DE2734150C3 - Verfahren zur Herstellung von Human-Lysozympräparaten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Human-LysozympräparatenInfo
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Description
»Lysozym« ist ein allgemeiner Ausdruck für Enzyme, die die Hydrolyse von Mucopolysacchariden in Bakterienzellwänden
katalysieren und diese dabei auflösen.
In Albumin aus Geflügeleiern beträgt der Lysozymgehalt
3 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein. Deshalb werden Lysozympräparate vorwiegend aus
Eiweiß von Hühnereiern hergestellt. Andererseits findet sich Lysozym auch in menschlichen Körperflüssigkeiten,
wie Tränen, Nasenschleim, Blut und Urin. Mit Ausnahme der Tränen ist aber dabei der Lysozymgchalt
sehr gering. Ein höherer Lysozymgehalt findet sich in Körperflüssigkeiten von Leukämiepatienten. 1967 wurde
e/stmals Human-Lysozym in kristalliner Form aus
Urin von Patienten mit monozytärer Leukämie durch Adsorption an Bentonit isoliert; vgl. Osserman, Science,
Bd. 155 (1967), S. 1536 bis 1537 und P. Jolles, Angew.
Chem., 81 (1967), S. 244 bis 256.
Da aus Hühnereiweiß isoliertes Lysozym für den menschlichen Körper ein heterogenes Protein darstellt,
ist dessen Anwendung und Verabreichungsart bei der Verwendung als Arzneistoff in der Humanmedizin
Beschränkungen unterworfen Außerdem beträgt dessen enzymatische Aktivität nur etwa 1/2 bis 1/3 im
Vergleich von Human-Lysozym. jedoch ist die Menge an Lysozym, die in zur Verfügung stehenden Körperflüssigkeiten
oder Geweben von normalen Menschen zur Verfugung steht, sehr gering. Beispielsweise beträgt
der Gehalt in normalem menschlichem Blut nur 2 bis 10 T. p. M. Zur Zeit steht ein wirtschaftlich arbeitendes und
in größerem Maßstab durchführbares Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Lysozym aus normalem
menschlichem Blut nicht zur Verfugung. Die Verwendung von Tränen, Nasenschleim oder Urin von
Leukämiepatienten als Queile zur Lysozymgewinnung für medizinische Zwecke kommt nicht in Betracht
Aus der DE-AS 17 67 404 ist bereits ein Verfahren zur Gewinnung von Lysozym aus einem Iyso2ymhaltigen
Ausgangsmaterial unter Verwendung einer Carboxyalkylcellulose
bekannt, das dadurch gekennzeichnet ist .iaß das Iysozymhaltige Ausgangsmaterial auf einen
pH-Wert über 7, vorzugsweise 9 bis 114 gepuffert, dann
mit einer Carboxylalkylcellulose in Berührung gebracht
die Carboxylalkylcellulose abgetrennt und das daran absorbierte Lysozym anschließend mit einer verdünnten
Salzlösung oder mit einer Pufferlösung, der ein Salz zugesetzt wurde, eluiert wird.
