DE2440927A1

DE2440927A1 - Verfahren zur herstellung von aktivierten hb-ag-vaccinen

Info

Publication number: DE2440927A1
Application number: DE2440927A
Authority: DE
Inventors: Tsunekazu Fukushima; Satoshi Funakoshi; Toshihiko Tanaka
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-12-28
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1975-07-03
Also published as: JPS5523253B2; CA1023663A; FR2256247B1; DE2440927C3; CH611338A5; JPS5095420A; DE2440927B2; GB1442564A; FR2256247A1

Description

" Verfahren zur Herstellung von aktivierten HB-Ag-Vaccinen "

Priorität: 28. Dezember 1973, Japan, Nr. 1 648/74

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur'Herstellung von HB-Ag-Vaccinen (Heptatitis B-Antigen-Vaccinen.). Ferner betrifft die Erfindung die nach diesem Verfahren hergestellten

HB-Ag-Vaccinen.

Es v/ird angenommen, daß HB-Ag ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Hepatitis hervorruft. Plasma-HB-Ag gehört elektrophoretisch zu den α- oder ß-Globulinen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt.

Um die Infektivität von HB-Ag zu beseitigen, wird eine Hitzebehandlung durchgeführt. Im allgemeinen wird ein Plasmaalbuminpräparat 10 Stunden bei 60⁰C einer Hitzebehandluiig unterworfen, um nach der Verabreichung an Menschen das Auftreten von

509 827/0784

~ ² " 244092?

Hepatitis zu verhindern. Bei der Verabreichung derartiger Präparate läßt sich jedoch die Bildung von HB-Ab (Antikörper zu HB-Ag) im Blut nicht beobachten. Da Gewebekulturen von HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von konzentrierten Vaccinen zur Verfügung.

In der US-PS 3 735 004 wird die Herstellung einer inaktivierten Vaccine durch 1- bis 3-minütiges Sieden (1 bis 3-minütige Behandlung bei 98°C) eines von Hepatitispatienten entnommenen verdünnten Serums beschrieben. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieser Vaccine wird das Auftreten von Hepatitis verhindert und auch bei bereits hervorgerufener Hepatitis wird der Krankheitsverlauf gemildert. Im allgemeinen wird jedoch die antigene Wirkung durch Erhitzen vermindert. Zur besseren Prophylaxe und Therapie von Hepatitis besteht daher ein Bedarf an inaktivierten Vaccinen mit einer stärkeren antigenen Wirkung und einer geringeren Infektivität, die in großen Dosen verabfolgt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es, HB-Ag-Vaccinen mit stark antigener Wirkung zur Verfügung zu stellen.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß beim Erhitzen einer HB-Ag enthaltenden wäßrigen Lösung in Gegenwart eines Monosaccharide, wie Glucose, eines Disaccharids, wie Saccharose, oder eines Zuckeralkohols, wie Mannit, die antigene Wirkung dieser Lösung deutlich stabilisiert v/erden kann.

509827/0784 8ADORiQlNAL

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von inaktivierten HB-Ag-7/accinen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung von menschlichem, HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart eines Monosaccharide, Disaccharide, Zuckeralkohols oder eines Gemisches dieser Verbindungen als Stabilisator eine ausreichende Z.eit auf 60 bis 120⁰C erhitzt, daß die. Infektivität des HB-Ag ohne Verlust seiner antigenen Wirkung verlorengeht, und anschließend den Stabilisator entfernt.

Eine wäßrige Lösung (pH-Wert 5) mit einem Gehalt an menschli- .' chem Plasmaprotein von 1 Prozent (Gewicht/Volumen) und einem HB-Ag-Titer von 8x, gemessen durch gekreuzte Immunelektrophorese, (im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakamura, Electrophoretic Experimental Method, erschienen bei Bunko-do, (1963), S. 287) wird durch Lösen von α- und ß-Globulinfraktionen von' menschlichem Plasma in. destilliertem Viasser hergestellt. Ferner wird eine entsprechende Lösung hergestellt, die zusätzlich 20 Prozent (Gewicht/Volumen) Mannit enthält. Teile dieser Lösung/T^erden auf Temperaturen von 60 bis 120⁰C erhitzt. Die Abhängigkeit des HB-Ag-Titers von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben.

