ES2234018T3 - Formulaciones de vacunas de adn. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE RELACIONA CON NUEVOS PROCEDIMIENTOS Y FORMULAS DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS DE ACIDO NUCLEICO, ESPECIFICAMENTE FORMULAS DE VACUNAS DE ACIDO NUCLEICO Y PRODUCTOS DE TERAPIA GENETICA DE ACIDO NUCLEICO. LAS FORMULAS DE LA INVENCION ESTABILIZAN LA ESTRUCTURA DE LOS PRODUCTOS FARMACEUTICOS DE ADN.
Description
Formulaciones de vacunas de ADN.
Esta solicitud es una continuación parcial de la
solicitud provisional de Patente de los Estados Unidos con nº de
Serie 60/017.049, presentada el 26 de Abril de 1996.
No se aplica
No se aplica
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de productos farmacéuticos de ácido nucleico, de forma
específica a formulaciones de productos de vacunas de ácido nucleico
y productos para terapia génica de ácido nucleico. Las formulaciones
de la descripción estabilizan la conformación de los productos
farmacéuticos de ADN. Las vacunas, cuando se introducen directamente
en las células del músculo, inducen la producción de respuestas
inmunes que reconocen de forma específica el virus de la gripe
humana.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones
de productos farmacéuticos de ácido nucleico, de forma específica a
formulaciones de productos de vacunas de ácido nucleico y productos
para terapia génica de ácido nucleico. Las formulaciones de la
descripción estabilizan la conformación de los productos
farmacéuticos de ADN. Las vacunas, cuando se introducen directamente
en las células del músculo, inducen la producción de respuestas
inmunes que reconocen de forma específica el virus de la gripe
humana.
Durante su almacenamiento como entidad
farmacéutica, las vacunas de plásmido de ADN experimentan un cambio
físico-químico en el que el plásmido superenrollado
se convierte a la forma circular abierta y linear. Diferentes
condiciones de almacenamiento (pH bajo, temperatura elevada, baja
fuerza iónica) pueden acelerar este proceso. En esta invención, la
eliminación y/o quelación de iones metálicos traza (con ácidos
málico o succínico, o con quelantes que contengan múltiples ligandos
fosfato) de la solución de plásmido de ADN, de los tampones de las
formulaciones, o de los viales y tapones, estabilizan el plásmido de
ADN frente a esta ruta de degradación durante el almacenamiento.
Además, se necesitan radicales libres secuestrantes no reductores
para evitar al plásmido de ADN daños procedentes de la producción de
radicales libres que puede seguir teniendo lugar, incluso en
disoluciones aparentemente desmetalizadas. Además, el tipo de
tampón, pH, concentración de sales, exposición a la luz, así como el
tipo de proceso de esterilización usado para preparar los viales,
todos deben controlarse en la formulación para optimizar la
estabilidad de la vacuna de ADN. La liofilización de la vacuna de
ADN en presencia de los excipientes de formulación adecuados puede
llevarse a cabo también para estabilizar el plásmido durante el
almacenamiento.
El GIBCO BRL Catalogue
(1993-1994, páginas 8-9,
8-11 y 8-13) proporciona ADN patrón
y ladder para dimensionar fragmentos lineales de ADN de cadena
doble.
Peak y col, Radiation Research
97:570-575, 1984 describen un espectro de
acción para la protección de ADN purificado mediante glicerol frente
a la inducción de roturas de cadena simple en el ADN mediante luz
ultravioleta.
El Documento WO 94/02639 describe el uso de
mejorantes de la permeación y mejorantes de señal para ensayos de
hibridación in situ e inmunoensayos.
A partir de la literatura científica, se
esperaría que la reacción de escisión de la cadena que da lugar a la
conversión del plásmido de ADN de superenrollado a circular abierto
a lineal tuviera lugar a través de dos mecanismos químicos
diferentes (ya que estas preparaciones de ADN muy purificado no
contienen nucleasas): (1) despurinización seguida de
\beta-eliminación y/o (2) oxidación con radicales
libres. Aunque se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza suprimiera el mecanismo de rotura de la cadena del ADN por
oxidación con radicales libres, nuestros resultados indican, de
forma sorprendente, que la eliminación o quelación de los iones
metálicos traza de la solución que contiene el ADN estabiliza el ADN
frente a ambos mecanismos de degradación, según se juzga por
comparación de nuestros datos de estabilidad con las velocidades de
despurinización y \beta-eliminación publicadas
(ver Lindahl y col., 1972, Biochemistry 19:
3610-3618; Lindahl y col., 1972, Biochemistry
19: 3618-3623). Basándose es estos y otros informes
publicados, no se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza tuviera un efecto significativo sobre las velocidades de
despurinización o \beta-eliminación. Por tanto, el
aumento en la estabilidad del ADN que resulta de la eliminación de
los iones metálicos traza es mucho mayor de lo que se esperaba, y no
se puede explicar en relación con las constantes de velocidad
publicadas para la despurinización y
\beta-eliminación.
Además, nuestros datos indican que los agentes
quelantes específicos, tales como hexanofosfato de inositol,
tripolifosfato, ácidos succínico y málico, incrementan la
estabilidad del plásmido de ADN en almacenamiento, mientras que
otros agentes quelantes usados habitualmente, tales como EDTA,
desferal, ácido
etilendiamina-di(o-hidroxi-fenil)
acético (EDDHA) y ácido dietilendiaminapenta-acético
(DTPA) no producen una mejora significativa de la estabilidad. Estos
resultados sugieren también que cualquier agente quelante con
múltiples ligandos fosfato (por ejemplo, ácido polifosfórico)
mejorará la estabilidad del ADN. No queda claro a partir de la
literatura publicada, sin embargo, porqué el hexafosfato de inositol
estabiliza el ADN, pero el EDDHA, el desferal y el DTPA no lo hacen.
Puesto que la literatura publicada sugiere que estos cuatro
quelantes inhiben la producción de radicales hidroxilo catalizada
por hierro, se esperaba que estos cuatro reactivos proporcionaran
una estabilidad mejorada del ADN (quelando iones metálicos traza e
inhibiendo la producción de radicales libres), pero esto no se ha
observado. Más aún, la literatura informa que tanto el EDTA como el
ATP soportan la producción de radical hidroxilo catalizada por iones
metálicos, perno nosotros hemos observado que el tripolifosfato (la
fracción ligante de metales del ATP) mejora la estabilidad del ADN,
mientras que el EDTA no lo hace. Por tanto, los efectos protectores
de los quelantes de iones metálicos no parecen estar directamente
correlacionados con su capacidad para soportar la producción de
radicales hidroxilo. La identificación de los quelantes adecuados
para estabilizar formulaciones de ADN requerirá ensayos empíricos
como los que se describen en este trabajo.
Además de la eliminación y/o quelación de iones
metálicos traza, el uso de secuestrantes no reductores de radicales
libres es importante para estabilizar las formulaciones de ADN
durante el almacenamiento. Nuestros resultados indican que etanol,
metionina, glicerol y dimetil sulfóxido mejoran la estabilidad del
ADN, sugiriendo que su efecto protector se debe al secuestro de
radicales libres. Más aún, nuestros resultados indican que los
secuestrantes capaces de actuar como agentes reductores, tales como
el ácido ascórbico, aceleran en gran medida la degradación del ADN,
presumiblemente actuando como un agente reductor que mantiene los
iones metálicos traza en su estado reducido (más dañino). Nuestros
resultados también indican que varios secuestrantes que
estabilizaran el ADN (según las constantes de velocidad conocidas
con el radical hidroxilo) aceleran la degradación del ADN de forma
inesperada, o bien no proporcionan aumento en la estabilidad. Por
ejemplo, la pentoxifilina y el ácido
para-aminobenzoico son secuestrantes del radical
hidroxilo con constantes de velocidad elevadas para los radicales
hidroxilo (k = 1,1 x 10^{10} M^{-1} s^{-1}; ver Freitas y
Filipe, 1995, Biol. Trace Elem. Res. 47:
307-311; Hu y col., 1995. J. Nutr.
Biochem. 6: 504-508), aunque la pentoxifilina no
mejora la estabilidad y el ácido p-aminobenzoico en
realidad acelera la degradación del ADN. Debido a estos resultados,
la selección empírica de diferentes secuestrantes de radicales
libres ha sido el medio más efectivo para identificar los compuestos
útiles.
Para maximizar la estabilidad del ADN en una
formulación farmacéutica, el tipo de tampón, concentración de sal,
pH, exposición a la luz, así como el tipo de procedimiento de
esterilización usado para preparar los viales, son todos ellos
parámetros importantes que se deben controlar en la formulación para
optimizar todavía más la estabilidad. Además, la liofilización de la
vacuna de ADN con excipientes de formulación adecuados también puede
verse como una mejora de la estabilidad del ADN, presumiblemente por
la reducción del movimiento molecular debida a la deshidratación.
Sin embargo, nuestros datos sugieren que la formulación que
proporcionará la mayor estabilidad a la vacuna de ADN será la que
incluya una solución desmetalizada que contenga un tampón (fosfato o
bicarbonato) con un pH comprendido en el intervalo de
7-8, una sal (NaCl, KCl, o LiCl) en el intervalo de
100-200 mM, un quitante de iones metálicos
(succinato, malato, hexafosfato de inositol, tripolifosfato o ácido
polifosfórico), un secuestrante no reductor de radicales libres
(etanol, glicol, metionina o dimetil sulfóxido), y la mayor
concentración de ADN que sea correcta en un vial de vidrio estéril,
empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente purificado y
libre de nucleasas.
Las formulaciones y procedimientos de la
invención se ejemplifican con una vacuna de ADN para la gripe. Nada
en esta descripción debería tomarse como limitante de las
formulaciones y procedimientos de la vacuna de ADN específica.
La gripe es una enfermedad febril aguda causada
por la infección del tracto respiratorio con el virus de la gripe, A
o B. Los brotes de gripe tienen lugar en todo el mundo casi cada año
con epidemias o pandemias periódicas. La gripe puede ocasionar
síntomas sistémicos significativos, enfermedad severa (tal como una
neumonía viral) que requiere hospitalización, y complicaciones tales
como neumonía bacteriana secundaria. Se cree que las epidemias más
recientes en los Estados Unidos han dado lugar a un exceso >
10.000 (de hasta 40.000) muertes por año, y
5.000-10.000 muertes por año en años no epidémicos.
La mejor estrategia para la prevención de la morbilidad y mortalidad
asociada con la gripe es la vacunación. Las vacunas patentadas en la
actualidad se derivan de virus que se hacen crecer en huevos, a
continuación se inactivan, y se incluyen tres cepas de virus (dos
cepas A y una cepa B). Están disponibles tres tipos de vacunas: de
virus completo, de subviriones y de antígeno de superficie
purificada. Solo las dos últimas se usan en niños debido a la mayor
respuesta febril de la vacuna de virus completo. Los niños menores
de 9 años necesitan dos inmunizaciones, mientras que los adultos
requieren una única inyección. Sin embargo, se ha sugerido [ver
Medical Setter 32:89-90, 17 de Sept. de
1993] que "los pacientes que se vacunan al principio del otoño
deberían beneficiarse de una segunda dosis en invierno o a principio
de la primavera" debido a las observaciones que en algunos
pacientes ancianos, el título de anticuerpos tras la vacunación
puede declinar a niveles inferiores a los protectores en un periodo
de cuatro meses o menos. Estas vacunas se reformulan cada año,
prediciendo qué cepas víricas recientes circularán de forma clínica
y evaluando qué nuevas cepas virulentas se espera que predominen en
la siguiente estación de gripe. Se recomienda la revacunación
anual.
anual.
Entre las limitaciones de las vacunas patentadas
se incluyen las siguientes:
1) La variación antigénica, de manera particular
en las cepas A de la gripe, da como resultado virus que no se
neutraliza por los anticuerpos generados en una vacuna anterior (o
en una infección anterior). Las cepas nuevas surgen por mutaciones
puntuales (deriva antigénica) y por reorganización (cambio
antigénico) de los genes que codifican las glicoproteínas de la
superficie (hemaglutinina [HA] y neuraminidasa), mientras que las
proteínas internas se conservan en gran medida en las cepas
derivadas y cambiadas. La inmunización induce inmunidad
"homóloga" mediada por anticuerpos específicos de la cepa, no
inmunidad "heteróloga" común a un grupo basada en la inmunidad
mediada por células.
2) Incluso en las cepas predominantes circulantes
del virus de la gripe que no derivan o cambian de manera
significativa de un año para el siguiente, la inmunización debe
realizarse cada año porque el título de anticuerpos disminuye.
Aunque se informa que los anticuerpos inhibidores de la
hemoaglutinación (HI) y neutralizantes son algo persistentes durante
meses a años con una disminución gradual posterior, el Advisory
Committee on Immunization Practices cita el título de anticuerpos
decreciente en el año posterior a la vacunación como una razón para
la inmunización anual, incluso aunque no haya habido deriva o cambio
(los anticuerpos HI inhiben la capacidad del virus de la gripe para
aglutinar los glóbulos rojos de la sangre. Como los anticuerpos
neutralizantes, se dirigen de forma principal contra el antígeno HA.
Los ensayos de inhibición de la hemoaglutinación son más sencillos y
más baratos de realizar que los ensayos de inhibición, y por tanto,
se usan a menudo como un procedimiento para evaluar la capacidad de
los anticuerpos que aparecieron frente a una cepa de gripe para
reaccionar con una cepa diferente). Como se ha mencionado
anteriormente, la Medical Letter sugiere que ciertos
individuos más ancianos de alto riesgo deben vacunarse dos veces en
la misma estación debido a la corta vida del título de anticuerpos
protectores.
3) La eficacia de la vacuna está por debajo del
óptimo. El desarrollo de las vacunas de la estación siguiente se
basa en la predicción de las cepas circulantes que aparecen
(mediante muestreo de anticipación en Asia), lo que es inexacto y
puede dar lugar a un mal emparejamiento entre las cepas usadas para
la vacuna y las que realmente circulan en el campo. Más aún, tal
como sucedió en la estación de gripe de 1992-1993,
una cepa H3N2 nueva (A/Beijin/92) se volvió clínicamente evidente
durante la última fase de la estación de gripe. Esto ocasionó un
cambio en la composición de la vacuna de 1993-1994,
debida a un mal entrecruzamiento de la reactividad con A/Beijin/92
del anticuerpo indicado con la cepa H3N2 anterior (A/Beijin/89). Sin
embargo, debido al tiempo necesario para fabricar y formular la
vacuna patentada actual, la nueva cepa de vacuna no pudo
introducirse durante la estación de 1992-1993, a
pesar de la evidencia de la mala protección que ofrecía la vacuna
existente y el incremento en la virulencia de la nueva cepa H3N2
circulante.
Entre las características de una vacuna universal
ideal contra la gripe se incluyen las siguientes:
1) Generación de una protección de grupo común
(heteróloga)
2) Aumento en la amplitud de respuesta del
anticuerpo. Puesto que se cree que el CTL juega un papel en la
recuperación de la enfermedad, se esperaría que una vacuna basada
únicamente en una respuesta CTL disminuiría la duración de la
enfermedad (potencialmente desde el punto de volver la enfermedad
subclínica), pero no prevendría la enfermedad en su totalidad.
3) Incremento en la duración de las respuestas de
los anticuerpos. Puesto que uno de los muchos grupos en riesgo
elevado de morbilidad y mortalidad por infección por gripe (los
ancianos) es también el grupo en el que el título de anticuerpos
protectores declina demasiado rápidamente para que la inmunización
anual sea efectiva, una vacuna mejorada debería generar títulos de
anticuerpo que persistieran durante más tiempo.
La inoculación intramuscular de constructos de
polinucleótidos, es decir, plásmidos de ADN que codifican proteínas,
ha demostrado dar resultado en la generación in situ de
proteínas en las células musculares. Usando plásmidos de ADNc que
codifican proteínas virales se han generado tanto anticuerpos como
respuestas CTK, proporcionando protección homologa y heteróloga
frente a posteriores provocaciones, tanto con la protección homologa
como de cadena cruzada, respectivamente. Cada uno de estos tipos de
respuestas inmunes ofrece una ventaja potencial sobre las
estratégicas de vacunación existentes. El uso de PNV (vacunas de
polinucleótidos) para generar anticuerpos puede dar como resultado
un aumento en la duración de las respuestas de los anticuerpos, así
como la provisión de un antígeno que puede tener tanto la secuencia
exacta de la cepa de virus clínicamente circulante como las
modificaciones post-traslacionales adecuadas y
conformación de la proteína nativa (frente a una proteína
recombínate), La generación de respuestas CTL por este procedimiento
ofrece los beneficios de la protección por cepa cruzada sin el uso
de un vector vivo o virus atenuado potencialmente patógeno.
Por tanto, esta invención contempla cualquiera de
los procedimientos conocidos para introducir ácidos nucleicos en
tejidos vivos para inducir la expresión de proteínas. Esta invención
proporciona un procedimiento para introducir proteínas virales en la
ruta de procesado de antígeno para generar CTL específicos de un
virus. Así, se cumple mediante esta invención para el virus de la
gripe la necesidad de agentes terapéuticos específicos capaces de
despertar las respuestas inmunes profilácticas deseadas frente a
patógenos virales. De particular importancia en esta hipótesis
terapéutica es la capacidad de inducir respuestas inmunes de células
T que pueden evitar infecciones incluso de cepas de virus que sean
heterólogas respecto de la cepa de la que se ha obtenido el
antígeno. Por tanto, esta invención proporciona constructos de ADN
que codifican las proteínas virales del virus de la gripe humana
nucleoproteína (NP), hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NM), matriz
(M), no estructural (NS), polimerasa (PB1 y PB2 = polimerasas
básicas 1 y 2; PA = polimerasa acídica) o cualquiera de resto de los
genes de la gripe que codifican productos que generan CTL
específicos.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones
de productos farmacéuticos de ácido nucleico, de forma específica a
formulaciones de productos de vacunas de ácido nucleico y productos
para terapia génica de ácido nucleico. Las formulaciones de la
descripción estabilizan la conformación de los productos
farmacéuticos de ADN. Las vacunas, cuando se introducen directamente
en las células del músculo, inducen la producción de respuestas
inmunes que reconocen de forma específica el virus de la gripe
humana.
Durante su almacenamiento como entidad
farmacéutica, las vacunas de plásmido de ADN experimentan un cambio
fisicoquímico en el que el plásmido superenrollado se convierte a la
forma circular abierta y linear. Diferentes condiciones de
almacenamiento (pH bajo, temperatura elevada, baja fuerza iónica)
pueden acelerar este proceso. En esta invención, la eliminación y/o
quelación de iones metálicos traza (con ácidos málico o succínico, o
con quelantes que contienen múltiples ligandos fosfato) de la
solución de plásmido de ADN, de las formulaciones de los tampones, o
de los viales y tapones, estabilizan el plásmido de ADN de esta ruta
de degradación durante el almacenamiento. Además, se necesitan
secuestrantes de radicales libres no reductores para evitar al
plásmido de ADN daños procedentes de la producción de radicales
libres, que puede seguir teniendo lugar incluso en disoluciones
aparentemente desmetalizadas. Además, el tipo de tampón, pH,
concentración de sales, exposición a la luz, así como el tipo de
proceso de esterilización usado para preparar los viales, todos
deben controlarse en la formulación para optimizar la estabilidad de
la vacuna de ADN. La liofilización de la vacuna de ADN en presencia
de los excipientes de formulación adecuados puede llevarse a cabo
también para estabilizar el plásmido durante el almacenamiento.
A partir de la literatura científica, se
esperaría que la reacción de escisión de la cadena que da lugar a la
conversión del plásmido de ADN de superenrollado a circular abierto
a lineal tuviera lugar a través de dos mecanismos químicos
diferentes (ya que estas preparaciones de ADN muy purificado no
contienen nucleasas): (1) despurinización seguida de
\beta-eliminación y/o (2) oxidación con radicales
libres. Aunque se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza suprimiera el mecanismo de rotura de la cadena del ADN por
oxidación con radicales libres, nuestros resultados indican, de
forma sorprendente, que la eliminación o quelación de los iones
metálicos traza de la solución que contiene el ADN estabiliza el ADN
frente a ambos mecanismos de degradación, según se juzga por
comparación de nuestros datos de estabilidad con las velocidades de
despurinización y \beta-eliminación publicadas
(ver Lindahl y col., 1972, Biochemistry 19:
3610-3618; Lindahl y col., 1972, Biochemistry
19: 3618-3623). Basándose en estos y otros informes
publicados, no se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza tuviera un efecto significativo sobre las velocidades de
despurinización o \beta-eliminación. Por tanto, el
aumento en la estabilidad del ADN que resulta de la eliminación de
los iones metálicos traza es mucho mayor de lo que se esperaba, y no
se puede explicar en relación con las constantes de velocidad
publicadas para la despurinización y
\beta-eliminación.
