ES2950887T3 - Purificación del Virus Zika - Google Patents
Purificación del Virus Zika Download PDFInfo
- Publication number
- ES2950887T3 ES2950887T3 ES16826741T ES16826741T ES2950887T3 ES 2950887 T3 ES2950887 T3 ES 2950887T3 ES 16826741 T ES16826741 T ES 16826741T ES 16826741 T ES16826741 T ES 16826741T ES 2950887 T3 ES2950887 T3 ES 2950887T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- zika virus
- zika
- virus
- particles
- infectious
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 31
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 45
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 41
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 claims description 68
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 60
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 60
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 60
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 36
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 35
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 28
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 26
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 14
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 12
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 229940124956 Ixiaro Drugs 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 229940124743 Zika virus vaccine Drugs 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000013315 hypercross-linked polymer Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 4
- 101000619564 Homo sapiens Putative testis-specific prion protein Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 102100022208 Putative testis-specific prion protein Human genes 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 3
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 208000001455 Zika Virus Infection Diseases 0.000 description 2
- 208000035332 Zika virus disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 2
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012534 cell culture medium component Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- ZKEHTYWGPMMGBC-XUXIUFHCSA-N Ala-Leu-Leu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZKEHTYWGPMMGBC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 101001055091 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026907 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[Al] Chemical compound O.O.O.[Al] MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- GGVZJDBDOZDSMR-UHFFFAOYSA-N africanone Natural products CC1CCC2=C(C1=O)C(C)(C)CC3CC23C GGVZJDBDOZDSMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L disulfite Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])(=O)=O WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000012787 harvest procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940043026 inactivated japanese encephalitis virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000029302 virus maturation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
- C07K14/1816—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus), border disease virus
- C07K14/1825—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/06—Inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
En el presente documento se describen procesos para purificar partículas infecciosas del virus Zika y usos de protamina en dichos procesos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Purificación del Virus Zika
CAMPO
La divulgación se refiere a métodos para la purificación de virus Zika para su uso en vacuna
AN TECED EN TES
Los organismos reguladores, como la Organización Mundial de la Salud, establecen normas y directrices para la producción de composiciones farmacéuticas administradas a seres humanos, como las vacunas, que limitan la cantidad y los componentes de las composiciones. Cumplir estas normas es especialmente difícil en lo que respecta a la producción de vacunas que contienen agentes biológicos, como los virus, que deben propagarse en sustratos celulares. Dichos preparados vacunales deben ser estériles (es decir, libres de organismos que se repliquen independientemente) y no pueden contener más de 10 ng de ADN de células huésped por dosis humana, entre otros requisitos. Estas normas tienen por objeto garantizar la seguridad de la composición para la administración humana, pero pueden plantear problemas en el desarrollo de los procesos utilizados para producir dichas composiciones.
La protamina se aisló originalmente del esperma del salmón y otras especies de peces, pero ahora se produce principalmente mediante biotecnología recombinante. Es un péptido altamente catiónico que se une a moléculas cargadas negativamente, como los ácidos nucleicos, para formar un par iónico estable. Su uso para eliminar el ácido nucleico de la célula huésped está bien documentado.
Cox et al. (2015, Predicting Zika virus structural biology: challenges and opportunities for intervention. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 24(3-4): 118-126. DOI: 10.1177/2040206616653873) predice las estructuras de las proteínas del virus del zika basándose en la homología con otros flavivirus. Srivastava et al. (2001, A purified inactivated Japanese encephalitis virus vaccine made in Vero cells, Vaccine, 19(31): 4557-4565. DOI: 10.1016/s0264-410x(01 )00208-0) divulga una vacuna inactivada purificada de segunda generación contra el virus de la encefalitis japonesa (EJ).
RESUMEN
Durante el curso de la purificación rutinaria del virus, se observó que la adición de sulfato de protamina a una cosecha de virus Zika producida en un sustrato celular eliminaba no sólo el ADN contaminante derivado de las células huésped, como era de esperar, sino que sorprendentemente también eliminaba prácticamente las partículas de virus inmaduras y por lo demás no infecciosas de la preparación. Este hallazgo proporciona un proceso racionalizado, suave y reproducible para obtener partículas infecciosas del virus Zika altamente purificadas para aplicaciones como la preparación de vacunas contra el Zika; además, el proceso no depende de la carga de la partícula del virus Zika.
En el presente documento se describen procesos posteriores para purificar partículas del virus Zika a partir de una preparación en bruto. El proceso posterior puede aplicarse tanto a un virus Zika que no se haya adaptado a la propagación en un sustrato celular concreto como a una partícula de virus Zika parcial o totalmente adaptada al sustrato celular. Los aspectos y las formas de realización de la presente invención se exponen en las reivindicaciones.
Aspectos de la invención proporcionan procesos para la purificación de partículas infecciosas del virus Zika que comprenden las etapas de (a) proporcionar una cosecha bruta (a) que comprende partículas de virus e impurezas, donde las impurezas se generan a partir del cultivo de dichas partículas de virus en un sustrato celular; (b) reducir las impurezas de la cosecha cruda (a) mediante el uso de sulfato de protamina para separar las partículas infecciosas del virus del Zika de las partículas no infecciosas del virus del Zika para obtener una preparación del virus (b); y (c) purificar aún más la preparación del virus del Zika (b) utilizando una o más etapas de purificación por exclusión de tamaño seleccionadas entre: (i) una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, (ii) una matriz de fase sólida (como se describe en el presente documento) y (iii) cromatografía de exclusión por tamaño, para obtener una preparación del virus del Zika (c) que comprende las partículas infecciosas del virus del Zika.
En algunas formas de realización, la concentración de sulfato de protamina en la etapa (b) es de aproximadamente 1 a 10 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 5 mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 2 mg/ml. En una forma de realización, la concentración de sulfato de protamina en la etapa (b) es de aproximadamente 2 mg/ml. En una forma de realización, la concentración de sulfato de protamina es de 1,2 a 1,8 mg/ml, más preferiblemente de 1,4 a 1,6 mg/ml. En una forma de realización preferida, la concentración de sulfato de protamina en la etapa (b) es de aproximadamente 1,6 mg/ml o aproximadamente 2 mg/ml.
En algunas formas de realización, el ADN residual de la célula huésped de la preparación vírica (e) es inferior a 1 Mg/ml, especialmente inferior a 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 o 200 ng/ml, preferiblemente inferior a 100 ng/ml. En una forma de realización preferida, el ADN residual de la célula huésped de la preparación vírica (c) es inferior a 10 ng/ml. En algunas formas de realización, la proteína residual de la célula huésped de la preparación final del virus (c) es inferior a 10 Mg/ml, especialmente inferior a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 Mg/ml, preferiblemente inferior a 1 Mg/ml. En
una forma de realización preferida, la proteína residual de la célula huésped de la preparación vírica (c) es inferior a 100 ng/ml. En algunas formas de realización, las partículas víricas residuales no infecciosas de la preparación vírica final (c) es inferior a 10 pg/ml, especialmente inferior a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 pg/ml, preferiblemente inferior a 1 pg/ml. En una forma de realización preferida, las partículas víricas residuales no infecciosas de la preparación vírica (c) es inferior a 100 ng/ml.
En algunas formas de realización, la protamina residual es inferior a 1 μg/ml, especialmente inferior a 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 o 200 ng/ml, preferiblemente inferior a 100 ng/ml, más preferiblemente está por debajo del límite de detección de HPLC, en particular por debajo del límite de detección en la sustancia farmacológica final. En algunas formas de realización, el contenido de PS se comprueba mediante HPLC o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC ). Por ejemplo, la HPLC está validada para la determinación de PS en muestras de conjunto de gradiente de sacarosa de JE V como un ensayo de liberación de rutina y es muy sensible (es decir, LOQ 3 μg/ml; LOD 1 μg/ml). En la invención actual, el contenido de PS en las muestras de SD del virus Zika era <LOD. En una forma de realización, la evaluación por HPLC del contenido de PS puede realizarse en una columna Superdex Peptide 10/300GL (GE: 17 5176-01) utilizando acetonitrilo al 30%, ácido trifluoroacético al 0,1% como disolvente con un caudal de 0,6 ml/min a 25°C y detección a 214 nm. Un método más sensible para medir la protamina residual en una preparación de virus purificada es la espectrometría de masas (EM). En algunas formas de realización, los niveles residuales de PS en una preparación del virus Zika se analizan mediante MS u otro método de alta sensibilidad, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (NMR). Con este método, la PS residual, así como los fragmentos y/o productos de descomposición de la PS, pueden detectarse en cantidades traza, como niveles tan bajos como, por ejemplo, 106, 107 o 108 moléculas por carga de muestra típica. En algunas formas de realización, los niveles de PS se analizan en el grupo de gradiente de sacarosa. En algunas formas de realización, los niveles de PS se analizan en el medicamento. En algunas formas de realización, los niveles de PS se analizan en la sustancia activa.
En algunas formas de realización, la cosecha bruta (a) que comprende las partículas de virus y las impurezas se somete a una o más etapa(s) de pre-purificación antes de la etapa (b). En algunas formas de realización, la(s) etapa(s) de pre-purificación comprende(n) la digestión del ADN genómico de la célula huésped en la cosecha bruta (a) que comprende las partículas de virus y las impurezas mediante tratamiento enzimático. En algunas formas de realización, la(s) etapa(s) de pre-purificación comprende(n) filtración, ultrafiltración, concentración, intercambio de tampón y/o diafiltración. En algunas formas de realización, la una o más etapas de pre-purificación es la filtración utilizando un filtro que tiene un tamaño de poro igual o inferior a 1 μm. En algunas formas de realización, el filtro tiene un tamaño de poro igual o inferior a 0,2 μm. En una forma de realización preferida, el filtro tiene un tamaño de poro de 0,2 μm. En algunas formas de realización, la concentración y/o ultra/diafiltración y/o intercambio tampón se realiza por filtración de flujo tangencial (TFF). En algunas formas de realización, la ultra/diafiltración de la cosecha bruta (a) que comprende las partículas de virus y las impurezas se lleva a cabo utilizando una membrana de fibra hueca que tiene un corte igual o inferior a 300 kDa. En una forma de realización preferida, la membrana de fibra hueca tiene un corte de 100 kDa.
En algunas formas de realización, la partícula de virus Zika es un virus Zika vivo, un virus quimérico, un virus vivo atenuado, un virus vivo modificado o un virus vivo recombinante. En un paso posterior, las partículas del virus Zika de la invención pueden inactivarse opcionalmente. En algunas formas de realización, la partícula del virus Zika es una forma atenuada de la partícula del virus. Por ejemplo, el virus Zika puede tener una infectividad, virulencia y/o replicación reducidas en un huésped, en comparación con un virus Zika de tipo salvaje. En algunas formas de realización, el virus Zika es un virus Zika mutado o modificado, por ejemplo, el ácido nucleico del virus Zika puede contener al menos una mutación relativa al virus Zika de tipo salvaje. En algunas formas de realización, el virus Zika es un virus Zika recombinante vivo, es decir, un virus Zika que se genera de forma recombinante y puede contener ácido nucleico de diferentes fuentes.
