JP2001316297A - 遺伝子包埋リポソーム製剤及びその製法 - Google Patents

遺伝子包埋リポソーム製剤及びその製法

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JP2001316297A JP2001007758A JP2001007758A JP2001316297A JP 2001316297 A JP2001316297 A JP 2001316297A JP 2001007758 A JP2001007758 A JP 2001007758A JP 2001007758 A JP2001007758 A JP 2001007758A JP 2001316297 A JP2001316297 A JP 2001316297A
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Haruyoshi Yajima
晴良 矢嶋
Keizo Sakuta
啓三 佐久田
Hideshi Ideno
英志 出野
Kunio Yagi
國夫 八木
Shigeko Oishi
誠子 大石
Jun Yoshida
純 吉田
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Kaken Pharmaceutical Co Ltd
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OYO SEIKAGAKU KENKYUSHO
Kaken Pharmaceutical Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Abstract

(57)【要約】 【課題】 長期保存が可能な遺伝子包埋リポソーム製剤
及びその製法を提供する。 【解決手段】 遺伝子包埋リポソームに二糖類水溶液を
添加して凍結又は凍結乾燥させる。 【効果】 本発明による遺伝子包埋リポソーム製剤は凍
結製剤の場合に、-20℃保存において 6 ケ 月以上の保存
が可能であり、用時における復水性が良好であって生物
活性が低下しない。凍結乾燥製剤の場合にも 1 年間程
度の長期保存が可能であり、用時における復水性が良好
であって生物活性が低下しない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子包埋リポソー
ム製剤及びその製法に係り、殊に長期保存可能な遺伝子
包埋リポソーム製剤及びその製法に係る。
【０００２】
【従来の技術】現在、リポソームは、遺伝子治療におけ
る遺伝子導入用ベクターとして、ウイルスをベクターと
する場合に比較して品質管理が容易であり、安全性が高
い等の理由で遺伝子治療用製剤としての実用化が期待さ
れている。しかしながら、リポソームに包埋されたプラ
スミド DNA は溶液中では安定性が低いので、最近にお
いては遺伝子組換えプラスミド DNA 含有溶液とリポソ
ームの構成脂質溶液とをそれぞれ別のバイアルに充填し
て乾燥させ、これらの乾燥品を用時にそれぞれ溶液化し
て混合する DNA/脂質複合体法 (DNA/Lipids Complex)
が研究の主流を占めている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】上記の
DNA/脂質複合体法は用時に製剤化せねばならず、その
調製法が複雑であって、均一な製剤を調製することが困
難な点に課題がある。従って保存安定性に優れ、用時に
おいて調製が容易であり且つ均一で安定な遺伝子治療用
リポソーム製剤の開発が強く要望されている。一方、構
成脂質が N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジド
デシル-D-グルタメートクロライド (以下、単に「TMA
G」と称する) と、ジラウロイルホスファチジルコリン
(以下、単に「DLPC」と称する) と、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン (以下、単に「DOPE」と称
する) であり、モル比が 1 : 2 : 2 である多重膜リポ
ソームは遺伝子の捕捉効率が高く、遺伝子の発現性が良
好であり且つ投与した場合に細胞毒性が低く、有効性と
安全性が高い点において遺伝子治療用ベクターとして有
用である (特開平 4 - 108391 号公報)。しかしなが
ら、この遺伝子包埋リポソームを溶液中で保存すると D
NA の分解が生じ易く、長期保存には適していない。DNA
の安定性における向上自体は、これを包埋しているリ
ポソームの溶液を凍結させることにより可能であるが、
凍結時にリポソームに凝集が生じ、用時に融解させた場