Además, nuestros datos indican que los agentes
quelantes específicos, tales como hexanofosfato de inositol,
tripolifosfato, ácidos succínico y málico, incrementan la
estabilidad del plásmido de ADN en almacenamiento, mientras que
otros agentes quelantes usados habitualmente, tales como EDTA,
desferal, ácido
etilendiamina-di(o-hidroxi-fenil)
acético (EDDHA) y ácido dietilendiaminapenta-acético
(DTPA) no producen una mejora significativa de la estabilidad. Estos
resultados sugieren también que cualquier agente quelante con
múltiples ligandos fosfato (por ejemplo, ácido polifosfórico)
mejorará la estabilidad del ADN. No queda claro a partir de la
literatura publicada, sin embargo, porqué el hexafosfato de inositol
estabiliza el ADN, pero el EDDHA, el desferal y el DTPA no lo hacen.
Puesto que la literatura publicada sugiere que estos cuatro
quelantes inhiben la producción de radicales hidroxilo catalizada
por hierro, se esperaba que estos cuatro reactivos proporcionaran
una estabilidad mejorada del ADN (quelando iones metálicos traza e
inhibiendo la producción de radicales libres), pero esto no se ha
observado. Más aún, la literatura informa que tanto el EDTA como el
ATP soportan la producción de radical hidroxilo catalizada por iones
metálicos, perno nosotros hemos observado que el tripolifosfato (la
fracción ligante de metales del ATP) mejora la estabilidad del ADN,
mientras que el EDTA no lo hace. Por tanto, los efectos protectores
de los quelantes de iones metálicos no parecen estar directamente
correlacionados con su capacidad para soportar la producción de
radicales hidroxilo. La identificación de los quelantes adecuados
para estabilizar formulaciones de ADN requerirá ensayos empíricos
como los que se describen en este trabajo.
Además de la eliminación y/o quelación de iones
metálicos traza, el uso de secuestrantes no reductores de radicales
libres es importante para estabilizar las formulaciones de ADN
durante el almacenamiento. Nuestros resultados indican que etanol,
metionina, glicerol y dimetil sulfóxido mejoran la estabilidad del
ADN, sugiriendo que su efecto protector se debe al secuestro de
radicales libres. Más aún, nuestros resultados indican que los
secuestrantes capaces de actuar como agentes reductores, tales como
el ácido ascórbico, aceleran en gran medida la degradación del ADN,
presumiblemente actuando como un agente reductor que mantiene los
iones metálicos traza en su estado reducido (más dañino). Nuestros
resultados también indican que varios secuestrantes que
estabilizaran el ADN (basado en las constantes de velocidad
conocidas con el radical hidroxilo) aceleran la degradación del ADN
de forma inesperada, o bien no proporcionan aumento en la
estabilidad. Por ejemplo, la pentoxifilina y el ácido
para-aminobenzoico son secuestrantes del radical
hidroxilo con constantes de velocidad elevadas para los radicales
hidroxilo (k = 1,1 x 10^{10} M^{-1} s^{-1}; ver Freitas y
Filipe, 1995, Biol. Trace Elem. Res. 47:
307-311; Hu y col., 1995. J. Nutr.
Biochem. 6: 504-508), aunque la pentoxifilina no
mejora la estabilidad y el ácido p-aminobenzoico en
realidad acelera la degradación del ADN. Debido a estos resultados,
la selección empírica de diferentes secuestrantes de radicales
libres ha sido el medio más efectivo para identificar los compuestos
útiles.
Para maximizar la estabilidad del ADN en una
formulación farmacéutica, el tipo de tampón, concentración de sal,
pH, exposición a la luz, así como el tipo de procedimiento de
esterilización usado para preparar los viales, son todos ellos
parámetros importantes que se deben controlar en la formulación para
optimizar todavía más la estabilidad. Además, la liofilización de la
vacuna de ADN con excipientes de formulación adecuados también puede
verse como una mejora de la estabilidad del ADN, presumiblemente por
la reducción del movimiento molecular debida a la deshidratación.
Sin embargo, nuestros datos sugieren que la formulación que
proporcionará la mayor estabilidad a la vacuna de ADN será la que
incluya una solución desmetalizada que contenga un tampón (fosfato o
bicarbonato) con un pH comprendido en el intervalo de
7-8, una sal (NaCl, KCl, o LiCl) en el intervalo de
100-200 mM, un quelante de iones metálicos
(succinato, malato, hexafosfato de inositol, tripolifosfato o ácido
polifosfórico), un secuestrante no reductor de radicales libres
(etanol, glicol, metionina o dimetil sulfóxido), y la mayor
concentración de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril,
empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente purificado y
libre de nucleasas.
En esta memoria se presentan datos que
ejemplifican varias formulaciones para vacuna adicionales. De forma
más específica, la presente invención se refiere a formulaciones de
vacunas de ADN que comprenden una solución desmetalizada que
contiene un tampón fisiológicamente aceptable con un pH comprendido
entre al menos más de 8,0 hasta al menos 9,5, una sal (incluyendo
pero sin limitarse a NaCl, KCl ó LiCl) en el intervalo de hasta 300
mM, y el quelante de iones metálicos EDTA (en el intervalo de hasta
5 mM), en combinación con el secuestrante de radicales libres etanol
(en el intervalo de hasta aproximadamente un 3%) y la mayor
concentración de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril,
empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente purificado y
libre de nucleasas.
En un aspecto específico de la presente
invención, las formulaciones de vacuna de ADN comprenden una
combinación de EDTA y etanol, NaCl en una concentración de entre
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM, EDTA en el
intervalo de entre 1 \muM hasta aproximadamente 1 mM, etanol
presente en el intervalo de hasta aproximadamente un 2%, todo con la
mayor concentración de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio
estéril, empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente
purificado y libre de nucleasas.
En otra forma de realización de las formulaciones
de vacuna de ADN, comprenden una combinación de EDTA y etanol, NaCl
está presente en entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente
200 mM, EDTA está presente entre 1 \muM hasta aproximadamente 750
\muM, etanol está presente entre aproximadamente 0,5% hasta
aproximadamente un 2,5%, todo con la mayor concentración de ADN que
sea apropiada en un vial de vidrio estéril, empaquetado para
proteger de la luz el ADN altamente purificado y libre de nucleasas,
y en un tampón fisiológicamente aceptable que de forma preferible es
Tris-HCl a un pH comprendido entre aproximadamente
8,0 y aproximadamente 9,0, y glicina entre aproximadamente pH 9,0 a
aproximadamente pH 9,5. Deberá entenderse que se pueden utilizar en
las diferentes formulaciones de vacuna de ADN de la presente
invención otros tampones con capacidad tampón comprendida en
diferentes intervalos de pH, tales como de pH 8,0 a pH 9,5.
En un aspecto especialmente preferido de la
presente invención, las formulaciones de vacunas de ADN comprenden
una combinación de EDTA y etanol, con NaCl presente a una
concentración de entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente
200 mM, EDTA está presente a aproximadamente 500 \muM, etanol está
presente en aproximadamente un 1,0%, todo con la mayor concentración
de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril, empaquetado
para proteger de la luz el ADN altamente purificado y libre de
nucleasas, y en un tampón fisiológicamente aceptable que de forma
preferible es Tris-HCl a un pH comprendido entre
aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0.
La Figura 1A, Figura 1B, Figura 1C, y la Figura
1D muestran el efecto del tipo de contenedor sobre el contenido
superenrollado de una vacuna de ADN para gripe HA (Georgia/93)
durante el almacenamiento. La solución de plásmido de ADN se preparó
a 100 mcg/ml de ADN en suero salino. El contenido superenrollado de
plásmido se determinó por electroforesis en gel de agarosa. Panel A
- vidrio; Panel B - vidrio siliconado; Panel C - plástico
autoclavado; Panel D - plástico gamma.
La Figura 2 el efecto de la concentración de
plásmido de ADN sobre el contenido superenrollado de una vacuna de
ADN para gripe HA (Georgia/93) durante el almacenamiento a 37ºC. La
solución de plásmido de ADN se preparó a 20-1.800
mcg/ml. El contenido superenrollado de plásmido se determinó por
electroforesis en gel de agarosa.
La Figura 3 muestra la curva de fusión en UV del
plásmido de ADN almacenado en tampón fosfato 10 mM (pH 6,0) a lo
largo del intervalo de concentraciones de NaCl 0-200
mM. Las muestras contenían 100 mcg/ml de plásmido de ADN con las
siguientes concentraciones de NaCl; (a) 0 mM, (b) 5 mM, (c) 20 mM,
(d) 50 mM, (e) 100 mM, (f) 200 mM.
La Figura 4 muestra la estabilidad del plásmido
de ADN en presencia de concentraciones crecientes de NaCl. Las
muestras se incubaron a 60ºC durante 48 horas, a continuación se
analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. A tiempo cero,
las muestras contenían ADN superenrollado al 90%.
Las Figura 5A, Figura 5B y Figura 5C muestran la
estabilidad del plásmido de ADN en presencia de cationes divalentes
en TE (Panel A), PBS (Panel B) y suero salino (Panel C). Las
muestras se calentaron a 60ºC durante 48 horas a una concentración
de 100 mcg/ml, a continuación se analizó su degradación mediante
electroforesis en gel de agarosa. A tiempo cero, las muestras
contenían ADN superenrollado al 90%.
La Figura 6 muestra la curva de fusión en UV a lo
largo de un intervalo de pH 4,5-10. Las muestras
contenían 20 mcg/ml de plásmido en los siguientes tampones de pH:
(a) citrato pH 4,5, (b) fosfato pH 6,0, (c) fosfato pH 6,5, (d)
fosfato pH 7,0, (e) fosfato pH 7,5, (f) fosfato pH 8,0, (g) borato
pH 10.
La Figura 7A muestra la estabilidad
conformacional del plásmido de ADN en PBS y TE
(tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM) tamponado a lo largo del
intervalo de pH 6,0 a 8,5. Las muestras se incubaron a 100 mcg/ml
durante 48 horas a 60ºC, a continuación se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa. A tiempo cero, las muestras
contenían ADN superenrollado al 90%.
La Figura 7B muestra el efecto del tipo de tampón
y pH de la solución sobre el contenido superenrollado (estabilidad
del ADN) de la vacuna de ADN para gripe durante el almacenamiento a
37ºC. Las soluciones de plásmido de ADN se prepararon a 20 mcg/ml.
El ADN se formuló en suero salina solo, o en suero salino con un
tampón Tris, Hepes, fosfato o bicarbonato de sodio. El pH del tampón
se midió a tiempo cero (temperatura ambiente) y a 3 meses (37ºC). El
contenido de plásmido superenrollado se determinó por electroforesis
en gel de agarosa.
La Figura 8A y la Figura 8B muestran el efecto de
la formulación en PBS frente a en solución salina (0,9% p/v NaCl)
del contenido superenrollado en la vacuna de ADN (HA - Georgia/93)
para gripe durante el almacenamiento a 25ºC (Panel B) y 37ºC (Panel
A). Las soluciones de plásmido de ADN se prepararon a 2 mcg/ml. El
contenido superenrollado de plásmido se determinó por electroforesis
en gel de agarosa.
La Figura 9 muestra una respuesta inmune inducida
en ratones tal como se mide mediante título de HI para una inyección
única de vacuna de ADN para gripe HA (Georgia/93) formulada en PBS
frente a la formulada en suero salino. Las soluciones de plásmido de
ADN se prepararon a diferentes dosis, y se inyectaron 200
microlitros de vacuna en cada ratón (diez ratones por dosis por
formulación).
La Figura 10 muestra el efecto de la exposición a
la luz del contenido superenrollado de la vacuna de ADN para gripe
durante el almacenamiento a 25ºC. Las soluciones de plásmido de ADN
se prepararon a 100 mcg/ml de ADN en suero salino. El contenido
superenrollado de plásmido se determinó por electroforesis en gel de
agarosa.
La Figura 11 muestra el efecto de los
secuestrantes de radicales libres sobre el contenido superenrollado
de la vacuna de ADN para gripe durante el almacenamiento a 37ºC. Las
soluciones de plásmido de ADN se prepararon a 100 mcg/ml de ADN en
suero salino. El contenido superenrollado de plásmido se determinó
por electroforesis en gel de agarosa.
La Figura 12 muestra el efecto de la
liofilización sobre el contenido superenrollado de la vacuna de ADN
para gripe durante el almacenamiento a 37ºC. Las soluciones de
plásmido de ADN se prepararon a 20 mcg/ml de ADN tanto en tampón
fosfato como en suero salino tamponado con fosfato (pH 7) que
contiene los azúcares indicados. Aproximadamente 0,7 ml de la
solución formulada de ADN se colocaron en viales de vidrio de 3 ml y
se liofilizaron. Las formulaciones de ADN criodesecadas en el Día 0
no mostraron cambios en el contenido de plásmido superenrollado,
comparado con los controles líquidos (sin liofilización); El
contenido superenrollado de plásmido se determinó por electroforesis
en gel de agarosa. A - PBS (control líquido; sin liofilización); B -
PBS que contiene manitol al 5%, liofilizado; C - tampón fosfato que
contiene manitol al 5%, liofilizado; D - PBS que contiene lactosa al
5%, liofilizado; F - tampón fosfato que contiene manitol al 4% y
lactosa al 1%, liofilizado; G - tampón fosfato que contiene manitol
al 4% y sacarosa al 1%, liofilizado. Las formulaciones se
almacenaron durante 1 mes a
37ºC.
37ºC.
La Figura 13 muestra el efecto del pH sobre la
estabilidad del ADN (en forma de porcentaje del plásmido de ADN
superenrollado inicial remanente) después de dos semanas a 50ºC en
Bis-Tris-propano 20 mM, NaCl 150 mM.
El control es ADN en PBS a pH 7,1.
La Figura 14 muestra el efecto del tipo de tampón
y pH sobre la estabilidad del ADN a 50ºC a una concentración de ADN
de 20 mcg/ml. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 15 muestra el efecto de la
desmetalización sobre la estabilidad del ADN a 50ºC y pH 7,2 en 2
mcg/ml de ADN. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 16 muestra el efecto de la
desmetalización sobre la estabilidad del ADN a 50ºC y pH 8,0 en 2
mcg/ml de ADN. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 17 muestra el efecto de la
desmetalización sobre la estabilidad del ADN en formulaciones que
contienen succinato y etanol. La estabilidad del ADN se mide en
forma de % del ADN superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 18 muestra el efecto de la
desmetalización sobre la estabilidad del ADN en formulaciones que
contienen bicarbonato y borato. La estabilidad del ADN se mide en
forma de % del ADN superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 19 muestra el efecto de la
desmetalización sobre la estabilidad del ADN en formulaciones en PBS
y bicarbonato a 30ºC. La estabilidad del ADN se mide en forma de %
del ADN superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 20 muestra el efecto del EDTA y el
etanol sobre la estabilidad del ADN a 50ºC en PBS a pH 7,2. La
estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN superenrollado
inicial (SC) que queda.
La Figura 21 muestra el efecto del EDTA y el
etanol sobre la estabilidad del ADN a 50ºC en PBS a pH 8,0. La
estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN superenrollado
inicial (SC) que queda.
La Figura 22 muestra el efecto del hierro sobre
la estabilidad del ADN en formulaciones que contienen EDTA / etanol
a 50ºC. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 23 muestra el efecto de los quelantes
del hierro metálico sobre la estabilidad del ADN en PBS a pH 8,0. La
estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN superenrollado
inicial (SC) que queda.
La Figura 24 muestra el efecto de los quelantes
de iones metálicos sobre la estabilidad en PBS a pH 8,0 en presencia
de etanol. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 25 muestra el efecto de la
concentración de EDTA sobre la estabilidad del ADN en PBS en etanol
al 1%. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 26 muestra la estabilidad de
formulaciones de ADN liofilizadas (formulaciones
#1-6) y líquidas (formulaciones 7-9)
tras 4 meses a 50ºC. La formulación #1 es sacarosa al 5%, NaPO_{4}
5 mM, la formulación #2 es sacarosa al 5%, NaPO_{4} 5 mM,
desmetalizada; la formulación #3 es sacarosa al 5%, NaPO_{4} 5 mM
NaCl 150 nM; la formulación #4 es sacarosa al 5%, NaPO_{4} 5 mM
NaCl 150 nM, desmetalizada; la formulación #5 es manosa al 4%,
sacarosa al 1%, NaPO_{4} 5 mM, desmetalizada; la formulación #6 es
manosa al 4%, sacarosa al 1%, NaPO_{4} 5 mM, desmetalizada; la
formulación #7 es NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM y
etanol al 2% a pH o,0; la formulación #8 es Tris 20 mM, NaCl 150 mM,
succinato 10mM, etanol al 2% a pH 9,0. La estabilidad del ADN se
mide en forma de % del ADN superenrollado inicial (SC) que
queda.
La Figura 27 muestra el efecto de la luz sobre la
estabilidad del ADN en formulaciones que contienen hierro y EDTA. La
estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN superenrollado
inicial (SC) que queda.
La Figura 28 muestra el efecto de la luz sobre la
estabilidad del ADN en formulaciones que contienen hierro, EDTA y
etanol. La estabilidad del ADN se mide en forma de % del ADN
superenrollado inicial (SC) que queda.
La Figura 29 muestra un gráfico de Arrhenius de
la despurinación en PBS, etanol al 1% y EDTA 0,5 mM a pH 7,4.
La Figura 30 muestra un gráfico de Arrhenius de
la \beta-eliminación en PBS, etanol al 1% y EDTA
0,5 mM a pH 7,4.
La Figura 31 muestra una predicción de la
estabilidad del ADN a 50ºC usando valores publicados y medidos de
k_{1} y k_{2}.
La Figura 32 muestra una predicción de la
estabilidad del ADN a 30ºC basada en valores medidos de k_{1} y
k_{2} a pH 7,4.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones
de productos farmacéuticos de ácido nucleico, de forma específica a
formulaciones de productos de vacunas de ácido nucleico y productos
para terapia génica de ácido nucleico. Las formulaciones de la
descripción estabilizan la conformación de los productos
farmacéuticos de ADN. Las vacunas, cuando se introducen directamente
en las células del músculo, inducen la producción de respuestas
inmunes que reconocen de forma específica el virus de la gripe
humana.
Durante su almacenamiento como entidad
farmacéutica, las vacunas de plásmido de ADN experimentan un cambio
fisicoquímico en el que el plásmido superenrollado se convierte a la
forma circular abierta y linear. Diferentes condiciones de
almacenamiento (pH bajo, temperatura elevada, baja fuerza iónica)
pueden acelerar este proceso. En esta invención, la eliminación y/o
quelación de iones metálicos traza (con ácidos málico o succínico, o
con quelantes que contienen múltiples ligandos fosfato) de la
solución de ADN de plásmido, de los tampones de las formulaciones, o
de los viales y tapones, estabiliza el plásmido de ADN de esta ruta
de degradación durante el almacenamiento. Además, se necesitan
secuestrantes de radicales libres no reductores para evitar al
plásmido de ADN daños procedentes de la producción de radicales
libres, que puede seguir teniendo lugar incluso en disoluciones
aparentemente desmetalizadas. Además, el tipo de tampón, pH,
concentración de sales, exposición a la luz, así como el tipo de
proceso de esterilización usado para preparar los viales, todos
deben controlarse en la formulación para optimizar la estabilidad de
la vacuna de ADN. La liofilización de la vacuna de ADN en presencia
de los excipientes de formulación adecuados puede llevarse a cabo
también para estabilizar el plásmido durante el almacenamiento.
A partir de la literatura científica, se
esperaría que la reacción de escisión de la cadena que da lugar a la
conversión del plásmido de ADN de superenrollado a circular abierto
a lineal tuviera lugar a través de dos mecanismos químicos
diferentes (ya que estas preparaciones de ADN muy purificado no
contienen nucleasas): (1) despurinización seguida de
\beta-eliminación y/o (2) oxidación con radicales
libres. Aunque se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza suprimiera el mecanismo de rotura de la cadena del ADN por
oxidación con radicales libres, nuestros resultados indican, de
forma sorprendente, que la eliminación o quelación de los iones
metálicos traza de la solución que contiene el ADN estabiliza el ADN
frente a ambos mecanismos de degradación, según se juzga por
comparación de nuestros datos de estabilidad con las velocidades de
despurinización y \beta-eliminación publicadas
(ver Lindahl y col., 1972, Biochemistry 19:
3610-3618; Lindahl y col., 1972, Biochemistry
19: 3618-3623). Basándose es estos y otros informes
publicados, no se esperaría que la eliminación de iones metálicos
traza tuviera un efecto significativo sobre las velocidades de
despurinización o \beta-eliminación. Por tanto, el
aumento en la estabilidad del ADN que resulta de la eliminación de
los iones metálicos traza es mucho mayor de lo que se esperaba, y no
se puede explicar en relación con las constantes de velocidad
publicadas para la despurinización y
\beta-eliminación.