En algunas formas de realización, la partícula de virus Zika es un virus vivo, un virus vivo atenuado, un virus vivo modificado o un virus vivo recombinante. En una forma de realización preferida, el virus Zika es un virus Zika de linaje asiático.
En algunas formas de realización, la reducción relativa de impurezas de la preparación final del virus del Zika en relación con el medio líquido (a) que comprende las partículas del virus del Zika y las impurezas está en un intervalo del 60 al 95%. En algunas formas de realización, la impureza residual de la preparación final del virus Zika es inferior al 1%. Observamos una disminución de los picos de HCP y de los picos de agregados no infecciosos en el HPLC-S EC o SDS-PAGE. Una cuantificación exacta es difícil, pero se puede medir la densidad de las bandas SD S-PAGE y otros métodos.
En algunas formas de realización, el virus Zika se propaga en una línea celular seleccionada del grupo que consiste en una línea celular EB66, una línea celular Vero, una línea celular Vero-aHis, una línea celular HeLa, una línea celular HeLa-S3, una línea celular 293, una línea celular PC12, una línea celular CHO, una línea celular 3T3, una línea celular PerC6, una línea celular MDSK, una línea celular de fibroblastos embrionarios de pollo, una línea celular de pato y una línea celular aviar diploide. En algunas formas de realización, dicha línea celular es una línea celular de pato. En algunas formas de realización, dicha línea celular es una línea celular aviar diploide. En algunas formas de realización, dicha línea celular es la línea celular EB66. En una forma de realización preferida, dicha línea celular es una línea celular Vero.
Aspectos de la invención proporcionan un uso de cualquiera de los procesos aquí descritos para fabricar una composición para inmunización contra una infección viral por Zika. En una forma de realización preferida, la composición es una vacuna. En una forma de realización, la composición o vacuna está dirigida contra un virus Zika del linaje asiático.
Otros aspectos proporcionan composiciones que comprenden las partículas del virus del Zika obtenibles por cualquiera de los procesos descritos en el presente documento para tratar y/o prevenir una infección viral del Zika. En una forma de realización, la infección por el virus Zika está causada por un virus Zika de linaje asiático.
En algunas formas de realización, el virus Zika se deriva del linaje asiático. En algunas formas de realización, el virus Zika es un virus Zika como se describe parcial o totalmente en la sección Secuencia de esta solicitud, es decir, cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 2 a 69 o 72, en particular todos los virus Zika parcial o totalmente descritos de los linajes asiáticos o una variante inmunogénica de los mismos. Las variantes inmunogénicas del virus Zika o del virus Zika de los linajes asiáticos se definen en el presente documento como aquellas que tienen al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las secuencias descritas en cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 2 a 69 o 72, especialmente al menos un 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
En algunas formas de realización, el proceso de la invención da como resultado un enriquecimiento de partículas infecciosas del virus del Zika a partir de la cosecha bruta que comprende partículas infecciosas del virus del Zika y partículas no infecciosas del virus del Zika y otros productos del virus del Zika de tal manera que el enriquecimiento de las partículas infecciosas del virus del Zika es de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, preferiblemente al menos el 80%, especialmente el 85% en relación con el contenido total de partículas víricas de la cosecha bruta (a) que comprende las partículas del virus del Zika y las impurezas.
En algunas formas de realización, la impureza residual de la preparación final del virus Zika con respecto a todas las impurezas de la cosecha cruda es inferior al 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, preferiblemente inferior al 5%, según se determine mediante SEC-HPLC (cromatografía de exclusión por tamaño - HPLC).
En algunas formas de realización, la etapa de filtración de la preparación del virus de Zika (b) tras el contacto con la matriz en fase sólida se realiza utilizando un filtro con un tamaño de poro igual o superior a 1 μm. En algunas formas de realización, el filtro tiene un tamaño de poro igual o superior a 0,2 μm. En una forma de realización preferida, el filtro tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 pm, como 0,22 pm.
En algunas formas de realización, el virus Zika se propaga en una línea celular seleccionada del grupo que consiste en una línea celular EB66, una línea celular Vero, una línea celular Vero-aHis, una línea celular HeLa, una línea celular HeLa-S3, una línea celular 293, una línea celular PC12, una línea celular CHO, una línea celular 3T3, una línea celular PerC6, una línea celular MDSK, una línea celular de fibroblastos embrionarios de pollo, una línea celular de pato y una línea celular aviar diploide. En algunas formas de realización, dicha línea celular es una línea celular de pato. En algunas formas de realización, dicha línea celular es una línea celular aviar diploide. En algunas formas de realización, dicha línea celular es la línea celular EB66. En una forma de realización preferida, dicha línea celular es una línea celular Vero.
La divulgación proporciona el uso de cualquiera de los procesos descritos en el presente documento para la fabricación de una composición para la inmunización contra una infección por el virus Zika. La composición puede ser una vacuna. La vacuna puede administrarse al sujeto una, dos o tres o más veces, preferiblemente una o dos veces.
Los datos in vivo divulgados en el presente documento relativos a la inmunogenicidad de la vacuna inactivada contra el virus del Zika indican que el virus es sorprendentemente potente desde el punto de vista inmunogénico y también con alta inmunidad cruzada (inmunogenicidad muy similar en las cepas africanas y asiáticas). Los datos indican que la inmunogenicidad fue inesperadamente superior a la de la vacuna inactivada contra el virus del Zika de la que se ha informado recientemente (Larocca, et. al, 2016, Nature doi:10.1038/naturel8952.). Los virus inactivados se encuentran entre las vacunas más seguras y se prefieren especialmente para su administración a poblaciones en las que la seguridad es especialmente preocupante, como las mujeres embarazadas, los niños y las personas inmunodeprimidas, lo que hace que el virus del Zika inactivado aquí descrito sea especialmente adecuado. Obtener un título elevado de virus inactivado es un reto sobre el terreno. El proceso aquí descrito para purificar el virus Zika inactivado da como resultado no sólo un alto rendimiento, sino también una sustancia farmacológica muy pura.
BR EV E DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. Las figuras son meramente ilustrativas y no son necesarias para la habilitación de la divulgación. Por motivos de claridad, es posible que no todos los componentes estén etiquetados en todos los dibujos, las alineaciones se realizaron con el paquete de alineación múltiple Jalview (Waterhouse et al., 2009, Bioinformatics 25 (9) 1189-1191). En los dibujos:
Figura 1 : Árbol de distancia medio (por % de identidad, nt), genomas completos.
Figura 2 : Árbol de unión de vecinos (por % de identidad, nt), genomas completos.
Figura 3 : Alineación por pares-Jalview (% de identidad, nt), genomas completos.
Figura 4 : Árbol de distancia medio (por % de identidad, aa), proteína E.
Figura 5 : Árbol de unión de vecinos (por % de identidad, aa), proteína E.
Figura 6 : Alineación por pares-Jalview (% de identidad, aa), proteína E.
Figura 7 : Alineación (sombreado: % de identidad, aa), proteína E.
Figura 8 : Un ejemplo de maduración de partículas víricas en la célula huésped. Como se observa en los flavivirus, la maduración completa de las partículas requiere la escisión proteolítica de la glicoproteína de membrana precursora (prM) por la proteasa furina del huésped. No todas las moléculas de prM se escinden, lo que da como resultado la liberación de conformaciones maduras, en mosaico o de tipo inmaduro de las células. Las formas de mosaico e inmaduras generalmente no son infecciosas, solo los viriones maduros son infecciosos y tienen actividad de hemaglutinina (HA)/TCID50. (Figura adaptada de Plevka, et al., La maduración de los flavivirus comienza en uno o más centros de nucleación icosaédricamente independientes, EMBO reports (2011) 12, 602-606).
Figura 9 : Un proceso de purificación de virus en sentido descendente ejemplar desde la cosecha bruta hasta la formulación de la sustancia farmacéutica (vacuna) (A). En (B) se muestra un diagrama de flujo de un proceso de inactivación de virus ejemplar.
Figura 10 : El tratamiento con PS da como resultado la eliminación selectiva de los agregados del virus del Zika y las impurezas Vero HCP y LMW (SEC-HPLC del día 5 de recolección del virus del Zika concentrado 30x).
Figura 11 : SEC-HPLC de recolección de Zika concentrado 30x individuales antes del tratamiento con PS en diferentes puntos temporales.
Figura 12 : SEC-HPLC de Zika concentrado 30x individuales después del tratamiento con PS en diferentes puntos temporales. El gráfico más pequeño indica el efecto citopático observado (CPE) a lo largo del tiempo.
Figura 13: Preparación del gradiente de sacarosa.
Figura 14 : Se muestra una SDS-PAGE representativa de la recolección de gradiente de sacarosa de una purificación de Zika.
Figura 15: Comparación de los programas/rendimientos de recolección de JE V y ZikaV.
Figura 16 : Perfil de elución de SEC-HPLC de ZikaV NIV. Los datos se procesaron en la columna Dionex Ultimate 3000 / Superose 6 Increase. Ambos paneles son del mismo cromatograma. El gráfico superior es el perfil de elución completo; el gráfico inferior es una ampliación del pico de elución de ZIKAV.
Figura 17: Análisis SEC-M ALLS de ZikaV inactivado.
Figura 18: Distribución acumulativa del tamaño de partículas de Zika NIV.
Figura 19 : Representación gráfica de la neutralización del virus del Zika H/PH2013 con sueros de ratón agrupados. El número de placas sin suero se estableció en el 100%. La EC50 se calculó usando el método de 3 parámetros. Figura 20 : Representación gráfica de la neutralización del virus del Zika MR766 con sueros de ratón agrupados. El número de placas sin suero se estableció en el 100%. La EC50 se calculó usando el método de 3 parámetros. Figura 21 : Correlación entre contenido de antígeno de JE V en virus inactivado neutralizado (NIV) analizado por ELISA y SEC-HPLC (columna Dionex Ultimate 3000, Superose 6).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen procesos para la purificación de partículas infecciosas del virus del Zika, es decir, partículas maduras y funcionales del virus del Zika. Los procesos divulgados se caracterizan por la eliminación de subproductos no deseados de la producción del virus Zika en células huésped, como partículas no infecciosas del virus Zika y subproductos agregados e inmaduros del virus Zika. Los procesos aquí proporcionados permiten la producción de preparados de virus Zika altamente purificados que comprenden partículas de virus Zika mayoritariamente infecciosas. En el transcurso de la invención, se observó que el sulfato de protamina (PS), añadido para eliminar el ADN contaminante durante la purificación del virus Zika, no sólo daba lugar a la eliminación del ADN contaminante, sino también a la pérdida de un alto porcentaje del total de partículas del virus Zika presentes en la preparación. Sorprendentemente, sin embargo, la cuantificación del total de partículas infecciosas del virus Zika por
TCID50 antes y después del tratamiento con PS reveló que el número absoluto de partículas infecciosas del virus Zika no cambió tras esta pérdida de partículas totales del virus Zika. Esta observación muestra claramente que el tratamiento con PS puede facilitar la eliminación selectiva de subproductos virales no infecciosos, agregados e inmaduros, dejando atrás las partículas infecciosas del virus Zika. Dado que los subproductos producidos durante el crecimiento del virus Zika en las células huésped pueden tener propiedades inmunológicas diferentes (e indeseables) u otros efectos secundarios no deseados o problemas de seguridad, una forma sencilla y sólida de eliminar estos subproductos es de gran importancia para la calidad y seguridad del producto final.