Versuche haben ergeben, daß bei Verwendung einer auf ein^n pH-Wert von 10 äquilibrierten CM-Cellulose
und einer aus Plazentablut gemäß dem Verfahren der JP-AS 40 132/1976 hergestellten, thermisch stabilen
Plasmaproteinlösung (vgl. das nachstehende Beispiel 1) das Albumin zwar durch den Austauscher wandert, aber
etwas modifiziert ist Die Wiedergewinnung dieses Albumins beträgt nur etwa 50%.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von Human-Lysoz^mpräparaten
aus menschlichem Blut zur Verfügung zu stellen.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß Lysozym in der Albuminfraktion von Blut angereichert
werden kann. Erfindungsgemäß läßt sich Lysozym aus der Albuminfraktion nach einem einfachen Verfahren
isolieren.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Human-Lysozympräparaten, wobei
man menschliches Blut zur Isolierung einer Albuminfraktion unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden
fraktioniert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Albuminfraktion zur Adsorption des darin
enthaltenen Lysozyms mit einem schwach sauren Kationenaiistauscher bei einem pH-Wert von 7 bis 9 in
Kontakt bringt und das adsorbierte Lysozym desorbiert.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als menschliches
Blut vorzugsweise menschliches Normalblut verwendet, wozu auch Blut in Plazentagewebe und
retroplazentales Blut gehört. Es ist bekannt, daß die Albuminfraktion aus derartigem menschlichem Blut
durch Fraktionierung unter Ausnutzung von Löslichkcitsunterschieden
abgetrennt werden kann. Als derartige Verfahren kommen hauptsächlich die Fraktionierung
mit Ammoniumsulfat oder die Fraktionierung mit Alkohol bei niedrigen Temperaturen gemäß Co h η in
Frage. Bei der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat wird die Albuminfraktion im Blut in Form von
Niederschlagen gesammelt, die sich bei einer Sättigung mit Ammoniumsulfat in einem Konzentrationsbereich
von 45 bis 75 Prozent bilden. Bei der Alkoholfällung bei niedrigen Temperaturen gemäß Co h η wird die
Albuminfraklion im Blut in den Fraktionen IV-I und V gewonnen. Diese Fraktionen werden gereinigt und sind
als Albuminpräparate Handelsprodukte. In der Literatur sind eine Anzahl von Verfahren beschrieben, die eine
Modifikation oder Verbesserung dieser Fraktionierungs- und Reinigungsverfahren betreffen. Hier sei auf
folgende Literaturstellen verwiesen;
(l)AusPIasmaoderSerum
Verfahren, bei dem der Überstand der Fraktion IV-I gemäß C ο h η nochmals der Fraktionierung mit
Äthanol bei einer Konzentration von 25 bis 38 Prozent unterzogen wird (vgL US-PS 29 58 628); Verfahren, bei
dem Proteinverunreinigungen, wie Lipoprotein, aus der in
Fraktion IV-I jinter Verwendung von organischen
Säuren und 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridin-lactat (Acrinol)
entfernt werden (vgl. US-PS 40 17 470); Verfahren, bei dem Albumin aus dem Niederschlag der Fraktion
IV-4 gewonnen wird (vgl. US-PS 38 50 903); Verfahren, ι ί
bei dem eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an Albumin mit einer Fettsäure versetzt wird, das erhaltene
Gemisch erwärmt wird und anschließend gereinigtes Albumin gewonnen wird (vgl. US-PS 27 65 299 und
27 05 230).
(2) Aus Plazenta
Ein Verfahren, bei dem ein flüssiger Plazer^aextrakt
zur Entfernung von Verunreinigungen nacheinander mit Citronensäure, Phenol und Natriumcarbonat extrahiert >->
und anschließend Albumin gewonnen wird (vgl. jP-AS 7762/1973); ein Verfahren, bei dem ein flüssiger
Plazentaextrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert wird, diese Fraktion mit Buttersäure versetzt und erhitzt wird
und anschließend das Albumin aus dem Überstand u> gewonnen wird (vgl. JP-AS 16 041/1968); Verfahren: bei
dem im letztgenannten Verfahren anstelle von Buttersäure Alkohol und ein Salz einer Fettsäure verwendet
wird (vgl. US-PS 39 26 939); Verfahren, bei dem statt dessen Mandelsäure oder Capronsäure und Äthylendi- r>
amintciraessigsäure verwendet werden (vgl. JP-OS
88 621/1976); Verfahren, bei dem statt dessen Mandelsäure
verwendet wird (vgl. JP-AS 40 132/1976): Verfahren,
bei dem statt dessen Caprylsäure und Chloroform verwendet wird (vgl. GB-PS 14 41 752). -m
Sämtliche vorerwähnten Verfahren lassen sich erfindungsgemäß zur Herstellung der Albuminfraktion
anwenden. Bei Verwendung von Plasma oder Serum als Ausgangsmaterial werden vorzugsweise die Verfahren
der US-PS 40 17 470 und 29 58628 angewendet. Bei -n Verwendung von Plazenta ist es empfehlenswert, ein
Verfahren anzuwenden, bei dem dit Albuminfraktion aus Plazenta zur Entfernung von Proteinverunreinigungen
in Gegenwart einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen erhitzt wird. Vorstehend sind "><
> Literaturstellen für derartige Verfahren angegeben.