Además, nuestros datos indican que los agentes
quelantes específicos, tales como hexanofosfato de inositol,
tripolifosfato, ácidos succínico y málico, incrementan la
estabilidad del plásmido de ADN en almacenamiento, mientras que
otros agentes quelantes usados habitualmente, tales como EDTA,
desferal, ácido
etilendiamina-di(o-hidroxi-fenil)
acético (EDDHA) y ácido dietilendiaminapenta-acético
(DTPA) no producen una mejora significativa de la estabilidad. Estos
resultados sugieren también que cualquier agente quelante con
múltiples ligandos fosfato (por ejemplo, ácido polifosfórico)
mejorará la estabilidad del ADN. No queda claro a partir de la
literatura publicada, sin embargo, porqué el hexafosfato de inositol
estabiliza el ADN, pero el EDDHA, el desferal y el DTPA no lo hacen.
Puesto que la literatura publicada sugiere que estos cuatro
quelantes inhiben la producción de radicales hidroxilo catalizada
por hierro, se esperaba que estos cuatro reactivos proporcionaran
una estabilidad mejorada del ADN (quelando iones metálicos traza e
inhibiendo la producción de radicales libres), pero esto no se ha
observado. Más aún, la literatura informa que tanto el EDTA como el
ATP soportan la producción de radical hidroxilo catalizada por iones
metálicos, perno nosotros hemos observado que el tripolifosfato (la
fracción ligante de metales del ATP) mejora la estabilidad del ADN,
mientras que el EDTA no lo hace. Por tanto, los efectos protectores
de los quelantes de iones metálicos no parecen estar directamente
correlacionados con su capacidad para soportar la producción de
radicales hidroxilo. La identificación de los quelantes adecuados
para estabilizar formulaciones de ADN requerirá ensayos empíricos
como los que se describen en este trabajo.
Además de la eliminación y/o quelación de iones
metálicos traza, el uso de secuestrantes de radicales libres no
reductores es importante para estabilizar las formulaciones de ADN
durante el almacenamiento. Nuestros resultados indican que etanol,
metionina, glicerol y dimetil sulfóxido mejoran la estabilidad del
ADN, sugiriendo que su efecto protector se debe al secuestro de
radicales libres. Más aún, nuestros resultados indican que los
secuestrantes capaces de actuar como agentes reductores, tales como
el ácido ascórbico, aceleran en gran medida la degradación del ADN,
presumiblemente actuando como un agente reductor que mantiene los
iones metálicos traza en su estado reducido (más dañino). Nuestros
resultados también indican que varios secuestrantes que
estabilizarían el ADN (basado en las constantes de velocidad
conocidas con el radical hidroxilo) aceleran la degradación del ADN
de forma inesperada, o bien no proporcionan aumento en la
estabilidad. Por ejemplo, la pentoxifilina y el ácido
para-aminobenzoico son secuestrantes del radical
hidroxilo con constantes de velocidad elevadas para los radicales
hidroxilo (k = 1,1 x 10^{10} M^{-1} s^{-1}; ver Freitas y
Filipe, 1995, Biol. Trace Elem. Res. 47:
307-311; Hu y col., 1995. J. Nutr.
Biochem. 6: 504-508), aunque la pentoxifilina no
mejora la estabilidad y el ácido p-aminobenzoico en
realidad acelera la degradación del ADN. Debido a estos resultados,
la selección empírica de diferentes secuestrantes de radicales
libres ha sido el medio más efectivo para identificar los compuestos
útiles.
Para maximizar la estabilidad del ADN en una
formulación farmacéutica, el tipo de tampón, concentración de sal,
pH, exposición a la luz, así como el tipo de procedimiento de
esterilización usado para preparar los viales, son todos ellos
parámetros importantes que se deben controlar en la formulación para
optimizar todavía más la estabilidad. Además. La liofilización de la
vacuna de ADN con excipientes de formulación adecuados también puede
verse como una mejora de la estabilidad del ADN, presumiblemente por
la reducción del movimiento molecular debida a la deshidratación.
Sin embargo, nuestros datos sugieren que la formulación que
proporcionará la mayor estabilidad a la vacuna de ADN será la que
incluya una solución desmetalizada que contenga un tampón (fosfato o
bicarbonato) con un pH comprendido en el intervalo de
7-8, una sal (NaCl, KCl, o LiCl) en el intervalo de
100-200 mM, un quitante de iones metálicos
(succinato, malato, hexafosfato de inositol, tripolifosfato o ácido
polifosfórico), un secuestrante no reductor de radicales libres
(etanol, glicol, metionina o dimetil sulfóxido), y la mayor
concentración de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril,
empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente purificado y
libre de nucleasas.
Los constructos de ADN que codifican las
proteínas virales de la gripe despiertan respuestas inmunes
protectoras en los animales. Las respuestas inmunes en los animales
incluyen la generación de anticuerpos y CLT en ratones, generación
de anticuerpos en hurones y primates, y protección de las
provocaciones virales en ratones y hurones con cepas de gripe
homólogas, derivadas y cambiadas. Quizás, el resultado más relevante
de la inmunización con ADN que codifica proteínas virales es la
capacidad de de conferir protección frente a distintos subtipos de
virus. Esto sugiere que añadir a una vacuna un componente que
despierte CTL debería servir para mitigar el impacto de variantes
nuevas que aparecen en mitad de la estación, o que no se habían
previsto cuando las cepas de vacuna se eligen cada año para el año
siguiente. De forma importante, la inmunización con vectores ADNc
que codifican un gen HA, NP y MI fue capaz de proteger de manera más
efectiva frente a una cepa derivada de virus en hurones que la
vacuna patentada. Esto proporciona una justificación para el uso de
constructos que codifican genes internos en la IDV (vacuna de ADN de
la gripe).
En una forma de realización, el producto vacuna
consistirá en plásmidos de ADN distintos que codifican, por ejemplo,
HA procedente de 3 cepas clínicas principales que representan los
virus A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) y B (B/Panamá/90),
así como constructos de ADN que codifican las proteínas internas
conservadas NP y M1 (matriz) tanto de las cepa A (Beijing/89; H3N2)
como de la B, con el fin de proporcionar protección de grupo común
frente a antígenos derivados y cambiados. El ADN de HA funcionará
generando la HA, y dando como resultado anticuerpos neutralizantes
frente a HA. Estos serán específicos del tipo, con cierto incremento
en la amplitud de la protección frente a una cepa derivada, en
comparación con la vacuna actualmente patentada, basada en proteína.
Los constructos NP y M1 darán como resultado la generación de CTL
que proporcionarán protección de cepa cruzada con cargas virales
potencialmente inferiores y con aceleración de la recuperación de la
enfermedad. La persistencia esperada de los constructos de ADN (en
una forma episomal, no replicante y no integrada en las células del
músculo) se espera que proporcione una mayor duración de la
protección, en comparación con la vacuna actual.
Las ventajas previstas sobre las actuales vacunas
patentadas incluyen: mayor amplitud de la protección debido a las
respuestas CTL \pm incremento en la amplitud del anticuerpo, y
mayor duración de la protección. La hipótesis IDV evita la necesidad
de fabricar, seleccionar y propagar reassortants como se lleva a
cabo para las vacunas actuales patentadas, ya que se puede fabricar
un nuevo constructo de ADN de manera más directa a partir de un
aislado clínico de campo. Respuesta de linfocitos.
La inyección intramuscular (i.m.) de un vector de
expresión de ADN que codifica una proteína interna conservada de
gripe A dio como resultado la generación de una inmunidad protectora
significativa frente a posteriores provocaciones virales. En
particular, se produjeron anticuerpos NP-específicos
y CTL primarios. La inmunización con ADN de NP dio como resultado
menores títulos de virus en los pulmones, inhibición de la pérdida
de peso, e incremento en la supervivencia, en comparación con los
controles. La respuesta inmune protectora no fue mediada por los
anticuerpos NP-específicos, tal como se demuestra
por la falta de efecto de los anticuerpos NP en solitario (ver el
ejemplo 4) en el combate de una infección por virus, y por tanto
posiblemente fue debida a la inmunidad celular
NP-específica. Más aún, se generaron niveles
significativos de CTL primarios dirigidos contra NP. La protección
fue contra una cepa virulenta de gripe A que era heteróloga de la
cepa a partir de la cual se había clonado el ADN. De forma
adicional, la cepa provocadora apareció más de tres décadas después
de la cepa A/PR/8/34, indicando que las respuestas inmunes dirigidas
contra proteínas conservadas pueden ser efectivas a pesar de la
deriva y cambio antigénicos de las proteínas variables de la
carcasa. Puesto que cada uno de los productos de los genes del virus
de la gripe presenta cierto grado de conservación, y puesto que
pueden generarse CTL en respuesta a la expresión intracelular y
procesado MHC, es predecible que otros genes del virus de la gripe
puedan dar lugar a respuestas análogas a las que se consiguen con
NP. Los procedimientos para identificar epítopos inmunogénicos son
ahora bien conocidos en la técnica [ver, por ejemplo, Shirai y col.,
1992, J. Immunol 148:1457-1667; Choppin et
al., 1991, J. Immunol 147:575-583;
Calin-Laurens, y col., Caccine
11:974-978]. Así, muchos de estos genes han sido
clonados, como se demuestra por los añadidos clonados y secuenciados
en el vector de expresión (ver más adelante), de forma que estos
constructos son agentes profilácticos en forma disponible.
Las técnicas convencionales de biología molecular
para preparar y purificar constructos de ADN permiten la preparación
de productos terapéuticos de ADN en esta invención. Aunque las
técnicas convencionales de biología molecular son por tanto
suficientes para la producción de los productos de esta invención,
los constructos específicos descritos en el presente documento
proporcionan nuevos productos terapéuticos que, de forma
sorprendente, proporcionan protección de cepa cruzada, un resultado
que hasta el momento no se podía obtener con las vacunas de virus
completos inactivados o subunidades de proteína.
La cantidad de ADN que se puede expresar a
introducir en una vacuna receptora dependerá de la fuerza de los
promotores de trascripción y traslación que se usen en el constructo
de ADN, y de la inmunogenidad del producto del gen expresado. En
general, se administra directamente en el tejido muscular una dosis
inmunológica o profilácticamente efectiva de aproximadamente 1
\mug a 1 mg, y de forma preferible de aproximadamente 10 \mug a
300 \mug. También se contemplan la inyección subcutánea,
introducción intradérmica, liberación intravenosa o inhalación. Se
contempla también el suministro de vacunaciones de refuerzo.
El ADN puede estar desnudo, esto es, no asociado
con ninguna proteína, coadyuvante u otros agentes que tengan
influencia sobre el sistema inmunológico de los receptores. En este
caso, es deseable que el ADN esté en forma de una solución
fisiológicamente aceptable, tal como, pero sin limitarse a solución
salina estéril o tampón salino estéril. De manera alternativa, el
ADN puede estar asociado con liposomas, tal como liposomas de
lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, tal como una
mezcla ADN - liposoma (ver, por ejemplo, el Documento WO93/24640), o
bien el ADN puede estar asociado con un coadyuvante conocido en la
técnica para reforzar las respuestas inmunes, tal como una proteína
u otro vehículo. Pueden usarse también de forma ventajosa agentes
que ayudan a la captación celular de ADN, tales como pero sin
limitarse a, iones calcio, proteínas virales y otros agentes que
facilitan la transfección y como vehículos farmacéuticamente
aceptables. Tal como se usa en el presente documento, el término gen
hace referencia a un segmento de ácido nucleico que codifica un
polipéptido discreto. El término producto farmacéutico y vacuna se
usan de forma intercambiable para indicar composiciones útiles para
inducir respuestas inmunes. Los términos constructo y plásmido se
usan de forma intercambiable. Se usa el término vector para indicar
un ADN en el que se clonan genes para uso de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención.
En otra forma de realización de esta invención,
la vacuna de ADN codifica productos génicos de nucleoproteínas,
hemaglutinina, matriz, no estructural o polimerasa del virus de la
gripe humana. Los ejemplos específicos de esta forma de realización
se proporcionan más adelante, en el que los genes del virus de la
gripe humana codifican la nucleoproteína, polimerasa básica 1,
proteína no estructural 1, hemaglutinina, matriz 1, polimerasa
básica 2 del aislado A/PR/8/34 del virus de la gripe humana, la
nucleoproteína del aislado A/Beijing/353/89 del virus de la gripe
humana, el gen de la hemaglutinina del aislado A/Texas/36/91 del
virus de la gripe humana, o el gen de la hemaglutinina del aislado
B/Panamá/46/90 del virus de la gripe humana.
En esta memoria se presentan datos que
ejemplifican varias formulaciones para vacuna adicionales. De forma
más específica, la presente invención se refiere a formulaciones de
vacuna de ADN que comprenden una solución desmetalizada que contiene
un tampón fisiológicamente aceptable con un pH comprendido entre al
menos más de 8,0 hasta al menos 9,5, una sal (incluyendo pero sin
limitarse a NaCl, KCl o LiCl) en el intervalo de hasta 300 mM, y el
quelante de iones metálicos EDTA (en el intervalo de hasta 5 mM), en
combinación con el secuestrante de radicales libres etanol (en el
intervalo de hasta aproximadamente un 3%) y la mayor concentración
de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril, empaquetado
para proteger de la luz el ADN altamente purificado y libre de
nucleasas, y en un tampón fisiológicamente aceptable.
En un aspecto específico de la presente
invención, las formulaciones de vacunas de ADN comprenden una
combinación de EDTA y etanol, NaCl en una concentración de entre
aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM, EDTA en el
intervalo de entre 1 \muM hasta aproximadamente 1 mM, etanol está
presente en el intervalo de hasta aproximadamente un 2%, todo con la
mayor concentración de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio
estéril, empaquetado para proteger de la luz el ADN altamente
purificado y libre de nucleasas y en un tampón fisiológicamente
aceptable.
En otra forma de realización de las formulaciones
de vacunas de ADN, comprenden una combinación de EDTA y etanol, NaCl
está presente entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200
mM, EDTA está presente entre 1 \muM hasta aproximadamente 750
\muM, etanol está presente en entre aproximadamente 0,5% hasta
aproximadamente un 2,5%, todo con la mayor concentración de ADN que
sea apropiada en un vial de vidrio estéril, empaquetado para
proteger de la luz el ADN altamente purificado y libre de nucleasas,
y en un tampón fisiológicamente aceptable que de forma preferible es
Tris-HCl a un pH comprendido entre aproximadamente
8,0 y aproximadamente 9,0, y glicina en entre aproximadamente pH 9,0
a aproximadamente pH 9,5. Deberá entenderse que se pueden utilizar
en las diferentes formulaciones para vacuna de ADN de la presente
invención otros tampones con una capacidad tampón en diferentes
intervalos de pH, tales como de pH 8,0 a pH 9,5.
En un aspecto especialmente preferido de la
presente invención, las formulaciones de vacunas de ADN comprenden
una combinación de EDTA y etanol, con NaCl presente a una
concentración de entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente
200 mM, EDTA está presente a aproximadamente 500 \muM, etanol está
presente en aproximadamente un 1,0%, todo con la mayor concentración
de ADN que sea apropiada en un vial de vidrio estéril, empaquetado
para proteger de la luz el ADN altamente purificado y libre de
nucleasas, y en un tampón fisiológicamente aceptable que de forma
preferible es Tris-HCl a un pH comprendido entre
aproximadamente 8,0 y aproximadamente 9,0.
Se presentan datos que demuestran que el pH de la
formulación afecta a la estabilidad del ADN, y que el pH óptimo es
\geq 8,5. La Figura 14 indica que la mayor formulación ensayada
(pH 9,0) que proporciona la mayor estabilidad del ADN es también la
que usa el pH más elevado (pH 9,0). El efecto del tipo de tampón
sobre la estabilidad del ADN se estudió también, y los datos
correspondientes se describen en el presente documento. De forma
breve, el mayor efecto del tampón sobre la estabilidad del ADN se ve
cuando se comparan la glicina y el bis-tris propano.
El tampón de glicina a pH 9 fue significativamente superior a la
formulación de bis-tris-propano para
el mismo pH. Por el contrario, los tampones Tris, Bicina y tricina a
pH 8,2 proporcionan una estabilidad del ADN casi idéntica a las 12
semanas. Los datos que correlacionan el tamponado y la estabilidad
del ADN sugieren que el control de la oxidación de los radicales
libres del ADN da como resultado una estabilidad del ADN global que
se controla a través del pH de la
formulación.
formulación.
El efecto de la luz sobre la estabilidad del ADN
se describe en el presente documento, y se demuestra que el efecto
perjudicial de la luz puede superarse en su mayor parte por la
adición de EDTA y etanol a la formulación. La adición de estos
componentes a la formulación estabiliza el ADN en muestras
almacenadas tanto a la luz como en la oscuridad. Por tanto, las
formulaciones de vacuna de ADN que contienen EDTA y etanol son
muchos menos sensibles a los efectos perjudiciales de la luz y de
los iones metálicos traza que las formulaciones que carecen de ambos
estabilizantes.
Se describen también en esta memoria diferentes
datos que ensayan el efecto de desmetalizar tampones antes de la
generación de formulaciones de vacuna de ADN. Se describe en el
presente documento que la desmetalización mejora la estabilidad del
ADN ligeramente en las formulaciones que contienen glicerol, pero no
tiene efecto sobre la estabilidad del ADN en una formulación con
etanol. Estos datos demuestran que se puede conseguir el mismo grado
de estabilidad del ADN tanto controlando la oxidación de radicales
libres con succinato y etanol, como eliminando los iones metálicos
traza por desmetalización. También se presentan datos que demuestran
que la mejora en la estabilidad del ADN por desmetalización es
efectiva en un amplio intervalo de temperatura y tiempo de
almacenamiento.
Los experimentos acerca de la estabilidad del ADN
se realizaron también para demostrar que el etanol es un
secuestrante efectivo de radicales libres en presencia de EDTA. La
combinación de etanol y EDTA proporciona un buen aumento en la
estabilidad del ADN (a pH 7,2) en hasta 4 semanas, pero únicamente
un pequeño aumento de la estabilidad en la semana 8. Estos
resultados sugieren que el etanol es un secuestrante de radicales
libres más efectivo en presencia de EDTA que en ausencia de éste.
Más aún, los resultados sugieren que el EDTA en solitario disminuye
la estabilidad del ADN en ausencia de etanol, pero aumenta la
estabilidad del ADN en presencia de etanol. Estos resultados
sugieren fuertemente que el etanol es un secuestrante más efectivo
en presencia de EDTA porque el EDTA elimina los iones metálicos
enlazados al ADN, a la vez que permite la generación de radicales
libres en el volumen de solución, en oposición a la generación de
radicales por el hierro unido al ADN. Los datos presentados para
ejemplificar la presente invención también muestran que los efectos
de estabilización del etanol y EDTA/EtOH sobre el ADN son mayores a
pH 8,0 que a pH 7,2. Se demuestra además que se puede obtener un
grado similar de protección mediante la combinación de succinato y
etanol.
Otra parte ejemplificada de la invención se
refiere a quelantes alternativos para iones metálicos, incluyendo
pero son limitarse necesariamente a NTA (ácido nitriloacético) y
DTPA (ácido dietilentriamina pentaacético). Se presentan datos que
demuestran que NTA ó DTPA, de forma preferible DPTA, mejoran la
estabilidad del ADN en ausencia de etanol.
La presente invención se refiere a formulaciones
de vacuna de ADN tanto líquidas como liofilizadas. Se presentan
datos que demuestran que la estabilidad de la formulación mejor
liofilizada excede la de las formulaciones líquidas a corto plazo,
mientras que las formulaciones líquidas presentan buena estabilidad
en grandes periodos de tiempo. Los resultados también demuestran que
la desmetalización mejora la estabilidad del ADN liofilizado en las
formulaciones 1 y 2, pero tiene poco efecto sobre el % de ADN SC en
el resto de formulaciones liofilizadas. Por tanto, la liofilización
es un procedimiento efectivo para estabilizar las vacunas de ADN, y
la desmetalización de la solución tampón mejora la estabilidad del
ADN liofilizado en algunas formulaciones.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
definir mejor la invención, sin limitar la invención a los que
especifican los ejemplos.
El V1J se deriva de los vectores V1 y pUC18, un
plásmido comercialmente disponible. V1 se digirió con los enzimas de
restricción SspI y EcoRI, produciendo dos fragmentos de ADN. El más
pequeño de estos fragmentos, que contiene el promotor CMVintA y los
elementos finales de trascripción de la Hormona Bovina del
Crecimiento (BGH) que controla la expresión de los genes
heterólogos, se purificaron mediante electroforesis en gel de
agarosa. Los extremos de este fragmento de ADN se "embotaron"
usando el enzima polimerasa de ADN T4 con el objetivo de facilitar
su enlace con otro fragmento de ADN de "extremo romo".