Las protaminas son pequeñas proteínas nucleares ricas en arginina, presentes en grandes cantidades en el esperma de los peces, que desempeñan un papel importante en el empaquetamiento del ADN durante la espermatogénesis. El sulfato de protamina (o ''protamina'' o "PS") puede formar un par iónico estable con la heparina, por lo que se utiliza habitualmente durante determinadas intervenciones quirúrgicas cuando ya no es necesario el efecto anticoagulante de la heparina. En grandes dosis, el sulfato de protamina administrado solo también puede tener un efecto anticoagulante débil (“Protamine sulfate”. Wikipedia: The Free Encyclopedia. Wikimedia Foundation, Inc. 30 Sep 2015 Web. 26 Nov 2015 <https://en.wikipedia.org/wiki/ Protamine_sulfate>). Además, el sulfato de protamina se utiliza habitualmente en aplicaciones biotecnológicas como la precipitación de ADN (por ejemplo, eliminación de ADN de células huésped en procesos de cultivo celular), la purificación de proteínas de unión a ADN y la transferencia de genes mediada por retrovirus.
La protamina se obtiene a partir de esperma de salmón o se produce de forma recombinante y se utiliza como sal de sulfato. Los cuatro péptidos principales, que constituyen casi todo el material que contiene nitrógeno en la protamina del salmón, se han caracterizado completamente y se ha descubierto que son polipéptidos de 30-32 aminoácidos de longitud, de los cuales 21- 22 residuos son arginina. La masa molecular media es del orden de 4250 Da para la secuencia siguiente: P R R R R SS SR P V RR R RR PR V S R RR R RR G G R R RR (SEQ ID N°: 1). En el presente documento, protamina o sal de protamina se refiere al sulfato de protamina.
La presente invención se refiere al uso de sulfato de protamina (PS) en un proceso de purificación de un virus vivo de Zika, en el que el sulfato de protamina facilita la eliminación de impurezas de una cosecha cruda de virus, incluidas partículas y agregados no infecciosos de virus. Como se observa en la Fig. 8 utilizando flavivirus como ejemplo, la producción de virus en la célula huésped puede dar lugar a la liberación de productos de virus que no están maduros, y partículas no infecciosas, que también pueden considerarse impurezas según la presente invención. Como tal, la presente invención también se refiere al enriquecimiento de partículas de virus infecciosas a partir de una cosecha cruda que contiene una mezcla de partículas de virus y otros productos virales en diversas etapas de maduración.
El uso de sulfato de protamina puede seguir a la lisis celular bruta o a cualquier otra etapa posterior a la lisis celular (por ejemplo, incluso después de una pre-purificación con filtración, cromatografía, etc.) en el que las partículas de virus Zika se enriquecen o concentran aún más y/o se eliminan otras impurezas y/o se intercambian los componentes del tampón. Las etapas posteriores pueden comprender la filtración o la concentración del lisado celular bruto.
El sulfato de protamina puede comprender la secuencia P R R R R SS SR P V RR R RR PR V S R RR R RR G G R R RR (SEQ ID N°: 1) o una variante de la misma en la que la secuencia de aminoácidos comprende entre 28-35 aminoácidos, preferiblemente 29-34, más preferiblemente 30-33 aminoácidos, más preferiblemente 31 o 32 aminoácidos. El sulfato de protamina comprende preferentemente al menos 19 residuos de arginina, más preferentemente al menos 20 residuos de arginina, más preferentemente al menos 21 residuos de arginina, aún más preferentemente al menos 22 residuos, más preferentemente 20 o 21 residuos de arginina. Además, pueden utilizarse otros compuestos similares al sulfato de protamina o sus variantes. Por lo tanto, el uso del término "sal de protamina" en el presente documento servirá para englobar las variaciones naturales de SEQ ID N°: 1, que consisten en las formas de sulfato de protamina.
El proceso que comprende el uso del sulfato de protamina de la invención puede aplicarse a la purificación del virus Zika para su uso en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, para una composición farmacéutica como una vacuna en la que es importante que el virus Zika esté en su forma infecciosa. El virus Zika a purificar puede ser un virus vivo, un virus vivo atenuado o un virus quimérico vivo, preferiblemente un virus Zika vivo de tipo salvaje, como un virus Zika de linaje asiático. En una forma de realización, la partícula del virus Zika también se inactiva posteriormente. En una forma de realización preferida, el virus Zika se inactiva con formaldehído.
El proceso según la presente invención también puede comprender el uso de un gradiente de sacarosa, preferentemente un gradiente de sacarosa optimizado. El gradiente de sacarosa se optimiza preferentemente para la eliminación de sulfato de protamina, también para la eliminación de partículas víricas inmaduras u otras partículas víricas que no son infecciosas o proteínas de células huésped o ácidos nucleicos (ADN, ARN, ARNm, etc.) u otros restos de células huésped. En la invención actual el gradiente de sacarosa optimizado comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro capas de soluciones de sacarosa con diferentes densidades. En una forma de realización, la preparación de virus que se va a purificar se proporciona en una solución de sacarosa que tiene una densidad de aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 11 %, aproximadamente 12% de sacarosa (p/p), preferiblemente aproximadamente 10%. En una forma de realización, una solución de sacarosa en el gradiente tiene una densidad de aproximadamente 45%, aproximadamente 46%, aproximadamente 47%, aproximadamente 48%, aproximadamente 49%, aproximadamente 50%, aproximadamente 51%, aproximadamente 52%, aproximadamente 53%, aproximadamente 54%, aproximadamente 55% de sacarosa (p/p), preferiblemente
aproximadamente 50%. En una forma de realización, una solución de sacarosa en el gradiente tiene una densidad de aproximadamente 30%, aproximadamente 31%, aproximadamente 32%, aproximadamente 33%, aproximadamente 34%, aproximadamente 35%, aproximadamente 36%, aproximadamente 37%, aproximadamente 38%, aproximadamente 39%, aproximadamente 40% de sacarosa (p/p), preferiblemente aproximadamente 35%. En una forma de realización, una solución de sacarosa en el gradiente tiene una densidad de aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20% de sacarosa (p/p), preferiblemente aproximadamente 15% de sacarosa. En una forma de realización preferida, el gradiente de sacarosa comprende tres capas de soluciones de sacarosa de aproximadamente 50%, aproximadamente 35% y aproximadamente 15% (p/p) de sacarosa y la composición vírica a purificar está contenida en aproximadamente 10% (p/p) de sacarosa. Dado que se proporcionan medios no sólo para analizar el ADN de la célula huésped, sino también las partículas virales inmaduras, el experto en la materia puede optimizar con mayor precisión el gradiente de sacarosa para una purificación más eficaz e incluir herramientas adicionales como el ensayo PRNT para supervisar el éxito de la purificación.
En una forma de realización preferida, el virus Zika producido se deriva del linaje asiático (que incluye las cepas encontradas en Sudamérica y todas las cepas derivadas de cualquier linaje asiático). En algunas otras formas de realización, el virus Zika producido es un virus Zika como el descrito en la sección Secuencia de esta solicitud (SEQ ID N°: 2 a 69). En una forma de realización preferida, el virus Zika comprende el ARN correspondiente a la secuencia de ADN proporcionada por SEQ ID N°: 72 o sus variantes. En una forma de realización preferida, el virus Zika codifica la poliproteína completa según SEQ ID N°: 73.
Tabla 1. Visión general de tampones y soluciones madre del proceso
Tabla 2. Abreviaturas
Brix:
*Grados Brix (°Bx) es el contenido de azúcar de una solución acuosa. Un grado Brix es 1 gramo de sacarosa en 100 gramos de solución y representa la concentración de la solución como porcentaje en masa. °Bx corresponde al contenido de sacarosa en porcentaje (p/p), por ejemplo, 45 °Bx equivale a 45% (p/p) de sacarosa.
Tabla A . Cebadores para la secuenciación del virus del Zika: las letras minúsculas indican bases no incluidas en ZIKA pero que contienen sitios de restricción para clonación posterior cuando sea necesario (por lo tanto, se proporcionan dos Tms).
SECUEN CIAS
SEQ ID N2: 1
Una forma típica de protamina
P R R R R S S S R P V R R R R R P R V S RRR R RR G G R R RR
A continuación, se proporcionan ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos de los genomas de los virus del zika que pueden usarse en los métodos, las composiciones o las vacunas descritos en la presente.
En algunas realizaciones, el virus del Zika tiene un genoma de ARN correspondiente a la secuencia de ADN proporcionada por la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID N°: 2-13 o 72. En algunas realizaciones, el virus del Zika tiene una variante del genoma que es por lo menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% idéntica a cualquiera de las SEQ ID N°: 2-13 o 72.
A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos de las proteínas E de cepas de Zika que pueden usarse en los métodos, composiciones y/o vacunas descritos en la presente.