Nachstehend wird eine Zusammenfassung der Verfahrender
US-PS 40 17 47Gund29 58 628 gegeben:
»Verfahren zur Herstellung von wärmestabilen Plasmaproteinlösungen ohne blutdrucksenkende Wir-
<. kung, wobei destilliertes Wasser zu dem Brei IV-I, einer
bei der Fraktionierung von Plasma mit kaltem Äthanol gemäß C ο h η erhaltenen Fraktion, zur Extraktion von
wasserlöslichen Proteinen aus diesem Brei versetzt und die im Gemisch enthaltenen Feststoffe durch Zentrifu- nu
gieren unter Bildung eines Extrakts mit einem Gehalt an wasserlöslichen Proteinen zentrifugiert, den erhaltenen
Extrakt mit einem pH-Wert von 4.5 bis 5,5 bei 50 bis 65"C mit einer organischen Säure mit 4 bis 8
Kohlenstoffatomen bis zu einer Rndkonzcntration der i>-,
organischen Säure von 2 bis 6 Prozent (Gewicht/Volumen) behandelt, durch Filtrieren oder Zentrifugieren im
Extrakt erhaltene Lipo- v.nd Glycoproteine als Niederschläge
entfernt, den erhaltenen Überstand mit 0,2 bis 3,0 g Acrinol pro Liter Überstand versetzt, das Gemisch
bei Raumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen stehenläßt und die restlichen Lipoproteine durch
Fällung, wobei eine Trübung des Überstands entsteht, entfernt, und anschließend im erhaltenen Überstand
enthaltene blutdrucksenkende Substanzen durch Adsorption mit einem anorganischen Adsorptionsmittel
oder einem Kationenaustauscher entfernt«.
»Verfahren zur Fraktionierung von menschlichem Plasmaprotein durch fraktionierende Fällung mit
kaltem Äthanol nach vorheriger Entfernung von sämtlichen koagulierenden Bestandteilen und dem
gesamten y-Globulin, wobei ein Gemisch aus Albumin,
«-Globulin und ^-Globulin bei einer Temperatur zwischen —2° C und dem Gefrierpunkt der Lösung,
einer Ionenstärke von weniger als 0,12 und einer Proteinkonzentration von mehr als 2,2 Prozent bei einer
Äthanolkonzentration von 25 bis 38 Prozent bei einem pH-Wert von 43 bis 4,7 gefällt wird«.
Als Beispiel für ein bevorzugtes v;rfahren bei der
Verwendung von Plazenta wird nachstehend eine Zusammenfassung des Verfahrens der JP-AS 40 132/76
gegeben:
»Verfahren zur Gewinnung von wärmestabilem, menschlichem Plasmaprotein aus Plazenta oder retroplazentalem
Blut des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Plazenta oder
retroplazentales Blut vom Menschen verwendet, die bzw. das unmittelbar nach seiner Gewinnung gefroren
oder verschlossen worden ist, aus einer aus dem Ausgangsmaterial fraktionierten Lösung von Blutbestandteilen
das y-Globulin unter Gewinnung eines Überstands abtrennt, den Überstand mit fester Mandelsäure
oder einer Lösung derselben bis zu einer Säurekonzentration von 2.5 bis 5,0 Prozent versetzt, den
pH-Wert der Reaktionslösurig im Bereich von 4,5 bis 5,5 hält, die Lösung auf 58 bis 62°C erwärmt, sämtliche
entstandenen Niederschläge entfernt und die gewünschte Substanz aus dem Überstand gewinnt«.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können mit Erfolg die vorerwähnten Albuminfraktionen oder daraus
hergestellte gereinigte Präparate eingesetzt werden. Es geht auf den erfindungsgemäßen Befund zurück, daß
während der gesamten Fraktionierung des Bluts aufgrund von Löslichkeitsunterschiedeii das Lysozym
sich wie Albumin verhält und somit beide Bestandteile in den Albuminfraktionen angereichert werden. Dieses
Verhalten von Lysozym wurde bisher nicht beschrieben. Das angereicherte Lysozym wurde bisher als Verunreinigung
in Albuminpräparaten übersehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Lysozym umfaßt die Fraktionierung von menschlichem
Plasma, menschlichem Serum oder Blut aus menschlicher Plazenta, wie ein Extrakt aus menschlicher
Plazenta oder menschliches retroplazentales Blut, um Albuminfraktionen daraus unter Ausnutzung von
Löslichkeitsunterschieden zu isolieren. Die isolierten Albuminfraktionen werden sodann, wie bereits erwähnt,
mit einem schwa· h sauren Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 7 bis 9 in Kontakt gebracht, wobei
das Lysozym am Austauscher adsorbiert wird. Schließlich wird das adsorbierte Lysoz.ym desorbiert und
gewonnen.