Se eligió pUC18 para proporcionar el
"esqueleto" del vector de expresión. Se sabe cómo producir
altos rendimientos de plásmido, está bien caracterizado por
secuencia y función, y es de tamaño mínimo. Eliminamos el operón
lac completo de este vector, que no era necesario para
nuestros objetivos, y podía ser perjudicial para el rendimiento de
plásmido y expresión del gen heterólogo, por digestión parcial con
el enzima de restricción HaeII. El resto del plásmido se purificó
mediante electroforesis en gel de agarosa, se embotó con el enzima
polimerasa de ADN T4, se trató con fosfatasa alcalina intestinal de
ternera, y se ligó con el elemento CMVintA/BGH descrito
anteriormente. Se obtuvieron plásmidos que exhibían cualquiera de
las dos posibles orientaciones del los elementos del promotor en el
esqueleto pUC. Uno de estos plásmidos produjo un rendimiento mucho
mayor de ADN en E. Coli, y se designo como V1J. Esta
estructura de vector se verificó mediante análisis de secuencia de
las regiones de unión, y se demostró posteriormente que producía una
expresión comparable o superior a la de los genes heterólogos
comparado con V1.
Muchos de los genes de la cepa A/PR/8/34 del
virus de la gripe se clonaron en el vector de expresión V1J, que da
lugar a expresión a niveles tan o más elevados que en el vector V1.
Las secuencias de los genes PR son conocidas y están disponibles en
la base de datos GENBANK. Para cada uno de los genes clonados más
adelante, el tamaño del fragmento clonado se comprobó por
dimensionamiento en gel, y se comparó y proporcionó el número de
registro de GENBANK frente a la secuencia parcial. Un procedimiento
de obtención de estos genes a partir de cepas de virus, por ejemplo
a partir de virus obtenidos a partir del ATCC (A/PR/8/34 es ATCC
VR-95; muchas otras cepas también están depositadas
en el ATCC).
El gen NP se subclonó a partir de pAPR501 (J. F.
Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M.
Rosenberg (1983), en The Origins of Pandemic Influenza
Viruses, ed. W. G. Laver (Elsevier, Ámsterdam) pp.
129-138). Se realizó cortando pAPR501 con EcoRI, el
fragmento se purificó en gel, y se embotó usando el enzima
polimerasa de ADN T4. El fragmento embotado se insertó en el corte
de V1J con Bgl II, y se embotó también usando el enzima polimerasa
de ADN T4. El fragmento clonado tenía una longitud de 1,6
kilobases.
El gen NS se subclonó a partir de pAPR801 (J. F.
Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M.
Rosenberg (1983), en The Origins of Pandemic Influenza
Viruses, ed. W. G. Laver (Elsevier, Ámsterdam) pp.
129-138). Se realizó cortando pAPR801 con EcoRI, el
fragmento se purificó en gel, y se embotó usando el enzima
polimerasa de ADN T4. El fragmento embotado se insertó en el corte
de V1J con Bgl II, y se embotó también usando el enzima polimerasa
de ADN T4. El fragmento clonado tenía una longitud de 0,9 kilobases
(la región codificante NS completa, incluye NS1 y NS2).
El gen HA se subclonó a partir de pJZ102 (J. F.
Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M.
Rosenberg (1983), en The Origins of Pandemic Influenza
Viruses, ed. W. G. Laver (Elsevier, Ámsterdam) pp.
129-138). Se realizó cortando pJZ102 con Hind III,
el fragmento se purificó en gel, y se embotó usando el enzima
polimerasa de ADN T4. El fragmento embotado se insertó en el corte
de V1J con Bgl II, y se embotó también usando el enzima polimerasa
de ADN T4. El fragmento clonado tenía una longitud de 1,75
kilobases.
El gen PB1 se subclonó a partir de
pGem1-PB1 (se secuenciaron las uniones 5' y 3' de
los genes con el vector para verificar su identidad). Ver J. F.
Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M.
Rosenberg (1983), en The Origins of Pandemic Influenza
Viruses, ed. W. G. Laver (Elsevier, Ámsterdam) pp.
129-138. Se realizó cortando
pGem1-PB1 con Hind III, el fragmento se purificó en
gel, y se embotó usando el enzima polimerasa de ADN T4. El fragmento
embotado se insertó en el corte de V1J con Bgl II, y se embotó
también usando el enzima polimerasa de ADN T4. El fragmento clonado
tenía una longitud de 2,3 kilobases.
El gen PB2 se subclonó a partir de
pGem1-PB2 (se secuenciaron las uniones 5' y 3' de
los genes con el vector para verificar su identidad). Ver J. F.
Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M.
Rosenberg (1983), en The Origins of Pandemic influenza
Viruses, ed. W. G. Laver (Elsevier, Ámsterdam) pp.
129-138. Se realizó cortando
pGem2-PB1 con BamH I y el fragmento se purificó en
gel. El fragmento con el extremo pegajoso se insertó en el corte de
V1J con Bgl II. El fragmento clonado tenía una longitud de 2,3
kilobases.
El gen M1 se generó mediante PCR a partir del
plásmido p8901 MITE. La secuencia M de este plásmido se generó
mediante PCR a partir de pAPR701 (J. F. Young, U. Desselberber, P.
Graves, P. Palese, A. Shatzman, y M. Rosenberg (1983), en The
Origins of Pandemic influenza Virases, ed. W. G. Laver
(Elsevier, Ámsterdam) pp. 129-138). El fragmento PCR
se purificó en gel, se cortó con Bgl II y se ligó con el corte de
V1J con Bgl II. El fragmento clonado tenía una longitud de 0,7
kilobases. El término amino del M1 codificado se codificó en el
"sentido" del primer anteriormente mostrado en el codón
"ATG", mientras que el codón de detención de la traducción se
codifica mediante el inverso del codón "TCA", que en el sentido
de la dirección es el codón de detención "TGA".
En cada caso, se muestran las secuencias de unión
desde la región del promotor 5' (CMVintA) en el gen clonado. La
posición en la que se produce la unión se marca con "/", que no
representa ninguna discontinuidad en la secuencia. El procedimiento
de preparar estos constructos se resume después de todas las
secuencias siguientes. Cada secuencia proporcionada representa un
contracto de ADN completo, disponible y expresable para el gen de la
gripe designado.
Cada constructo se transfectó de forma no
estacionaria a células RD (ATCC CCL136), una línea celular de
rhabdomiosarcoma en cultivo. Cuarenta y ocho horas después de la
transfección, las células re recolectaron, lisaron y se realizaron
ensayos western blot (excepto para el constructo
V1J-PR-HA, que se ensayó en ratones
y produjo un anticuerpo anti-HA específico antes de
realizar un ensayo western blot, obviando de esta forma la necesidad
de llevar a cabo un ensayo western blot ya que la expresión se
observó in vivo). Se proporcionaron anticuerpos específicos
para las proteínas PB1, PB2 y NS por Stephen Inglis, de la
Universidad de Cambridge, quién usó proteínas purificadas expresadas
como proteínas de fusión con \beta-galactosidasa
para generar antisueros policlonales. El antisuero policlonal
anti-NP se generó por inmunización de conejos con
virus A/PR/8/34 completo. El anticuerpo anti-M1 está
comercializado por Biodesign como un antisuero cabra
anti-gripeA, número de catálogo B65245G. En cada
caso, se observó una proteína del tamaño predicho, confirmando la
expresión in Vitro de la proteína codificada de la gripe.
La nomenclatura de estos constructos sigue la
convención:"nombre del vector - gen de la cepa de gripe". En
cada caso, la secuencia se comprobó frente a secuencias conocidas a
partir de GENBANK para la secuencia del gen A/PR/8/34 clonado y
secuenciado.
Se añadió un emplazamiento Sfi I a V1Jneo para
facilitar los estudios de integración. Se añadió un par de 13 bases
del enlazante Sfi I comercialmente disponible (New England BioLabs)
en el emplazamiento Kpn 1 en la secuencia BGH del vector. El V1Jneo
se linealizó con Kpn1, se purificó en gel, se embotó usando el
enzima polimerasa de ADN T4, y se ligó con el enlazante embotado Sfi
I. Se eligieron aislados clónicos mediante mapas de restricción, y
se verificaron secuenciando a través del enlazante. El vector nuevo
se designó como V1Jns. La expresión de los genes heterólogos en
V1Jns (con Sfi I) fue comparable a la expresión de los mismos genes
en V1Jneo (con Kpn I).
Un litro de suspensión de células de E.
Coli congeladas se usó para fabricar 8 litros de suspensión
celular en tampón STET (sacarosa al 8%, TRITON al 0,5%, tampón TRIS
50 mM, pH 8,5 y EDTA 50 mM). La absorbancia de la suspensión celular
a 600 nm fue de aproximadamente O.D. 30. La suspensión se agitó de
forma continua para asegurar la homogeneidad. Se determinó la
viscosidad de la suspensión de células y fue de aproximadamente 1,94
cp (0,002 N.m/s) a temperatura ambiente (24ºC). La suspensión de
células se bombeó a través de un intercambiador de calor a 81
ml/min, que se corresponde con un tiempo de residencia de la
solución de células de aproximadamente 35 segundos. La temperatura
del baño se mantuvo a 92ºC. Se determinaron las temperaturas de
entrada y salida de la solución de células, que fueron de
aproximadamente 24ºC y aproximadamente 89ºC (promedio),
respectivamente. Se hizo pasar aproximadamente 1 litro de la muestra
a través del intercambiador de calor. No se observó ninguna
obturación visible de la tubuladura, aunque el lisato era algo más
espeso que el material de partida. El lisato se enfrió hasta
temperatura ambiente, y se determinó su viscosidad, que fue
aproximadamente de 40 cp (0,04 N.m/s). El lisato de células se
clarificó por centrifugación discontinua a 9.000 rpm durante 50
minutos usando un Beckman J-21. El análisis del
sobrenadante confirmó la lisis efectiva de las células y la
recuperación del producto. El rendimiento del producto producido por
lisis térmica en flujo pistón fue al menos comparable a la que se
realizó por el método de ebullición de Quigley & Colmes. Este
último procedimiento, sin embargo, debe llevarse a cabo a escala de
laboratorio por lotes, y por tanto no es adecuado para procesado a
gran escala (5 litros o más). Puesto que el procedimiento del
intercambio de calor es en flujo pistón, no existe un límite máximo
para el volumen de suspensión celular que se pueda procesar. Este
proceso puede por tanto ajustarse a fermentaciones bacterianas a
gran escala para producir grandes cantidades de plásmido de ADN
altamente purificado.
El lisato clarificado se filtró a continuación a
través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 micrómetros
para eliminar los residuos finos. El filtrado se diafiltró a
continuación usando una membrana con un corte de pesos moleculares
de aproximadamente 100.000.
Ajustando el caudal (es decir, el tiempo de
residencia) con el que la suspensión de células se bombea a través
del intercambiado de calor se permite un control fino de la
temperatura de lisis, es decir, la temperatura de salida. Se preparó
una suspensión de células como la que se ha descrito en el ejemplo
3, y se bombeó a través del intercambiador de calor a caudales
comprendidos entre 160 y 850 ml/min. Las correspondientes
temperaturas de salida estuvieron comprendidas entre 93ºC y 65ºC,
respectivamente. La temperatura inicial de la suspensión de células
fue de 24ºC, y la temperatura de baño se mantuvo constante a 96ºC.
Además, se realizaron varios ensayos en los que el objetivo era una
temperatura de salida de 80ºC. Se obtuvieron de forma consistente
rendimientos de 24 mg de ADN circular por litro de sobrenadante
clarificado, demostrando la reproducibilidad del proceso.
Se prepararon las células microbianas y los
lisatos tal como se ha descrito, y se llevaron a cabo los siguientes
análisis. Para ilustrar que la adición de EDTA 100 mM frente a EDTA
50 mM incrementaba el porcentaje de ADN superenrollado, y para
determinar un intervalo aceptable de temperaturas de salida (es
decir, temperatura de lisis) con respecto a la recuperación de ADN
superenrollado, se llevaron a cabo los siguientes análisis. La forma
superenrollada del plásmido de ADN es deseable puesto que es más
estable que la forma circular relajada. Una manera en el ADN
superenrollado puede convertirse en circular abierta es por isomería
con DNasa. Hemos encontrado que la adición de EDTA 100 mM frente a
EDTA 50 mM en tampón STET minimiza la formación del plásmido
circular abierto. La suspensión de células se preparó como se ha
descrito. El caudal operativo en estas experimentaciones fue de
aproximadamente 186 ml/min. Las temperaturas en la entrada, salida,
y baño son 24ºC, 92ºC y 96ºC, respectiva-
mente.
mente.
Se determinó un intervalo aceptable de
temperaturas de lisis midiendo el porcentaje de plásmido
superenrollado generado en cada ensayo. La concentración de plásmido
superenrollado como función de la temperatura de salida. Un
intervalo aceptable de temperaturas de lisis está comprendido entre
75º y 92ºC. A temperaturas inferiores a 75ºC, se generó más plásmido
circular relajado, muy posiblemente debido a la mayor actividad
DNasa. Por encima de 93ºC, los niveles de plásmido superenrollado
parecen disminuir, posiblemente debido a la desnaturalización
térmica.
Tras la lisis térmica y centrifugación en
continuo, 1 ml de lisato clarificado se incubó bien con 5 \mug de
RNasa durante 2 horas o bien se usó sin tratar. Las muestras
tratadas con RNasa y sin tratar se cargaron a continuación a una
columna de intercambio aniónico (Poros Q/M 4,6 x 100) que se había
equilibrado previamente con una mezcla 50-50 de
solventes A y B [solvente de HPLC A: 20 mM de Tris/Bis propano, pH
8,0; y solvente B: NaCl 1M en Tris/Bis Propano, pH 8,0]. La columna
se eluyó usando un gradiente del 50% al 85% B en 10 volúmenes de
columna. El plásmido circular abierto se eluye a aproximadamente 68%
de B, mientras que el superenrollado se eluye a 72% de B.
Como se ha descrito anteriormente, la
diafiltración previa a la cromatografía de intercambio iónico
incrementa notablemente la cantidad de lisato que se puede cargar a
la columna.
El plásmido de ADN eluído de la columna de
intercambio iónico se separó en formas individuales mediante
análisis de HPLC en fase reversa. Las formas fueron plásmido
superenrollado (forma 1) y círculo con muescas (formas 2). Las dos
formas se separaron con facilidad y permitieron el aislamiento de
las formas individuales de plásmido.
Se resuspendió una pasta de células de
fermentación en tampón STET modificado, y lisado térmicamente a
continuación de forma discontinua. De forma alternativa, se
resuspendió una pasta de células de fermentación en tampón STET
modificado, y lisado térmicamente a continuación en el proceso de
flujo pistón descrito. El lisato se centrifugó como se ha descrito
anteriormente. Se filtraron veinte ml del sobrenadante como ha
descrito anteriormente y se cargaron a una columna de intercambio
aniónico (Poros Q/M 4,6 x 100) que se había equilibrado previamente
con una mezcla 50-50 de tampones A y B como se han
descrito anteriormente. Se usó un gradiente de 50% a 85% de B en 50
volúmenes de columna, con un caudal de 10 ml/minuto. Se recogieron
de la columna fracciones de 2,5 ml cada una. El plásmido
superenrollado de ADN se eluyó de la columna a 72% B.
El producto de intercambio aniónico se cargó a
continuación en una columna de cromatografía en fase reversa (Poros
R/H), que se había equilibrado previamente con bicarbonato de amonio
100 mM a pH 8,0, y se usó un gradiente de metanol de 0% a 80% para
eluir el material ligado. El plásmido superenrollado de ADN
altamente purificado se eluyó de la columna a 22% de metanol.
Basándose en los ensayos descrito de geles de
agarosa, colororimétrico y por HPLC, el producto final, que se
muestra en la Figura 9, es muy puro. El producto consiste en más del
90% de superenrollado y menos del 10% de plásmido circular abierto.
El ARN quedó por debajo de los límites de detección del ensayo
usado. Los niveles de ADN genómico y de proteína contaminantes
quedaron también por debajo de los límites de detección de los
ensayos usado. El rendimiento total de plásmido superenrollado al
final del procedimiento fue aproximadamente de 60% de plásmido
superenrollado en el lisato clarificado.
Se usaron 4,5 l de una suspensión congelada de
E. Coli para fabricar 33,7 l de suspensión celular en tampón
STET (sacarosa al 8%, Triton al 2%, tampón Tris 50 mM, EDTA 50 mM,
pH 8,5) con 2.500 unidades/ml de lisozima. La absorbancia de la
suspensión a 600 nm fue O.D. 30. La suspensión se agitó a
temperatura ambiente durante 15 minutos para asegurar una buena
mezcla, y a continuación se incubó durante 45 minutos con agitación
continua a 37ºC. Tras la incubación, se continuó la mezcla a
temperatura ambiente, y la suspensión de células se bombeó a través
de un intercambiador de calor a un caudal de 500 ml/min. La
temperatura del baño se mantuvo a 100ºC, y se determinaron las
temperaturas de entrada y salida de la suspensión celular, que
fueron de aproximadamente 24º y entre 70-77ºC,
respectivamente. El lisato de células que sale del intercambiador de
calor se recogió en botellas para centrífuga Beckman
J-21 durante 50 minutos a 9.000 rpm. Tras la
centrifugación, se encontró que el sobrenadante contenía
4-5 veces más producto de plásmido que en el caso de
no usar incubación con lisozima. El sobrenadante producto de la
centrifugación se diafiltró inmediatamente frente a 3 volúmenes de
tampón TE (Tris-EDTA a 25 mM a pH 8,0), y se incubó
a continuación con 20 x 10^{5} unidades de RNasa de E. Coli
durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Tras
completar la incubación, la solución de producto se diafiltró
seguidamente con 6 volúmenes mas de tampón TE usando una membrana
MWCO de 100kD, a continuación se filtró a través de un filtro de
0,45 micrómetros para eliminar los residuos. El lisato filtrado se
diluyo hasta NaCl 0,7 M con tampón Bis/Tris
Propano-NaCl 20 mM a pH 7,5, que prepara el filtrado
diluido para su carga en la columna de intercambio aniónico. La
columna de intercambio aniónico (3,6 l de Poros PI/M) se había
equilibrado previamente con Bis/Tris propano y NaCl 0,7 M. El lisato
filtrado se cargó en la capacidad de la columna. En este caso, se
cargaron 5 gramos del plásmido superenrollado en la columna de
intercambio iónico. Tras la carga, la columna se lavó con
2-4 volúmenes de columna con Bis/Tris propano 20 mM
y NaCl 0,7 M. Se llevó a cabo un gradiente de 10 volúmenes de
columna con NaCl desde 0,7 M hasta 2,0 M en Bis/Tris propano, para
limpiar la mayor parte de proteínas de E. Coli, ARN y algunas
endotoxinas. La fracción de plásmido superenrollado se eluyó de la
columna con NaCl entre 1,4M y 2,0M. La fracción superenrollada
procedente de la columna de intercambio aniónico, que contenía 4
gramos de plásmido superenrollado, se diluyó a continuación
2-3 veces con agua libre de pirógenos, se ajustó a
IPA 1,2%, y se ajustó el pH a 8,5 con NaOH 1N. La fracción
superenrollada diluida procedente del intercambio aniónico se cargó
en una columna de fase reversa de 7 l (POROS R2/M) que se había
equilibrado previamente con bicarbonato de amonio 100 mM que
contenía IPA al 1,2%: En este caso, se cargaron 3,2 gramos de
plásmido superenrollado en la columna de fase reversa, y a
continuación se lavó la columna con 6-10 volúmenes
de columna de IPA al 1,2% en bicarbonato de amonio 100 mM. Este
lavado extenso se llevó a cabo para eliminar impurezas. A
continuación, se realizó un gradiente de IPA del 1,2% al 11,2% en 5
volúmenes de columna. La fracción de producto superenrollado
procedente de la columna de fase reversa se concentró a continuación
y se diafiltró en suero salino normal usando una membrana MWCO de 30
kD. El producto final bruto se filtró a través de un filtro de 0,22
micrómetros. El rendimiento global de producto del proceso fue
superior al 50% de plásmido superenrollado en el lisato clarificado
de células, como indica el ensayo de intercambio aniónico
HPLC.
HPLC.
Se inyectaron monos Rhesus (006 NP, 009 NP o
control 101; 021) con 1 mg/emplazamiento de RSV - NP i.m. en tres
emplazamientos en el día 1. Las inyecciones, cada una de 1 mg, de
RSV - LUX y CMV-int-LUX, constructos
del gen indicador que expresa la luciferasa en luciérnagas, se
proporcionaron al mismo tiempo en emplazamientos separados. Se
reinyectó a los animales en el día 15 con las mismas cantidades de
ADN como anteriormente, y también con 1 mg de
pD5-CAT, un constructo del gen indicador que expresa
la cloranfenicol acetil transferasa, en un emplazamiento cada uno.
Los emplazamientos musculares que contienen genes indicadores se
sometieron a biopsia y se ensayaron para la actividad del gen
indicador. Se recogió suero a las 3, 5, 9, 11, y 13 semanas después
de la primera inyección. La primera muestra positiva para los
anticuerpos anti-NP se reacogió en la semana 11, y
se recogieron también muestras positivas en las semanas 13 y 15. Los
anticuerpos anti-NP se determinaron mediante
ELISA:
Los monos se inyectaron i.m. con
V1J-PR-HA en el día 1. Dos animales
recibieron cada uno 1 mg, 100 \mug o 10 \mug de ADN en cada
músculo cuadriceps. Se administró cada inyección en un volumen de
0,5 ml. Se sacó sangre a los animales antes de la inyección del día
1. Se inyectó ADN a todos los animales en el día 15, y se recogió
sangre posteriormente en intervalos de 2-4 semanas.