合に均一性が損なわれ、斯くて生物活性が低下してしま
う点に課題がある。
【０００４】この遺伝子包埋リポソームは、その粒子径
が小さい時には細胞毒性を生じ、逆に大きいときには包
埋した遺伝子の細胞への導入効率が悪くなるため、リポ
ソーム粒子径のコントロールは遺伝子治療を行う上で重
要な要素となっている。
【０００５】従って、本発明の目的は、遺伝子の捕捉効
率が高く、遺伝子の発現性が良好であり、投与した場合
に細胞毒性が低く、安全性が高く、保存安定性において
優れており、用時において投与形態への変換が容易であ
り且つ投与形態になしても生物活性が低下しない、遺伝
子包埋リポソーム製剤及びその製法を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決し目的を達成する手段】本発明者等は既述
の課題を解決し且つ上記の目的を達成するために鋭意研
究を重ねた結果、遺伝子包埋リポソームに二糖類水溶液
を添加して凍結又は凍結乾燥させることにより得たリポ
ソームは、一定期間保存後において水に懸濁させた場合
に復水性が良好であり、その粒子径に著しい変化は認め
られず、従って凍結又は凍結乾燥時にリポソームが凝集
することはなく、遺伝子 DNA の発現性においても優れ
ているとの知見を得、斯くて本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】従って、本発明による長期保存可能な遺伝
子包埋リポソーム製剤は遺伝子包埋リポソームと保護剤
としての二糖類とを含有している凍結品又は凍結乾燥品
であることを特徴としている。
【０００８】一方、本発明による長期保存可能な遺伝子
包埋リポソーム製剤の製法は遺伝子包埋リポソームに二
糖類水溶液を添加して凍結又は凍結乾燥させることを特
徴としている。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において、リポソームの構
成脂質は TMAG と DLPC と DOPE であるのが好ましく、
そのモル比は 1 : 2 : 2 であるのが好ましい。
【００１０】二糖類としてはスクロース、トレハロー
ス、ラクトース、キシロビオース、キトビオース、レバ
ンビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオ
ース、エピセロビオース、ツラノース、ラクツロース、
ルチノース、コンドロシン等を挙げることができるが、
スクロース及びラクトースの内の少なくとも一方である
ことが好ましい。二糖類の含有量は、スクロースの場合
及びラクトースの場合を問わず、リポソームに包埋され
る遺伝子の質量 1g 当り、300g - 3333g の範囲内であ
るのが好ましい。
【００１１】リポソームの平均粒子径は 0.02 - 10μm
であることが好ましく、更に好ましくは 0.6 - 6μm で
ある。
【００１２】
【実施例等】次に、試験例により本発明を更に詳細に且
つ具体的に説明する。尚、後記の試験例において用いら
れた物質、遺伝子包埋リポソームの調製法、試験法等は
下記の通りである。
【００１３】物質 (a) TMAG (相互薬工株式会社製)、(b) DLPC (日油リポ
ソーム株式会社製)、(c) DOPE (日油リポソーム株式会
社製)、(d) ヒトインターフェロン β 発現プラスミド
(pDRSV-IFN β) :E. coli DH5α を用いてクローニング
し、QIA Ultra 100 キット (QIAGEN社製) を用いて精製
することにより得た、(e) 日局スクロース (協和発酵株
式会社製)、(f) 特級ラクトース (和光純薬株式会社
製)、(g) 日局ラクトース (イワキ株式会社製)、(h) 日
局ソルビトール (純正化学株式会社製)、(i) 日局マン
ニトール (協和発酵株式会社製)、(j) 特級キシリトー
ル (和光純薬株式会社製)、(k) 特級グルコース (和光
純薬株式会社製) 及び(l) 日局グルコン酸マグネシウム
(協和発酵株式会社製)。
【００１４】遺伝子包埋リポソームの調製法 TMAG、DLPC 及び DOPE をモル比が 1 : 2 : 2 になるよ
うに採取してクロロホルムに溶解させた後に減圧濃縮及
び減圧乾燥を行ってクロロホルムを除去する。この脂質
混合物に pDRSV-IFNβ、等張燐酸塩緩衝液 (塩化ナトリ
ウム 13.7mmol/l、燐酸一水素ナトリウム 8.7mmol/l 及
び燐酸二水素ナトリウム 1.4mmol/l) 溶液を添加してポ
リトロンホモジナイザーにより 15000rpm で処理した
後、加圧濾過及び遠心分離を行うことにより遺伝子包埋
リポソームを調製した。このリポソームは DNA を約 1.
