Metallionenchelatoren nicht direkt mit ihrem Vermögen zur Förderung der Bildung von Hydroxylradikalen korreliert zu sein. Die Identifizierung der geeigneten Chelatbildner zur Stabilisierung von DNA-Formulierungen wird empirische Tests erforderlich machen, wie in dieser Arbeit beschrieben.
Neben der Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen ist die Verwendung von nicht-reduzierenden Radikalfängern für die Stabilisierung von DNA-Formulierungen während der Lagerung wichtig. Unsere Ergebnisse zeigen an, dass Ethanol, Methionin, Glycerin und Dimethylsulfoxid die DNA-Stabilität erhöhen, was nahelegt, dass deren Schutzwirkung auf das Abfangen freier Radikale zurückzuführen ist. Ferner zeigen unsere Ergebnisse an, dass Radikalfänger, welche als Reduktionsmittel dienen können, wie z.B. Ascorbinsäure, den DNA-Abbau stark beschleunigen, mutmaßlich durch die Wirkung als Reduktionsmittel, um Spurenmetallionen in ihrem reduzierten (schädlichsten) Zustand zu halten. Unsere Ergebnisse zeigen auch an, dass mehrere Radikalfänger, von denen erwartet wurde, dass sie DNA stabilisieren (basierend auf bekannten Geschwindigkeitskonstanten mit dem Hydroxylradikal), unerwarteterweise den DNA-Abbau beschleunigten oder keine Erhöhung der Stabilität ergaben. Beispielsweise sind Pentoxifyllin und p-Aminobenzoesäure Hydroxylradikalfänger mit großen Geschwindigkeitskonstanten für Hydroxylradikale (k = 1,1 × 10¹⁰ M^–1s^–1; siehe Freitas und Filipe, 1995, Biol. Trace Elem. Res. 47: 307–311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6: 504–508), jedoch erhöhte Pentoxifyllin die Stabilität nicht und p-Aminobenzoesäure beschleunigte tatsächlich den DNA-Abbau. Aufgrund dieser Ergebnisse war das empirische Screenen einer Anzahl von Radikalfängern das wirksamste Mittel zur Identifizierung geeigneter Verbindungen.
Zur Maximierung der DNA-Stabilität in einer pharmazeutischen Formulierung sind die Art des Puffers, die Salzkonzentration, der pH-Wert, die Lichtexposition sowie die Art des angewandten Sterilisierungsverfahrens zur Präparierung der Gefäße alle wichtige Parameter, welche in der Formulierung kontrolliert werden müssen, um die Stabilität weiter zu optimieren. Ferner kann auch eine Lyophilisierung des DNA-Vakzins mit geeigneten Formulierungsexzipienten durchgeführt werden, um die DNA-Stabilität zu erhöhen, mutmaßlich durch Verringerung der Molekülbewegung mittels Entwässerung. Deshalb legen unsere Daten nahe, dass die Formulierung, welche die höchste Stabilität des DNA-Vakzins ergeben wird, eine sein wird, welche eine entmetallisierte Lösung, enthaltend einen Puffer (Phosphat oder Hydrogencarbonat) mit einem pH-Wert im Bereich von 7–8, ein Salz (NaCl, KCl oder LiCl) im Bereich von 100–200 mM, einen Metallionenchelator (Succinat, Malat, Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat oder Polyphosphorsäure), einen nicht-reduzierenden Radikalfänger (Ethanol, Glycerin, Methionin oder Dimethylsulfoxid) und die höchste geeignete DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte, nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, einschließt.
In dieser Patentbeschreibung werden Daten präsentiert, welche beispielhaft mehrere weitere DNA-Vakzin-Formulierungen erläutern. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Vakzin-Formulierungen, welche eine entmetallisierte Lösung, enthaltend einen physiologisch annehmbaren Puffer innerhalb eines pH-Bereichs von mindestens größer als etwa 8,0 bis mindestens etwa 9,5, ein Salz (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, NaCl, KCl oder LiCl) im Bereich bis zu etwa 300 mM und den Metallionenchelator EDTA (im Bereich bis zu etwa 5 mM) in Kombination mit dem Radikalfänger Ethanol (im Bereich bis zu etwa 3%) und die höchste geeignete DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte, nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer umfassen.
In einem speziellen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassen die DNA-Vakzin-Formulierungen eine Kombination von EDTA und Ethanol, NaCl in einer Konzentration von etwa 100 mM bis etwa 200 mM, EDTA im Bereich von etwa 1 μM bis etwa 1 mM, Ethanol mit bis zu etwa 2% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer.
In einer weiteren Ausführungsform der DNA-Vakzin-Formulierungen, die eine Kombination von EDTA und Ethanol umfassen, ist NaCl mit etwa 100 mM bis etwa 200 mM anwesend, EDTA ist mit etwa 1 μM bis etwa 750 μM anwesend, Ethanol ist mit etwa 0,5% bis etwa 2,5% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer, welcher vorzugsweise Tris-HCl bei einem pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 9,0 und Glycin von etwa pH 9,0 bis etwa 9,5 ist. Es versteht sich, dass andere bekannte Puffer mit einer Pufferkapazität innerhalb unterschiedlicher pH-Bereiche, wie z.B. pH 8,0 bis 9,5, in den verschiedenen DNA-Vakzin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
In einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung, wobei die DNA-Vakzin-Formulierungen eine Kombination von EDTA und Ethanol, NaCl in einer Konzentration von etwa 100 mM bis etwa 200 mM umfassen, ist EDTA mit etwa 500 μM anwesend, Ethanol mit etwa 1,0% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer, welcher vorzugsweise Tris-HCl bei einem pH-Wert von etwa 8,5 bis etwa 9,0 ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A, 1B, 1C und 1D zeigen die Wirkung des Behältertyps auf den Superspiralgehalt des Influenza-DNA-Vakzins HA (Georgia/93) während der Lagerung. Die DNA-Plasmid-Lösung wurde mit 100 μg/ml DNA in Salzlösung hergestellt. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Feld A – Glas; Feld B – silikonisiertes Glas; Feld C – autoklavierter Kunststoff; Feld D – gamma-bestrahlter Kunststoff.
2 zeigt die Wirkung der DNA-Plasmidkonzentration auf den Superspiralgehalt des Influenza-DNA-Vakzins HA (Georgia/93) während der Lagerung bei 37°C. DNA-Plasmid-Lösung wurde mit 20–1800 μg/ml hergestellt. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.
3 zeigt die UV-Schmelzkurve von Plasmid-DNA, die in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) über den NaCl-Konzentrationsbereich von 0–200 mM gelagert worden war. Die Proben enthielten 100 μg/ml Plasmid-DNA mit den folgenden Konzentrationen an NaCl; (a) 0 mM, (b) 5 mM, (c) 20 mM, (d) 50 mM, (e) 100 mM, (f) 200 mM.
4 zeigt die Stabilität von Plasmid-DNA in Anwesenheit zunehmender Konzentrationen von NaCl. Proben wurden bei 60°C 48 Stunden lang inkubiert, dann mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Zum Zeitpunkt 0 enthielten die Proben 90% superspiralisierte DNA.
Die 5A, 5B und 5C zeigen die Stabilität von Plasmid-DNA in Anwesenheit zweiwertiger Kationen in TE (Feld A), PBS (Feld B) und Salzlösung (Feld C). Die Proben wurden bei 60°C 48 Stunden lang bei einer Konzentration von 100 μg/ml erwärmt, dann mittels Agarosegelelektrophorese hinsichtlich Abbau analysiert. Zum Zeitpunkt 0 enthielten die Proben 90% superspiralisierte DNA.
6 zeigt die UV-Schmelzkurve von DNA über den pH-Bereich 4,5–10. Die Proben enthielten 20 μg/ml Plasmid in den folgenden pH-Puffern: (a) Citrat, pH 4,5, (b) Phosphat, pH 6,0, (c) Phosphat, pH 6,5, (d) Phosphat, pH 7,0, (e) Phosphat, pH 7,5, (f) Phosphat, pH 8,0, (g) Borat, pH 10.
7A zeigt die Konformationsstabilität von Plasmid-DNA in PBS und TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA), gepuffert über den pH-Bereich 6,0 bis 8,5. Proben wurden mit 100 μg/ml 48 Stunden lang bei 60°C inkubiert, dann mittels Elektrophorese hinsichtlich Abbau analysiert. Zum Zeitpunkt 0 enthielten die Proben 90% superspiralisierte DNA.
7B zeigt die Wirkung des Puffertyps und des pH-Werts der Lösung auf den Superspiralgehalt (DNA-Stabilität) von Influenza-DNA-Vakzin während der Lagerung bei 37°C. DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit 20 μg/ml hergestellt. DNA wurde in Salzlösung allein oder in einer Salzlösung mit einem Tris-, Hepes-, Phosphat- oder Natriumhydrogencarbonatpuffer formuliert. Der pH-Wert des Puffers wurde zum Zeitpunkt 0 (Raumtemperatur) und nach 3 Monaten (37°C) gemessen. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt.
8A und 8B zeigen die Wirkung einer Formulierung mit PBS gegenüber Salzlösung (0,9% Gew./Vol. NaCl) auf den Superspiralgehalt von Influenza-DNA (HA-Georgia/93)-Vakzin während der Lagerung bei 25°C (Feld B) und 37°C (Feld A). DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit 2 μg/ml hergestellt. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt.
9 zeigt eine induzierte Maus-Immunreaktion, wie mittels HI-Titer gemessen, für eine einzige Injektion von Influenza-DNA-Vakzin, HA (Georgia/93), formuliert in PBS bzw. Salzlösung. DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit verschiedenen Dosen hergestellt und 200 μl des Vakzins wurden jeder Maus injiziert (10 Mäuse pro Dosis pro Formulierung).
10 zeigt die Wirkung der Exposition gegenüber Licht auf den Superspiralgehalt von Influenza-DNA-Vakzin während der Lagerung bei 25°C. DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit 100 μg/ml DNA in Salzlösung hergestellt. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt.
11 zeigt die Wirkung von Radikalfängern auf den Superspiralgehalt von Influenza-DNA-Vakzin während der Lagerung bei 37°C. DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit 100 μg/ml DNA in Salzlösung hergestellt. Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt.
12 zeigt die Wirkung der Lyophilisierung auf den Superspiralgehalt von Influenza-DNA-Vakzin während der Lagerung bei 37°C. DNA-Plasmid-Lösungen wurden mit 20 μg/ml DNA in entweder Phosphatpuffer oder phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7), enthaltend die angegebenen Zucker, hergestellt. Etwa 0,7 ml der formulierten DNA-Lösung wurden in 3-ml-Glasgefäße plaziert und dann lyophilisiert. Gefriergetrocknete DNA-Formulierungen am Tag 0 zeigten keine Veränderung des Gehalts an superspiralisiertem Plasmid im Vergleich zu flüssigen Kontrollen (keine Lyophilisierung). Der Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. A – PBS (flüssige Kontrolle: keine Lyophilisierung); B – PBS, enthaltend 5% Mannit, lyophilisiert; C – Phosphatpuffer, enthaltend 5% Mannit, lyophilisiert; D – PBS, enthaltend 5% Lactose, lyophilisiert; E – Phosphatpuffer, enthaltend 5% Sucrose, lyophilisiert; F – Phosphatpuffer, enthaltend 4% Mannit und 1% Lactose, lyophilisiert; G – Phosphatpuffer, enthaltend 4% Mannit und 1% Sucrose, lyophilisiert. Die Formulierungen wurden 1 Monat lang bei 37°C gelagert.
13 zeigt die Wirkung des pH-Werts auf die DNA-Stabilität (als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten Plasmid-DNA) nach zwei Wochen bei 50°C in 20 mM Bis-Tris-Propan, 150 mM NaCl. Die Kontrolle ist DNA in PBS bei pH 7,1.
14 zeigt die Wirkung des Puffertyps und pH-Werts auf die DNA-Stabilität bei 50°C bei einer DNA-Konzentration von 20 μg/ml. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten („supercoiled"; SC)-DNA gemessen.
15 zeigt die Wirkung der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität bei 50°C, pH 7,2, in 2 μg/ml DNA. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
16 zeigt die Wirkung der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität bei 50°C, pH 8,0, in 2 μg/ml DNA. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
17 zeigt die Wirkung der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Succinat und Ethanol enthalten. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
18 zeigt die Wirkung der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Hydrogencarbonat und Borat enthalten. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
19 zeigt die Wirkung der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in PBS- und Hydrogencarbonat-Formulierungen bei 30°C. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
20 zeigt die Wirkung von EDTA und Ethanol auf die DNA-Stabilität bei 50°C in PBS bei pH 7,2. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
21 zeigt die Wirkung von EDTA und Ethanol auf die DNA-Stabilität bei 50°C in PBS bei pH 8,0. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
22 zeigt die Wirkung von Eisen auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die EDTA/Ethanol bei 50°C enthalten. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
23 zeigt die Wirkung von Metallionenchelatoren auf die DNA-Stabilität in PBS bei pH 8,0. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
24 zeigt die Wirkung von Metallionenchelatoren auf die DNA-Stabilität in PBS bei pH 8,0 in Anwesenheit von Ethanol. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
25 zeigt die Wirkung der EDTA-Konzentration auf die DNA-Stabilität in PBS bei 1% Ethanol. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
26 zeigt die Stabilität von lyophilisierten (Formulierungen # 1–6) und flüssigen (Formulierungen 7–9) DNA-Formulierungen nach 4 Monaten bei 50°C. Formulierung #1 ist 5 Sucrose, 5 mM NaPO₄; Formulierung #2 ist 5% Sucrose, 5 mM NaPO₄, entmetallisiert; Formulierung #3 ist 5% Sucrose, 5 mM NaPO₄, 150 mM NaCl; Formulierung #4 ist 5% Sucrose, 5 mM NaPO₄, 150 mM NaCl, entmetallisiert; Formulierung #5 ist 4% Mannose, 1% Sucrose, 5 mM NaPO4; Formulierung #6 ist 4% Mannose, 1% Sucrose, 5 mM NaPO₄, entmetallisiert; Formulierung #7 ist 10 mM NaPO₄, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA und 2% Ethanol bei pH 8,0; Formulierung #8 ist 20 mM Tris, 150 NaCl, 10 mM Succinat, 2% Ethanol bei pH 8,2; und Formulierung #9 ist 20 mM Glycin, 150 mM NaCl, 10 mM Succinat, 2% Ethanol bei pH 9,0. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
27 zeigt die Wirkung von Licht auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Eisen und EDTA enthalten. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
28 zeigt die Wirkung von Licht auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Eisen, EDTA und Ethanol enthalten. Die DNA-Stabilität wird als verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten (SC)-DNA gemessen.
29 zeigt einen Arrhenius-Plot der Depurinierung in PBS, 1% Ethanol und 0,5 mM EDTA bei pH 7,4.
30 zeigt einen Arrhenius-Plot der β-Eliminierung in PBS, 1% Ethanol und 0,5 mM EDTA bei pH 7,4.
31 zeigt eine Voraussage der DNA-Stabilität bei 50°C unter Verwendung veröffentlichter und gemessener Werte von k₁ und k₂.
32 zeigt eine Voraussage der DNA-Stabilität bei 30°C, basierend auf gemessenen Werfen von k₁ und k₂ bei pH 7,4.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Formulierungen von pharmazeutischen Nukleinsäure-Produkten, insbesondere Formulierungen von Nukleinsäure-Vakzin-Produkten und Nukleinsäure-Gentherapie-Produkten. Die Formulierungen der Offenbarung stabilisieren die Konformation von pharmazeutischen DNA-Produkten. Die Vakzine induzieren bei direkter Einführung in Muskelzellen die Hervorrufung von Immunreaktionen, welche spezifisch Human-Influenzavirus erkennen.
Während der Lagerung als Pharmazeutikum erfahren DNA-Plasmid-Vakzine eine physikalisch-chemische Veränderung, bei der das superspiralisierte Plasmid in die offen zirkuläre und lineare Form umgewandelt wird. Eine Vielfalt von Lagerungsbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur, niedrige Ionenstärke) kann diesen Prozess beschleunigen. In dieser Erfindung stabilisiert die Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen (mit Bernsteinsäure oder Äpfelsäure, oder mit Chelatbildnern, die mehrere Phosphatliganden enthalten) aus der DNA-Plasmid-Lösung, aus den Formulierungspuffern oder aus den Gefäßen und Verschlüssen das DNA-Plasmid gegenüber diesem Abbauweg während der Lagerung. Darüber hinaus sind nicht-reduzierende Radikalfänger erforderlich, um eine Schädigung des DNA-Plasmids durch Bildung freier Radikale, welche immer noch in sogar anscheinend entmetallisierten Lösungen auftreten können, zu verhindern. Ferner müssen in der Formulierung der Puffertyp, der pH-Wert, die Salzkonzentration, Lichtexposition sowie die Art des verwendeten Sterilisationverfahrens zur Präparierung der Gefäße alle kontrolliert werden, um die Stabilität des DNA-Vakzins zu optimieren. Eine Lyophilisierung des DNA-Vakzins in Gegenwart der geeigneten Formulierungsexzipienten kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Plasmid während der Lagerung zu stabilisieren.
Gemäß der wissenschaftlichen Literatur wäre zu erwarten, dass die Kettenspaltungsreaktion, welche die Überführung von superspiralisiertem DNA-Plasmid in das offen zirkuläre bis lineare DNA-Plasmid verursacht, über zwei unterschiedliche chemische Mechanismen geschieht (da diese Präparationen von hochgereinigter DNA keine Nukleasen enthalten): (1) Depurinierung, gefolgt von β-Eliminierung, und/oder (2) radikalische Oxidation. Obwohl zu erwarten wäre, dass die Entfernung von Spurenmetallionen den radikalischen Oxidationsmechanismus der DNA-Kettenspaltung unterdrücken würde, weisen unsere Ergebnisse überraschenderweise darauf hin, dass die Entfernung oder Chelierung von Spurenmetallionen aus der DNA-haltigen Lösung die DNA gegen beide Abbaumechanismen stabilisiert, wie beurteilt durch Vergleich unserer Stabilitätsdaten mit den veröffentlichten Raten der Depurinierung und β-Eliminierung (siehe Lindahl et al., Biochemistry 19: 3610–3618, 1972; Lindahl et al., Biochemistry 19: 3618–3623, 1972). Auf Grundlage dieser und anderer veröffentlichter Berichte würde man nicht erwartet haben, dass die Entfernung von Spurenmetallionen eine signifikante Auswirkung auf die Raten der Depurinierung oder β-Eliminierung haben würde. Deshalb ist die Erhöhung der DNA-Stabilität, welche sich aus der Entfernung von Spurenmetallionen ergibt, viel größer als erwartet und kann nicht auf Grundlage der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung erklärt werden.
Darüber hinaus zeigen unsere Daten an, dass spezifische Chelatbildner, wie z.B. Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat, Bernsteinsäure und Äpfelsäure, die Stabilität von Plasmid-DNA bei der Lagerung erhöhen, während andere üblicherweise eingesetzte Chelatbildner, wie z.B. EDTA, Desferal, Ethylendiamin-di(o-hydroxyphenylessigsäure (EDDHA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) keine signifikante Stabilitätserhöhung ergeben. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass ein beliebiger Chelatbildner mit mehreren Phosphatliganden (beispielsweise Polyphosphorsäure) die DNA-Stabilität erhöhen wird. Aus der veröffentlichten Literatur geht jedoch nicht klar hervor, warum Inositolhexaphosphat DNA stabilisiert, jedoch EDDHA, Desferal und DTPA nicht. Nachdem die veröffentlichte Literatur nahelegt, dass alle vier dieser Chelatbildner die eisen-katalysierte Bildung von Hydroxylradikalen inhibieren, wurde erwartet, dass alle diese Reagenzien eine erhöhte DNA-Stabilität ergeben würden (durch Chelierung von Spurenmetallionen und Inhibierung der Bildung freier Radikale); dies wurde jedoch nicht beobachtet. Darüber hinaus berichtet die Literatur, dass sowohl EDTA als auch ATP die metallionen-katalysierte Hydroxylradikalbildung fördern, wir beobachteten jedoch, dass Tripolyphosphat (die metallbindende Gruppierung von ATP) die DNA-Stabilität erhöht, während EDTA dies nicht tut. Deshalb scheinen die Schutzwirkungen der Metallionenchelatoren nicht direkt mit ihrem Vermögen zur Förderung der Bildung von Hydroxylradikalen korreliert zu sein. Die Identifizierung der geeigneten Chelatbildner zur Stabilisierung von DNA-Formulierungen wird empirische Tests erforderlich machen, wie in dieser Arbeit beschrieben.
