JP4386965B2 - Dnaワクチン製剤 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関し、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関する。開示の製剤は、DNA医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を誘導する。
開示の背景
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、DNA医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
DNAプラスミドワクチンは、医薬品としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型(open-circlular)および直鎖型(linear)に変換される。様々な保存条件(低pH、高温、低イオン強度)により、このプロセスは促進される可能性がある。本発明では、DNAプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを(コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって)除去および/またはキレート化することで、DNAプラスミドを安定化し、保存の期間にプラスミドDNAを分解プロセスから守る。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからDNAプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、DNAワクチンの安定性を最大化する製剤においては、緩衝液の種類、pH、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てを制御しなければならない。保存の間、プラスミドを安定化させるために、適切な製剤賦形剤を用いてDNAワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型DNAプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の2つの異なる化学機構によって生じると考えられる(何故なら、これらの高度に精製されたDNA標本はヌクレアーゼを含まないため):(1)脱プリンに続くβ脱離、および/または、(2)フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、DNA鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、DNA含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してDNAが安定化されることを示す(Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照)。これらの報告および他の発表されている報告に基づけば、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、DNA安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上したことになり、これはすでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドDNAの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用される、EDTA、デスフェラール、エチレンジアミンジ(o−ヒドロキシフェニル酢酸(EDDHA))やジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤(例えば、ポリリン酸)であればどれでも、DNAの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がDNAを安定化できるのに、なぜEDDHA、デスフェラール、及びDTPAではDNAを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら4つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが(微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより)DNAの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、EDTAとATPのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸(ATPの金属結合部分)がDNAの安定性を向上させ、しかし、EDTAではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。DNA製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような経験主義的な試験が必要となろう。
保存中のDNA製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および/またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがDNAの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、DNAの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元(最も損傷能力を持った)状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、DNAを安定化すると期待される(ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく)幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってDNAの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとp−アミノ安息香酸(パラアミノ安息香酸)はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数(k=1.1×1010M-1s-1;Freitas and Filipe, 1995, Biol. Ttace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照)を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはDNA安定性を促進できず、p−アミノ安息香酸は事実上、DNAの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、フリーラジカルスカベンジャーを経験主義的に個別スクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてDNA安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、pH、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、DNAの凍結乾燥もDNAの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところでは、最も安定したDNAワクチンを提供する製剤とは、pHが7から8の緩衝液(リン酸または重炭酸塩)、100〜200mMの塩(NaCl、KClまたはLiCl)、金属イオンキレート化剤(コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸)、非還元フリーラジカルスカベンジャー(エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド)、及び最も高い適切な濃度のDNAを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたDNAを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
本発明製剤と方法について、インフルエンザウイルスに対するDNAワクチンを例にとって述べる。この開示中のいかなる部分も、特異的DNAワクチンに関する製剤および方法を限定するものと解釈してはならない。
インフルエンザは急性の発熱性疾患であり、呼吸器を介してインフルエンザA型またはB型ウイルスに感染することによって引き起こされる。インフルエンザは世界的に勃発し、ほとんど毎年周期的に、また全国的に流行する。インフルエンザは顕著な全身的症状や、入院を必要とする深刻な状態(ウイルス性肺炎など)、また二次的細菌性肺炎などの合併症を引き起こすことがある。最近の米国に於ける流行病は毎年10,000人を越える(最大40,000人)死者を余計にもたらしていると考えられ、これに対して流行のない年の死者は5,000−10,000人である。インフルエンザの罹患率と死亡率を予防する最善の方法はワクチン接種である。現在の認可されたワクチンは卵内で増殖させたウイルスから得られ、これが不活化されたもので、3株のウイルス(2株のA型と1株のB型)について作られている。以下の3種類に対するワクチンが入手可能である:全ウイルス、サブビリオン、精製された表面抗原。この場合、全ウイルスを用いるワクチンでは発熱反応が増加するので、子供には後者2種だけが使用される。9歳以下の子供は2回の免疫が必要で、一方、大人は1回だけの免疫注射で十分である。しかし、年配の患者では、予防接種後の抗体力価が4カ月または4カ月未満で防衛可能なレベルよりも下がることが観察されていることから、「初秋に予防接種した患者は、冬や初春に行う2度目の接種用量から効果を得る」ことが示唆されている(Medical letter 32:89-90, Sept.17, 1993参照)。これらのワクチンは、最近のどのウイルス株が臨床的に循環しているのかを予測し、どの新しい毒性のある株が来たるべき風邪の季節に優勢となるのかを評価して、毎年再調製される。再接種は毎年、行うことが望ましい。
認可されたワクチンの限界は以下の通りである:
1)特にA型のインフルエンザは抗原が多様であるため、このウイルスは前回の接種(または前回の感染)で産生された抗体では中和されない。新しい株は、点変異(抗原のドリフト)、および表面糖タンパク質(赤血球凝集素[HA]とノイラミニダーゼ)をコードした遺伝子の再配列(抗原のシフト)によって生じるが、一方で、内部のタンパク質はドリフトした株とシフトした株の間で高度に保存されている。免疫接種は「ホモロガスな」株−特異抗体を介した免疫を誘導するが、「ヘテロロガスの」グループに共通な、細胞を介した免疫に基づいた免疫は誘導しない。
2)もし優勢な循環しているインフルエンザウイルス株のシフトやドリフトが、ある年から翌年に掛けて顕著でなかったとしても、抗体力価は減少するので、免疫は毎年、行われなければならない。血球凝集阻止反応(HI)と中和抗体の効力は数カ月から一年間持続して、以後徐々に低下すると報告されているが、免疫実務諮問委員会(Advisory Committee on Immunization Practices)は、主だった変動やシフトがない場合でも毎年の免疫が必要である理由として、予防接種に引き続いて一年間、抗体力価が減少し続けることを挙げている。(HI抗体はインフルエンザウイルスの赤血球を凝集させる能力を抑制する。中和抗体のように、それらは主としてHA抗原に結合する。血球凝集阻止反応検査は簡単で、中和検定よりも費用も掛からず、したがって、あるインフルエンザ株に対して作られた抗体が、異なる株にも反応する能力を測定する方法としてしばしば用いられる。上に述べたように、「Medial Letter」誌は、特定の高い危険率を負った人や老人は、防衛に係る抗体力価が短期間で失われるため、1シーズンに予防接種を2度受けなければならないと示唆している。
3)ワクチンは有効性の最適状態が得られない。次のシーズンに対応したワクチンの開発は、訪れるであろう循環している株をどう予測するか(ウイルスを見張るためのサンプリングをアジアで行って)に掛かっているが、これは不正確であり、その結果、ワクチン製造に用いた株と実際に世間で循環している株でタイプがほとんど合わない事態を招く。さらに、1992から1993年の風邪のシーズンに起こったように、新しいH3N2株(A/Beijing/92)が風邪のシーズンの後半になって臨床的に明らかになることもある。この時は、初期のH3N2株(A/Beijing/89)によって作られた抗体と、A/Beijing/92の交叉反応性が、抗原シフトのせいで悪かったため、1993−1994年のワクチン組成を変える必要を促した。しかし、現在の認可されたワクチンを製造し、定式化するために長い時間が必要だったため、当時のワクチンには防衛力がないことが明らかで、新たに循環し出したH3N2株の毒性が高まっていたにも関わらず、新しいワクチン株は、1992−1993年のシーズンに導入することが出来なかった。
理想的な普遍的インフルエンザワクチンは以下の特性を有する:
1)グループに共通の(ヘテロロガスな)防衛力の創出
2)抗体反応の幅の拡大。何故なら、CTLは病気からの回復に役割を演じていると考えられるので、CTLの反応だけに基づいたワクチンは病気の持続期間を短縮化する(病気が無症状とみなされる所まで)と期待されたが、病気そのものを完全に防ぐことは出来なかった。
3)抗体反応の持続時間の延長。インフルエンザ感染の罹患率と生存率にある高い危険率を抱えているグループの一つ(老人)は、同時に年間の免疫に対して防衛的抗体力価が急速に減少して効力を失ってしまうグループでもあるので、改良されたワクチンは、長く効力を維持し防衛力となる力価を持つ抗体を産生するものでなければならない。
ポリヌクレオチド構築物、例えばタンパク質をコードしたDNAプラスミドを筋肉内に接種すると、筋肉細胞中にin situでタンパク質を生産することが示されている。ウイルスタンパク質をコードしたcDNAプラスミドを用いると、抗体反応とCTL反応の両方が起こり、これは引き続く抗原曝露に対し同種株または交叉株を防衛することにより、それぞれホモロガスな防衛とヘテロロガスな防衛を提供する。これらの種類の免疫応答のそれぞれが、現行の予防接種の戦略よりも潜在的な有利さを提供する。抗体を産生させるためにPNV(ポリヌクレオチドワクチン)を使用すれば、抗体反応の期間の延長をもたらすことができるばかりでなく、臨床的に循環しているウイルス株の正確な配列を有すると共に野性タンパク質(組換えタンパク質に対峙するものとして)に固有な翻訳後修飾とコンフォメーションを有する抗原を供給することができるかもしれない。この手段によるCTL反応の生起は、交叉株に対する防衛に利点があり、生きた潜在的病原性ベクターまたは弱毒ウイルスを用いなくともよいという利点を提供する。
したがって、本発明では、核酸を生きた組織に導入してタンパク質を発現させる既知の方法のいずれをも対象とする。本発明は、ウイルス特異的なCTLを産生するためにウイルスタンパク質を抗原処理経路に導入する方法を提供する。このように、ウイルス病原体に対して望ましい予防免疫応答を誘導できる特異的治療剤が必要とされているが、インフルエンザウイルスに対しては、本発明がその要求に応えるものである。この治療的アプローチに於いて特に重要なことは、T細胞免疫反応を誘導する能力であり、この能力によって、抗原遺伝子が得られた株に対してヘテロロガスなウイルス株であっても、その感染を予防できるのである。したがって、本発明は、次の各ウイルスタンパク質をコードしたDNA構築物を提供する:ヒトインフルエンザウイルスの核タンパク質(NP)、赤血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NM)、マトリクス(M)、非構造(NS)、ポリメラーゼ(PB1とPB2=基本ポリメラーゼ1と2;PA=酸性ポリメラーゼ)、またはそれ以外のインフルエンザ遺伝子で、特異的なCTLを生成する産物をコードするインフルエンザ遺伝子の全て。
発明の概要
本発明は、核酸医薬品の新しい製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、DNA医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入され、ヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
DNAプラスミドワクチンは、医薬としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型(open-circlular)および直鎖型(linear)に変換される。このプロセスは、様々な保存条件(低pH、高温、低イオン強度)によって促進される場合がある。本発明では、DNAプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを(コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって)除去、および/またはキレート化することで、DNAプラスミドを安定化し、保存中にプラスミドDNAが分解されないようにする。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからDNAプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、DNAワクチンの安定性を最適化する製剤においては、緩衝液の種類、pH、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てが制御されなければならない。保存中、プラスミドを安定に保つために、適切な製剤賦形剤を用いてDNAワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型DNAプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の2つの異なる化学機構によって生じると考えられる(何故なら、これらの高度に精製されたDNA標本はヌクレアーゼを含まないため):(1)脱プリンに続くβ脱離、および/または、(2)フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、DNA鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、DNA含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してDNAが安定化されることを示す(Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照)。これらの報告および他の発表されている報告に基づくと、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、DNA安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上した点について、すでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドDNAの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用されるEDTA、デスフェラール、エチレンジアミンジ(o−ヒドロキシフェニル酢酸(EDDHA))やジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤(例えば、ポリリン酸)であればどれでも、DNAの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がDNAを安定化できるのに、なぜEDDHA、デスフェラール、及びDTPAではDNAを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら4つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが(微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより)DNAの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、EDTAとATPのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸(ATPの金属結合部分)がDNAの安定性を向上させ、一方、EDTAではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。DNA製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような経験主義的な試験が必要となろう。