Los títulos de inhibición de la hemoaglutinación (HI) frente a
A/PR/8/34 fueron positivos a 5 semanas, 9 semanas y 12 semanas
después de la primera inyección con el ADN
V1J-PR-HA.
V1J-PR-HA.
La conversión del plásmido de ADN superenrollado
a sus formas circular abierta y lineal es un cambio fisicoquímico
principal que se produce durante el almacenamiento in vitro.
En los ejemplos 9-16 se determinaron los efectos de
diferentes condiciones de almacenamiento sobre la estabilidad del
plásmido de ADN, monitorizando la rotura química del esqueleto de
fosfodiéster, lo que lleva a la conversión conformacional del
plásmido de ADN superenrollado a las formas circular abierta y
lineal. Para monitorizar este cambio, se formuló un plásmido de ADN
(vacuna de ADN de gripe, HA (Georgia/93), se esterilizó mediante
filtración estéril en necesidad de ello, se colocó en viales de
vidrio tapados (0,8 ml en viales de 3 ml), y se incubaron a
diferentes temperaturas. Después del periodo de incubación, un único
vial de cada formulación particular se retiró de la incubadora y se
congeló a menos 70ºC. A continuación, cada vial se descongeló, y se
aplicaron 20 ng de ADN procedente del vial a un gel de agarosa al
1%, y se sometieron a electroforesis durante 90 minutos. A
continuación, el gel se tiñó con bromuro de etidio, se destiñó y
fotografió bajo iluminación UV. Para cuantificar la cantidad de ADN
superenrollado, circular y linear en cada muestra, se escaneó el
negativo de la fotografía del gel con un densitómetro
Bio-RAD (GS-670). Los datos de la
absorbancia de cada fila del gel se compararon con la absorbancia de
una serie de patrones de ADN superenrollado, circular y linear
situados sobre el mismo gel, usando un programa de ordenador
(Molécula Analyst, versión 1.3, BIO-RAD
Laboratorios). Se usó la absorbancia de los patrones de ADN para
construir una curva normalizada para el ADN superenrollado, circular
y linear. Se aplicaron siete patrones de ADN de cada forma se
aplicaron al gel (de 1 a 30 ng de ADN superenrollado, de 0,1875 a 15
ng de ADN circular abierta y lineal). Para expresar la estabilidad
del ADN con el tiempo, la cantidad de ADN superenrollado en la
muestra a tiempo cero se normalizó al 100% (el porcentaje inicial de
ADN superenrollado oscilaban normalmente entre
90-100%). La estabilidad de las muestras de ADN se
expresó a continuación en forma de porcentaje del ADN superenrollado
que quedaba después de cierto periodo de incubación. Aunque se
determinaron a partir del muestreo de un único vial, se tomaron
múltiples puntos temporales normalmente para permitir la observación
de un porcentaje decreciente de ADN superenrollado a lo largo de un
periodo de tiempo extendido. Para las muestras incubadas a 50ºC, los
puntos de muestreo temporales se tomaron normalmente a 1, 2, 4, 6 y
8 semanas, mientras que las muestras a 4, 25 y 37ºC se analizaron
tras 1, 2, 3 y a veces, 6 meses.
Usando plásmido de ADN purificado por
cromatografía, se iniciaron los experimentos de preformulación para
determinar el mecanismo potencial de la degradación del plásmido
durante el almacenamiento in Vitro bajo diferentes
condiciones de almacenamiento. Para examinar la estabilidad de la
vacuna de ADN de la gripe (Georgia/93) durante la exposición a
diferentes tipos de contenedor, los plásmidos de ADN (100 mcg/ml en
suero salino) se incubaron en diferentes contenedores a 5, 24 y 37ºC
durante 6 meses. Los resultados (Figuras 1A, 1B, 1c y 1D) indican
que los viales de vidrio fueron superiores al vidrio siliconado,
plástico autoclavado o viales de plástico irradiado con rayos gamma
para estabilizar el ADN. Para determinar el efecto de la
concentración de ADN sobre la estabilidad, se incubó plásmido de ADN
a 20, 100 y 1800 mcg/ml en suero salino durante 6 meses a 37ºC
(Figura 2). Los estudios adicionales del efecto de la concentración
de ADN, con ADN formulado en suero salido o PBS, también indican que
las concentraciones más elevadas fueron más estables a de 2 a 8ºC
(Tabla 1A) y a menos 70ºC (Tabla B).
\hskip0,5cm(A)
\newpage
\hskip0,5cm (B)
Los experimentos de estabilidad del ADN
demuestran que los tapones de caucho usados para cerrar los
contenedores viales de vidrio tienen un efecto perjudicial sobre la
estabilidad del ADN. La Tabla 2 muestra el efecto de tres tipos de
tapón sobre la estabilidad del ADN en dos formulaciones de vacuna de
ADN diferentes. Los viales (conteniendo las soluciones de ADN, 2
mcg/ml) se incubaron a 50ºC en configuración tanto boca arriba como
boca abajo para cada uno de los tapones ensayado. Además, la adición
de etanol mejora la estabilidad del ADN y reduce el efecto
degradante del tapón. Para el tapón #3 (Tabla 29), la adición de
etanol eliminó completamente el efecto degradante del tapón sobre la
estabilidad del ADN. Estos resultados sugieren que el tapón
contribuye a la degradación del ADN durante el almacenamiento, y el
etanol puede usarse para control de los efectos degradantes de
diferentes tipos de tapón sobre la estabilidad del ADN.
Para cuantificar la influencia del tapón sobre la
estabilidad del ADN en viales de vidrio, se llevó a cabo un
experimento para determinar la estabilidad del ADN a lo largo de 8
semanas a 50ºC en viales de vidrio con tres tipos diferentes de
tapón, y en ampollas de vidrio selladas. La Tabla 3 muestra
formulaciones con y sin succinato (un mejorante de la estabilidad
del ADN), el ADN fue significativamente más estable en ampollas de
vidrio selladas que en viales de vidrio con cualquiera de los
tapones ensayados. También hubo solamente pequeñas diferencias entre
los tres tipos de tapones sobre la estabilidad del ADN. Estos datos
muestran que diferentes tipos de tapón en cuatro formulaciones
diferentes (Tablas 2 y 3) contribuyen de manera significativa a la
degradación del ADN. La optimización de la estabilidad del ADN en
viales de vidrio requerirá el ensayo de diferentes tipos de tapón, y
puede también requerir la adición de secuestrantes de radicales
libres como el etanol para controlar los efectos degradadores
del
tapón.
tapón.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el efecto de la concentración de
sal sobre la estabilidad del ADN se realizó un experimento inicial
para determinar la temperatura de fusión (Tm) del ADN a lo largo de
un intervalo de concentraciones de NaCl comprendido entre 0 y 200
mM. Para determinar la Tm a cada concentración de NaCl, se
monitorizó la absorbancia del plásmido de ADN (10 mcg/ml ADN)
formulado en fosfato de sodio 10 mM (pH 6,0) a 260 nm a medida que
la temperatura aumentada. Los resultados (Figura 3) indican una Tm
de 72º, 73º, 78º y 82º para NaCl 0, 5, 20 y 50 mM, respectivamente.
El valor Tm para NaCl 100 y 200 nM no se pudo determinar debido a
que el gran efecto estabilizante de la sal aumentó la Tm por encima
de 90ºC. Estos resultados sugieren que la concentración de NaCl
necesaria mínima para proporcionar la máxima estabilidad térmica al
ADN está en el intervalo de 100-200 mM.
Para examinar el efecto de la concentración de
NaCl sobre la velocidad de conversión del ADN de superenrollado a
circular abierto durante el almacenamiento, se formulo el plásmido
de ADN (100 mcg/ml) en tampón de fosfato de sodio (pH 7,2) con NaCl
variando de 1 a 320 mM. Las soluciones se incubaron a 60ºC durante
48 horas, y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
Los resultados (Figura 4) indican un aumento en la estabilidad del
ADN a medida que la concentración de NaCl aumenta de 160 a 320 mM.
Estos resultados son consistentes con los de la Figura 3, sugiriendo
que el concentración necesaria mínima de NaCl para una estabilidad
del ADN máxima está entre 100-200 mM.
Para examinar el efecto de los cationes
divalentes sobre la estabilidad del ADN se formuló el plásmido de
ADN tanto en TC como en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
o suero salino (0,9% de NaCl) en presencia de ZnCl_{2},
CaCl_{2}, MnCl_{2} ó MgCl_{2}. Las soluciones de ADN (100
mcg/ml) se incubaron a 60ºC durante 48 horas, y se analizaron
mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados (Figura
5A, 5B y 5C) indican que los iones cinc no mejoran la estabilidad
del ADN. Sin embargo, el efecto de los iones calcio fue variable. En
TE y suero salino, los iones calcio mejoraron la estabilidad,
mientras que en PBS no lo hicieron. Los iones manganeso mejoraron la
estabilidad en TE, pero únicamente a concentraciones bajas. En PBS y
suero salino, los iones manganeso no mejoraron la estabilidad. Los
iones magnesio aumentaron la estabilidad del ADN en las tres
formulaciones, pero solo a elevadas concentraciones en solución
salina.
Históricamente, los plásmidos de ADN se han
almacenado en tampón TE (tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) en
manipulaciones rutinarias de biología molecular que se llevan a cabo
en suero salino y agua destilada. En consecuencia, consideramos que
era necesario examinar y definir un tampón apropiado en el tanto
almacenar como manipular el plásmido de ADN para futuros
experimentos de formulación. Como estudio inicial, el ADN se
incorporó en diferentes tampones a varios valores de pH, y se
almacenó a diferentes temperaturas. El plásmido de ADN se formuló a
500 mcg/ml en PBS a pH 4,5, 7,2 y 9,0, TE a pH 8,0 y10, agua
destilada (pH 6,0), solución salina (pH 6,0) y TFA (ácido
trifluoroacético, 0,1%) a pH 2,0. Se almacenaron las muestras a 4º y
24ºC, y se analizaron posteriormente en intervalos de 1, 4 y 12
semanas mediante electroforesis en gel de agarosa.
La Tabla 4 muestra la estabilidad conformacional
del plásmido de ADN almacenado a pH diferentes. Las muestras se
analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa; (+)
superenrollado, (+/-) superenrollado/ circular abierto, (-)
principalmente circulo abierto (plásmido relajado). Estos datos
muestran que a pH bajo (2,0-4,5) el ADN se degrada
rápidamente mientras que a pH elevado (7,2-9,0) hay
poca degradación. Por ejemplo, el plásmido de ADN almacenado tanto
en TE como PBS a valores entre 7 y 10 fue estable hasta 12 semanas a
4ºC. Para investigar todavía más este efecto del pH sobre la
estabilidad conformacional del plásmido de ADN, se generó una curva
de fusión en UV a lo largo del intervalo de pH de
4,5-10 (Figura 6). Esta técnica permite determinar
la estabilidad relativa del ADN en diferentes pH midiendo la
transición del punto de fusión (Tm), que tienen lugar como resultado
del desparejamiento de las bases emparejadas que da lugar a un
aumento de absorbancia a 260 nm. Los resultados muestran que a
medida que disminuye el pH, la absorbancia del ADN a 260 se
incrementa a una temperatura baja, es decir un Tm más bajo. Esto
indica que la doble cadena de ADN estás menos ordenada a pH más
bajos, y que las regiones desemparejadas de la moléculas son más
susceptibles a una rotura a pH más bajo. Otro punto que enfatizar es
que el plásmido de ADN es bastante resistente a la desnaturalización
térmica bajo estas condiciones. Puesto que calentar a 90ºC no da
lugar a una desnaturalización completa de la doble cadena de ADN, no
se puede determinar una Tm precisa.
Para explorar rápidamente las condiciones de
almacenamiento que mejor se ajustan para un almacenamiento de ADN a
largo plazo, se realizaron estudios es estabilidad en el que las
muestras se almacenaron a 60ºC durante 48 horas, y se analizaron
mediante electroforesis en gel de agarosa después. Los resultados
previos (Tabla 1) indican que el almacenamiento por debajo de pH 6,0
es un problema para la estabilidad del ADN, y que pueden ser
necesarios sal o EDTA (o ambos) para estabilizarlo frente a la
degradación conformacional. Así, se analizaron dos tampones, PBS y
TE (Tris-EDTA) para su capacidad de estabilizar
plásmido en el intervalo de pH 6,0-8,5. Las muestras
de plásmido de ADN se formularon a 100 mcg/ml en el tampón adecuado.
El material de partida contenía 90% de las especies superenrolladas.
Los resultados se muestran en la Figura 7A. Tras incubación a 60ºC
durante 48 horas, las muestras almacenadas en TE a pH
7,5-8,5 tuvieron 120-25% de plásmido
superenrollado remanente, mientras que los formulados en PBS (pH
7,5-8,5) contenían el 50% de plásmido
superenrollado. Además, TE no presentaba aparentemente efecto
estabilizante alguno sobre el ADN a pH 6,5-7,0,
mientras que PBS mostró un ligero efecto estabilizante en el mismo
intervalo de pH. Ningún tampón evitó la degradación a pH
6,0.
6,0.
Los resultados de los estudios acelerados
indicaron que tanto el pH como la sal son parámetros importantes
para optimizar, con el fin de estabilizar el ADN durante el
almacenamiento. Estos datos preliminares sugieren que el PBS es un
mejor estabilizante que el TE. Sin embargo, no quedó claro si los
efectos estabilizantes del PBS se debían a la presencia de iones
fosfato o bien debido a la presencia de NaCl. Además, la cuestión de
si un quelante de iones metálico estabilizaría el ADN necesitaba
tratarse de manera más adecuada. Para resolver estas cuestiones, se
implementó un estudio de estabilidad acelerado (60ºC, 48 h, 100
mcg/ml ADN) en el que el PBS se suplementó con NaCl o fosfato. Los
resultados que se muestran en la Tabla 3 indican que la adición de
EDTA o fosfato al PBS no mejoró la estabilidad del ADN frente a la
degradación. Sin embargo, la adición de NaCl 150 mM al tampón TE
incrementó la estabilidad del ADN en comparación con el TE no
suplementado. Estos resultados sugieren que el efecto estabilizante
del PBS sobre TE era debido a la presencia de NaCl 150 mM en el
PBS.
| Formulación | % de ADN superenrollado remanente |
| PBS (pH 7,2) | 50 |
| PBS + EDTA 1 mM | 50 |
| PBS + fosfato de sodio 20 mM | 50 |
| PBS + fosfato de sodio 100 mM | 50 |
| PBS (pH 6,0) | 0 |
| PBS (pH 10,0) | 50 |
| TE + fosfato de sodio 20 mM | 10 |
| TE | 10 |
| Suero salino (pH 8,0) | 0 |
| TE + NaCl 20 mM | 50 |
| PBS + EDTA 10 mM | 50 |
La Tabla 5 muestra la estabilidad conformacional
del plásmido de ADN a 60ºC durante 48 horas en diferentes tampones.
A tiempo cero, las muestras contenían 90% de ADN superenrollado.
Puesto que la presencia de NaCl en el PBS parece ser la razón para
una estabilidad del ADN mejorada, en comparación con TE, se inició
otro estudio para comparar la solución salina con PBS. Para estos
experimentos, se formuló plásmido de ADN (puro desde el punto de
vista cromatográfico) directamente a una concentración elevada
(2,0-2,5 mg/ml) en NaCl al 0,9%. Se llevaron a cabo
estudios de estabilidad con sondas usando este ADN con un
concentración de plásmido baja (2 mcg/ml), formulado tanto en tampón
PBS (pH 7,2) o NaCl al 0,9% ajustados a ph 6, 7, y 8. El contenido
en ADN superenrollado del plásmido se monitorizó mediante
electroforesis en gel de agarosa a lo largo de tres meses a 25º y
37ºC. Como se muestra en la Figura 8A (37ºC) y 8B (37ºC), cuando el
pH inicial del material formulado en solución salina disminuye, la
velocidad de pérdida de plásmido de ADN superenrollado aumenta. El
material formulado en solución salina no mantuvo el pH a lo largo
del tiempo. Por ejemplo, tras dos meses a 37ºC, el plásmido
formulado en solución salina (pH inicial de 6, 7 y 8) tuvo un valor
de pH de 5,9, 6,0 y 6,3, respectivamente. Por el contrario, el
material formulado en PBS mantuvo su valor de pH
(7,1-7,2) a lo largo del mismo periodo de
incubación. El material formulado en PBS también contiene el
porcentaje más elevado de contenido superenrollado con un nivel más
o menos consistente de plásmido superenrollado tras 3 meses a
25ºC.
A medida que el contenido superenrollado de
plásmido disminuye, se observó mediante electroforesis en gel de
agarosa un incremento concomitante de la forma circular abierta del
plásmido. Tras largos periodos de tiempo, la forma circular abierta
se convierte en un plásmido de ADN lineal. Por ejemplo, tras tres
meses a 37ºC, el material formulado en solución salina a pH 6 y pH 7
(que contenían originalmente 92 a 93% de plásmido de ADN
superenrollado) contenía 0% de superenrollado inicial, \sim36% de
circular abierto y \sim64% de plásmido de ADN lineal.
Para determinar si las tendencias observadas con
el material de sonda formulado en solución salina frente a PBS bajo
condiciones aceleradas se corresponden con el material en
condiciones de almacenamiento no aceleradas, se concertó un estudio
de estabilidad. Se formuló el plásmido de ADN a dosis bajas,
intermedias y altas tanto en solución salina (2, 20 y 2200 mcg/ml de
plásmido) y PBS (2, 20 y 1000 mcg/ml de plásmido). Se monitorizaron
tanto el Ph como el contenido superenrollado de la solución durante
el almacenamiento a 2-8ºC y -70ºC. Como se muestra
en la Tabla 1, el material formulado en PBS fue más consistente en
términos de pH y plásmido de ADN superenrollado durante
almacenamiento de hasta 3 meses.
Para examinar los efectos de los diferentes iones
del tampón y del pH sobre la estabilidad del ADN, se formularon
varios lotes de plásmido de ADN con diferentes combinaciones
tampón/pH, y se incubaron durante 3 meses a 37ºC. Tras la
incubación, el contenido porcentual de ADN superenrollado inicial se
determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados
que se muestran en la Tabla 6 indican que la estabilidad es muy
variable de lote a lote de ADN, que el pH ácido es perjudicial para
la estabilidad, y que las formulaciones que tienen una concentración
de ADN más elevada fueron más estables. La variabilidad de lote a
lote puede deberse al contenido variable en metales traza. Los
resultados de la Tabla 6 sugieren que ciertas combinaciones tampón
/pH requerirían una mayor investigación. Las combinaciones más
prometedoras identificadas mediante este estudio fueron bicarbonato
de sodio (pH 7,2), PBS (pH 7,2-8,0) y succinato de
sodio (pH 7,2).
Para resolver el dilema de si la adición de un
tampón a la solución salina mejora la estabilidad del ADN, se inició
un estudio para comparar los efectos de la solución salina sola, con
solución salina en combinación con cuatro tampones diferentes. Para
este estudio, se formuló ADN a 20 mcg/ml y se incubó a 37ºC durante
3 meses. El porcentaje de ADN superenrollado inicial se determinó
mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados, que se
muestran en la Figura 7B, indican claramente que la adición de
bicarbonato de sodio o tampones fosfato, Hepes o Tris mejoran la
estabilidad del ADN, en comparación con la solución salina sola. Los
datos sugieren también que hay diferencias importantes en los
efectos estabilizantes de los iones del tampón. Además, los
resultados sugieren que la estabilidad del ADN está relacionada con
el mantenimiento del PH. Como puede verse en la Figura 7B, la
combinación Tris/solución salina, y en concreto, la solución salina
sola, tiene el menor efecto estabilizante sobre el ADN, y no mantuvo
un pH constante a lo largo de los tres meses de incubación. Así, una
de las funciones del tampón con respecto de la estabilización del
ADN es mantener el pH en el intervalo de neutro a ligeramente
básico. Aunque otra función del tampón es estabilizar el ADN frente
a las rutas degradativas, estos resultados indican que los
diferentes tampones tienen distintas capacidades de estabilizar el
ADN, y que se necesita más trabajo para identificar los tampones
concretos que tendrían en mayor efecto estabilizante. A este
respecto, estos datos fueron la primera indicación que el
bicarbonato de sodio estabiliza el ADN durante el
almacenamiento.