Neben der Entfernung und/oder Chelierung von Spurenmetallionen ist die Verwendung von nicht-reduzierenden Radikalfängern für die Stabilisierung von DNA-Formulierungen während der Lagerung wichtig. Unsere Ergebnisse zeigen an, dass Ethanol, Methionin, Glycerin und Dimethylsulfoxid die DNA-Stabilität erhöhen, was nahelegt, dass deren Schutzwirkung auf das Abfangen freier Radikale zurückzuführen ist. Ferner zeigen unsere Ergebnisse an, dass Radikalfänger, welche als Reduktionsmittel dienen können, wie z.B. Ascorbinsäure, den DNA-Abbau stark beschleunigen, mutmaßlich durch die Wirkung als Reduktionsmittel, um Spurenmetallionen in ihrem reduzierten (schädlichsten) Zustand zu halten. Unsere Ergebnisse zeigen auch an, dass mehrere Radikalfänger, von denen erwartet wurde, dass sie DNA stabilisieren (basierend auf bekannten Geschwindigkeitskonstanten mit dem Hydroxylradikal), unerwarteterweise den DNA-Abbau beschleunigten oder keine Erhöhung der Stabilität ergaben. Beispielsweise sind Pentoxifyllin und p-Aminobenzoesäure Hydroxylradikalfänger mit großen Geschwindigkeitskonstanten für Hydroxylradikale (k = 1,1 × 10¹⁰ M^–1s^–1; siehe Freitas und Filipe, Biol. Trace Elem. Res. 47: 307–311, 1995; Hu et al., J. Nutr. Biochem. 6: 504–508, 1995), jedoch erhöhte Pentoxifyllin die Stabilität nicht und p-Aminobenzoesäure beschleunigte tatsächlich den DNA-Abbau. Aufgrund dieser Ergebnisse war das empirische Screenen einer Anzahl von Radikalfängern das wirksamste Mittel zur Identifizierung geeigneter Verbindungen.
Zur Maximierung der DNA-Stabilität in einer pharmazeutischen Formulierung sind die Art des Puffers, die Salzkonzentration, der pH-Wert, die Lichtexposition sowie die Art des angewandten Sterilisierungsverfahrens zur Präparierung der Gefäße alle wichtige Parameter, welche in der Formulierung kontrolliert werden müssen, um die Stabilität weiter zu optimieren. Ferner kann auch eine Lyophilisierung des DNA-Vakzins mit geeigneten Formulierungsexzipienten durchgeführt werden, um die DNA-Stabilität zu erhöhen, mutmaßlich durch Verringerung der Molekülbewegung mittels Entwässerung. Deshalb legen unsere Daten nahe, dass die Formulierung, welche die höchste Stabilität des DNA-Vakzins ergeben wird, eine sein wird, welche eine entmetallisierte Lösung, enthaltend einen Puffer (Phosphat oder Hydrogencarbonat) mit einem pH-Wert im Bereich von 7–8, ein Salz (NaCl, KCl oder LiCl) im Bereich von 100–200 mM, einen Metallionenchelator (Succinat, Malat, Inositolhexaphosphat, Tripolyphosphat oder Polyphosphorsäure), einen nicht-reduzierenden Radikal fänger (Ethanol, Glycerin, Methionin oder Dimethylsulfoxid) und die höchste geeignete DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, einschließt.
DNA-Konstrukte, welche für Influenzavirus-Proteine codieren, rufen schützende Immunreaktionen in Lebewesen hervor. Immunreaktionen in Lebewesen umfassten Antikörper- und CTL-Bildung in Mäusen, Antikörperbildung in Frettchen und Primaten und Schutz vor einer viralen Herausforderung in Mäusen und Frettchen mit homologen, „gedrifteten" und „geshifteten" Stämmen von Influenza. Vielleicht das hervorstechendste Ergebnis der Immunisierung mit DNA, welche für virale Proteine codiert, war das Vermögen, Schutz gegen unterschiedliche Subtypen des Virus zu verleihen. Dies legt nahe, dass die Hinzufügung einer CTL-hervorrufenden Komponente zu einem Vakzin dazu dienen sollte, die Folgen neuer Varianten, welche in der Mitte der Saison auftreten oder nicht erwartet werden, wenn die Vakzinstämme jedes Jahr für das folgende Jahr ausgewählt werden, zu mildern. Es ist von Bedeutung, dass die Immunisierung mit cDNA-Vektoren, welche für ein HA-, NP- und M1-Gen codierten, in der Lage war, wirksamer gegen einen gedrifteten Virusstamm in Frettchen zu schützen als das zugelassene Vakzin. Dies bietet eine Rechtfertigung für die Verwendung von Konstrukten, welche für interne Gene codieren, in dem IDV (Influenza-DNA-Vakzin).
In einer Ausführungsform wird das Vakzin-Produkt aus separaten DNA-Plasmiden bestehen, die beispielsweise für HA der drei verbreitetsten klinischen Stämme, welche die Viren A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) und B (B/Panama/90) repräsentieren, codieren, sowie aus DNA-Konstrukten, welche für die internen konservierten Proteine NP und MI (Matrix) von sowohl A-Stämmen (Beijing/89; H3N2) als auch B-Stämmen codieren, um einen gruppengemeinsamen Schutz gegen gedriftete und geshiftete Antigene bereitzustellen. Die HA-DNA wird durch Bildung von HA und resultierenden neutralisierenden Antikörpern gegen HA wirken. Diese werden typenspezifisch sein, mit einer etwas erhöhten Schutzbreite gegen einen gedrifteten Stamm im Vergleich zu dem gegenwärtig zugelassenen Vakzin auf Proteinbasis. Die NP- und M1-Konstrukte werden zur Bildung von CTL führen, welche einen stammübergreifenden Schutz mit potentiell geringeren Virusbelastungen und mit einer beschleunigten Erholung von einer Erkrankung bieten werden. Es steht zu erwarten, dass die erwartete Persistenz der DNA-Konstrukte (in einer episomalen, nicht-replizierenden, nicht-integrierten Form in den Muskelzellen) eine erhöhte Schutzdauer im Vergleich zu dem gegenwärtigen Vakzin bieten wird.
Die erwarteten Vorteile gegenüber den gegenwärtigen zugelassenen Vakzinen umfassen: erhöhte Schutzbreite aufgrund von CTL-Reaktionen ± erhöhte Antikörperbreite und erhöhte Schutzdauer. Der IDV-Ansatz umgeht die Notwendigkeit, Umlagerungsstämme herzustellen, zu selektionieren und zu vermehren, wie es für das gegenwärtig zugelassene Vakzin durchgeführt wird, da ein neues DNA-Konstrukt direkter von einem klinischen Feldisolat hergestellt werden kann. Lymphozyten-Reaktion.
Die intramuskuläre (IM) Injektion eines DNA Expressionsvektors, codierend für ein konserviertes internes Protein von Influenza A, führte zur Erzeugung einer signifikanten schützenden Immunität gegen eine nachfolgende virale Herausforderung. Insbesondere wurden NP-spezifische Antikörper und primäre CTLs gebildet. Die NP-DNA-Immunisierung führte zu herabgesetzten viralen Titern in der Lunge, Hemmung des Gewichtsverlustes und erhöhter Überlebensrate im Vergleich zu Kontrollen. Die schützende Immunreaktion wurde nicht durch die NP-spezifischen Antikörper vermittelt, wie durch die mangelnde Wirkung von NP-Antikörpern alleine (siehe Beispiel 4) bei der Bekämpfung einer Virusinfektion demonstriert, und war somit wahrscheinlich auf eine NP-spezifische zelluläre Immunität zurückzuführen. Darüber hinaus wurden signifikante Niveaus an primären CTLs, gerichtet gegen NP, erzeugt. Der Schutz richtete sich gegen einen virulenten Stamm von Influenza A, welcher heterolog zu dem Stamm war, aus dem die DNA kloniert wurde. Darüber hinaus entstand der Herausforderungsstamm mehr als drei Dekaden nach dem A/PR/8/34-Stamm, was anzeigt, dass gegen konservierte Proteine gerichtete Immunreaktionen trotz der Antigenshifts und Antigendrifts der variablen Hüllproteine wirksam sein können. Nachdem jedes der Influenza-Genprodukte einen gewissen Grad an Konservierung aufweist und nachdem CTLs als Reaktion auf eine intrazelluläre Expression und MHC-Prozessierung erzeugt werden können, ist es voraussagbar, dass andere Influenzavirus-Gene zu Reaktionen führen werden, die den für NP erreichten analog sind. Verfahren zur Identifizierung immunogener Epitope sind nun im Stand der Technik wohl bekannt (siehe beispielsweise Shirai et al., 1992, J. Immunol 148: 1657–1667; Choppin et al., 1991, J. Immunol. 147: 575–583; Calin-Laurens, et al., 1992, Vaccine 11: 947–978]. So wurden viele dieser Gene kloniert, wie gezeigt durch die klonierten und sequenzierten Verbindungsstellen in dem Expressionsvektor (siehe unten), so dass diese Konstrukte prophylaktische Agenzien in verfügbarer Form sind.
Die Standardtechniken der Molekularbiologie zur Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten ermöglichen die Herstellung der DNA-Therapeutika dieser Erfindung. Während Standardtechniken der molekularen Biologie deshalb für die Herstellung der Produkte dieser Erfindung ausreichend sind, stellen die hier offenbarten speziellen Konstrukte neue Therapeutika bereit, welche überraschenderweise einen stammübergreifenden Schutz ergeben, ein Ergebnis, das bisher mit Standardvakzinen mit ganzem Virus oder Untereinheitsprotein nicht erreichbar war.
Die Menge an exprimierbarer DNA, welche in einen Vakzin-Empfänger einzuführen ist, wird von der Stärke der transkriptionalen und translationalen Promotoren, die in dem DNA-Konstrukt verwendet werden, und von der Immunogenizität des exprimierten Genprodukts abhängen. Im allgemeinen wird eine immunologisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 μg bis 1 mg und vorzugsweise etwa 10 μg bis 300 μg direkt in Muskelgewebe verabreicht. Subkutane Injektion, intradermale Einführung, Impression durch die Haut und andere Verabreichungsweisen, wie z.B. intraperitonale, intravenöse Abgabe oder Abgabe mittels Inhalation, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Es wird auch in Betracht gezogen, dass Auffrischungsimpfungen vorzusehen sind.
Die DNA kann nackt sein, d.h. nicht assoziiert mit irgendwelchen Proteinen, Adjuvantien oder anderen Mitteln, welche einen Einfluss auf das Immunsystem des Empfängers haben. in diesem Fall ist es wünschenswert, dass die DNA in einer physiologisch annehmbaren Lösung, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, sterile(r) Salzlösung oder sterile(r) gepufferter Salzlösung, vorliegt. Alternativ kann die DNA mit Liposomen assoziiert sein, wie z.B. Lecithin-Liposomen oder anderen im Stand der Technik bekannten Liposomen, als eine DNA-Liposom-Mischung (siehe beispielsweise WO 93/24640), oder die DNA kann mit einem im Stand der Technik bekannten Adjuvans assoziiert sein, um Immunreaktionen zu verstärken, wie z.B. einem Protein oder anderen Träger. Agenzien, welche die zelluläre Aufnahme von DNA unterstützen, z.B., jedoch nicht beschränkt auf, Calciumionen, virale Proteine und andere die Transfektion erleichternde Agenzien, können ebenfalls vorteilhaft genutzt werden. Diese Agenzien werden im allgemeinen als transfektionserleichternde Agenzien bezeichnet und als pharmazeutisch annehmbare Träger. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Gen" auf ein Segment von Nukleinsäure, welches für ein diskretes Polypeptid codiert. Der Begriff „pharmazeutisch" und „Vakzin" werden austauschbar verwendet, um Zusammensetzungen anzuzeigen, welche zur Induktion von Immunreaktionen geeignet sind. Die Begriffe „Konstrukt" und „Plasmid" werden austauschbar verwendet. Der Begriff „Vektor" wird verwendet, um eine DNA anzuzeigen, in die Gene zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung kloniert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung codiert das DNA-Vakzin für Human-Influenzavirus-Nukleoprotein, -Hämagglutinin, -Matrix, -Nichtstrukturprotein oder -Polymerase-Genprodukt. Spezifische Beispiele dieser Ausführungsform werden im Folgenden gegeben, wobei das Human-Influenzavirus-Gen für das Nukleoprotein, die basische Polymerase 1, das Nichtstrukturprotein 1, Hämagglutinin, Matrix 1, die basische Polymerase 2 des Human-Influenzavirus-Isolats A/PR/8/34, das Nukleoprotein des Human-Influenzavirus-Isolats A/Beijing/353/89, das Hämagglutinin-Gen des Human-Influenzavirus- Isolats A/Texas/36/91 oder das Hämagglutinin-Gen des Human-Influenzavirus-Isolats B/Panama/46/90 codiert.
In dieser Patentbeschreibung werden Daten präsentiert, welche beispielhaft mehrere zusätzliche DNA-Vakzin-Formulierungen erläutern. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Vakzin-Formulierungen, welche eine entmetallisierte Lösung umfassen, die einen physiologisch annehmbaren Puffer innerhalb eines pH-Bereichs von mindestens größer als etwa 8,0 bis etwa mindestens 9,5, ein Salz (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, NaCl, KCl oder LiCl) im Bereich von bis zu etwa 300 mM und den Metallionenchelator EDTA (im Bereich von bis zu etwa 5 mM) in Kombination mit dem Radikalfänger Ethanol (in dem Bereich bis zu etwa 3%) und die höchste geeignete DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer enthält.
In einem speziellen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassen die DNA-Vakzin-Formulierungen eine Kombination von EDTA und Ethanol, NaCl in einer Konzentration von etwa 100 mM bis etwa 200 mM, EDTA im Bereich von etwa 1 μM bis etwa 1 mM, Ethanol mit bis zu etwa 2% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer.
In einer weiteren Ausführungsform der DNA-Vakzin-Formulierungen, welche eine Kombination von EDTA und Ethanol umfassen, ist NaCl mit etwa 100 mM bis etwa 200 mM anwesend, EDTA ist mit etwa 1 μM bis etwa 750 μM anwesend, Ethanol ist mit etwa 0,5% bis etwa 2,5% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer, welcher vorzugsweise Tris-HCl bei einem pH-Wert von etwa 8.0 bis etwa 9,0 ist. Es versteht sich, dass andere bekannte Puffer mit einer Pufferkapazität innerhalb verschiedener pH-Bereiche, wie z.B. pH 8,0 bis 9,5, in den verschiedenen DNA-Vakzin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Während beispielsweise Tris-HCl bis zu etwa pH 9,0 wirksam ist, wird wiederum ein Glycin-Puffer mindestens in dem Bereich von etwa pH 9,0 bis etwa 9,5 wirksam sein.
In einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung, bei dem die DNA-Vakzin-Formulierungen eine Kombination von EDTA und Ethanol, NaCl in einer Konzentration von etwa 100 mM bis etwa 200 mM umfassen, ist EDTA mit etwa 500 μM anwesend, ist Ethanol mit etwa 1,0% anwesend, alle in der höchsten geeigneten DNA-Konzentration in einem sterilen Glasgefäß, verpackt, um die hochgereinigte nukleasefreie DNA vor Licht zu schützen, und in einem physiologisch annehmbaren Puffer, welcher vorzugsweise Tris-HCl bei einem pH-Wert von etwa 8,5 bis etwa 9.0 ist.
Es werden Daten präsentiert, welche zeigen, dass der pH-Wert der Formulierung die Stabilität der DNA beeinflusst und dass der optimale pH-Wert > 8,5 ist. 14 zeigt an, dass die höchste getestete Formulierung (pH 9,0), welche die größte DNA-Stabilität ergab, auch bei dem höchsten verwendeten pH-Wert (pH 9) war. Die Wirkung des Puffertyps auf die DNA-Stabilität wurde ebenfalls untersucht und entsprechende Daten sind hier offenbart. In Kürze, die größte Pufferwirkung auf die DNA-Stabilität wurde beobachtet, wenn Glycin und Bis-Tris-Propan verglichen wurden. Der Glycinpuffer bei pH 9 war der Bis-Tris-Propan-Formulierung beim selben pH-Wert signifikant überlegen. Im Gegensatz dazu ergaben die Tris, Bicin- und Tricinpuffer bei pH 8,2 eine nahezu identische DNA-Stabilität bis zu 12 Wochen. Die Daten, welche die Pufferung mit der DNA-Stabilität korrelieren, legen nahe, dass eine Kontrolle der radikalischen Oxidation von DNA zu einer allgemeinen DNA-Stabilität führt, die dann durch den pH-Wert der Formulierung kontrolliert wird.
Die Wirkung von Licht auf die DNA-Stabilität wird hier offenbart und es wird gezeigt, dass die schädliche Wirkung von Licht größtenteils durch die Zugabe von EDTA und Ethanol zur Formulierung behoben werden kann. Die Zugabe dieser Formulierungskomponenten stabilisiert DNA in Proben, die entweder im Licht oder im Dunklen aufgehoben wurden. Deshalb werden DNA-Vakzin-Formulierungen, die EDTA und Ethanol enthalten, viel weniger anfällig für die schädlichen Wirkungen von Licht und Spurenmetallionen sein, als Formulierungen, denen einer dieser beiden Stabilisatoren fehlt.
In dieser Patentbeschreibung werden auch verschiedene Daten offenbart, welche die Wirkung der Entmetallisierung von Puffern vor der Herstellung von DNA-Vakzin-Formulierungen testen. Es wird hier offenbart, dass eine Entmetallisierung die DNA-Stabilität in der Formulierung, welche Glycerin enthält, leicht verbessert, jedoch keine Wirkung auf die DNA-Stabilität in einer Ethanol-Formulierung hat. Diese Daten zeigen, dass dasselbe Niveau an DNA-Stabilität durch entweder Kontrolle der radikalischen Oxidation mit Succinat und Ethanol oder durch Entfernung der Spurenmetallionen mittels Entmetallisierung erzielt werden kann. Es werden auch Daten präsentiert, welche zeigen, dass die Erhöhung der DNA-Stabilität durch Entmetallisierung über einen breiten Bereich von Temperaturen und Lagerungszeiten wirksam ist.
DNA-Stabilitätsexperimente wurden ebenfalls durchgeführt, um zu zeigen, dass Ethanol ein wirksamer Radikalfänger in Anwesenheit von EDTA ist. Die Kombination von Ethanol und EDTA ergibt eine große Erhöhung der DNA-Stabilität (bei pH 7,2) bis zu 4 Wochen, jedoch nur eine geringe Stabilitätserhöhung ab Woche 8. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ethanol ein wirksamerer Abfänger von freien Radikalen in Anwesenheit von EDTA als in seiner Abwesenheit ist. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass EDTA alleine die DNA-Stabilität in Abwesenheit von Ethanol verringert, jedoch die DNA-Stabilität in Anwesenheit von Ethanol erhöht. Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass Ethanol ein wirksamerer Radikalfänger in Anwesenheit von EDTA ist, da EDTA an DNA gebundene Metallionen entfernt und damit die Bildung von Hydroxylradikalen im Volumen der Lösung erlaubt, im Gegensatz zur Bildung von Radikalen durch an die DNA gebundenes Eisen. Die Daten, welche zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung präsentiert werden, zeigen auch, dass die DNA-Stabilisierungswirkungen von Ethanol und EDTA/EtOH bei pH 8,0 größer als bei pH 7,2 sind. Es wird weiter gezeigt, dass ein ähnliches Ausmaß an Schutz durch die Kombination von Succinat und Ethanol erhalten werden kann.