保存中のDNA製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および/またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがDNAの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、DNAの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元(最も損傷能力を持った)状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、DNAを安定化すると期待される(ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく)幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってDNAの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとp−アミノ安息香酸(パラアミノ安息香酸)はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数(k=1.1×1010M-1s-1;Freitas and Filipe, 1995, Biol. Ttace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照)を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはDNA安定性を促進できず、p−アミノ安息香酸は事実上、DNAの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、多くのフリーラジカルスカベンジャーを実験的にスクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてDNA安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、pH、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、DNAの凍結乾燥もDNAの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところによれば、最も安定したDNAワクチンを提供する製剤とは、pHが7から8の緩衝液(リン酸または重炭酸塩)、100〜200mMの塩(NaCl、KClまたはLiCl)、金属イオンキレート化剤(コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸)、非還元フリーラジカルスカベンジャー(エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド)、及び最も高い適切な濃度のDNAを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたDNAを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
その他の幾つかのDNAワクチン製剤を例証したデータを本明細書に記載する。より具体的には、本発明は、pHが少なくとも約8.0よりも大きく約9.5よりも小さい範囲にある生理学的に許容しうる緩衝液と;約300mMまでの塩(NaCl、KCl、またはLiClを含むがこれらに限定されない)と;金属イオンキレート化剤EDTA(約5mMまでの範囲において)とフリーラジカルスカベンジャーとしてのエタノール(約3%までの範囲において)との組み合わせと;さらに最も高い適切な濃度のDNAと;を含有する脱金属化溶液を滅菌ガラスバイアル中に封入された形態で含有し、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製された上記DNAを光から保護すると共に生理学的に許容される緩衝液中に保存するための包装が施されたDNAワクチン製剤に関する。
本発明は、その一具体的側面においては、前記DNAワクチン製剤は、EDTAとエタノールの組み合わせを含むと共に、約100mMから約200mMのNaCl、約1μMから約1mMの範囲にあるEDTA、及び約2%までのエタノールを含み、これら全ては最も高い適切なDNA濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製された上記DNAを光から保護し且つ生理学的に許容される緩衝液中に保存するための包装が施されたものとされる。
EDTAとエタノールの組み合わせを含有する上記DNAワクチン製剤の他の実施態様においては、NaClを約100mMから約200mM、EDTAを約1μMから750μM含み、エタノールを約0.5%から約2.5%の濃度で含み、これら全ては最も高い適切なDNA濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製された上記DNAを光から保護する包装がなされ、生理学的に許容される緩衝液中、好ましくはpHが約8.0から約9.0のトリス−塩酸とpHが約9.0から約9.5のグリシンの緩衝液中に保存される。pH8.0から9.5などの様々なpH範囲で緩衝能力を有する他の既知の緩衝液も本発明の各種DNAワクチン製剤に用いることが出来ることは理解されるであろう。
本発明の特に好ましい側面においては、EDTAとエタノールの組み合わせを含有する上記DNAワクチン製剤は、NaCl濃度が約100mMから約200mMであり、EDTAが約500μM存在し、エタノールが約1.0%存在し、これら全ては最も高い適切なDNA濃度で滅菌ガラスバイアルに封入されて、ヌクアーゼの混じらない高度に精製されたDNAを光から保護する包装がなされ、生理学的に許容される緩衝液中、好ましくはpHが約8.5から約9.0のトリス−塩酸緩衝液中に保存される。
【図面の簡単な説明】
図1A、図1B、図1C、図1Dは、保存中のインフルエンザDNAワクチン、HA(Georgia/93)の超らせん含有量に及ぼす容器の種類の効果を示す。DNAプラスミド溶液は生理食塩水中DNAが100mcg/mLの濃度となるよう調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。図A−ガラス;図B−シリコーン処理ガラス;図C−加圧蒸気滅菌プラスチック;図D−γ−プラスチック。
図2は、DNAプラスミドの濃度が37℃で保存中のインフルエンザDNAワクチン、HA(Georgia/93)の超らせん含有量に対して及ぼす影響を示す。DNAプラスミド溶液は20−1800mcg/mLの濃度で調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図3は、濃度範囲0−200mMのNaCl溶液を含む10mMリン酸緩衝液(pH6.0)中に保存されたプラスミドDNAのUV−融解曲線を示す。検体は各々100mcg/mLのプラスミドDNAと、以下の濃度のNaClを含んでいた:(a)0mM、(b)5mM、(c)20mM、(d)50mM、(e)100mM、(f)200mM。
図4は、NaCl濃度を増加させた条件下でのプラスミドDNAの安定性を示す。全ての検体は60℃で48時間インキュベート処理され、次にアガロースゲル電気泳動によって解析した。時間0において各検体は超らせんDNAを90%含有していた。
図5A、図5B、図5Cは、それぞれTE(図A)、PBS(図B)、生理食塩水(図C)中における、2価陽イオンの存在下でのプラスミドDNAの安定性を示す。全ての検体は100mcg/mLの濃度で60℃で48時間加熱し、次いでアガロースゲル電気泳動によってその分解を解析した。時間0に於いて、各検体は超らせんDNAを90%含んでいた。
図6は、pH範囲4.5から10に於けるDNAのUV−溶解曲線を示す。各検体は20mcg/mLのプラスミドを含有し、各々、以下のpH緩衝液に溶解されている:(a)クエン酸緩衝液pH4.5、(b)リン酸緩衝液pH6.0、(c)リン酸緩衝液pH6.5、(d)リン酸緩衝液pH7.0、(e)リン酸緩衝液pH7.5、(f)リン酸緩衝液pH8.0、(g)ホウ酸緩衝液pH10。
図7Aは、pH範囲6.0から8.5までのPBSおよびTE(10mMトリス−塩酸、1mM EDTA)緩衝液中での、プラスミドDNAのコンフォメーション安定性を示す。各検体は100mcg/mLに調製し、60℃で48時間インキューベート処理し、次いで電気泳動法によって分解を解析した。時間0に於いて各検体は超らせんDNAを90%含有していた。
図7Bは、37℃で保存中のインフルエンザDNAワクチンの超らせん含有量(DNA安定性)に及ぼす、緩衝液の種類と溶液のpHの影響を示す。DNAプラスミド溶液は20mcg/mLの濃度で調製した。DNAは生理食塩水のみ、またはトリス、ヘペス、リン酸、あるいは重炭酸塩ナトリウム緩衝液と生理食塩水を組み合わせた溶液中に溶解した。緩衝液のpHは時間0(室温)と3カ月(37℃)で測定した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図8A及び図8Bは、25℃(図B)と37℃(図A)、それぞれの温度で保存したインフルエンザDNA(HA−Georgia/93)の超らせん含有量に対する、PBSと生理食塩水(0.9%w/v NaCl)のそれぞれの影響を比較して示す。DNAプラスミド溶液は2mcg/mLの濃度で調製した。プラスミドの超らせん含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図9は、インフルエンザDNAワクチンHA(Georgia/93)をPBSまたは生理食塩水を用いて製造し、PBSと生理食塩水によるこれら両製剤を比較して、単一注射によって誘導されたマウス免疫反応をHI力価を指標として示す。DNAプラスミド溶液は様々な用量で調製し、各ワクチンは200μlづつ各マウスに注射した(一製剤、一用量につき10匹のマウス)。
図10は、25℃で保存中のインフルエンザDNAワクチンの超らせん含有量に対して光への曝露が及ぼす影響を示す。DNAプラスミド溶液は生理食塩水中100mcg/mL・DNAの濃度となるように調製した。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図11は、37℃で保存中のインフルエンザDNAワクチンの超らせん含有量に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果を示す。DNAプラスミド溶液は生理食塩水中100mcg/mL・DNAの濃度となるように調製した。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。
図12は、37℃で保存中のインフルエンザDNAワクチンの超らせん含有量に対する凍結乾燥の効果を示す。DNAプラスミド溶液は、示された糖を含む、リン酸緩衝液またはリン酸で緩衝された生理食塩水(pH7)のいずれかを用いて20mcg/mL・DNAに調製した。製造されたDNA溶液の約0.7mLをガラスバイアルに加え、凍結乾燥を行った。凍結乾燥されたDNA製剤は、液状コントロール(凍結乾燥なし)DNAと比べて、0日目ではプラスミドの超らせん含有量に変化を生じなかった。プラスミドの超らせんの含有量はアガロースゲル電気泳動によって測定した。A−PBS(液状コントロール;凍結乾燥なし);B−5%マンニトールを含むPBS、凍結乾燥;C−5%マンニトールを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥;D−5%ラクトースを含むPBS、凍結乾燥;E−5%スクロースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥;F−4%マンニトールと1%ラクトースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥;G−4%マンニトールと1%スクロースを含むリン酸緩衝液、凍結乾燥。製剤は37℃で1カ月間保存した。
図13は、50℃で、20mM ビス−トリス−プロパン、150mM NaCl中で維持した2週間後のDNA安定性に対するpHの効果を示す(最初の超らせんプラスミドDNAで残存しているものの割合(%))。コントロールはPBS中でpH7.1に維持したDNAである。
図14は、50℃、DNA濃度20mcg/mLの条件下での、DNA安定性に対する緩衝液の種類とpHの効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図15は、50℃、pH7.2、DNA濃度2mcg/mLの条件下での、DNA安定性に対する脱金属化の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図16は、50℃、pH8.0、DNA濃度2mcg/mLの条件下での、DNA安定性に対する脱金属化の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図17は、コハク酸塩とエタノールを含んだ製剤に於けるDNAの安定性に対する脱金属化の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図18は、重炭酸塩とホウ酸を含んだ製剤に於けるDNAの安定性に対する脱金属化の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図19は、30℃で、PBSと重炭酸塩を用いた製剤に於けるDNA安定性に対する脱金属化の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図20は、50℃、PBS中で、pH7.2の条件下でのDNA安定性に対するEDTAとエタノールの効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図21は、50℃、PBS中で、pH8.0の条件下でのDNA安定性に対するEDTAとエタノールの効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図22は、EDTAとエタノールを含む製剤で、50℃の条件下でのDNA安定性に対する鉄の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図23は、PBS中で、pH8.0の条件下でのDNA安定性に対する金属鉄キレート化剤の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図24は、エタノール存在下のPBS中で、pH8.0の条件でのDNA安定性に対する金属鉄キレート化剤の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図25は、1%エタノールを含むPBS中でのDNA安定性に対するEDTA濃度の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図26は、凍結乾燥DNA製剤(製剤No.1から6)と液状DNA製剤(製剤No.7から9)における、50℃、4カ月後のDNAの安定性を示す。製剤No.1は5% スクロース、5mM NaPO4;製剤No.2は、5% スクロース、5mM NaPO4、脱金属化;製剤No.2は、5% スクロース、5mM NaPO4、150mM NaCl;製剤No.4は、5% スクロース、5mM NaPO4、150mM NaCl、脱金属化;製剤No.5は、4% マンノース、1% スクロース、5mM NaPO4;製剤No.6は、4% マンノース、1% スクロース、5mM NaPO4、脱金属化;製剤No.7は、10mM NaPO4、150mM NaCl、0.5mM EDTA、2% エタノール、pH8.0;製剤No.8は、20mM トリス、150 NaCl、10mM コハク酸塩、2% エタノール、pH8.2;製剤No.9は、20mM グリシン、150mM NaCl、10mM コハク酸塩、2% エタノール、pH9.0である。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図27は、鉄とEDTAを含む製剤に於けるDNA安定性に対する光の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図28は、鉄とEDTAとエタノールを含む製剤に於けるDNA安定性に対する光の効果を示す。DNAの安定性は超らせん(SC)DNA残存率の初期値に対する%で測定している。
図29は、1%エタノール、0.5mM EDTA、pH7.4のPBS中での、脱プリンのアレニウスプロットを示す。
図30は、1%エタノール、0.5mM EDTA、pH7.4のPBS中での、β脱離のアレニウスプロットを示す。
図31は、刊行物記載のk1値とk2値、または測定したk1値とk2値を用いて予測した50℃でのDNA安定性の予測値を示す。
図32は、pH7.4に於いて測定されたk1値とk2値に基づいて計算した、30℃に於けるDNA安定性の予測値を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸医薬品の新規製剤に関するもので、特に核酸ワクチン製品と核酸遺伝子治療製品の製剤に関するものである。開示の製剤は、DNA医薬品のコンフォメーションを安定化させる。ワクチンは直接、筋細胞に導入されてヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫応答の産生を促す。
DNAプラスミドワクチンは、医薬品としての形態で保存される間に物理化学的な変化を受け、超らせん型プラスミドから開環型(open-circlular)および直鎖型(linear)に変換される。様々な保存条件(低pH、高温、低イオン強度)により、このプロセスは促進される可能性がある。本発明では、DNAプラスミド溶液、調製緩衝液、またはガラスバイアルや栓から、微量金属イオンを(コハク酸またはリンゴ酸、または多価リン酸リガンドを有する他のキレート化剤によって)除去および/またはキレート化することで、DNAプラスミドを安定化し、保存の期間にプラスミドDNAを分解プロセスから守る。これに加えて、完全に脱金属化された溶液中でさえ発生するフリーラジカルからDNAプラスミドの損傷を防ぐためには、非還元フリーラジカルスカベンジャーが必要である。さらに、DNAワクチンの安定性を最大化する製剤においては、緩衝液の種類、pH、塩濃度、光への曝露、およびガラスバイアルを準備するために用いられる滅菌方法の種類などの全てを制御しなければならない。保存の間、プラスミドを安定化させるために、適切な製剤賦形剤を用いてDNAワクチンの凍結乾燥も行なわれる。
