CN102026657A

CN102026657A - 疟疾疫苗

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Publication number: CN102026657A
Application number: CN2008801272415A
Authority: CN
Inventors: D·I·勒穆瓦; F·E·J·F·沃特斯
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2011-04-20
Also published as: MA32030B1; EP2234637A2; TW200940086A; BRPI0822098A2; AR071741A1; WO2009080715A3; UY31569A1; CA2708716A1; KR20100109556A; DOP2010000189A; AP2010005296A0; PE20091528A1; US20100272745A1; JP2011507816A; IL206308A0; WO2009080715A2; ZA201004304B; CO6300963A2; CR11577A; CL2008003808A1

Abstract

本发明公开了疟疾疫苗用组分，其包括：a)免疫原性粒子RTS，S和/或b)来源于一种或多种间日疟原虫虫株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，或c)包含RTS、CSV-S和任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括具有至少一个硫醇官能团的稳定剂或其混合物的稳定剂。本发明还公开了制备所述组分的方法，所述组分的药物用途，特别是在预防疟疾感染中的应用，包含所述组分的组合物/疫苗，以及所述组合物/疫苗的应用，特别是在治疗中的应用。

Description

疟疾疫苗

本发明涉及用于治疗疟疾的稳定化的脂蛋白粒子，其制备方法，其在医药中的应用，特别是在预防疟疾感染中的应用，包含所述粒子的组合物/疫苗，以及所述组合物/疫苗特别是在治疗中的应用。

疟疾，是全世界主要的健康问题之一，每年超过2-4百万人死于该病。该病的最流行的形式之一由原生动物寄生虫间日疟原虫(P.vivax)所引起，该间日疟原虫在热带和亚热带地区被发现。令人感兴趣的是，该寄生虫可以在低至15℃的温度下完成其蚊体周期，这使得该病在温带气候中得以蔓延。

该病的最急性形式之一由原生动物寄生虫恶性疟原虫(P.falciparum)所引起，该恶性疟原虫是导致由疟疾造成的大多数死亡的原因。

疟原虫的生命周期是复杂的，需要两种寄主即人和蚊用于完成生命周期。人的感染开始于子孢子通过被感染蚊子的叮咬被接种进入血流中。所述子孢子移到肝并感染那里的肝细胞，其中所述子孢子经由红细胞外的胞内阶段分化成裂殖子阶段，其感染红细胞(RBC)以启动在无性血内阶段中的循环复制。该周期通过在RBC中许多裂殖子分化成有性繁殖阶段的配子体而完成，所述配子体被蚊子摄入，在蚊子体内，所述配子体在蚊子中肠内经由一系列阶段发展生成子孢子，其移到唾液腺。

由于由间日疟原虫引起的疾病很少致命的事实，预防和治疗疟疾的努力已集中于更加致命形式的由恶性疟原虫引起的疾病。

尽管由间日疟原虫引起的疾病不常导致患者死亡，由于看起来日益增多的大量的病例，对患者生命质量的显著影响，日益增加的关于该病导致贫血症和死亡的严重事件的报导，以及经济影响，仍然需要用于该病的有效疫苗。另外，对该病的两种病因都能够提供防护的单一疫苗将是有利的。

间日疟原虫的特征在于，一些虫株能够通过在进入外周循环以显现临床症状之前在肝内保持潜伏而造成延迟感染。因此，当例如穿过污染地区时，对象可被感染，但是可能历时数月不表现出症状。这是引起疾病蔓延的潜在原因，并且由于这一缘故，到污染区域旅行的人在到该污染区域旅行之后的规定的一段时间内不允许捐赠输血。

间日疟原虫疟疾感染在肝内保持潜伏，而所述寄生虫正经历红细胞内裂殖生长前(pre-erthrocytic shizogony)阶段。如果所述寄生虫在其离开肝之前在该阶段受到控制，在患者中观察不到疾病的临床症状。

疟原虫的子孢子阶段被确定为是疟疾疫苗的潜在的靶标。使用去活化(经照射的)子孢子的疫苗已显示诱导对实验人类疟疾的防护(Am.J，Trap.Med.Hyg 24：297-402，1975)。然而，根据这一方法论，采用经照射的子孢子来生产用于一般人群的疟疾疫苗在实践中和就后勤学而言是不可能的。

所述子孢子的主要表面蛋白被称为环子孢子蛋白(CS蛋白)。认为在子孢子从被蚊子叮咬的最初接种位置进入循环(在那里子孢子移到肝处)期间，所述蛋白参与子孢子的移动和侵入。

疟原虫的CS蛋白的特征在于，侧接非重复的氨基(N端)片段和羧基(C端)片段的中央重复结构域(重复区)。间日疟原虫的中央结构域由重复单元、通常是九个串联氨基酸的若干区组组成。

在某些亚洲株中，在所述中央重复区之后，存在大约12个氨基酸的附加序列(参见SEQ ID No 11)。后者的功能是未知的。然而，据一些人假设，所述氨基酸可能与疾病临床症状的延迟发病相关联，尽管尚未对此进行考察。认为N端的特征在于被称为I区的5个氨基酸的序列(参见SEQ ID No 1)。还认为C端的特征在于包括被称为II区的12个氨基酸的序列。后者包含细胞粘附基序，其在所有的疟疾CS蛋白中是高度保守的(参见SEQ ID No.2)。

若干研究小组已提出了基于环子孢子蛋白的亚单位疫苗。完全基于所述中央重复区的这些疫苗中的两个在二十世纪八十年代初经历临床试验；一个疫苗是合成肽，另一个疫苗是重组蛋白(Ballou等人，Lancet：June 6(1987)，第1277页起，和Herrington等人，Nature 328：257(1987))。这些疫苗在刺激抗子孢子应答中获得成功。尽管如此，应答幅度是令人失望的，一些疫苗根本不产生应答。另外，在随后的注射之后，抗体水平“加强”的缺乏以及体外淋巴细胞增殖试验的结果暗示了，这些志愿者中大多数的T细胞不识别免疫显性重复(immuno-dominant repeat)。另外，这两个疫苗的效率勉强说得过去，只有一个被接种的志愿者没有发展成寄生虫血症。这些疫苗没有作进一步讨论。

WO 93/10152和WO 98/05355描述了来源于恶性疟原虫的CS蛋白的疫苗，并且使用其中所述的方法在朝着抗恶性疟原虫的疫苗方面似乎有了一些进展，还参见，Heppner等人，2005，Vaccine 23，2243-50。

迄今为止，在临床上最先进的疟疾疫苗基于被称作RTS，S的脂蛋白粒子(又名病毒样粒子)。该粒子包含恶性疟原虫的CS蛋白的一部分，该部分实质上与恶性疟原虫(虫株NF54/3D7)的CS蛋白的氨基酸207-395相对应，该部分通过线性接头在框架内融合至来自乙型肝炎的S抗原的N端。所述接头可包括来自S-抗原的preS2的一部分。详细内容请参见以下的讨论。