SEQ ID N2: 74
9320_Zika_PF_1 F
ttaggatccGTT GTTGAT CTGTGT GAAT
SEQ ID N2: 75
9321_Zika_PF_1 R
taactcgagCGTACACAACCCAAGTT
SEQ ID N2: 76
9322_Zika_PF_2F
ttaggatccTCACTAGACGTGGGAGTG
SEQ ID N2: 77
9323_Zika_PF_2R
taactcgagAAGCCAT G TCYG AT ATT GAT
SEQ ID N2: 78
9324_Zika_PF_3F
ttaggatccGCATACAGCATCAGGTG
SEQ ID N2: 79
9325_Zika_PF_3R
taactcgagTGTGGAGTTCCGGTGTCT
SEQ ID N2: 80
9326_Zika_PF_4F
ttaggatccGAATAGAGCGAARGTTGAGATA
SEQ ID N2: 81
9327_Zika_PF_4R
taactcgAGTGGTGGGTGATCTTCTTCT
SEQ ID N2: 82
9328_Zika_PF_5F
ttaggatcCAGTCACAGTGGAGGTACAGTAC
SEQ ID N2: 83
9329_Zika_PF_5R
taactcgagCRCAGATACCATCTTCCC
SEQ ID N2: 84
9330_Zika_PF_6F
ttaggatCCCTTATGTGCTTGGCCTTAG
SEQ ID N2: 85
9331_Zika_PF_6R
taactcgagTCTTCAGCCTCCATGTG
SEQ ID N2: 86
9332_Zika_PF_7F
ttaggatccAATGCCCACTCAAACATAGA
SEQ ID N2: 87
9333_Zika_PF_7R
taactcgagTCATTCTCTTCTTCAGCCCTT
SEQ ID N2: 88
9334_Zika_PF_8F
ttaggatccAAGGGTGATCGAGGAAT
SEQ ID N2: 89
9335_Zika_PF_8R
taactcgagTTCCCTTCAGAGAGAGGAGC
SEQ ID N2: 90
9336_Zika_PF_9F
ttaggatccTCTTTTGCAAACTGCGATC
SEQ ID N2: 91
9337_Zika_PF_9R
taactcgagTCCAGCTGCAAAGGGTAT
SEQ ID N2: 92
9338_Zika_PF_10F
ttaggatccGTGTGGACATGTACATTGA
SEQ ID N2: 93
9339_Zika_PF_10R
taactcgagCCCATTGCCATAAAGTC
SEQ ID N2: 94
9340_Zika_PF_11F
ttaggatccTCATACTGTGGTCCATGGA
SEQ ID N2: 95
9341_Zika_PF_11R
taactcgagGCCCATCTCAACCCTTG
SEQ ID N2: 96
9342_Zika_PF_12F
ttaggatccTAGAGGGCTTCCAGTGC
SEQ ID N2: 97
9343_Zika_PF_12R
taactcgAGATACTCATCTCCAGGTTTGTTG
SEQ ID N2: 98
9344_Zika_PF_13F
ttaggatccGAAAACAAAACATCAAGAGTG
SEQ ID N2: 99
9345_Zika_PF_13R
taactcgagGAATCTCTCTGTCATGTGTCCT
SEQ ID N2: 100
9346_Zika_PF_14F
ttaggatccTTGATGGCACGACCAAC
SEQ ID N2: 101
9347_Zika_PF_14R
ttaggatccGTTGTTGATCTGTGTGAAT
SEQ ID N2: 102
9348_Zika_PF_15F
taactcgagCAGGTCAATGTCCATTG
SEQ ID N2: 103
9349_Zika_PF_15R
ttaggatccTGTTGTGTTCCTATTGCTGGT
SEQ ID N2: 104
9350_Zika_PF_16F
taactcgaGTGATCAGRGCCCCAGC
SEQ ID N2: 105
9351_Zika_PF_16R
ttaggatccTGCTGCCCAGAAGAGAA
SEQ ID N2: 106
9352 Zika PF 17F
taactcgaGCACCAACAYGGGTTCTT
SEQ ID N2: 107
9353_Zika_PF_17R
ttaggatcCTCAAGGACGGTGTGGC
SEQ ID N2: 108
9354_Zika_PF_18F
taactcgagCAATGATCTTCATGTTGGG
SEQ ID N2: 109
9355_Zika_PF_18R
ttaggatccTATGGGGGAGGACTGGT
SEQ ID N2: 110
9356_Zika_PF_19F
taactcGAGCCCAGAACCTTGGATC
SEQ ID N2: 111
9357_Zika_PF_19R
ttaggatcCAGACCCCCAAGAAGGC
SEQ ID N2: 112
9358_Zika_PF_20F
taactcgagCCCCTTTGGTCTTGTCT
SEQ ID N2: 113
9359_Zika_PF_20R
ttaggatccAGGAAGGATGTATGCAGATG
SEQ ID N2: 114
9360_Zika_PF_21 F
taactcgagACATTTGCGCATATGATTTTG
SEQ ID N2: 115
9361_Zika_PF_21 R
ttaggatccAGGAAGGACACACAAGAGT
SEQ ID N2: 116
9362_Zika_PF_22F
taactcgagACAGGCTGCACAGCTTT
SEQ ID N2: 117
9363_Zika_PF_22R
ttaggatccTCTCTCATAGGGCACAGAC
En algunas formas de realización, el virus del Zika tiene una poliproteína, incluyendo una proteína de envoltura (E), con una secuencia de aminoácidos proporcionada por cualquiera de las SEQ ID N°: 14-69 o 72. En algunas formas de realización, la secuencia de poliproteína o proteína E es por lo menos un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%. 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% idéntica a cualquiera de las SEQ ID N°: 2-69 o 72.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad) sobre una región específica o sobre la secuencia completa, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente sobre una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud. En algunas formas de realización, la identidad existe a lo largo de la longitud de una proteína, como la proteína E.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math.
2:482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J . Mol. Biol. 48:443, 1970, por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, B ESTF IT , FASTA, Jalview y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group. 575 Science Dr., Madison. WI), por la implementación de alineación de múltiples secuencias usando, por ejemplo, CLUSTALW (Larkin et al., (2007). Bioinformatics, 23, 2947-2948.) o MAFFT (Katoh & Toh 2008 Briefings in Bioinformatics 9:286-298), o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)). Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 y Altschul et al., J . Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción de una sustancia farmacéutica contra el Zika adecuada para su aplicación como vacuna en seres humanos y animales
M ateriales y m étodos:
Para la producción de ZikaV se usó como base la plataforma de proceso de JE V (Srivastava et al., Vaccine 19 (2001) 4557-4565; US 6,309,650B 1). Se adaptaron pequeños cambios de ciertos pasos del proceso a las propiedades de ZikaV y para mejorar la pureza. A continuación se describe un breve resumen de los pasos del proceso (consultar también la Figura 9A y B). Brevemente, se evaluaron las propiedades de purificación inesperadas y novedosas del sulfato de protamina (PS) en los procesos de purificación del virus del Zika. Como se muestra en la Figura 10, los agregados de partículas de virus no infecciosos, HCP y otras impurezas de LMW se eliminaron mediante la precipitación con PS, como se muestra mediante la eliminación del hombro agregado en SEC-HPLC y sin pérdida del título de virus infeccioso por el tratamiento con PS. A continuación se proporciona una mayor optimización del protocolo de purificación del Zika.
Sentido ascendente:
• Expansión de células Vero basada en botella de rodillo (25x850cm2 CellBind):
• 5% de CO2, 35° C, MEM+2 mM L-Glutamina 10% F b S
• Investigación de infección con ZikaV Master Seed Bank (rMSB) en MOI 0.01
• Producción de virus sin suero
• 5% de CO2, 35° C, MEM+2mM L-Glutamina
• Cosechas múltiples (días 2, 3, 5 y 7) con realimentación
• Filtración estéril de cosechas y almacenamiento a 2-8° C hasta su procesamiento posterior
Sentido descendente:
• Agrupación de cosechas y concentración por ultrafiltración (100 kDa)
• Estabilización de cosecha concentrada (Tris/sacarosa al 10%) para almacenamiento si es necesario (-80° C)
• Eliminación de ADNhc por sulfato de protamina (2 mg/ml)
• Purificación de gradiente de sacarosa (gradiente optimizado de tres capas)
• Inactivación de formaldehído (0,02%, 22° C, 10 días), neutralización con metabisulfito de Na
• Dilución al contenido objetivo del antígeno DS y formulación con hidróxido de aluminio (0,5 mg Al/ml)
La cepa del virus del Zika H/PH2013 se aisló originalmente de una mujer de 51 años (número de acceso KJ776791.1, también SEQ ID N°: 13 en la presente) de la Polinesia Francesa. Se obtuvo una muestra del Archivo Europeo de Virus (EVAg; Ref-SKU: 001v-EVA1545). A partir de este material, se preparó un banco de semillas maestras de investigación (rMSB) sobre células Vero como sustrato celular y se comprobó la secuencia genómica mediante secuenciación. Como se desconocía la secuencia genómica en las secuencias flanqueantes 5' y 3' de la cepa H/PH2013 del virus del Zika, se diseñaron cebadores para la secuenciación en esas regiones sobre la base de otras cepas del virus del Zika, mientras que los cebadores internos se diseñaron a partir de la secuencia publicada (SEQ ID N°: 74 a 117, ver también la Tabla A). La secuencia obtenida del rMSB mediante el uso de estos cebadores se proporciona mediante la SEQ ID N°: 72. Hubo un 100% de superposición de la secuencia con la secuencia publicada de la cepa H/PH2013 del virus del Zika (SEQ ID N°: 13). Sin embargo, secuenciamos regiones 5' (40 pb adicionales) y 3' (160 pb adicionales) adicionales representadas en la SEQ ID N°: 72. En una realización preferida, el virus del Zika de la invención comprende la SEQ ID N°: 72. El ARN genómico es algo más largo que la secuencia de acuerdo con la SEQ ID N°: 72 (quizás unos 200 pb adicionales). Además, puede esperarse que un virus del Zika adaptado a una célula huésped como, por ejemplo, las células Vero, contenga una o más mutaciones. Por estas razones, el virus del Zika de la presente invención comprende la secuencia de la SEQ ID N°: 72 o, preferiblemente, una secuencia con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con el secuencia proporcionada por la SEQ ID N°: 72. Además, como es probable que el genoma vírico contenga aún más regiones flanqueantes para la SEQ ID N°: 72; en una realización, el virus del Zika de la invención contiene la secuencia de la SEQ ID N°: 72 y opcionalmente comprende además extensiones en los extremos 5' y/o 3' de por lo menos 10, por lo menos 20, por lo
menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 100, por lo menos 110, por lo menos 120 o por lo menos 130 nucleótidos. En una realización preferida, el virus del Zika comprende por lo menos la secuencia codificante de la poliproteína completa de la cepa H/PH2013 del virus del Zika de la invención, es decir, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 73 o una poliproteína con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia proporcionada por la SEQ ID N°: 73. Además, el virus del Zika comprende por lo menos la secuencia codificante para la proteína E de la cepa del virus del Zika H/PH2013 de la invención SEQ ID N°: 47 o una proteína de la misma con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98% o por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia proporcionada por la SEQ ID N°: 43.
Crecim iento d e l virus en célu las Vero
Las células Vero se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10%. Se infectaron cultivos en botellas giratorias de monocapas de células Vero con la cepa H/PH2013 del virus del Zika a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 unidades formadoras de placas (pfu) por célula. Después de 2 horas de adsorción del virus, los cultivos se lavaron 3 veces con PBS y se alimentaron con EMEM sin FBS y se incubaron a 35° C con un 5% de CO2. Los cultivos de células Vero infectadas se incubaron hasta que el título del virus alcanzó el nivel deseado.