科学文献によれば、超らせん型から開環型へ、さらに直鎖型DNAプラスミドへの変換を起こす鎖切断反応は、以下の2つの異なる化学機構によって生じると考えられる(何故なら、これらの高度に精製されたDNA標本はヌクレアーゼを含まないため):(1)脱プリンに続くβ脱離、および/または、(2)フリーラジカル酸化。微量金属イオンを除去することによって、DNA鎖を切断するフリーラジカル酸化機構が抑圧されるとはいえ、驚くべきことに、発表されている脱プリン及びβ脱離の速度と本発明者らの安定化データを比較してみると、本発明者らの結果は、DNA含有溶液から微量金属イオンの除去またはキレート化を行うと、両方の分解機構に対してDNAが安定化されることを示す(Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3610-3618; Lindahl et al., 1972, Biochemistry 19:3618-3623参照)。これらの報告および他の発表されている報告に基づけば、微量金属イオンを除去しても、脱プリンまたはβ脱離の速度を変えるような顕著な効果は期待できないと考えられる。したがって今回微量金属イオンを除去した結果、DNA安定性が期待した値よりも遥かに大きく向上したことになり、これはすでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数に基づいて説明することはできない。
加えて、本発明者らのデータは、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、コハク酸、リンゴ酸のような特異的なキレート化剤が保存中のプラスミドDNAの安定性を向上させることを示したが、一方で、他の一般的に使用される、EDTA、デスフェラール、エチレンジアミンジ(o−ヒドロキシフェニル酢酸(EDDHA))やジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)などのキレート化剤では、安定性の有意な向上はみられなかった。これらの結果は、多価リン酸リガンドを有するキレート化剤(例えば、ポリリン酸)であればどれでも、DNAの安定性を向上させることを示唆している。しかし発表されている文献からは、イノシトールヘキサリン酸がDNAを安定化できるのに、なぜEDDHA、デスフェラール、及びDTPAではDNAを安定化できないのか不明である。発表された文献では、これら4つのキレート化剤すべてが鉄触媒によって産生されるヒドロキシルラジカルを抑制することを示唆しているので、これらの試薬のいずれもが(微量金属イオンをキレート化して、フリーラジカルの産生を抑制することにより)DNAの安定性を向上させると期待されたが、本発明者らの結果では、それは観察されなかった。しかも上記文献によれば、EDTAとATPのいずれもが金属イオンを触媒にしたヒドロキシルラジカルの産生を助けると報告されているが、本発明者らはトリポリリン酸(ATPの金属結合部分)がDNAの安定性を向上させ、しかし、EDTAではその効果がないことを観察した。従って、金属イオンキレート化剤の保護的効果と、ヒドロキシルラジカルの産生促進能力との間に直接的な相関関係はないように思われる。DNA製剤を安定化させるための適切なキレート化剤を見出すためには、本研究の中に記されているような実験的な試験が必要となろう。
保存中のDNA製剤の安定化には、微量金属イオンの除去および/またはキレート化に加えて、非還元フリーラジカルスカベンジャーを用いることが重要である。本発明者らの結果は、エタノール、メチオニン、グリセロール、ジメチルスルホキシドがDNAの安定性を向上させることを示しており、これは、これらの物質がフリーラジカルを除去して、その結果、保護効果を発揮することを示唆している。さらに、本発明者らの結果によれば、還元剤としての能力を有するアスコルビン酸などのスカベンジャーは、DNAの分解を大きく促進するが、これはおそらくスカベンジャーが還元剤として作用して、微量金属イオンの状態を還元(最も損傷能力を持った)状態に保持するためであろうと考えられる。また、本発明者らの結果は、DNAを安定化すると期待される(ヒドロキシルラジカルの既知の速度定数に基づく)幾つかのスカベンジャーが、予想とは違ってDNAの分解を促進し、もしくは安定性の向上に全く寄与しないことを示す。例えば、ペントキシフィリンとp−アミノ安息香酸(パラアミノ安息香酸)はヒドロキシラジカルに対して大きな速度定数(k=1.1×1010M-1s-1;Freitas and Filipe, Biol. Trace Elem. Res. 47:307-311; Hu et al., 1995, J. Nutr. Biochem. 6:504-508参照)を有するヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるが、ペントキシフィリンはDNA安定性を促進できず、p−アミノ安息香酸は事実上、DNAの分解を促進する。これらの結果より、有用な化合物を同定するためには、多くのフリーラジカルスカベンジャーを実験的にスクリーニングすることが、最も効果的な手段であると思われる。
医薬製剤に於いてDNA安定性を最大化するためには、緩衝液の種類、塩濃度、pH、光への曝露量およびガラスバイアル準備の際に用いる滅菌の種類など、全てが重要なパラメータとなり、これらは、さらに安定性を最適化するために製剤中で制御されなければならない。また、DNAの凍結乾燥もDNAの安定性を向上させるために適切な製剤賦形剤を用いて行われ、これはおそらく脱水和によって分子運動が不活発となるためであろう。従って、本発明者らのデータが示すところでは、最も安定したDNAワクチンを提供する製剤とは、pHが7から8の緩衝液(リン酸または重炭酸塩)、100〜200mMの塩(NaCl、KClまたはLiCl)、金属イオンキレート化剤(コハク酸、リンゴ酸、イノシトールヘキサリン酸、トリポリリン酸、またはポリリン酸)、非還元フリーラジカルスカベンジャー(エタノール、グリセロール、メチオニン、またはジメチルスルホキシド)、及び最も高い適切な濃度のDNAを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌ガラスバイアル中に保存され、ヌクレアーゼの混じらない高度に精製されたDNAを光から保護する包装が施されたものでなければならない。
インフルエンザウイルスタンパク質をコードするDNA構築物は動物の体内で防御免疫反応を誘発する。動物体内の免疫反応には、マウスに見られる抗体とCTLの産生、フェレットと霊長類に見られる抗体産生、マウスとフェレットに見られるインフルエンザのホモロガスな、ドリフトおよびシフトされたウイルス株によるウイルス曝露からの防御などがある。ウイルスタンパク質をコードするDNAによる免疫で最も注目すべき結果は、ウイルスの全く別個の亜型(サブタイプ)に対しても防御能力を持つことであろう。このことからCTL−誘発成分をワクチンに加えることで新しいバリアントがインフルエンザの流行中に発生したり、翌年のワクチン株を選択する時点では全く予期されていなかったような新しいバリアントが発生してもその衝撃を緩和できる。重要なことは、フェレットにおいてHA、NP、MI遺伝子をコードするcDNAベクターによる免疫の方が、認可ワクチンよりもより効果的にウイルスのドリフトした株に対して防御できたことである。このことからIDV(インフルエンザDNAワクチン)中の内部遺伝子をコードする構築物の使用が正当化される。
一実施例においては、ドリフトおよびシフトした抗原に対する防御を各グループに共通して与えるためにワクチン製品を、例えばA/H1N1(A/Texas/91)、A/H3N2(A/Georgia/93)、B(B/Panama/90)のそれぞれのウイルスを代表する3種の広く流布している臨床株から採取したHAをコードする別個のDNAプラスミド、及びA(Beijing/89; H3N2)とBの両株から採取された内部保存タンパク質NPとM1(マトリックス)をコードするDNA構築物から構成している。HA DNAはHAを産生しHAに対する中和抗体をもたらす働きをする。これはタイプ特異的であり、現在認可されているタンパク質をベースとしたワクチンに比べてドリフトした株に対する防御幅が広くなると考えられる。NPとMI構築物の方は、CTL産生をもたらすが、これはより少量のウイルス負荷でより早い病状の回復が望める交叉株防御を提供するであろう。(筋肉細胞中で非複製的、非組込み的な形態のエピソーム状で)DNA構築物は持続的存続が予想されるので、現在のワクチンと比べより長期に渡り防御が持続することが期待される。
現在認可されているワクチンより優れていると予想される利点として、CTL反応による防御幅の拡大±抗体幅の拡大、および防御持続性の長期化などが挙げられる。IDVアプローチによって新しいDNA構築物は臨床上の分離株からより直接的に作ることが可能なため、現在認可されているワクチンに対して行っている再配列体の作製、選択、増殖の必要が無くなる。リンパ球反応。
インフルエンザAの保存された内部タンパク質をコードするDNA発現ベクターを筋肉内(i.m.)注射した結果、その後のウイルス攻撃に対する防御免疫が有意に発現した。特にNP-特異的抗体および一次性のCTLが産生された。NP DNA免疫化の結果、対照群に比べウイルス肺力価が減少し、体重減少が抑制され、生存率が上昇した。NP抗体のみでは有効にウイルス感染と戦うことが不可能であったこと(実施例4参照)から示されるように、防御免疫反応はNP-特異的抗体によって媒介されておらず、従ってNP-特異的細胞性免疫による可能性が高い。しかもNPに対抗する一次性CTLが有意なレベルで産生された。その防御はDNAがクローン化された株とは異種のインフルエンザAの毒性株に対するものであった。またチャレンジ(攻撃ウイルス)株はA/PR/8/34株後30年以上も経ってから発生した。このことは保存タンパク質に対する免疫反応は可変外膜(エンベロープ)タンパク質の抗原シフトやドリフトにもかかわらず有効であることを示している。インフルエンザウイルス遺伝子の各産物は何らかの程度の保存を示し、また細胞内発現およびMHCプロセシングに反応してCTLが産生される可能性があることから、他のインフルエンザウイルス遺伝子によって、NPに対する反応と類似した反応が生じると予測できる。免疫エピトープを見つける方法は今では当分野でよく知られている(例、Shiraiら、1992、J. Immunol 148:1657-1667; Choppinら、1991、J. Immunol 147: 575-583; Calin-Laurensら、1992、Vaccine 11: 974-978参照)。従って発現ベクターにおいてクローン化された塩基配列が明らかにされたジャンクションに示されるように(後記参照)これらの遺伝子の多くがこれまでにクローン化され、これらの構築物は入手可能な予防薬となっている。
DNA構築物を調製し精製する標準的な分子生物学の技術により、本発明のDNA治療薬は調製可能である。従って本発明の製品製造には標準的な分子生物学の技術で十分であるが、ここに開示される特定の構築物は、驚くべきことに異種の株に対しても防御する新規な治療薬を提供するが、これは標準的な不活性化された全ウイルスまたはサブユニットタンパク質に対するワクチンではこれまで達成不可能であった。
ワクチン被接種者に導入されるべき発現可能なDNA量はそのDNA構築物に使用される転写・翻訳プロモータの能力および発現された遺伝子製品の免疫原性によって変わる。一般に免疫学的あるいは予防的に有効な量である約1μgから1mg、好ましくは約10μgから300μgが筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮内注射、経皮インプレッション、また腹腔内・静脈内投与、吸入など他の投与方法も考えられる。追加ワクチン接種を提供することも考えられる。
用いられるDNAは裸である。すなわち被接種者の免疫システムに影響を与えるいかなるタンパク質、アジュバント、他の薬剤によっても修飾されない。この場合、DNAは生理学的に許容しうる溶液中、例えば滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水中に存在することが望ましいがこれらに限定されない。あるいはDNA−リポソーム混合物としてリポソーム、例えばレシチン・リポソームや当業者に既知の他のリポソームなどがDNAに会合していてもよい(例、WO93/24640参照)。また免疫反応を高めるために本技術分野で知られているアジュバント、例えばタンパク質や他の担体などのアジュバントがDNAに会合していてもよい。DNAの細胞内への取り込みを補助する物質には例えばカルシウムイオン、ウイルスタンパク質、他のトランスフェクション促進剤などがあり、これらを有利に使用してもよい。ただしDNAの細胞内での取り込みを補助する物質はこれらに限定されない。これらの物質は一般にトランスフェクション促進剤または薬学的に許容しうる担体と呼ばれる。ここで遺伝子という語は離散ポリペプチドをコードする核酸の染色体部分を指す。また医薬という語とワクチンという語は同じ意味の語として互いに置き換え可能に使用されており、免疫反応を誘発するのに有用な成分を指す。構築物とプラスミドも同じ意味を持つ語として使用されている。ベクターという語は本発明の方法に従って使用するために、内部にクローン化された遺伝子を組み込んだDNAを指す。
本発明の別の態様ではDNAワクチンはヒトインフルエンザウイルス核タンパク質、赤血球凝集素、マトリックス、非構造またはポリメラーゼ遺伝子産製物をコードしている。この実施例の特定の例が後に説明されるが、そこではヒトインフルエンザウイルス遺伝子が、ヒトインフルエンザウイルス分離株A/PR/8/34の核タンパク質、基本ポリメラーゼ1、非構造タンパク質1、赤血球凝集素、マトリックス1、および基本ポリメラーゼ2;ヒトインフルエンザウイルス分離株A/Beijing/353/89の核タンパク質;ヒトインフルエンザウイルス分離株A/Texas/36/91の赤血球凝集素遺伝子;ヒトインフルエンザウイルス分離株B/Panama/46/90赤血球凝集素遺伝子;のいずれかをコードしている。
本明細書に提示されているデータにより、その他いくつかのDNAワクチン製剤が例示される。特に本発明は、最低pHが約8.0以上、最高pHが約9.5以上の範囲にある生理学的に許容しうる緩衝液、約300mM以下の塩(例、NaCl,KCl,LiCl;ただしこれらに限定されない)、フリーラジカルスカベンジャーエタノール(約3%以下)と組み合わせた金属イオンキレート化剤EDTA(約5mM以下)および最適の濃縮DNAを含有する脱金属化溶液を含み、滅菌されたガラス製のバイアルに入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のDNAが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液中に入れられたDNAワクチン製剤に関する。
本発明の具体的一面においては、DNAワクチン製剤はEDTAとエタノールの組み合わせ、濃度が約100mMから約200mMのNaCl、約1μMから約1mMのEDTA、約2%以下添加されたエタノール、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮DNAの中に入れられ、高純度に精製されヌクレアーゼを含まないDNAが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液中にある。
EDTAとエタノールの組み合わせを含む本発明のDNAワクチン製剤の別の実施例では、NaClが約100mMから約200m、EDTAが約1μMから約750μM、エタノールが約0.5%から約2.5%存在し、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮DNAの中に入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のDNAが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液-好ましくはpHが約8.0から9.0のTris−HCl-中にある。様々なpH範囲内-例えばpH8.0から9.5-の緩衝能を持つ他の既知の緩衝液もまた本発明の様々なDNAワクチン製剤に使用できることが理解されるであろう。例えば、Tris−HClはおよそpH9.0まで有効であるが、グリシン緩衝液はpHが約9.0以上約9.5以下で有効である。
本発明の特に好ましい側面においては、DNAワクチン製剤がEDTAとエタノールの組み合わせ、濃度が約100mMから約200mMのNaCl、約500μMのEDTA、約1%添加されたエタノール、これらすべてが滅菌されたガラス製バイアル中の最適な濃縮DNAの中に入れられ、ヌクレアーゼを含まない高純度のDNAが露光されないよう包装され、生理学的に許容しうる緩衝液(好ましくはpHが約8.5から9.0のTris−HCl)中に置かれる。
提示されたデータによれば、製剤のpHはDNAの安定性に影響を与え、最適pHは≧8.5である。図14に示すようにテストされた製剤のうち最もpHの高い製剤(pH9.0)が最大のDNA安定性を示した。緩衝液のタイプがDNAの安定性に与える影響も調べ、そのデータが本明細書に開示されている。簡潔に言うと、DNAの安定性に対する最大の緩衝液効果が見られたのはグリシンとビストリスプロパンを比較した時であった。pH9ではグリシン緩衝液の方が同pHでビストリスプロパン製剤より有意に優れていた。逆にトリス、ビシン、トリシンの各緩衝液はpH8.2で12週間にわたりほぼ同レベルのDNA安定性を示した。緩衝とDNA安定性の相関性を調べたデータから、DNAのフリーラジカル酸化を抑制することによりDNAの安定性が全体的に向上し、その後製剤のpHによって抑制されることが示される。
光がDNAの安定性に与える影響について本明細書で開示されている。光の有害な影響はその大部分が製剤にEDTAとエタノールを添加することにより排除できる可能性が示されている。これらの製剤成分を添加することにより、光曝露または遮光して保存したサンプル中のDNAはいずれの場合も安定する。従ってEDTAとエタノールを含有するDNAワクチン製剤は、これら2種類の安定剤のいずれも含有しない製剤に比べ光や微量金属イオンの有害な影響をはるかに受けにくいと思われる。
本明細書では他の様々なデータも開示されているが、DNAワクチン製剤を生成する前の脱金属化緩衝液の影響についても調べた。脱金属化によってグリセリン含有製剤のDNA安定性はわずかに向上するが、エタノール製剤ではDNAの安定性に影響は無いことが本明細書に開示されている。このデータからフリーラジカル酸化をコハク酸エステルとエタノールで抑制するか、あるいは脱金属化で微量金属イオンを除去するかのいずれによっても同程度のDNAの安定性が得られることがわかる。
データからはまた脱金属化によって幅広い温度領域や保存期間においてDNAの安定性が向上することがわかる。
またエタノールがEDTAの存在下で有効なフリーラジカルスカベンジャーであることを示すDNA安定性実験も行われた。
エタノールとEDTAの組み合わせにより(pH7.2で)DNAの安定性は4週間まで大きく向上する。しかしその後第8週までは安定性はわずかしか向上しない。これらの結果からエタノールはEDTAの非存在下よりもその存在下でフリーラジカルスカベンジャーとして有効であることがわかる。またこれらの結果からエタノールの非存在下でEDTA単独の場合はDNAの安定性が悪くなるのに対し、エタノールの存在下ではDNAの安定性が向上することも示されている。これらの結果から強く示唆されるのはエタノールはEDTAの存在下でより有効なスカベンジャーであり、それはEDTAがDNAと結合している金属イオンを除去し、その結果、DNAに結合する鉄によってラジカルが産生されるのとは反対に、バルク溶液中にヒドロキシルラジカルを産生させるためである。本発明を例証するために提示されたデータからはまたエタノールとEDTA/EtOHのDNA安定効果はpH7.2よりもpH8.0でより大きいことがわかる。またコハク酸エステルとエタノールの組み合わせでも同程度の防御効果が得られることも示されている。
さらに別の例示として本発明は、代替金属イオンキレート化剤、例えばNTA(アンモニア三酢酸)やDTPA(ジエチレントリアミペンタアセテート酸)(但しこれらに限定されない)を開示する。提示されたデータによるとNTAとDTPAのいずれもがエタノールの非存在下でもDNAの安定性を向上させるが、DTPAの方が好ましい。