5OC 3 27/078 4

Tabelle I

	Temp«;	HB-Ag-Titer vor dem Erhitzen	1	(Minuten)^;	10	30	. 1	3	(Stund	en)	24 48
			-		-	-	8x	8x			Ix
		8x	-	3	8x ! I	4x	4x	I I ^2x I	. 6	10	_ _
		8x	8x 4x	-	4x 4x	4x ' I I _2x	IV) IV) X M	2x	! 4x J	4x j I	0
wäßrige Lösung		8x 8x	4x	8x	2x	2x	Ix	-	Ix	-	. - —
		8x	4x	! Ax I 4x	Ix	0	0	-	Ix	Ix
		8x	4x				-	-
^ratur, ⁵C)						-	-

60
70
80 90
100
120

Tabelle I - Fortsetzimg

60

8x

-

*

8x

I

8x

Γ

I
I
I
I
J

8x

8x j
j

4x 4x

' 70

8x

-

8x

8z

I
I
I

4x

4x !

2x

mit Mannit
versetzte

80

8x

I
8x j

4x

4x ;
I

2x

Lösung

90 .

8x

4x

2x

O¹

100

8x

I"
4x !
I
I

Ix

Ix ,

0

120

8x

.8x

8x

4x

2 χ

Ix

Q

0

.. 6

Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Als Maß für den HB-Ag-Titer wird, die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag mit dem IES-Verfahren noch nachweisen läßt.

"-" bedeutet, daß keine. Messung durchgeführt wurde. Die strichpunktierte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, innerhalb derer der HB-Ag-Titer kleiner wird als vor dem Erhitzen. Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten an, bei der der HB-Ag-Titer um die Hälfte bis ein Viertel kleiner wird als vor dem Erhitzen.

Aus Tabelle I geht hervor, daß Mannit eine starke Stabilisierung der antigenen Wirkung von HB-Ag hervorruft. Im Fall der wäßrigen Lösung ohne Mannitzusatz bleibt der vor dem Erhitzen bestehende HB-Ag-Titer nur bei relativ niedrigen Temperaturen im Bereich von 60 bis 80⁰C erhalten. Selbst bei diesen niedrigen Temperaturen dürfen die Erhitzungszeiten nur relativ kurz sein, so daß sie als nicht ausreichend zur Beseitigung der Infektivität anzusehen sind. Beispielsweise ist beim Erhitzen der Lösung auf 60°C die maximal mögliche Erhitzungszeit., bei der der vor dem Erhitzen vorhandene HB-Ag-Titer erhalten bleibt, 3 Stunden und somit wesentlich kürzer als die bisher zur Beseitigung der Infektivität notwendige Erhitzungsdauer von 10 Stunden. Durch den erfindungsgemäßen Mannitzusatz können nicht nur' die Erhitzungszeiten über den ganzen in Tabelle I angegebenen Temperaturbereich unter Beibehaltung des HB-Ag-Titers ausgedehnt werden, sondern es können auch die maximalen Erhitzungszeiten so' verlängert werden, wie sie zur Beseitigung der

509827/0784

Infektivität notwendig sind, d.h. man kann 10 Stunden auf 60⁰C

bzw. 3 Minuten auf 100⁰C erhitzen.

Nimmt man im erfindungsgemäßen Verfahren einen Verlust der antigenen Aktivität durch die Hitzebehandlung um die Hälfte in : Kauf, so läßt sich eine weiter verlängerte Hitzebehandlung durchführen, um eine eventuell hoch vorhandene Infektivität noch gründlicher zu beseitigen. Die Tatsache, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hitzebehandlung 48 Stunden bei 60°C oder 1 Stunde bei 100°C durchgeführt werden kann, bedeutet, daß die dadurch hergestellten inaktivierten Vaceinen in ihrem HB-Ag-Titer mit herkömmlichen inaktiverten Präparaten oder Vaccinen vergleichbar sind und eine geringere Aktivität als diese aufweisen,