Bei der Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem verfahren zur Herstellung von
Albuminpräparaten läßt sich Lysozym zusammen mit einem weiter gereinigten Albumin erhalten. Demgemäß
wird als Ausgangsmaterial vorzugsweise eine gereinigte Lösung einer Albuniinfraktion verwendet, die noch
nicht sterilisiert, filtriert, getrocknet und zu einem Präparat verarbeitet worden ist. Die Lösung enthält
Albumin mit einem Reinheitsgrad von 50 bis 97 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein.
Als schwach saurer Kationenaustauscher wird vorzugsweise Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose),
Phosphocellulose (p-Cellulose) und Carboxymethyl-Sephadex
(CM-Sephadex, d. h. vernetztes Dextran mit Carboxymethylgruppen) verwendet. Die Lösung wird
mit dem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 7 bis 9 in Kontakt gebracht. Die pH-Werte der Lösung
mit der Albuminfraktion und des Kationenaustauschers werden vorzugsweise unter Verwendung eines Puffers,
beispielsweise 0,02 m Phosphatpuffer, auf den vorerwähnten Bereich eingestellt. Der Kontakt kann
durchgeführt werden, indem man entweder die Bestand-Ipilp
pinfarh vprmisch* odpr 'Ji? LÖS'JP11 ΓΠΪΐ der
Albuminfraktion über eine mit dem Kationenaustauscherharz gepackte Säule gibt. Dabei wird das Lysozym
in der Lösung vollständig am Kationenaustauscher adsorbiert, während das Albumin in weiter gereinigtem
Zustand in der Lösung verbleibt. Der Kationenaustauscher mit dem adsorbierten Lysozym wird vorzugsweise
mit dem vorstehend erwähnten Puffer gewaschen, wonach das Lysozym vom Kationenaustauscher auf
übliche Weise mit einem Elutionsmittel, wie einer alkalischen Lösung (pH-Wert 10 bis 12), einer
hochkonzentrierten Lösung eines anorganischen neutralen Salzes (beispielsweise eine etwa 5 bis ISprozentige
Lösung von Natriumchlorid) oder einer wäßrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer
Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent und einem pH-Wert von 8 bis 10, eluiert wird.
Mit Ausnahme der vorerwähnten Bedingungen bestehen bei der Adsorption und Desorption keine
speziellen Beschränkungen. Die Temperatur kann im Bereich der Umgebungstemperatur von 3 bis 20'C
liegen. Die Menge des schwach sauren Kationenaustauschers beträgt im allgemeinen etwa 30 bis 100 ml pro I
Liter Ausgangslösung mit einem Gehalt an 3 bis 10 KrozennL/ewicnt/volumen) Albumin.