恶性疟原虫内的CS蛋白具有保守的中央重复区。相比之下，间日疟原虫的CS蛋白的至少两种形式(被称为VK210或I型以及VK247或II型)是已知的。这使得更难以鉴定具有全部所需性质诸如免疫原性的CS蛋白的构建体，该构建体提供对间日疟原虫的总体防护而与CS蛋白的具体类型无关，因为针对I型中央重复区的抗体未必识别相应的II型区上的表位，反之亦然。

就本发明人所知晓的程度，尚未提议基于间日疟原虫的单一虫株的与RTS，S相当的粒子。

杂合间日疟原虫CS蛋白描述于WO 2006/088597中。

包含WO 2006/088597的杂合蛋白以及来自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白(本文中被称作CSV-S)以及包含该融合蛋白的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057301中。

包含CSV-S、RTS和任选的S单元的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057296中。

目前，RTS，S疟疾疫苗作为冻干抗原被提供，其在递送之前不久用助剂进行重新构成。这是因为该抗原当储存历时相当长的时段时不稳定，特别是在助剂的存在下。所述不稳定性自身表现为团聚和/或降解。

到2018/2019年，据估计需要8300万剂量的疟疾疫苗。目前的冻干(冷冻干燥)方法花费约40小时。因此，目前的方法不可能满足未来的需求。有可能将生产周期缩短到约28小时，但是这仍不大可能满足所述需求。另外，进一步缩短周期时间看来导致出现不合格产品。

疟疾疫苗主要在基础设施(infra-structure)和设备贫乏的国家中用于递送，因此，在直到给药前是稳定的疫苗提供形式是至关重要的，特别是如果提供的是液体制剂时。

由发明人提供的初始数据表明，在磷酸盐缓冲盐水中制备的、含有残留量的聚山梨醇酯80(0.0062％w/w)且不含其它赋形剂的、pH为6.1的RTS，S纯体积(purified bulk)，在加速稳定性试验(即在37℃下储存7天)后，显示显著的降解和氧化性聚集。在4℃下储存2个月后观察到轻微聚集和降解。

考察了以下的选项：

·pH从6.1增加到7.4似乎降低了S抗原降解，但是增加CS蛋白降解；

·聚山梨醇酯80(也称为吐温80)浓度增加到0.05％、0.5％和1.0％似乎增加聚集和降解二者，这是令人惊讶的，因为吐温80通常降低抗原聚集(据发明人假设，这是由在土温内存在残留的过氧化物所导致的，残留的过氧化物可能催化蛋白/抗原内的硫醇基的催化氧化-使用本发明的还原剂似乎防止这一效果)；和

·加入蔗糖(6.2％w/w)对聚集或降解没有影响。

据假设，所述聚集过程在许多阶段中发生，并且如果这些阶段之一可被成功地阻止的话，则可以阻止聚集和/或降解(参见：″Minimizingprotein inactivation″，D.B.Volkin和A.M.Klibanov，″Protein function：apractical approach″，T.E.Creighton编-IRL Press，Oxford University Press)。

第一阶段是天然蛋白解折叠，从而暴露出其疏水性更大的区域。该疏水性区域的暴露导致若干蛋白组在一起。最后阶段是所述蛋白通过二硫键的形成而发生不可逆变性。

还可能的是，为使所述抗原增溶而被加入的聚山梨醇酯80含有残留的过氧化物，残留的过氧化物催化聚集和/或降解。

本发明人尝试了许多的稳定试剂/稳定方法，例如，糖，多元醇，共溶剂，聚合物，离子，pH，缓冲剂，抗氧化剂，螯合剂和表面活性剂，它们都不提供所需效果。例如，加入抗坏血酸产生显著的聚集。使用单独的EDTA或在抗氧化的存在下使用EDTA不阻止聚集。另外，加入亚硫酸盐不提供所需的稳定效果。一些常见的稳定剂与在最终的疟疾制剂中所采用的辅助制剂不相容。本发明人目前相信，疟原虫CS蛋白(恶性疟原虫和/或间日疟原虫)的脂蛋白粒子可采用特定的稳定剂进行稳定化用于储存，例如，包含至少一个硫醇(-SH)基团的还原剂，诸如硫代硫酸盐，N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘油，半胱氨酸，还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠或其混合物，特别是N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘油，半胱氨酸，硫代乙酸钠及其混合物，特别是一硫代甘油，半胱氨酸及其混合物。

作为这些包含至少一个硫醇(-SH)基团的还原剂的替代物或者与这些还原剂相组合，本发明使用的脂蛋白粒子可通过从它们被储存在内的容器中除去氧和/或使所述制剂避光(例如通过使用褐色玻璃容器)而被稳定化或进一步稳定化，可保护/进一步保护所述抗原。

因此，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含：

a)免疫原性粒子RTS，S，和/或

b)来源于一种或多种间日疟原虫虫株的CS蛋白和来自乙型肝炎的S抗原以及任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，和/或

c)包含RTS、CSV-S和任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，和

d)包括(或选自)具有至少一个硫醇官能团的还原剂的稳定剂，例如，如上所述的还原剂，诸如一硫代甘油，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸或其混合物。

在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含上述的a)、b)、c)和任选的d)，并且其中在其制备中采用诸如从容器中除去氧和/或通过例如使用褐色玻璃容器使所述制剂避光的保护措施。

有利地是，包含来自疟原虫的CS蛋白以及来自肝炎的S抗原的脂蛋白粒子抗原可通过采用一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物和/或诸如从小瓶中除去氧和/或通过例如使用褐色玻璃容器使所述制剂避光而被足够地稳定化。

序列表

SEQ.ID.No.1 间日疟原虫的N端的I区

SEQ.ID.No.2 是在间日疟原虫的C端中的II区的高度保守

部分

SEQ.ID.No.3-9 间日疟原虫的I型CS蛋白的多种重复单元

SEQ.ID.No.10 间日疟原虫的II型CS蛋白的主要重复单元

SEQ.ID.No.11 在间日疟原虫的亚洲株中发现的附加氨基酸

SEQ.ID.No.12 间日疟原虫的杂合蛋白CSV的核苷酸序列

(为在大肠杆菌中表达而被优化)

SEQ.ID.No.13 间日疟原虫的杂合蛋白CSV的氨基酸序列

SEQ.ID.No.14 间日疟原虫的II型CS蛋白的次要重复单元

SEQ.ID.No.15 间日疟原虫的杂合蛋白CSV的核苷酸序列

(为在酵母中表达而被优化)

SEQ.ID.No.16 杂合融合蛋白CSV-S的核苷酸序列

SEQ.ID.No.17 杂合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列

SEQ.ID No.18 RTS表示盒的核苷酸序列

SEQ.ID No.19 来自SEQ ID No.18的预期RTS融合蛋白

SEQ ID Nos.20到25包含CpG的寡核苷酸的实施例。

附图说明

图1pRIT15546酵母游离型载体的质粒图谱；

图2通过在将所需抗原与来自乙型肝炎的S抗原“融合”中使用的GSK制备的质粒pGF1-S2的质粒图谱。(在切除12bp SmaI DNA片段之后)在SmaI位点之间的克隆异源DNA序列与S基因产生符合读框的融合；

