DE1966436C3

DE1966436C3 - Verwendung einer Antigen-Immunserum-Kombination als Impfstoff

Info

Publication number: DE1966436C3
Application number: DE19691966436
Authority: DE
Inventors: Marc Dr. Tassin Rhone Bonneau
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1968-05-28
Filing date: 1969-05-27
Publication date: 1982-02-04
Also published as: DE1966436B2; AT293612B; GB1248097A; IT1053697B; CH513979A; DE1926817A1; LU56161A1; DE1966436A1; FR2009493A1; BE733615A; NL6908122A; IE33123B1; IE33123L

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Produkts, bestehend aus der Kombination von agglutinogenen Antigenen der Colibacillose, den Salmonellosen, den Staphylokokken- und Streptokokkenerkrankungen, der Tuberkulose, des Keuchhustens, der Cholera, der Pest, der New-Castle-Krankheit und/oder der Grippe mit einer Menge des entsprechenden Immunserums, die zur vollständigen Absättigung der agglutinogenen Stellen des Antigens ausreicht, als nicht-agglutinierender Impfstoff.

Gegenwärtig verwendete Impfstoffe verursachen in der Regel eine Bildung von agglutinierenden Antikörpern in dem Empfängerorganismus, die später von den durch eine normale Reaktion gegen eine Krankheit eines nicht geimpften Organismus gebildeten Antikörpern nicht unterschieden werden können. Wenn man daher beispielsweise eine Kontrolluntersuchung von spezifischen Antikörpern einer Krankheit vornimmt, ist es praktisch nicht möglich festzustellen, ob man es mit einem kranken oder mit einem geimpften Organismus zu tun hat

Derartige Verwechslungen können schwerwiegende Nachteile zur Folge haben, besonders in der Veterinärmedizin und bei Krankheiten mit einer langsamen Entwicklung, wobei die sichtbaren Symptome nicht gestatten, eine klare Unterscheidung eines kranken Organismus von einem geimpften Organismus vorzunehmen.

Um diesen Nachteil abzuhelfen, wurde schon vorgeschlagen, solche nicht-agglutinogenen Vaccinen zu verwenden, die grundsätzlich keine Bildung von nachweisbar agglutinierenden Antikörpern im geimpften Organismus nach sich ziehen. Ein bekanntes Verfahren zur Herstellung von solchen nicht-agglutinogenen Vaccinen besteht darin, daß man die Herstellung der Vaccinen aus einem in »rauher« Phase kultivierten Mikrobenstamm vornimmt.

Die bekannten nicht-agglutinogenen Vaccinen befriedigen jedoch nicht vollständig, da sie trotz der Fabrikationskontrollen, denen sie unterworfen sind, in gewissen Fällen zur Bildung einer nicht zu vernachlässigenden Menge von agglutinierenden Antikörpern Anlaß geben, was dazu führt daß Organismen als krank betrachtet werden, die einfach geimpft worden waren.

Erfindungsgemäß werden auf einfache Art und Weise erhaltene nicht-agglutinierende Impfstoffe verwendet, die in dem Empfängerorganismus keine Bildung von agglutinierenden Antikörpern veranlassen oder die nur die Bildung einer so geringen Menge von agglutinierenden Antikörpern verursachen, daß jede Verwechslung eines geimpften mit einem kranken Organismus vermieden wird. Sie besitzen ebenfalls eine den bisher bekannten Vaccinen allgemein überlegene immunisierungskraft

Es sind zwar schon Antikörper aus z. B. Tuberkelbazillen dadurch isoliert worden, indem vollständige Tuberkelbazillen mit einem leichten Serumüberschuß behandelt wurden, wobei Agglutination auftritt und anschließend die Bakterien und damit die Bindungen zwischen den Antikörpern und den agglutinogenen

ίο Stellen in den Bakterienhüllen beseitigt worden (DE-PS 2 31 055). Hierbei wird aber weder ein entsprechendes Immunserum verwendet noch ein abgesättigter Antigen-Immunserum-Komplex gebildet Dies ist auch nicht bei mit Tuberkuloseserum ausgefällten Tuberkelbazillenextrakten gemäß der DE-PS 2 31 056 der Fall. Diese bekannten Produkte sind daher auch keine Impfstoffe, sondern Heilmittel zur Serumtherapie.

Demgegenüber beruht die immunisierende Wirkung von erfindungsgemäß verwendeten Produkten auf einem überraschenden Effekt von dem angenommen wird, daß er auf der Stimulierung des lustiolymphocytären Systems zusammenhängt auf welchem Phagozyten wachsen können. Derartig stimulierte Makrophagen vermögen eine unspezifische Immunisierung hervorzurufen.