Ein weiterer beispielhaft erläuterter Teil der Erfindung bezieht sich auf alternative Metallionenchelatoren, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, NTA (Nitrilotriessigsäure) und DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure). Es werden Daten präsentiert, welche zeigen, dass NTA oder DTPA, vorzugsweise DTPA, die DNA-Stabilität in Abwesenheit von Ethanol erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft entweder flüssige oder lyophilisierte DNA-Vakzin-Formulierungen. Es werden Daten präsentiert, welche zeigen, dass die Stabilität der besten lyophilisierten Formulierung diejenige der flüssigen Formulierungen kurzfristig übertraf, wohingegen flüssige Formulierungen eine gute Stabilität über längere Zeiträume zeigten. Die Ergebnisse zeigen auch, dass eine Entmetallisierung die Stabilisierung der lyophilisierten DNA in den Formulierungen 1 und 2 verbessert, jedoch wenig Wirkung auf den Prozentsatz an (superspiralisierter) SC-DNA in den anderen lyophilisierten Formulierungen hat. Deshalb ist die Lyophilisierung ein wirksames Verfahren zur Stabilisierung von DNA-Vakzinen und die Entmetallisierung des Formulierungspuffers verbessert die Stabilität von lyophilisierter DNA in einigen Formulierungen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter definieren, ohne die Erfindung auf die Details der Beispiele zu beschränken.
BEISPIEL 1
V1J-Expressionsvektor – V1J ist von den Vektoren V1 und pUC18, einem im Handel erhältlichen Plasmid, abgeleitet. V1 wurde mit den Restriktionsenzymen SspI und EcoRI verdaut, welches zwei DNA-Fragmente ergab. Das kleinere dieser Fragmente, enthaltend den CMVintA-Promoter und Rinderwachstumshormon (BGH)-Transkriptionsterminationselemente, welche die Expression heterologer Gene kontrollieren, wurde aus einem Agaroseelektrophoresegel gereinigt. Die Enden dieses DNA-Fragments wurden dann mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Polymerase „glattendig" gemacht, um seine Ligierung mit einem anderen „glattendigen" DNA-Fragment zu erleichtern.
pUC18 wurde gewählt, um das „Gerüst" des Expressionsvektors bereitzustellen. Es ist bekannt, dass es hohe Plasmidausbeuten ergibt, ist hinsichtlich Sequenz und Funktion wohl charakterisiert und weist eine minimale Größe auf. Wir entfernten das gesamte lac-Operon, welches für unsere Zwecke unnötig war und für die Plasmidausbeuten und heterologe Genexpression abträglich sein könnte, durch partielle Verdauung mit dem Restriktionsenzym HaeII aus diesem Vektor. Das verbleibende Plasmid wurde aus einem Agaroseelektrophoresegel gereinigt, mit der T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt und mit dem oben beschriebenen CMVintA/BGH-Element ligiert. Plasmide, welche eine von zwei möglichen Orientierungen der Promotorelemente innerhalb des pUC-Gerüsts aufwiesen, wurden erhalten. Eines dieser Plasmide ergab viel höhere Ausbeuten an DNA in E. coli und wurde als V1J bezeichnet. Die Struktur dieses Vektors wurde mittels Sequenzanalyse der Verbindungsbereiche verifiziert und von ihm wurde anschließend gezeigt, dass er eine vergleichbare oder höhere Expression heterologer Gene im Vergleich mit V1 ergab.
BEISPIEL 2
Influenzavirus-Gen-Konstrukte in dem Expressionsvektor V1J – Viele der Gene des A/PR/8/34-Stammes des Influenzavirus wurden in den Expressionsvektor V1J kloniert, welcher eine Expression auf so hohen oder höheren Niveaus wie in dem V1-Vektor ergibt. Die PR8-Gensequenzen sind bekannt und in der GENBANK-Datenbank verfügbar. Für jedes der im folgenden klonierten Gene wurde die Größe des klonierten Fragments durch Größenbestimmung in einem Gel überprüft und die GENBANK-Hinterlegungsnummer, mit der die partielle Sequenz verglichen wurde, ist angegeben. Für ein Verfahren zur Gewinnung dieser Gene aus Virusstämmen, beispielsweise aus Virus, das von der ATCC erhalten wurde (A/PR/8/34 ist ATCC VR-95; viele andere Stämme sind ebenfalls bei der ATCC hinterlegt).
A. Subklonierung der PR8-Gene in V1J:

1. NP – Das NP-Gen wurde aus pAPR501 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138) subkloniert. Es wurde ausgeschnitten durch Spalten von pAPR501 mit EcoRI, das Fragment wurde gelgereinigt und mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das glattendige Fragment wurde in V1J inseriert, der mit Bgl II gespalten und ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht worden war. Das klonierte Fragment war 1,6 Kilobasen lang.
2. NS – Das NS-Gen wurde aus pAPR801 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138) subkloniert. Es wurde ausgeschnitten durch Spalten von pAPR801 mit EcoRI, das Fragment wurde gelgereinigt und mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das glattendige Fragment wurde in V1J, gespalten mit Bgl II und ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, inseriert. Das klonierte Fragment war 0,9 Kilobasen lang (der vollständige für NS codierende Bereich, einschließlich NS1 und NS2).
3. HA – Das HA-Gen wurde aus pJZ102 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138) subkloniert. Es wurde durch Spalten von pJZ102 mit Hind III ausgeschnitten, das Fragment wurde gelgereinigt und mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das glattendige Fragment wurde in V1J inseriert, der mit Bgl II gespalten und ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht worden war. Das klonierte Fragment war 1,75 Kilobasen lang.
4. PB1 – Das PB1-Gen wurde aus pGem1-PB1 subkloniert (Die 5'- und 3'-Verbindungsstellen der Gene mit dem Vektor wurden sequenziert, um deren Identität zu bestätigen. Siehe J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138. Es wurde durch Spalten von pGem-PB1 mit Hind III ausgeschnitten, das Fragment wurde gelgereinigt und mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das glattendige Fragment wurde in V1J inseriert, der mit Bgl II gespalten und ebenfalls mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht worden war. Das klonierte Fragment war 2,3 Kilobasen lang.
5. P82 – Das PB2-Gen wurde aus pGem1-PB2 subkloniert (Die 5'- und 3'-Verbindungsstellen der Gene mit dem Vektor wurden sequenziert, um deren Identität zu bestätigen. Siehe J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138. Es wurde ausgeschnitten durch Spalten von pGem-PB2 mit BamH I und Gelreinigung des Fragments. Das Fragment mit kohäsiven Enden wurde in V1J inseriert, der mit Bgl II gespalten worden war. Das klonierte Fragment war 2,3 Kilobasen lang.
6. M1 – Das M1-Gen wurde mittels PCR aus dem Plasmid p8901 MITE erzeugt. Die M-Sequenz in diesem Plasmid wurde mittels PCR aus pAPR701 erzeugt (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman und M. Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza Viruses, Hrsg. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) S. 129–138). Das PCR-Fragment wurde gelgereinigt, mit Bgl II gespalten und in V1J ligiert, der mit Bgl II gespalten worden war. Das klonierte Fragment war 0,7 Kilobasen lang. Der Aminoterminus des codierten M1 wird in dem "Sense"-Primer codiert, der oben als das "ATG"-Codon gezeigt ist, während das M1-Translationsstopcodon von der Umkehrung des "TCA"-Codons codiert wird, welches in der Sense-Richtung das Stopcodon "TGA" ist.

B. Influenzagen-V1J-Expressionskonstrukte
In jedem Fall sind die Verbindungssequenzen von der 5'-Promoterregion (CMVintA) in das klonierte Gen gezeigt. Die Position, an der die Verbindungsstelle auftritt, ist mit einem "/" markiert, welches keinerlei Unterbrechung der Sequenz anzeigt. Das Verfahren zur Herstellung dieser Konstrukte wird nach allen folgenden Sequenzen zusammengefasst. Jede bereitgestellte Sequenz repräsentiert ein vollständiges, verfügbares, exprimierbares DNA-Konstrukt für das ausgewählte Influenzagen.
Jedes Konstrukt wurde vorübergehend in RD-Zellen transfiziert (ATCC CCL136), eine Human-Rhabdomyosarkom-Zellinie in Kultur. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und Westernblots durchgeführt (mit Ausnahme des V1J-PR-NA-Konstrukts, welches in Mäusen getestet wurde und einen spezifischen Anti-HA-Antikörper ergab, bevor ein Westernblot durchgeführt wurde, und somit der Notwendigkeit zur Durchführung eines Westernblots enthob, da die Expression in vivo beobachtet wurde). Antikörper, welcher für die PB1-, PB2- und NS-Proteine spezifisch war, wurde von Stephen Inglis der University of Cambridge bereitgestellt, der gereinigte Proteine verwendete, welche als β-Galactosidase-Fusionsproteine exprimiert wurden, um polyklonale Antiseren zu erzeugen. Polyklonales Anti-NP-Antiserum wurde erzeugt durch Immunisierung von Kaninchen mit ganzem A/PR/8/34-Virus. Anti-M1-Antikörper ist im Handel erhältlich von Biodesign als ein Anti-InfluenzaA-Ziegenantiserum, Katalog-Nummer B65245G. In jedem Fall wurde ein Protein der vorausgesagten Größe beobachtet, was die in vitro Expression des codierten Influenzaproteins bestätigt.
Die Nomenklatur für diese Konstrukte folgt der Konvention: "Vektorbezeichnung-Influenzastamm-Gen". In jedem Fall wurde die Sequenz gegen bekannte Sequenzen aus GENBANK hinsichtlich der klonierten und sequenzierten A/PR/8/34-Gensequenz überprüft.
C. Produktion von V1jns
Eine Sfi I-Stelle wurde V1Jneo hinzugefügt, um Integrationsstudien zu erleichtern. Ein im Handel erhältlicher 13-Basenpaar-Sfi I-Linker (New England BioLabs) wurde an der Kpn I-Stelle innerhalb der BGH-Sequenz des Vektors hinzugefügt. V1Jneo wurde mit Kpn I linearisiert, gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem glattendigen Sfi I-Linker ligiert. Klonale Isolate wurden durch Restriktionskartierung ausgewählt und mittels Sequenzierung über den Linker verifiziert. Der neue Vektor wurde als V1Jns bezeichnet. Die Expression heterologer Gene in V1Jns (mit Sfi I) war vergleichbar mit der Expression der gleichen Gene in V1Jneo (mit Kpn I).
BEISPIEL 3
Züchtung mikrobieller Zellen, Zellyse und Klärung – Ein Liter einer eingefrorenen E. coli-Zellaufschlämmung wurde zur Herstellung von 8 Litern Zellsuspension in STET-Puffer (8% Sucrose, 0,5% TRITON, 50 mM TRIS-Puffer, pH 8,5, und 50 mM EDTA) verwendet. Die Extinktion der Zellsuspension bei 600 nm betrug etwa 30 OD. Die Suspension wurde kontinuierlich gerührt, um die Homogenität sicherzustellen. Die Viskosität der Zellsuspension wurde als etwa 1,94 cp bei Raumtemperatur (24°C) gemessen. Die Zellsuspension wurde durch den Wärmeaustauscher mit 81 ml/Min. durchgepumpt, welches einer Verweilzeit der Zellösung in dem Wärmeaustauscher von etwa 35 Sekunden entsprach. Die Badtemperatur wurde bei 92°C gehalten. Die Eintritts- und Austrittstemperaturen der Zellösung wurden als etwa 24°C bzw. etwa 89°C (Mittelwert) gemessen. Etwa 1 Liter Probe wurde durch den Wärmeaustauscher laufen gelassen. Es wurde kein sichtbares Verstopfen des Rohrs beobachtet, obwohl das Lysat etwas dicker als das Ausgangsmaterial war. Das Lysat wurde auf Raumtemperatur gekühlt und seine Viskosität als etwa 40 cp gemessen. Das Zellysat wurde geklärt durch diskontinuierliche Zentrifugation mit 9000 UpM für 50 Minuten unter Verwendung der Beckman J-21. Eine Analyse des Überstands bestätigte eine effektive Zellyse und Produktgewinnung. Die Produktausbeute, welche sich bei Durchfluss-Wärmelyse ergab, war mindestens vergleichbar mit derjenigen, welche nach dem Siedeverfahren von Quigley & Holmes erhalten wurde. Das letztere Verfahren muss jedoch im Labormaßstab in einem diskontinuierlichen Modus durchgeführt werden und ist deshalb ungeeignet für eine Aufarbeitung im großen Maßstab (5 Liter oder mehr). Nachdem das Wärmeaustauscherverfahren ein Durchflussprozess ist, gibt es keine Maximalgrenze für das Volumen der Zellsuspension, welche aufgearbeitet werden kann. Dieses Verfahren kann deshalb an Fermentationen von Bakterien in sehr großem Maßstab angepasst werden, um große Mengen an hochgereinigter Plasmid-DNA herzustellen.
Das geklärte Lysat wurde dann durch eine Membran filtriert, welche eine Porengröße von 0,45 Mikron aufwies, um feinere Zelltrümmer zu entfernen. Das Filtrat wurde dann unter Verwendung einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von etwa 100.000 diafiltriert.
BEISPIEL 4
Kontrolle und Reproduzierbarkeit der Zellyse mit dem Wärmeaustauscher – Die Einstellung der Durchflussrate (d.h. Verweilzeit), mit der die Zellaufschlämmung durch den Wärmeaustauscher gepumpt wird, erlaubt eine strenge Kontrolle der Lysetemperatur, d.h. der Austrittstemperatur. Eine Zellaufschlämmungslösung wurde hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben und durch den Wärmeaustauscher mit Durchflussraten gepumpt, welche von 160 bis 850 ml/Min. reichten. Die entsprechenden Austrittstemperaturen lagen im Bereich zwischen 93°C und 65°C. Die Anfangstemperatur der Zellaufschlämmung betrug 24°C und die Badtemperatur wurde konstant bei 96°C gehalten. Darüber hinaus wurde eine Anzahl von Läufen durchgeführt, wobei eine Austrittstemperatur von 80°C angestrebt wurde. Ausbeuten von 24 mg zirkulärer DNA pro Liter geklärtem Überstand wurden kontinuierlich erhalten, was die Reproduzierbarkeit des Verfahrens demonstriert.
BEISPIEL 5
Reinigung von Plasmid-DNA – Mikrobielle Zellen und Lysate wurden wie beschrieben hergestellt und die folgenden Analysen wurden durchgeführt. Zur Illustration, dass die Zugabe von 100 mM EDTA gegenüber 50 mM EDTA den Prozentsatz an superspiralisierter DNA erhöhte, und zur Feststellung eines annehmbaren Bereichs von Austrittstemperaturen (d.h. Lysetemperatur) bezüglich der Gewinnung von superspiralisierter DNA wurden die folgenden Analysen durchgeführt. Die superspiralisierte Form von Plasmid-DNA ist wünschenswert, da sie stabiler als die entspannte Kreisform ist. Ein Weg, mit dem superspiralisierte DNA in die offene Kreisform überführt werden kann, ist durch Einzelstrangspaltung mit DNase. Wir fanden, dass die Zugabe von 100 mM EDTA gegenüber 50 mM in dem STET-Puffer die Bildung des offen kreisförmigen Plasmids minimierte. Die Zellsuspension wurde wie beschrieben hergestellt. Die Arbeitsflussrate für diese Läufe betrug etwa 186 ml/Min. Die Temperaturen des Eintritts, Austritts und des Bads betragen 24°C, 92°C bzw. 96°C.
Ein annehmbarer Bereich von Lysetemperaturen wurde bestimmt durch Messung des Prozentsatzes an superspiralisiertem Plasmid, welches für jeden Lauf erzeugt wurde. Die Konzentration an superspiralisiertem Plasmid ist eine Funktion der Austrittstemperatur. Ein annehmbarer Bereich von Lysetemperaturen liegt zwischen 75°C und 92°C. Bei Temperaturen unterhalb 75°C wurde mehr entspanntes kreisförmiges Plasmid erzeugt, am wahrscheinlichsten aufgrund erhöhter DNase-Aktivität. Oberhalb von 93°C scheinen die Niveaus an superspiralisiertem Plasmid verringert zu werden, mutmaßlich aufgrund von Wärmedenaturierung.
Nach kontinuierlicher Wärmelyse und Zentrifugation wurde 1 ml geklärtes Lysat entweder mit 5 μg RNase 2 h lang inkubiert oder unbehandelt eingesetzt. Die RNase- behandelten und unbehandelten Proben wurden dann auf eine Anionenaustauschersäule (Poros Q/M 4,6 × 100) aufgetragen, welche zuvor mit einer 50-50-Mischung der Lösungsmittel A und B [HPLC-Lösungsmittel A: 20 mM Tris/Bis-Propan, pH 8,0; und Lösungsmittel B: 1 M NaCl in 20 mM Tris/Bis-Propan, pH 8,0] äquilibriert worden waren. Die Säule wurde mit Hilfe eines über 100 Säulenvolumina laufenden Gradienten von 50% bis 85% B eluiert. Plasmid in der offenen Kreisform eluiert bei etwa 68% B und superspiralisiertes eluiert bei 72% B.
Wie oben beschrieben, erhöht eine Diafiltration vor der Anionenaustauschchromatographie erheblich die Menge an Lysat, welche auf der Säule aufgetragen werden kann.
Die Plasmid-DNA, welche von der Anionenaustauschersäule eluierte, wurde mittels Umkehrphasen-HPLC-Analyse in die individuellen Formen aufgetrennt. Die Formen sind superspiralisiertes Plasmid (Form 1) und einzelstrang-gespaltener („nicked") Kreis (Form 2). Die beiden Formen wurden leicht getrennt und erlaubten die Isolierung individueller Formen des Plasmids.
BEISPIEL 6
Hochgereinigte Plasmid-DNA aus einem Verfahren auf Chromatographiebasis – Eine Fermentationszellpaste wurde in einem modifizierten STET-Puffer resuspendiert und dann thermisch auf diskontinuierliche Weise lysiert. Alternativ wird eine Fermentationszellpaste in modifiziertem STET-Puffer resuspendiert und dann in dem oben beschriebenen Durchflussverfahren thermisch lysiert. Das Lysat wurde wie oben beschrieben zentrifugiert. 20 ml des Überstands wurden wie oben beschrieben filtriert und auf eine Anionenaustauschersäule (Poros Q/M 4,6 × 100) aufgetragen, welche zuvor mit einer 50-50-Mischung der oben beschriebenen Puffer A und B äquilibriert worden war. Ein Gradient von 50% bis 85% B wurde mit einer Durchflussrate von 10 ml/Min über 50 Säulenvolumina laufen gelassen. Fraktionen von jeweils 2,5 ml wurden von der Säule gesammelt. Die superspiralisierte Plasmid-DNA eluierte bei 72% B von der Säule.
Das Anionenaustauschprodukt wurde dann auf einer Umkehrphasen-Chromatographiesäule (Poros R/H) aufgetragen, welche zuvor mit 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat bei pH 8,0 äquilibriert worden war, und ein Gradient von 0% bis 80% Methanol wurde zur Elution des gebundenen Materials verwendet. Die hochgereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA eluierte bei 22% Methanol.
Auf Grundlage der Agarosegele und der beschriebenen colorimetrischen und HPLC-Assays ist das Endprodukt, in 9 gezeigt, hochrein. Das Produkt besteht aus mehr als 90% superspiralisiertem Plasmid und weniger als 10% offen zirkulärem Plasmid. RNA befand sich unterhalb den Nachweisgrenzen des verwendeten Assays. Genomische DNA und Proteinverunreinigungsniveaus waren ebenfalls unterhalb der Nachweisgrenzen der verwendeten Assays. Die gesamte Ausbeute an superspiralisiertem Plasmid am Ende des Verfahrens betrug etwa 60% des superspiralisierten Plasmids in dem geklärten Lysat.