图3pRIT15582的质粒图谱；

用XhoI消化释放携带CSV-S表达盒加LEU2选择性标记的8.5kb的线形DNA片段，用于插入所述酵母染色体内；

图4用于整合CSV-S表达盒的线性XhoI片段的限制图谱；

图5在虫株Y1835中产生的CSV-S，S混合粒子的电子显微照片；

CSV-S，S粒子从可溶性细胞抽提物(基于RTS，S纯化法)纯化并经历电子显微镜分析。在用磷钨酸进行负染色之后可见到粒子。比例等于100nm；

图6显示在37℃+/-AOT-Novex凝胶中在非还原(左)和还原(右)条件下储存7天之后，在与AS01混合之前(上)或与AS01在25℃混合24小时之后(下)的SDS page分析，

1.Mw

2.PB T0

3.PB 7天37℃

4.NaCl PO₄7天37℃

5.NaCl PO₄7天37℃+AOT褐色玻璃

6.NaCl PO₄7天37℃+AOT白色玻璃

7.MTG 0.01％7天37℃

8.MTG 0.01％7天37℃+AOT褐色玻璃

9.MTG 0.01％7天37℃+AOT白色玻璃

10.MTG 0.04％7天37℃

11.MTG 0.04％7天37℃+AOT褐色玻璃

12.MTG 0.04％7天37℃+AOT白色玻璃；

图7显示在还原(左)和非还原(右)条件下在37℃-Novex凝胶中储存14天之后，在与AS01混合之前或与AS01混合在25℃历时24小时之后的SDS page分析；

图8显示在还原(左)和非还原(右)条件下在37℃-Novex凝胶中储存5周之后，在与AS01混合之前或与AS01混合在25℃历时24小时之后的SDS page分析；

对于图7图8：

1.Mw

2.PB T0还原

3.RTS，S NaCl PO₄5周37℃还原

4.RTS，S MTG 0.01％5周37℃还原

5.RTS，S MTG 0.04％5周37℃还原

6.(RTS，S NaCl PO₄5周37℃)/AS01E 24小时25℃还原

7.(RTS，S MTG 0.01％5周37℃)/AS01E 24小时25℃还原

8.(RTS，S MTG 0.04％5周37℃)/AS01E 24小时25℃还原

9.PB T0非还原

10.RTS，S NaCl PO₄5周37℃非还原

11.RTS，S MTG 0.01％5周37℃非还原

12.RTS，S MTG 0.04％5周37℃非还原

13.(RTS，S NaCl PO₄5周37℃)/AS01E 24小时25℃非还原

14.(RTS，S MTG 001％5周37℃)/AS01E24小时25℃非还原

15.(RTS，S MTG 0.04％5周37℃)/AS01E 24小时25℃非还原

图9通过混合ELISA αCSP-α-S显示在有或者没有一硫代甘油的液体制剂中的RTS，S抗原性；

图10显示抗CS血清学结果；

图11显示抗HBS血清学结果；

图12显示CS特异性CD4T细胞应答；

图13显示HBs特异性CD4T细胞应答；

图14显示CS特异性CD8T细胞应答；

图15显示HBs特异性CD8T细胞应答；

发明详述

采用N-乙酰半胱氨酸、一硫代甘油、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠或其混合物的本发明的方面具有另外的优点，该优点在于该实施方案提供了可行的替代硫酸钠的生产备选方案(可能希望避免硫酸钠的使用)。

尽管不希望束缚于理论约束，据本发明人假设，在稳定剂/还原剂中的硫醇官能团与抗原中的硫醇官能团结合，从而阻断所述位点并防止该位点与不同抗原分子上的硫醇官能团发生键合/相互作用。另外，因为所述稳定剂/还原剂相对小，还认为在所述抗原内的表位、特别是构象表位不被破裂，从而所述抗原的免疫原性得以被保留，并防止发生聚集。

替代地或另外地，吐温(tween)中的过氧化物被淬灭。

在本发明的一个方面，所述稳定剂是一硫代甘油。

在本发明的一个方面，所述稳定剂是半胱氨酸。

在本发明的一个方面，所述稳定剂是N-乙酰半胱氨酸。

所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用：0.01到10％w/v，诸如1到5％，2到6％，4到7％，3到8％，诸如0.01到1％，0.2到0.4％，0.1％到0.5％，0.3到0.8％，0.6到0.9％，例如实质上是0.2，0.4，0.5和0.8％，或者诸如0.01到0.1％，0.01到0.02％，0.01到0.05％，0.01到0.08％，0.02到0.05％，0.02到0.08％或0.05到0.08％w/v。

替代地，所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用：0.01到10％w/w，诸如1到5％，2到6％，4到7％，3到8％，诸如0.01到1％，0.2到0.4％，0.1％到0.5％，0.3到0.8％，0.6到0.9％，例如实质上为0.2，0.4，0.5和0.8％，或者诸如0.01到0.1％，0.01到0.02％，0.01到0.05％，0.01到0.08％，0.02到0.05％，0.02到0.08％或0.05到0.08％w/w。

半胱氨酸的适合量为总制剂重量的0.1到1.0％。因此，例如，在一个500μl的人用剂量中，半胱氨酸的量为100μg到5000μg范围，诸如500μg。

在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含：

a)免疫原性粒子RTS，S，和/或

b)来源于一种或多种间日疟原虫虫株的CS蛋白和来自乙型肝炎的S抗原以及任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，和

c)稳定剂，其包括一硫代甘油。

本发明的这一方面可进一步采用另外的保护措施，诸如从所述容器/小瓶除去氧和/或通过例如使用褐色玻璃容器使所述制剂避光。

一硫代甘油由式HSCH₂CH(OH)CH₂OH表示并且还被称作3-巯基-1，2-丙二醇或1-硫代甘油。用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围：0.01到10％，诸如0.01到1％或0.01到0.1％，0.01到0.02％，0.01到0.05％，0.01到0.08％，0.02到0.05％，0.02到0.08％或0.05到0.08％w/v，例如0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016，0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05或0.08％w/v。250μl的单一人用剂量可含有例如10到2500μg，诸如25到250μg的一硫代甘油，例如50，125或200μg的一硫代甘油。

替代地，用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围：0.01到10％诸如0.01到1％，0.01到0.1％，0.01到0.02％，0.01到0.05％，0.01到0.08％，0.02到0.05％，0.02到0.08％或0.05到0.08％w/w，例如0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016，0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05或0.08％w/w。

有利地是，当根据本发明使用一硫代甘油时，似乎与辅助制剂例如水包油型乳液或包含MPL和/或QS21的脂质体制剂相容。

另外，一硫代甘油降低了由MPL和QS21的脂质体辅助制剂诱导的脂蛋白粒子聚集，从而提供与制备之后不久经纯化的大体积的液体制剂相类似的液体制剂。

在本说明书的背景下，经纯化的体积(purified bulk)是指在超过两个剂量的大体积量下经纯化的抗原。

在本说明书背景下，最终体积(final bulk)是指超过一个或两个剂量的经纯化的抗原和赋形剂诸如磷酸盐缓冲盐水，不包括辅助组分。

当使用0.01％的一硫代甘油、在缺乏助剂的条件下以50μg/ml配制RTS，S时，其在37℃储存7天之后具有与新鲜体积相同的特性。0.01％一硫代甘油也足够避免RTS，S发生由光催化的聚集。