Erfindungsgemäß verwendete Produkte sind also nicht auf einen Impfstoff, der den Organismus gegen eine bestimmte Krankheit immun macht beschränkt sondern können vorteilhaft auf viele agglutinogene Vaccinen angewendet werden. Somit können Impfstoffe sehr verschiedener Art geschaffen werden, insbesondere gegen Brucellose, Colibazillose, Salmonellose, Staphylokokken- und Streptokokkenerkrankungen, Tuberkulose, Keuchhusten, Cholera, Pest, New-Castle-Krankheit und Grippe.

Somit unterscheiden sich die erfindungsgemäß verwendeten Impfstoffe von Seroanavaccinen des bekannten Typus durch die Tatsache, daß die Seruanavaccinen zum Ziel haben, dem Empfängerorganismus die spezifischen Antikörper auf einmal zu liefern, die diesem die Bekämpfung der Krankheit durch Aufbau seiner eigenen Antikörper erlauben, während erfindungsgemäß verwendete Produkte genau bestimmte Mengenverhältnisse der Antigene und des Immunserums aufweisen, damit eine nicht-agglutinogene Vaccine erhalten wird.

Weiterhin werden die bekannten Seroanavaccine im allgemeinen durch Inaktivierung eines Mikroorganismus durch Formol und Hinzufügen des Serums

so gewonnen, während die erfindungsgemäß als Impfstoff verwendeten Produkte auf der Basis von Antigenen gebildet werden, die an sich inaktiv sind.

Bei den erfindungsgemäß verwendeten Produkten wird vorzugsweise das Antigen mit einem heterologen Immunserum verbunden, d. h. einem Serum, das von einer anderen Tierart stammt als diejenige, für die es bestimmt ist. In bestimmten Fällen kann jedoch ein homologes Immunserum ebenfalls in Verbindung mit dem Antigen verwendet werden.

Diese Impfstoffe können sowohl in der Humanmedizin wie in der Veterinärmedizin Verwendung finden. Das in dem erfindungsgemäß verwendeten Produkt verwendete Antigen kann ein Antigen auf der Basis von Bestandteilen oder Extrakten von Mikroben sein. Es kann zum Beispiel aus Bakterien, die durch ein Inaktivierungsmittel, wie Formol, Wärme oder Merthiolat, vollkommen inaktiviert worden sind, oder aus vollständigen lebenden Bakterien, die einem verdünnten

oder avirulenten Stamm angehören, bestehen.

Das Antigen kann auch durch agglutinogene, einer Lyse unterworfenen Bakterien gebildet werden, wobei die Lyse zum Beispiel durch enzymatische Einwirkung, durch Ultraschall oder auf chemischem Wege mittels Produkten wie Basen oder Säuren erfolgt ist Das Antigen kann außerdem ein aus Bakterienhüllen oder durch Extraktion erhaltenes agglutinogenes Antigen sein.

Das verwendete Serum kann entweder Blutserum oder Lactoserum sein. Es muß nur der Bedingung genügen, daß es eine entsprechend der Natur des Antigens der Vaccine ausreichende Dosis Antikörper enthält

Zur Bestimmung der notwendigen und ausreichenden Menge des Serums tcann man folgendermaßen vorgehen:

Man gießt eine bestimmte Menge von agglutinogenem Antigen und jeweils unterschiedliche Mengen von agglutinierendem Immunserum in eine Reihe von Reagenzgläsern (Serie Nr. 1). Man hält die Gläser mit der Mischung aus Antigen und Serum auf 37° C. Darauf wird das Serum in jedem Reagenzglas gewonnen, was durch Zentrifugieren durchgeführt werden kann, wenn das Antigen teilchenförmig vorliegt, und durch Filtrieren und Extrahieren über eine chromatografische Säule, wenn das Antigen löslich ist

Die derart aus der Reagenzglasreihe (Serie Nr. 1) gewonnenen Seren werden in eine neue Reihe von Reagenzgläsern (Serie Nr. 2) gegossen und mit neuen vorbestimmten Mengen von agglutinogenem Antigen zusammengebracht Man beläßt die Röhren mit der neuen Mischung aus Antigen und Serum 24 Stunden bei 37°C. Die Reagenzgläser der Serie Nr. 2, in denen sich eine neue Agglutination zeigt, sind solche, in denen das verwendete Serum noch agglutinierende Antikörper im Überschuß enthielt. Die kleinste Serummenge, die eine erneute Agglutination der Antigene der Gläser der Serie Nr. 2 erlaubt, entspricht der notwendigen und ausreichenden Menge von agglutinierendem Serum, die gleichsam zur Sättigung der gesamten in der Serie Nr. 1 verwendeten agglutinierenden Antigene erforderlich ist

Diese Methode gestattet die leichte Bestimmung der Mengenverhältnisse der Antigene und des Immunserums in vitro, die angewendet werden müssen, um den erfindungsgemäß verwendeten Impfstoff herzustellen.