Los efectos de las combinaciones adicionales
tampón/pH sobre la estabilidad del ADN se muestran en la Tabla 7. En
este estudio, se formuló el ADN en diferentes combinaciones
Tampón/pH y se incubaron durante un mes a 5º, 24º, y 37ºC. Tras la
incubación, el contenido porcentual de ADN superenrollado inicial se
determinó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados
indicaron que la mejor combinación tampón/pH fue tricita a Ph 7,5.
Sin embargo, varias combinaciones distintas demostraron estabilidad
superior a la del fosfato de sodio a pH 7,5, entre las que se
incluyen succinato de sodio (pH 6,2), malato de sodio (pH 6,2) y
Tris (pH 7,5). Están realizándose estudios adicionales diseñados
para comparar las combinaciones tampón/pH más prometedoras, de nuevo
a 4º, 25º, 37º y 50ºC.
Para determinar si los iones de los tampones en
la formulación de vacuna de ADN afectan a la respuesta inmune, se
midió la respuesta inmune inducida de la vacuna de ADN de la gripe,
HA (Georgia/93) en diferentes dosis de ADN midiendo los títulos HI.
Los resultados que se muestran en la Figura 9 indican que la
respuesta inmune a la vacuna de ADN formulada en PBS fue superior a
la respuesta observada para el ADN formulado en suero salino.
Para determinar los efectos del pH sobre la
estabilidad a lo largo de un amplio intervalo de pH, se llevo a cabo
un experimento de estabilidad en
Bis-Tris-propano 20 mM que contiene
NaCl 150 mM, entre pH 6,0 y pH 9,0. Los resultados del ensayo de
estabilidad se muestran en la Figura 13, tras 2 semanas de
incubación a 50ºC (2 mcg/ml ADN). Los resultados indican claramente
que el pH de la formulación afecta mucho a la estabilidad del ADN, y
que el pH óptimo es \geq 8,5. Puesto que la estabilidad del ADN en
el PBS control a pH 7,1 fue casi igual al del ADN en
Bis-Tris-propano a pH 7,5, los
resultados sugieren que el tipo de tampón también tiene influencia
sobre la estabilidad del ADN a un pH dado.
Para determinar los efectos del tipo de tampón
sobre la estabilidad del ADN, se llevó a cabo un experimento de
estabilidad en el que se introdujo ADN a 20 mcg/ml en siete
formulaciones diferentes. A pesar de que experimentos anteriores
habían demostrado que la pureza del tampón tenia influencia sobre la
estabilidad del ADN, se añadieron a cada formulación succinato 10 mM
y etanol al 2% para inhibir la oxidación con radicales libres del
ADN (los datos que se presentan en los ejemplos 14 y 15 demuestran
que el succinato y el etanol, cada uno, aumentan la estabilidad del
ADN). Los resultados (Figura 14) indican que la formulación que
proporciona la mayor estabilidad del ADN fue también la del mayor pH
usado (pH 9). Sin embargo, se notaron también algunos efectos del
tampón. El mayor efecto del tampón fue entre glicina y
Bis-Tris-propano, donde los datos
indican que la formulación de glicina a pH 9 fue significativamente
superior a la formulación de
Bis-Tris-propano al mismo pH. Por el
contrario, los tampones Tris, Bicina y Tricita a pH 8,2
proporcionaron una estabilidad del ADN casi idéntica a las 12
semanas. Los datos también indican que las dos formulaciones de
fosfato (a pH 7,7 y 8,0) proporcionaron la menor estabilidad del
ADN, pero estas fueron también las formulaciones ensayadas que
tenían un pH inferior. Debido a la baja capacidad tamponadora de los
tampones fosfato por encima de pH 8, las formulaciones de fosfato se
limitaron a valores del pH de o inferiores a 8,0. Estos resultados
sugieren que una vez que se controla la oxidación del ADN por
radicales libres mediante la adición de quelantes (ver el ejemplo 15
para los datos que muestran qué quelantes mejoran la estabilidad del
ADN y en qué condiciones) y secuestrantes de radicales libres (ver
el ejemplo 14 para los datos que muestran la mejora en la
estabilidad del ADN debida al etanol), la estabilidad del ADN se
controla principalmente mediante el pH de la formulación.
Inicialmente, se evaluó la sensibilidad a la luz
del material para determinar si se necesitarían precauciones de
manipulación especiales o serían necesarios viales color ámbar para
almacenamiento a largo plazo. Los resultados de un experimento para
medir la sensibilidad a la luz (Fig. 10) indicó que la exposición de
100 mcg/ml de plásmido de ADN en solución salina aceleró la
conversión del plásmido de ADN superenrollado a la forma circular
abierta, tal como se determinó mediante electroforesis en gel de
agarosa. La conversión a la forma circular abierta fue mucho más
pronunciada cuando el ADN se almacenó en viales de vidrio
transparente en oposición a los viales color ámbar, tal como se
esperaba. Aunque una exposición de 2-4 semanas a la
luz da lugar a una degradación significativa, no se observaron
pérdidas significativas en un día de ocho horas. Puesto que los
viales de color ámbar tienen el potencial de liberar iones metálicos
traza con el tiempo, que catalizarían la oxidación con radicales
libres del ADN (ver más adelante), se necesita para el
almacenamiento a largo plazo una solución de embalaje respecto de la
sensibilidad a la luz.
Para determinar los efectos de la luz sobre la
estabilidad del ADN en formulaciones que contenían Fe^{+3}, se
realizó un estudio estabilidad a lo largo de 9 semanas a 30ºC con
quelantes de iones metálicos y secuestrantes de radicales libres, en
presencia y ausencia de luz visible (luz fluorescente a 2.000 lux).
La concentración de ADN fue de 20 mcg/ml, y el tampón de formulación
fue fosfato de sodio 10 mM conteniendo NaCl 150 mM a pH 8,0. Los
resultados, mostrados en las Figuras 27 y 28 siguientes, indicaron
que la luz hacía disminuir la estabilidad del ADN de forma
significativa en el PBS control y en el PBS que contenía 500 ppb de
Fe, o PBS que contenía EDTA 0,5 mM y 500 ppb de Fe^{+3}. Los
resultados también indicaron que la presencia de EDTA 0,5 mM no
disminuyó el efecto perjudicial de la luz sobre la estabilidad del
ADN en presencia de 500 ppb de Fe^{+3}. Los resultados de la
Figura 16 muestran los efectos de la luz sobre la estabilidad del
ADN en formulaciones que contienen EDTA y <etanol. Los resultados
indican que la presencia de EDTA y etanol estabilizan fuertemente el
ADN, tan muestras a la luz y en la oscuridad, en comparación con la
formulación de control en la Figura 15. Los resultados también
indican que los efectos perjudiciales de la luz sobre la estabilidad
del ADN quedaron muy disminuidos por la presencia de EDTA y etanol,
incluso en formulaciones que contenían 500 ppb de Fe^{+3}. Por
tanto, los resultados sugieren que las formulaciones de vacuna de
ADN que contienen EDTA y etanol son mucho menos sensibles a los
efectos perjudiciales de la luz y de los iones metálicos traza que
las mismas formulaciones que carecen de estos dos
estabilizantes.
Para preparar PBS desmetalizado, se lavaron 20,0
g de resina Chelex 100 (BIO-RAD Laboratorios) con
400 ml de agua USP usando filtración a vacío a través de una
membrana de acetato de celulosa (tamaño de poro de 0,22
micrómetros). La resina lavada se agregó a aproximadamente 1 litro
de PBS, y se agitó lentamente durante toda la noche a
2-8ºC, mediante un imán en una botella pequeña que
contenía la suspensión, y ajustando el agitador magnético a su
velocidad de agitación más reducida. Al día siguiente, la resina se
retiró mediante filtración a vacío estéril usando una membrana de
acetato de celulosa (Corning, tamaño de poro de 0,22 micrómetros).
Se tuvo cuidado en prelavar la membrana con dos aplicaciones de 10
ml de la suspensión desmetalizada antes de recoger el producto
filtrado final. Esta etapa se llevó a cabo asegurando que cualquier
posible lixiviado de iones metálicos desde la membrana no
contaminaría el producto desmetalizado.
Para desmetalizar las soluciones que contenían
plásmido de ADN, el ADN se diluyó con PBS desmetalizado hasta un
volumen final de aproximadamente 2 ml. A continuación, se aplicó el
ADN a una columna resina Chelex 100 (1 ml), equilibrada
anteriormente lavando la columna con 5 ml de PBS desmetalizado. El
ADN desmetalizado del efluente se recogió, seguido por la adición de
6 ml más de PBS desmetalizado para extraer de la columna el resto
del ADN. El efluente entero se diluyó a continuación hasta un
volumen final de 12,0 ml con PBS desmetalizado, y se filtró de forma
estéril con un filtro de jeringa Millipore Millex-GV
de 25 mm (tamaño de poro de 0,22 micrómetros). Nuestros experimentos
iniciales implicaron la desmetalización de únicamente 48 microgramos
de ADN con una columna de 1 ml, sin embargo, la capacidad de la
resina Chelex 100 permite desmetalizar cantidades de ADN mucho
mayores usando una columna con las mismas dimensiones.
Para preparar PBS desoxigenado (desgasificado), O
PBS desoxigenado y desmetalizada, se calentaron 250 ml del tampón en
una botella Pirex. A continuación se dejó enfriar la solución hasta
temperatura ambiente bajo corriente de helio, y se tapó.
Para preparar soluciones de ADN desoxigenadas
para los estudios de estabilidad, la vacuna de ADN de la gripe HA
(Georgia/93) se diluyó en PBS desoxigenado estéril. No se desoxigenó
la solución madre inicial de vacuna de ADN de la gripe porque se
diluyó unas 1.000 veces (de 2,55 mg/ml a 2,0 mcg/ml). La solución de
ADN desoxigenada se colocó a continuación en viales de vidrio
estériles, y se taparon tras rellenar el espacio de cabeza con
nitrógeno filtrado. Para preparar soluciones de ADN desoxigenadas y
desmetalizadas para los estudios de estabilidad, la vacuna de ADN de
la gripe HA (Georgia/93) se diluyó en primer lugar con PBS
desmetalizado y desoxigenado. Esta solución se aplicó a una columna
resina Chelex 100 (1 ml), para desmetalizar el ADN. La disolución se
diluyó a continuación con más PBS desmetalizado y desoxigenado, se
filtró de forma estéril, y se borboteó con helio justo antes de
rellenar los viales. El espacio de cabeza de cada vial se rellenó
con nitrógeno filtrado antes de tapar.
La Tabla 6 contiene los resultados de un
experimento para determinar la estabilidad del plásmido de ADN en
PBS (pH 7,2) y PBS desmetalizado. Los resultados indican una mejora
de la estabilidad del ADN en PBS desmetalizado superior a la
condición de control, y sugiere que la estabilidad de una vacuna de
ADN quedaría muy mejorada si se almacenara en un tampón
desmetalizado. Además, el ADN almacenado en PBS desmetalizado fue
mucho más estable de los que se había predicho usando las constantes
de velocidad publicadas para la despurinización y
\beta-eliminación. La despurinización y
\beta-eliminación son dos reacciones químicas
consecutivas en el proceso de rotura del esqueleto fosfodiéster del
ADN, que se produce en medio acuoso. En la primera etapa, la
[H^{+}] cataliza la pérdida de bases de purina del ADN, dejando
tras de sí un emplazamiento apurínico (emplazamiento AP). En la
segunda etapa de la hidrólisis, la [OH^{-}] cataliza una reacción
de \beta-eliminación, que rompe el enlace entre el
átomo de oxígeno ligado al carbono 3' de la desoxirribosa, y el
átomo de carbono 3'. Puesto que la despurinización y
\beta-eliminación son procesos naturales que no se
pueden evitar completamente, en medio acuoso, se esperaría que si el
resto de las fuentes de degradación del ADN se eliminan, entonces
las velocidades naturales de despurinización y
\beta-eliminación definirían la estabilidad del
ADN. La constante de velocidad publicada 8k) y la energía de
activación (Ea) de la despurinización a pH 7,4 (70ºC + MgCl_{2} 10
mM) son 4,0 x 10^{-9} s^{-1} y 31 kcal/mol, respectivamente (ver
Lindahl y col., Biochemistry, 19:3610-3618).
Por tanto, a 50ºC, la velocidad de despurinización en PBS debería
ser de aproximadamente 2,3 x 10^{-10} s^{-1} en presencia de
magnesio, y de 3,3 x 10^{-10} s^{-1} en ausencia de magnesio,
basado en los efectos del magnesio a 70ºC. La constante de velocidad
publicada (70ºC, en ausencia de magnesio) y la Ea para la etapa de
\beta-eliminación son 2,4 x 10^{-5} s^{-1} y
24,5 kcal/mol, respectivamente (ver Lindahl y col.,
Biochemistry, 19:3610-3618). Por tanto, a
50ºC, la velocidad la etapa de \beta-eliminación
debería ser de aproximadamente 2,6 x 10^{-6} s^{-1}. Por tanto,
la velocidad de formación de roturas en la cadena (SB) será igual a
[emplazamientos AP]k_{2}, donde k_{1} es la constante de
velocidad para la despurinización, k_{2} es la constante de
velocidad para la \beta-eliminación,
[emplazamientos AP] es la concentración de emplazamientos apurínicos
en el ADN, tal como se muestra a continuación.
Plásmido de ADN - - k_{1} \rightarrow
[emplazamientos AP] - - k_{2} \rightarrow rotura de
cadenas (SB)
Por tanto, para determinar la velocidad de
formación de roturas de cadena en cualquier momento, tras un periodo
de incubación a 50ºC.
Velocidad = 6.600 purinas (para IDV, HA,
Georgia/93) x 3,3 x 10^{-10} s^{-1} x k_{2}
Velocidad = 2,2 x 10^{-6}s^{-1} x k_{2}
Velocidad = 2,2 x 10^{-6}s^{-1} x 2,6 x
10^{-6}s^{-1}
Velocidad = 5,7 x 10^{-12}s^{-1}
Velocidad de formación de SP en cualquier tiempo
x 5,7 x 10^{-12}s^{-1} (tiempo en segundos).
Así, el número de SB presente en cualquier
momento t es igual a la integral de 5,7 x 10^{-12}(t) con
el tiempo entre t = 0 y t= tiempo
Así, el número de SB presente en cualquier
momento t = ½ (5,7 x 10^{-12})t^{2}
Por tanto, el número de SB presente en cualquier
momento t = 2,85 x 10^{-12}(t^{2})
Si usamos las constantes de velocidad anteriores
para determinar el número de cadenas rotas en la vacuna de ADN para
la gripe tras 28 días de incubación a 28 días, obtenemos 16,7
roturas por plásmido. Una distribución aleatoria de 16,7 roturas de
cadena por molécula de plásmido en una población de plásmidos
produciría una población completamente carente de cualquier ADN
superenrollado. Sin embargo, los datos de la Tabla 6 indican que en
la muestra desmetalizada, el 65% del ADN superenrollado inicial
permanecía tras 28 días. Estos datos sugieren que la desmetalización
reduce en gran medida la velocidad de despurinización y/o
\beta-eliminación, en medio acuoso. No se sabe
cómo los iones metálicos traza podrían afectar las reacciones de
despurinización o \beta-eliminación a este
grado.
Los resultados de la Tabla 8 indican también que
la desoxigenación mejora la estabilidad del ADN, presumiblemente
reduciendo la producción de radicales libres que contienen oxígeno.
La formulación más estable en este estudio fue la muestra
desmetalizada y desoxigenada, con un 37% de ADN superenrollado
inicial permanente después de 42 días a 50ºC.
Los resultados de otro estudio sobre los efectos
de la desmetalización (Tabla 9) también indican que la
desmetalización y desoxigenación del tampón PBS y del ADN mejora en
gran medida la estabilidad del ADN a 50ºC, por encima del PBS
control no desmetalizado. Con el fin de eliminar cualquier ión
metálico residual de los viales de vidrio usados para el
almacenamiento, algunos de los viales se lavaron con una solución de
PBS que contenía EDTA 1 mM, agua desionizada, y se autoclavaron
antes del uso. La comparación de la estabilidad del ADN entre los
viales lavados y no lavados indicó que lavar los viales no mejoraba
de forma significativa la estabilidad del ADN, en condiciones
aceleradas. Sin embargo, el lavado de los viales para reducir el
contenido en iones metálicos de la superficie puede mejorar la
estabilidad a largo plazo de la vacuna de ADN.
Para determinar si la estabilidad mejorada
observada en el PBS desmetalizado requiere la desmetalización del
plásmido de ADN antes de su adición al PBS desmetalizado, se inició
un estudio para determinar el efecto sobre la estabilidad de una
disolución de 1.000 veces de un plásmido de ADN no desmetalizado en
PBS desmetalizado. Los resultados (Tabla 10, condiciones
C1-C3) indicó una reducción en la estabilidad cuando
el ADN no se desmetalizaba, sugiriendo que es necesario desmetalizar
el ADN y el PBS para obtener la máxima estabilidad.
Con el fin de determinar si la estabilidad
mejorada en condiciones desmetalizadas era debida a la Inactivación
de la actividad nucleasa contaminante residual, realizamos un
experimento para determinar los efectos de eliminar o desnaturalizar
cualquier actividad nucleasa contaminante sobre la estabilidad del
ADN. Los resultados (Tabla 11) indican que la adición de SDS al 1%
no mejoro de forma significativa la estabilidad sobre el PBS
control. Además, el tratamiento del ADN con 1 mcg de proteasa K
durante 1 hora a 24ºC, seguido por eliminación de la enzima con una
membrana Micropure EZ, no mejoró la estabilidad. La el tratamiento
único con membrana Micropure EZ tampoco mejoró la estabilidad.
Además, encontramos que una extracción con fenol y una precipitación
con etanol del ADN no tuvieron efecto sobre la estabilidad. Estos
resultados sugieren fuertemente que la estabilidad mejorada
observada en PBS desmetalizado no es debida a la actividad nucleasa
residual, sino debida a la eliminación de iones metálicos capaces de
catalizar la oxidación del ADN por radicales libres.
Para examinar adicionalmente los efectos de las
desmetalización sobre la estabilidad del ADN se llevaron a cabo una
serie de experimentos de estabilidad del ADN usando tampones
desmetalizados con un procedimiento de desmetalización en
discontinuo mejorado que asegura la eliminación eficiente de iones
metálicos traza sin alterar el pH del tampón. Los tampones se
desmetalizaron colocando 5 g de resina Chelex en \sim75 ml del
tampón a desmetalizar. Agitando la disolución a velocidad moderada
mediante un agitador magnético, se añadió a la suspensión HCl 1N
gota a gota para ajustar el pH al pH deseado del tampón. A
continuación, se añadió más HCl 1N en los siguientes
15-30 minutos hasta que el pH de la suspensión se
estabilizó al pH deseado. Cuando el pH se hubo estabilizado, la
suspensión se filtró y se recogieron el filtrado y la resina Chelex
con el pH ajustado. A continuación, los 5 gramos completos de la
resina lavada se colocaron en 250 ml del tampón a desmetalizar 8en
una botella tapada de 250 ml), y se agitó lentamente durante toda la
noche, a 2-8ºC. A continuación, el tampón se filtró
de forma estéril usando una unidad de filtración a vacío Corning con
una membrana de acetato de celulosa de 0,22 mm. Antes de recoger el
tampón filtrado, la membrana de la unidad de filtración Corning se
lavó dos veces con 5-10 ml de suspensión cada vez,
para eliminar cualquier ion metálico trata de la membrana de acetato
de celulosa, y para lavar el contenedor de poliestireno. El tampón
desmetalizado se almacenó a 2-8ºC hasta uso.
Para determinar los efectos de la pureza de los
reactivos y de la desmetalización sobre la estabilidad del ADN, se
incubó plásmido de ADN a 2 mcg/ml en PBS, fabricado a partir de
reactivos de dos fuentes diferentes a pH 7,2 durante 6 semanas a
50ºC. Los resultados (Figura 15) indican que la desmetalización de
la formulación tampón mejora de forma significativa la estabilidad
del ADN en PBS fabricado con los reactivos B, por tuvo poco efecto
sobre la estabilidad del ADN en PBS fabricado con los reactivos A.
Estos resultados sugieren que las impurezas de los iones metálicos
traza en las formulaciones de los reactivos tampón puede llevar a la
degradación del ADN durante el almacenamiento, y que la
desmetalización de las formulaciones de tampón menos puras mejora la
estabilidad del ADN.
Para determinar los efectos de la desmetalización
sobre la estabilidad del ADN en formulaciones a un pH elevado, se
llevó a cabo un estudio de estabilidad a lo largo de 6 semanas a
50ºC con ADN a 2 mcg/ml en PBS y PBS desmetalizado, ajustado a pH
8,0. Los resultados, que se muestran en la Figura 16, indican que la
desmetalización de la formulación tampón mejora también la
estabilidad del ADN a pH 8,0 en PBS.