本発明は液体または凍結乾燥のDNAワクチン製剤に関する。提示されたデータによると最も優れた凍結乾燥製剤は液体製剤よりも短期間ではより安定していたが、長期間では液体製剤はよく安定していた。またこれらの結果から脱金属化によって製剤1と2の凍結乾燥DNAの安定性は向上するが、別の凍結乾燥製剤中の%SC DNAには脱金属化の影響はほとんどないことがわかる。従って凍結乾燥はDNAワクチン安定化に有効な方法であり、製剤緩衝液の脱金属化は一部の製剤中では凍結乾燥DNAの安定性を向上させる。
本発明をさらに定義するため、以下に実施例を示す。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1
V1J発現ベクター: V1JプラスミドはV1プラスミド及び市販のpUC18プラスミドから得られる。このV1をSspIとEcoRI制限酵素により消化し、2つのDNA断片を得た後、小さいほうの断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。なお、このDNA断片はヘテロロガス遺伝子発現を制御するCMVintAプロモーター及びウシ成長ホルモン(BGH)転写終止エレメントを含んでいる。次に、“両端がブラントエンドされた”他のDNA断片との連結を促進するため、このDNA断片の両端をT4DNAポリメラーゼ酵素により、ブラントエンドとした。
発現ベクターの“バックボーン”として、pUC18プラスミドを選んだ。理由はこのプラスミドが大量のプラスミドを産生することで良く知られており、そのDNA塩基配列及び機能も良く調べられており、かつ、プラスミドのサイズが最小であるためである。このベクターに存在しているlacオペロン部分は本発明の目的には不要であり、さらに、プラスミド収率やヘテロロガスな遺伝子発現に有害であるかもしれないため、Hae II制限酵素による部分消化によって、lacオペロン部分すべてをこのベクターから取り除いた。残っているプラスミド断片はアガロースゲル電気泳動で精製し、T4DNAポリメラーゼ酵素でブラントエンドとし、子ウシ腸アルカリフォスファターゼ酵素処理を行い、上述のCMVintA/BGHエレメントを含むDNA断片と連結した。pUCバックボーン内でこのプロモーターがそれぞれ別々の方向を持つものを得たが、これらのプラスミドのうち一つのタイプが大腸菌でより高いプラスミドDNA収率を示し、このプラスミドをV1Jと名付けた。プロモーター断片とpUCバックボーンの結合部位のDNA塩基配列決定により、V1Jベクターの構造は予想通りであることが分かった。そして、ヘテロロガスな遺伝子発現レベルに関する実験では、V1ベクターに較べ、このベクターは同等もしくはより高い発現を示すことが証明された。
実施例2
V1J発現ベクター内のインフルエンザウイルス遺伝子構築物: インフルエンザウイルスA/PR/8/34株の色々な遺伝子をV1J発現ベクターでクローニングした。V1ベクターの場合と較べ、V1Jは同等もしくはより高い発現を与える。なお、PR8株に存在している遺伝子のDNA塩基配列は決定されており、GENBANKデータベースより入手可能である。以下に記載するクローニングした遺伝子それぞれのDNA断片の大きさはサイジング・ゲルを用いて確認した。また、これらの部分DNA塩基配列と比較した遺伝子のGENBANK受託番号を示す。ウイルス株、例えばATCCから入手したウイルス(A/PR/8/34はATCC VR−95である。また、他の多くの株もATCCに寄託されている)、からこれらの遺伝子を得る方法は、次の通りである。
A.様々なPR8遺伝子のV1Jベクターへのサブクローニング
1. NP: NP遺伝子はpAPR501からサブクローニングした(J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam、Elsevier、1983))。この遺伝子をEcoRIでpAR501から切り出し、その切り出した断片を精製し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドにした。そして、V1JプラスミドをBgl IIで切り、その後、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドとしたV1Jにその断片の長さを挿入した。なお、このクローニングした断片は1.6キロベースであった。
2. NS: NS遺伝子はpAPR801からサブクローニングした(J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam,Elsevier、1983)。この遺伝子をEcoRIでpAR801から切り出し、ゲル電気泳動法で精製し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドにした。このブラントエンド化した断片を、V1JプラスミドをBgl IIで切りT4 DNAポリメラーゼでブラントエンドとしたV1Jに挿入した。なお、このクローニングした断片は0.9キロベース長であった(完全長NSコーディング領域はNS1とNS2を含んでいる)。
3. HA: HA遺伝子はpJZ102よりサブクローニングした(J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam、Elsevier、1983)。この遺伝子をHind IIIでpJZ102から切り出し、ゲル電気泳動法で精製し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドにしたのち、V1JプラスミドをBgl IIで切りT4 DNAポリメラーゼでブラントエンドとしたV1Jに挿入した。クローニングした断片は1.75キロベースであった。
4. PBI: PBI遺伝子はpGem1−PB1からサブクローニングした(クローニングした遺伝子がGem1−PB1であるかどうかはサブクローニングしたDNAの5’及び3’部分とベクターとの結合部域を塩基配列決定により確かめた)(J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam,Elsevier、1983)を参照)。このDNAをpGem−PB1をHind III消化により切り出し、電気泳動法で精製し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドにした。そして、V1JプラスミドをBgl IIで切りT4 DNAポリメラーゼでブラントエンドとしたV1Jに挿入した。クローニングした断片は2.3キロベース長であった。
5. PB2: PB2遺伝子はpGem1−PB2からサブクローニングした(これら遺伝子の5’及び3’部分とベクターとの結合部域は塩基配列決定により確かめた。J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam、Elsevier、1983)を参照)。このDNAをpGem−PB2のBamH I消化により切り出した。電気泳動法で精製された付着末端を有する断片を、V1JプラスミドをBgl IIで切ったVJ1に挿入した。クローニングした断片は2.3キロベース長であった。
6. M1: M1遺伝子はPCRによりプラスミドp8901MITEより得た。そして、このプラスミドのM塩基配列部分はpAPR701をPCRに付すことにより得た(J.F.Young,U.Desselberber,P.Graves,P.Palese,A.Shatzman及びM.Rosenberg著W.G.Laver編“The Origins of Pandemic Influenza Viruses”p129−138(Amsterdam、Elsevier、1983)。PCRにより得たM1断片を電気泳動法で精製し、Bgl IIで切った後、V1JプラスミドをBgl IIで切断したV1J断片とライゲーションした。クローニングしたM1遺伝子断片は0.7キロベースであった。M1タンパク質のアミノ末端は、上に“ATG”コドンとして示されている“センス”プライマーにコードされている。一方、M1の翻訳停止コドンはセンス方向では停止コドンである“TGA”となる、対応する“TCA”コドンによりコードされている。
B.V1Jでのインフルエンザ遺伝子発現構築物
5’プロモーター領域(CMVintA)とクローニングした各遺伝子との間の結合部位の塩基配列を示す。この結合部位の境界点は“/”で示されているが、これは塩基配列が不連続であるということを意味しているのではない。これら構築物を調製する方法については、以下に示すすべての塩基配列の後にその概要を述べる。それぞれ示されている塩基配列は対応インフルエンザ遺伝子の完全長で、かつ、入手可能であり、発現することの出来るDNA構築物である。
それぞれの構築物を培養ヒト横紋筋肉腫細胞株RD(ATCC CCL136)にトランスフェクションして一過性に発現させた。トランスフェクション48時間後、細胞を回収し、溶解した後、ウエスタンブロッテングを行った。(但し、V1J−PR−HA構築物の場合は、マウスでテストしたため、抗HA特異抗体をウエスタンブロッテングを行う前に使用した。これはインビボで既に発現されているためウエスタンブロットで解析する必要を省くためである。)PB1、PB2、そしてNSタンパク質に対する特異抗体はStephen Inglis(University of Cambridge)により提供された。彼はβガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現された、精製タンパク質からポリクローナル抗血清を作製した。抗NPポリクローナル抗血清はA/PR/8/34ウイルスをまるごとウサギに免疫することにより作製した。抗M1抗体は市販のものでBiodesignよりヤギ由来抗fluA抗血清、カタログナンバーB65245Gとして入手できる。それぞれの構築物に関しては、予測された大きさのタンパク質が観察され、コードされているインフルエンザタンパク質がインビトロで発現されていることを確かめた。
これらの構築物の呼称は現行法に従い、“ベクター名−インフルエンザ株名−遺伝子名”とした。どの場合においても、それぞれの塩基配列は既に知られているGENBANKにあるクローニングされ塩基配列決定されたA/PR/8/34の遺伝子塩基配列を用いてチェックした。
C.V1jns産生
DNAの組込み研究を促進させるために、V1JneoにSfi Iサイトを一つ加えた。これは市販されている13塩基対からなるSfi Iリンカー(New England BioLabs)をベクターのBGH配列内のKpn Iサイトに加えることによりなされた。即ち、V1JneoをKpn Iで線状化し、ゲル電気泳動で精製し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドにした後、ブラントエンドのSfi Iリンカーと連結した。単離したプラスミドクローンを制限酵素によるマッピングによって選択した後、リンカー部全域を含む部分の塩基配列決定により確かめた。この新しいベクターをV1Jnsと命名した。なお、Sfi Iを有するV1Jnsを用いてのヘテロロガスな遺伝子発現レベルはKpn Iのみを有するV1Jneoでの発現レベルと同程度であった。
実施例3
微生物細胞の増殖、細胞可溶化、及び清澄化(クラリフィケーション): 1リットルの凍結大腸菌細胞スラリーを、STETバッファー(8%スクロース、0.5%TRITON、50mMTrisバッファー(pH8.5)、50mM EDTA)に加え、8リットルの細胞サスペンジョンを作製した。600nmでのこのサスペンジョンの吸光度は約O.D.30であった。サスペンジョンの均一性を保つため、絶えず撹拌し続けた。その粘稠度は室温(24℃)で1.94cpと測定された。この細胞サスペンジョンをポンプにより、81mL/minの速度で熱交換器を通過させた。なお、細胞液の熱交換器滞在時間は大体35秒に相当する。熱交換器の浴温度を92℃に保った。細胞液の流入口、流出口での温度はそれぞれ約24℃、約89℃(平均)であった。約1リットルのサンプルを熱交換器に付したが、使用チューブに明らかな目詰まりは観察されなかった。ただ、溶解産物は原料に較べいくらか粘稠であった。室温まで冷やしたこの溶解産物の粘稠度は約40cpであった。細胞溶解産物はBeckman J−21を用いて、9000RPM、50分間のバッチ式遠心により清澄化した。この上清の解析から、この方法は細胞の可溶化及び産物の回収において効果的であることが分かった。このフロースルー熱可溶化によって得た産物の回収率はQuigleyとHolmesによる沸騰法の場合の収率と少なくとも同程度であった。ただ、後者の方法はバッチ法で実験室レベルのスケールでしか行なえず、大規模(5リットルもしくはそれ以上)のサンプル処理には適当でない。一方、熱交換プロセスはフロースルーであるため、処理できる細胞サスペンジョンの量に上限が存在しない。従って、この処理方法は高純度のプラスミドDNAを大量に得ることを目的とした非常に大規模に培養したバクテリアの場合に適用することが出来る。
次に、清澄化した溶解産物は、細かい砕片物を取り除くため、0.45ミクロンの孔径のフィルターを通し、この濾過液をさらにカットオフ値分子量約100、000の膜を用いて透析した。
実施例4
熱交換器を用いた細胞可溶化のコントロール及び再現性: 細胞スラリーをポンプで熱交換器を通過させる時の流速(その滞在時間)を調整することにより細胞を可溶化させる温度、即ち流出口での温度、を精密に制御することが出来る。細胞スラリー液を実施例3に記載のように調製し、ポンプで熱交換器を160〜850mL/minの範囲内の流速で通過させた。これに対応した流出口温度はそれぞれ93℃、65℃であった。スラリーの温度は最初24℃であり、浴の温度は96℃の定温に保った。さらに、流出口温度目標値を80℃として、実験を多数回繰り返した。これらの実験から、清澄化上清1リットルあたり24mgの閉環状DNAの収率という一貫した結果を得た。このことはこの一連の過程が再現性を有することを証明している。
実施例5
プラスミドDNAの精製: 大腸菌及びその溶解産物を既に述べたように調製し、100mM EDTA添加が、50mM EDTA添加に較べ、超らせんプラスミドDNAの比率を増加させることを示すため、そして超らせんDNAの収率とにらみ合わせた許容範囲内の流出口温度(即ち、可溶化温度)範囲を決定するため、次のような実験をおこなった。プラスミドDNAの超らせん形は弛緩環状(relaxed circle)DNAよりもより安定であるため、超らせん形のプラスミドDNAを得ることがより望ましい。超らせん形を開環状DNAに変換する一つの方法はDNaseでニックを入れることである。本発明者らはSTET緩衝液のEDTAを50mMから100mMとすることにより、開環状プラスミド形成を最小限に抑えることが出来ることを見いだした。細胞サスペンジョンは既述のように調製した。これらの実験に使用した流速は約186ml/minであり、流入時、流出時及び浴の温度はそれぞれ24℃、92℃、96℃であった。
可溶化温度の許容範囲は各実験で得た超らせんプラスミドの百分率を測定することにより決定した。超らせんプラスミドの濃度は流出時の温度の関数として表わすことが出来ることが分かった。可溶化温度の許容範囲は75℃と92℃の間の温度である。75℃未満の温度では、弛緩環状プラスミド形成が増加した。これはおそらDNase活性が増加するためである。93℃よりも高い温度では、おそらく熱変性のために、超らせんプラスミドのレベルは減少するようである。
連続的な熱可溶化及び遠心の後、清澄化した溶解産物1mlを5μg/mlのRNaseで2時間インキュベートするもの、しないものに分け、これらのサンプルを陰イオン交換カラム(Poros Q/M4.6X100)にかけた。なお、このカラムは前もって溶剤A及びBの50:50混合液で平衡化しておいたものである(HPLC溶剤A:20mM Tris/Bis Propane、pH8.0;溶剤B:1M NaClを含む20mM Tris/Bis Propane、pH8.0)。カラムは100カラム容量以上の溶剤Bの50%〜80%の勾配で溶出した。開環状プラスミドは約68%B溶剤で溶出し、超らせんプラスミドは72%溶剤Bで溶出する。
既に述べたように、陰イオン交換クロマトグラフィーに先立ち透析することにより、カラムにかけることができる溶解産物の量を著しく増加させることが出来る。
陰イオン交換カラムから溶出したプラスミドDNAを逆相HPLCによりそれぞれのDNA形に分離した。このDNA形としては超らせんプラスミド(フォーム1)、そしてニックの入った環状プラスミド(フォーム2)がある。これらの2つのフォームは容易に分離することができるため、それぞれのフォームのプラスミドを単離することが出来た。
実施例6
クロマトグラフィーに基づくプロセスにより得た高純度プラスミドDNA:
大量培養したバクテリアペーストを改良STETバッファーに再懸濁し、バッチ法で熱可溶化した。一方で、同じバクテリアペーストを改良STETバッファーに再懸濁し、上述したフロースルー処理により可溶化した。溶解産物は上述のように遠心し、その上清20mlを上述したように濾過し、上述したバッファーAとBの50:50混合液で前もって平衡化した陰イオン交換カラム(Poros Q/M 4.6x100)にのせ、流速10ml/minで50倍のカラム容量の50%〜85%バッファーBの勾配液で溶出した。カラムによる分画は1画分あたり2.5mlで行った。超らせんプラスミドDNAは72%バッファーBで溶出した。
次に、あらかじめpH8.0の100mM炭酸水素アンモニウムで平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム(Poros R/H)に陰イオン交換によって得たサンプルをのせ、0〜80%勾配のメタノールで結合物質を溶出した。高純度超らせんプラスミドは22%メタノールで溶出した。
アガロースゲル電気泳動、比色定量、上述したHPLC解析によると、図9に示すように、最終産物は非常に純度が高く、90%を超える超らせんプラスミド、10%未満の開環状プラスミドからなっていた。RNAは検出限界以下であった。ゲノムDNA及びタンパク質の混入もまた用いたアッセイの検出限界以下であった。最終段階における超らせんプラスミドの総収率は清澄化した溶解産物の超らせんプラスミド量の約60%であった。
実施例7
数グラムスケールでのプラスミドDNAの精製: 4.5リットルの凍結大腸菌細胞スラリーに、2500ユニット/mlのリゾチームを含むSTETバッファー(8%スクロース、2%Triton、50mMTrisバッファー、50mMEDTA、pH8.5)に加えて33.7リットルの細胞懸濁液を得た。この懸濁液の600nmでの吸光度は約O.D.30であった。懸濁液を均一な懸濁液にするために、室温で15分撹拌し、37℃で連続的に撹拌しながら45分間インキュベートした。その後、室温で連続的に撹拌しながら、ポンプにより、細胞懸濁液を500ml/minの流速で、熱交換器を通した。浴の温度を100℃に保ち、細胞懸濁液の流入口、流出口での温度はそれぞれ24℃、70〜77℃であった。熱交換器を出た細胞の溶解産物をBeckman遠心管に集め(それぞれ500mlづつ)、速やかにBeckman J−21遠心機で9000RPMの速度で50分間遠心した。遠心後、その上清はリゾチーム無しのインキュベーションに較べ、4−5倍量のプラスミドを含んでいることが分かった。遠心後の上清産物を3倍量のTEバッファー(25mM Tris−EDTA、pH8.0)を用いて、素早く透析し、20x105ユニットのRNaseを加えて、室温で2〜4時間インキュベートした。インキュベーションを終えた後、さらに6倍量のTEバッファーを用い、産物を100kD MWCO膜で透析し、この後、残存砕片を取り除くため0.45ミクロンのフィルターで濾過した。陰イオン交換カラムに付すために、このろ過した溶解産物を0.7M NaClを含む20mM Bis/Tris Propane−NaClバッファー(pH7.5)で希釈した。この陰イオン交換カラム(3.6リットルのPOROS PI/M)は前もって20mM Bis/Tris Propane、0.7M NaClの液で平衡化したものである。ろ過した溶解産物はカラムの許容量までのせた。この場合、5グラムの超らせんプラスミドを陰イオン交換カラムに付した。サンプルを加えた後、カラムを2〜4倍量の20mM Bis/Tris Propaneと0.7M NaClの液で洗った。10倍量のカラム容量の0.7M NaCl〜2.0M NaCl勾配をもつ20mM Bis/Tris Propaneバッファーで溶出した。これにより、ほとんどの大腸菌由来タンパク質、RNAそしてエンドトキシンを超らせんプラスミドから分離除去できた。超らせんプラスミドを含む分画は1.4Mと2.0M NaClの間で溶出した。この分画は4グラムの超らせんプラスミドを含んでいた。次に、この分画を非パイロジェン水で2〜3倍希釈し、IPAを1.2%、pHを1N NaOHで8.5に調整した。この希釈した陰イオン交換超らせんプラスミド分画を7リットルの逆相カラム(POROS R2/M)に付した。なお、このカラムはあらかじめ1.2%IPAを含む100mM 炭酸水素アンモニウムで平衡化しておいた。この場合、3.2グラムの超らせんプラスミドを逆相カラムに付し、不純物を取り除くために、6〜10倍量のカラム容量の1.2%IPAを含む100mM 炭酸水素アンモニウムで洗った。次に、5倍量のカラム容量の1.2%IPA〜11.2%IPA勾配液で溶出した。超らせんプラスミド分画は約4%IPAの所で溶出した。この逆相カラムで得た超らせんプラスミド画分を濃縮し、30kD MWCO膜を用い、生理的食塩水に対してダイアフィルトレーションし、この最終産物を0.22ミクロンフィルターで濾過した。この処理による産物の総収率は、陰イオン交換HPLCカラムを用いての解析で示したように、清澄化細胞溶解産物に存在していた超らせんプラスミド量に比して50%を超える収率であった。