尽管如此，对于疟原虫CS蛋白的脂蛋白粒子的、例如在100μg/ml的抗原和例如最多1.0％w/v诸如0.02、0.05或0.08％的一硫代甘油的液体制剂而言，期待获得其约2或3年的货架寿命。

在本发明的一个方面，所述还原剂不是二硫苏糖醇。

所述疫苗的液体组分，包括其辅助组分，可要求在约4℃下储存。

本发明的所述制剂具有适于注射的pH和渗克分子浓度(osmolality)。适当地，所述液体制剂的pH为约6.5到7.2，诸如约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0或7.1。

本发明的所述制剂可进一步包含防腐剂诸如硫柳汞，例如，当超过10个剂量被一起提供时。然而，在至少一个实施方案中，本文所述的制剂不含硫柳汞。

研究显示，与0.01或0.04％一硫代甘油一起储存的例如在50μg/ml下的RTS，S在4℃或37℃下历时5周之后，没有可检测的由非特异性吸收导致的抗原损失。

另外，在加速稳定性，即在37℃下储存7天、然后暴露于强光下约15小时(在本文被称作加速氧化试验AOT)之后，未观察到RTS，S粒度分布发生改变。

在一个方面，本发明提供了作为单独的液体制剂的疟疾疫苗用组分以及适于加到该单独液体制剂中的助剂，任选地作为包括每个成分(element)的单独的小瓶的药包(kit)被提供。在该实施方案的一个方面，每个小瓶在视觉上是不同的，例如，在一个小瓶上的卷边盖是有颜色的，从而使该小瓶与其它小瓶区分开，和/或一个小瓶是琥珀色的(诸如包含所述抗原的小瓶)并且另一个小瓶是透明的(诸如包含所述助剂的小瓶)。

适合的小瓶包括例如3mL的玻璃小瓶。

在一个方面，本发明提供了包含抗原和稳定剂(或本文所述的还原剂)的冻干组分，其然后可用液体助剂重新构成。所述冻干组分和所述液体助剂(诸如MPL和QS21的水包油型制剂或脂质体制剂)可作为药包被提供。本发明的这一方面具有以下的优点：其不需要在重新构成之后立即使用，而是在储存至少24小时是稳定的，例如，当在混合之后在25℃下储存时抗原的抗原性保持至少24小时。在下文详细地讨论助剂。

在本发明的一个方面，提供了最终的液体制剂。最终的液体制剂是指包含最多10个剂量诸如1或2个剂量并包含除助剂组分以外的全部赋形剂的液体制剂。

在一个方面，所述组分或最终疫苗作为单剂量被提供。

在本说明书背景下的疫苗是包含全部所述组分的免疫原性制剂，所述组分包括适于注射进人体的辅助组分。

在一个方面，所述组分或最终疫苗作为双剂量被提供。这可能是有利的(例如，当对于一个剂量而言的量较小时)，因为提供两个剂量可以使得在重新构成和/或给予所述最终制剂时重要组分的损失最小化。

因此，疫苗例如作为2个小瓶制剂的双剂量形式被提供，其包含：

小瓶1：500μl(2个剂量)的RTS，S，2×浓缩(100μg/ml)+一硫代甘油(0.02、0.05或0.08％)

小瓶2：500μl(2个剂量)的助剂，2×浓缩(AS01)

在重新构成之后，所述制剂提供1ml(2个剂量)的在AS01中的RTS，S，+0.01、0.025或0.04％的一硫代甘油。

间日疟原虫抗原

本发明使用的CSV-S蛋白可包含：来源于间日疟原虫的CS蛋白的一部分(CSV)。该CSV抗原可以是天然蛋白，诸如在间日疟原虫的I型CS蛋白中发现的和/或在间日疟原虫的II型蛋白中发现的。替代地，所述CSV蛋白可能是包含来自所述I型和II型CS蛋白的成分的杂合蛋白或嵌合(chimeric)蛋白。当后者被融合至所述S抗原时，这在本文中被称作杂合融合蛋白。

CSV-S在本文中作为通用术语被使用，用于涵盖包含来自间日疟原虫的CS蛋白的序列/片段和来自乙型肝炎的S-抗原的序列的融合蛋白。

所述杂合/嵌合蛋白通常包括：

至少一个来源于间日疟原虫的I型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元，以及

至少一个来源于间日疟原虫的II型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元。

通常，所述杂合蛋白还将含有来自疟原虫诸如间日疟原虫的CS蛋白的N端片段，例如，包含I区诸如由SEQ ID No.1所示的氨基酸的片段。

通常，所述杂合蛋白将包含来自疟原虫诸如间日疟原虫的CS蛋白的C端片段，例如包含II区诸如由SEQ ID No 2所示的基序的片段。

尽管不希望束缚于理论，认为所述的N端和C端片段包括若干个T细胞和B细胞表位。

本发明可使用任何适合的间日疟原虫虫株，包括：拉丁，美洲(即，Sal 1，Belem)，朝鲜，中国，泰国，印度尼西亚，印度和越南。在SEQID No 13中的构建体基于朝鲜虫株(更准确地说，基于南朝鲜虫株)。

具有I型CS蛋白的间日疟原虫比具有II型CS蛋白的间日疟原虫更普遍。因此，在一个方面，本发明采用了来自I型的CS蛋白。在可供选择的方面，本发明提供了包含来自I型的重复单元和来自II型的重复单元的杂合蛋白，例如，其中在杂合蛋白中包含了比II型重复单元更多的来自I型的重复单元。

更准确地说，本发明的所述杂合蛋白可包含1到15个来自I型的重复单元，诸如9个来自I型的重复单元。

来自I型CS蛋白的适合的重复单元的实例在SEQ ID No.s 3到9中给出。

在一个实施方案中，本发明提供了具有不同的I型重复单元的混合物的杂合蛋白，诸如各自在SEQ ID No.s 3到9中被列举的那些重复单元。

一个或多个重复单元可在杂合蛋白中被复制，例如，SEQ ID No 3和/或4的两个重复单元可被并入所述构建体中。

a)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 3所示单元。

b)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 4所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)段中的单元组合。

c)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 5所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)和b)段中的单元组合。

d)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 6所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)-c)段中的一个或多个单元组合。

f)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 7所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)-d)段中的一个或多个单元组合。

g)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 8所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)-f)段中的一个或多个单元组合。

h)在一个方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 9所示单元，任选地与上面刚刚描述的a)-g)段中的一个或多个单元组合。

得自II型CS蛋白的适合的组分重复单元的实例在SEQ ID No.10和14诸如SEQ ID No.10中被给出。

在本发明的一个方面，提供了具有5个或更少的来源于II型的重复单元诸如例如SEQ ID No.10所示的一个重复单元的杂合蛋白。

所述杂合蛋白还可包含在某些间日疟原虫的亚洲虫株中发现的在所述重复区末端被发现的12氨基酸插入，例如SEQ ID No.11所示。

在一个实施方案中，所述杂合蛋白包含来源于间日疟原虫CS蛋白的约257个氨基酸。

本发明的来源于CSV的抗原组分通常被融合至所述S蛋白的氨基端。

据信，所述得自乙型肝炎的表面抗原的存在加强了所述CS蛋白部分的免疫原性，有助于稳定性，和/或帮助所述蛋白的可重现生产。

在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白包含约494个氨基酸，例如其中的约257个氨基酸来源于间日疟原虫CS蛋白。