Die Stabilisierung der antigenen Wirkung von HB-Ag läßt sich nicht nur durch Mannit erreichen, sondern auch durch Zuckeralkohole, wie Sorbit und Xylit, Monosaccharide, wie Glucose, Mannose, Galactose und Fructose, und Disaccharide, wie Saccharose, Maltose und Lactose, sowie durch Gemische der vorgenannten Verbindungen. Diese Stabilisatoren werden in Konzentrationen von mindestens 5 Prozent (Gewicht/Volumen) vorzugsweise 15 bis 20 Prozent, verwendet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur HB-Ag enthaltende menschliche Plasmaproteine verwendet werden, die beim Menschen tatsächlich Hepatitis verursachen, sondern auch alle anderen Proteine,' in denen sich HB-Ag durch das IES-Verfahren oder auf radioimmunologischem Wege (im folgenden als RIA-Ver-

509827/0784

2U0927

fahren bezeichnet; vgl. Shige.shi Toyoshima et al., "Pediatric

Clinic"/ nachweisen läßt/

/(Japan) Bd. 24, 1971, S. 3044)/. Es können also Plasma, Serum und verschiedene, durch übliche Verfahren zur Plasmafraktionierung erhaltene Proteinfraktionen verwendet v/erden.

Wie sich elektrbnenmikroskopisch feststellen läßt, ist HB-Ag von unterschiedlicher Gestalt und Größe. Ebenso hängt auch die Infektivität in spezifischer Weise von der einzelnen,HB-Ag enthaltenden Plasmaproteinfraktion ab. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen HB-Ag-Gehalts, gemessen nach dem RIA-Verfahren,eine deutlich höhere Hepatitisinfektivität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist vermutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält. Die HB-Ag-Menge in einem Albuminpräparat ist, gemessen nach dem RIA-Verfahren, zumindest äquivalent der in der Fibrinogenfraktion enthaltenen Menge, jedoch ist ihre Infektivität so gering, daß sie kaum Hepatitis verursacht, wenn das Präparat einer lOstündigen Hitzebehandlung bei 60⁰C unterzogen wird. Andererseits ist der HB-Ag-Gehalt von α- und ß-Globulinfraktionen höher als der der Albuminfraktion. Demgemäß ist die in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin- und Haptoglobinpräparaten festgestellte HB-Ag-Menge größer als im Albuminpräparat. Diese Transferrin- und Haptoglobinpräparate verursachen jedoch beim Menschen keine Hepatitis, wenn sie nach einer unter den gleichen. Bedingungen wie beim Albuminpräparat durchgeführten Hitzebehandlung verabfolgt v/erden. Es'ist daher anzunehmen, daß das in den α- und ß-Globulinfraktionen enthaltene HB-Ag eine geringe Infektivität aufweist.

509 827/0 7 84

Als Ausgangsmaterialien werden im erfindungsgemäßen Verfahren α- und ß-Globulinfraktionen, die große Mengen an HB-Ag enthalten und eine geringe Infektivität aufweisen, besonders bevorzugt. Diese Fraktionen werden zweckmäßigerweise als Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen erhalten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Plasmaproteinfraktionen werden nach herkömmlichen Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaprotein gewonnen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen nach Cohn; vgl. E.J. Cohn, L.E. Strong, W.L. Hughes, D.J. Mulford, J.N. Ashworth, M. Melin und H.L. Taylor, Journal of the American Chemical Society, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden α- und ß-Globulinfraktionen als Fraktionen IV und IV-1 gemäß der Cohn¹sehen Fraktionierung oder als Niederschläge bei der Fällung mit Ammoniumsulfat bei 35 bis 50prozentiger Sättigung erhalten. Falls die wäßrigen Lösungen der Proteinfraktionen trübe sind, können sie zur Erleichterung der weiteren Verarbeitung geklärt v/erden. Die Klärung wird beispielsweise durch Zentrifugieren oder durch Erhitzen der Lösung auf etwa 60⁰C bei neutralem pH-Wert und anschließendes Abfiltrieren der Niederschläge durchgeführt.