実施例8
霊長類へのポリヌクレオチドワクチン接種
アカゲザルのNP抗体: アカゲザル(006NP、009NP、コントロール101及び021)に、1日目、1ヵ所当たり1mgのRSV−NPを3ヵ所に筋内注射した。同じ時に、ホタルのルシフェラーゼ レポーター遺伝子発現を見るための構築物RSV−LUX及びCMV−int−LUXをそれぞれ1mg、別々の箇所に注射した。15日目に、それぞれ同じ量のDNAを再び注射した。同時に、また、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ・レポーター遺伝子発現を見るための構築物pD5−CATを1mg各1ヵ所に注射した。レポーター遺伝子を注射した筋肉箇所を生検し、レポーター遺伝子活性を見るための解析を行った。血清は最初の注射後、3、5、9、11、13、そして15週間目に採取した。抗NP抗体をもつ最初の陽性サンプルは11週目に採取したものであり、13週目、15週目のものも陽性であった。抗NP抗体の存在はELISAによって決定した。
アカゲザル中の血球凝集阻害(HI)抗体: 1日目に、VlJ−PR−HAをサルに筋内注射した。2匹のサルそれぞれの大腿四頭筋に1mg、100μgもしくは10μgのDNAをそれぞれ注射した。注射量は各0.5mlであった。なお、1日目の注射以前にサルから血液を採取した。すべてのサルに15日目にDNAを再び注射し、この後、2〜4週間間隔で血液を採取した。A/PR/8/34ウイルスに対する血球凝集阻害(HI)のタイターは、V1J−PR−HA DNAを最初に注射した後、5週目、9週目で陽性であった。
実施例9
DNA濃度及び保存容器タイプがDNA安定性に及ぼす影響: DNAを試験管に保存している際に起きる主たる物理化学的変化は超らせんプラスミドDNAから開環状DNA及びリニアDNAへの変換である。実施例9〜16では、色々な保存条件がプラスミドの安定性にどのような影響を及ぼすかを検討した。これはフォスフォジエステル骨格が化学的切断により超らせんプラスミドDNAから開環状DNA及びリニアDNAへとコンフォメーション変換することをモニターすることによって行った。この検討を行うために、プラスミドDNA(インフルエンザDNAワクチンHA(Georgia/93))を製剤化し、必要な場合は滅菌フィルターで滅菌した後、滅菌したキャップ付ガラスバイアルに入れ(3mlバイアルに0.8ml)、異なる温度でインキュベートした。インキュベーション時間終了後、特定のDNA製剤について一バイアルをインキュベータから取り出し、−70℃に凍結した。この後、それぞれのバイアルのサンプルを融解し、20ngのDNAを1%アガロースゲルに付し、90分間、電気泳動した。ゲルはエチジウムブロマイドで染色し、脱染色の後、UV光線下で写真撮影した。超らせんDNA、開環状DNA及びリニアDNAを定量化するためにゲルの写真のネガをBio−RAD(GS−670)デンシトメータでスキャンした。ゲル上の各レーンの吸光度データを同じゲル上の一連の超らせんDNA、開環状DNA及びリニアDNAのスタンダードサンプルの吸光度と、コンピュータプログラム(Molecular Analystバージョン1.3、BIO−RAD Laboratories)を用いて比較した。これらの標準DNAの吸光度から超らせんDNA、開環状DNA及びリニアDNA、それぞれの標準曲線を得た。各フォームにつき、7つの標準DNAサンプルをゲルにのせた(超らせんDNAの場合は1〜30ng、開環状DNA及びリニアDNAの場合はそれぞれ0.1875〜15ng)。DNAの時間経過による安定性を調べる場合は、ゼロ時間の超らせんDNA量を100%とした(このゼロ時間における総DNAに対する超らせんDNAの割合は通常90〜100%であった)。そして、このDNAサンプルの安定性は、ある時間インキュベーションした後に残っている超らせんDNAのゼロ時間に対する百分率として表わした。この一連のサンプルのそれぞれは一つのバイアルから採取したが、通常、色々な時間インキュベートして、時間経過とともに減少する超らせんDNA量の百分率を観察した。50℃でインキュベートしたサンプルの場合、通常、1、2、4、6、及び8週目にサンプルを採取し、一方、4、25、37℃の場合、1、2、3ヵ月目、時として、6ヵ月目にサンプルを採取した。
種々の保存条件下でのインビトロ保存の間に、プラスミドDNAが分解してゆく潜在的メカニズムを探るために、クロマトグラフィー法で精製したプラスミドDNAを用いて製剤前段階実験をおこなった。種々の容器に曝露した場合のインフルエンザDNAワクチン(Georgia/93)の安定性を調べるために、プラスミドDNA(100mcg/ml生理的食塩水)を色々な容器に入れ、6ヵ月間、5、24、及び37℃でインキュベートした。結果(図1A、1B、1C、そして1D)は、処理しないガラスバイアルがシリコーン化処理したガラスバイアル、オートクレーブしたプラスチックバイアル、そしてガンマ線照射したプラスチックバイアルに較べ、DNA安定化に関して圧倒的に優れていることを示した。DNA濃度の安定性に対する影響を調べるために、20、100、1800mcg/ml生理的食塩水のプラスミドDNAを37℃で6ヵ月間インキュベートした。超らせんDNAの量を解析した結果、その安定性は用量依存性を示した。即ち、37℃で保存した場合、プラスミド濃度が濃くなればなるほど、DNAはより安定化した(図2)。DNA濃度の安定性についてさらに調べたところ、DNAを生理的食塩水もしくはPBSで製剤化した場合、いずれも、2〜8℃(表1A)そして−70℃(表1B)でDNA濃度が濃い方がより安定であることが明らかとなった。
DNA安定性実験はガラスバイアル容器のキャップ内部にゴムのストッパーを使用することはDNA安定性に有害であることを示した。表2は、3つのタイプのストッパーが2つの異なったDNAワクチン製剤に対するDNA安定性に対して及ぼす影響を示す。この実験では2μg/mlのDNA液が入っているバイアルを50℃でインキュベートした。なお、この場合、ストッパーのDNA安定性に対する影響を見るため、バイアルを通常行うように直立させてインキュベートした場合とバイアルを倒立させてインキュベートした場合の影響を見ている。いずれのストッパーの場合も、バイアルを逆さにせず、正常の形でインキュベートした場合、DNAはより安定であった。さらに、エタノール添加はDNA安定性を促進させ、かつ、用いたストッパーによる分解効果を減少させた。ストッパー#3の場合(表2)、エタノール添加はDNA安定性に対するストッパーによる分解効果を完全に除去した。これらの結果は保存の際、ストッパーがDNA分解に寄与していることを示唆している。また、DNAのストッパーによる分解効果を制御するためにエタノールを使用することが出来ることを示唆している。
ガラスバイアルに保存されているDNAの安定性にストッパーがどのくらい影響を及ぼすかを決定するために、一つの実験を行った。3つの異なったタイプのストッパーを使用したガラスバイアル、そして密封したガラスアンプルを8週間にわたり50℃でインキュベートした。表3はコハク酸塩(DNA安定性向上剤)を含む製剤、そして含まない製剤を示す。この実験で、テストしたストッパーのいずれと比較しても、密封ガラスのDNAが有意により安定であった。また、3つの異なったタイプのストッパーを使用したバイアル間では、DNA安定性に関してはほんの小さな差しか見られなかった。これらのデータは4つの異なったDNA製剤(表2及び3)を用いた異なったタイプのストッパーがDNA分解に有意に寄与していることを示している。ガラスバイアルを用いての最適なDNA安定性を決定するためには、様々なタイプのストッパーをテストすることが必要であり、そして、また、ストッパーの分解作用を制御するために、エタノールのようなフリーラジカルを取り除くことの出来るものを添加することも要求されるであろう。
実施例10
DNA安定性に対する塩濃度の効果 − DNA安定性に対する塩濃度の効果を調べる目的で、0〜200mMのNaCl濃度範囲に於けるDNAの融解温度(Tm)を測定する初期実験を行った。NaClの各濃度に於けるTm値を決定するため、10mMリン酸ナトリウム溶液(pH6.0)中で製造したプラスミドDNA(10mcg/mL・DNA)について、加熱条件下で、260nmでのUV吸収を測定した。その結果(図3)、NaCl濃度の0、5、20、50mMに対するTm値はそれぞれ、72℃、73℃、78℃、82℃を示した。100および200mMのNaClに対するTm値は、塩による強い安定化効果によって90℃を越える大きなTm値となったため決定することはできなかった。これらの結果はDNAの熱安定性を最大にするために必要な最小のNaCl濃度が、100ー200mMの範囲にあることを示唆している。
保存中のDNAが超らせん型から開環型へ変換する比率に対するNaCl濃度の効果を調べるために、1〜320mMまでの様々な濃度のNaClを含んだ10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中でプラスミドDNA(100mcg/mL)を製造した。溶液は60℃で48時間インキュベート処理を行い、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。その結果(図4)、NaCl濃度が1〜160mMに増加する間、DNA安定性も増加することが示され、NaClが160〜320mMの間では、DNA安定性は顕著な違いを示さなかった。これらの結果は図3に於ける結果と一致しており、DNAの安定性を最大にするために必要な最小のNaCl濃度は100ー200mMであることを示唆している。
DNA安定性に対する2価陽イオンの効果を調べるために、それぞれ、TE、リン酸で緩衝した生理食塩水(PBS)、または、ZnCl2、CaCl2、MnCl2またはMgCl2の存在下の生理食塩水(0.9%NaCl)中で、プラスミドDNAを製造した。DNA溶液(100mcg/mL)は60℃で48時間インキュベート処理を行い、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。その結果(図5A、図5B、図5C)、亜鉛イオンはDNA安定性を増加させないことがわかった。しかし、カルシウムイオンの効果は条件によって変化した。カルシウムイオンは、TEと生理食塩水中ではDNA安定性を増加させ、一方、PBS中ではカルシウムイオンはDNA安定性を増加させなかった。マンガンイオンはTE中で安定性を増加させたが、これは低い濃度範囲に於いてのみ観察された。マンガンイオンはPBSと生理食塩水中ではDNA安定性を増加させなかった。マグネシウムイオンは3つの全ての製剤中でDNA安定性を増加させたが、生理食塩水中では高濃度のイオンが含有された場合のみ安定性を増加させた。
実施例11
DNA安定性に対する緩衝液の種類とpHの効果 − 歴史的に、プラスミドDNAはTE緩衝液(10mMトリス、1mM EDTA、pH8.0)中に保存され、日常的な分子生物学的手技は生理食塩水と蒸留水を用いて行われてきた。したがって、更なる製剤実験、プラスミドDNAの保存という両方の目的で適切な緩衝液を明らかにして、調べる必要があると我々は考えた。初期的研究として、DNAを様々なpH値を持つ異なる緩衝液中に組み入れて、異なる温度条件下で保存を行った。プラスミドDNAを、500mcg/mLでpH4.5、7.2、9.0のPBS中、pH8.0、10のTE中、蒸留水(pH6.0)、生理食塩水(pH6.0)、およびpH2.0のTFA(トリフルオロ酢酸;0.1%)中で製造した。検体はそれぞれ4℃と24℃で保存し、その1、4、12週間後に、アガロースゲル電気泳動法によって解析した。
表4は様々なpH条件下で保存されたプラスミドDNAのコンフォメーションの安定性を示したものである。検体はアガロースゲル電気泳動法によって解析された;(+)超らせん、(+/−)超らせん/開環型、(−)主として開環型(ニックの入ったプラスミド)。これらのデータは、低いpH(2.0-4.5)においてDNAは急速に分解し、一方で高いpH(7.2-9.0)ではほとんど分解は観察されないことを示している。たとえば、7〜10の高いpHを持つTEとPBSの両方に保存されたプラスミドDNAは4℃で12週間まで安定であった。DNAのコンフォメーションの安定性に対するこのpHの効果をさらに検討するために、UV融解曲線をpHの範囲4.5-10について作製した(図6)。融解点遷移(Tm)は、塩基対の解離の結果として起こり、260nmにおける紫外光吸収を増加させるが、上記の技術は、融解点遷移(Tm)を測定することで様々なpHにおけるDNAの相対安定性を決定できる。その結果、より低い温度条件下では、pHが減少するにつれてDNAの260nmにおける吸収は増加することが観察され、したがって低いTm値が得られた。これは、低いpH条件下では二重鎖DNAは構造が不安定となり、分子内で解離している塩基対の部分は低いpH条件下でいっそう分解されやすい部分となることを示している。もう一つ強調すべきことは、プラスミドDNAがこれらの条件下で熱変性に対しては強い抵抗力があることである。90℃まで加熱した条件で二重鎖DNAは完全な変性を生じなかったので、精密なTm値は測定できなかった。
長期DNA保存に最も適した保存条件を迅速に調べるためには、加速安定性研究法があり、この研究法は、検体を60℃で48時間保存して、次にアガロースゲル電気泳動法で解析を行うものである。以前の結果(表1)では、pH6.0以下での保存は、DNAの安定性に問題を生じやすく、特にコンホーメーションの分解を安定化させるためには、塩またはEDTA(またはその両方)が必要であることを示している。したがって2種類の緩衝液、PBSとTE(トリスーEDTA)について、pH範囲が6.0−8.5でのプラスミド安定化能力の解析を行った。プラスミドDNA検体を、適切な緩衝液中で、100mcg/mLの濃度で製造した。実験開始時の検体は超らせんDNAを90%含んでいた。その結果は図7Aに示す通りである。60℃で48時間、インキュベート処理を行った後、pH7.5−8.5のTEに保存した検体は、10−25%の超らせんプラスミド残存率を示したが、一方、PBS(pH7.5−8.5)で保存した検体では超らせんプラスミド残存率が50%であった。さらに、TEではpH6.5−7.0の範囲に於いて、DNAに対して顕著な安定化効果は見られなかったが、一方、PBSでは同じpH範囲に於いて僅かな安定化効果が観察された。どちらの緩衝液もpH6.0に於ける分解を阻止することはできなかった。
加速研究から得られた結果は、保存中のDNAを安定化させるための最適化には、pHと塩が重要なパラメータであることを示していた。これらの予備試験の結果は、PBSがTEよりも優れた安定化能力を持っていることを示唆している。しかし、PBSの安定化効果がリン酸イオンの存在によるものなのか、またはNaClの存在によるものなのかは明らかではない。さらに、金属イオンキレート化剤がDNAを安定化させるのかどうかについては、より適切な調査を行う必要がある。これらの疑問に答えるために、60℃、48時間、100mcg/mL・DNAの条件下で、EDTAまたはリン酸をさらに添加したPBSを用いて、あるいはNaClまたはリン酸を添加したTEを用いて、加速安定性研究を実施した。表3に示す結果は、EDTAまたはリン酸をPBSに添加しても、DNAの分解に対する安定性は向上しないことを示している。しかし、150mMのNaClをTEに添加した場合、NaClをTEに添加しなかった検体と比べて、DNA安定性の増加が観察された。これらの結果は、TEよりもPBSが安定化効果に優れている理由はPBS中には150mMのNaClが含まれていることによるものであることを示唆している。
表5は様々な緩衝液中で48時間、60℃で処理した場合のプラスミドDNAのコンフォメーション安定性を示している。時間0において、検体は90%の超らせんDNAを含有していた。TEと比べて、PBS中のNaClの存在がDNAの安定性を改善する理由であるようなので、PBSに対して生理食塩水を比較するもう一つの研究を行った。これらの実験のために、プラスミドDNA(クロマトグラフィー上で純粋であることが確認されたもの)を直接、0.9%NaCl中で高い濃度(2.0-2.5mg/mL)で製造した。このDNAを用いたプローブ安定性研究は、PBS緩衝液中またはpH6、7、8に調製された0.9%NaCl中のいずれかで調製した低い濃度のプラスミド(2mcg/mL)を用いて実施した。プラスミドの超らせん含有量を、25℃と37℃で、3ヶ月間にわたり、アガロースゲル電気泳動法によって調査した。図8A(37℃)と図8B(37℃)に示すように、生理食塩水で調製された検体の初期状態におけるpHが減少するにつれ超らせんプラスミドDNAの消失速度は増加した。
生理食塩水で製造された検体は、時間経過につれpHを維持しなかった。例えば、生理食塩水で製造したプラスミド(初期条件はpH6、7、8)は、37℃、2カ月後のpH値がそれぞれ、5.9、6.0、6.3に低下した。これとは対照的に、PBSで製造した検体は、同じインキュベート処理期間の間、pH値(7.1−7.2)を維持した。PBSで製造した検体は、同時に、超らせんプラスミドの含有量の比率が高く、25℃、3カ月後に於いても、ほぼ同じ高いレベルの超らせんプラスミドを含んでいた。
プラスミドの超らせん含有量が減少するにつれて、それに一致して開環型プラスミドが増加することがアガロースゲル電気泳動法によって観察された。長期の間に、開環型プラスミドは直鎖型プラスミドDNAに変換される。例えば、pH6とpH7の生理食塩水で製造した検体(初期状態で超らせんプラスミドDNAを92〜93%含有する)は、37℃、3カ月後には、初期状態の超らせん含有率が0%となり、開環型プラスミドDNAの含有率が〜36%、直鎖型プラスミドDNAでは〜64%となる。
非加速保存条件下の検体に対応して、加速条件下で生理食塩水とPBSで調製した検体を比較した場合に、何か特別な傾向が観察されるかどうかを測定する目的で安定性研究を行った。
プラスミドDNAを、低、中間、高の3種類の用量で、生理食塩水(2、20、および2200mcg/mL・プラスミド)とPBS(2、20、1000mcg/mL・プラスミド)中で、それぞれ製造した。そして、2−8℃と−70℃での保存期間の間、両方の溶液のpH、および超らせん含有量を測定した。表1に示すように、PBSで調製した検体は、3カ月後まで、pHと超らせんプラスミドDNAの含有量のいずれに於いても、非加速条件下の研究結果と、よく一致していた。