所述杂合融合蛋白还可包含另外的来源于恶性疟原虫和/或间日疟原虫的抗原，例如，其中所述抗原选自DBP，PvTRAP，PvMSP2，PvMSP4，PvMSP5，PvMSP6，PvMSP7，PvMSP8，PvMSP9，PvAMA1和RBP，或其片段。

来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括，PfEMP-1，Pfs 16抗原，MSP-1，MSP-3，LSA-1，LSA-3，AMA-1和TRAP。其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA，GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白(Sequestrin)，Pf332，STARP，SALSA，PfEXPl，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs48/45，Pfs230以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。

在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白(CSV-S)具有如SEQ ID No.17中所示的氨基酸序列。在所述序列中，氨基酸6到262源自于CSV，以及氨基酸269到494源自于S。剩余的氨基酸通过基因构建被引入(其视具体情况而定是不同的)。这四种氨基酸，即Met、Met Ala Pro，特别地来源于质粒pGF1-S2(参见图4)。

SEQ ID No 17所示蛋白的核苷酸序列在SEQ ID No 16中给出。

编码免疫原性CS多肽的多核苷酸序列可能是为哺乳动物细胞而被优化的密码子。这种密码子优化详细描述于WO 05/025614中。

RTS，S

被称作RTS的本发明的蛋白粒子的组分(即，来源于恶性疟原虫)可以根据WO 93/10152所述制备，该文献包括RTS*的说明(来自恶性疟原虫NF54/3D7虫株-本文称作RTS)。

在本发明的一个或多个实施方案中，在所述融合蛋白中采用的来源于恶性疟原虫的抗原可实质上是其全CS蛋白。

在本发明的一个实施方案中，采用了全长S-抗原。在另一个实施方案中，采用了所述S-抗原的片段。

在一个实施方案中，所述来源于恶性疟原虫的抗原在中央重复区中包含至少4个重复单元。更准确地说，该抗原包含含有至少160个氨基酸的序列，其与所述CS蛋白的C端部分实质上同源。所述CS蛋白可缺乏自C端起最后的12到14个(诸如12个)氨基酸。

更准确地说，所采用的来源于恶性疟原虫的融合蛋白是由SEQ IDNo 18所示的RTS表达盒的核苷酸序列编码的融合蛋白。

来自乙型肝炎的S-抗原

适合的S抗原可包含preS2区。适合的血清型的实例是adw(Nature280：815-819，1979)。

通常，所述来自乙型肝炎的序列将是全长S-抗原。通常，所述preS2区将不被包括在内。

在一个方面，本发明的所述杂合融合蛋白包含来源于突变S蛋白的一部分，例如，在美国申请公开No.2006/194196(还作为WO2004/113369公开)中所述的。该文献描述了突变标记的HDB05。其特别地描述了在图1和图6中的突变蛋白和野生型蛋白的比较以及在图4和图5中描述了突变蛋白的基因。其中的序列12到22描述了突变S蛋白的特定多肽。上述每种作为参考并入本文。

所述融合蛋白CSV-S可例如采用质粒pGFl-S2(有关详细情形参见图2以及实施例)制备，当与CSV对应的适当的序列被插入在SamI克隆位点时，质粒pGFl-S2可在适合的条件下产生所述融合蛋白CSV-S。

编码本发明蛋白的DNA序列可侧接转录控制元件(优选来源于酵母基因)并被并入表达载体中。

本发明所用杂合蛋白的表达盒可例如被构建为包括以下特征：

·启动子序列，例如来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。

·编码适当的融合蛋白的序列。

·被包含在所述序列内的转录终止序列，例如，来源于酿酒酵母ARG3基因。

特定的启动子的实例是来自Musti等人的酿酒酵母TDH3基因的启动子。

适合的质粒则因此可被采用，以将编码所述杂合融合蛋白的序列插入到适合的合成用寄主中。适合质粒的实例是pRIT 15546，即2微米基的用于携带适合表达盒的载体，有关详细情形参见图1和实施例。

所述质粒通常包含内装标记以帮助选择，例如编码抗生素抗性或LEU2或HIS营养缺陷型的基因。

通常，所述寄主将具有用于所述粒子中各融合蛋白的表达盒，并且还可具有一个或多个用于被整合到其基因组内的S抗原的表达盒。

本发明还涉及使用本发明载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核的或真核的，但优选是酵母，例如酵母菌属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诸如在ATCC数据库中的DC5(登录号20820)，名为RIT DC5cir(o)。保藏人：Smith Kline-RIT)和非酵母菌属酵母。这些包括裂殖糖酵母(例如粟酒裂殖糖酵母)，克卢费氏酵母(例如，乳克卢费氏酵母)，毕赤氏酵母(例如巴斯德毕赤氏酵母)，汉逊氏酵母(例如多形汉逊氏酵母)，脂耶氏酵母(例如解脂脂耶氏酵母)和许旺氏酵母(例如西方许旺氏酵母)。

适合的重组酵母菌株是用于表达所述融合蛋白的Y1834(以及其应用构成本发明的一部分)，其制备参见实施例。

本发明所使用的所述核苷酸序列或其部分(诸如编码所述CS/杂合蛋白的部分，但是任选不是编码蛋白S的部分)可为在寄主诸如酵母中表达而被优化的密码子。

所述宿主细胞可包含来源于间日疟原虫的融合蛋白所用的表达盒，和来源于恶性疟原虫的所述融合蛋白所用的表达盒，以及任选的S抗原。

在某些寄主诸如酵母细胞中，一经表达，所述融合蛋白(包含所述S抗原)自发组装成由所述融合蛋白的众多单体组成的蛋白结构/粒子。当所述酵母表达两种不同的融合蛋白(或融合蛋白和S抗原)时，这些被认为在粒子中进行共组装。

当被选择的受体酵母菌株在其基因组中已携带若干乙型肝炎S表达盒的整合拷贝时，则组装的所述粒子还可包含未融合S抗原的单体。

这些粒子还可被称作病毒样粒子(VLP)。所述粒子还可被称作多聚体型脂蛋白粒子，或被简称为免疫原性粒子。

因此，提供了包含以下单体的免疫原性蛋白粒子：

a.包含来源于间日疟原虫的CS蛋白的序列的融合蛋白(诸如CSV-S)，和/或

b.包含来源于恶性疟原虫的CS蛋白的序列的融合蛋白(诸如RTS)，和

c.任选的未融合S抗原，

其中所述粒子与例如上文所定义的稳定剂诸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物结合使用。

在一个方面，本发明提供包含如上所定义的单体a)和/或b)和c)的免疫原性蛋白粒子，以及其中已从容纳所述粒子的容器或小瓶中除去氧和/或其中例如通过褐色玻璃容器使所述粒子避光保护的保护措施。