El medio de cultivo se recogió en los días 2, 3, 5 y 7 y se agrupó a partir de esos días de recogida y luego se centrifugó en una centrífuga estándar. Luego se filtraron los sobrenadantes. Los sobrenadantes del cultivo de virus se concentraron mediante ultrafiltración T FF para eliminar los componentes del medio de cultivo celular y reducir el volumen del lote.
Procedim iento d e evaluación d e la co se c h a
El proceso de cosecha actual de JE V tiene cosechas programadas en los días 3, 5, 7 y 9 posteriores a la infección. Para imitar el proceso de JE V se infectaron botellas giratorias con ZIKV banco P4-FBS a una MOI de 0,01 en medio de infección (MEM con 2% de FBS 2 mM de L-glutamina) durante 2 horas. Después de retirar el inóculo, las células se lavaron dos veces con PBS y se añadieron 200 ml de medio de producción (MEM+ L-glutamina 2 mM).
Después de tomar una muestra el día 2, se realizó la primera cosecha de virus el día 3 después de la infección. En este punto, se pudo observar un C PE significativamente más alto en comparación con las células en las que se eliminó el virus el día 2. El análisis del ensayo de placa mostró que los títulos víricos en el día 2 estaban en el mismo intervalo que para el programa de cosecha estándar. Sin embargo, a partir del día 3 de cosecha, los títulos observados fueron significativamente más bajos en correlación con el C PE aumentado observado en comparación con el programa estándar de cosecha. En el día 5 después de la infección no se pudieron observar más células vivas y el experimento finalizó con una cosecha final en el día 5.
Tabla 3: Los títulos calculados por ensayo de placa se resumen en la lista a continuación.
Este descubrimiento llevó a un programa de cosecha optimizado para un mejor control de C PE y permitir una cosecha adicional los días 5 y 7, ver la Figura 15. Para ambos días de cosecha, el protocolo ZikaV optimizado proporcionó títulos de virus significativamente más altos en comparación con el protocolo modificado que muestra que el momento de la primera cosecha es crucial para los rendimientos de producción. Además, la primera cosecha en el día 3 da como resultado un máximo de 2 puntos de cosecha, mientras que la primera cosecha en el día 2 permite 4 puntos de cosecha, lo que aumenta adicionalmente la ganancia de rendimiento.
Purificación en sentido d e sce n d e n te d el virus d e l Zika
El proceso de purificación se llevó a cabo a temperatura ambiente (18-22° C) a menos que se indique lo contrario. La purificación del virus comenzó con la concentración de la cosecha combinada filtrada usando módulos de ultrafiltración T FF de corte de 100 kDa para eliminar los componentes del medio de cultivo celular y reducir el volumen del lote. Después de la concentración, el material recogido filtrado agrupado se ajustó a una concentración final de Tris 25 mM, pH 7,5 y sacarosa al 10% (p/p) usando una solución madre de ambos componentes (ver la Figura 11 para SEC-HPLC de diferentes cosechas antes del tratamiento PS). Esto permitió congelar la cosecha concentrada a <-65° C si se requería.
La reducción de la proteína y del ADN de la célula huésped, así como la reducción de agregados de virus no infecciosos en el material concentrado se logró mediante precipitación con sulfato de protamina (2 mg/ml) seguido de centrifugación en densidad de sacarosa (2-8° C) como paso final de pulido (ver Figura 20 para SEC- HPLC de diferentes cosechas después del tratamiento con PS). El proceso de purificación fue diseñado para completarse en 2
días hábiles con SG C comenzando al final del día 1 seguido de fraccionamiento y análisis SDS- PAGE el día 2. Las fracciones de gradiente de sacarosa se almacenaron a 2-8° C durante el análisis SD S-PAGE (tinción con plata) para identificar las fracciones puras que contenían ZikaV (ver la Figura 21). Después de agrupar las fracciones relevantes, el grupo se diluyó e inactivó con formalina. Después de agrupar las fracciones relevantes de la centrifugación en gradiente de sacarosa, la mezcla se diluyó 1: 3 en PBS y se inactivó por formalina (0,02% v/v, 200 ppm). Las fracciones se sometieron a análisis por SDS-PAGE.
E fecto d e l tratamiento con P S so b re la recu peración d el virus
Se analizaron muestras de cosechas concentradas 30x individuales los días 2, 3, 5 y 7 antes (Figura 11) y después (Figura 12) del tratamiento con PS mediante SEC-HPLC y ensayo de placa. Se usó SEC-HPLC para la determinación del contenido total relativo de ZikaV (activo inactivo) expresado como área máxima, mientras que el contenido la pureza máxima de ZikaV rel. se proporciona como el contenido relativo de la población de monómeros del virus con respecto al pico total del virus. El ensayo de placa indica el contenido de partículas víricas activas totales en cada muestra. Los resultados experimentales se resumen en la Tabla 4. La recuperación del pico de virus por SEC-HPLC fue solo entre el 12 y el 36% con una pureza máxima después del tratamiento con PS en el intervalo del >90% (no se detectaron agregados de virus). La recuperación de partículas de virus activas por ensayo de placa fue del >100% (130-700%, intervalo dentro de la variabilidad del ensayo) que muestra que no se perdieron partículas víricas activas durante el tratamiento con PS. Estos resultados muestran que durante el tratamiento con PS solo se eliminaron las partículas no infecciosas (virus inmaduros y/o agregados).
Tabla 4: Recuperación de ZikaV por SEC-HPLC y ensayo de placas antes y después del tratamiento con PS.
SEC-HPLC
En l
Centrifugación en gradiente de sa ca ro sa
La cosecha tratada con PS se dividió en dos partes y se cargó en dos botellas de centrífuga. Se usó centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa (SGC) para la concentración final y el pulido del material de ZikaV. La cosecha concentrada tratada con PS de ZikaV se cargó encima de una solución que consistía en tres capas de sacarosa con diferentes densidades. Las tres capas de sacarosa se seleccionaron basándose en un estudio preliminar que mostró la formación de un gradiente de sacarosa lineal y la separación completa de las partículas de virus de los contaminantes residuales como se demostró para ChikV (Fig. 15D). Los volúmenes óptimos de las soluciones de sacarosa se determinaron empíricamente. Los volúmenes de las capas individuales para una centrifugación a escala de botella de 100 ml se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Capas/volúmenes individuales para una centrifugación en botella.
Las botellas de gradiente de sacarosa se prepararon estratificando las capas de sacarosa individuales. Se unió un tubo de plástico al tubo de la bomba peristáltica. El tubo de plástico se montó en un soporte de laboratorio usando una abrazadera y se colocó en la botella de centrífuga. La boquilla del tubo de plástico estaba tocando el fondo de la
botella. Usando una bomba peristáltica, se bombearon al cilindro el material de ZikaV y las soluciones de sacarosa. Se usó un cilindro de medición como recipiente de alimentación. La primera solución bombeada fue el material de ZikaV, ya que representaba la solución de menor densidad (10% de sacarosa (p/p)). Después del material ZikaV, se bombearon las soluciones de sacarosa en orden ascendente comenzando con la solución J al 15% (p/p), seguido por la solución I al 35% de sacarosa y terminando con la solución H de sacarosa de densidad más alta (50% (p/p)). La configuración descrita se muestra en la Figura 14. Después de que se hubiesen transferido todas las soluciones de sacarosa se retiró con cuidado el tubo de plástico para no alterar las capas.
Antes de la centrifugación, la centrífuga se enfrió previamente a 4° C. Las botellas SG preparadas se transfirieron cuidadosamente al rotor enfriado previamente. (Nota: debe evitarse el movimiento repentino de las botellas durante la transferencia al rotor para no alterar las capas de sacarosa). Las botellas se centrifugaron a ~11.000 RCF máx. a 4° C durante por lo menos 20 horas, sin freno/desaceleración activados. En caso de que se use un sistema de centrifuga diferente con un rotor diferente, deben calcularse la velocidad necesaria y los tiempos de centrifugado en función del factor k para lograr una eficiencia de centrifugado comparable.
La recogida del gradiente de sacarosa se realizó manualmente usando una bomba peristáltica. Se usó un tubo de plástico unido a un tubo de bomba peristáltica para recoger el gradiente de sacarosa. La botella que contenía el gradiente se montó en un soporte de laboratorio en una posición inclinada (-12°) usando una abrazadera. Luego, el tubo de plástico se colocó en la botella tocando el borde inferior de la botella y se sujetó en posición usando una abrazadera. Esto dio como resultado un pequeño espacio de 1 -2 mm entre la entrada del tubo y el fondo de la botella (ver Figura 14).
Usando una bomba peristáltica ajustada a un caudal de 30 ml por minuto, se recogió el gradiente y se dividió manualmente en fracciones de 2 ml. Se recogieron un número total de 32 fracciones por botella (~64 ml) y se descartó el volumen restante. Las fracciones se probaron inmediatamente mediante SDS-PAGE/tinción de plata para identificar las fracciones que contenían virus con suficiente pureza. La SDS-PAGE representativa se muestra en la Figura 14. Las fracciones 10-14 se agruparon y se procesaron adicionalmente.
La solución vírica purificada se inactivó mediante incubación con formaldehído al 0,02% durante un período de diez días en una incubadora a temperatura controlada a 22° C. El formaldehído se neutraliza mediante la adición de metabisulfito de sodio al décimo día.
El grupo de gradiente de sacarosa (~17 ml después del muestreo) se diluyó tres veces más con PBS hasta un volumen final de 51 ml en un recipiente de PETG . A este grupo se le añadió un volumen de solución de formaldehído al 1% (10.000 ppm) equivalente a 1/50 del volumen final del grupo de preformaldehído, lo que dio como resultado una concentración efectiva de 200 ppm. La solución tratada con formaldehído se mezcló en un agitador magnético durante 10 minutos. Después del muestreo, la solución vírica tratada con formaldehído se colocó dentro de una incubadora enfriada a 22° C ± 2° C. El día 5 después de la adición de formaldehído, la solución vírica tratada con formaldehído se filtró a través de un filtro de 0,2 μm y luego se colocó de nuevo en la incubadora a 22° C ± 2° C. El día 10, después de retirar la muestra final de inactivación de 10 días, se transfirió asépticamente un volumen del 1% (del peso de la solución vírica tratada con formaldehído final) de solución de metabisulfito de sodio 200 mM (concentración final de 2 mM) al recipiente de PETG que contenía la solución vírica tratada con formaldehído. Después de mezclar durante 5 minutos en un agitador magnético, la solución vírica inactivada neutralizada se mantiene a temperatura ambiente (20 a 25° C) durante un mínimo de 30 minutos. Después del muestreo, la solución vírica inactivada neutralizada se almacena a 5° C ± 3° C hasta su procesamiento posterior.