Zur Herstellung der Vaccine genügt es dann, die entsprechenden Mengen von Antigen und Immunserum, vorzugsweise unter Rühren einzustellen.

Gemäß einer Abänderung des Verfahrens ist es ebenfalls möglich, die Antigene in Gegenwart eine* Überschusses an Immunserum einzustellen, und danach, zum Beispiel durch Filtrieren, das Serum abzutrennen, das anschließend für andere Zwecke verwendet werden kann.

Beispiel 1

Herstellung einer
nicht-agglutinogenenSalmonellose-Vaccine

60

Man geht aus von einem Stamm Salmonella Pullorum Gallinarum, den man auf gewöhnlicher Gelose kultiviert und nach 48 Stunden erntet.

Durch Verwendung von geeigneten Verdünnungen wird eine Bakteriensuspension hergestellt, die etwa 100 Milliarden Bakterien je ml Suspension enthält. Man bringt 5 ml der Bakteriensuspension dieses Titers in ein Zentrifugenrohr. Diese Probe wird mit großer Geschwindigkeit 30 Minuten lang zentrifugiert Es werden zwei Phasen in dem Zentrifugenrohr erhalten, nämlich
eine überstehende flüssige Phase A, die in einer auf 4° C gehaltenen Flasche aufgefangen und auf vollständige Abwesenheit von Mikrobenkörpern geprüft wird, und
eine dickflüssige Phase B, die am Boden absetzt Sie besteht aus Bakterienkörpern.

Die Phase B wird entnommen und erneut in 10 ml einer auf 5% verdünnten Formaldehydlösung suspendiert Die mit Formol inaktivierte Bakteriensuspension wird im Reagenzglas in ein Wasserbad von 58° C 30 Minuten lang eingestellt und anschließend 30 Minuten lang mit großer Geschwindigkeit zentrifugiert Man erhält zwei Phasen im Zentrifugenrohr, nämlich eine überstehende flüssige Phase, die verworfen wird, und
eine dickflüssige bakterienhaltige Phase Bi, die sich am Boden absetzt

Die Phase Bi setzt sich aus durch Wärme und Formol inaktivierten Bakterien zusammen.

Die Bakterienphase Bi wird dann in ein Reagenzglas gebracht und in der gesamten Phase A wieder suspendiert Diese letzte Bakteriensuspensior (A+ Bi) wird als Suspension C bezeichnet Sie enthält annähernd fünfhrndert Milliarden inaktivierte Bakterien in einem Volumen von etwa 5 ml.

Die Bakteriensuspension C bildet den ersten Bestandteil der erfindungsgemäßen Vaccine.

Ein Salmonellose-Serum, das reich an Antikörpern ist, wird durch Hyperimmunisation eines erwachsenen warmblütigen Tieres mit Hilfe einer agglutinogenen Antisalmonellose-Vaccine gewonnen.

Zehn Tage nach der letzten Vaccineinjektion entnimmt man den» Tier nüchtern durch Punktion der Halsvene Blut. Man entnimmt steril zweihundert ml Blut in eine Flasche, läßt das Blut gerinnen und fängt das Serum in einer neuen Flasche auf. Das Serum wird durch Aufwärmen im Wasserbad bei 56° C 30 Minuten lang inaktiviert. Die Sterilität des Serums wird geprüft. Der Titer der agglutinierenden Antikörper des Serums wird nach dem langsamen Serumagglutinationsverfahren von Wright im Röhrchen bestimmt. Ein agglutinierendes Serum mit einem Titer von 8000 internationalen agglutinierenden Einheiten pro ml stellt den zweiten Bestandteil der Vaccine dar.

Die endgültige Hersteilung der Vaccine wird folgendermaßen durchgeführt:

Man gießt in eine sterile Flasche soviel ml der Suspension C und des agglutinierenden Salmonellose-Serums mit einem gemessenen Fiter, daß alle agglutinogenen Stellen des Antigens abgesättigt sind.

Das Gemisch wird 60 Minuten in ein Wasserbad einer Temperatur von 37° C gestellt, dann bei 37° C 24 Stunden unter zeitweilig unterbrochenem und mäßigem Rühren in einen Brutschrank gestellt und danach 24 Stunden auf 4° C gekühlt. Sterilität, Unschädlichkeit und Wirksamkeit der Vaccine wird geprüft, die Vaccine hat keine Agglutinationskraft. Anstelle von Blutserum kann auch Lactoserum verwendet werden.