在另一个方面，本发明提供了与本文所定义的例如选自一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物的还原剂结合使用的包含以下各项的融合蛋白的应用：

a)来源于间日疟原虫的CS蛋白的序列(例如，来自I型和/或II型的重复区的序列)，

b)来源于恶性疟原虫的CS蛋白的序列(诸如来自其重复区的序列)，和

c)来自乙型肝炎的S抗原的序列，

当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合S抗原的病毒样粒子，以生成粒子。

在另一个方面，本发明提供了在其中已除去氧和/或通过例如使用褐色玻璃容器使所述蛋白/粒子避光保护的环境中，包含以下各项的融合蛋白的应用：

c)来自乙型肝炎的S抗原的序列，

当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合S抗原的病毒样粒子，以生产粒子。

因此，本发明提供了具有至少一个硫醇官能团的还原剂例如本文所述的诸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物、特别是一硫代甘油用于稳定免疫原性脂蛋白粒子形式的包含来源于间日疟原虫的CS蛋白的融合蛋白和/或来源于恶性疟原虫的CS蛋白的融合蛋白(诸如RTS)的蛋白粒子的应用。

因此，本发明提供可具有至少一个硫醇官能团的还原剂，例如本文所述的诸如一硫代甘油，用于稳定包含CSV-S和/或RTS单元的VLP的应用。在一个方面，本发明提供了基本上由CSV-S和/或RTS单元组成的粒子。在可供选择的方面，所述生成的粒子包含或基本上由CSV-S和/或RTS以及S单元组成。

据假设，本发明所使用的所述脂蛋白粒子可为在体内进一步刺激对所述抗原蛋白的免疫应答作贡献。

据进一步假设，加入具有至少一个硫醇官能团的稳定剂例如本文所述的诸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物为每种粒子提供了内稳定化作用，从而所述试剂可在被给出的粒子内被结合或内在化。

本发明还涉及包含与适合的赋形剂例如稀释剂混合的免疫保护量的本发明的稳定化的蛋白粒子的疫苗。

在本说明书背景下的疫苗是指包含全部所述组分(包括辅助组分在内)并适于注射进人类患者的制剂。

在本发明背景下的稳定化意欲表示其中具有至少一个硫醇官能团的稳定剂(本文中还被称作还原剂)例如本文所述的诸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物被省略的相应制剂，例如当在37℃下储存7或14天和/或当在加速稳定性条件下储存时诸如在37℃下储存7天、然后在强光存在下处理约15小时。

稳定性可涉及以下方面：粒子大小(例如通过光散射技术、筛析(SizeExclusion)色谱法或场流分级法测量的)和/或聚集/降解(例如通过SDS-page和蛋白质印迹(Western Blot)测量的)和/或抗原性(例如通过ELISA测量的)和/或免疫原性(例如在体内测量的)。

在一个方面，稳定性是指不存在聚集和降解的。

组合物

在本说明书的背景下，赋形剂是指在药物制剂中的自身没有治疗效果的组分。助剂是一种赋形剂，因为尽管在不存在治疗性组分诸如抗原的条件下，存在由所述助剂产生的生理作用，但是这一生理作用是非特异性的并且其自身是非治疗性的。稀释剂或液体载体落入赋形剂的定义范围内。

在本说明书的背景下，免疫原性意欲是指能够引发对所使用的融合蛋白的CS部分和/或S抗原部分的特异性免疫应答的能力。该应答可以是例如当所述脂蛋白粒子在可能包含/要求适合的助剂的适当的制剂中被给药时。可能要求包含类似于或小于初始剂量的剂量的加强剂，以获得所需的免疫原性应答。

本发明的所述组合物/药物制剂还可包含与一种或多种另外的抗原的混合物，所述另外的抗原为诸如来源于恶性疟原虫和/或间日疟原虫的那些，例如其中所述抗原选自DBP，PvTRAP，PvMSP2，PvMSP4，PvMSP5，PvMSP6，PvMSP7，PvMSP8，PvMSP9，PvAMA1和RBP或其片段。

来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括PfEMP-1，Pfs 16抗原，MSP-1，MSP-3，LSA-1，LSA-3，AMA-1和TRAP。其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA，GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白，Pf332，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs48/45，Pfs230以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。

本发明的所述组合物/药物制剂还可包含与含有CSV-S的粒子混合的RTS，S的粒子(如WO 93/10152所述)。

在本发明的疫苗中，可直接使用所述粒子的水性溶液。替代地，经过或未经过先前冷冻干燥的蛋白可与助剂混合或被助剂所吸附。

助剂

适合的助剂是选自以下组中的那些：金属盐，水包油型乳液，Toll样受体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂，Toll样受体3激动剂，Toll样受体4激动剂，Toll样受体7激动剂，Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)，皂草苷或它们的组合，前提条件是金属盐仅仅用于与另一种的助剂组合使用而非单独使用，除非它们以至多约60％的所述抗原被吸附到所述金属盐上的方式进行配制。在一个实施方案中，所述助剂不包括金属盐作为唯一助剂。在一个实施方案中，所述助剂不包括金属盐。

在一实施方案中，所述助剂是Toll样受体(TLR)4配体，例如诸如脂质A衍生物的激动剂，所述脂质A衍生物特别是单磷酰脂质A或更特别是3-去酰基化单磷酰脂质A(3D-MPL)。

3-去酰基化单磷酰脂质A从美国专利No.4,912,094和英国专利申请No.2,220,211(Ribi)中已知并且可得自Ribi Immunochem，Montana，USA。

3D-MPL由Corixa公司以商标

销售并且主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。其可以根据GB 2220211A中所公开的方法制备。在化学上讲，其是3-去酰基化单磷酰基脂质A与3、4、5或6个酰基化链的混合物。在本发明的所述组合物中优选使用小粒子3D-MPL。小粒子3D-MPL具有使得其可被无菌过滤通过0.22μm过滤器的粒度大小。这种制备物描述于WO 94/21292中。脂质A的合成衍生物是已知的并被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-O-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四碳酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基磷酸二氢酯)，(WO 95/14026)；

OM 294DP(3S，9R)-3-[(R)-十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四碳酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氢酯)(WO99/64301和WO 00/0462)；

OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四碳酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-磷酸二氢酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

一般地，当使用3D-MPL时，所述抗原和3D-MPL使用明矾递送或者存在于水包油型乳液或多相水包油型乳液中。并入3D-MPL是有利的，因为其是效应器T细胞应答的刺激物。

可使用的其它的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，诸如在WO 9850399或US 6303347中公开的那些(也公开了用于制备AGPs的方法)，或如在US 6764840中公开的AGPs的药学可接受的盐。一些AGPs是TLR4激动剂，以及一些是TLR4拮抗剂。认为二者都可用作助剂。

另一种用于本发明的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是从南美树木皂树Quilaja Saponaria Molina中分离的皂草苷制备物并且由Dalsgaard等人在1974首次描述为具有助剂活性(″Saponin adjuvants″，Archiv.für die gesamte Virusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)。Quil A的经纯化的级分已通过HPLC被分离，其保留了助剂活性而不具有与Quil A有关的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(又名QA7和QA21)。QS21是来源于皂树Quilaja Saponaria Molina的树皮的天然皂草苷，其诱导CD8+细胞毒T细胞(CTLs)、Th1细胞和支配性IgG2a抗体应答。