BEISPIEL 7
Reinigung von Plasmid-DNA in einem Maßstab von mehreren Gramm – 4,5 l eingefrorener E. coli-Zellaufschlämmung wurden dazu verwendet, um 33,7 l Zellsuspension in STET-Puffer (8% Sucrose, 2% Triton, 50 mM Tris-Puffer, 50 mM EDTA, pH 8,5) mit 2500 Einheiten/ml Lysozym herzustellen. Die Extinktion der Suspension bei 600 nm betrug etwa 30 OD. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt, um richtiges Mischen sicherzustellen und wurde dann 45 Minuten lang unter kontinuierlichem Rühren bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Mischen bei Raumtemperatur fortgesetzt und die Zellsuspension wurde mit einer Durchflussrate von 500 ml/Min. durch den Wärmeaustauscher gepumpt. Die Ansatztemperatur wurde bei 100°C gehalten und die Eintritts- und Austrittstemperaturen der Zellsuspension wurden als etwa 24°C bzw. 70–77°C gemessen. Das Zellysat, welches aus dem Wärmeaustauscher austrat, wurde in Beckman-Zentrifugenflaschen (jeweils 500 ml) gewonnen und das Material wurde unmittelbar in Beckman J-21-Zentrifugen für 50 Minuten bei 9000 × UpM zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand befunden, 4–5mal mehr Plasmidprodukt als in dem Fall ohne Lysozym-Inkubation zu enthalten. Das Überstandsprodukt der Zentrifugation wurde unmittelbar gegen 3 Volumina TE-Puffer (25 mM Tris-EDTA bei pH 8,0) diafiltriert und dann mit 20 × 10⁵ Einheiten E. coli-RNase für 2–4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde die Produktlösung dann mit zusätzlichen 6 Volumina TE-Puffer unter Verwendung einer 100-kD-MG-Aussschluss-Membran diafiltriert und dann durch ein 0,45-Mikron-Filter filtriert, um restliche Zelltrümmer zu entfernen. Das filtrierte Lysat wurde mit einem Puffer von 20 mM Bis/Tris-Propan-NaCl bei pH 7,5 auf 0,7 M NaCl verdünnt, was das verdünnte Filtrat für die Auftragung auf die Anionenaustauschersäule vorbereitet. Die Anionenaustauschersäule (3,6 l POROS PI/M) wurde zuvor mit 20 mM Bis/Tris-Propan und 0,7 M NaCl äquilibriert. Das filtrierte Lysat wurde bis zur Säulenkapazität aufgetragen. In diesem Fall wurden 5 Gramm superspiralisiertes Plasmid auf die Anionenaustauschersäule aufgetragen. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit 2–4 Säulenvolumina an 20 mM Bis/Tris-Propan und 0,7 M NaCl gewaschen. Ein Gradient mit 10 Säulenvolumina von 0,7 M NaCl bis 2,0 M NaCl in 20 mM Bis/Tris-Propan wurde durchgeführt, um den größten Teil des E. coli-Proteins, RNA und etwas Endotoxin abzutrennen. Die Fraktion des superspiralisierten Plasmids eluierte zwischen 1,4 M und 2,0 M NaCl. Die superspiralisierte Fraktion von der Anionenaustauschersäule, welche 4 Gramm superspiralisiertes Plasmid enthielt, wurde dann 2–3mal mit pyrogen-freiem Wasser verdünnt, auf 1,2% IPA eingestellt und der pH mit 1 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Die verdünnte superspiralisierte Anionenaustauscherfraktion wurde dann auf eine 7-l-Umkehrphasensäule (POROS R2/M) aufgetragen, welche zuvor mit 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat, enthaltend 1,2% IPA, äquilibriert worden war. In diesem Fall wurden 3,2 Gramm superspiralisiertes Plasmid auf die Umkehrphasensäule aufgetragen und dann wurde die Säule mit 6–10 Säulenvolumina von 1,2% IPA in 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat gewaschen. Diese ausgiebige Waschung wurde durchgeführt, um Verunreinigungen abzutrennen. Anschließend wurde ein Gradient von 1,2% IPA bis 11,2% IPA in 5 Säulenvolumina durchgeführt. Die superspiralisierte Plasmidfraktion eluiert bei etwa 4% IPA. Die superspiralisierte Produktfraktion von der Umkehrphasensäule wurde dann konzentriert und unter Einsatz einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 30 kD in normale Salzlösung diafiltriert. Die endgültige Produktmasse wurde durch ein 0,22-Mikron-Filter filtriert. Die Gesamtproduktausbeute des Verfahrens betrug mehr als 50% des superspiralisierten Plasmids in dem geklärten Zellysat, wie mit dem Anionenaustausch-HPLC-Assay angezeigt.
BEISPIEL 8
Polynukleotid-Impfung in Primaten
Antikörper gegen NP in Rhesusaffen – Rhesusaffen (006 NP, 009 NP oder Kontrolle 101; 021) wurde 1 mg/Stelle an RSV-NP intramuskulär in drei Stellen am Tag 1 injiziert. Injektionen von jeweils 1 mg RSV-LUX und CMV-int-LUX, Konstrukten für die Expression des Reportergens Glühwürmchen-Luciferase, wurden zur gleichen Zeit in separate Stellen verabreicht. Die Tiere erhielten eine erneute Injektion am Tag 15 mit denselben DNA-Mengen wie zuvor und auch mit 1 mg pD5-CAT, einem Konstrukt für die Expression des Reportergens Chloramphenicolacetyltransferase, in jeweils eine Stelle. Muskelstellen, die Reportergene enthielten, wurden einer Biopsie unterworfen und hinsichtlich Aktivität des Reportergens untersucht. Serum wurde 3, 5, 9, 11, 13 und 15 Wochen nach der ersten Injektion gewonnen. Die erste positive Probe für Anti-NP-Antikörper wurde in der Woche 11 gewonnen und positive Proben wurden ebenfalls in den Wochen 13 und 15 gewonnen. Anti-NP-Antikörper wurde mittels ELISA bestimmt.
Hämagglutinations-inhibierender (HI)-Antikörper in Rhesusaffen – Affen wurde intramuskulär V1J-PR-HA am Tag 1 injiziert. Zwei Tiere erhielten jeweils 1 mg, 100 μg oder 10 μg DNA in jeden Quadriceps-Muskel. Jede Injektion wurde in einem Volumen von 0,5 ml verabreicht. Den Tieren wurde vor der Injektion am Tag 1 Blut entnommen. Allen Tieren wurde am Tag 15 erneut DNA injiziert und Blut wurde danach in zwei- bis vierwöchigen Intervallen entnommen. Hämagglutinations-Inhibierungs (HI)-Titer gegen A/PR/8/34 waren nach 5 Wochen, 9 Wochen und 12 Wochen nach der ersten Injektion von V1J-PR-HA-DNA positiv.
BEISPIEL 9
Wirkung des Behältertyps und der DNA-Konzentration auf die DNA-Stabilität – Die Umwandlung von superspiralisierter Plasmid-DNA in ihre offen zirkulären und linearen Formen ist eine größere physikalisch-chemische Veränderung, die bei in vitro-Lagerung stattfindet. In den Beispielen 9–16 wurden die Wirkungen einer Vielfalt von Lagerungsbedingungen auf die Stabilität von Plasmid-DNA beobachtet, indem die chemische Spaltung des Phosphodiestergerüsts, welche zur Konformationsumwandlung von superspiralisierter Plasmid-DNA in offen zirkuläre und lineare Formen führt, überwacht wurde. Zur Überwachung dieser Veränderung wurde Plasmid-DNA (Influenza-DNA-Vakzin, HA (Georgia/93)) formuliert, erforderlichenfalls durch sterile Filtration sterilisiert, in sterile, mit einem Verschluss versehene Glasgefäße (0,8 ml in 3-ml-Gefäßen) eingebracht und bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurde ein einzelnes Gefäß von jeder speziellen Formulierung aus dem Inkubator entnommen und bei –70°C eingefroren. Jedes Gefäß wurde dann aufgetaut und 20 ng DNA aus dem Gefäß wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgebracht und 90 Minuten lang elektrophoresiert. Das Gel wurde dann mit Ethidiumbromid angefärbt, entfärbt und unter UV-Beleuchtung fotografiert. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an superspiralisierter, offen zirkulärer und linearer DNA in jeder Probe wurde das Negativ der Gelfotografie mit einem Bio-RAD (GS-670)-Densitometer gescannt. Die Extinktionsdaten für jede Spur auf dem Gel wurden dann mit der Extinktion einer Reihe von superspiralisierten, offen zirkulären und linearen DNA-Standards auf demselben Gel mit Hilfe eines Computerprogramms (Molecular Analyst, Version 1.3, BIO-RAD Laboratories) verglichen. Die Extinktion der DNA-Standards wurde dazu verwendet, um eine Standardkurve für superspiralisierte, offen zirkuläre und lineare DNA zu erstellen. 7 DNA-Standards einer jeden Form wurden auf das Gel aufgebracht (1 bis 30 ng superspiralisierter DNA, 0,1875 bis 15 ng offen zirkulärer und linearer DNA). Zur Darstellung der Stabilität der DNA über die Zeit wurde die Menge an superspiralisierter DNA in der Probe zum Zeitpunkt 0 auf 100% normalisiert (der anfängliche Prozentsatz an superspiralisierter DNA lag normalerweise im Bereich von 90–100%). Die Stabilität der DNA-Proben wurde dann ausgedrückt als Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA, welcher nach einem gewissen Inkubationszeitraum verblieb. Obwohl sie jeweils durch Probenentnahme aus einem einzigen Gefäß bestimmt wurden, wurden gewöhnlich mehrere Zeitpunkte genommen, um die Beobachtung eines abnehmenden Prozentsatzes superspiralisierter DNA, der über einen längeren Zeitraum verblieb, zu ermöglichen. Für Proben, die bei 50°C inkubiert wurden, waren die Probennahmezeitpunkte gewöhnlich nach 1, 2, 4, 6 und 8 Wochen, während die Proben bei 4, 25 und 37°C nach 1, 2, 3 und manchmal 6 Monaten analysiert wurden.
Unter Verwendung von chromatographisch gereinigter Plasmid-DNA wurden Vorformulierungsversuche initiiert, um den potentiellen Mechanismus des Plasmidabbaus während in vitro-Lagerung unter einer Vielfalt von Lagerbedingungen festzustellen. Zur Untersuchung der Stabilität des Influenza-DNA-Vakzins (Georgia/93) während Exposition gegenüber verschiedenen Behältertypen wurde Plasmid-DNA (100 μg/ml in Salzlösung) in verschiedenen Behältern für 6 Monate bei 5, 24 und 37°C inkubiert. Die Ergebnisse (1A, 1B, 1C und 1D) zeigten an, dass Glasgefäße Gefäßen aus silikonisiertem Glas, autoklaviertem Kunststoff oder gamma-bestrahltem Kunststoff zur Stabilisierung der DNA überlegen waren. Zur Feststellung der Wirkung der DNA-Konzentration auf die Stabilität wurde Plasmid-DNA mit 20, 100 und 1800 μg/ml in Salzlösung 6 Monate bei 37°C inkubiert. Eine Analyse des Gehalts an superspiralisierter DNA zeigte an, dass die Stabilität dosisabhängig war, wobei höhere Konzentrationen an Plasmid während der Lagerung bei 37°C stabiler waren (2). Weitere Studien hinsichtlich der Wirkung der DNA-Konzentration mit der in Salzlösung oder PBS formulierten DNA zeigten auch an, dass höhere Konzentrationen bei 2 bis 8°C (Tabelle 1A) und bei –70°C (Tabelle 1B) stabiler waren.
Tabelle 1: Stabilitätsdaten für Formulierungen des Influenza-DNA-Vakzins HA (Georgia/93), bei (A) 2 bis 8°C und (B) –70°C gelagert
DNA-Stabilitätsexperimente zeigen, dass die zum Verschließen der Glasgefäßbehälter verwendeten Gummistopfen eine abträgliche Auswirkung auf die DNA-Stabilität haben. Tabelle 2 zeigt die Wirkungen von drei Stopfentypen auf die DNA-Stabilität in zwei verschiedenen DNA-Vakzin-Formulierungen. Die Gefäße (enthaltend die DNA-Lösungen, 2 μg/ml) wurden bei 50°C sowohl in der Konfiguration mit der richtigen Seite nach oben als auch umgedreht inkubiert, um die Wirkung der Stopfen auf die DNA-Stabilität zu festzustellen. Die DNA war bei jedem getesteten Stopfentyp stabiler, wenn die Gefäße in der Konfiguration mit der richtigen Seite nach oben inkubiert wurden. Ferner erhöht die Zugabe von Ethanol die DNA-Stabilität und verringert die abbauende Wirkung des Stopfens. Für den Stopfen Nr. 3 (Tabelle 2) eliminierte die Zugabe von Ethanol die Abbauwirkung des Stopfens auf die DNA-Stabilität vollständig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Stopfen zu dem DNA-Abbau während der Lagerung beiträgt und dass Ethanol verwendet werden kann, um die Abbauwirkungen einiger Stopfentypen auf die DNA-Stabilität zu kontrollieren.
Zur Feststellung, wie stark der Stopfen die Stabilität von DNA in Glasgefäßen beeinflusst, wurde ein Experiment durchgeführt, um die Stabilität von DNA in Glasgefäßen mit drei verschiedenen Arten von Stopfen und in versiegelten Glasampullen über 8 Wochen bei 50°C festzustellen. Tabelle 3 zeigt Formulierungen mit und ohne Succinat (einem DNA-Stabilitätsverstärker), die DNA war in versiegelten Glasampullen signifikant stabiler als in Glasgefäßen mit einem der getesteten Stopfen. Es gab auch nur geringe Unterschiede in der DNA-Stabilität bei den Gefäßen mit den drei verschiedenen Stopfentypen. Diese Daten zeigen an, dass verschiedene Stopfentypen in vier verschiedenen Formulierungen (Tabellen 2, 3) signifikant zu dem DNA-Abbau beitragen. Die Optimierung der DNA-Stabilität in Glasgefäßen wird das Testen mehrerer Stopfentypen erfordern und kann auch die Zugabe von Radikalfängern wie Ethanol erfordern, um Abbauwirkungen des Stopfens zu kontrollieren.
BEISPIEL 10
Wirkung der Salzkonzentration auf die DNA-Stabilität – Zur Untersuchung der Wirkung der Salzkonzentration auf die DNA-Stabilität wurde ein erstes Experiment entwickelt, um die Schmelztemperatur (Tm) der DNA über ein Spektrum von NaCl-Konzentrationen von 0 bis 200 mM festzustellen. Zur Feststellung der Tm bei jeder Konzentration von NaCl wurde die UV-Extinktion von Plasmid-DNA (10 μg/ml DNA), die in 10 mM Natriumphosphat (pH 6,0) formuliert war, bei 260 nm überprüft, während die Temperatur erhöht wurde. Die Ergebnisse (3) zeigten eine Tm von 72°, 73°, 78° und 82°C für 0, 5, 20 bzw. 50 mM NaCl an. Der Tm-Wert für 100 und 200 mM NaCl konnte nicht bestimmt werden, da die starke Stabilisierungswirkung des Salzes die Tm auf mehr als 90°C erhöhte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die minimale NaCl-Konzentration, welche erforderlich ist, um die maximale thermische DNA-Stabilität zu ergeben, im Bereich von 100–200 mM liegt.
Zur Untersuchung der Wirkung der NaCl-Konzentration auf die Umwandlungsrate von superspiralisierter DNA in offen zirkuläre DNA während der Lagerung wurde Plasmid-DNA (100 μg/ml) in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) formuliert, wobei NaCl von 1 bis 320 mM variierte. Die Lösungen wurden 48 h lang bei 60°C inkubiert und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse (4) zeigten eine Erhöhung der DNA-Stabilität an, wenn die NaCl-Konzentration von 1 auf 160 mM erhöht wurde, und keinen signifikanten Stabilitätsunterschied zwischen 160 und 320 mM. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit denjenigen von 3 und legen nahe, dass die minimale NaCl-Konzentration, welche für eine maximale DNA-Stabilität erforderlich ist, zwischen 100–200 mM liegt.
Zur Untersuchung der Wirkung zweiwertiger Kationen auf die DNA-Stabilität wurde Plasmid-DNA in entweder TE, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Salzlösung (0,9% NaCl) in Gegenwart von ZnCl₂, CaCl₂, MnCl₂ oder MgCl₂ formuliert. Die DNA-Lösungen (100 μg/ml) wurden 48 h lang bei 60°C inkubiert und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse (5A, 5B und 5C) zeigten an, dass Zinkionen die DNA-Stabilität nicht verbesserten. Jedoch war die Wirkung von Calciumionen variabel. In TE und Salzlösung verbesserten Calciumionen die Stabilität, während in PBS Calciumionen die Stabilität nicht erhöhten. Manganionen verbesserten die Stabilität in TE, jedoch nur in niedrigen Konzentrationen. In PBS und Salzlösung verbesserten Manganionen die Stabilität nicht. Magnesiumionen erhöhten die DNA-Stabilität in allen drei Formulierungen, jedoch nur bei hohen Konzentrationen in Salzlösung.
BEISPIEL 11
Wirkung des Puffertyps und pH-Werts auf die DNA-Stabilität – In der Vergangenheit wurde Plasmid-DNA in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelagert, wobei routinemäßig molekularbiologische Manipulationen in Salzlösung und destilliertem Wasser durchgeführt wurden. Folglich erschien es uns notwendig, einen geeigneten Puffer zu prüfen und zu definieren, in dem Plasmid-DNA sowohl gelagert als auch für zukünftige Formulierungsexperimente manipuliert werden konnte. Als anfängliche Studie wurde DNA in verschiedene Puffer bei verschiedenen pH-Werten inkorporiert und bei verschiedenen Temperaturen gelagert. Plasmid-DNA wurde mit 500 μg/ml in PBS bei pH 4,5, 7,2 und 9,0, TE bei pH 8,0 und 10, destilliertem Wasser (pH 6,0), Salzlösung (pH 6,0) und TFA (Trifluoressigsäure; 0,1%) bei pH 2,0 formuliert. Proben wurden bei 4° und 24°C gelagert und dann in einwöchigen, vierwöchigen und zwölfwöchigen Intervallen durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt die Konformationsstabilität von DNA-Plasmid, das bei verschiedenen pH-Werten gelagert wurde. Die Proben wurde mittels Agarosegelelektrophorese analysiert; (+) superspiralisiert, (+/–) superspiralisiert/offen zirkulär, (–) hauptsächlich offen zirkulär ("genicktes" Plasmid). Diese Daten zeigen, dass bei niedrigem pH-Wert (2,0–4,5) DNA schnell abgebaut wird, während es bei hohem pH-Wert (7,2–9,0) wenig Abbau gibt. Beispielsweise war Plasmid-DNA, die in sowohl TE als auch PBS bei pH-Werten von 7 bis 10 gelagert wurde, bis zu 12 Wochen bei 4°C stabil. Zur weiteren Untersuchung dieser pH-Wirkung auf die Konformationsstabilität von DNA-Plasmid wurde eine UV-Schmelzkurve über den pH-Bereich von 4,5–10 erstellt (6). Diese Technik ermöglicht die Feststellung der relativen Stabilität von DNA bei verschiedenen pH-Werten durch Messung des Schmelzpunktübergangs (Tm), der als Ergebnis der Basenpaar-Trennung auftritt, was zu einer erhöhten Extinktion bei 260 nm führt. Die Ergebnisse zeigen, dass mit abnehmendem pH-Wert die Extinktion der DNA bei 260 nm bei einer niedrigeren Temperatur ansteigt, somit eine niedrigere Tm. Dies weist darauf hin, dass doppelsträngige DNA bei niedrigeren pH-Werten weniger geordnet ist und dass die ungepaarten Bereiche des Moleküls bei niedrigerem pH-Wert bruchanfälliger sind. Ein weiterer hervorzuhebender Punkt ist, dass die Plasmid-DNA unter diesen Bedingungen ziemlich resistent gegenüber einer Wärmedenaturierung war. Nachdem eine Erwärmung auf 90°C keine vollständige Denaturierung von doppelsträngiger DNA verursachte, konnte keine präzise Tm festgestellt werden.
Zur schnellen Untersuchung der Lagerungsbedingungen, welche am besten für eine Langzeit-DNA-Lagerung geeignet sind, wurden beschleunigte Stabilitätsstudien etabliert, wobei Proben bei 60°C für 48 h gelagert und dann mittels Agarosegelelektrophorese analysiert wurden. Frühere Ergebnisse (Tabelle 1) weisen darauf hin, dass eine Lagerung unter einem pH-Wert von 6,0 problematisch für die DNA-Stabilität ist und dass entweder Salz oder EDTA (oder beide) erforderlich sein können, um sie gegenüber Konformationsabbau zu stabilisieren. Somit wurden zwei Puffer, PBS und TE (Tris-EDTA), hinsichtlich ihres Vermögens zur Stabilisierung von Plasmid in dem pH-Bereich von 6,0–8,5 analysiert. Plasmid-DNA-Proben wurden mit 100 μg/ml in dem geeigneten Puffer formuliert. Das Ausgangsmaterial enthielt 90% der superspiralisierten Spezies. Die Ergebnisse sind in 7A gezeigt. Nach Inkubation bei 60°C für 48 h besaßen Proben, die in TE bei pH 7,5–8,5 gelagert worden waren, 10–25% verbleibendes superspiralisiertes Plasmid, während die in PBS formulierten (pH 7,5–8,5) 50% superspiralisiertes Plasmid enthielten. Ferner hatte TE keine ersichtliche stabilisierende Wirkung auf die DNA bei pH 6,5–7,0, während PBS eine leichte Stabilisierungswirkung im selben pH-Bereich zeigte. Kein Puffer verhinderte den Abbau bei pH 6,0.