DNA安定性に対する異なる緩衝液イオンとpHの効果を調べるために、数種類の異なる緩衝液/pHの組み合わせで、数種類のプラスミドのロットを製造し、37℃で3カ月間、インキュベート処理を行った。インキュベート処理に引き続き、初期状態に於ける超らせんDNA含有量の比率を、アガロースゲル電気泳動法によって測定した。表6に示す結果は、安定性はロットごとに大きく変動すること、酸性pHは安定性に悪影響を与えること、高濃度のDNAで製造したものはより安定していることを示している。ロットごとに安定性が変動するのは、微量金属イオンの含有量が各々のロットで異なるためと考えられる。表6の結果は、特定の緩衝液/pHの組み合わせが、さらに研究を進めるために必要であることを示唆している。この研究に於いて同定された最も有望な組み合わせは、重炭酸塩ナトリウム(pH7.2)、PBS(pH7.2−8.0)とコハク酸ナトリウム(pH7.2)である。
生理食塩水に緩衝液を添加することが、DNAの安定性を向上させるかどうかを明らかにするために、生理食塩水のみに対して、生理食塩水に4つの緩衝液を組み合わせて添加した場合の効果を比較する研究を行った。この研究のために、DNAは20mcg/mLに製造され、37℃で3カ月間、インキュベート処理を行った。初期状態の超らせんDNAの比率をアガロースゲル電気泳動法によって測定した。図7Bに示した結果は、重炭酸塩ナトリウム、リン酸、ヘペス、またはトリス緩衝液の内、どれを添加しても、生理食塩水のみに比べて、DNAの安定性を向上させることを顕著に示している。またデータは、緩衝液イオンの安定化効果には、互いに主たる違いがあることを示唆している。さらにこの結果は、DNAの安定性がpHの維持に関連していることを示唆している。図7Bに見られるように、トリス/生理食塩水の組み合わせと、特に生理食塩水のみの場合は、DNAに対してほとんど安定化効果がなく、インキュベート処理の3カ月間に一定のpHを維持できなかった。したがって、DNAの安定化に関する緩衝液の機能の一つは、pHを中性からやや塩基性の範囲に維持することであることが分かる。緩衝液のもう一つの機能がDNAを分解過程から保護することであるとはいえ、異なる緩衝液はDNA安定化のための異なる能力を持っており、最大の安定化効果を持つ特定の緩衝液を同定するためには、さらに進んだ研究が必要であることを示している。その意味で、これらの結果は、重炭酸塩ナトリウムが保存中のDNAを安定化させることを示した最初のデータであるといえる。
添加する緩衝液/pHの組み合わせによるDNA安定性に及ぼす効果は表7に示してある。この研究では、DNAを様々な緩衝液/pHの組み合わせで製造し、5℃、24℃、37℃でそれぞれ1カ月間、インキュベート処理を行った。インキュベート処理に引き続き、初期状態に於ける超らせんDNA含有量の比率を、アガロースゲル電気泳動法によって測定した。その結果、最善の緩衝液/pHの組み合わせは、pH7.5のトリシンであることが示された。しかし、幾つかの他の組み合わせも、コハク酸ナトリウム(pH6.2)、リンゴ酸ナトリウム(pH6.2)、トリス(pH7.5)、およびpH7.5のリン酸ナトリウムのいづれの安定化効果よりも大きな安定化効果をもたらした。また、最も有望な緩衝液/pHの組み合わせが、4℃、25℃、37℃、および50℃に於いても同じように最も有望な組み合わせであるかどうかを比較するための追加実験が現在進行中である。
DNAワクチン製剤に於ける緩衝液イオンが免疫反応に影響を与えるかどうかを測定する目的で、インフルエンザDNAワクチン、HA(Georgia/93)に対する誘導免疫反応について、数種類のDNA用量を用いて、HI力価を指標として測定を行った。図9に示す結果は、PBS中で調製したDNAワクチンに対する免疫反応が、生理食塩水中で調製されたDNAワクチンによる反応よりも優れていることを示していた。
DNAの安定性に対する広い範囲のpHの効果を測定するために、150mM NaClを含んだpH6.0〜9.0の20mM ビスートリスープロパン中で安定性試験を行った。50℃(2mcg/mL・DNA)で、2週間のインキュベーション後に得られた安定性試験の結果を図13に示した。結果は、製剤のpHがDNAの安定性に大きく影響すること、および最適なpHが8.5以上であることを顕著に示している。試験結果は、pH7.1のPBSコントールに於けるDNAの安定性が、pH7.5のビスートリスープロパンのDNAの安定性とほぼ同じであることから、各々のpHに於いて緩衝液の種類もDNAの安定性に影響することを示唆している。
DNA安定性に対する緩衝液の種類による効果を明らかにする目的で、20mcg/mLのDNAについて7つの異なる製剤によって安定性試験を行った。以前の試験が、緩衝液の純度がDNA安定性に影響を与えることを示したので、フリーラジカルによるDNAの酸化を抑制するために、各製剤に10mMコハク酸と2%エタノールを添加した(実施例14と15に於けるデータで、コハク酸とエタノールのそれぞれがDNA安定性を増加させる)。その結果(図14)、最大のDNA安定性をもたらす製剤は、同時に最も高いpH(pH9.0)を用いた製剤であることが明らかになった。しかし、他の幾つかの緩衝液の効果も顕著であった。最大の緩衝液の効果はグリシンとビスートリスープロパンの中間にあり、データは、pH9のグリシン製剤が、同じpHに於けるビスートリスープロパン製剤よりも顕著に優れていることを示していた。これとは対照的に、pH8.2のトリス、ビシン、トリシン緩衝液はほとんど同じDNA安定性を12週間まで維持した。データはまた、2つのリン酸製剤(pH7.7と8.0)を用いた場合に、DNA安定性が最も低下することを示し、同時にこれらの製剤は最も低いpHの製剤であることが試験から判明した。pH8.0以上ではリン酸緩衝液は緩衝能力が低下するため、リン酸製剤を用いる場合は、pHを8.0か、または8.0以下に制限しなければならなかった。これらの結果は、キレート化剤(実施例15参照、データはどのキレート化剤がDNA安定性を向上させ、どのような条件下であるかを示している)とフリーラジカルスカベンジャー(実施例14参照、データはエタノールによってDNA安定性が向上することを示している)の添加によって、一度、フリーラジカルによるDNAの酸化が抑制されれば、DNAの安定性は主として製剤のpHによって支配されることを示唆している。
実施例12
DNA安定性に対する光の効果 − もし特別な手技過程が必要であったり、遮光ガラス瓶が長期間の保存に必要であるかもしれないので、まず第一に、物質の光感受性を見積もった。光感受性を測定した実験結果(図10)は、アガロースゲル電気泳動法によって測定したところ、生理食塩水中の100mcg/mLのプラスミドDNAに対する露光が、超らせんDNAプラスミドを開環型へ変換する過程を促進することを示した。開環型への変換は、DNAが透明なガラス瓶に保存された場合と、同じものを遮光ガラス瓶に保存した場合では、期待されたように、反対の結果がより顕著に観察された。2−4週間の露光が顕著な分解を引き起こすとはいえ、一日目の8時間までは顕著な分解は観察されなかった。遮光ガラス瓶は、長い時間放置しておくと微量金属イオンを水分中に浸出させる可能性があり、微量金属イオンはDNAのフリーラジカル酸化を触媒するので、長期の保存のためには、光感受性に対するプラスミドの専用パッケージ溶液が必要である。
Fe+3、金属イオンキレート化剤、およびフリーラジカルスカベンジャーを含む製剤での、DNA安定性に対する光の効果を測定する目的で、30℃で9週間に渡って、可視光(2000Luxの蛍光)の存在下、非存在下に於いて、安定性研究が行われた。DNA濃度は20mcg/mLに調整され、製造緩衝液には、150mMのNaClを含むpH8.0の10mMリン酸ナトリウム溶液を用いた。下記の図27と図28に見られる通り、その結果は、PBSコントロール、500ppbのFe+3を含むPBS、または0.5mMのEDTAと500ppbのFe+3を含むPBSのいづれの中でも、光は顕著にDNA安定性を減少させた。結果はまた、0.5mMのEDTAの存在は、500ppbのFe+3の存在下でのDNA安定性に対する光の悪影響を減少させることができないことを示していた。図16に於ける結果は、EDTAとエタノールを含む製剤でのDNA安定性に対する光の効果を示している。その結果は、図15のコントロール製剤と比較して、光照射検体と暗検体のどちらに於いても、EDTAとエタノールの存在がDNAを大きく安定化させることを示していた。この結果はさらに、DNA安定性への光の悪影響がEDTAとエタノールの存在によって大きく減少することを示し、500ppbのFe+3を含む製剤に於いてでさえ、減少効果を示していた。したがって、これらの結果は、EDTAとエタノールを含むDNAワクチン製剤は、これら2つの安定化剤のどちらも含まない製剤よりも、光、および微量金属イオンが及ぼす有害な効果に対して、感受性が遥かに少ないことを示唆している。
実施例13
DNA安定性に対する脱金属化および脱酸素化の効果:PBSの脱金属化方法 − 脱金属化PBSを調製するために、20.0グラムのチェレックス100樹脂(Chelex 100 resin;バイオラッド・ラボラトリーズ[BIO-RAD Laboratories])を400mLのUSP水で、真空ろ過法により酢酸セルロース膜(孔サイズ:0.22マイクロメーター)を通して洗浄した。洗浄した樹脂を約1リットルのPBSに加え、スラリーを含む1リットル瓶の中に磁気攪拌棒を置き、最低攪拌速度に設定した磁気スターラーを用いて2〜8℃で一晩ゆっくり攪拌した。翌日、酢酸セルロース膜(コーニング[Corning]社、孔サイズ:0.22ミクロン)を用いて、真空滅菌ろ過により樹脂を取り除いた。最終ろ過生成物を集める前に、脱金属化スラリー10mLを2回使用して注意深く膜を予備洗浄した。このステップは、膜から金属イオンが浸出して脱金属化生成物を汚染しないようにするために行なわれた。
プラスミドDNAの脱金属化方法−プラスミドDNAを含む溶液を脱金属化するために、脱金属化したDNAをPBSで稀釈し、最終容量を約2mLとした。次いで、予め5mLの脱金属化PBSで洗浄することにより平衡化した1mLのチェレックス100カラムにDNAを通した。溶出した脱金属化DNAを採取し、引き続き、追加の脱金属化PBS6mLを添加して残ったDNAをカラムから洗い流した。次に、脱金属化したPBSを用いて全溶出物を最終容量12.0mLに稀釈し、ミリポア・ミレックス[Millipore Millex]−GV 25mmシリンジ・フィルタ(孔サイズ:0.22ミクロン)を使用して滅菌ろ過した。本発明者らの当初の実験では、1mLカラムを使用してわずか48マイクログラムのDNAを脱金属化しただけであったが、チェレックス100樹脂の容量であれば、同じサイズのカラムを使用してさらに多量のDNAを脱金属化できるであろう。
PBSおよび脱金属化PBSの脱酸素化方法−脱酸素(脱気)化PBS、または脱酸素化・脱金属化PBSを調製するために、250mLの緩衝液をパイレックス瓶中で加熱し、沸騰させた。次にその溶液を連続ヘリウム噴霧下で室温まで冷却し、密栓した。
脱酸素化または脱酸素化・脱金属化プラスミドDNAの調製方法−安定性研究のための脱酸素化DNA溶液を調製するために、インフルエンザワクチンDNA、HA(Georgia/93)を、滅菌した脱酸素化PBS中に稀釈した。インフルエンザワクチンDNAの最初のストックについては脱酸素化しなかったが、これはこのストックを1000倍に稀釈(2.55mg/mLから2.0mcg/mL)したためである。脱酸素化DNA溶液を次に滅菌ガラス瓶中に入れ、フィルターろ過した窒素で頭部空間を充満させたあと、密栓した。安定性研究に用いる脱酸素化・脱金属化DNA溶液を調製するために、インフルエンザワクチンDNA、HA(Georgia/93)をまず脱金属化・脱酸素化PBS中に稀釈した。次に、この溶液を1mLのチェレックス100カラムに通してDNAの脱金属化を行なった。次に、この溶液を追加の脱酸素化・脱金属化PBSで稀釈し、瓶に詰める直前に滅菌ろ過およびヘリウム噴霧を行った。それぞれの瓶の頭部空間は、密栓前にフィルターろ過した窒素を充満させた。
表6は、PBS(pH7.2)および脱金属化PBS中のプラスミドDNAの安定性を測定するための実験結果を示している。この結果は、脱金属化PBS中のDNAの安定性は対照条件下におけるものよりも改善されることを示しており、またDNAワクチンの安定性は脱金属化した緩衝液中に貯蔵した場合に著しく高まることを示唆している。さらに、脱金属化PBS中に貯蔵されたDNAは、公表されている脱プリンおよびβ脱離の速度定数を用いて予測されるものよりはるかに安定であった。脱プリンおよびβ脱離はDNAのリン酸ジエステル骨格の破壊ステップをなす2つの連続した化学反応であり、これは水溶液中で起きる。第1のステップでは、[H+]がDNAからプリン塩基の消失を触媒し、アプリン部位(APサイト)を残す。加水分解の第2ステップにおいては、[OH-がβ脱離反応を触媒し、デオキシリボースの3’炭素に結合している酸素原子と3’炭素原子の間の結合を切断する。水溶液中で脱プリンおよびβ脱離は完全に防止することができない自然プロセスであるため、他のすべてのDNA分解源が排除されるとした場合、脱プリンおよびβ脱離の自然速度がDNAの安定性を規定することになると考えられる。pH7.4(70℃、+10mM MgCl2)における脱プリンの公表速度定数(k)と活性化エネルギー(Ea)はそれぞれ4.0×10-9s-1及び31kcal/mol(Lindahlら、1972、Biochemistry 19:3610−3618参照)である。したがって、70℃におけるマグネシウムの効果を考えると、50℃におけるPBS中の脱プリン速度はマグネシウムの存在下で約2.3×10-10s-1、またマグネシウムの非存在下では3.3×10-10s-1である。β脱離ステップにおける公表速度定数(70℃、マグネシウム非存在)およびEaは、2.4×10-5s-1および24.5kcal/mol(Lindahlら、1972、Biochemistry 19:3610−3618参照)である。したがって、50℃におけるβ脱離ステップの速度定数は約2.6×10-6s-1となる。したがって、鎖切断(SB)形成速度は[APサイト]k2と等しくなる。ただし下記に示すように、k1は脱プリンの速度定数、k2はβ脱離の速度定数であり、[APサイト]はDNA中のアプリン部位の濃度である。
プラスミドDNA----k1---->[APサイト]----k2---->
超らせん切断(SB)
したがって、50℃におけるインキュベーション期間後の任意の時点における鎖断形成の速度を求めるためには、
速度=6,600プリン(IDV、HA、Georgia/93に関して)×3.3×10-10s-1×k2
速度=2.2×10-6s-1×k2
速度=2.2×10-6s-×2.6×10-6s-1
速度=5.7×10-12s-2
任意の時間におけるSB形成速度=5.7×10-12s-2×(時間:秒)となる。
ゆえに、任意の時点tにおいて存在するSBの数は、5.7×10-12(t)のt=0からt=任意の時点の間の積分値、に等しくなる。
ゆえに、任意の時点tにおいて存在するSBの数=1/2(5.7×10-12)t2を示す。したがって、任意の時点tにおいて存在するSBの数=2.85×10-12(t2)となる。
もし、50℃、28日間のインキュベート処理後のインフルエンザDNAワクチンの鎖切断数を求めるために上記の公表速度定数を用いれば、1プラスミドDNA当たり16.7の鎖切断数が見られることになる。プラスミド母集団の中で1プラスミド分子当たり16.7の鎖切断がランダムに分布するということは、超らせんDNAがまったくない組成物を得ることになる。しかしながら、表6のデータでは脱金属化サンプル中では28日後に、超らせんDNAの初期状態の65%が残存していることを示している。これらのデータは、水溶液中では脱金属化が脱プリンおよび/またはβ脱離の速度を著しく減少させることを示唆している。微量金属イオンがどのようにして脱プリンまたはβ脱離反応にこの程度の影響を及ぼすかは明らかとなっていない。
表8の結果はまた、脱酸素化がDNAの安定性を改善することを示しているが、これはおそらくフリーラジカルを含む酸素の生成を減らすことによるものであろう。本研究において最も安定であった製剤は、脱金属化・脱酸素化サンプルであり、50℃で42日後に、初期状態の37%の超らせんDNAが残存していた。
脱金属化の効果に関する別の検討結果(表9)もまた、PBS緩衝液とDNAの脱金属化および脱酸素化が、非脱金属化PBSコントロールに比べて50℃におけるDNA安定性を著しく改善したことを示している。貯蔵のためのガラス容器から残存金属イオンを除去するために、いくつかの容器を1mM EDTAと脱イオン水を含むPBS溶液で洗浄し、使用前にオートクレーブにかけた。洗浄した容器と未洗浄容器とのDNA安定性の比較では、加速条件下では、容器の洗浄はDNAの安定性を著しく高める効果がないことを示している。しかしながら、表面の金属イオン含有量を減らすための容器の洗浄はDNAワクチンの長期安定性を改善することになるであろう。
脱金属化PBSの場合に観察される安定性の増加は、プラスミドDNAの脱金属化PBSへの添加に先立つプラスミドDNAの脱金属化を必要とするものであるかどうかを判断するために、脱金属化PBSへ非脱金属化プラスミドDNAを1000倍稀釈して入れた場合のDNA安定性に及ぼす効果を調べる研究を実施した。その結果(表10、条件C1〜C3)は、DNAを脱金属化しなかった場合に安定性が減少したことを示しており、最大の安定性を得るためにはDNAとPBSを脱金属化する必要があることを示唆している。
脱金属化条件下での安定性の増加がDNA中の残存微量ヌクレアーゼ活性の不活化(金属イオン除去によるもの)によるものかどうかを判断するために、本発明者らはDNA安定性に対して微量ヌクレアーゼ活性の除去または変性の効果を判定する実験を実施した。その結果(表11)は、PBSコントロールと比べて、0.1%SDSの添加は安定性を著しく高めなかったことを示している。さらに、1mcgのプロテアーゼKを用いて1時間、24℃でDNAを処理し、マイクロピュア[Micropure]EZ膜を使用して酵素を除去しても安定性を強化することはなかった。マイクロピュアEZ膜処理だけの場合もまた安定性を改善することはなかった。さらに、DNAのフェノール抽出およびエタノール沈降も安定性にはまったく効果がなかったことを確認した。これらの結果は、脱金属化PBS中で観察される安定性の増進が残存ヌクレアーゼ活性の不活化によるものではなく、DNAのフリーラジカル酸化を触媒する能力のある金属イオンの除去によるものであることを明確に示している。
DNA安定性に対する脱金属化の効果をさらに調べるために、微量金属イオンの効率的な除去が確実にでき、かつ緩衝液pHを変化させない改良型のバッチ結合式脱金属化法(batch binding demetalation procedure)で脱金属化した緩衝液を用いて一連のDNA安定性実験を行なった。緩衝液は脱金属化しようとする緩衝液〜75mL中に5gのチェレックス樹脂を入れることにより脱金属化した。この溶液を磁気スターラー上で中程度の速度で攪拌しながら、緩衝液として望ましいpHに調節するために1N HClをスラリーに滴下した。次いで、スラリーのpHが望ましいpHで安定するまで15〜30分間追加の1N HClを添加した。pHが安定した後スラリーをフィルターろ過し、洗浄し、pHが調節されたチェレックス樹脂を回収した。洗浄された樹脂の全量5グラムを次に脱金属化しようとする250mLの緩衝液(250mL密栓瓶)中に入れ、2〜8℃で一晩ゆっくり攪拌した。次に、この緩衝液を、0.22mm酢酸セルロース膜を有するコーニング社製真空ろ過装置を使用して、ろ過滅菌した。ろ過した緩衝液を回収する前に、コーニングのろ過装置の膜をそれぞれ5〜10mLのスラリーで2回洗浄し、酢酸セルロース膜から微量金属イオンを取り除き、またポリスチレン容器を洗浄した。滅菌脱金属化された緩衝液は使用するまで2〜8℃で貯蔵した。
DNA安定性に対する試薬の純度と脱金属化の効果を判定するために、2mcg/mLのプラスミドDNAを、異なるメーカーの2つの試薬で調製したPBS中で、50℃、pH7.2で6週間インキュベート処理を行った。その結果(図15)は、B試薬を用いたPBSについてはこの処方緩衝液の脱金属化がDNA安定性を著しく強化したが、A試薬によるPBS中ではDNAの安定性に対してほとんど効果がなかったことを示している。これらの結果は処方緩衝液試薬中の微量の金属イオン不純物が貯蔵中のDNAに分解をもたらし、また純度のより低い処方緩衝液の脱金属化はDNA安定性を改善することを示している。