Die Lysozymkonzentration im Eluat wird durch
Messen der Proteinkonzentration bei 280 nm oder ! jrbidimetrisch (vgl. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.. Bd. 1 19
(!965), S. 384 bis 386) unter Berücksichtigung des Lysozymtiters bestimmt. Das Eiuat wird 10 bis 20
Stunden gegen Wasser dialysiert. bis die anorganischen Salze praktisch ganz entfernt sind. Anschließend wird
der pH-Wert auf 5.0 bis 6.0 eingestellt. Gegebenenfalls wird 10 Stunden auf 60cC erhitzt, um Hepatitisviren zu
inaktivieren. Lysozym ist bei erhöhten Temperaturen dieser Größenordnung beständig. Anschließend wird
sterilisiert und filtriert. Man erhält eine Lösung eines injizierbaren Lysozympräparats. Schließlich kann die
Lösung zu einem festen Vorratspräparat von Lysozym gefriergetrocknet werden.
Das auf diese Weise erhaltene Lysozympräparat weist eine Reinheit von 60 Prozent oder mehr auf und
kann direkt zur intravenösen, intraarteriellen oder intramuskulären Injektion verwendet werden. Selbstverständlich
kann das Präparat dem menschlichen Körper auch in Form eines Collyriums. eines Aerosols
oder eines oralen Präparats verabfolgt werden. Es kann zu beliebigen Zeitpunkten ohne Auftreten von allergischen
Reaktionen in Dosen von 0.! bis 20 mg Titer/kg Körpergewicht bei Verwendung als injektionspräparat
und in Dosen von 0,2 bis 10 mg Titer/ml, be Verwendung als künstliche Tränen oder Collyriun
verabfolgt werden.
Durch zusätzliche Reinigung des auf die vorstehend*
> Weise erhaltenen Lysozympräparats ist es möglich kristallines Lysozym zu erhalten. Dabei wird dit
Lysozymlösung der Gelfiltration an vernetzten! Dex trän, beispielsweise Sephadex G-50, bei einem pH-Wer
von 5 bis 6 unterworfen, wodurch die Reinheit de;
ίο Lysozyms bis auf 90 Prozent erhöht wird. Anschließenr
wird die gereinigte Lösung gegen Natriumchloridlösunf (pH-Wert 4 bis 5) dialysiert. Die dialysierte Lösung wire
schließlich eingeengt. F i g. I zeigt eine photographisclu
Abbildung in 400facher Vergrößerung eines auf diesr
Γι Weise erhaltenen Kristalls.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergeslell tes Human-Lysozym kann auf oralem Wege ar
Patienten verabfolgt werden, die an Krankheiten leiden die mit herkömmlichen I.y<;o7ymnränaratpn air
2Ί Hühnereiweiß behandelt werden können. Ferner kam
das erfindungsgemäß hergestellt·: Lysozympräparai auch durch Injektion verabfolgt werden. Somit weiser
die erfindungsgemäßen Präparate einen vergrößerter Anwendungsbereich auf. Beispielsweise kann man da1
r. Lysozym auf einen bakteriellen Eiterherd einwirker lassen, indem man es direkt in den Herd oder über die
Arterie injiziert. Ferner ist es möglich, daß astmatische Patien'en die erfindiingsgcmäßen Lysozympräparate ir
ihohen Konzentrationen inhalieren, um Sputum, das be
in einem Asthmaanfall die Bronchiolen verstopft, zi
beseitigen. Bei einem derartigen Anfall kann eine Besserung ohne allergische Reektionen erzielt werden
Gelegentlich können Patienten sogar vor dem Tode bewahrt werden.
r, Erfindungsgemäß lassen sich Human-Lysozympräpa
rate, die bisher auf dem Markt nicht zur Verfügung standen, in hoher Reinheit herstellen, indem man. wie
bereits erwähnt, eine Blutfraktionierung unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden anwendet. Die<
■■■' stellt auch die grundlegende Verfahrensmaßnahme vor
herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Human Albuminpräparaten dar. Ein Nebeneffekt des crfin
dungsgemauen Verfahrens besteht dann, dau eine
Albuminfraktion in weiter gereinigter Form crhaltcr
• "i werden kann. Aus diesen Gründen ist das erfindungsge
mäße Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt au·· wertvoll.