Para determinar los efectos de la desmetalización
sobre la estabilidad del ADN en formulaciones que contienen
secuestrantes de radicales libres y quelantes de iones metálicos, se
llevó a cabo un experimento de estabilidad del ADN con plásmido de
ADN a 2 mcg/ml. Se ensayaron dos formulaciones, cada una en estado
desmetalizado y no desmetalizado. Se usó PBS como tampón, y
succinato de sodio 10 mM como quelante. Se usaron etanol y glicerol
como secuestrantes de radicales libres, cada uno al 2% (v/v). Los
resultados, que se muestran en la Figura 17, indican que la
desmetalización mejora ligeramente la estabilidad del ADN en la
formulación que contiene glicerol, pero no tiene efecto sobre la
estabilidad del ADN en la formulación de etanol. Estos resultados
sugieren que se puede conseguir el mismo grado de estabilidad del
ADN tanto controlando la oxidación de radicales libres con succinato
y etanol, o eliminando los iones metálicos traza mediante
desmetalización. Sin embargo, se esperaría que la adición de
succinato y etanol protegería el ADN de cualquier ion metálico traza
introducido durante la formulación y filtración de la vacuna de ADN.
Aunque la desmetalización no protegería el ADN de la carga de iones
metálicos traza introducidos durante la formulación, puede
incrementar la estabilidad del ADN durante el almacenamiento a lo
largo de periodos más prolongados.
Para examinar los efectos de la desmetalización
sobre la estabilidad del ADN en otros tipos de tampón, se llevó a
cabo un experimento de estabilidad del ADN a 2 mcg/ml en tampones
que contenían tanto bicarbonato como borato. Los resultados, que se
muestran en la Figura 18 siguiente, indican que la desmetalización
incrementa notablemente la estabilidad del ADN en cada una de las
formulaciones. Por tanto, los datos sugieren que la desmetalización
es una manera efectiva de mejorar la estabilidad del ADN en
diferentes formulaciones tampón a lo largo de un amplio intervalo de
pH.
Para determinar si la desmetalización de la
formulación tampón para la vacuna de ADN mejora la estabilidad del
ADN a temperaturas bajas y periodos de almacenamiento mucho más
largos, se llevó a cabo un experimento de estabilidad del ADN con
ADN a 2 mcg/ml a lo largo de 9 meses a 30ºC. Los resultados, que se
muestran en la Figura 19, indican que la desmetalización de las
formulaciones que contienen PBS y bicarbonato mejorar la estabilidad
del ADN de manera significativa. Estos resultados sugieren que la
mejora en la estabilidad del ADN por desmetalización es efectiva en
un amplio intervalo de temperaturas y tiempo de almacenamiento.
En la actualidad, se reconoce ampliamente que un
mecanismo de la degradación del ADN implica la oxidación de
radicales libres mediante moléculas tales como los radicales
hidroxilo. Una forma de evitar o minimizar la cantidad de daño en el
ADN debido a los radicales libres es añadir un secuestrante de
radicales libres a la solución. Estas moléculas actúan con el
objetivo de protegen el ADN, compitiendo con el ADN por los
radicales libres. Puesto que los secuestrantes son compuestos que se
seleccionan por su elevada reactividad frente a los radicales
libres, y están a menudo presentes en concentraciones más elevadas
que la parte reactiva del ADN (normalmente el azúcar desoxirribosa),
protegen de forma eficaz el ADN del daño.
Para determinar si durante el almacenamiento se
produce oxidación con radicales libres, y para ensayar la eficacia
de varios secuestrantes de radicales libres, se formuló vacuna de
ADN del la gripe, HA (Georgia/93) en solución salina que contenía
manitol al 4% (p/v), glicerol al 4% (p/v), metionina 5 mM o azida de
sodio 10 mM (secuestrantes de radicales libres conocidos) y se
incubaron a 37ºC durante tres meses. El ADN se sometió a
electroforesis en gel de agarosa en tres momentos para determinan el
porcentaje de ADN superenrollado inicial remanente. Los resultados,
en la Figura 11, indican que en solución salina, el glicerol,
metionina y la azida de sodio estabilizan el ADN, en comparación con
el control de solución salina. Estos resultados iniciales sugieren
que la oxidación con radicales libres tiene lugar durante el
almacenamiento, y que estos tres tipos diferentes de secuestrantes
de radicales libres son estabilizantes efectivos del ADN.
Se muestran los resultados de otro estudio
diseñado para examinar el efecto del secuestrante de radicales
libres dimetil sulfóxido (DMSO) y de los agentes reductores ácido
ascórbico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y tioglicerol sobre
la estabilidad del ADN. En este ejemplo, se formuló ADN a 20 mcg/ml
en PBS (pH 7,2) y se incubó a 5, 24 y 37ºC. Los resultados indican
una destrucción importante del ADN en presencia de todos los agentes
reductores, y la mejora de la estabilidad con DMSO al 0,2% (v/v), en
comparación con el PBS control. Los resultados de este experimento
son consistentes con los de la Figura 11, en el que la mayor parte
de los secuestrantes de radicales libres no reductores ensayados
estabilizaron el ADN.
Se llevó a cabo a continuación una reevaluación
de los secuestrantes de radicales libres para examinar los efectos
del glicerol al 10% (v/v), metionina 10 mM y etanol al 2% (v/v)
sobre la estabilidad del ADN. En este experimento, se formuló ADN a
20 mcg/ml en PBS (pH 7,2) y se incubó a 5, 24 y 37ºC. Los
resultados, que se muestran en la Tabla 13, indican que el etanol al
2% en PBS fue el estabilizante más efectivo. Sin embargo, glicerol y
metionina también mostraron algún efecto estabilizante. Otro
resultado de este estudio fue que las formulaciones en PBS fueron
mucho más estables que las formulaciones en solución salina,
presumiblemente porque el pH tendía a descender con el tiempo en las
soluciones salinas, originando un aumento en la velocidad de
degradación.
Los resultados de un experimento para examinar
los efectos de los secuestrantes de radicales libres pentoxifilina,
tert-butilhidroquina y ácido
p-aminobenzoico sobre la estabilidad del ADN se
muestran en la Tabla 14. En este estudio, se formulo la IDV HA
(Georgia/93) a 2,0 mcg/ml en PBS (pH 7,2) en presencia de una
concentración 10 mM del secuestrante. Las muestras de este estudio
se incubaron a 50ºC, y se examinaron respecto del contenido en ADN
superenrollado mediante electroforesis en gel de agarosa. Los
resultados indicaron que ninguno de los secuestrantes ensayados
mejoró la estabilidad del ADN, y que de hecho aceleraban en gran
medida la degradación del ADN. No queda claro porqué estos
secuestrantes aceleran la degradación del ADN, mientras que etanol,
DMSO, glicerol y metionina proporcionan una mejora en la
estabilidad.
Se examinó también la capacidad del etanol para
estabilizar el ADN en PBS desmetalizado, así como en PBS
desmetalizado y desoxigenado. Para estos dos estudios, se formuló
ADN a 2,0 mcg/ml, y se incubó a 50ºC. Los resultados, que se
muestran en las Tablas 9 y 10, indican que el etanol al 5% (v/v)
estabilizó el ADN en PBS, y en cualquiera de las formulaciones
desmetalizadas.
Los recientes resultados del primer punto
temporal (1 mes) de un estudio de estabilidad a largo plazo también
indican que el etanol al 5% estabiliza el ADN en PBS desmetalizado a
37ºC, en formulaciones que contienen 2,0 mcg/ml de ADN. El punto
temporal a un mes indicó que el PBS control tenía un 93% del ADN
superenrollado inicial remanente, mientras que la muestra
desmetalizada tenía un 96,1%, y la muestra desmetalizada que
contenía etanol al 5% tenía el 100%.
Para examinar los efectos de los secuestrantes de
radicales libres sobre la estabilidad del ADN se realizaron dos
experimentos de estabilidad del ADN a lo largo de 8 semanas a 50ºC
con ADN a 20 mcg/ml en PBS a pH 7,2 y pH 8,0. Puesto que el etanol
es un secuestrante de radicales libres efectivo aprobado para uso
humano, se ensayo etanol al 2% (v/v) como secuestrante, en presencia
y ausencia de EDTA. Los resultados del primer experimento (a pH 7,2)
se muestran en la Figura 20 siguiente. Los resultados indican que el
etanol solo mejora la estabilidad del ADN, mientras que el EDTA sólo
disminuye la estabilidad del ADN. La combinación de etanol y EDTA
proporcionó un buen incremento en la estabilidad del ADN durante
4semanas, pero sólo un pequeño aumento de la estabilidad en la
semana 8. Estos resultados sugieren fuertemente que etanol es un
secuestrante más efectivo en presencia de EDTA porque el EDTA retira
los iones metálicos enlazados al ADN, permitiendo de esta forma la
generación de radicales hidroxilo en el volumen de solución, en
oposición a la generación de radicales hidroxilo por el hierro
ligado al ADN. La producción de radicales hidroxilo en el volumen de
solución daría a las moléculas de etanol más tiempo para secuestrar
los radicales puesto que el camino libre medio del radical sería más
largo antes de su interacción con el ADN. Los radicales hidroxilo
generados por las moléculas de hierro enlazadas al ADN estarían muy
cerca del ADN. Por tanto, la capacidad del etanol para secuestrar
los radicales producidos en la "superficie" del ADN quedaría
muy disminuida. Estos resultados sugieren también que otros
quelantes distintos del EDTA podrían ser estabilizantes efectivos
del ADN, supuesto que el quelante fuera capaz de eliminar los iones
metálicos (hierro y cobre) casi ligados al ADN.
Los resultados del segundo estudio de
estabilidad, a pH 8,0, se muestran a continuación en la Figura 21.
Los datos de este experimento muestran claramente que los efectos
estabilizantes del ADN del etanol y de EDTA/EtOH con mayores a pH
8,0 que a pH 7,2.
Para determinar si la combinación de succinato y
etanol proporcionaría el mismo grado de estabilización en el ADN que
el observado con la combinación EDTA/EtOH, y para determinar si
alguna de estas combinaciones protegería el ADN de la presencia de
Fe^{+3}, se realizó un estudio de estabilidad a lo largo de 6
semanas a 50ºC en tampón fosfato de sodio 10 mM que contenía NaCl
150 mM a pH 8,0 con 20 mcg/ml de ADN. Los resultados indican que la
combinación succinato/EtOH no proporciona el mismo grado de
estabilización del ADN que EDTA/EtOH. Sin embargo, la combinación de
succinato y etanol proporcionó una protección casi completa de la
generación de radicales libres estimulada por la adición de 500 ppb
de Fe^{+3}. Los resultados, que se muestran en la Figura 22,
indican también que la combinación EDTA/EtOH proporcionó la mejor
estabilidad global del ADN, y el mismo grado de estabilidad del ADN
no puede conseguirse usando la combinación de succinato y
etanol.
En estudios preliminares diseñados para examinar
los efectos de los iones tampón, pH y sal sobre la estabilidad del
ADN, también examinamos el efecto de añadir EDTA 1 mM y 10 mM al ADN
formulado en PBS (pH 7,2). Para estos experimentos iniciales, se
formuló plásmido de ADN a 100 mcg/ml en PBS y se incubó a 60ºC
durante 48 horas. El contenido en ADN superenrollado se determinó
seguidamente mediante electroforesis en gel de agarosa. Los
resultados, que se muestran en la Tabla 5, indicaron que el EDTA no
tenía efecto sobre la estabilidad del ADN sugiriendo, en este primer
momento no se necesitaban iones metálicos traza para el proceso de
degradación del ADN que estábamos observando.
Otros experimentos también incluyeron un examen
de los efectos del ADN sobre la estabilidad del ADN. Estos
resultados se muestran en la Tabla 12, por ejemplo, indicando que
EDTA 0,5 mM no tenía efectos significativos sobre la estabilidad del
ADN formulado a 2,0 mcg/ml en PBS (pH 7,2), o en PBS que contenía
etanol al 5% (v/v), cuando se incubaba a 50ºC.
Un experimento temprano diseñado para examinar el
efecto del quelante de iones desferal (a 1 mM) sobre la estabilidad
del ADN indicó una velocidad de degradación estimulada. En este
estudio, se formuló ADN en PBS (pH 7,2) a 20 mcg/ml) y se incubó a
5, 24 y 37ºC. La razón para este estímulo en la velocidad de
degradación no está clara.
Experimentos posteriores confirmaron también el
efecto perjudicial del desferal sobre la estabilidad del ADN. Los
resultados que se muestran en la Tabla 15, por ejemplo, muestran de
desferal 0,5 mM dan lugar a una rápida degradación del ADN en PBS,
incluso si el PBS se trataba con desferal antes de mezclarlo con el
ADN. Este experimento demostró también que el tratamiento del ADN
con desferal 1 mM, durante toda la noche, antes de diluirlo en PBS
desmetalizado seguida dando lugar a una rápida degradación del ADN.
Para estos últimos experimentos con desferal, se formuló ADN a 2
mcg/ml en PBS y se incubó a 50ºC.
Los resultados de un experimento para examinar
los efectos de algunos quelantes de iones metálicos bien
caracterizados sobre la estabilidad del ADN se muestran en la Tabla
14. Para estos estudios, se formuló ADN a 2,0 mcg/ml en PBS (pH 7,2)
y se incubó a 50ºC. Se usaron cuatro quelantes diferentes, cada uno
a 0,5 mM. Estos resultados indican que el hexafosfato de inositol
(IHP) y el tripolifosfato (TOO) mejoraron la estabilidad del ADN.
Sin embargo, el ácido
etilendiamina-Di(o-hidroxi-fenil)
acético (EDDHA) y el ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA) no
mejoraron la estabilidad. Estos resultados sugieren que IHP y TPP
pueden ser útiles para estabiliza aun más el ADN en PBS
desmetalizado, y en PBS desmetalizado que contiene etanol como
secuestrante de radicales libres. Aunque el efecto estabilizante de
IHP y TPP es consistente con el aumento en la estabilidad por
desmetalización, y los efectos estabilizantes del etanol (basado en
que el mecanismo de la degradación del ADN sea una reacción
catalizada por iones metálicos, oxidación con radicales libres) no
queda claro porqué otros quelantes de iones metálicos no estabilizan
el ADN. La literatura publicada 8ver J. Biol. Chem., 259,
3620-3624; 1984) sugiere que IHP, EDDHA, DTPA y
desferal carecen de un punto de coordinación libre en el metal
cuando se coordinan con el hierro. Por tanto, se informa que estos
cuatro quelantes no producen radicales hidroxilo cuando se complejan
con el hierro, tal como hace el EDTA. Con esta comprensión de la
química, es difícil explicar los distintos efectos de estos
quelantes sobre la estabilidad del ADN. Sin embargo, nuestros
resultados sugieren que los quelantes que contienen muchos ligandos
fosfato pueden ser los quelantes más efectivos para proteger el ADN
de la oxidación catalizada por iones metálicos. Además, los
quelantes adicionales con múltiples ligandos fosfato incluirían las
diferentes formas de sales del ácido
polifosfórico.
polifosfórico.
Los resultados de nuestros estudios más recientes
para examinar diferentes tampones en estado desmetalizado (ver
Ejemplo 16) sugieren también que los quelantes de iones metálicos
específicos son importantes para estabilizar el ADN durante el
almacenamiento. Puesto que el PBS desmetalizado que contiene
succinato o malato fue superior al PBS desmetalizado solo, el efecto
estabilizante aparentemente se debe al enlace de los iones metálicos
con los iones de succinato y malato. Sin embargo, nuestros datos
también indican que el citrato, un tampón usado habitualmente con
una afinidad más elevada que el succinato por los iones metálicos,
no proporcionó estabilidad alguna del ADN. Más aún, desferal,
inositol, hexafosfato, EDDHA y DTPA todos tienen afinidades elevadas
por los iones metálicos, pero no estabilizan el ADN durante el
almacenamiento. Por tanto, la capacidad del quelante de iones
metálicos para estabilizar las formulaciones de ADN no está
relacionada con la afinidad de enlace del quelante por los iones
metálicos. Esta conclusión sugiere que la identificación de
quelantes efectivos requerirá una selección empírica de moléculas
con múltiples ligandos fosfato, o con un parecido químico a los
ácidos succínico o
málico.
málico.
Para examinar los efectos de los quelantes de
iones metálicos sobre la estabilidad del ADN, se realizaron series
de experimentos de estabilidad del ADN. El objetivo del primer
experimento fue determinar el efecto de diferentes quelantes sobre
la estabilidad del ADN en PBS a pH 8,0 en ausencia de etanol. El
experimento se llevó a cabo durante dos semanas a 50ºC usando 20 mcg
de ADN. Los resultados, que se muestran en la Figura 23, indican que
sólo NTA (ácido nitrilotriacético) y DTPA (ácido dietilentriamina
pentaacético) mejoran la estabilidad del ADN en ausencia de etanol.
Los datos de la Figura 23 son consistentes con los resultados
anteriores que se muestran en las Figuras 21 y 22, en los que el
EDTA disminuye la estabilidad del ADN en ausencia de etanol. Estos
resultados sugieren que, entre estos quelantes, solo el DTPA es un
estabilizante de ADN efectivo en ausencia de etanol.
Para examinar la capacidad de los quelantes de
iones metálicos para mejorar la estabilidad del ADN en presencia de
etanol, se llevó a cabo un experimento usando 5 quelantes diferentes
a lo largo de 12 semanas a 50ºC en PBS a pH 8,0. Los resultados, que
se muestran en la figura 24, indican que solo DTPA y EDTA
incrementan de forma significativa la estabilidad del ADN sobre el
PBS control que contiene EtOH al 1%. Sin embargo, DTPA 200 mM
también mejoró la estabilidad del ADN en una cantidad equivalente en
presencia y ausencia de etanol. Estos resultados son consistentes
con un informa publicado (ver Graf y col., 1984 J. Biol.
Chem. 259:3620-3624) en el que los complejos
hierro-DTPA no soportan la generación de radicales
hidroxilo, y por tanto, se esperaría que el etanol no fuera
necesario como secuestrante.
Para determinar la concentración óptima de EDTA
para estabilizar el plásmido de ADN en PBS que contienen EtOH al 1%
a pH 8,0, se llevó a cabo un experimento de estabilidad a lo largo
de 6 semanas a 50ºC usando 20 mcg/ml de ADN. Los resultados, que se
muestran en la Figura 25, indican que en estas condiciones, EDTA 10
\muM proporciona la misma mejora de estabilidad que EDTA 500
\muM. Estos resultados sugieren que EDTA mejora la estabilidad del
ADN enlazando bajas concentraciones de iones metálicos traza
presentes en las formulaciones de tampón o en las preparaciones de
ADN. Basándose en estos datos, un incremento en la concentración del
ADN de 20 mcg/ml a 1,0 mg/ml puede únicamente necesitar un aumento
en la concentración de EDTA de 10 \muM a 500 \muM. Por tanto, el
uso de EDTA y etanol para estabilizar las formulaciones de vacuna de
ADN no requerirán más de 1 mM de EDTA, incluso con vacunas de ADN
con concentraciones de ADN de 2,0 mg/ml.
Nuestros estudios iniciales acerca de los efectos
de los iones de los tampones se llevaron a cabo con tampones que no
habían sido desmetalizados. Sin embargo, puesto que el contenido en
iones metálicos traza de los tampones posiblemente varía,
dependiendo de la pureza del tampón, la estabilidad del ADN en
tampones no desmetalizados puede determinarse en gran medida por el
contenido en iones metálicos traza. Por tanto, puede ser necesario
comparar los efectos de los tampones desmetalizados para determinar
la verdadera influencia de los iones de los tampones sobre la
estabilidad del ADN.
Para examinar los efectos de los diferentes iones
de los tampones sobre la estabilidad, se prepararon cuatro tampones
desmetalizados diferentes. El tampón de control fue PBS
desmetalizado a pH 7,2. Los otros tampones ensayados fueron PBS
desmetalizado conteniendo succinato sódico 10 mM (pH 7,2), PBS
desmetalizado conteniendo malato sódico 10 mM (pH 7,2), bicarbonato
sódico desmetalizado conteniendo NaCl 150 mM,
Tris-Cl 10 mM, NaCl 150 mM (pH 7,8) y tricita 10 mM,
NaCl 150 mM (pH 7,8). Los tampones tris y tricita no se
desmetalizaron debido a que el ion tamponante es catiónico y se
enlaza con la columna Chelex 100. Para el estudio de los tampones
desmetalizados, la vacuna de la gripe se formuló a 20,0 mcg/ml y se
incubó a 50ºC. Los resultados del primer punto temporal (dos
semanas) indican que el PBS desmetalizado control tenía un 75% de
ADN superenrollado inicial remanente, mientras que los tampones
succinato, malato, bicarbonato sódico, tris y tricita tuvieron 98%,
94%, 100%, 31% y 65% del ADN superenrollado inicial remanente. Estos
resultados indican que los tampones desmetalizados que contenían
succinato y malato fueron superiores al PBS desmetalizado, y que el
bicarbonato sódico que contenía NaCl 150 mM fue la formulación más
estable. Aunque no queda claro porqué el bicarbonato de sodio es
superior al PBS, el efecto estabilizante del PBS que contiene
succinato y malato es posible que se deba a la capacidad de estos
compuestos para quelar iones metálicos. Puesto que el succinato y
malato son seguros para uso en productos farmacéuticos, y pueden
usarse a concentraciones relativamente elevadas, estos compuestos
pueden ser la vía más efectiva de quelar iones metálicos traza y, de
esta forma, estabilizar el ADN.