4mg/ml (吸光度法による) 及び脂質成分を約 40μmol/m
l (HPLC 法による) を含有しており、平均粒子径は 1 -
2μm であった。
【００１５】凍結法 スクロースと遺伝子包埋リポソームとを含有している懸
濁液を調製し、各 1ml宛ガラス製バイアルに分注して凍
結することにより凍結試料を得た。凍結乾燥法 調製した遺伝子包埋リポソーム 1ml をガラス製バイア
ル内に入れ、凍結乾燥機 (共和真空株式会社製) を用い
て凍結乾燥し、凍結乾燥試料を得た。
【００１６】安定性試験 凍結試料については -20℃ で 1 〜 6 ケ 月間保存し、
定期的にサンプリングを行い、凍結試料を室温において
融解させ、下記の項目の試験を実施した。 (1) 粒子径の測定 NICOMP M370 サブミクロンパーティクルサイザーを用い
てリポソームの平均粒子径を測定した。 (2) DNA の残存量測定 10% Triton X-100 によりリポソームを可溶化させた
後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマ
イドを添加して、pDRSV-IFNβのバンドの蛍光強度によ
り DNA 量を測定した。DNA 純度は、電気泳動で得られ
た全てのバンドの蛍光強度の総和に占める pDRSV-IFNβ
のバンドの蛍光強度の割合を算出した値である。
【００１７】凍結乾燥試料については -20℃、5℃ 及び
10℃ で冷凍もしくは冷蔵保存し、定期的にサンプリン
グを行い、下記の 4 項目の試験を実施した。試験期間
は 1 - 6 ケ 月間又は 4 - 12 ケ 月間であった。 (1) 復水性 バイアル内の凍結乾燥試料に蒸留水 1ml を添加して 10
分間放置した後に、バイアルを手で振り混ぜ、次いで
均一な懸濁溶液であるか否かを目視観察により判定し
た。 (2) 粒子径の測定 NICOMP M370 サブミクロンパーティクルサイザーを用い
てリポソームの平均粒子径を測定した。 (3) DNA の残存量測定 10% Triton X-100 によりリポソームを可溶化させた
後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマ
イドを添加して、得られた全てのバンドの 蛍光強度の
総和に占める pDRSV-IFNβ のバンドの蛍光強度の割合
により DNA 純度を測定した。DNA 残存率は、凍結乾燥
前の DNA 純度を 100 とした時の、残存している DNA
量の割合を算出した値である。 (4) ヒトインターフェロンβ の産生試験 DNA として 15ng/ml の濃度に D-MEM 培地で希釈したリ
ポソームをヒト脳腫瘍細胞である U251SP 株に添加し、
37℃ において 2 日間培養し、産生されたヒトインター
フェロンβ の量を ELISA 法により測定した。
【００１８】試験例 1 (糖類のリポソーム凝集防止効
果) 上記の遺伝子包埋リポソームに終濃度として 9 W/V %
のスクロース、9 W/V %のラクトース又は 5 W/V % のマ
ンニトールを添加して凍結した。次いでこの凍結試料を
蒸留水で融解し、目視観察した。その結果、マンニトー
ルの場合においてのみ凝集が認められ、スクロース及び
ラクトースの場合にはリポソームの凝集防止効果が認め
られた。次に、スクロース及びラクトースの添加濃度を
変化させて凝集防止効果に及ぼす影響を調べた。更に、
比較検討のために他の糖及び糖アルコールについても凝
集防止効果の存否を調べた。本試験例の場合には、糖又
は糖アルコールと遺伝子包埋リポソーム [pDRSV-IFNβ
の終濃度 : 150μg/ml、脂質 6.7μmol/ml (TMAG : DLP
C : DOPE = 1 : 2 : 2)] を含有している懸濁液を調製
し、凍結後 -20℃ において 一晩放置した後、室温にお
いて融解させ、次いで粒子径を調べた。結果は下記の表
1 に示されている通りであり、スクロース、ラクトー
ス、ソルビトール及びグルコースを用いた場合にリポソ
ームの凝集防止効果が認められ、終濃度が 18 W/V % の
スクロース、9 及び 14 W/V % のラクトース及び 5 W/V
% のソルビトールを用いた場合に良好なリポソームの
凝集防止効果が認められた。
【００１９】
【表１】
【００２０】試験例 2 スクロース (終濃度 : 9 W/V %) と遺伝子包埋リポソー