Die Angabe »Prozent« (Gewicht/Volumen) in der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet, daß die
v. Konzentration eines gelösten Stoffes in einer Lösung als Verhältnis des Gewichts des gelösten Stof s pro
Volumeneinheit der Lösung angegeben ist.
Die Beispiele erläutert die Erfindung.
Die Beispiele erläutert die Erfindung.
10 Liter einer thermisch stabilen Plasmaproteinlösung (Proteingehalt 600 g; chemische Zusammensetzung
des Proteins: Albumin 95 Prozent, λ- und ^-Globuline 4 Prozent, Proteine, die von der y-Region
tv zur Kathode wandern, 1 Prozent), die aus Plazeruabiut
gemäß dem Verfahren der JP-AS 40 132/1976 erhalten worden ist, wird mit 1 η NaOH-Lösung auf den
pH-Wert 7.0 ± 0.05 eingestellt. Diese Lösung des thermisch stabilen Plasmaproteins wird über eine mit
<;") 100 g CM-Cellulose gepackte Säule, die vorher gründlich
gewascher, und auf einer. pH-Wert von 7,0 ± 0,05
eingestellt worden ist. gegeben. Man ^häk eine
Albuminfraktion, deren optische Dichte bei 280 nm
bestimmt wird. Sie weist nahezu den gleichen Proteingehalt wie die vorher auf die Säule aufgesetzte
Lösung auf, so daß mehr als 99 Prozent des Proteins an der Säule nicht adsorbiert werden. Die erhaltene
Fraktion enthält überhaupt kein Lysozym, was anzeigt, daß das Lysozym vollständig durch die CM-Cellulose
adsorbiert worden ist. Um das auf der Säule verbliebene Albumin zu entfernen, wird die Säule mit 1000 ml 0,02 m
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure
(pH-Wert 9,0) und anschließend mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 0,13 m NaCI (pH-Wer; <J,0) gewaschen. Sodann wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 15 Prozent NaCI (pH-Wert 9,0) über die Säule gegeben. Das eluierte Lysozym weist einen Reinheitsgrad von etwa 80 Prozent auf. Das Eluat wird gegen fließendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet.
(pH-Wert 9,0) und anschließend mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 0,13 m NaCI (pH-Wer; <J,0) gewaschen. Sodann wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 15 Prozent NaCI (pH-Wert 9,0) über die Säule gegeben. Das eluierte Lysozym weist einen Reinheitsgrad von etwa 80 Prozent auf. Das Eluat wird gegen fließendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet.
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Präparate weisen eine spezifische Aktivität von 3,2 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 1,6 mg
auf. Die Gesamtausbeute beträgt 208 mg.
B e i s ρ i e I 2
10 Liter thermisch stabiles Plasmaprotein (Proteingehalt 500 g; chemische Zusammensetzung des Proteins:
Albumin 87,0 Prozent, «-Globulin 8,4 Prozent, ^-Globulin 3,6 Prozent, andere Proteine, die von der y-Region
zur Kathode wandern, 1 Prozent), das aus dem Cohn-Überstand der Fraktion IV-I aus menschlichem
P.jsma gemäß dem Verfahren der US-PS 29 58 628 erhalten worden ist, wird mit 1 η NaOH-Lösung auf den
pH-Wert 7,0 ± 0,05 eingestellt. Ferner werden 600 ml p-Cellulose, die gründlich mit Wasser gewaschen und
mit 0,02 m Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,0 ± 0,05 eingestellt worden ist, in eine Säule gepackt. Über diese
Säule wird die vorstehend erwähnte thermisch stabile Plasmaproteinlösung gegeben. Das in dieser Lösung
enthaltene Albumin passiert die Säule ohne adsorbiert zu werden. Anschließend wird die Säule mit dem
gleichen Puffer, wie er zur Äquilibrierung verwendet worden ist. eewaschen und sodann zur vollständigen
Entfernung des Albumins von der Säule mit 0,02 m Tris-(hydroxymethyI)-aminomethan-Salzsäure mit
einem Gehalt an 0,13 m NaCl gewaschen. Anschließend wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-SaIzsäure mit
einem Gehalt an 8 Prozent NaCl (pH-Wert 8,5) über die Säule gegeben. Das Eluat wird gesammelt, gegen
laufendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet Das auf diese
Weise in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad von 60 Prozent, eine spezifische
Aktivität von 2,4 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 2,1 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt
30 mg.