特定的QS21制剂已有描述，其进一步包括甾醇(WO 96/33739)。QS21∶甾醇的比率一般为1∶100到1∶1重量/重量级别。通常，存在过量的甾醇，QS21∶甾醇的比率为至少1∶2w/w。一般对于人类给药而言，QS21和甾醇在疫苗中将以每剂量约1μg到约100μg、诸如每剂量约10μg到约50μg的范围存在。

所述脂质体通常包括中性脂质，例如卵磷脂，其在室温下通常是非晶体，例如蛋黄卵磷脂，二油酰基卵磷脂或二月桂酰基卵磷脂。所述脂质体还可包含带电荷的脂质，其增加了用于由饱和脂质构成的脂质体的脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电荷脂质的量通常是1-20％w/w，诸如5-10％。甾醇∶磷脂的比率是1-50％(mol/mol)，诸如20-25％。

这些组合物可包含MPL(3-去酰基化单磷酰脂质A，又名3D-MPL)。3D-MPL从GB 2220211(Ribi)中已知是三种类型的具有4、5或6个酰基化链的去-O-酰基化单磷酰脂质A的混合物并且由Ribi Immunochem，Montana生产。

所述皂草苷可以分别是胶束、混合胶束(通常然而并非唯一地具有胆汁盐)的形式，或者可为ISCOM基质形式(EP 0109942)、脂质体或相关的胶态结构的形式诸如蜗杆样或环样多聚体复合物以及当使用胆固醇和脂质进行配制时的脂质/层状结构和薄片的形式，或者为水包油型乳液的形式(例如在WO 95/17210中)。

通常，所述皂草苷以脂质体制剂、ISCOM或水包油型乳液的形式存在。

还可使用免疫刺激性寡核苷酸。用于本发明的助剂或疫苗中的寡核苷酸的实例包括含有CpG的寡核苷酸，通常含有被至少三个、更优选被至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是跟随有鸟苷酸的胞嘧啶核苷酸。所述CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在一个实施方案中，在所述寡核苷酸中的核苷酸间键合是二硫代磷酸酯键，或更优选是硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯键和其它的核苷酸间键也落入本发明的范围内。还被包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键合的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US 5,278,302和WO 95/26204中。

寡核苷酸的实例如下所示：

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)-SEQ ID No.20

TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)-SEQ ID No.21

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG-SEQ ID No.22

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)-SEQ ID No.23

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)-SEQ ID No.24

TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)-SEQ ID No.25

所述序列可包含用硫代磷酸酯改性的核苷酸间键合。

替代的CpG寡核苷酸可包含上述的一种或多种序列，对所述序列进行无关紧要的缺失或附加。

所述CpG寡核苷酸可通过本领域已知的任何方法合成(例如，参见EP 468520)。方便地是，这种寡核苷酸可采用自动合成器来合成。

TLR 2激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉类诸如咪喹莫特和雷西莫特是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(在人类中是TLR8，在小鼠中是TLR7)，而双链RNA和聚肌胞苷酸(聚肌苷酸-聚胞苷酸-病毒RNA的市售的合成模拟物)是TLR 3激动剂的示例。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，而CpG是TLR9激动剂的实例。

免疫刺激剂可替代地或附加地被加入。在一个实施方案中，该免疫刺激剂将是3-去酰基化单磷酰脂质A(3D-MPL)。

在一个方面，所述助剂含有3D-MPL。

在一个方面，所述助剂含有QS21。

在一个方面，所述助剂含有CpG。

在一个方面，所述助剂被配制为水包油型乳液。

在一个方面，所述助剂被配制为脂质体。

助剂组合包括3D-MPL和QS21(EP 0671948B1)，包含3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210，WO 98/56414)，在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21，或与其它载体进行配制的3D-MPL(EP 0689454B1)。其它助剂系统包括3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合，如US6558670和US 6544518所述。

在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的稳定化的粒子与3D-MPL和稀释剂组合的疫苗。所述稀释剂一般是水包油型乳液或明矾。

疫苗制备物通常描述于New Trends and Developments in Vaccines，Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.，1978中。在脂质体内的囊封由例如Fullerton等人描述于美国专利4,235,877中。

在每个疫苗剂量中存在的本发明的蛋白粒子的量被选择为诱导免疫保护应答而无典型疫苗中的显著的不良副作用的量。这种量将根据使用哪种特异性免疫原以及所述疫苗是否采用助剂而异。通常，可以预期每个剂量将包含1-1000μg的蛋白，优选1-200μg的蛋白，最优选10-100μg的蛋白。对于特定疫苗的最佳量可通过标准研究来确定，所述标准研究涉及观察对象中的抗体滴度以及其它应答。在最初接种疫苗后，对象优选在约4周内接受加强接种，然后只要存在感染风险，则每六个月重复进行加强接种。对本发明蛋白的免疫应答通过使用助剂和/或免疫刺激剂得以被增强。

使用的3D-MPL的量通常较小，但是根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量1-1000μg，例如每剂量1-500μg，或每剂量1到100μg，诸如每剂量50或25μg。

在本发明的助剂或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常较小，但是根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量1-1000μg，例如每剂量1-500μg，诸如每剂量1-100μg。

在本发明的助剂中使用的皂草苷的量可为每剂量1-1000μg，例如每剂量1-500μg，诸如每1-250μg，特别是每剂量1-100μg，尤其是每剂量50或25μg。

制剂

本发明的制剂可用于预防性或治疗性目的。因此，本发明提供了本文所述的疫苗组合物，其用于医药用途，例如，用于治疗(或预防)疟疾(或用于制备用于治疗/预防疟疾的药物)。

本发明的另一个方面提供了制备本发明的疫苗组分和疫苗以及包含各成分的药包的方法，该方法包括在适合的寄主例如酵母中表达编码所述蛋白的DNA序列，并回收作为脂蛋白粒子的产物，并将后者与本文所定义的至少一种稳定剂、特别是一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物、诸如一硫代甘油混合。

最终体积通常被无菌地分配在3ml玻璃小瓶中，然后将玻璃小瓶宽松地塞上并转移到冷冻干燥器中经历约40小时的冻干循环。

在制备所述抗原组分的过程中，所述赋形剂通常被加入并混合，以及作为最终步骤，所述抗原/脂蛋白粒子将被加入。对于该制备物，也可最后施加保护措施诸如从小瓶中除去氧或通过使用褐色玻璃容器使所述疫苗避光，并结合使用稳定剂或作为备选措施。