ム [pDRSV-IFN β の終濃度 : 150μg/ml、脂質 6.7μm
ol/ml (TMAG : DLPC : DOPE = 1 : 2 : 2)]とを含有し
ている懸濁液を調製し、各 1ml 宛ガラス製バイアルに
分注して凍結させた。これらの凍結製剤を -20℃ にお
いて 1 〜 6 ケ 月間保存し、この保存期間中にサンプリ
ングし、室温において融解し、次いで平均粒子径を測定
し、又DNA の安定性につい て検討した。これらの結果
は下記の表 2 に示されている通りであり、凍結保存に
起因する粒子径の変化は認められず、DNA の分解も抑制
された。又、これらは何れも IFN-β 産生量の低下も認
められなかった。
【００２１】
【表２】
【００２２】試験例 3 スクロース (終濃度 : 7、9、18 W/V %) と遺伝子包埋
リポソーム [pDRSV-IFNβ の終濃度 : 150μg/ml、脂質
6.7μmol/ml (TMAG : DLPC : DOPE = 1 : 2 :2)] を含
有している懸濁液を調製し、1ml 宛ガラス製バイアルに
分注し、凍結乾燥させた。これらの凍結乾燥試料を 5℃
において 1 - 6 ケ 月間に亘り保存した後、蒸留水に懸
濁させ、次いで平均粒子径及び DNA の安定性について
検討した。粒子径の測定結果は後記の表 3 に示されて
いる通りであり、全ての濃度においてリポソームの凝集
防止効果が認められ、殊に終濃度が 9 及び 18 W/V %の
スクロ ースを用いた場合に良好なリポソームの凝集防
止効果が認められた。又、本試験に供した凍結乾燥試料
の復水性は何れも良好であった。尚、スクロースの終濃
度 9 及 び 18 W/V % は、リポソームに包埋されている
遺伝子の質量1g 当りに換算すると、それぞれ 600g 及
び 1200g になる。
【００２３】
【表３】
【００２４】試験例 4 終濃度が 7、9 又は 14 W/V % のラクトースを用いた以
外は試験例 3 と同様にして凍結乾燥試料を調製し且つ
同様の試験を行った。粒子径の測定結果は下記の表 4
に示されている通りであり、何れの濃度のラクトースを
用いた場合においてもリポソームの凝集防止効果が認め
られた。又、本試験に供した凍結乾燥試料の復水性は何
れも良好であった。尚、ラクトースの終濃度 7、9 及び
14 W/V% は、リポソームに包埋されている遺伝子の質
量 1g 当りに換算すると、それぞれ 467g、600g 及び 9
33g になる。
【００２５】
【表４】
【００２６】試験例 5 スクロースを保護剤とする処方の精密化を行うために、
表 5 に示されている処方により pDRSV-IFN β 包埋凍
結乾燥リポソーム製剤を調製し、-20℃ 又は10℃ にお
いて 4 - 12 ケ 月間に亘り保存し、サンプリングして蒸
留水に懸濁させ、次いで平均粒子径を調べ且つ DNA の
残存率及びヒトインターフェロンβ の産生能を測定し
た。結果は表 6 及び表 7 に示されている通りであり、
何れの処方においてもリポソームの凝集防止効果、DNA
の安定効果が認められた。又、本発明の遺伝子包埋リポ
ソーム凍結乾燥製剤は、表 5 の処方 1 - 6 の何れにお
いても、10℃ 並びに -20℃ で 12 ケ 月保存の後も IFN
-β 産生量の低下が認められなかった。一方、遺伝子包
埋リポソームを溶液状態において 10℃ で保存した処、
経時的に IFN-β の産生量の低下が認められた。又、ス
クロースの添加量はリポソームに包埋されている遺伝子
の質量 1g 当りに換算すると、それぞれ、処方 1 は 26
67g、処方 2 は 3000g、処方 3 は 1200g、処方 4 は 9
00g、処方 5は 600g、処方 6 は 3333g になる。
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【表７】
【００３０】試験例 6 ラクトースを保護剤とする処方の精密化を行うために、
表 8 に示されている処方により、試験例 3 と同様にし
て平均粒子径を調べ、DNA の残存率及びヒトインターフ
ェロンβ の産生能を測定した。結果は表 9 及び表 10
に示されている通りであり、何れの処方の場合において
もリポソームの凝集防止効果、DNA の安定効果が認めら
れた。又、本発明の遺伝子包埋リポソーム凍結乾燥製剤
は、表8 の処方 1 - 6 のいずれにおいても、10℃ 並び