Beispiel 2

Herstellung einer nicht-agglutinogenen Vaccine
gegen den Virus der New Castle-Krankheit

Eine Viruskultur der New Castle-Krankheit wird über Eier mit Hühnerembryonen im Alter von 10 Tagen durchgeführt. Man injiziert den Virus in die Chorioallantois des Eis. Die Eier werden im Brutschrank bei

einer Temperatur von 38,5° C 30 Stunden lang bebrütet, anschließend aus dem Brutschrank herausgenommen und die bebrüteten Eier bei einer Temperatur von 4° C 12 Stunden lang aufbewahrt Anschließend wird Chorioallantois-Flüssigkeit entnommen und der Virustiter durch Hämagglutination bestimmt.

Mit Hilfe des erhaltenen Virus stellt man eine Vaccine und ein Serum gemäß Beispiel 1 her. Danach bestimmt man die entsprechenden Mengen und bereitet ein Gemisch, wie in Beispiel 1 angegeben ist

Es kühn auch eine Vaccine gemäß der Erfindung mit Hilfe von Lactoserum hergestellt werden. Weitere Ausführungsformen zur Vaccineherstellung sind im Rahmen der Erfindung durchführbar.

Beispiel 3
Herstellung einer Keuchhusten-Vaccine

Es wird eine Kultur von Bordetella pertussis (StammRAFFA) in einem Kulturmilieu Bordet-Gengou kultiviert und nach 48 Stunden inkubierung bei 36°C geerntet Nach dem Auszählen der Bakterien wird eine Suspension hergestellt, die etwa 20¹⁰ Bakterien je cm³ enthält Es wird 1 cm³ der Suspension entnommen und zentrifugiert Das nach dem Zentrifugieren abgesetzte Material wird in 500 cm³ einer Merthiolatlösung (1/100On) suspendiert Die Suspension wird 15 Std. bei 4° C aufbewahrt Die inaktivierten Bakterienkörper werden anschließend durch Zentrifugieren gesammelt und erneut in einem Volumen von 1 1 der Lösung suspendiert. Es wird eine Suspension mit 20¹⁰ Bakterien in inaktivierter Form je cm³ erhalten.

Zur Herstellung der Vaccine wird eine Mischung von 100 cm³ dieser Suspension in 500 cm³ einer Immunoglobulinlösung aus menschlicher Placenta mit einem Titer von 1/1280 vermischt (mittels einer Hemagglutinationsmethode nach Flosdorff geprüft). Das Gemisch wird auf dem Wasserbad bei 37° C 48 Std. bebrütet und anschließend bei 350 g 30 min bei 4° C zentrifugiert Der Rückstand wird in 100 cm³ einer sterilen isotonischen wäßrigen Lösung suspendiert Es werden 100 cm' der Vaccine erhalten, die den üblichen Kontrollen unterworfen wird. Hierbei zeigt sich, daß die Vaccine nicht mehr agglutinogen ist wenn sie nach dem Verfahren von Beispiel 1 geprüft wird.

Beispiel 4

Herstellung einer
nicht-agglutinogenen Vaccine gegen Grippe

Es wird ein menschliches Grippevirus (Stamm A) auf einem Hühnerembryo im Ei gemäß Beispiel 2 kultiviert und gewonnen. Die gesammelte Viruskultur wird anschließend in Formollösung von 0,5% inaktiviert

Mit einer Menge menschlicher Immunoglobuline aus Placenta mit einem Proteintiter von 160 mg/cm³ wird durch Mikroagglutination diejenige Menge Immunogluboline bestimmt die erforderlich ist um die gesamten agglutinogenen Stellen der Virussuspension zu neutralisieren. Nach dieser Bestimmung wird eine Vaccine hergestellt, wobei 100 mm³ der Immunoglobulinlösung mit 100 cm³ der inaktivierten Virussuspension gemischt werden. Es wird eine Vaccine erhalten, die nach dem genannten Verfahren keine Agglutinationskraft mehr hat.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung eines Produkts, bestehend aus der Kombination von agglutinogenen Antigenen der Colibacillose, den Salmonellosen, den Staphylokokken- und Streptokokkenerkrankungen, der Tuberkulose, des Keuchhustens, der Cholera, der Pest, der New-Castle-Krankheit und/oder der Grippe mit einer Menge des entsprechenden Immunserums, die zur vollständigen Absättigung der agglutinogenen Stellen des Antigens ausreicht als nicht-agglutinierender Impfstoff.