Aus 10 Liter Plasmaprotein, das Albumin als Hauptbestandteil enthält (chemische Zusammensetzung
des Proteins: Albumin 95 Prozent,«- und ^-Globuline 4
Prozent, andere Proteine, die von der y-Region zur Kathode wandern. 1 Prozent) und das aus dem
Niederschlag der Cohn-Fraktion IV-I gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 der US-PS 40 17 470 erhalten
worden ist, wird Lysozym gemäß Beispiel 1 gewonnen. Das in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist
einen Reinheitsgrad von 65 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,6 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt
von 1,9 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt ΟΛ ma
—— ..·ο·
Aus 10 Liter thermisch stabilem Plasmaprotein wird gemäß Beispiel 1 Lysozym gewonnen. Das thermisch
stabile Plasmaprotein ist gemäß Beispiel I der JP-OS 88 621/1976 durch lstündiges Erwärmen der aus
Plazentablut erhaltenen Fraktion auf 600C bei einem pH-Wert von 4,8 in Gegenwart von 4 Prozent
(Gewicht/Volumen) Mandelsäure und 1 millimolar EDTA erhalten worden, wobei ein Niederschlag mit
einem Gehalt an Hämoglobin und alkalischer Phosphatase entfernt worden ist. Die chemische Zusammensetzung
des Ausgangsproteins ist nachstehend angegeben: Albumin 95 Prozent, «- und ^-Globuline 4 Prozent,
andere Proteine, die von der y-Region zur Kathode wandern, 1 Prozent. Das in Ampullen verpackte
Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad von 70 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,8 mg Titer/mg
und einen Gesamtproteingehalt von 1,8 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 150 mg.
Eine 5prozentige wäßrige Lysozymlösung, die gemäß Beispiel i erhalten worden isi (spczimuiic Akiivuäi
3,2 mg Titer/mg, Gesamtproteingehalt 208 mg) wird an Sephadex G-50 bei einem pH-Wert von 5,5 der
Gelfiltration unterworfen. Das Filtrat wird eingeengt und gegen eine 5prozentige wäßrige NaCI-Lösung vom
pH-Wert 4,5 dialysiert. Auf diese Weise erhält man Lysozym in kristalliner Form. Die Figur zeigt eine
photographische Abbildung in 400facher Vergrößerung des erhaltenen Kristalls.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von Human-Lysozympräparaten,
wobei man menschliches Blut zur ~~· Isolierung einer Albuminfraktion unter Ausnutzung
von Löslichkeitsunterschieden fraktioniert, dadurch gekennzeichnet, daß man die Albuminfraktion
zur Adsorption des darin enthaltenen Lysozyms mit einem schwach sauren Kationenaus- '<
> tauscher bei einem pH-Wert von 7 bis 9 in Kontakt bringt und das adsorbierte Lysozym desorbiert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als schwach sauren Kationenaustauscher Carboxymethylcellulose, Phosphocellulose '^
oder carboxymethylvernetztes Dextran verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Desorption bei einem pH-Wert von etwa 10 bis 12 durchführt
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- -1»
zeichnet, da3 man die Desorption in einer wäßrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit
einer Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent durchführt
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- -'>
zeichnet, daß man die Desorption in einer wäßrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit
einer Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent und einem pH-Wert von 8 bis 10 durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- !l)
zeichnet, daß man die Lösung des desorbierten Materials 10 Stunden auf 600C erwärmt
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung des desorbierten
Materials der Gelfiltration unterwirft und einengt, '"' und das darin enthaltene Lysozy.n zur Kristallisation
bringt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gelfiltration vernetztes
Dextran verwendet. «'
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