Die Ergebnisse der beschleunigten Studien zeigten an, dass sowohl pH-Wert als auch Salz wichtige Parameter zur Optimierung sind, um DNA während der Lagerung zu stabilisieren. Diese einleitenden Ergebnisse legten nahe, dass PBS ein besserer Stabilisator als TE ist. Es war jedoch nicht klar, ob die Stabilisierungswirkung von PBS auf die Anwesenheit von Phosphationen oder die Anwesenheit von NaCl zurückzuführen war. Ferner musste die Frage, ob ein Metallionenchelator DNA stabilisieren würde, eingehender untersucht werden. Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine beschleunigte Stabilitätsstudie (60°C, 48 h, 100 μg/ml DNA) durchgeführt, wobei PBS mit EDTA oder zusätzlichem Phosphat ergänzt war und TE mit NaCl oder Phosphat ergänzt war. Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass die Zugabe von EDTA oder Phosphat zu PBS die Stabilität von DNA gegenüber Abbau nicht erhöhte. Jedoch erhöhte die Zugabe von 150 mM NaCl zu TE-Puffer die Stabilität von DNA im Vergleich zu nicht ergänztem TE. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Stabilisierungswirkung von PBS gegenüber TE auf die Anwesenheit von 150 mM NaCl in dem PBS zurückzuführen war. Tabelle 5

Formulierung	Verbleibende % der superspiralisierten DNA
PBS (pH 7,2)	50
PBS + 1 mM EDTA	50
PBS + 20 mM Natriumphosphat	50
PBS + 100 mM Natriumphosphat	50
PBS (pH 6,0)	0
PBS (pH 10,0)	50
TE + 20 mM Natriumphosphat	10
TE	10
Salzlösung (pH 8,0)	0
TE + 150 mM NaCl	50
PBS + 10 mM EDTA	50

Tabelle 5 zeigt die Konformationsstabilität von Plasmid-DNA bei 60°C für 48 h in verschiedenen Puffern. Zum Zeitpunkt Null enthielten die Proben 90% superspiralisierte DNA. Nachdem die Anwesenheit von NaCl in dem PBS der Grund für die verbesserte DNA-Stabilität im Vergleich zu TE sein schien, wurde eine weitere Studie begonnen, um Salzlösung mit PBS zu vergleichen. Für diese Experimente wurde Plasmid-DNA (chromatographisch rein) direkt in hoher Konzentration (2,0–2,5 mg/ml) in 0,9% NaCl formuliert. Probenstabilitätsstudien unter Verwendung dieser DNA wurden mit einer niedrigen Konzentration von Plasmid (2 μg/ml), formuliert in entweder einem PBS-Puffer (pH 7,2) oder 0,9% NaCl, auf pH 6, 7 und 8 eingestellt, durchgeführt. Der Gehalt des Plasmids an superspiralisierter DNA wurde mittels Agarosegelelektrophoresen über drei Monate bei 25° und 37°C überwacht. Wie in 8A (37°C) und 8B (37°C) gezeigt, nahm die Verlustrate an superspiralisierter Plasmid-DNA zu, wenn der anfängliche pH-Wert des in Salzlösung formulierten Materials erniedrigt wurde. Das in Salzlösung formulierte Material behielt den pH-Wert über die Zeit nicht bei. Beispielsweise besaß nach zwei Monaten bei 37°C das in Salzlösung formulierte Plasmid (anfänglicher pH von 6, 7 und 8) einen pH-Wert von 5,9, 6,0 bzw. 6,3. Im Gegensatz dazu behielt das in PBS formulierte Material seinen pH-Wert (7,1–7,2) über denselben Inkubationszeitraum bei. Das in PBS formulierte Material enthielt auch den höchsten Prozentsatz an Superspiralgehalt mit einem mehr oder weniger gleich bleibenden Niveau an superspiralisiertem Plasmid nach drei Monaten bei 25°C.
Mit abnehmendem Gehalt an superspiralisiertem Plasmid wurde eine gleichzeitige Zunahme der offen zirkulären Form des Plasmids mittels Agarosegelelektrophorese beobachtet. Nach längeren Zeiträumen wandelt sich die offen zirkuläre Form in lineare Plasmid-DNA um. Beispielsweise enthält nach 3 Monaten bei 37°C das bei pH 6 und pH 7 in Salzlösung formulierte Material (anfänglich 92 bis 93% superspiralisierte Plasmid-DNA enthaltend) 0% der anfänglich superspiralisierten, ~36% offen zirkuläre und ~64% lineare Plasmid-DNA.
Zur Feststellung, ob die Trends, welche bei dem in Salzlösung gegenüber dem in PBS formulierten Probenmaterial unter beschleunigten Bedingungen beobachtet wurden, einem Material unter nicht-beschleunigten Lagerungsbedingungen entsprechen, wurde eine Stabilitätsstudie entwickelt. Plasmid-DNA wurde in niedrigen, mittleren und hohen Dosen in sowohl Salzlösung (2, 20 und 2200 μg/ml Plasmid) als auch PBS (2, 20, 1000 μg/ml Plasmid) formuliert. Sowohl der pH-Wert der Lösung als auch der Superspiralgehalt wurden während der Lagerung bei 2–8°C und –70°C überprüft. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war das in PBS formulierte Material hinsichtlich pH und Gehalt an superspiralisierter Plasmid-DNA während der Lagerung für bis zu 3 Monate beständiger.
Zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Pufferionen und des pH-Werts auf die DNA-Stabilität wurden mehrere Lots von Plasmid-DNA mit mehreren verschiedenen Puffer/pH-Kombinationen formuliert und 3 Monate lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass die Stabilität von einem Lot DNA zu einem anderen Lot hoch variabel ist, dass ein saurer pH-Wert der Stabilität abträglich ist und dass Formulierungen mit einer höheren DNA-Konzentration stabiler waren. Die Variabilität von Lot zu Lot kann auf einem variierenden Gehalt an Spurenmetallen beruht haben. Die Ergebnisse von Tabelle 6 legten nahe, dass bestimmte Puffer/pH-Kombinationen eine weitere Untersuchung erfordern würden. Die aussichtsreichsten Kombinationen, welche mit dieser Studie identifiziert wurden, waren Natriumhydrogencarbonat (pH 7,2), PBS (pH 7,2–8,0) und Natriumsuccinat (pH 7,2).
Tabelle 6 Tabelle 6: Zusammenfassung der Stabilität der Proben 3–9; zur Untersuchung der Wirkung von Pufferionen und pH-Wert auf die Stabilität des Influenza-DNA-Vakzins HA (Georgia/93) während der Lagerung bei 37°C. Der verbleibende Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Verbleibender Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA nach drei Monaten bei 37°C
Tabelle 7
Zur Untersuchung der Frage, ob die Zugabe eines Puffers zu Salzlösung die Stabilität der DNA verbessert, wurde eine Studie begonnen, um die Wirkungen von Salzlösung allein mit Salzlösung in Kombination mit vier verschiedenen Puffern zu vergleichen. Für diese Studie wurde DNA mit 20 μg/ml formuliert und 3 Monate lang bei 37°C inkubiert. Der Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Ergebnisse, in 7B gezeigt, zeigen klar an, dass die Zugabe von entweder einem Natriumhydrogencarbonat-, Phosphat-, Hepes- oder Tris-Puffer die Stabilität der DNA im Vergleich zu Salzlösung alleine verbesserte. Die Daten legten auch nahe, dass es größere Unterschiede in den Stabilisierungswirkungen der Pufferionen gibt. Ferner legen die Ergebnisse nahe, dass die DNA-Stabilität in Bezug zur Aufrechterhaltung des pH-Werts steht. Wie in 7B zu sehen, wiesen die Kombination Tris/Salzlösung und insbesondere Salzlösung alleine die geringste Stabilisierungswirkung auf die DNA auf und hielten keinen konstanten pH-Wert über die 3 Monate der Inkubation aufrecht. Deshalb ist eine der Funktionen des Puffers bezüglich der Stabilisierung von DNA das Halten des pH-Werts in dem neutralen bis leicht basischen Bereich. Obwohl eine weitere Funktion des Puffers in der Stabilisierung der DNA gegenüber Abbauwegen besteht, zeigen diese Ergebnisse an, dass verschiedene Puffer unterschiedliche Kapazitäten zur Stabilisierung von DNA aufweisen, und weitere Arbeiten waren erforderlich, um die speziellen Puffer zu identifizieren, welche die größte Stabilisierungswirkung besitzen. Diesbezüglich waren diese Daten das erste Indiz, dass Natriumhydrogencarbonat DNA während der Lagerung stabilisiert.
Die Wirkungen von zusätzlichen Puffer/pH-Kombinationen auf die DNA-Stabilität sind in Tabelle 7 gezeigt. In dieser Studie wurde die DNA in verschiedenen Puffer/pH-Kombinationen formuliert und einen Monat lang bei 5°, 24° und 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Prozentsatz der anfänglichen superspiralisierten DNA mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Ergebnisse zeigten an, dass die beste Puffer/pH-Kombination Tricin bei pH 7,5 war. Jedoch ergaben mehrere andere Kombinationen eine Stabilität oberhalb derjenigen von Natriumphosphat bei pH 7,5, einschließlich Natriumsuccinat (pH 6,2), Natriummalat (pH 6,2) und Tris (pH 7,5). Zusätzliche Studien, welche wiederum für den Vergleich der aussichtsreichsten Puffer/pH-Kombinationen entwickelt wurden, sind bei 4°, 25°, 37° und 50°C im Gange.
Zur Feststellung, ob die Pufferionen in der DNA-Vakzin-Formulierung die Immunreaktion beeinflussen würden, wurde die induzierte Immunreaktion auf das Influenza-DNA-Vakzin HA (Georgia/93) bei mehreren Dosen von DNA durch Messung des HI-Titers gemessen. Die in 9 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass die Immunreaktion auf das DNA-Vakzin, welches in PBS formuliert war, der für in Salzlösung formulierter DNA beobachteten Reaktion überlegen war.
Zur Feststellung der Wirkungen des pH-Werts auf die DNA-Stabilität über ein breites pH-Spektrum wurde ein Stabilitätsexperiment in 20 mM Bis-Tris-Propan, enthaltend 150 mM NaCl, von pH 6,0 bis 9,0, durchgeführt. Die Ergebnisse des Stabilitätstests nach zwei Wochen Inkubation bei 50°C (2 μg/ml DNA) sind in 13 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen klar an, dass der pH-Wert der Formulierung die Stabilität der DNA stark beeinflusst und dass der optimale pH-Wert > 8,5 ist. Nachdem die Stabilität der DNA in der PBS-Kontrolle, bei pH 7,1, nahezu gleich derjenigen der DNA in Bis-Tris-Propan bei pH 7,5 war, legen die Ergebnisse nahe, dass der Puffertyp ebenfalls die Stabilität der DNA bei einem gegebenen pH-Wert beeinflusst.
Zur Untersuchung der Wirkungen des Puffertyps auf die DNA-Stabilität wurde ein Stabilitätsexperiment mit DNA bei 20 μg/ml in 7 verschiedenen Formulierungen durchgeführt. Nachdem frühere Experimente gezeigt hatten, dass die Reinheit des Puffers die DNA-Stabilität beeinflusste, wurden 10 mM Succinat und 2% Ethanol jeder Formulierung zugegeben, um die radikalische Oxidation der DNA zu inhibieren (die in den Beispielen 14 und 15 präsentierten Daten zeigen, dass Succinat und Ethanol jeweils die DNA-Stabilität erhöhen). Die Ergebnisse (14) zeigen an, dass die Formulierung, welche die höchste DNA-Stabilität ergab, auch die bei dem höchsten verwendeten pH-Wert war (pH 9). Es wurden jedoch auch einige Pufferwirkungen beobachtet. Die größte Pufferwirkung gab es zwischen Glycin und Bis-Tris-Propan, wobei die Daten anzeigen, dass die Glycin-Formulierung bei pH 9 der Bis-Tris-Propan-Formulierung bei dem gleichen pH-Wert signifikant überlegen war. Im Gegensatz dazu ergaben die Tris-, Bicin- und Tricin-Puffer bei pH 8,2 nahezu identische DNA-Stabilität bis zu 12 Wochen. Die Daten zeigen auch an, dass die beiden Phosphatformulierungen (bei pH 7,7 und 8,0) die niedrigste DNA-Stabilität ergaben, sie jedoch auch die Formulierungen mit dem niedrigsten getesteten pH-Wert waren. Aufgrund der niedrigen Pufferkapazität von Phosphatpuffern oberhalb von pH 8,0 waren die Phosphatformulierungen auf pH-Werte bei oder unterhalb von 8,0 beschränkt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sobald die radikalische Oxidation der DNA durch die Zugabe von Chelatoren (siehe Beispiel 15 hinsichtlich Daten, die zeigen, welche Chelatoren die DNA-Stabilität erhöhen und unter welchen Bedingungen) und Radikalfängern (siehe Beispiel 14 hinsichtlich Daten, welche die Erhöhung der DNA-Stabilität durch Ethanol zeigen) kontrolliert wird, die Stabilität der DNA primär durch den pH-Wert der Formulierung kontrolliert wird.
BEISPIEL 12
Wirkung von Licht auf die DNA-Stabilität – Zunächst wurde die Lichtsensitivität des Materials beurteilt, um festzustellen, ob spezielle Handhabungsprozeduren erforderlich sein würden oder ob bernsteinfarbene Gefäße für die Langzeitlagerung erforderlich sein würden. Die Ergebnisse eines Experiments zur Messung der Lichtsensitivität (10) wiesen darauf hin, das die Exposition von 100 μg/ml Plasmid-DNA in Salzlösung gegenüber Licht die Umwandlung von superspiralisiertem DNA-Plasmid in die offene zirkuläre Form beschleunigte, wie gemessen durch Agarosegelelektrophorese. Die Umwandlung in die offene zirkuläre Form war erwartungsgemäß weit ausgeprägter, wenn die DNA in klaren Glasgefäßen gelagert wurde, im Gegensatz zu bernsteinfarbenen Gefäßen. Obwohl eine zwei- bis vierwöchige Exposition gegenüber Licht einen signifikanten Abbau verursachte, wurden keine signifikanten Verluste über einen 8-Stunden-Tag beobachtet. Nachdem bernsteinfarbene Gefäße das Potential aufweisen, im Laufe der Zeit Spurenmetallionen abzugeben, welche die radikalische Oxidation der DNA katalysieren (siehe unten), ist eine Verpackungslösung für die Lichtsensitivität des Plasmids zur Langzeitlagerung erforderlich.
Zur Feststellung der Wirkungen von Licht auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Fe⁺³, Metallionenchelatoren und Radikalfänger enthalten, wurde eine Stabilitätsstudie über 9 Wochen bei 30°C in Gegenwart und Abwesenheit von sichtbarem Licht durchgeführt (Fluoreszenzlicht bei 2000 Lux). Die DNA-Konzentration betrug 20 μg/ml und der Formulierungspuffer war 10 mM Natriumphosphat mit 150 mM NaCl bei pH 8,0. Die in den 27 und 28 unten gezeigten Ergebnisse zeigten an, dass Licht die Stabilität der DNA in der PBS-Kontrolle und in PBS, enthaltend 500 ppb Fe⁺³, oder PBS, enthaltend 0,5 mM EDTA und 500 ppb Fe⁺³, signifikant erhöhte. Die Ergebnisse zeigten auch an, dass die Anwesenheit von 0,5 mM EDTA die schädlichen Wirkungen von Licht auf die DNA-Stabilität in Gegenwart von 500 ppb Fe⁺³ nicht verringerten. Die Ergebnisse in 16 zeigen die Wirkungen von Licht auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die EDTA und Ethanol enthalten. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Anwesenheit von EDTA und Ethanol die DNA in den Proben in Licht und Dunkelheit im Vergleich zu der Kontrollformulierung in 15 stark stabilisierte. Die Ergebnisse zeigten auch an, dass die schädlichen Wirkungen von Licht auf die DNA-Stabilität durch die Anwesenheit von EDTA und Ethanol stark verringert wurden, sogar in Formulierungen, die 500 ppb Fe⁺³ enthielten. Somit legen die Ergebnisse nahe, dass DNA-Vakzin-Formulierungen, die EDTA und Ethanol enthalten, für die schädlichen Wirkungen von Licht und Spurenmetallionen wesentlich weniger anfällig sein würden als Formulierungen, denen einer dieser beiden Stabilisatoren fehlt.
BEISPIEL 13
Wirkung der Entmetallisierung und Desoxygenierung auf die DNA-Stabilität: Verfahren zur Entmetallisierung von PBS – Zur Herstellung von entmetallisiertem PBS wurden 20,0 g Chelex 100-Harz (BIO-RAD Laboratories) mit 400 ml USP-Wasser mittels Vakuumfiltration über eine Celluloseacetat-Membran (0,22 Mikrometer Porengröße) gewaschen. Das gewaschene Harz wurde zu ungefähr 1 Liter PBS zugegeben und langsam über Nacht bei 2–8°C gerührt, indem ein Magnetrührstab in die Ein-Liter-Flasche, welche die Aufschlämmung enthält, plaziert und ein Magnetrührer eingesetzt wurde, der auf seine langsamste Rührgeschwindigkeit eingestellt war. Am folgenden Tag wurde das Harz durch eine sterile Vakuumfiltration unter Verwendung einer Celluloseacetat-Membran (Corning, 0,22 Mikron Porengröße) entfernt. Es wurde sorgfältig darauf geachtet, dass die Membran mit zwei 10-ml-Auftragungen der entmetallisierten Aufschlämmung vor der Gewinnung des filtrierten Endprodukts vorgewaschen wurde. Dieser Schritt wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass ein etwaiges potentielles Austreten von Metallionen aus der Membran das entmetallisierte Produkt nicht kontaminieren würde.
Verfahren zur Entmetallisierung von Plasmid-DNA – Zur Entmetallisierung von Lösungen, welche Plasmid-DNA enthielten, wurde die DNA mit entmetallisiertem PBS auf ein Endvolumen von etwa 2 ml verdünnt. Die DNA wurde dann auf eine 1-ml-Chelex-100-Säule aufgetragen, die zuvor durch Waschen der Säule mit 5 ml entmetallisiertem PBS äquilibriert worden war. Die entmetallisierte DNA in dem Ausfluss wurde gewonnen, gefolgt von der Zugabe von 6 ml zusätzlichem entmetallisiertem PBS, um die verbleibende DNA von der Säule zu waschen. Der gesamte Ausfluss wurde dann auf ein Endvolumen von 12,0 ml mit entmetallisiertem PBS verdünnt und steril mit einem Millipore Millex-GV 25-mm-Spritzenfilter (0,22 Mikron Porengröße) filtriert. Unsere anfänglichen Experimenten beinhalteten die Entmetallisierung von nur 48 Mikrogramm DNA mit einer 1-ml-Säule, jedoch wird die Kapazität des Chelex 100-Harzes die Entmetallisierung von wesentlich größeren Mengen an DNA mit derselben Säulengröße erlauben.
Verfahren zur Desoxygenierung von PBS und entmetallisiertem PBS – Zur Herstellung von desoxygeniertem (entgastem) PBS oder desoxygeniertem und entmetallisiertem PBS wurden 250 ml des Puffers bis zum Sieden in einer Pyrex-Flasche erwärmt. Die Lösung wurde dann unter kontinuierlichem Durchperlen von Helium auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und verschlossen.