高pH製剤中でのDNA安定性に対する脱金属化の効果を判定するために、pHを8.0に調節したPBSおよび脱金属化PBSに2mcg/mLのDNAを入れて安定性試験を50℃で6週間行なった。その結果を図16に示すが、この処方緩衝液の脱金属化もまたpH8.0のPBS中でDNA安定性を改善したことを示している。
フリーラジカルスカベンジャーと金属イオンキレート化剤を含む処方中でのDNA安定性に対する脱金属化の効果を判定するために、2mcg/mLのプラスミドDNAを用いて50℃で6週間DNA安定性実験を行なった。脱金属化したものおよび非脱金属化状態の2つの製剤を試験した。PBSを緩衝液として使用し、10mMコハク酸ナトリウムをキレート化剤として使用した。エタノールとグリセリンをそれぞれ2%(v/v)で、フリーラジカルスカベンジャーとして使用した。その結果を図17に示すが、グリセリンを含む製剤中では脱金属化がDNA安定性をわずかに改善したが、エタノール製剤中ではDNA安定性に関してはまったく効果がなかったことを示している。これらの結果は、同じレベルのDNA安定性がコハク酸エステルおよびエタノールを用いることによるフリーラジカル酸化の制御か、あるいは脱金属化による微量金属イオンの除去のいずれかにより達成できることを示唆している。しかしながら、コハク酸エステルおよびエタノールの添加は、DNAワクチンの製造および充填中に入り込む微量金属イオンからDNAを保護することが期待される。脱金属化は、脱金属化処理後に入り込む金属イオンからDNAを防御することはないが、製造時の微量金属イオン負荷を減らし、また長期保存中のDNA安定性を高めることが期待される。
その他の種類の緩衝液のDNA安定性に対する脱金属化の効果を調べるために、プラスミドDNAを重炭酸塩またはホウ酸塩のいずれかを含む緩衝液中に入れ、2mcg/mLのDNA、50℃で6週間、DNA安定性実験を行なった。その結果を図18に示すが、脱金属化がそれぞれの製剤中でのDNA安定性を著しく高めた。したがって、このデータは脱金属化がさまざまな処方緩衝液の広いpH範囲でDNA安定性を効果的に高めるものであることを示唆している。
DNAワクチンの処方緩衝液の脱金属化が低温および長期貯蔵の場合にDNA安定性を高めるかどうかを判定するために、2つの処方中で2mcg/mLのDNAを用いて30℃で9カ月のDNA安定性実験を行なった。その結果を図19に示すが、PBS製剤および重炭酸塩含有製剤の脱金属化がDNA安定性を顕著に高めたことを示している。これらの結果は、脱金属化によるDNA安定性の強化が、広い温度範囲ならびに長期間の貯蔵において、効果的であることを示唆している。
実施例14
DNA安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果−DNA分解のメカニズムの1つに、ヒドロキシルラジカルなどの分子によるフリーラジカル酸化があることは今日広く知られている。フリーラジカルによるDNA損傷を防いだり、あるいはその程度を少なくする1つの方法は、DNAの溶液にフリーラジカルスカベンジャーを添加することである。これらの分子はフリーラジカルに対しDNAと競合することにより、DNAを保護する目的に役立つ。スカベンジャーはフリーラジカルに対して反応性が高い化合物が選択され、またしばしばDNAの反応性の高い部分(通常、デオキシリボース糖)より高濃度で存在して効果的にDNAを損傷から保護する。
フリーラジカル酸化が果たして貯蔵中に起きているかどうかを判定するため、またいくつかのフリーラジカルスカベンジャーの効果を試験するために、インフルエンザDNAワクチン、HA(Georgia/93)を、4%(w/v)マンニトール、4%(v/v)グリセリン、5mMメチオニンまたは10mMアジ化ナトリウム(公知のフリーラジカルスカベンジャー)を含む生理食塩水中に入れ、37℃で3カ月間インキュベート処理をした。3つの時点でDNAをアガロース・ゲル電気泳動に付して初期状態の超らせんDNAの残存割合を求めた。図11の結果は、生理食塩水、グリセリン、メチオニンおよびアジ化ナトリウム中では、生理食塩水コントロールと比較して、DNAを安定化させたことを示している。これらの初期の実験結果は、フリーラジカル酸化が貯蔵中に起きていること、および3つの異なるフリーラジカルスカベンジャーがDNAの効果的な安定剤であることを示唆している。
フリーラジカルスカベンジャーであるジメチルスルホキシド(DMSO)、還元剤であるアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムおよびチオグリセリンのDNA安定性に対する効果を調べるように設計された別の研究の結果を表12に示す。この実施例においては、DNAはPBS(pH7.2)に20mcg/mLで調製され、5、24、および37℃でインキュベート処理を行った。この結果はPBSコントロールと比較して、これらの還元剤が存在する場合はすべてDNAの劇的な破壊があり、0.2%(v/v)DMSOの場合は安定性が強化されたことを示している。本実験の結果は図11の結果と一致しており、試験した非還元型フリーラジカルスカベンジャーのほとんどがDNAを安定化させた。
DNA安定性に対する10%(v/v)グリセリン、10mMメチオニンおよび2%(v/v)エタノールの効果を調べるために、フリーラジカルスカベンジャーの再試験を行なった。本実験においてはDNAをPBS(pH7.2)中で20mcg/mLに調製し、5、24および37℃でインキュベート処理をした。図13に示されている結果は、PBS中2%のエタノールが最も効果的な安定剤であったことを示している。しかしながら、グリセリンおよびメチオニンもまたいくらかの安定化効果を示した。本検討におけるもう1つの結果は、PBS製剤は生理食塩水製剤よりもかなり安定であったことである。これはおそらくは、pHが時間の経過につれて生理食塩水処方中では徐々に低下し、分解速度を速めたことによるものであろう。
DNA安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーであるペントキシフィリン、第三級ブチルヒドロキノンおよびp−アミノ安息香酸の効果を調べるための1つの実験の結果を表14に示す。この検討においてはIDV、HA(Georgia/93)をPBS(pH7.2)中、10mM濃度のスカベンジャーの存在下、2.0mcg/mLに調製した。この検討におけるサンプルは50℃でインキュベート処理を行い、アガロース・ゲル電気泳動により超らせんDNAの含有量を調べた。その結果は、試験したスカベンジャーはいずれもDNAの安定性を改善はせず、実際にはそれらは著しくDNAの分解を加速させたことを示している。エタノール、DMSO、グリセリンおよびメチオニンが安定性を強化したのに対し、これらのスカベンジャーがなぜDNAの分解を加速させたかは明らかではない。
DNAを安定化させるためのエタノールの能力についても、脱金属化PBS、ならびに脱金属化・脱酸素化PBS中で調べた。これら2つの研究では、DNAは2.0mcg/mLに調製し、50℃でインキュベートした。表9および10に示した結果は、5%(v/v)エタノールがPBS中、および脱金属化したいずれかの処方中でDNAを安定化したことを示している。
長期安定性検討における第1時点(1カ月)の最近の結果もまた、5%エタノールが脱金属化PBS中2.0mcg/mLのDNAを含む処方を37℃において安定化させたことを示している。この1カ月時点では、PBSコントロールは、初期状態の超らせんDNAの93%が残存していたのに対し、脱金属化サンプルは96.1%、また5%エタノールを含む脱金属化サンプルでは100%残存していたことを示している。
DNA安定性に対するフリーラジカルスカベンジャーの効果を調べるために、pH7.2およびpH8.0のPBS中に20mcg/mLのDNAを入れ、50℃で8週間、2つのDNA安定性実験を行なった。エタノールはヒトに使用できる効果的なフリーラジカルスカベンジャーであることが認められているため、EDTAの存在下および非存在下でスカベンジャーとして2%(v/v)エタノールで試験した。第1の実験(pH7.2)の結果を下記の図20に示す。この結果は、エタノール単独のものがDNA安定性を強化したのに対し、EDTA単独ではDNA安定性を減少させたことを示している。エタノールとEDTAの組み合わせは、4週間まではDNA安定性を大幅に高めたが、第8週までには安定性の増加はごくわずかとなった。これらの結果は、エタノールはEDTAが共存しない場合よりも共存した方が、より有効なフリーラジカルスカベンジャーとなることを示唆している。さらに、これらの結果は、エタノールの非存在下でEDTAは単独ではDNA安定性を減少させたが、エタノールの存在下ではDNA安定性を高めたことを示している。これらの結果は、エタノールはEDTAの存在下でより効果的なスカベンジャーとなることを明白に示唆しているが、これはEDTAがDNAに結合している金属イオンを除去し、それによりDNAに結合している鉄によるラジカルの生成に拮抗して、溶液中に水酸基ラジカルを生成するからである。バルク溶液中で水酸基ラジカルが生成すると、エタノール分子はより多くの時間、ラジカルを捕捉することができる。なぜならば、ラジカルの平均自由行程はDNAとの相互作用距離よりも長いからである。DNAに結合した鉄分子によって生成される水酸基ラジカルはDNAの極めて近くにある。したがって、エタノールがDNAの“表面”に生成されたラジカルを捕捉する能力は著しく減殺される。これらの結果はまた、EDTA以外のキレート化剤が、DNAにすでに結合している金属イオン類(鉄および銅)を除去する能力がある場合には、有効なDNA安定剤になることを示唆している。
pH8.0での第2の安定性研究の結果を下記の図21に示す。本実験によるデータは、エタノールとEDTA/EtOHのDNA安定化効果が、pH7.2よりもpH8.0の方が大きいことを明確に示している。
コハク酸エステルおよびエタノールの組み合わせが、EDTA/EtOHの組み合わせで観察されるのと同一程度のDNA安定化をもたらすかどうか、またこれらの組み合わせのいずれがFe+3の存在からDNAを保護するのかを判定するために、20mcg/mLのDNA、150mMのNaClを含むpH8.0の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液中で、50℃で6週間にわたる安定性実験を行なった。その結果は、コハク酸エステル/EtOHの組み合わせはEDTA/EtOHと同一のDNA安定化をもたらさなかったことを示している。しかしながら、コハク酸エステルとエタノールの組み合わせは、500ppbのFe+3の添加によって発生する大量のフリーラジカルからほぼ完全にDNAを保護した。図22に示す結果もまた、EDTA/EtOHの組み合わせが総体的に最大のDNA安定化をもたらし、500ppbのFe+3添加による影響からの完全な保護を示している。これらの結果は、EDTAとエタノールの特定の組み合わせはDNA安定性を著しく強化するが、コハク酸エステルとエタノールの組み合わせを使用しても同一程度のDNA安定性は達成できないことを示唆している。
実施例15
DNA安定性に対する金属イオンキレート化剤の効果−DNA安定性に対する緩衝液イオン類、pHおよび塩の効果を調べるように考案された予備研究において、本発明者らはPBS(pH7.2)中のDNAに対する1mMおよび10mMのEDTA添加の効果も調べた。これら初期の実験においてはプラスミドDNAは100mcg/mLに調製し、60℃で48時間インキュベート処理を行った。次に超らせんDNA含有量をアガロース・ゲル電気泳動によって測定した。表5に示した結果は、EDTAがDNAの安定性に対して全く効果を有さないことを示している。この初期の段階では、我々が観察したDNA分解プロセスでは微量金属イオンが必要とされなかったことを示唆している。
その他の実験でも、DNA安定性に対するEDTAの効果についての試験が行われた。たとえば表12に示す結果は、50℃でインキュベート処理を行った場合、PBS(pH7.2)または5%(v/v)エタノールを含むPBS中で、0.5mM EDTAは、2.0mcg/mLで調製されたDNAの安定性に顕著な効果をもたらさないことを示している。
DNA安定性に対する鉄キレート化剤デスフェラール(Desferal;1mM)の効果を調べるために考案された初期の実験では、分解の速度増大が示された。この研究においてはDNAはPBS(pH7.2)中で20mcg/mLに調製し、5、25および37℃でインキュベート処理を行った。分解の速度増大の理由は明らかではない。
その後の実験でも、DNA安定性に対するデスフェラールの有害な作用が確認された。たとえば表15に示されている結果は、0.5mMのデスフェラールがPBS中のDNAの急速な分解を引き起こし、これはPBSをDNAとの混合前にデスフェラールで処理した場合でも起きることを示している。この実験はまた、脱金属化PBS中に稀釈する前にDNAを一晩1.0mMのデスフェラールで処理した場合にも、DNAを急速に分解させることを示した。これらデスフェラールを用いた最新の実験では、DNAはPBS中2.0mcg/mLに調製し、50℃でインキュベート処理を行った。
DNA安定性に対する特性が判明しているいくつかの金属イオンキレート化剤の効果を調べるための実験結果が表14に示されている。これらの検討では、DNAをPBS(pH7.2)中2.0mcg/mLに調製し、50℃でインキュベート処理を行った。4つの異なるキレート化剤をそれぞれ0.5mMで試験した。その結果は、ヘキサリン酸イノシトール(IHP)および三リン酸塩(TPP)がDNAの安定性を改善したことを示している。しかしながら、エチレンジアミン−ジ(o−ヒドロキシ−フェニル酢酸(EDDHA))およびジエチレントリアミンペンタ−酢酸(DTPA)は安定性を高めることはなかった。これらの結果は、IHPおよびTPPは、脱金属化PBS、およびエタノールをフリーラジカルスカベンジャーとして含む脱金属化PBS中のDNAをさらに安定化させるのに有用であることを示唆している。IHPおよびTPPの安定化効果は脱金属化に伴う安定性の増強、ならびにエタノールの安定化効果(金属イオン触媒によるフリーラジカル酸化というDNA分解メカニズムに基づいて)とも整合するが、なぜその他の金属イオンキレート化剤がDNAを安定化させないかは明確にはなっていない。既刊の文献(J.Biol.Chem.259、3620−3624;1984)では、IHP、EDDHA、DTPAおよびデスフェラールは鉄に配位する場合に、金属面フリー配位部位を有しないことを示唆している。したがって、これら4つのキレート化剤は鉄と錯体を作るときにEDTAの場合のようには水酸基ラジカルを生成しないことが報告されている。こうした化学的な理解ではDNA安定性に対するこれらキレート化剤の異なる効果を説明するのは難しい。しかしながら、本発明者らの結果は多価リン酸リガンドを含むキレート化剤は、DNAを金属イオン触媒による酸化から保護するのに最も効果的なキレート化剤であることを示唆している。さらに、多価リン酸リガンドを有するその他のキレート化剤としてはポリリン酸などのさまざまな塩類が挙げられる。
また脱金属化状態のさまざまな緩衝液を調べるための本研究者らの最新の研究結果(実施例16参照)もまた、特定の金属イオンキレート化剤が貯蔵中のDNAの安定化に重要であることを示唆している。コハク酸エステルまたはリンゴ酸エステルを含む脱金属化PBSが脱金属化PBS単独より優れていることから、安定化効果はコハク酸エステルおよびリンゴ酸アニオンによる金属イオンの結合によるものと考えられる。しかしながら、本研究者らのデータはまた、クエン酸塩がコハク酸エステルよりも金属イオンに対する高い親和性を有し、広く使用されている緩衝剤であるにもかかわらず、まったくDNAの安定化をもたらさないことを示している。さらに、EDTA、デスDTPAはすべて金属イオンに対する極めて高い親フェラール、ヘキサリン酸イノシトール、EDDHAおよび和性を有するが、これらは貯蔵中のDNAを安定化させることはない。したがって、DNA組成物を安定化させるための金属イオンキレート化剤の能力は、金属イオンに対するキレート化剤の結合親和性には関係しないのである。この結論は、有効なキレート化剤の選定には多価リン酸リガンドを有する分子の実験的な選択または、コハク酸またはリンゴ酸と化学的に似た分子を実験的に選定する必要があることを示唆している。
DNA安定性に対する金属イオンキレート化剤の効果を調べるために、一連のDNA安定性実験を行なった。第1の実験の目的は、エタノール非存在下で、pH8.0におけるPBS中でのDNA安定性に対するいくつかの異なるキレート化剤の効果を判定することにあった。この実験は20mcg/mLのDNAを用い、50℃で2週間にわたり実施した。図23に示されている結果はNTA(ニトリロトリ酢酸)およびDTPA(ジエチレントリアミンペンタ酢酸)だけがエタノールの非存在下でDNA安定性を高めたことを示している。図23のデータは、EDTAがエタノールの非不存在下でDNAの安定性を減ずるという点において、図21および図22に示されている従前の結果と整合している。これらの結果は、これらのキレート化剤の中ではDTPAだけがエタノール不在下での効果的なDNA安定化剤であることを示唆している。
エタノール存在下でのDNA安定性を増強させる金属イオンキレート化剤の能力を調べるために、pH8.0でPBS中に5つの異なるキレート化剤を入れて、50℃で12週間にわたる実験を行なった。図24に示されている結果は、DTPAとEDTAだけが1%EtOHを含むPBS対照に比べてDNA安定性を著しく高めたことを示している。しかしながら、200mMのDTPAもまたエタノールの存在下および不存在下でDNA安定性を同量まで高めた。これらの結果は、鉄−DTPA錯体は水酸基ラジカルの発生を促進せず、したがってスカベンジャーとしてエタノールは必要とされないであろう、という既報(Grafら、1984、J.Biol.Chem.259:3620−3624)と整合するものである。
1%EtOHを含むpH8.0のPBS中でのプラスミドDNAの安定性を最適化するEDTA濃度を決定する目的で、20mcg/mLのDNAを用いて、50℃で6週間に渡って安定性試験を行った。その結果、図25に示すように、10μMのEDTAには、同じ条件下の500μMのEDTAと同じ安定性増加効果があることが示された。これらの結果は、EDTAが定式化緩衝液の中またはDNA検体の中に存在する低い濃度の微量金属イオンと結合することで、DNA安定性を増加させることを示唆している。これらのデータに基づくと、20mcg/mLから1.0mg/mLまでDNA濃度を増加させた場合でも、EDTAはおそらく10μMから500μMの濃度の増加で十分であると考えられる。したがって、DNAワクチン製剤を安定化させるEDTAとエタノールの使用は、1mM以下のEDTA濃度で十分であり、DNA濃度が2mg/mLのDNAワクチンであっても、それ以上の濃度のEDTAは必要とされないはずである。
実施例16
DNA安定性に対する脱金属化緩衝液の効果 − 緩衝液イオンの効果についての本発明者らの初期研究は、脱金属化されていない緩衝液を用いて行った。しかし、緩衝液中に含有される微量金属イオンの量は恐らく緩衝液の純度に応じて変化するので、非脱金属化緩衝液中のDNAの安定性は微量金属イオンの含有量でほぼ決定すると言ってよいであろう。したがって、DNA安定性に対する緩衝液イオンの真の影響を決定するためには、脱金属化緩衝液の効果を比較することが必要であろう。