Inactivación p o r form aldehído
Los parámetros críticos para este paso son la concentración final de formalina, la temperatura, el mezclado y la transferencia a un nuevo recipiente. Se ha establecido un criterio de aceptación preliminar para el máximo de pfu/ml (determinado por ensayo de placa) en el tratamiento previo con formaldehído del grupo diluido.
La calidad de la solución vírica inactivada neutralizada se monitorizó mediante los siguientes parámetros: ensayo de placa el día 10, SEC-HPLC , SDS-PAGE/transferencia Western.
Curiosamente, el análisis SEC-HPLC de las muestras tomadas durante el período de inactivación seguido de neutralización con bisulfito mostró un área de pico más o menos constante durante todo el período de inactivación. Esto contrasta con JE V donde se observan pérdidas de partículas víricas de hasta el 60% usando el proceso divulgado por Srivastava et al. Vaccine 19 (2001) 4557-4565. En un modelo a escala reducida, las pérdidas víricas fueron incluso mucho mayores debido a la relación superficie/área a una escala más pequeña y las pérdidas elevadas debido a la adsorción inespecífica. Las diferencias del experimento de inactivación de ZikaV y la inactivación de JE V se informaron de la siguiente manera:
A) Pureza mucho mayor del conjunto de SG P de ZikaV con respecto al PS residual (<2 μg/ml) en comparación con JEV . La muestra inactivada de ZikaV 3 veces contenía, por lo tanto, <<1μg/ml de PS residual. El grupo de JE V SG P comercial contiene de media ~20 μg/ml (hasta 152 μg/ml posibles). La dilución media a la solución de inactivación de ~14 veces da como resultado un contenido de PS residual de hasta ~11 μg/ml. Es posible que una cantidad más alta de PS residual provoque la precipitación del virus debido a la
reticulación/reacción con formalina.
B) La muestra de inactivación de ZikaV contenía ~10% de sacarosa (dilución de 3 veces del grupo de SGP que contenía -30-35% de sacarosa). La sacarosa podría tener un efecto estabilizador de las partículas víricas de ZikaV durante el tratamiento con formalina.
Dilución a D S y formulación con hidróxido d e aluminio (DP)
Para la preparación de la sustancia farmacéutica de ZikaV usada en el ensayo de potencia en ratones, se buscó un contenido de antígeno (expresado como partículas víricas totales o área máxima de SEC ) de 5 veces mayor en comparación con Ixiaro. La base para la determinación del contenido de antígeno fue SEC-HPLC . Brevemente, se usó una columna Superose 610/300 Increase (GE Healthcare) equilibrada con PBS NaCl 250 mM, pH 7,4 a 1 ml/min y 25° C, para detectar ZikaV a una longitud de onda de detección de 214 nm en muestras recogidas y durante todo el proceso en sentido descendente. En el proceso JE V actual, el contenido de antígeno en NIV se determina mediante un ELISA específico. Se observó una buena correlación entre el contenido de antígeno determinado por ELISA y SEC-HPLC. De media, el contenido de antígeno en las muestras comerciales de NIV está en el intervalo de 33 AU/ml que corresponde a ~5,2 mAU del área máxima de JEV , ver la Figura 21.
El día 10 de NIV de ZikaV (pico de Zika ~36 mAU, analizado en la columna Waters HPLC/Superose6 Increase) se diluyó con PBS hasta un objetivo de 6,3 (dilución de ~5,7x). Se añadió hidróxido de aluminio a una concentración final de 0,5 mg/ml de aluminio (1/20 v/v de solución madre de alumbre al 2%) para preparar el producto farmacéutico de ZikaV (DP). El DP se mezcló suavemente durante 5 min. Se extrajo una alícuota del DP, el alumbre se sedimentó por centrifugación y el sobrenadante trasparente se analizó por SEC-HPLC . No se detectó ningún pico de ZikaV en el sobrenadante, lo que indica una adsorción completa (estimada como >95%) de las partículas víricas en el adyuvante mineral. El DP de ZikaV formulado se almacenó a 2-8° C.
El perfil de impurezas de DS del virus del Zika inactivado es comparable al perfil de DS de JE V con la excepción de un contenido de PS más bajo (Tabla 6).
Tabla 6: Determinación del perfil de impurezas en muestras de DS de Zika y JEV :
R esu lta d o s d e S E C - M A L L S
En la Figura 16 se muestra un perfil de elución de SEC-HPLC representativo de ZikaV NIV a una longitud de onda de detección de 214 nm. Tener en cuenta que se añadió BSA (50 |jg/ml) a la muestra para minimizar las pérdidas en el vial de vidrio de HPLC debido a la adsorción superficial inespecífica. El contenido de monómero de ZikaV se estimó en ~98% con un contenido de multímero del ~2%.
El análisis SEC-M ALLS (Figura 17) de la muestra confirmó que el radio Rz del pico 1 de la población del monómero ZikaV era de 21,6 nm y de -49 nm para el pico 2 del multímero. La distribución acumulada del tamaño de las partículas mostró que el 89% de todas las partículas víricas se encuentran dentro de un intervalo de radio de entre 18 y 25 nm (Figura 18).
Los resultados confirman la pureza y la homogeneidad de ZikaV NIV.
Título vírico p o r en sa y o d e placa
Tabla 7: Los pfus del ZikaV activo se cuantificaron mediante un ensayo de placa durante todo el proceso.
Com paración d e P S y B en zo n a sa so b re e l rendim iento d el p ro ceso
Se realizó una comparación directa del método de eliminación de ADN del grupo de recogida de ZikaV concentrado. Una alícuota se trató con PS (2 mg/ml, 15 min a temperatura ambiente), la otra alícuota se trató con Benzonasa (50 U/ml, 2 mM MgCl2, 4 h a Ta, 48 h a 2-8° C). Ambas muestras se purificaron adicionalmente mediante un gradiente de sacarosa como se describe en este informe. Curiosamente, las muestras tratadas con Benzonasa no produjeron fracciones puras después de la centrifugación en gradiente de sacarosa de la cosecha de ZikaV tratada. En aquellas fracciones en las que se detectaron las bandas de virus específicas, se detectó una alta cantidad de proteína de la célula huésped en todas las fracciones recogidas. El material tratado con PS dio como resultado fracciones que contenían ZikaV puro, como se esperaba. Este descubrimiento puede sugerir que PS no solo es eficaz para la eliminación de ADN por precipitación; además, mejora la recuperación de partículas de virus en el gradiente al alterar la interacción de ADN (fragmentos) y partículas de virus. El tratamiento con Benzonasa no elimina el ADN, solo da como resultado su fragmentación. Los fragmentos de ADN residuales aún pueden interactuar con partículas de virus y HCP residuales, lo que da como resultado una contaminación cruzada y una copurificación en el gradiente de sacarosa. Las fracciones de SG P agrupadas también se analizaron mediante SEC- HPLC. Aunque se detectó un gran pico, SD S-PAGE confirmó que esta muestra estaba altamente contaminada con HCP. Es posible que se detecte un pico grande en UV214 y 280 nm después del análisis SEC-HPLC debido a la posible interacción de los HCP con partículas de virus grandes, lo que cambia la absorbancia UV.
Inmunogenicidad del virus del Zika cultivado en Vero
Inm unización d e ratones
Antes de la inmunización, se extrajeron muestras de sangre de grupos de diez ratones CD1 hembra de 6 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon sueros preinmunitarios. Se administró una inmunización intraperitoneal de 200 μl. Una titulación de dosis (12 μg, 3 μg, 1 μg, 0,33 μg, 0,11 μg, 0,037 μg y 0,012 μg, equivalente a la cantidad de proteína en IXIARO) de virus del Zika inactivado formulado con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,7%. Tres semanas después de la inmunización, se recogió sangre y se prepararon sueros inmunes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB 1 Nr. 501/1989) y fueron aprobados por el "Magistratsabteilung 58".
Pru eba d e neutralización p o r reducción d e placa (P R N T )
Para la PRNT se usaron placas de doce pocillos. Cada pocillo se sembró con 1 ml de medio que contenía 4 x 105 células Vero y se incubó a 35° C con CO2 al 5% durante la noche. Se probaron por triplicado grupos de sueros inactivados por calor de cada grupo de dosis. Los virus objetivo (H/PH2013 (SEQ iD N°: 13) o MR766 (SEQ ID N°: 11)) se diluyeron a 100 pfu/165 μl. Se incubaron volúmenes iguales de virus objetivo y dilución de suero a 35° C con CO2 al 5% durante 1 hora. El medio de cultivo celular se aspiró de las células Vero y se añadieron 330 μl de la mezcla de dilución de virus/suero objetivo a cada pocillo y las placas se agitaron de un lado a otro 5 veces antes de incubarlas durante 2 horas a 35° C con 5% de CO2. A cada pocillo se le añadió 1 ml de una solución de metilcelulosa al 2% que contenía EMEM y nutrientes, luego las placas se incubaron durante 5 días a 35° C con CO2 al 5% antes de teñir las células durante 1 hora con cristal violeta/formaldehído al 5% y posteriormente se lavarlas 3 veces con agua desionizada. Las placas se secaron al aire y se contaron manualmente los números de placas en cada pocillo.
R esu lta d o s
Se observó neutralización con grupos de suero de ratones inmunizados con la vacuna inactivada contra el virus del Zika (H/PH2013) hasta 37 ng (dosis equivalente a la cantidad de proteína en IXIARO®) contra los virus del Zika de tanto el linaje asiático (H/PH2013) como el africano (MR766) (Figuras 19 y 20, respectivamente). Se observó una inhibición completa en la dilución de suero 1:20 con una dosis de inmunización de hasta 110 ng (dosificación
equivalente a la cantidad de proteína en IXIARO®). La neutralización de tanto el linaje asiático (H/PH2013) como el africano (MR766) del virus del Zika fue equivalente, lo que indica una neutralización cruzada alta entre diferentes cepas del virus del Zika de la vacuna inactivada contra el virus del Zika (H/PH2013).
Se realizó otro ensayo de neutralización usando el ensayo de microneutralización descrito por Larocca, et al. (2016, Naturaleza doi:10.1038/nature18952). Se descubrió que el virus del Zika inactivado de la presente invención tenía un título de MN50 (microneutralización) de 90 a 1 μg de virus purificado inactivado.
Métodos adicionales: La inmunogenicidad de las preparaciones inactivadas del virus del Zika se evalúa usando un modelo de ratón de infección por Zika. Se inmunizan grupos de ratones adultos por vía subcutánea (s.c.) con 500, 50 o 5 ng de virus del Zika inactivado con adyuvante (por ejemplo, hidróxido de aluminio con o sin IC31®) o sin adyuvante. Un grupo adicional de ratones recibe PBS como control negativo. A cada grupo se le administra el inóculo indicado en t=0 y en algunos casos también a las tres o cuatro semanas (t=3/4). Comenzando aproximadamente tres semanas después de la administración de la última inmunización, se obtienen muestras de suero de cada uno de los ratones a intervalos regulares. Las muestras de suero se prueban para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes usando PRNT.