El ADN es susceptible a numerosos procesos
degradantes distintos en medio acuoso, entre los que se incluyen las
reacciones de oxidación con radicales libres, despurinización y
\beta-eliminación. Una hipótesis para minimizar la
velocidad de estos procesos sería liofilizar el ADN, reduciendo de
esta forma el contenido en agua y la movilidad molecular. Para
determinar los efectos de la liofilización sobre la estabilidad del
ADN, se prepararon seis formulaciones liofilizadas diferentes. La
estabilidad del ADN en las muestras liofilizadas se comparó con una
formulación a 20 mgc/ml en PBS líquido, tras un mes de incubación a
37ºC, mediante electroforesis en gel de agarosa. Para preparar las
muestras liofilizadas, se formuló la vacuna de ADN de la gripe a 20
mcg/ml con los estabilizantes apropiados, y se colocaron 0,8 ml de
solución en viales de vidrio de 3 ml. Las muestras se colocaron
seguidamente en el liofilizador, y se congelaron durante el
enfriamiento de la carcasa a aproximadamente -45ºC durante un
periodo de 4 horas. A continuación, se aplicó vacío (20 mTorr, 2,6
Pa), mientras que la temperatura de la carcasa se mantenía entre
-30º y -20º durante 26 horas. A continuación la temperatura de la
carcasa ascendió hasta 0ºC durante 2 horas, a continuación hasta una
temperatura de 25ºC durante 6 horas a una velocidad concreta. A
continuación, se relajó el vacío, y los viales se taparon bajo
atmósfera de nitrógeno.
Los resultados del estudio de liofilización, que
se muestran en la Figura 12, indicaron que el ADN en cuatro de las
seis formulaciones liofilizadas fue mucho más estable que el ADN en
el PBS control líquido, sugiriendo que la liofilización sería una
vía muy efectiva de estabilizar las vacunas de ADN. De forma
interesante, las formulaciones de vacuna de ADN que contiene
azúcares amorfos tales como sacarosa y lactosa estabilizan
fuertemente el ADN, mientras que los azúcares cristalinos tales como
manitol no mejoran la estabilidad del ADN en comparación con la
solución de control (en PBS). Entre los estudios a inicial pronto se
incluyen el uso de tampones desmetalizados para preparar las
muestras de ADN liofilizadas. Puesto que los iones metálicos son muy
perjudiciales para la estabilidad del ADN en estado líquido, las
formulaciones de ADN desmetalizadas y liofilizadas puede
proporcionar una estabilidad muy mejorada respecto de las
formulaciones líquidas.
Para determinar la estabilidad de las vacunas de
ADN liofilizadas, y para determinar los efectos de desmetalizar la
formulación de tampón sobre la estabilidad del ADN liofilizado, se
llevó a cabo un estudio de estabilidad sobre las muestras
liofilizadas a lo largo de 4 meses a 50ºC. Se ensayaron tres
formulaciones, cada una en estado desmetalizado y no desmetalizado.
La concentración de ADN antes de la liofilización fue 20 mcg/ml. Las
condiciones de liofilización fueron las mismas que se han descrito
en esta sección de Ejemplo. Tras cuatro meses de incubación, las
muestras se resuspendieron en agua estéril, y se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa para determinar el % de ADN SC, OC
y lineal. Los resultados, que se muestran en la Figura 26, indican
que la estabilidad de la formulación mejor liofilizada excedieron
las de las formulaciones líquidas. Sin embargo, la estabilidad
predicha a 4 meses de la mejor formulación líquida excedía a la de
las formulaciones liofilizadas 1, 5 y 6. Los datos de estabilidad a
los cuatro meses de las formulaciones líquidas se basaron en
extrapolaciones de los datos de estabilidad a 3 meses (formulaciones
8&9) o a 6 semanas (formulación 7) a 50ºC y 20 mgc/ml de ADN.
Los resultados también indicaron que la desmetalización mejoró la
estabilidad del ADN liofilizado en las formulaciones 1 y 2, pero
tuvo poco efecto sobre el % ADN SC en el resto de formulaciones
liofilizadas. Estos resultados sugieren que la liofilización es una
vía efectiva para estabilizar las vacunas de ADN, y que la
desmetalización de la formulación tampón mejora la estabilidad del
ADN liofilizado en algunas formulaciones.
Los resultados de los estudios sobre estabilidad
del ADN descritos en el presente documento sugieren que, en ausencia
de secuestrantes de radicales libres y de quelantes de iones
metálicos, la oxidación con radicales libres el mecanismo principal
de degradación del ADN durante el almacenamiento. Los datos soportan
también la hipótesis de que los iones metálicos traza y el oxigeno
disuelto en las formulaciones de tampones originan la oxidación del
ADN por radicales libres. Basándose en esta hipótesis, los
principales mecanismos de degradación del ADN en las formulaciones
en las que se controla de forma efectiva la oxidación con radicales
libres (mediante EDTA y etanol) serían los procesos de
despurinización y \beta-eliminación, que se
producen sobre el ADN en medio acuoso (Lindahl y col., 1972
Biochemistry 11: 3610-3618). Si la
despurinización y \beta-eliminación son los
mecanismos predominantes de degradación del ADN durante el
almacenamiento, entonces es posible predecir de forma precisa el %
ADN SC con el tiempo, usando los valores publicados de las
constantes de velocidad de la despurinización y
\beta-eliminación, así como las energías de
activación (E_{a}) de estas reacciones. Sin embargo, los
resultados de diferentes estudios de estabilidad del ADN que
implicaban formulaciones de vacunas de ADN que contenían etanol y
EDTA/EtOH sugerían que el ADN en estas formulaciones es mucho más
estable de lo que se había predicho en función de las constantes de
velocidad publicadas. La razón para esta estabilidad del ADN
superior a la esperada en las formulaciones que contienen etanol
puede deberse a los niveles mucho menores de oxidación con radicales
libres. Esta hipótesis es consistente con la técnica conocida que
describe el etanol como un secuestrante efectivo de los radicales
hidroxilo. Por tanto, para determinar la estabilidad inherente del
ADN en medio acuoso, se inició un estudio de estabilidad con ADN a
100 mcg/ml en PBS que contenía EtOH al 1% y EDTA 0,5 mM a pH 7,4.
Para controlar aún más la oxidación con radicales libres del ADN,
las soluciones se colocaron en ampollas de vidrio selladas. Las
ampollas se incubaron a 40, 50, 60 y 80ºC. Tras varios periodos de
tiempo, las ampollas se sacaron de la incubadora, y las soluciones
se ensayaron para %ADN SC, en presencia y ausencia de Exonucleasa
III de E. coli, para determinar el número de emplazamientos
AP (apurínicos) por plásmido, y para determinar las constantes de
velocidad de la despurinización (k_{1}) y
\beta-eliminación (k_{2}). Se registra a
continuación una descripción del ensayo de emplazamiento AP y del
procedimiento para determinar las constantes de velocidad de la
despurinización (k_{1}) y \beta-eliminación
(k_{2}).
Este ensayo se basa en la conversión de plásmido
de ADN superenrollado (que contienen emplazamientos AP) a la forma
circular abierta, después de tratamiento con Exonucleasa III. La
Exonucleasa III de E. Coli tiene una actividad asociada
AP-endonucleasa que romperá el esqueleto de ADN en
los emplazamientos AP, dejando un ADN que carece de emplazamientos
AP completamente superenrollados. Puesto que el plásmido de ADN
superenrollado que contiene un único emplazamiento AP por plásmido
se convierte completamente a ADN circular abierto mediante Exo III,
el ensayo es lo suficientemente sensible para detectar la presencia
de emplazamientos AP cuando solo 5 a 10% de las moléculas de ADN
contienen un emplazamiento AP.
El ensayo se lleva a cabo incubando 100 ng de
plásmido de ADN con y sin 0,25 unidades de Exo III durante 30
minutos a 37ºC en un volumen total de 365 ml. Se somete a
continuación una alícuota del ADN (18 ng) a electroforesis en gel de
agarosa y tinción con bromuro de etidio. El negativo de la
fotografía del gel se escanea a continuación, y los resultados se
comparan con patrones de ASD superenrollado, circular abierto y
lineal que se aplican al mismo gel, para permitir la cuantificación
de cada una de las formas del ADN. Para determinar el número de
emplazamientos AP en una muestra de ADN, usamos los datos del
porcentaje del ADN superenrollado antes y después del tratamiento
con Exo III. Por ejemplo, si una muestra de ADN tenía un 90% de
superenrollado antes del tratamiento, y 50% de superenrollado
después del tratamiento, el cálculo del número de los emplazamientos
AP sería como sigue. En primer lugar, basado en trabajos anteriores,
suponemos que la velocidad de despurinización es independiente de la
secuencia de ADN, y que la introducción de emplazamiento AP sigue
una distribución de Poisson. A continuación, se usa una ecuación que
describe el número de roturas en la cadena en una población de
moléculas de ADN (SB) en función de la fracción de ADN que está
superenrollada (f_{1}).
- SB = - ln f_{1}
Para un ADN que está superenrollado en un 90%, el
número de roturas de cadena por plásmido, en promedio, es:
- SB = - ln (0,90) ó 0,104
Para un ADN que está superenrollado en un
50%:
- SB = - ln (0,50) ó 0,693
Por tanto, la diferencia entre 0,693 y 0,105
(0,588) es el número de roturas de cadena introducidas por rotura
del ADN en los emplazamientos AP, y por tanto es igual al número de
emplazamientos AP en el ADN.
Para determinar las constantes de velocidad de la
despurinización (k_{1}) y \beta-eliminación
(k_{2}) es necesario en primer lugar derivar una ecuación que
establezca la relación matemática entre estas constantes de
velocidad y algún parámetro de estabilidad del ADN que se puede
medir de forma sencilla. En este caso, hemos derivado una ecuación
que establece la relación entre el número de roturas de cadena por
plásmido (SB) y el número de emplazamientos AP por plásmido con
k_{1} y k_{2}. Puesto que acabamos de describir la relación
entre SB y el % ADN SC (ver antes), podemos usar los datos de
estabilidad del ADN (midiendo el % ADN SC con el tiempo) y el ensayo
de emplazamientos AP para determinar k_{1} y k_{2} en las
formulaciones de vacuna de ADN que contienen ETA y etanol.
En una población de moléculas, podemos empezar
con la hipótesis de que el número de roturas de cadena pos plásmido
(SB) en cualquier punto temporal es igual al número total de
emplazamientos AP producidos hasta ese momento (TAP) menos el número
de emplazamientos AP que quedan, por plásmido (AP). Para simplificar
los cálculos, podremos también asumir que el ADN de partida no
contiene emplazamientos AP o roturas de cadena a tiempo cero.
Así,
- SB = TAP - AP
Puesto que TAP = k_{1}(PB)t,
donde k_{1} es la constante de velocidad de la despurinización, PB
= número de bases de purina y t = tiempo. Así,
- SB = k_{1}(PB)t - AP
Sin embargo, AP debe expresarse en términos de
k1, k2 y PB. Por tanto, la velocidad de variación de AP se iguala a
la velocidad de producción de emplazamientos AP menos la velocidad
de conversión a roturas de cadena. A continuación, se obtiene AP
mediante integración.
- dAP/dt = k_{1} (PB) – k_{2} (AP)
- dAP = k_{1} (PB) dt – k_{2} (PB) dt
- \int dAP = \int k_{1} (PB) dt - \int k_{2} (PB) dt
Suponiendo que AP inicial es cero, entonces;
- \int k_{2} (PB) dt = k_{2} (PB) t \hskip0,5cm y;
- AP = k_{1} (PB) t – k_{2} (PB) t
A continuación, resolviendo para AP;
- AP = k_{1} (PB) t / 1 + k_{2}t
A continuación, sustituyendo esta forma de AP en
nuestra ecuación para SB, se obtiene una ecuación que indica el
número de roturas de cadena por plásmido en cualquier tiempo.
- SB = k_{1} (PB) t – [k_{1} (PB) t / 1 + k_{2} t]
O, SB puede expresarse en términos de AP
Puesto que \int k_{2} (AP) dt = k_{2} (AP)
t, y \int k_{2} (AP) dt = SB
Entonces, SB = k_{2} (AP) t
Usando las ecuaciones anteriores, se determinaron
k_{1} y k_{2} para una formulación de vacuna de ADN que
contienen EDTA y etanol a 40, 50, 60 y 80ºC. Los resultados se
muestran en la Tabla 16. La Tabla 16 muestra también un comparación
entre los valores medidos y publicados de k_{1} y k_{2} para el
mismo pH y temperatura. A 50ºC, k_{1} en esta formulación es casi
7 veces inferior al valor publicado, determinado al mismo pH y
temperatura. Los resultados indican claramente que los valores de
k_{1} y k_{2} en esta formulación son mucho más pequeños que las
constantes de velocidad publicadas (Lindahl y col., 1972
Biochemistry 11: 3610-3618). Esta conclusión
sugiere que si se controla de forma efectiva la oxidación con
radicales libres del ADN, entonces el ADN es más estable de lo que
se habría pensado, en función de las constantes de velocidad de la
despurinización (k_{1}) y \beta-eliminación
(k_{2}) publicadas. Más aún, los resultados sugieren que las
constantes de velocidad publicadas son erróneamente elevadas, debido
a una oxidación con radicales libres incontrolada.
Para determinar las energías de activación para
la despurinización (k_{1}) y \beta-eliminación
(k_{2}) en presencia de EDTA/EtOH y para determinar si el
mecanismo de degradación en PBS que contiene EDTA/EtOH se debe de
forma predominante a la despurinización y
\beta-eliminación, se usaron los datos anteriores
para dibujar gráficas de Arrhenius. Los resultados se muestran en
las Figuras 29 y 30. Los resultados indican que las energías de
activación para la despurinización y
\beta-eliminación son 118,9 y 105,9 kJ/mol (28,4 y
25,2 kcal/mol, respectivamente). Estos valores concuerdan
extremadamente bien con los valores publicados de 128 \pm 8 kj/mol
(31 \pm 2 kcal/mol) y 117 kj/mol (28 kcal/mol) para la
despurinización ((Lindahl y col., 1972 Biochemistry 11:
3610-3618; Creer y Zamenhof, 1962, J. Mol.
Bio. 4 : 123), y 102,6 kj/mol (24,5 kcal/mol) para la
\beta-eliminación (Lindahl y col., 1972
Biochemistry 11: 3618). Estos datos sugieren que los
mecanismos principales de degradación en PBS que contiene EDTA/EtOH
son la despurinización y \beta-eliminación, y que
el mecanismo de estas reacciones no se altera por la presencia de
EDTA y etanol. Estos datos también permiten la predicción del
porcentaje de ADN superenrollado remanente para los estudios de
estabilidad de ADN realizados a diferentes temperatura (a pH 7,4),
siempre que la formulación controle de manera efectiva la oxidación
con radicales libres.
Para demostrar la estabilidad del ADN en una
formulación de vacuna de ADN que contienen EDTA 100 mM y etanol al
1% (a pH 7,4) es muy superior al predicho por las constantes de
velocidad publicadas, los datos de estabilidad del ADN se
representan más adelante (Figura 31), junto con dos predicciones de
estabilidad. Los resultados indican claramente que el ADN de esta
formulación es mucho más estable de los que los datos de las
constantes de velocidad publicadas permitían sugerir. Más aún, los
resultados indican que las constantes de velocidad determinadas
experimentalmente permiten una predicción de la estabilidad del ADN
mucho mejor que usando las constantes de velocidad publicadas.
Usando las constantes de velocidad determinadas
experimentalmente (k1 y k2), y las relaciones derivadas entre las
constantes de velocidad y el % ADN SC, es posible predecir el pH de
la formulación que se requeriría para conseguir una estabilidad a
largo plazo a temperatura ambiente. Estas predicciones (ver Figura
32) sugieren que el pH de una formulación de vacuna de ADN
(conteniendo EDTA/EtOH) debería ser de aproximadamente 8,0 , con el
fin de mantener mas del 50% de ADN SC durante dos años a 30ºC en una
ampolla de vidrio.
Estos resultados muestran que el EDTA/EtOH
controla de forma efectiva la oxidación con radicales libres en
formulaciones de vacuna de ADN, y por tanto mejoran la estabilidad
del ADN a niveles que no se esperaban, basándose en el uso de las
constantes de velocidad de la despurinización y
\beta-eliminación.
Claims (19)
1. Un procedimiento para estabilizar una
preparación de vacuna de ácido nucleico o producto para terapia
génica que comprende plásmido de ADN superenrollado purificado, el
procedimiento comprende introducir la mencionada preparación en una
formulación que comprende:
- (a)
- Un quelante de iones metálicos
- (b)
- Un agente secuestrante no reductor de radicales libres, seleccionado entre alcohol etílico, glicerol, metionina, dimetil sulfóxido, y combinaciones de los anteriores; y
- (c)
- Un tampón
dando como resultado una
preparación de ADN
estabilizado
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que los iones metálicos se han retirado de la preparación de
plásmido de ADN superenrollado.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la formulación tampón se selecciona del grupo constituido por
Tris-HCl, glicina, fosfato de sodio, fosfato de
potasio, fosfato de litio, succinato de sodio, succinato de potasio,
succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio, malato de
litio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio, bicarbonato de
litio, y combinaciones de los anteriores.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el
que el quelante de iones metálicos se selecciona del grupo
constituido por EDTA, DTPA, NTA, hexafosfato de inositol,
tripolifosfato, ácido polifosfórico, succinato de sodio, succinato
de potasio, succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio,
malato de litio, y combinaciones de los anteriores.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en el que la formulación además
comprende una sal.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que la sal se selecciona entre NaCl, KCl, LiCl, y combinaciones de
los anteriores.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el
que el quelante de iones metálicos es EDTA a una concentración de
hasta 5 mM, el secuestrante no reductor de radicales libres es
etanol a una concentración de hasta el 3% v/v, el tampón es
tris-HCl a una pH entre 8,0 y 9,0, y la sal es NaCl
a una concentración entre 50 mM y 500 mM.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en el que el plásmido de ADN
superenrollado se selecciona del grupo constituido por ADN del virus
de la gripe, ADN del virus de la hepatitis A, ADN del virus de la
hepatitis B, ADN del virus de la hepatitis C, ADN del virus del
papiloma humano, ADN de Mycobacterium tuberculosis, ADN del
virus de la inmunodeficiencia humana. ADN del virus varicela zoster,
ADN del virus del sarampión, ADN de rotavirus, ADN del virus de las
paperas, ADN del virus de la rubéola, y combinaciones de los
anteriores.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8 en el que el plásmido de ADN superenrollado
codifica pro-
ductos genéticos de nucleoproteína, hemaglutinina, matriz, no estructural o polimerasa del virus de la gripe humana.
ductos genéticos de nucleoproteína, hemaglutinina, matriz, no estructural o polimerasa del virus de la gripe humana.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores que comprende además las etapas de
colocar la preparación de ADN estabilizado en una segunda
formulación que comprende un azúcar amorfo y liofilizar la solución
resultante.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el azúcar amorfo es sacarosa o lactosa.
12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores que comprende además el
almacenamiento de la preparación estabilizada en ausencia de
luz.
13. Una preparación de vacuna de ácido nucleico o
producto para terapia génica que comprende:
- (a)
- plásmido de ADN superenrollado;
- (b)
- tampón tris-HCl a un pH entre 8,0 y 9,0;
- (c)
- etanol hasta un 3% v/v;
- (d)
- EDTA en un intervalo de concentraciones de hasta 5 mM; y
- (e)
- NaCl a una concentración de 50 mM a 500 mM.
14. La preparación estabilizada de la
reivindicación 13 en la que los iones metálicos se han eliminado del
plásmido de ADN superenrollado.
15. La preparación estabilizada de la
reivindicación 13 o la reivindicación 14, en la que la concentración
de NaCl es de 100 mM a 200 mM.
16. Una preparación estabilizada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el pH del
tampón es de 8,5 a 9,0.
17. Una preparación estabilizada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que el EDTA está
presente a una concentración de hasta 500 \muM.
18. Una preparación estabilizada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en la que el etanol está
presente a una concentración de hasta 2%.
19. Una preparación estabilizada de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que el plásmido de
ADN superenrollado se selecciona entre el grupo constituido por ADN
del virus de la gripe, ADN del virus de la hepatitis A, ADN del
virus de la hepatitis B, ADN del virus de la hepatitis C, ADN del
papilomavirus humano, ADN de Mycobacterium tuberculosis, ADN
del virus de la inmunodeficiencia humana, ADN del virus varicela
zoster, ADN del virus del herpes, ADN del virus de la varicela, ADN
de rotavirus, ADN del virus de las paperas, ADN del virus de la
rubéola, y combinaciones de los anteriores.
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