Verfahren zur Herstellung von desoxygenierter oder desoxygenierter und entmetallisierter Plasmid-DNA – Zur Herstellung von desoxygenierten DNA-Lösungen für Stabilitätsstudien wurde Influenza-Vakzin-DNA, HA (Georgia/93), in sterilem desoxygenierten PBS verdünnt. Die ursprüngliche Stamm-Influenza-Vakzin-DNA wurde nicht desoxygeniert, da sie über 1000fach verdünnt wurde (von 2,55 mg/ml auf 2,0 μg/ml). Die desoxygenierte DNA-Lösung wurde dann in sterile Glasgefäße eingebracht und nach dem Fluten des Kopfraums mit filtriertem Stickstoff verschlossen. Zur Herstellung von desoxygenierten und entmetallisierten DNA-Lösungen für Stabilitätsstudien wurde Influenza-Vakzin-DNA, HA (Georgia/93), zuerst in entmetallisiertem und desoxygeniertem PBS verdünnt. Die Lösung wurde dann auf eine 1-ml-Chelex-100-Säule aufgetragen, um die DNA zu entmetallisieren. Die Lösung wurde dann mit zusätzlichem desoxygenierten und entmetallisierten PBS verdünnt, filter sterilisiert und unmittelbar vor dem Füllen der Gefäße mit Helium gespült. Der Kopfraum eines jeden Gefäßes wurde vor dem Verschließen mit filtriertem Stickstoff geflutet.
Tabelle 6 enthält die Ergebnisse eines Experiments zur Feststellung der Stabilität von Plasmid-DNA in PBS (pH 7,2) und entmetallisiertem PBS. Die Ergebnisse zeigen eine Verbesserung der DNA-Stabilität in entmetallisiertem PBS gegenüber den Kontrollbedingungen an und legen nahe, dass die Stabilität eines DNA-Vakzins stark erhöht würde, wenn es in einem entmetallisiertem Puffer gelagert würde. Ferner war DNA, die in entmetallisiertem PBS gelagert wurde, weit stabiler als man bei Verwendung der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung voraussagen würde. Depurinierung und β-Eliminierung sind zwei aufeinander folgende chemische Reaktionen bei dem Prozess des Aufbrechens des Phosphodiestergerüsts der DNA, welcher in wässeriger Lösung stattfindet. Bei dem ersten Schritt katalysiert [H⁺] die Entfernung von Purinbasen von DNA, was eine purinfreie Stelle (AP-Stelle) zurücklässt. Bei dem zweiten Schritt der Hydrolyse katalysiert [OH^–] eine β-Eliminierungsreaktion, welche die Bindung zwischen dem Sauerstoffatom, welches an den 3'-Kohlenstoff der Desoxyribose gebunden ist, und dem 3'-Kohlenstoffatom spaltet. Nachdem Depurinierung und β-Eliminierung natürliche Prozesse sind, deren Stattfinden in wässeriger Lösung nicht vollständig verhindert werden kann, würde man erwarten, dass, wenn alle anderen Ursachen des DNA-Abbaus ausgeschaltet sind, die natürlichen Raten der Depurinierung und β-Eliminierung die Stabilität der DNA definieren würden. Die veröffentlichte Geschwindigkeitskonstante (k) und Aktivierungsenergie (Ea) für die Depurinierung bei pH 7,4 (70°C, + 10 mM MgCl₂) betragen 4,0 × 10^–9 s^–1 bzw. 31 kcal/mol (siehe Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3610–3618). Deshalb sollte bei 50°C die Depurinierungsrate in PBS etwa 2,3 × 10^–10 s^–1 in Gegenwart von Magnesium und 3,3 × 10^–10s^–1 in Abwesenheit von Magnesium betragen, basierend auf den Wirkungen von Magnesium bei 70°C. Die veröffentliche Geschwindigkeitskonstante (70°C, in Abwesenheit von Magnesium) und Ea für den β-Eliminierungsschritt betragen 2,4 × 10^–5s^–1 bzw. 24,5 kcal/mol (siehe Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19: 3610–3618). Deshalb sollte bei 50°C die Geschwindigkeitskonstante für den β-Eliminierungsschritt etwa 2,6 × 10^–6s^–1 betragen. Somit würde die Rate der Strangbruch (SB)-Bildung gleich [AP-Stellen]k₂ sein, wobei k₁ die Geschwindigkeitskonstante für die Depurinierung ist, k₂ die Geschwindigkeitskonstante für die β-Eliminierung ist und [AP-Stellen] die Konzentration von purinfreien (AP)-Stellen in der DNA ist, wie im folgenden gezeigt.
Plasmid-DNA ------k₁------> [AP-Stellen] ------ k₂------> Strangbrüche (SB)
Zur Feststellung der Rate der Strangbruchbildung zu irgendeinem Zeitpunkt nach einer Inkubationsperiode bei 50°C ist somit:
Rate = 6.600 Purine (für IDV, HA, Georgia/93) × 3,3 × 10^–10 s^–1 × k₂
Rate = 2,2 × 10^–6 s^–1 × k₂
Rate = 2,2 × 10^–6 s^–1 × 2,6 × 10^–6 s^–1
Rate = 5,7 × 10^–12 s^–2
Rate der SB-Bildung zu irgendeinem Zeitpunkt = 5,7 × 10^–12 s^–2 × (Zeit in Sekunden).
Dann ist die Anzahl der zu irgendeinem Zeitpunkt t vorhandenen SB gleich dem Integral von 5,7 × 10^–12 (t) über die Zeit von t = 0 bis t = Zeit.
Dann ist die Anzahl der zu irgendeinem Zeitpunkt t vorhandenen SB = 1/2 (5,7 × 10^–12)t².
Somit ist die Anzahl der zu irgendeinem Zeitpunkt t vorhandenen SB = 2,85 × 10^–12 (t²).
Wenn wir die obigen veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten dazu verwenden, die Anzahl der Strangbrüche in dem Influenza-DNA-Vakzin nach 28 Tagen Inkubation bei 50°C zu bestimmen, erhalten wir 16,7 Strangbrüche pro Plasmid. Eine statistische Verteilung von 16,7 Strangbrüchen pro Plasmidmolekül in einer Population von Plasmiden würde eine Zusammensetzung ergeben, die vollständig frei von jeglicher superspiralisierter DNA ist. Jedoch zeigen die Daten in Tabelle 6 an, dass in der entmetallisierten Probe 65% der anfänglichen superspiralisierten DNA nach 28 Tagen übrig blieb. Diese Daten legen nahe, dass die Entmetallisierung die Rate der Depurinierung und/oder β-Eliminierung in wässeriger Lösung stark verringert. Es ist nicht bekannt, wie Spurenmetallionen die Depurinierungs- oder β-Eliminierungsreaktionen bis zu diesem Grad beeinflussen könnten.
Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen auch an, dass die Desoxygenisierung die DNA-Stabilität verbesserte, mutmaßlich durch Verringerung der Bildung von sauerstoff-enthaltenden freien Radikalen. Die stabilste Formulierung in dieser Studie war die entmetallisierte desoxygenierte Probe, die verbleibende 37% der anfänglichen superspiralisierten DNA nach 42 Tagen bei 50°C aufwies.
Die Ergebnisse einer weiteren Studie hinsichtlich der Wirkungen einer Entmetallisierung (Tabelle 9) zeigen ebenfalls an, dass die Entmetallisierung und Desoxygenierung des PBS-Puffers und der DNA die DNA-Stabilität bei 50°C gegenüber der nicht-entmetallisierten PBS-Kontrolle stark verbessert. Zur Entfernung etwaiger restlicher Metallionen aus den für die Lagerung verwendeten Glasgefäßen wurden einige der Gefäße mit einer Lösung von PBS, enthaltend 1 mM EDTA, entionisiertem Wasser gewaschen und vor der Verwendung autoklaviert. Ein Vergleich der DNA-Stabilität zwischen gewaschenen und ungewaschenen Gefäßen zeigte an, dass das Waschen der Gefäße die Stabilität der DNA unter beschleunigten Bedingungen nicht signifikant verbesserte. Jedoch mag das Waschen der Gefäße, um den Oberflächengehalt an Metallionen zu verringern, die Langzeitstabilität des DNA-Vakzins verbessern.
Tabelle 8
Tabelle 9
Tabelle 10
Tabelle 11
Zur Feststellung, ob die erhöhte Stabilität, die in entmetallisiertem PBS beobachtet wurde, die Entmetallisierung der Plasmid-DNA vor ihrer Zugabe zu dem entmetallisierten PBS erfordert, wurde eine Studie begonnen, um die Wirkung einer 1000fachen Verdünnung der nicht-entmetallisierten Plasmid-DNA in entmetallisiertem PBS auf die Stabilität zu bestimmen. Die Ergebnisse (Tabelle 10, Bedingungen C1–C3) zeigten eine Verringerung der Stabilität an, wenn die DNA nicht entmetallisiert war, welches nahelegt, dass es erforderlich ist, die DNA und das PBS zu entmetallisieren, um eine maximale Stabilität zu erhalten.
Zur Feststellung, ob die erhöhte Stabilität unter den entmetallisierten Bedingungen auf die Inaktivierung von restlicher kontaminierender Nukleaseaktivität (verursacht durch Metallionenentfernung) in der DNA zurückzuführen war, führten wir einen Versuch durch, um die Wirkungen der Entfernung oder Denaturierung etwaiger kontaminierender Nukleaseaktivität auf die DNA-Stabilität festzustellen. Die Ergebnisse (Tabelle 11) zeigten an, dass die Zugabe von 0,1% SDS die Stabilität gegenüber der PBS-Kontrolle nicht wesentlich erhöhte. Ferner erhöhte eine Behandlung der DNA mit 1 μg Protease K für 1 h bei 24°C, gefolgt von Entfernung des Enzyms mit einer Micropure EZ-Membran, die Stabilität nicht. Die Micropure EZ-Membranbehandlung alleine verbesserte die Stabilität ebenfalls nicht. Darüber hinaus fanden wir, dass eine Phenolextraktion und Ethanolfällung der DNA keine Wirkung auf die Stabilität hatte. Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass die erhöhte Stabilität, die in entmetallisierten PBS beobachtet wurde, nicht auf die Inaktivierung von restlicher Nukleaseaktivität zurückzuführen ist, sondern stattdessen auf die Entfernung von Metallionen, welche zur Katalyse einer radikalischen Oxidation der DNA in der Lage sind.
Zur weiteren Untersuchung der Wirkungen der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität wurde eine Reihe von DNA-Stabilitätsexperimenten durchgeführt unter Verwendung von entmetallisierten Puffern mit einem verbesserten Chargenbindungs-Entmetallisierungsverfahren, welches eine effiziente Entfernung von Spurenmetallionen und keine Veränderung des pH-Werts des Puffers sicherstellt. Die Puffer wurden entmetallisiert durch Einbringen von 5 g Chelex-Harz in ~75 ml des zu entmetallisierenden Puffers. Während die Lösung mit einer mäßigen Geschwindigkeit mit einem Magnetrührer gerührt wurde, wurde 1 N HCl tropfenweise der Aufschlämmung zugegeben, um den pH-Wert auf den gewünschten pH-Wert des Puffers einzustellen. Dann wurde zusätzliche 1 N HCl im Verlauf der nächsten 15–30 Minuten zugegeben, bis sich der pH-Wert der Aufschlämmung bei dem gewünschten pH-Wert stabilisierte. Als sich der pH-Wert stabilisiert hatte, wurde die Aufschlämmung filtriert und das gewaschene und pH-eingestellte Chelex-Harz gewonnen. Die gesamten 5 Gramm des gewaschenen Harzes wurden dann in 250 ml des zu entmetallisierenden Puffers (in einer 250-ml-Flasche mit Verschluss) eingebracht und langsam über Nacht bei 2–8°C gerührt. Dann wurde der Puffer mit Hilfe einer Corning-Vakuumfiltrationseinheit mit einer Celluloseacetat-Membran von 0,22 mm filtersterilisiert. Vor der Gewinnung des filtrierten Puffers wurde die Membran der Corning-Filtrationseinheit zweimal mit jeweils 5–10 ml der Aufschlämmung gewaschen, um etwaige Spurenmetallionen von der Celluloseacetat-Membran zu entfernen und den Polystyrolbehälter zu waschen. Der sterile entmetallisierte Puffer wurde bis zur Verwendung bei 2–8°C gelagert.
Zur Feststellung der Wirkungen der Reagenzienreinheit und Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität wurde Plasmid-DNA mit 2 μg/ml in PBS, welches mit Reagenzien von zwei verschiedenen Bezugsquellen hergestellt worden war, bei pH 7,2 6 Wochen lang bei 50°C inkubiert. Die Ergebnisse (15) zeigten an, dass die Entmetallisierung des Formulierungspuffers die DNA-Stabilisierung für PBS, das mit den B-Reagenzien hergestellt worden war, signifikant erhöhte, jedoch wenig Wirkung auf die Stabilität von DNA in PBS hatte, das mit den A-Reagenzien hergestellt worden war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Spurenmetallionenverunreinigungen in Formulierungspufferreagenzien zu einem DNA-Abbau während der Lagerung führen können und dass eine Entmetallisierung der weniger reinen Formulierungspuffer die DNA-Stabilität verbessert.
Zur Feststellung der Wirkungen der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in Formulierungen mit einem höheren pH-Wert wurde eine Stabilitätsstudie über 6 Wochen bei 50°C mit DNA bei 2 μg/ml in PBS und entmetallisiertem PBS, die auf pH 8,0 eingestellt worden waren, durchgeführt. Die Ergebnisse, in 16 gezeigt, zeigen an, dass die Entmetallisierung des Formulierungspuffers auch die DNA-Stabilität bei pH 8,0 in PBS verbesserte.
Zur Feststellung der Wirkungen der Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in Formulierungen, die Radikalfänger und Metallionenchelatoren enthalten, wurde ein DNA-Stabilitätsexperiment im Verlauf von 6 Wochen bei 50°C mit Plasmid-DNA bei 2 μg/ml durchgeführt. Zwei Formulierungen wurden getestet, jeweils im entmetallisierten und nicht-entmetallisierten Zustand. PBS wurde als Puffer und 10 mM Natriumsuccinat als Chelator verwendet. Ethanol und Glycerin wurden als Radikalfänger, jeweils mit 2% (Vol./Vol.), verwendet. Die Ergebnisse, in 17 gezeigt, zeigen an, dass die Entmetallisierung die DNA-Stabilität in der glycerin-enthaltenden Formulierung leicht erhöhte, jedoch keine Auswirkung auf die DNA-Stabilität in der Ethanol-Formulierung hatte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass dasselbe Niveau der DNA-Stabilität entweder durch Kontrolle der radikalischen Oxidation mit Succinat und Ethanol oder durch Entfernung der Spurenmetallionen mittels Entmetallisierung erhalten werden kann. Jedoch würde man erwarten, dass die Zugabe von Succinat und Ethanol die DNA vor etwaigen Spurenmetallionen schützen würde, welche während der DNA-Vakzin-Formulierung und dem Einfüllen eingeführt wurden. Obwohl eine Entmetallisierung die DNA nicht vor Metallionen schützen würde, welche nach der Entmetallisierungs prozedur eingeführt wurden, würde sie die Belastung mit Spurenmetallionen in der Formulierung verringern und könnte die DNA-Stabilisierung während der Lagerung über viel längere Zeiträume erhöhen.
Zur Untersuchung der Wirkungen einer Entmetallisierung auf die DNA-Stabilität in anderen Puffertypen wurde ein DNA-Stabilisierungsexperiment mit Plasmid-DNA über 6 Wochen bei 50°C mit DNA bei 2 μg/ml in entweder einem hydrogencarbonat- oder einem borat-enthaltenden Puffer durchgeführt. Die Ergebnisse, in 18 unten gezeigt, zeigen an, dass die Entmetallisierung die DNA-Stabilität in jeder der Formulierungen stark erhöhte. Deshalb legen die Daten nahe, dass Entmetallisierung ein wirksamer Weg ist, um die DNA-Stabilität in einer Vielfalt von Formulierungspuffern über einen breiten pH-Bereich zu erhöhen.
Zur Feststellung, ob die Entmetallisierung des Formulierungspuffers für ein DNA-Vakzin die DNA-Stabilität bei niedrigeren Temperaturen und über viel längere Lagerungszeiträume erhöht, wurde ein DNA-Stabilisierungsexperiment über 9 Monate bei 30°C mit DNA bei 2 μg/ml in zwei Formulierungen durchgeführt. Die Ergebnisse, in 19 gezeigt, zeigen an, dass die Entmetallisierung der PBS- und hydrogencarbonat-enthaltenden Formulierungen die DNA-Stabilität signifikant verbesserte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Erhöhung der DNA-Stabilität durch Entmetallisierung über einen breiten Bereich von Temperaturen und Lagerungszeiten wirksam ist.
BEISPIEL 14
Wirkung von Radikalfängern auf die DNA-Stabilität – Es ist nun allgemein anerkannt, dass ein Mechanismus des DNA-Abbaus die radikalische Oxidation durch Moleküle wie Hydroxylradikale beinhaltet. Ein Weg zur Verhinderung oder Minimierung des Ausmaßes der DNA-Schädigung durch freie Radikale ist die Zugabe eines Radikalfängers zu der Lösung. Diese Moleküle dienen dem Zweck, die DNA durch Konkurrenz mit der DNA um die freien Radikale zu schützen. Nachdem die Radikalfänger Verbindungen sind, welche hinsichtlich hoher Reaktivität gegenüber Radikalen ausgewählt sind und oft in höheren Konzentrationen wie der reaktive Teil der DNA (gewöhnlich der Desoxyribosezucker) vorliegen, schützen sie die DNA wirksam vor Schädigung.
Zur Feststellung, ob eine radikalische Oxidation während der Lagerung stattfand, und um die Wirksamkeit verschiedener Radikalfänger zu testen, wurde Influenza-DNA-Vakzin, HA (Georgia/93), in Salzlösung formuliert, die 4% (Gew./Vol.) Mannit, 4% (Vol./Vol.) Glycerin, 5 mM Methionin oder 10 mM Natriumazid (bekannte Radikalfänger) enthielt, und bei 37°C drei Monate lang inkubiert. Die DNA wurde zu drei Zeitpunkten einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, um den verbleibenden Prozentsatz der anfänglichen super spiralisierten DNA zu bestimmen. Die Ergebnisse in 11 zeigen an, dass in Salzlösung Glycerin, Methionin und Natriumazid die DNA im Vergleich zur Salzlösungskontrolle stabilisierten. Diese frühen Ergebnisse legten nahe, dass eine radikalische Oxidation während der Lagerung stattfand und dass drei verschiedene Radikalfänger effektive Stabilisatoren der DNA waren.
Die Ergebnisse einer weiteren Studie, welche dazu entwickelt wurde, die Wirkungen des Radikalfängers Dimethylsulfoxid (DMSO) und der Reduktionsmittel Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit und Thioglycerin auf die DNA-Stabilität zu testen, sind in Tabelle 12 gezeigt. In diesem Beispiel wurde DNA mit 20 μg/ml in PBS (pH 7,2) formuliert und bei 5, 24 und 37°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigen eine dramatische Zerstörung der DNA in Gegenwart aller Reduktionsmittel an und eine Erhöhung der Stabilität mit 0,2% (Vol./Vol.) DMSO im Vergleich zu der PBS-Kontrolle. Die Ergebnisse dieses Experiments stehen mit denen von 11 in Einklang, dass die meisten der getesteten nichtreduzierenden Radikalfänger die DNA stabilisierten.
Eine erneute Überprüfung von Radikalfängern wurde dann durchgeführt, um die Wirkungen von 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 10 mM Methionin und 2% (Vol./Vol.) Ethanol auf die DNA-Stabilität zu überprüfen. In diesem Experiment wurde die DNA mit 20 μg/ml in PBS (pH 7,2) formuliert und bei 5, 24 und 37°C inkubiert. Die Ergebnisse, in Tabelle 13 gezeigt, zeigten an, dass 2% Ethanol in PBS der effektivste Stabilisator war. Jedoch zeigten Glycerin und Methionin auch eine gewisse Stabilisierungswirkung. Ein weiteres Ergebnis dieser Studie war, dass die PBS-Formulierungen wesentlich stabiler als die Salzlösungs-Formulierungen waren, mutmaßlich deshalb, da der pH-Wert in den Salzlösungs-Formulierungen mit der Zeit dazu tendierte, sich nach unten zu verschieben, was eine Erhöhung der Abbaurate verursachte.