La eficacia protectora in vivo de las preparaciones del virus del Zika inactivadas también se evalúa usando un modelo de ratón de infección por el Zika, es decir, ratones inactivados para el receptor de IFN-alfa/beta (A 129) (ver, por ejemplo, Dowall et al., 4 de marzo de 2016, http://dx.doi.org/10.1101/042358) o el bloqueo del receptor de IFN-alfa/beta mediante la administración de anticuerpos monoclonales anti-receptor de IFN-alfa/beta a ratones C57BL/6 o BALB/c (ver, por ejemplo, Pinto et al., 7 de diciembre de 2011, DOT 10.1371/journal.ppat.1002407). Para los ensayos de protección, se inoculó por vía subcutánea a grupos de 10 ratones BALB/c A129, C57BL/6 de tres a ocho semanas de edad en los cuartos traseros con virus del Zika inactivado con adyuvante (hidróxido de aluminio) o sin adyuvante en t=0. Los controles emparejados por edad se inoculan con PBS o antígenos no específicos en alumbre. Los ratones se refuerzan opcionalmente con una segunda administración de la inoculación indicada tres o cuatro semanas más tarde. Luego, los ratones se exponen por vía subcutánea a de tres a ocho semanas después de la inmunización mediante la inoculación con una dosis mortal del virus del Zika vivo. Un día antes de la exposición de los ratones C57BL/6 y BALB/c, se les administran pasivamente (por vía intraperitoneal) anticuerpos monoclonales anti-IFN-alfa/beta. Los ratones desafiados se monitorizan diariamente en cuanto a morbilidad y mortalidad durante un máximo de veintiún días. Otra alternativa es desafiar intracranealmente a ratones adultos vacunados/no vacunados y observar la protección.
Se espera que el virus del Zika producido mediante el proceso de la invención proporcione lecturas funcionales muy similares in vitro, in vivo y, finalmente, ensayos en humanos como la vacuna JE V actualmente autorizada en la UE y los USA y en otros lugares, IXIARO®. La dosificación puede variar, pero debido al perfil de impurezas muy similar y la fabricación casi idéntica, se esperará un resultado de eficacia y seguridad muy similar al que se determinó para la vacuna JE V actualmente autorizada (autorizada en la UE, los USA y otros lugares).
Análisis y conclusión
Se usó la plataforma de fabricación existente para la producción de la vacuna de JE V inactivada IXIARO® como base para un estudio de viabilidad de fabricación de la vacuna candidata de ZikaV inactivado (cepa asiática H/PH2013). El virus se produjo en células Vero cultivadas en botellas giratorias. El virus se purificó mediante tratamiento con PS seguido de un gradiente de sacarosa optimizado. La inactivación se realizó mediante tratamiento con formalina (0,02%, 10 días a 22° C). Para los estudios exploratorios de inmunización en ratones, se preparó una DP formulada con alumbre con un contenido estimado de partículas víricas cinco veces mayor en comparación con IXIARO®, la vacuna comercial contra la JEV . El perfil de impurezas de DS cumplió con todos los criterios definidos en la especificación de IXIARO®, la vacuna comercial contra JEV . La neutralización de los linajes asiático (H/PH2013) y africano (MR766) del virus del Zika fue equivalente, lo que indica una neutralización cruzada alta entre diferentes cepas del virus del Zika de la vacuna del virus del Zika inactivado (H/PH2013).
Los datos in vivo referentes a la inmunogenicidad de la vacuna del virus del Zika inactivado de la presente invención indican que el virus es sorprendentemente potentemente inmunogénico y también altamente protector cruzado (inmunogenicidad muy similar en cepas africanas y asiáticas). Los datos indican que la inmunogenicidad fue mayor que la vacuna candidata inactivada contra el virus del Zika informada recientemente (Larocca, et. al, 2016, supra). Los virus inactivados se encuentran entre las vacunas más seguras y se prefieren especialmente para administrarse a poblaciones en las que la seguridad es especialmente preocupante, como mujeres embarazadas, niños e individuos inmunocomprometidos, lo que hace que el virus del Zika inactivado divulgado en la presente sea especialmente adecuado. La obtención de un título alto de virus inactivado es un desafío en el campo. El proceso divulgado en la presente para purificar el virus del Zika inactivado da como resultado no solo un alto rendimiento, sino también una sustancia farmacéutica muy pura.
Claims (14)
1. Uso de sulfato de protamina para separar partículas infecciosas del virus Zika de partículas no infecciosas del virus Zika.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el sulfato de protamina también facilita la separación de partículas infecciosas del virus Zika de proteínas de células huésped y/o materiales de bajo peso molecular.
3. Un proceso para la purificación de partículas infecciosas del virus Zika, que comprende las etapas de:
a) proporcionar una cosecha bruta (a) que comprenda partículas del virus Zika e impurezas, en la que las impurezas se generen a partir del cultivo de dichas partículas del virus Zika en un sustrato celular;
b) reducir las impurezas de dicha cosecha bruta (a) mediante el uso de sulfato de protamina para separar las partículas infecciosas del virus Zika de las partículas no infecciosas del virus Zika, para obtener una preparación del virus Zika (b); y
c) purificar aún más la preparación de virus (b) utilizando una o más etapas de purificación por exclusión de tamaño seleccionadas entre:
i) una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa,
ii) una matriz en fase sólida empaquetada en una columna que comprende un núcleo activado por ligando y una cubierta inactiva que comprende poros, en la que el corte de peso molecular de los poros impide que las partículas de virus entren en el núcleo activado por ligando, y en la que una molécula más pequeña que el corte de peso molecular de los poros puede entrar en el núcleo activado por ligando y recoger las partículas de virus, y
iii) cromatografía de exclusión por tamaño,
para obtener un preparado vírico (c) que comprenda partículas víricas infecciosas.
4. El proceso de la reivindicación 3, en el que dicha centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa comprende tres capas de soluciones de sacarosa de aproximadamente 50%, aproximadamente 35% y aproximadamente 15% (p/p) de sacarosa, y la preparación de virus a purificar está contenida en aproximadamente 10% (p/p) de sacarosa.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el sulfato de protamina residual en la preparación de virus (c) es inferior a 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 o 200 ng/ml, preferentemente inferior a 100 ng/ml.
6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el contenido residual de ADN de la célula huésped de la preparación de virus Zika (c) es inferior a 10 ng/ml y el contenido residual de proteínas de la célula huésped es inferior a 100 ng/ml.
7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha cosecha bruta (a) que comprende partículas del virus Zika e impurezas se somete a una o más etapa(s) de pre-purificación antes de la etapa (b).
8. El proceso de la reivindicación 7, en el que dicha(s) etapa(s) de pre-purificación se selecciona(n) entre:
a) filtración mediante un filtro con un tamaño de poro igual o inferior a 0,2 pm;
b) digestión del ADN genómico de la célula huésped mediante tratamiento enzimático; y
c) ultra/diafiltración utilizando una membrana de fibra hueca con un tamaño de poro igual o superior a 300 kDa, preferentemente igual o superior a 100 kDa.
9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que la concentración de dicho sulfato de protamina es de 0,5 a 3 mg/ml, más preferiblemente de 1 a 2 mg/ml, más preferiblemente de 1,2 a 1,8 mg/ml, más preferiblemente de 1,4 a 1,6 mg/ml, más preferiblemente de 2,0 mg/ml.
10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que dicho enriquecimiento de partículas infecciosas del virus del Zika en la preparación del virus del Zika (c) o cualquier preparación final del virus del Zika en relación con los productos totales del virus del Zika en la cosecha bruta (a) está en el intervalo de al menos 50% a 95%, preferiblemente al menos 80%.
11. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que la impureza residual de dicho preparado de virus Zika (c) es inferior al 10%.
12. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que dicho virus Zika se propaga en una línea celular Vero.
13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que dicho virus Zika es preferentemente la cepa H/PH2013 del virus Zika, tal como se define en SEQ ID N°: 72 o una variante inmunogénica de la misma.