Beispiele für wäßrige Medien, in denen das erfindungsgemäße Erhitzen des HB-Ag enthaltenden Ausgangsmaterials in Gegenwart des Stabilisators durchgeführt werden kann_f sind Wasser und physiologisch verträgliche Salzlösungen. Die zu" erhitzende Lösung weist zweckmäßigerweise einen im wesentlichen neutralen pH-Wert auf und wird in einem pH-Bereich von 5 bis 9» Vorzugs»

. 509827/0784

weise 6,5 bis 7,5 gehalten. Zur Aufrechterhaltung eines gewünschten pH-Werts wird zweckmäßigerweise ein Puffer verwendet. Als Puffersubstanzen eignen sich anorganische Salze, wie Phosphate und Carbonate oder organische Salze, wie Acetate, Trisarainomethan-hydroChlorid und Glycin-hydrochlorid.

Wie bereits erwähnt, liegt die Erhitzungsteraperatur im Bereich von 60 bis 120°C. Die Erhitzungszeiten hängen von der Erhitzungstemperatur ab. In jedem Fall wird die Erhitzungszeit so gewählt, daß sie ausreicht, die Infektivität ohne Verlust der antigenen Wirkung,wiedergegeben durch den HB-Ag-Titer, zu beseitigen. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich die bisher zur Hitzebehandlung von Albuminfraktionen und a- und ß-Globulinfraktionen üblichen Hitzebehandlungen von 10 Stunden bei 6O⁰C bzw. 3 Minuten bei 100⁰C auf 48 Stunden bzw. 1 Stunde ausdehnen. Ebenso lassen sich die Erhitzungszeiten bei anderen Temperaturen verlängern. Wenn von den verschiedenen verlängerten Erhitzungszeiten bei verschiedenen Temperaturen eine relativ kurze Zeit ausgewählt wird, bei der die Infektivität aber nicht die antigene Wirkung beseitigt wird, läßt sich eine Vaccine erhalten, die im Bezug auf herkömmliche Vaccine eine geringere oder höchstens gleich große Infektivität aufweist. Die antigene Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Vaccines wiedergegeben durch den HB-Ag~Titer, entspricht der vor dem Erhitzen vorhandenen Wirkung. Werden andererseits unter den erfindungsgemäßen Bedingungen relativ lange Erhitzungszeiten ausgewählt, läßt sich inaktiviertes HB-Ag erhalten, dessen antigene Wirkung zwar abgenommen hat, dessen Infektivität aber wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist. Durch Einengen

509827/0784

des inaktivierten HB-Ag erhält man Vaccinen, die in großen Dosen verabfolgt werden können.

Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und anschließend gegen eine isotonische Lösung, wie isotonische Kochsalzlösung, zur Entfernung von Stabilisator, Pufiersalz und gebildeten niedermolekularen Substanzen dialysiert, wonach eine Vaccine erhalten wird. Durch Dialyse unter vermindertem Druck nach einem üblichen Verfahren läßt sich die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten Substanzen einengen. Die so erhaltenen Vaccinelösungen werden auf eine geeignete Konzentration eingestellt und anschließend der Sterilfiltration unterzogen, wodurch an Menschen verabreichbare Vaccinen erhalten werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die HB-Ag-Titer sind nach dem IES-Verfahren bestimmt.

Beispiel 1

Aus 1000 ml Sammelpiasrna (HB-Ag-Titer 8x) das aus 28 einzelnen Plasmaproben mit HB-Ag-Titern von 4x bis 32x besteht, werden die Fraktionen IV-1 und IV-4 nach dem Cohn¹sehen Verfahren durch Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen gewonnen. Das Gemisch wird bei 4⁰C in destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wird dialysiert und von unlöslichen Bestandteilen befreit. Man erhält 200 ml einer wäßrigen Lösung, die 1 Stunde auf 60⁰C erhitzt, vom gebildeten Niederschlag befreit und sodann gegen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 dialysiert wird. Man erhält 180 ml Lösung. Diese Lösung wird bis zu

509827/0784

- ¹² - 2UQ927

(Gew.

einer Konzentration von 20 Prozent/mit Mannit versetzt und 1 Stunde unter Verwendung eines Ölbads in einem verschlossenen Gefäß auf 105⁰C erhitzt, um Niederschläge abzuscheiden. Anschließend wird die Lösung vom Niederschlag abzentrifugiert und sodann unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, wobei Mannit entfernt und gleichzeitig die Lösung eingeengt wird. Man erhält 30 ml einer Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 128x. Diese. Lösung ergibt nach Sterilfiltration 25 ml einer injizierbaren Lösung/