に -20℃ で 12 ケ 月保存の後も IFN-β 産生量の低下
が認められなかった。一方、遺伝子包埋リポソームを溶
液状態において 10℃ で保存した処、経時的に IFN-β
の産生量の低下が認められた。又、ラクトー ス水溶液
に懸濁させたリポソームの凍結乾燥試料の復水性は何れ
も良好であった。尚、表 8 の処方 1 - 6 について、ラ
クトースの添加量はリポソームに包埋されている遺伝子
の質量 1g 当りに換算すると、それぞれ、処方 1 は 26
67g、 処方 2 は 3000g、処方 3 は 1200g、処方 4 は
900g、処方5は 600g、処方 6 は 3333g になる。
【００３１】
【表８】
【００３２】
【表９】
【００３３】
【表１０】
【００３４】本発明による遺伝子包埋リポソーム凍結製
剤は -20℃ の保存温度条件下において最低 6 ケ 月間は
安定であり、一方凍結乾燥製剤は -20℃ から +10℃ の
保存温度条件下において最低 1 年間は安定であって、
用時における復水性も良好であることが明らかになっ
た。
【００３５】
【発明の効果】本発明による遺伝子包埋リポソーム製剤
は長期保存が可能であり、用時において極めて容易に投
与形態になすことができる。該製剤は遺伝子包埋リポソ
ームの二糖類懸濁液を単に凍結又は凍結乾燥させること
により得られるので調製が極めて容易である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/24 Ａ６１Ｋ 47/24 47/26 47/26 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 佐久田 啓三 静岡県藤枝市源助301 科研製薬株式会社 開発研究所内 (72)発明者 出野 英志 静岡県藤枝市源助301 科研製薬株式会社 開発研究所内 (72)発明者 八木 國夫 愛知県名古屋市名東区西里町２−21 (72)発明者 大石 誠子 愛知県犬山市天神町１−17 しろひがしマ ンション１棟305号 (72)発明者 吉田 純 愛知県名古屋市東区筒井１−４−10 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA04 HA17 4C076 AA19 CC50 DD15 DD52 DD63 DD67 FF63 GG01 4C084 AA13 MA24 NA03 4C086 EA16 MA24 NA03

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子包埋リポソームと保護剤としての
    二糖類とを含有している凍結品であることを特徴とす
    る、遺伝子包埋リポソーム製剤。
  2. 【請求項２】 遺伝子包埋リポソームと保護剤としての
    二糖類とを含有している凍結乾燥品であることを特徴と
    する、遺伝子包埋リポソーム製剤。
  3. 【請求項３】 リポソームの構成脂質が N-(α-トリメ
    チルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメート
    クロライド (TMAG) と、ジラウロイルホスファチジルコ
    リン (DLPC) と、ジオレオイルホスファチジルエタノー
    ルアミン(DOPE) であることを特徴とする、請求項 1 又
    は 2 に記載の遺伝子包埋リポソーム製剤。
  4. 【請求項４】 二糖類がスクロース及びラクトースの少
    なくとも 1 方のものであることを特徴とする、請求項
    1 又は 2 に記載の遺伝子包埋リポソーム製剤。
  5. 【請求項５】 遺伝子包埋リポソームに二糖類水溶液を
    添加して凍結又は凍結乾燥させることを特徴とする、遺
    伝子包埋リポソーム製剤の製法。
  6. 【請求項６】 リポソームの構成脂質が N-(α-トリメ
    チルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメート
    クロライド (TMAG) と、ジラウロイルホスファチジルコ
    リン (DLPC) と、ジオレオイルホスファチジルエタノー
    ルアミン(DOPE) であることを特徴とする、請求項 5 に
    記載の遺伝子包埋リポソーム製剤の製法。
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