14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que dicho proceso que da lugar a la preparación final del virus Zika (c) va seguido de una etapa de inactivación, en la que el virus Zika se inactiva preferentemente mediante formaldehído.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP15202585 | 2015-12-23 | ||
EP16161068 | 2016-03-18 | ||
EP16176049 | 2016-06-23 | ||
EP16176025 | 2016-06-23 | ||
EP16182845 | 2016-08-04 | ||
PCT/EP2016/082667 WO2017109228A1 (en) | 2015-12-23 | 2016-12-23 | Zika virus purification |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2950887T3 true ES2950887T3 (es) | 2023-10-16 |
Family
ID=57821924
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16828746T Active ES2941967T3 (es) | 2015-12-23 | 2016-12-23 | Vacuna contra el virus del Zika |
ES16826741T Active ES2950887T3 (es) | 2015-12-23 | 2016-12-23 | Purificación del Virus Zika |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16828746T Active ES2941967T3 (es) | 2015-12-23 | 2016-12-23 | Vacuna contra el virus del Zika |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (13) | US10744194B2 (es) |
EP (8) | EP4218807A3 (es) |
JP (1) | JP6949027B2 (es) |
KR (1) | KR20180097558A (es) |
CN (2) | CN108697785B (es) |
AU (1) | AU2016375338B2 (es) |
BR (1) | BR112018012873A2 (es) |
CA (1) | CA3009278A1 (es) |
DK (1) | DK3393510T3 (es) |
ES (2) | ES2941967T3 (es) |
FI (1) | FI3393510T3 (es) |
HR (1) | HRP20230273T1 (es) |
HU (1) | HUE061679T2 (es) |
LT (1) | LT3393510T (es) |
MX (1) | MX2018007627A (es) |
PL (1) | PL3393510T3 (es) |
SG (1) | SG11201805120YA (es) |
SI (1) | SI3393510T1 (es) |
WO (6) | WO2017109229A1 (es) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9895437B2 (en) | 2012-04-18 | 2018-02-20 | Valneva Austria Gmbh | Aluminum compounds for use in therapeutics and vaccines |
EA035921B1 (ru) * | 2015-07-16 | 2020-08-31 | Бхарат Байотек Интернэшнл Лимитед | Вакцинные композиции для профилактики арбовирусных инфекций |
HUE061679T2 (hu) | 2015-12-23 | 2023-08-28 | Valneva Austria Gmbh | Zika vírus vakcina |
CA3030154A1 (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric dengue/zika viruses live-attenuated zika virus vaccines |
JP7301811B2 (ja) * | 2017-09-21 | 2023-07-03 | ヴァルネヴァ エスイー | 免疫原性チクングニアウイルスchikv-delta 5nsp3を含む医薬組成物を製造する方法 |
CA3081578A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same |
CN107988239B (zh) * | 2017-11-29 | 2021-03-19 | 南方医科大学 | 一种寨卡病毒的重组基因及其制备方法和应用 |
SG11202003975WA (en) * | 2017-11-30 | 2020-06-29 | Takeda Vaccines Inc | Method for inactivating zika virus and related methods |
CN107904215B (zh) * | 2017-12-27 | 2021-07-27 | 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司 | 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法 |
TWI658848B (zh) * | 2018-02-13 | 2019-05-11 | 國立清華大學 | 茲卡病毒疫苗組合物及其應用 |
CN110156880B (zh) * | 2018-02-13 | 2022-12-16 | 吴夙钦 | 兹卡病毒疫苗组合物及其应用 |
AU2019242601A1 (en) * | 2018-03-26 | 2020-11-12 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Method of producing an immunogenic composition |
CN108676780B (zh) * | 2018-07-24 | 2021-08-10 | 华中农业大学 | 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法 |
CN109337876A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-02-15 | 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 | 一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法 |
EP3883961A1 (en) | 2018-11-20 | 2021-09-29 | Takeda Vaccines, Inc. | Novel anti-zika virus antibodies and uses thereof |
CN109627297B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-06-14 | 复旦大学 | 来自寨卡病毒e蛋白的中和表位及其应用 |
AU2020211990A1 (en) * | 2019-01-22 | 2021-08-12 | 2Seventy Bio, Inc. | Methods and systems for manufacturing viral vectors |
EP3965811A1 (en) * | 2019-05-08 | 2022-03-16 | Takeda Vaccines, Inc. | Inactivated virus compositions and zika vaccine formulations |
EP4010015A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-06-15 | Valneva SE | Chikungunya vaccine formulations |
AU2020328159A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-01-27 | Valneva Se | Single shot Chikungunya virus vaccine |
WO2021048221A1 (en) | 2019-09-09 | 2021-03-18 | Valneva Austria Gmbh | Inactivation process for viruses |
KR102243295B1 (ko) * | 2019-11-15 | 2021-04-23 | 강원대학교산학협력단 | 지카바이러스의 외피 단백질을 포함하는 재조합 백신 조성물 |
KR102365464B1 (ko) * | 2019-12-24 | 2022-02-22 | 강원대학교산학협력단 | 지카바이러스 재조합 서브유닛 백신의 개발 및 이의 제조방법 |
WO2021158815A1 (en) * | 2020-02-05 | 2021-08-12 | New York Blood Center, Inc. | Zika virus immunogenic compositions |
EP3895729A1 (en) | 2020-03-01 | 2021-10-20 | Valneva Austria GmbH | Cpg-adjuvanted sars-cov-2 virus vaccine |
AU2021229710A1 (en) | 2020-03-01 | 2022-10-06 | Dynavax Technologies Corporation | CPG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine |
MX2022010956A (es) * | 2020-03-03 | 2022-10-07 | Mayo Found Medical Education & Res | Polipeptidos del virus del zika. |
TW202203967A (zh) | 2020-04-06 | 2022-02-01 | 奧地利商瓦爾尼瓦奧地利有限責任公司 | 不活化SARS—CoV—2病毒疫苗 |
US20230324404A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-10-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for detection of zika virus specific antibodies |
US20230204567A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-06-29 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for determining the potency of antigens |
WO2021236225A1 (en) | 2020-05-20 | 2021-11-25 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for detection of zika virus specific antibodies |
WO2023148256A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Valneva Austria Gmbh | Inactivated sars-cov-2 virus vaccine |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US86061A (en) * | 1869-01-19 | Improved horse-power | ||
EP1025209B1 (en) * | 1997-08-28 | 2007-02-28 | Cheil Jedang Corporation | An attenuated japanese encephalitis virus adapted to vero cell and a japanese encephalitis vaccine |
CA2341354C (en) * | 1998-09-02 | 2009-10-20 | The Government Of The United States Of America | Dengue viruses that are replication defective in mosquitos for use as vaccines |
AU2001275191A1 (en) | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Chiron Corporation | Method for the purification of alphavirus replicon particles |
WO2002074963A1 (en) * | 2001-03-16 | 2002-09-26 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Healt | Dengue viruses that are replication defective in mosquitos for use as vaccines |
US7871814B2 (en) * | 2001-05-10 | 2011-01-18 | The Regents Of The University Of California | Recombinant bicistronic flaviviruses and methods of use thereof |
ATE485056T1 (de) | 2003-03-24 | 2010-11-15 | Intercell Ag | Verbesserte impfstoffe |
CN101516395B (zh) * | 2006-09-01 | 2014-03-26 | 伯哈拉特生物技术国际有限公司 | 抗屈曲病毒感染的疫苗 |
WO2009048633A2 (en) | 2007-10-11 | 2009-04-16 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Chimeric chikungunya virus and uses thereof |
BRPI0910686A2 (pt) * | 2008-04-21 | 2015-09-29 | Tissue Regeneration Therapeutics Inc | células perivasculares do cordão umbilical humano geneticamente modificadas para a profilaxia contra agentes biológicos e químicos ou para o tratamento dos mesmos. |
SG171828A1 (en) * | 2008-11-26 | 2011-07-28 | Us Gov Health & Human Serv | Virus like particle compositions and methods of use |
WO2010085358A2 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Flaviviruses expressing the prm, e, and ns1 proteins of other flaviviruses and uses thereof |
US8765148B2 (en) | 2010-02-19 | 2014-07-01 | Valneva Austria Gmbh | 1C31 nanoparticles |
EP3785730B1 (en) | 2011-12-06 | 2024-04-24 | Valneva Austria GmbH | Aluminium compounds for use in therapeutics and vaccines |
US9895437B2 (en) | 2012-04-18 | 2018-02-20 | Valneva Austria Gmbh | Aluminum compounds for use in therapeutics and vaccines |
WO2016145149A1 (en) | 2015-03-11 | 2016-09-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army, On Behalf Of The Walter Reed Army Institute Of Research | Combination purified inactivated vaccine for flaviviruses |
EA035921B1 (ru) | 2015-07-16 | 2020-08-31 | Бхарат Байотек Интернэшнл Лимитед | Вакцинные композиции для профилактики арбовирусных инфекций |
HUE061679T2 (hu) | 2015-12-23 | 2023-08-28 | Valneva Austria Gmbh | Zika vírus vakcina |
CN105749268B (zh) | 2016-04-11 | 2020-09-11 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 一种灭活的寨卡病毒疫苗 |
JP7301811B2 (ja) | 2017-09-21 | 2023-07-03 | ヴァルネヴァ エスイー | 免疫原性チクングニアウイルスchikv-delta 5nsp3を含む医薬組成物を製造する方法 |
-
2016
- 2016-12-23 HU HUE16828746A patent/HUE061679T2/hu unknown
- 2016-12-23 EP EP23152481.0A patent/EP4218807A3/en active Pending
- 2016-12-23 US US15/781,825 patent/US10744194B2/en active Active
- 2016-12-23 US US16/063,007 patent/US10639365B2/en active Active
- 2016-12-23 US US16/060,054 patent/US11331382B2/en active Active
- 2016-12-23 FI FIEP16828746.4T patent/FI3393510T3/fi active
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082668 patent/WO2017109229A1/en active Application Filing
- 2016-12-23 EP EP16828745.6A patent/EP3393509B1/en active Active
- 2016-12-23 MX MX2018007627A patent/MX2018007627A/es unknown
- 2016-12-23 AU AU2016375338A patent/AU2016375338B2/en active Active
- 2016-12-23 JP JP2018532747A patent/JP6949027B2/ja active Active
- 2016-12-23 SI SI201631676T patent/SI3393510T1/sl unknown
- 2016-12-23 EP EP16826740.9A patent/EP3393507B1/en active Active
- 2016-12-23 HR HRP20230273TT patent/HRP20230273T1/hr unknown
- 2016-12-23 DK DK16828746.4T patent/DK3393510T3/da active
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082663 patent/WO2017109224A1/en active Application Filing
- 2016-12-23 EP EP16826739.1A patent/EP3393506B1/en active Active
- 2016-12-23 KR KR1020187017319A patent/KR20180097558A/ko unknown
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082664 patent/WO2017109225A1/en active Application Filing
- 2016-12-23 ES ES16828746T patent/ES2941967T3/es active Active
- 2016-12-23 US US16/062,245 patent/US10537630B2/en active Active
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082666 patent/WO2017109227A1/en active Application Filing
- 2016-12-23 EP EP23219512.3A patent/EP4357355A2/en active Pending
- 2016-12-23 US US15/781,959 patent/US10660950B2/en active Active
- 2016-12-23 CN CN201680074939.XA patent/CN108697785B/zh active Active
- 2016-12-23 ES ES16826741T patent/ES2950887T3/es active Active
- 2016-12-23 EP EP23175136.3A patent/EP4253403A3/en active Pending
- 2016-12-23 CA CA3009278A patent/CA3009278A1/en active Pending
- 2016-12-23 PL PL16828746.4T patent/PL3393510T3/pl unknown
- 2016-12-23 EP EP16826741.7A patent/EP3393508B9/en active Active
- 2016-12-23 SG SG11201805120YA patent/SG11201805120YA/en unknown
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082662 patent/WO2017109223A1/en active Application Filing
- 2016-12-23 BR BR112018012873-2A patent/BR112018012873A2/pt active Search and Examination
- 2016-12-23 LT LTEPPCT/EP2016/082664T patent/LT3393510T/lt unknown
- 2016-12-23 CN CN202210678575.3A patent/CN115381934A/zh active Pending
- 2016-12-23 EP EP16828746.4A patent/EP3393510B1/en active Active
- 2016-12-23 WO PCT/EP2016/082667 patent/WO2017109228A1/en active Application Filing
-
2019
- 2019-12-04 US US16/702,764 patent/US11207397B2/en active Active
-
2020
- 2020-03-10 US US16/813,862 patent/US11219681B2/en active Active
- 2020-04-06 US US16/840,760 patent/US11406700B2/en active Active
- 2020-07-13 US US16/927,086 patent/US11524064B2/en active Active
-
2021
- 2021-12-13 US US17/548,721 patent/US20220273786A1/en active Pending
-
2022
- 2022-07-06 US US17/811,059 patent/US20230056142A1/en active Pending
-
2023
- 2023-03-06 US US18/178,638 patent/US11951163B2/en active Active
- 2023-06-14 US US18/334,497 patent/US20240108712A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2950887T3 (es) | Purificación del Virus Zika | |
TW202203967A (zh) | 不活化SARS—CoV—2病毒疫苗 | |
CN108300705B (zh) | 稳定呼吸道合胞病毒融合蛋白的方法 | |
CN110684747A (zh) | 灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法 | |
WO2023287324A1 (en) | Influenza virus-based isolated recombinant virus |