Beispiel 2

100 ml Sammelplasma aus 12 einzelnen Plasmaproben mit einem HB-Ag-Titer \^on 4x werden in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wird durch Zugabe von 1 η HCl bzw. 1 η NaOH auf den pH-Wert 7,0 eingestellt. .Anschließend wird zur Ausfällung von Fibrinogen und y-Globulin Ammoniumsulfat bis zum Erreichen von 35 Prozent der Sättigungskonzentration zugesetzt. Nach dem Abzentrifugieren der gebildeten Niederschläge wird die Ammoniumsulfatkonzentration auf 50 Prozent der Sättigungskonzentration angehoben, und die gebildeten Niederschläge werden abzentrifugiert. Sodann werden die Niederschläge in 0,06 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 ge-

24 Stunden
löst und/gegen den gleichen Puffer dialysiert. Man erhält

20 ml Lösung. Diese Lösung wird bis zu einer Konzentration von

(Gew./Vol.)/
20 Prozent/mit Saccharose versetzt und anschließend 10 Minuten auf 120⁰C erhitzt. Der dabei gebildete Niederschlag wird anschließend abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird 24 Stunden gegen einen 0,06 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2, der 0,14 m an'Natriumchlorid ist, dialysiert. Nach Sterilfil-

50982 7/0784

- 13 tration erhält man 2 ml einer injizierbaren Lösung,

Beispiel 3

Aus Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 8x wird gemäß dem Cohn¹sehen Verfahren durch Fällung mit Äthanol bei niedrigen Temperaturen die Fraktion IV-1 gewonnen. lOLiter einer wäßrigen Suspension dieser Fraktion werden 48 Stunden gegen Wasser dialysiert und anschließend zur Entfernung der Niederschläge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 Stunden auf 60 C erhitzt. Die dabei gebildeten Niederschläge werden abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung wird bis zu einer Konzentration von 0,05 m mit dibasischem Natriumphosphat (NapHPO^.12HpO) und anschließend mit monobasischem Kaliumphosphat (ΚΗρΡΟΛ.2HaO) bis zu einem pH-Wert von 7,2 versetzt. Die erhaltene, gepufferte Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20 Prozent (Gewicht/Volumen) Glucose versetzt, 10 Stunden auf 80⁰C erhitzt und anschließend gegen einen 0,06 m Phosphatpuffer, der 0,14 m an Natriumchlorid ist und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, dialysiert. Man erhält 40 ml einer klaren Lösung. Diese Lösung ergibt nach Sterilfiltration eine injizierbare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 512x.

Beispie 14

Beispiel 3 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß die Phosphatpufferlösung anstelle von Glucose mit 15 Prozent (Gewicht/Volumen) Xylit, Lactose bzw. Mannose versetzt wird. Man erhält Lösungen mit einem HB-Ag-Titer von 128x, 128x bzw;-256x. - ■ ·

509827/0 7 8 4

Claims

Patentansp r'ü ehe

fly Verfahren zur Herstellung von inaktivierten HB-Ag-Vaccinen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von menschlichem, HB-Ag enthaltendem Plasmaprotein in Gegenwart eines Monosaccharids, Disaccharids, Zuckeralkohols oder eines Gemisches dieser Verbindungen als Stabilisator eine ausreichende Zeit auf 60 bis 12O⁰C erhitzt, daß die Infektivität des HB-Ag ohne Verlust seiner antigenen Wirkung verlorengeht und anschließend den Stabilisator entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Monosaccharid,Glucose, Mannose, Galactose oder Fructose verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Disaccharid Saccharose, Maltose oder Lactose verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zuckeralkohol Mannit, Sorbit oder Xylit verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als menschliches Plasmaprotein α- und ß-Globulinfraktionen verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung mit einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 verwendet.

509827/0784
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 5₅ dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Puffer eingestellt ist. ' -
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung verwendet, deren pH-Wert mit einem Phosphatpuffer eingestellt ist.
10. Verfahren nach Anspruch .1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator in einer Konzentration von mindestens 5 Prozent (Gewicht/Volumen) einsetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator in einer Konzentration von 15 bis 20 Prozent (Gewicht/Volumen) einsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator durch Dialyse entfernt.

509827/0784