安定性に対する異なる緩衝液イオンの影響を調べるために、4つの異なる脱金属化緩衝液を用意した。コントロール緩衝液は、pH7.2の脱金属化PBSである。試験に供せられた他の緩衝液は、10mMコハク酸ナトリウムを含む脱金属化PBS(pH7.2)、10mMリンゴ酸ナトリウムを含む脱金属化PBS(pH7.2)、150mM NaCl、10mMトリスーCl、150mM NaCl(pH7.8)を含む重炭酸塩ナトリウム(10mM)、および、10mMトリシン、150mM NaClを含む重炭酸塩ナトリウム(10mM、pH7.8)である。トリスとトリシンの緩衝液は脱金属化が行われなかったが、これは緩衝イオンが陽イオン性なので、Chelex100カラムに結合してしまうためである。脱金属化緩衝液のこの研究のために、インフルエンザDNAワクチンを20.0mcg/mLで製造し、50℃でインキュベート処理を行った。最初の時点(2週間)での結果は、PBSコントロールの初期状態での超らせんDNAの残存率が75%であったのに対し、コハク酸、リンゴ酸、重炭酸ナトリウム、トリス、トリシンの緩衝液は、それぞれ、初期状態での超らせんDNAの残存率が、98%、94%、100%、31%、65%であった。これらの結果は、コハク酸とリンゴ酸を含んだ脱金属化緩衝液が脱金属化PBSよりも優れていることを示しており、150mM NaClを含んだ重炭酸ナトリウム脱金属化緩衝液が最も安定な製剤であることを示す。なぜ重炭酸ナトリウムがPBSよりも優れているのかは明かではないが、コハク酸とリンゴ酸を含んだPBSの安定性効果はこれら化合物の金属イオンをキレート化する能力によってもたらされるもののようである。コハク酸とリンゴ酸は、薬品の中でも安全に用いることができる化合物として知られており、比較的高い濃度でも使用できるので、これらの化合物は微量金属イオンをキレート化してDNAを安定化させる上で最も効果的なものかもしれない。
実施例17
DNA安定性に対する凍結乾燥の効果 − DNAは水溶液中で、フリーラジカル酸化、脱プリン、β脱離反応を含む、様々な異なる種類の分解過程に敏感である。これらの過程の反応率を最小に抑える方法は、DNAを凍結乾燥することであり、その結果、水分含有量が減少し、分子運動が抑制される。保存中のDNA安定性に対する凍結乾燥の効果を測定する目的で、6つの異なる凍結乾燥製剤を用意した。凍結乾燥検体に於けるDNAの安定性を、20mcg/mL・DNAで調整された液体PBS製剤による安定性と比較するため、一ヶ月間、37℃でインキュベート処理を行った後、それぞれアガロースゲル電気泳動法によって解析された。凍結乾燥検体を作製するため、インフルエンザDNAワクチンが適切な安定化剤を用いて20mcg/mLで製造され、0.8mLの溶液が3mLのガラスバイアルの底に置かれた。次に検体は、凍結乾燥機の中に定置されて、冷却庫で、-45℃で4時間、凍結された。次に、庫内は真空状態(20mTorr)にされ、一方、庫内の温度は-30℃から-20℃の間に26時間、維持された。庫内の温度は次に0℃に上げられ、この状態で2時間放置し、次に、25℃まで6時間一定の速度で温度の上昇を行った。次に真空状態を解除し、ガラスバイアルは気体窒素の中で密栓した。
凍結乾燥研究の結果、図12に示すとおり、6つの凍結乾燥製剤の内、4つのDNAが、液体PBSコントロール中のものよりも遥かに安定であることが示された。これは凍結乾燥がDNAワクチンを安定化する上で非常に効果的な方法であることを示唆している。興味深いことに、スクロースやラクトースのような非結晶性の糖を含むDNAワクチン製剤は、液体コントロール(PBS)に比べて、DNAを大きく安定化させた。凍結乾燥DNA検体を作製するために、脱金属化緩衝液を用いた研究を早速行った。金属イオンは溶液中でのDNA安定性に対して非常に有害であるため、脱金属化と凍結乾燥によるDNA製剤が、液体製剤に比べて、大きく安定性を向上させるかもしれない。
凍結乾燥されたDNAの安定性と、凍結乾燥されたDNAの安定性に対する脱金属化緩衝液を用いた製剤の効果を測定する目的で、凍結乾燥された検体について、50℃、4カ月間の条件下で安定性研究を行った。3つの製剤について試験を行い、それぞれ、脱金属化された状態と脱金属化されない(非脱金属化)状態について行った。凍結乾燥に先立って、DNAの濃度は20mcg/mLに調整した。凍結乾燥の条件は、この実施例に記されたものと同一である。4カ月間、インキュベート処理を行った後、検体は滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動法で、SC、OC、直鎖型DNAの%を測定した。その結果は、図26に示すように、最も良い凍結乾燥製剤から得られた安定性は、液体製剤で得られた安定性を遥かに凌ぐ。しかし、最も良い液体製剤による4カ月後に予測された安定性は、凍結乾燥製剤の1番、5番、6番を凌いでいた。液体製剤から得られた4カ月後の安定性データは、50℃、20mcg/mL・DNAの条件下で3カ月後(製剤8番と9番)、または6カ月後(製剤7番)の安定性データから外挿された値に基づいている。結果はまた、脱金属化が、製剤1番と2番に於いて凍結乾燥DNAの安定性を向上させること、しかし、他の凍結乾燥製剤では、%SC・DNAに対してほとんど効果がなかったことを示している。これらの結果は、凍結乾燥がDNAワクチンを安定化させるために効果的な方法であること、そして、定式化緩衝液の脱金属化は、幾つかの製剤に於いて、凍結乾燥DNAの安定性を向上させることを示唆している。
実施例18
脱プリンとβ脱離の速度定数に対するEDTAとエタノールの効果
ここで開示されたDNA安定性研究の結果は、フリーラジカルスカベンジャーと金属イオンキレート剤が存在しない条件下で、保存中のDNAを分解する主たる機構は、フリーラジカル酸化であることを示唆している。データは同時に、定式化緩衝液中の微量金属イオンと、溶解している酸素が、DNAのフリーラジカル酸化を引き起こすという仮説を支持している。この仮説に基づくと、(EDTAとエタノールによって)フリーラジカル酸化が効果的に制御できる製剤に於ける、DNA分解の主たる機構は、脱プリンとβ脱離の過程であろうと考えられ、この反応は水溶液中でDNAに対して起こる(Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610-3618)。もし、脱プリンとβ脱離が、保存中のDNAを分解させる主たる機構であるとすれば、すでに発表されている脱プリンとβ脱離の速度定数と、これらの反応が起こる活性化エネルギー(Ea)値を用いて、時間経過中の%SC・DNA値を迅速に予測することが可能である。しかし、エタノールとEDTA/EtOHを含むDNAワクチン製剤に関する、幾つかのDNA安定性研究の結果は、これらの製剤に於けるDNAが、発表されている速度定数に基づいて予測した値よりも、遥かに安定であることが示唆されてきた。エタノールを含む製剤に於いて、DNA安定性が予測値よりも安定性が高い理由は、おそらくフリーラジカル酸化の速度がかなり低いレベルに抑えられているからであろう。この仮説は、ヒドロキシルラジカルに対する効果的なスカベンジャーとして知られているエタノールの開示されている技術内容と一致する。したがって、水溶液中のDNAの固有の安定性を決定する目的で、100mcg/mLのDNAを用いて、1%EtOHと0.5mM EDTAを含んだpH7.4のPBS中で安定性試験を行った。DNAのフリーラジカル酸化をさらに制御するために、密栓されたガラスアンプル中に溶液は保存された。アンプルは40、50、60、80℃で、それぞれインキュベート処理を行った。プラスミド当たりのAP(アプリン/塩基の脱落)部位の数を決定し、脱プリン(k1)とβ脱離(k2)の速度定数を決定するために、様々な時間経過後に、アンプルはインキュベート装置から取り出された。E.coliのエクソヌレアーゼIIIの存在下、非存在下で、溶液の%SC・DNAを測定した。AP部位測定法の記述と、脱プリン(k1)とβ脱離(k2)の速度定数を決定する方法を以下に記載する。
AP測定法の記述 − 測定の原理は、エキソヌクレアーゼIIIで処理した後に超らせん型プラスミドDNA(AP部位を含んでいる)が、開環型に変換する現象に基づいている。E.coliのエクソヌレアーゼIIIは、APーエンドヌレアーゼの活性に付随しており、AP-エンドヌレアーゼはDNA骨格をAP部位で切断して、AP部位を失ったDNAを完全な超らせん状態から解く酵素である。プラスミド当たり、ただ1つのAP部位を持つ超らせん型プラスミドDNAは、Exo IIIによって完全に開環型DNAに変換されるため、この測定法は、5〜10%のDNA分子が、ただ1カ所のAP部位を含むだけでも、AP部位の存在を検出できるだけの十分な感度を持っている。
この測定は、総量35mL系で100ngのプラスミドDNAについて、0.25ユニットのExo IIIの存在下、非存在下に於いて、37℃で30分間、インキュベート処理を行い、実施した。次に、検体からDNAの一用量(18ng)を、アガロースゲル電気泳動法とエチジウムブロマイド染色法によって測定した。次いでゲルのネガティブコントロールの写真を測定し、それぞれの型のDNAの定量ができるように同じゲルに、超らせん、開環型、直鎖型のそれぞれのスタンダード(標準品)が泳動された。そして、検体の結果をこれらと比較した。DNA検体中のAP部位の数を決定するために、本発明者らはExo IIIで処理した前後の超らせんDNAの百分率(%)で表現したデータを用いた。例えば、あるDNA検体が処理の前に90%の超らせんを含み、処理後に50%の超らせんを含んでいれば、AP部位の計算は下記のように行われる。まず第一に、過去の研究に基づいて、本発明者らは脱プリンの速度がDNA配列と独立であると仮定して、AP部位の導入はポワソン分布に基づくと仮定した。次に、DNA分子(SB)の母集団に於ける鎖の切断数を、超らせん状態(f1)であるDNAの分数の関数として表現する方程式を用いた。
SB=−ln f1
90%が超らせんであるDNAに対して、プラスミド当たりの鎖の切断数は、平均して:
SB=−ln(.90) または 0.105
50%が超らせんであるDNAに対しては:
SB=-ln(.50) または .693
したがって、.693と0.105(.588)の違いは、AP部位に於いてDNAを切断することで導入された鎖の切断数であり、したがってこれはDNAのAP部位の数と等しい。
脱プリン(k1)とβ脱離(k2)の速度定数を決定する方法 − 脱プリン(k1)とβ脱離(k2)の速度定数を決定するためには、まずこれらの速度定数と、幾つかの簡単に測定できるDNA安定性パラメータとの数学的関係を定める方程式が必要である。今回の場合、本発明者らは、k1値とk2値を含んだ、プラスミド(SB)当たりの鎖の切断数と、プラスミド当たりのAP部位の数の関係を定めた方程式を得た。本発明者らはすでに、SBと%SC・DNAの関係を表現(上記)したので、次に、DNA安定性データ(時間経過中に%SC・DNAを測定したもの)、および、EDTAとエタノールを含むDNAワクチン製剤に於けるk1値とk2値を決定するAP部位測定法を用いるのが適切であろう。
分子の母集団に於いて、各時点でのプラスミド(SB)当たりの鎖の切断数は、その時点までに生産されたAP部位の総数(TAP)から、プラスミド当たりのAP部位の数(AP)を差し引いた残値と等しい、という仮定から、本発明者らは出発することができる。計算を簡単にするために、本発明者らはさらに、出発時のDNAがAP部位を全く含まない、または0時間に於ける鎖の切断数は全くない、ことを仮定する。そうすると、
SB=TAP−AP
TAP=k1(PB)t であるので、k1を脱プリン速度定数、
PB=プリン塩基の数、t=時間、として、
SB=k1(PB)t−AP
しかし、APはk1、k2、PBの関数として表現されなければならない。したがって、APの変化率は、AP部位の生産率から、鎖切断への変換率を差し引いたものと同等であると定められる。次に、積分によってAPが解かれる。
AP初期値がゼロであると仮定すると、
ここで、APの形式を、SBについての方程式に代用して、各時点でのプラスミド当たりの鎖の切断数を示す方程式が得られる。
あるいは、APから関算してSBと算出し得る
k1とk2の決定の結果 − 上記の方程式を用いて導かれたk1とk2が、EDTAとエタノールを含む40、50、60、80℃に於けるDNAワクチン製剤のために決定された。その結果を表16に示す。また表16は、同じpHと温度条件下に於ける、すでに発表されているk1とk2と、測定されたk1とk2との比較も示してある。50℃では、製剤から得られたk1値は、同じpH、温度条件下で発表されている値に比べて、ほぼ7分の1で、かなり小さい値である。この結果は、この製剤でk1とk2が、発表されている速度定数(Lindahl et al.,1972,Biochemistry 11:3610-3618)に比べてかなり小さいことを明らかに示している。この結論は、もしDNAのフリーラジカル酸化が効果的に制御されれば、すでに脱プリンとβ脱離の速度定数として発表されている値に基づいて予測されたものより、DNAはずっと安定であることを示唆している。さらに、この結果は、発表されている速度定数は、フリーラジカル酸化が制御されていないために、間違いであるかのように数値が大きいことを示唆している。
EDTA/EtOH存在下での、脱プリン(k1)とβ脱離(k2)の活性化エネルギーを決定するために、また、EDTA/EtOHを含むPBS中でのDNAの分解機構が主として脱プリンとβ脱離によるものかどうかを調べるために、上記のデータを用いて、アレニウスプロットの作製を行った。その結果、図29と30に示してある。その結果から、脱プリンとβ脱離の活性化エネルギーは、それぞれ28.4と25.2kcal/molであることが明らかになった。これらの値は脱プリンに対して発表されている値、31±2kcal/molと28kcal/mol(Lindahl et al., 1972, Biochemistry 11: 3610-3618 ; Greer and Zamenhof, 1962, J. Mol. Biol. 4: 123)と、β脱離に対して発表されている値、24.5kcal/mol(Lindahl and Andersson, 1972, Biochemistry 11: 3618)に、非常に正確に一致する。これらの結果は、EDTA/EtOHを含むPBS中でのDNAの分解機構が、主として脱プリンとβ脱離によるものであること、そして、これらの反応の機構は、EDTAとエタノールの存在によって変化しないことを示唆している。これらのデータは同時に、他の温度条件下(pH7.4)で行った場合の、DNA安定性研究での超らせんDNA残存率を予測することを可能にし、製剤に於いて、フリーラジカル酸化を効率的に制御することを可能にする。
100mM EDTAと1%エタノール(pH7.4)を含むDNAワクチン製剤に於けるDNA安定性が、発表されている速度定数によって予測した値よりも遥かに大きいことを示すために、2つの安定性予測について、DNA安定性データをプロットして、下記に示した(図31)。その結果は、この製剤中のDNAが、発表された速度定数が示唆する値よりも遥かに良く安定していることを顕著に示している。さらに、この結果は、実験的に得られた速度定数が、発表された速度定数を使うよりも、良い予測値を与えることを示している。
実験的に得られた速度定数(k1とk2)、および速度定数と%SC・DNAついて得られた関係を用いて、室温に於ける長期安定性を確保するために必要である製剤のpHを予測することも可能である。これらの予測(図32参照)によれば、ガラスアンプル中で、30℃で2年間に渡ってSC・DNAを50%以上、維持するためには、DNAワクチン製剤(EDTA/EtOHを含む)のpHを約8.0にするのが望ましいことを示唆している。
これらの結果は、EDTA/EtOHが効果的にDNAワクチン製剤に於けるフリーラジカル酸化を制御することを示しており、それによって、脱プリンとβ脱離について発表されている速度定数からは予測できないほど高いレベルまで、DNA安定性を向上させることを示している。
Claims (18)
- 精製された超らせん型プラスミドDNAからなるDNA調製物を安定化する方法であって、EDTA、エタノールおよび緩衝剤を含む製剤に該DNA調製物を導入し安定化されたDNA製剤を得ることを含む前記方法。
- DNA調製物から金属イオンが除かれている請求項1に記載の方法。
- 製剤緩衝剤がTris−HCl、グリシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸リチウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項1又は2に記載の方法。
- 製剤が塩を含む請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 塩がNaCl、KCl、LiClおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項4に記載の製剤。
- 安定化したDNA製剤を光が存在しない条件下で保存することを更に含む請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 精製されたDNAが、インフルエンザウイルスDNA、A型肝炎ウイルスDNA、B型肝炎ウイルスDNA、C型肝炎ウイルスDNA、ヒトパピローマウイルスDNA、Mycobacterium tuberculosis由来のDNA、ヒト免疫不全ウイルスDNA、水痘ウイルスDNA、ヘルペスウイルスDNA、麻疹ウイルス(measles virus)DNA,ロタウイルスDNA、流行性耳下腺炎ウイルスDNA、風疹ウイルス(rubella virus)DNAおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項1〜6のいすれかに記載の方法。
- a)精製された超らせん型プラスミドDNA、
b)3%v/vまでの濃度で存在する、エタノールである非還元性フリーラジカル捕獲剤、
c)5mMまでの濃度で存在する、EDTAである金属イオンキレート剤、
d)塩および
e)製剤緩衝剤、
を含む安定化されたDNA製剤。 - 超らせん型プラスミドDNAから金属イオンが取り除かれている請求項8に記載の安定化されたDNA製剤。
- 製剤緩衝剤がTris−HCl、グリシン、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸リチウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、リンゴ酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウムおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項8又は9に記載の安定化されたDNA製剤。
- 塩がNaCl、KCl、LiClおよびこれらの組合わせから選択される請求項8〜10のいずれかに記載の安定化されたDNA製剤。
- (a)精製された超らせん型プラスミドDNA、
(b)pHが8.0から9.0のTris−HCl緩衝剤、
(c)3%v/vまでのエタノール、
(d)濃度範囲が5mMまでのEDTA、および
(e)50mMから500mMの濃度のNaCl、
を含む安定化されたDNA製剤。 - 超らせん型プラスミドDNAから金属イオンが取り除かれている請求項12に記載の安定化されたDNA製剤。
- NaClの濃度が100mMから200mMである請求項12又は13に記載の安定化されたDNA製剤。
- 緩衝剤のpHが8.5から9.0である請求項12〜14のいずれかに記載の安定化されたDNA製剤。
- EDTAが500μMまでの濃度で存在する請求項12〜15のいずれかに記載の安定化されたDNA製剤。
- エタノールが2%までの濃度で存在する請求項12〜16のいずれかに記載の安定化されたDNA製剤。
- 精製されたDNAがインフルエンザウイルスDNA、A型肝炎ウイルスDNA、B型肝炎ウイルスDNA、C型肝炎ウイルスDNA、ヒトパピローマウイルスDNA、Mycobacterium tuberculosis由来のDNA、ヒト免疫不全ウイルスDNA、水痘ウイルスDNA、ヘルペスウイルスDNA、麻疹ウイルス(measles virus)DNA,ロタウイルスDNA、流行性耳下腺炎ウイルスDNA、風疹ウイルス(rubella virus)DNAおよびこれらの組合わせから成る群より選択される請求項12〜17のいすれかに記載の安定化されたDNA製剤。
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