Tabelle 12
Tabelle 13
Die Ergebnisse eines Experiments zur Untersuchung der Wirkungen der Radikalfänger Pentoxifyllin, tert-Butylhydrochinon und p-Aminobenzoesäure auf die DNA-Stabilität sind in Tabelle 14 gezeigt. In dieser Studie wurde das IDV, HA (Georgia/93), mit 2,0 μg/ml in PBS (pH 7,2) in Gegenwart einer 10 mM Konzentration des Radikalfängers formuliert. Die Proben für diese Studie wurden bei 50°C inkubiert und hinsichtlich des Gehalts an superspiralisierter DNA mittels Agarosegelelektrophorese untersucht. Die Ergebnisse zeigten an, dass keiner der getesteten Radikalfänger die Stabilität der DNA verbesserte, und in der Tat beschleunigten sie den Abbau der DNA stark. Es ist nicht klar, warum diese Radikalfänger den Abbau der DNA beschleunigten, während Ethanol, DMSO, Glycerin und Methionin eine Erhöhung der Stabilität ergaben.
Das Vermögen von Ethanol zur Stabilisierung der DNA wurde auch in entmetallisiertem PBS sowie in entmetallisiertem und desoxygeniertem PBS untersucht. Für diese beiden Studien wurde die DNA mit 2,0 μg/ml formuliert und bei 50°C inkubiert. Die Ergebnisse, in den Tabellen 9 und 10 gezeigt, zeigen an, dass 5% (Vol./Vol.) Ethanol die DNA in PBS und in jeder der entmetallisierten Formulierungen stabilisierte.
Kürzliche Ergebnisse des ersten Zeitpunkts (1 Monat) einer Langzeit-Stabilitätsstudie zeigen ebenfalls an, dass 5% Ethanol die DNA in entmetallisiertem PBS bei 37°C in Formulierungen stabilisiert, die 2,0 μg/ml DNA enthalten. Der Ein-Monats-Zeitpunkt zeigte an, dass die PBS-Kontrolle verbleibende 93% der anfänglichen superspiralisierten DNA aufwies, während die entmetallisierte Probe 96,1% und die entmetallisierte Probe, die 5% Ethanol enthielt, 100% aufwies.
Zur Untersuchung der Wirkungen von Radikalfängern auf die DNA-Stabilität wurden zwei DNA-Stabilitätsexperimente über 8 Wochen bei 50°C mit DNA bei 20 μg/ml in PBS bei pH 7,2 und pH 8,0 durchgeführt. Nachdem Ethanol ein wirksamer Radikalfänger ist, der für die Anwendung beim Menschen zugelassen ist, wurde Ethanol als Radikalfänger bei 2% (Vol./Vol.) in Gegenwart und Abwesenheit von EDTA getestet. Die Ergebnisse des ersten Experiments (bei pH 7,2) sind in 20 unten gezeigt. Die Ergebnisse zeigen an, dass Ethanol alleine die DNA-Stabilität erhöhte, während EDTA alleine die DNA-Stabilität verringerte. Die Kombination von Ethanol und EDTA ergab eine große Zunahme der DNA-Stabilität bis zu 4 Wochen, jedoch nur eine kleine Zunahme der Stabilität ab Woche 8. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ethanol ein wirksamerer Radikalfänger in Gegenwart von EDTA als in deren Abwesenheit ist. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass EDTA alleine die DNA-Stabilität in Abwesenheit von Ethanol verringert, jedoch die DNA-Stabilität in Gegenwart von Ethanol erhöht. Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass Ethanol ein wirksamerer Radikalfänger in Gegenwart von EDTA ist, da EDTA an DNA gebundene Metallionen entfernt und somit die Bildung von Hydroxylradikalen im Volumen der Lösung erlaubt, im Gegensatz zur Bildung von Radikalen durch Eisen, welches an die DNA gebunden ist. Die Bildung von Hydroxylradikalen im Volumen der Lösung würde den Ethanolmolekülen mehr Zeit zum Abfangen der Radikale geben, da die mittlere freie Weglänge des Radikals vor seiner Wechselwirkung mit der DNA größer sein würde. Hydroxylradikale, welche durch an die DNA gebundene Eisenmoleküle erzeugt würden, wären in sehr enger Nachbarschaft mit der DNA. Deshalb würde das Vermögen von Ethanol, Radikale abzufangen, die auf der "Oberfläche" der DNA gebildet werden, stark verringert werden. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass andere Chelatoren als EDTA effektive DNA-Stabilisatoren sein könnten, vorausgesetzt, dass der Chelatbildner in der Lage ist, Metallionen (Eisen und Kupfer) zu entfernen, die bereits an die DNA gebunden sind.
Die Ergebnisse der zweiten Stabilitätsstudie, bei pH 8,0, sind unten in 21 gezeigt. Die Daten aus diesem Experiment zeigen klar, dass die DNA-stabilisierenden Wirkungen von Ethanol und EDTA/EtOH bei pH 8,0 größer als bei pH 7,2 sind.
Zur Feststellung, ob die Kombination von Succinat und Ethanol dasselbe Ausmaß an DNA-Stabilisierung ergeben würde wie mit der EDTA/EtOH-Kombination beobachtet, und zur Feststellung, ob eine dieser Kombinationen DNA vor der Anwesenheit von Fe⁺³ schützen würde, wurde ein Stabilitätsexperiment über 6 Wochen bei 50°C in 10 mM Natriumphosphatpuffer, enthaltend 150 mM NaCl, bei pH 8,0 mit 20 μg/ml DNA durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten an, dass die Succinat/EtOH-Kombination nicht denselben Grad an DNA-Stabilität wie EDTA/EtOH ergab. Jedoch ergab die Kombination von Succinat und Ethanol einen nahezu vollständigen Schutz von der erhöhten Radikalbildung, welche durch die Zugabe von 500 ppb Fe⁺³ hervorgerufen wurde. Die Ergebnisse, in 22 gezeigt, zeigten auch an, dass die EDTA/EtOH-Kombination die beste DNA-Gesamtstabilität ergab und einen vollständigen Schutz vor der Zugabe von 500 ppb Fe⁺³. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die spezifische Kombination von EDTA und Ethanol eine stark erhöhte DNA-Stabilität ergibt und dass derselbe Grad an DNA-Stabilität durch Verwendung der Kombination von Succinat und Ethanol nicht erzielt werden kann.
BEISPIEL 15
Wirkung von Metallionenchelatoren auf die DNA-Stabilität – In einleitenden Studien, welche zur Untersuchung der Wirkungen von Pufferionen, pH-Wert und Salz auf die DNA-Stabilität entwickelt wurden, untersuchten wir auch die Wirkung der Zugabe von 1 mM und 10 mM EDTA zu DNA, die in PBS (pH 7,2) formuliert war. Für diese frühen Experimente wurde die Plasmid-DNA mit 100 μg/ml formuliert und 48 h lang bei 60°C inkubiert. Der Gehalt an superspiralisierter DNA wurde dann mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Ergebnisse, in Tabelle 5 gezeigt, zeigten an, dass EDTA keine Auswirkung auf die Stabilität der DNA hatte. Dies legte zu diesem frühen Zeitpunkt nahe, dass Spurenmetallionen für den DNA-Abbauprozess, den wir beobachteten, nicht erforderlich waren.
Andere Experimente beinhalteten auch eine Untersuchung der Wirkungen von EDTA auf die DNA-Stabilität. Beispielsweise zeigten die in Tabelle 12 gezeigten Ergebnisse an, dass 0,5 mM EDTA keine signifikante Auswirkung auf die Stabilität von DNA hatte, die mit 2,0 μg/ml in PBS (pH 7,2) oder in PBS, enthaltend 5% (Vol./Vol.) Ethanol, bei Inkubation bei 50°C hatte.
Ein frühes Experiment, welches zur Untersuchung der Wirkung des Eisenchelators Desferal (mit 1 mM) auf die DNA-Stabilität entwickelt wurde, zeigte eine erhöhte Abbaugeschwindigkeit an. In dieser Studie wurde die DNA in PBS (pH 7,2) mit 20 μg/ml formuliert und bei 5, 25 und 37°C inkubiert. Der Grund für die erhöhte Abbaurate ist nicht klar.
Spätere Experimente bestätigen ebenfalls die abträgliche Wirkung von Desferal auf die DNA-Stabilität. Beispielsweise zeigen die in Tabelle 15 gezeigten Ergebnisse, dass 0,5 mM Desferal einen schnellen Abbau der DNA in PBS verursachte, selbst wenn das PBS mit Desferal behandelt wurde, bevor es mit der DNA gemischt wurde. Dieses Experiment zeigte auch, dass die Behandlung der DNA mit 1,0 mM Desferal über Nacht, vor deren Verdünnung in entmetallisiertem PBS, immer noch zu einem schnellen Abbau der DNA führte. Für diese letzten Experimente mit Desferal wurde die DNA in PBS mit 2,0 μg/ml formuliert und bei 50°C inkubiert.
Tabelle 14
Tabelle 15
Die Ergebnisse eines Experiments zur Untersuchung der Wirkungen einiger gut charakterisierter Metallionenchelatoren auf die DNA-Stabilität sind in Tabelle 14 gezeigt. Für diese Studien wurde die DNA mit 2,0 μg/ml in PBS (pH 7,2) formuliert und bei 50°C inkubiert. Vier verschiedene Chelatoren wurden getestet, jeweils bei 0,5 mM. Die Ergebnisse zeigten an, dass Inositolhexaphosphat (IHP) und Tripolyphosphat (TPP) die Stabilität der DNA verbesserten. Jedoch erhöhten Ethylendiamin-di(o-hydroxyphenylessigsäure (EDDHA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) die Stabilität nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass IHP und TPP zur weiteren Stabilisierung der DNA in entmetallisiertem PBS und in entmetallisiertem PBS, das Ethanol als Radikalfänger enthält, von Nutzen sein könnten. Obwohl die Stabilisierungswirkung von IHP und TPP mit der Erhöhung der Stabilität mit Entmetallisierung und den stabilisierenden Wirkungen von Ethanol (basierend darauf, dass der Mechanismus des DNA-Abbaus eine metallionen-katalysierte radikalische Oxidation ist) in Einklang steht, ist nicht klar, warum andere Metallionenchelatoren die DNA nicht stabilisieren. Die veröffentlichte Literatur (siehe J. Biol. Chem. 259, 3620–3624; 1984) legt nahe, dass IHP, EDDHA, DTPA und Desferal eine freie Koordinationsstelle auf dem Metall fehlt, wenn sie mit Eisen koordiniert sind. Deshalb wurde berichtet, dass diese vier Chelatoren keine Hydroxylradikale bilden, wenn sie mit Eisen komplexiert sind, wie dies EDTA tut. Mit diesem Verständnis der Chemie ist es schwierig, die unterschiedlichen Wirkungen dieser Chelatoren auf die DNA-Stabilität zu erklären. Jedoch legen unsere Ergebnisse nahe, dass Chelatoren, die mehrere Phosphatliganden enthalten, die wirksamsten Chelatoren zum Schutz von DNA vor einer metallionen-katalysierten Oxidation sein könnten. Ferner würden zusätzliche Chelatoren mit mehreren Phosphatliganden die verschiedenen Salzformen von Polyphosphorsäure einschließen.
Die Ergebnisse unserer jüngsten Studien zur Untersuchung verschiedener Puffer im entmetallisierten Zustand (siehe Beispiel 16) legen ebenfalls nahe, dass spezifische Metallionenchelatoren zur Stabilisierung von DNA während der Lagerung wichtig sind. Nachdem entmetallisiertes PBS mit Succinat oder Malat entmetallisiertem PBS alleine überlegen war, ist die stabilisierende Wirkung wahrscheinlich auf die Bindung von Metallionen durch die Succinat- und Malatanionen zurückzuführen. Jedoch zeigen unsere Daten auch an, dass Citrat, ein allgemein eingesetzter Puffer mit einer höheren Affinität für Metallionen als Succinat, keinerlei Stabilisierung der DNA ergab. Darüber hinaus haben EDTA, Desferal, Inositolhexaphosphat, EDDHA und DTPA alle sehr hohe Affinitäten für Metallionen, sie stabilisieren jedoch nicht die DNA während der Lagerung. Deshalb steht das Vermögen des Metallionenchelators zur Stabilisierung von DNA-Formulierungen in keinem Bezug zu dem Bindungsvermögen des Chelators für Metallionen. Diese Schlussfolgerung legt nahe, dass die Identifizierung effektiver Chelatoren ein empirisches Screening von Molekülen mit mehreren Phosphatliganden oder mit einer chemischen Ähnlichkeit zu Bernsteinsäure oder Äpfelsäure erfordern wird.
Zur Untersuchung der Wirkungen von Metallionenchelatoren auf die DNA-Stabilität wurde eine Reihe von DNA-Stabilitätsexperimenten durchgeführt. Der Zweck des ersten Experiments war die Bestimmung der Wirkungen mehrer verschiedener Chelatoren auf die DNA-Stabilität in PBS bei pH 8,0 in Abwesenheit von Ethanol. Das Experiment wurde über zwei Wochen bei 50°C unter Verwendung von 20 μg/ml DNA durchgeführt. Die Ergebnisse, in 23 gezeigt, zeigen an, dass nur NTA (Nitrilotriessigsäure) und DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) die DNA-Stabilität in Abwesenheit von Ethanol erhöhen. Die Daten in 23 stehen mit den vorherigen Ergebnissen, die in den 21 und 22 gezeigt sind, insofern in Einklang als EDTA die DNA-Stabilität in Abwesenheit von Ethanol verringerte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass von diesen Chelatoren nur DTPA ein wirksamer DNA-Stabilisator in Abwesenheit von Ethanol ist.
Zur Untersuchung des Vermögens von Metallionenchelatoren, die DNA-Stabilität in Gegenwart von Ethanol zu erhöhen, wurde ein Experiment unter Verwendung fünf verschiedener Chelatoren über 12 Wochen bei 50°C in PBS bei pH 8,0 durchgeführt. Die Ergebnisse, in 24 gezeigt, zeigten an, dass nur DTPA und EDTA signifikant die DNA-Stabilität gegenüber der PBS-Kontrolle, die 1% EtOH enthielt, erhöhten. Jedoch erhöhten 200 mM DTPA ebenfalls die DNA-Stabilität in einem äquivalenten Ausmaß, in Gegenwart und Abwesenheit von Ethanol. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit einem veröffentlichten Bericht (siehe Graf et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 3620–3624), dass Eisen-DTPA-Komplexe die Bildung von Hydroxylradikalen nicht fördern, und deshalb würde man erwarten, dass Ethanol nicht als Radikalfänger gebraucht würde.
Zur Bestimmung der optimalen Konzentration von EDTA zur Stabilisierung von Plasmid-DNA in PBS, enthaltend 1% EtOH bei pH 8,0, wurde ein Stabilitätsexperiment über 6 Wochen bei 50°C unter Verwendung von 20 μg/ml DNA durchgeführt. Die Ergebnisse, in Tabelle 25 gezeigt, zeigen an, dass unter diesen Bedingungen 10 μM EDTA die gleiche Stabilitätserhöhung ergab wie 500 μM EDTA. Diese Ergebnisse legen nahe, dass EDTA die Stabilität von DNA erhöht durch Binden niedriger Konzentrationen an Spurenmetallionen, welche in dem Formulierungspuffer oder in den DNA-Präparationen vorliegen. Auf Grundlage dieser Daten könnte eine Erhöhung der DNA-Konzentration von 20 μg/ml auf 1,0 mg/ml nur eine Erhöhung der EDTA-Konzentration von 10 μM auf 500 μM erfordern. Deshalb sollte die Verwendung von EDTA und Ethanol zur Stabilisierung von DNA-Vakzin-Formulierungen nicht mehr als 1 mM EDTA erfordern, selbst bei DNA-Vakzinen mit DNA-Konzentrationen von 2,0 mg/ml.
BEISPIEL 16
Wirkung von entmetallisierten Puffern auf die DNA-Stabilität – Unsere anfänglichen Studien hinsichtlich der Wirkungen von Pufferionen wurden mit Puffern durchgeführt, die nicht entmetallisiert waren. Nachdem jedoch der Spurenmetallionengehalt der Puffer wahrscheinlich variierte, in Abhängigkeit von der Reinheit des Puffers, mag die Stabilität der DNA in nicht-entmetallisierten Puffern hauptsächlich durch den Spurenmetallionengehalt bestimmt werden. Deshalb mag es erforderlich sein, die Wirkungen von entmetallisierten Puffern zu vergleichen, um den tatsächlichen Einfluss der Pufferionen auf die DNA-Stabilität zu bestimmen.
Zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener Pufferionen auf die Stabilität wurden vier verschiedene entmetallisierte Puffer hergestellt. Der Kontrollpuffer war entmetallisiertes PBS bei pH 7,2. Die anderen getesteten Puffer waren entmetallisiertes PBS mit 10 mM Natriumsuccinat (pH 7,2), entmetallisiertes PBS mit 10 mM Natriummalat (pH 7,2), entmetallisiertes Natriumhydrogencarbonat (10 mM) mit 150 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl (pH 7,8), und 10 mM Tricin, 150 mM NaCl (pH 7,8). Die Tris- und Tricin-Puffer waren nicht entmetallisiert, da das Pufferion kationisch ist und an die Chelex-100-Säule bindet. Für diese Studie entmetallisierter Puffer wurde das Influenza-DNA-Vakzin mit 20,0 μg/ml formuliert und bei 50°C inkubiert. Die Ergebnisse des ersten Zeitpunkts (zwei Wochen) zeigten an, dass die entmetallisierte PBS-Kontrolle 75% der anfänglichen superspiralisierten DNA behielt, während die Succinat-, Malat-, Natriumhydrogencarbonat-, Tris- und Tricin-Puffer 98%, 94%, 100%, 31% und 65% der anfänglichen superspiralisierten DNA behielten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die entmetallisierten Puffer, die Succinat und Malat enthielten, entmetallisiertem PBS überlegen waren, und dass entmetallisiertes Natriumhydrogencarbonat, enthaltend 150 mM NaCl, die stabilste Formulierung war. Obwohl nicht klar ist, warum Natriumhydrogencarbonat PBS überlegen ist, ist die Stabilisierungswirkung von PBS, enthaltend Succinat und Malat, wahrscheinlich auf das Vermögen dieser Verbindungen zur Chelierung von Metallionen zurückzuführen. Nachdem die Verwendung von Succinat und Malat in pharmazeutischen Produkten als sicher anerkannt ist und diese in relativ hohen Konzentrationen verwendet werden können, könnten diese Verbindungen die wirksamste Weise sein, um Spurenmetallionen zu chelieren und somit DNA zu stabilisieren.
BEISPIEL 17
Wirkung der Lyophilisierung auf die DNA-Stabilität – DNA ist für eine Reihe verschiedener Abbauprozesse in wässeriger Lösung, einschließlich radikalischer Oxidation, Depurinierung und β-Eliminierungsreaktionen, anfällig. Ein Ansatz zur Minimierung der Rate dieser Prozesse wäre die Lyophilisierung der DNA, um somit den Wassergehalt und die molekulare Beweglichkeit zu verringern. Zur Feststellung der Wirkungen einer Lyophilisierung auf die DNA-Stabilität während der Lagerung wurden sechs verschiedene lyophilisierte Formulierungen hergestellt. Die Stabilität der DNA in den lyophilisierten Proben wurde mit einer flüssigen PBS-Formulierung mit 20 μg/ml nach einem Monat Inkubation bei 37°C mittels Agarosegelelektrophorese verglichen. Zur Herstellung der lyophilisierten Proben wurde Influenza-DNA-Vakzin mit 20 μg/ml mit den geeigneten Stabilisatoren formuliert und 0,8 ml Lösung wurde in 3-ml-Glasgefäße eingebracht. Die Proben wurden dann in den Lyophilisator eingebracht und während des Abkühlens des Regals auf etwa – 45°C über einen Zeitraum von 4 h eingefroren. Ein Vakuum wurde dann angelegt (20 mTorr), während die Regaltemperatur für 26 h zwischen –30° und –20°C gehalten wurde. Die Regaltemperatur wurde dann auf 0°C für 2 h und dann auf eine Temperatur von 25°C für 6 h mit einer bestimmten Rate erhöht. Das Vakuum wurde dann aufgehoben und die Gefäße unter einer Stickstoffatmosphäre mit einem Stopfen verschlossen.
Die Ergebnisse der Lyophilisierungsstudie, in 12 gezeigt, zeigten an, dass die DNA in vier der sechs lyophilisierten Formulierungen viel stabiler war als die DNA in der flüssigen PBS-Kontrolle, was nahelegt, dass Lyophilisierung ein sehr effektiver Weg zur Stabilisierung von DNA-Vakzinen sein wird. Interessanterweise stabilisieren DNA-Vakzin-Formulierungen, die amorphe Zucker wie Sucrose und Lactose enthalten, die DNA stark, während kristalline Zucker wie Mannit die DNA-Stabilität im Vergleich zu der Lösungskontrolle (in PBS) nicht erhöhen. Demnächst zu beginnende Studien umfassen die Verwendung entmetallisierter Puffer, um die lyophilisierten DNA-Proben herzustellen. Nachdem Metallionen für die DNA-Stabilität im flüssigen Zustand sehr abträglich sind, könnten entmetallisierte und lyophilisierte DNA-Formulierungen eine stark erhöhte Stabilität gegenüber flüssigen Formulierungen ergeben.
Zur Feststellung der Stabilität von lyophilisiertem DNA-Vakzinen und zur Feststellung der Wirkungen einer Entmetallisierung des Formulierungspuffers hinsichtlich der Stabilität von lyophilisierter DNA wurde eine Stabilitätsstudie mit den lyophilisierten Proben über vier Monate bei 50°C durchgeführt. Drei Formulierungen wurden getestet, jeweils im entmetallisierten und nicht-entmetallisierten Zustand. Die DNA-Konzentration vor der Lyophilisierung betrug 20 μg/ml. Die Lyophilisierungsbedingungen waren dieselben wie in diesem Beispielsabschnitt beschrieben. Nach vier Monaten Inkubation wurden die Proben in sterilem Wasser resuspendiert und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert, um den Prozentsatz an superspiralisierter, offen zirkulärer und linearer DNA zu bestimmen. Die Ergebnisse, in 26 gezeigt, zeigten an, dass die Stabilität der besten lyophilisierten Formulierung diejenige der flüssigen Formulierungen übertraf. Jedoch übertraf die vorausgesagte Vier-Monats-Stabilität der besten flüssigen Formulierung diejenige der lyophilisierten Formulierungen 1, 5 und 6. Die Vier-Monats-Stabilitätsdaten für die flüssigen Formulierungen basierten auf Extrapolationen der Stabilitätsdaten von drei Monaten (Formulierungen 8 und 9) oder 6 Wochen (Formulierung 7) bei 50°C und 20 μg/ml DNA. Die Ergebnisse zeigten auch an, dass die Entmetallisierung die Stabilität der lyophilisierten DNA in den Formulierungen 1 und 2 erhöhte, jedoch wenig Auswirkung auf den Prozentsatz superspiralisierter (SC)-DNA in den anderen lyophilisierten Formulierungen hatte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Lyophilisierung eine effektive Weise zur Stabilisierung von DNA-Vakzinen ist und dass eine Entmetallisierung des Formulierungspuffers die Stabilität lyophilisierter DNA in einigen Formulierungen verbessert.
BEISPIEL 18
Wirkung von EDTA und Ethanol auf die Depurinierungs- und β-Eliminierungs-Geschwindigkeitskonstanten
Die Ergebnisse der hier offenbarten DNA-Stabilitätsstudien legen nahe, dass in Abwesenheit von Radikalfängern und Metallionenchelatoren eine radikalische Oxidation der Hauptmechanismus des DNA-Abbaus bei der Lagerung ist. Die Daten stützen auch die Hypothese, dass Spurenmetallionen und gelöster Sauerstoff in Formulierungspuffern eine radikalische Oxidation der DNA verursachen. Auf Grundlage dieser Hypothese wären die Hauptmechanismen des DNA-Abbaus in Formulierungen, in denen die radikalische Oxidation effektiv kontrolliert wird (durch EDTA und Ethanol), die Prozesse der Depurinierung und β-Eliminierung, welche bei DNA in wässerigen Lösungen stattfinden (Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610–3618). Wenn Depurinierung und β-Eliminierung die dominierenden Abbaumechanismen für DNA bei der Lagerung sind, ist es möglich, unter Verwendung der veröffentlichten Werte der Depurinierungs- und β-Eliminierungs-Geschwindigkeitskonstanten und der Aktivierungsenergien (E_a) für diese Reaktionen den Prozentsatz an superspiralisierter DNA über die Zeit genau vorauszusagen. Jedoch haben die Ergebnisse mehrerer DNA-Stabilitätsstudien unter Verwendung von DNA-Vakzin-Formulierungen, welche Ethanol und EDTA/EtOH enthalten, nahe gelegt, dass die DNA in diesen Formulierungen viel stabiler ist als man aufgrund der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten voraussagen würde. Der Grund für die höhere als erwartete DNA-Stabilität in Formulierungen, die Ethanol enthalten, sind wahrscheinlich die viel geringeren Niveaus der radikalischen Oxidation. Diese Hypothese steht im Einklang mit dem bekannten Stand der Technik, welcher Ethanol als effektiven Radikalfänger von Hydroxylradikalen offenbart. Deshalb wurde zur Feststellung der inhärenten Stabilität von DNA in wässeriger Lösung eine Stabilitätsstudie mit DNA bei 100 μg/ml in PBS, enthaltend 1% EtOH und 0,5 mM EDTA, bei pH 7,4, initiiert. Zur weiteren Kontrolle der radikalischen Oxidation der DNA wurden die Lösungen in versiegelte Glasampullen eingebracht. Die Ampullen wurden bei 40, 50, 60 und 80°C inkubiert. Nach verschiedenen Zeiträumen wurden Ampullen aus dem Inkubator entnommen und die Lösungen hinsichtlich des Prozentsatzes an superspiralisierter DNA in Gegenwart und Abwesenheit von E. coli-Exonuklease III untersucht, um die Anzahl der (purinfreien) AP-Stellen pro Plasmid zu bestimmen und um die Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung (k₁) und β-Eliminierung (k₂) zu bestimmen. Eine Beschreibung des AP-Stellen-Assays und des Verfahrens zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung (k₁) und β-Eliminierung (k₂) ist unten angeben.
Beschreibung des AP-Assays – Der Assay basiert auf der Überführung von superspiralisierter Plasmid-DNA (enthaltend AP-Stellen) in die offen zirkuläre Form nach Behandlung mit Exonuklease III. Exonuklease III aus E. coli hat eine assoziierte AP-Endonuklease-Aktivität, welche das DNA-Gerüst an AP-Stellen spalten und DNA, der AP-Stellen fehlen, vollständig superspiralisiert belassen wird. Nachdem superspiralisierte Plasmid-DNA mit nur einer einzigen AP-Stelle pro Plasmid durch Exonuklease III vollständig in offen zirkuläre DNA überführt wird, ist der Assay sensitiv genug, um die Anwesenheit von AP-Stellen nachzuweisen, wenn nur 5 bis 10% DNA-Moleküle eine AP-Stelle enthalten.
Der Assay wird durch Inkubation von 100 ng Plasmid-DNA mit und ohne 0,25 Einheiten Exonuklease III für 30 Minuten bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 35 ml durchgeführt. Ein Aliquot der DNA (18 ng) wird dann einer Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidanfärbung unterworfen. Das Negativ der Gelfotografie wird dann gescannt und die Ergebnisse werden mit superspiralisierten, offen zirkulären und linearen Standards verglichen, welche auf dasselbe Gel aufgetragen werden, um eine quantitative Bestimmung jeder Form von DNA zu erlauben. Zur Feststellung der Anzahl von AP-Stellen in einer Probe von DNA verwenden wir die Daten für den Prozentsatz an superspiralisierter DNA vor und nach Behandlung mit Exo III. Beispielsweise wäre, falls eine Probe von DNA vor der Behandlung zu 90% superspiralisiert war und zu 50% nach der Behandlung, die Berechnung der Anzahl der AP-Stellen wie folgt. Zuerst nehmen wir auf Grundlage vergangener Arbeiten an, dass die Rate der Depurinierung unabhängig von der DNA-Sequenz ist und dass die Einführung von AP-Stellen einer Poisson-Verteilung folgt. Dann wird eine Gleichung verwendet, welche die Anzahl der Strangbrüche in einer Population von DNA-Molekülen (SB) als Funktion des Bruchteils von superspiralisierter DNA (f₁) beschreibt. SB = –Inf1
Für DNA, die zu 90% superspiralisiert ist, ist die Anzahl der Strangbrüche pro Plasmid im Mittel:
SB = –In (0,90) oder 0,105.
Für DNA, die zu 50% superspiralisiert ist:
SB = –In (0,50) oder 0,693.
Deshalb ist der Unterschied zwischen 0,693 und 0,105 (0,588) die Anzahl der Strangbrüche, welche durch Spalten der DNA an den AP-Stellen eingeführt wurde, und deshalb gleich der Anzahl von AP-Stellen in der DNA.
Verfahren zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung (k₁) und β-Eliminierung (k₂ – Zur Bestimmung der Geschwindigkeitsraten für die Depurinierung (k₁) und β-Eliminierung (k₂) ist es zuerst erforderlich, eine Gleichung abzuleiten, um die mathematische Beziehung zwischen diesen Geschwindigkeitskonstanten und einem DNA-Stabilitätsparameter, der leicht gemessen wird, zu etablieren. In diesem Fall haben wir eine Gleichung abgeleitet, welche die Beziehung zwischen der Anzahl der Strangbrüche pro Plasmid (SB) und der Anzahl von AP-Stellen pro Plasmid mit k₁ und k₂ etabliert. Nachdem wir bereits die Beziehung zwischen SB und dem Prozentsatz an superspiralisierter DNA beschrieben haben (oben), können wir dann die DNA-Stabilitätsdaten (Messung des Prozentsatzes superspiralisierter DNA über die Zeit) und den AP-Stellen-Assay verwenden, um k₁ und k₂ in DNA-Vakzin-Formulierungen, die EDTA und Ethanol enthalten, zu bestimmen.
In einer Population von Molekülen können wir mit der Annahme beginnen, dass die Anzahl der Strangbrüche pro Plasmid (SB) zu irgendeinem Zeitpunkt gleich der Gesamtzahl von AP-Stellen ist, die bis zu dieser Zeit gebildet wurden, (TAP) minus der Anzahl von verbleibenden AP-Stellen pro Plasmid (AP). Zur Vereinfachung der Berechnungen werden wir auch annehmen, dass die Ausgangs-DNA keine AP-Stellen oder Strangbrüche zum Zeitpunkt Null enthält. Dann ist SB = TAP – AP.
Nachdem TAP = k₁(PB)t ist, wobei k₁ die Depurinierungs-Geschwindigkeitskonstante ist, PB = die Anzahl der Purinbasen und t = Zeit, ist dann SB = k1(PB)t – AP.
Jedoch muss AP in Begriffen von k₁, k₂ und PB ausgedrückt werden. Deswegen wird die Veränderungsrate von AP gleich der Bildungsrate der AP-Stellen minus der Rate der Überführung in Strangbrüche gesetzt. Dann wird durch Integration für AP aufgelöst. dAP/dt = k1(PB) – k2(AP) dAP = k1(PB)dt – k2(AP)dt ∫dAP = ∫k1(PB)dt – ∫k2(AP)dt.
Unter der Annahme, dass AP am Anfang Null ist, dann ist ∫k2(AP)dt = k2(AP)tundAP = k1(PB)t – k2(AP)t.
Anschließend Auflösen für AP; AP = k1(PB)t/1 + k2t.
Setzt man nun diese Form von AP in unsere Gleichung für SB ein, wird eine Gleichung erhalten, welche die Anzahl der Strangbrüche pro Plasmid zu irgendeinem gegebenen Zeitpunkt angibt. SB = k1(PB)t – [k1(PB)t/1 + k2t]
Oder SB kann in Begriffen von AP ausgedrückt werden.
Nachdem ∫k₂(AP)dt = k₂(AP)t und ∫k₂(AP)dt = SB, ist dann SB = k2(AP)t.
Ergebnisse von k₁ und k₂-Bestimmungen – Unter Verwendung der obigen Gleichungen wurden bestimmte k₁ und k₂ für eine DNA-Vakzin-Formulierung, enthaltend EDTA und Ethanol, bei 40, 50, 60 und 80°C bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16 zeigt auch einen Vergleich der gemessenen k₁ und k₂ mit den veröffentlichten kund k₂-Werten bei dem gleichen pH-Wert und der gleichen Temperatur. Bei 50°C ist k₁ in dieser Formulierung nahezu 7fach geringer als der veröffentlichte Wert, bestimmt beim gleichen pH-Wert und der gleichen Temperatur. Die Ergebnisse zeigen klar an, dass die Werte von k₁ und k₂ in dieser Formulierung viel kleiner als die veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten (Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610–3618) sind. Diese Schlussfolgerung legt nahe, dass wenn die radikalische Oxidation von DNA effektiv kontrolliert wird, die DNA dann stabiler ist als man auf Grundlage der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung voraussagen würde. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass die veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten aufgrund einer unkontrollierten radikalischen Oxidation fälschlich zu hoch sind.
Zur Bestimmung der Aktivierungsenergien für die Depurinierung (k₁) und β-Eliminierung (k₂) in Gegenwart von EDTA/EtOH und zur Feststellung, ob der Abbaumechanismus von DNA in PBS, enthaltend EDTA/EtOH, vorwiegend auf Depurinierung und β-Eliminierung zurückzuführen ist, wurden die obigen Daten zur Erstellung von Arrhenius-Plots verwendet. Die Ergebnisse sind in 29 und 30 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Aktivierungsenergien für die Depurinierung und β-Eliminierung 118,9 bzw. 105,5 kJ/mol (28,4 und 25,2 kcal/mol) betragen. Diese Werte stimmen extrem gut mit den veröffentlichten Werten von 129 ± 8 kJ/mol (31 ± 2 kcal/mol) und 117 kJ/mol (28 kcal/mol) für die Depurinierung (Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610–3618; Greer und Zamenhof, 1962, J. Mol. Biol. 4: 123) und 102,6 kJ/mol (24,5 kcal/mol) für die β-Eliminierung (Lindahl und Andersson, 1972, Biochemistry, 11: 3618) überein. Diese Daten legen nahe, dass die Hauptmechanismen des DNA-Abbaus im PBS, enthaltend EDTA/EtOH, die Depurinierung und β-Eliminierung sind und dass die Mechanismen dieser Reaktionen durch die Anwesenheit von EDTA und Ethanol nicht verändert werden. Diese Daten erlauben auch eine Voraussage des verbleibenden Prozentsatzes der superspiralisierten DNA für DNA-Stabilitätsstudien, die bei anderen Temperaturen (bei pH 7,4) durchgeführt wurden, vorausgesetzt, dass die Formulierung die radikalische Oxidation effektiv kontrolliert.
Um zu zeigen, dass die Stabilität von DNA in einer DNA-Vakzin-Formulierung, enthaltend 100 mM EDTA und 1% Ethanol (bei pH 7,4), viel größer ist als durch die veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten vorausgesagt, sind die DNA-Stabilitätsdaten unten (31) zusammen mit zwei Stabilitätsvoraussagen graphisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen klar an, dass die DNA in dieser Formulierung viel stabiler ist als die veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten nahelegen würden. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse an, dass die experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten eine viel bessere Voraussage der DNA-Stabilität erlauben als die Verwendung der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten.
Unter Verwendung der experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten (k₁ und k₂) und der abgeleiteten Beziehungen zwischen den Geschwindigkeitskonstanten und dem Prozentsatz an superspiralisierter DNA ist es möglich, den Formulierungs-pH-Wert vorauszusagen, welcher zur Erzielung einer Langzeitstabilität bei Raumtemperatur erforderlich wäre. Diese Voraussagen (siehe 32) legen nahe, dass der pH-Wert einer DNA-Vakzin-Formulierung (enthaltend EDTA/EtOH) etwa 8,0 sein müsste, um mehr als 50% superspiralisierte DNA für zwei Jahre bei 30°C in einer Glasampulle zu erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass EDTA/EtOH effektiv die radikalische Oxidation in DNA-Vakzin-Formulierungen kontrolliert und dadurch die DNA-Stabilität auf Niveaus erhöht, welche auf Grundlage der Verwendung der veröffentlichten Geschwindigkeitskonstanten für die Depurinierung und β-Eliminierung nicht erwartet würden.

Claims

Verfahren zur Stabilisierung eines Nukleinsäure-Vakzins oder einer Gentherapieprodukt-Präparation, umfassend gereinigte superspiralisierte („supercoiled") Plasmid-DNA, welches Verfahren die Einführung der Präparation in eine Formulierung, die a) einen Metallionenchelator, b) einen nicht-reduzierenden Radikalfänger, ausgewählt aus Ethanol, Glycerin, Methionin, Dimethylsulfoxid und Kombinationen davon; und c) einen Puffer umfaßt, umfaßt, wobei eine stabilisierte DNA-Präparation resultiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei aus der Präparation der superspiralisierten Plasmid-DNA Metallionen entfernt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Formulierungspuffer aus der Gruppe, welche aus Tris-HCl, Glycin, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Lithiumphosphat, Natriumsuccinat, Kaliumsuccinat, Lithiumsuccinat, Natriummalat, Kaliummalat, Lithiummalat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Lithiumhydrogencarbonat und Kombinationen davon besteht, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Metallionenchelator aus der Gruppe, welche aus EDTA, DTPA, NTA, Inosithexaphosphat, Tripolyphosphat, Polyphosphorsäure, Natriumsuccinat, Kaliumsuccinat, Lithiumsuccinat, Natriummalat, Kaliummalat, Lithiummalat und Kombinationen davon besteht, ausgewählt ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Formulierung zusätzlich ein Salz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Salz aus NaCl, KCl, LiCl und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Metallionenchelator EDTA in einer Konzentration von bis zu 5 mM ist, der nicht-reduzierende Radikalfänger Ethanol in einer Konzentration von bis zu 3% Vol./Vol. ist, der Puffer Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0 ist, und das Salz NaCl in einer Konzentration von 50 mM bis 500 mM ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die superspiralisierte Plasmid-DNA aus der Gruppe, welche aus Influenzavirus-DNA, Hepatitis A-Virus-DNA, Hepatitis B-Virus-DNA, Hepatitis-C-Virus-DNA, Human-Papillomavirus-DNA, DNA von Mycobacterium tuberculosis, Human-Immunschwächevirus-DNA, Varicella-zoster-Virus-DNA, Masernvirus-DNA, Rotavirus-DNA, Mumpsvirus-DNA, Rubellavirus-DNA und Kombinationen davon besteht, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die superspiralisierte Plasmid-DNA für ein Nukleoprotein, Hämagglutinin, ein Matrix-, nicht-strukturelles oder Polymerase-Genprodukt von Human-Influenzavirus kodiert.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches ferner die Schritte des Einbringens der stabilisierten DNA-Präparation in eine zweite Formulierung, die einen amorphen Zucker umfaßt, und des Lyophilisierens der resultierenden Lösung umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der amorphe Zucker Sucrose oder Lactose ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches ferner die Lagerung der stabilisierten Präparation in Abwesenheit von Licht umfaßt.
Stabilisiertes Nukleinsäure-Vakzin oder stabilisierte Gentherapieprodukt-Präparation, welche(s) umfaßt: a) gereinigte superspiralisierte Plasmid-DNA; b) Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0; c) Ethanol bis zu 3% Vol./Vol.; d) EDTA in einem Konzentrationsbereich bis zu 5 mM; und e) NaCl in einer Konzentration von 50 mM bis 500 mM.
Stabilisierte Präparation nach Anspruch 13, wobei von der superspiralisierten Plasmid-DNA Metallionen entfernt wurden.
Stabilisierte Präparation nach Anspruch 13 oder 14, wobei die NaCl-Konzentration 100 mM bis 200 mM beträgt.
Stabilisierte Präparation nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der pH-Wert des Puffers 8,5 bis 9,0 beträgt.
Stabilisierte Präparation nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 16, wobei EDTA in einer Konzentration bis zu 500 μM anwesend ist.
Stabilisierte Präparation nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 17, wobei Ethanol in einer Konzentration bis zu 2% anwesend ist.
Stabilisierte Präparation nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18, wobei die superspiralisierte Plasmid-DNA aus der Gruppe, welche aus Influenzavirus-DNA, Hepatitis A-Virus-DNA, Hepatitis B-Virus-DNA, Hepatitis-C-Virus-DNA, Human-Papillomavirus-DNA, DNA von Mycobacterium tuberculosis, Human-Immunschwächevirus-DNA, Varicella-zoster-Virus-DNA, Herpesvirus-DNA, Masernvirus-DNA, Rotavirus-DNA, Mumpsvirus-DNA, Rubellavirus-DNA und Kombinationen davon besteht, ausgewählt ist.