在本发明的其中除去氧的方面中，所述制剂/组分/粒子等可在氮气下储存。

所述助剂经常被加入到所述抗原的液体制剂(或所述抗原的冻干制剂)中以形成疫苗。

本发明的另一个方面在于通过给予如上所述的有效量的疫苗治疗容易受疟原虫感染的患者的方法。

在另一个方面，提供了用于本发明的治疗用的疫苗的抗原成分或疫苗(或它们在制备用于治疗/预防疟疾的药物的用途)。

本发明还包括初免加强方案，包括本文所述的各种组分中的一种或多种。

在本说明书的背景下，“包括”被解释为“包含”。

在一个方面，本发明提供了在3mL玻璃小瓶例如琥珀小瓶中的本文所述的稳定化的疟疾抗原，所述小瓶任选地在填充之前用氮气吹扫以除去小瓶中的氧物质。

使用的小瓶可以是硅化的或非硅化的。

本发明还延伸到由或基本上由本文所述的本发明的各方面组成的单独的实施方案，其视情况而定包括某些要素。

显示了以下的实施例用于说明所述方法，其用于制备本发明的粒子。

实施例

实施例1

用于RTS，S疟疾疫苗的单一儿科剂量(2小瓶制剂)的组分的处方

组分量

RTS，S 25μg

NaCl 2.25mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 125μg

注射用水使体积达250μL

以上处方的制备方法为：将RTS，S抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸盐缓冲液(Na/K₂)500mM(当稀释50倍时为pH 6.8)和一硫代甘油的10％的水性溶液的混合物中。最后，调节pH到7.0±0.1。

这可作为与助剂(例如，MPL和QS21的脂质体制剂)的单独的小瓶在一起的小瓶被提供。

组分量

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 500μg

胆固醇 125μg

MPL 25μg

QS21 25μg

NaCl 2.25mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

注射用水使体积达250μL

对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行，然后振摇。然后，以常规方式给予所述剂量。

最终液体制剂的pH为约6.6+/-0.1。

实施例1A

本发明的最终儿科液体制剂(1小瓶)可根据以下处方制备。

组分量

RTS，S 25μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 125μg

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 500μg

胆固醇 125μg

MPL 25μg

QS21 25μg

注射用水使体积达500μL

上述液体制剂的pH或者被调节到7.0+/-0.1(其对于抗原稳定性而言是有利的，但是对于MPL的稳定性而言完全没有利)，或者被调节到6.1+/-0.1(其对于MPL稳定性而言是有利的，但是对于RTS，S稳定性而言完全没有利)。因此，该制剂意欲在制备后迅速使用。

上述制剂如下制备：将RTS，S抗原加入到注射用水、NaCl 1500mM、磷酸盐缓冲液(Na/K₂)500mM(当稀释50倍时为pH 6.8)和一硫代甘油的10％的水性溶液的混合物中。然后，加入包含MPL与QS21的脂质体的预混合物，并且最后调节pH。

实施例1B

本发明的RTS，S的最终成人剂量(1小瓶制剂)可如下制备：

组分量

RTS，S 50μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 250μg

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 1000μg

胆固醇 250μg

MPL 50μg

QS21 50μg

注射用水使体积达500μL

实施例1C

可例如在填充之前用氮气吹扫琥珀小瓶而后将实施例1、1A或1B置于该小瓶中来制备实施例1C。

实施例2

本发明的组分还可作为用于儿科人群的二剂量(2小瓶制剂)被提供。

组分量

RTS，S 50μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 250μg

注射用水使体积达500μL

上述制剂的制备方法为：将RTS，S抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸盐缓冲液(Na/K₂)500mM(当稀释50倍时为pH 6.8)和一硫代甘油的10％的水性溶液的混合物中。最后，调节pH到7.0±0.1。

组分量

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 1000μg

胆固醇 250μg

MPL 50μg

QS21 50μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

注射用水使体积达500μL

对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行，然后振摇。然后以常规方式吸取单一剂量(500μL)并给药。

最终液体制剂的pH为约6.6+/-0.1。

实施例2A

本发明的最终儿科液体制剂(1小瓶)可根据以下处方被制备为双剂量。

组分量

RTS，S 50μg

NaCl 9mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 250μg

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 1000μg

胆固醇 250μg

MPL 50μg

QS21 50μg

注射用水使体积达1000μL

上述制剂按如下方法制备：将RTS，S抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸盐缓冲液(Na/K₂)500mM(当稀释50倍时为pH 6.8)和一硫代甘油的10％的水性溶液的混合物中。然后，加入包含MPL与QS21的脂质体的预混合物，并且最后调节pH。

实施例2B

本发明的RTS，S的最终成人剂量(1小瓶制剂)可如下被制备成双剂量：

组分量

RTS，S 100μg

NaCl 9mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 500μg

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 2000μg

胆固醇 500μg

MP 100μg

QS21 100μg

注射用水使体积达1000μL

实施例2C

可例如在填充之前用氮气吹琥珀小瓶而后将实施例2、2A或2B置于该小瓶中来制备实施例2C。

实施例3

用于填充体积为500μl的RTS，S疟疾疫苗的单一儿科剂量(2小瓶制剂)的组分的处方。

组分量

RTS，S 25μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

一硫代甘油 50μg或200μg

注射用水使体积达500μL

上述制剂按如下方法制备：将RTS，S抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸盐缓冲液(Na/K₂)500mM(当稀释50倍时为pH 6.8)和一硫代甘油的10％的水性溶液的混合物中。最后，调节pH到7.0±0.1。

这可作为与助剂(例如，填充体积为500μl的MPL和QS21的脂质体制剂)的单独的小瓶在一起的小瓶被提供。

组分量

1，2-二-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC) 500μg

胆固醇 125μg

MPL 25μg

QS21 25μg

NaCl 4.5mg

磷酸盐缓冲液(Na/K₂) 10mM

注射用水使体积达500μL

为了给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行，然后振摇。然后以常规方式给药所述剂量。

最终液体制剂的pH为约6.6+/-0.1并且注射体积为1ml。

实施例4

加速稳定性结果指示如下：

·pH和渗克分子浓度与注射相容；

·关于RTS，S含量：在4℃或37℃历时5周后，没有由非特异性吸附导致的抗原损失；

·关于抗原完整性(参见图6、7和8)：

·在加速稳定性之后(37℃±AOT历时7天，37℃历时14天)没有显著降解；

·没有惰化(without inerting)，要求抗氧化剂(一硫代甘油)以避免在加速稳定性(37℃±AOT历时7天，37℃历时14天)之后发生氧化性聚集；

о在37℃0.01％足以避免聚集；

о对于在37℃+AOT下的稳定性需要0.04％；

·琥珀色玻璃确保抗原避光(在AOT之后观察到的)；

·在加速稳定性(37℃历时7天)之后RTS，S粒度分布不发生改变；

·关于抗原性(参见图9)；

·没有惰化(without inerting)，要求抗氧化剂(一硫代甘油)以避免在加速稳定性(37℃±AOT历时7天)之后发生氧化性聚集和抗原性增加；

о0.01％允许很稳定的抗原性(80-120％)；

о0.04％在加速稳定性之后诱导轻微的抗原性降低(-10％)；

·在与AS01(含有MPL和QS21的脂质体助剂制剂)混合时：

·在混合之后RTS，S完整性和抗原性在25℃保持至少24小时。

在有或者没有一硫代甘油时将这些RTS，S液体制剂在37℃储存7天、14天，图8或甚至5周之后，已进行了SDS-Page分析。

图6表明

·在没有一硫代甘油的条件下：在37℃储存7天之后发生轻微的RTS，S聚集(孔3和4)；在暴露于AOT下之前在37℃在白色小瓶中储存7天后完全聚集和轻微降解(孔6)，而琥珀色玻璃避免RTS，S发生由光诱导的降解和氧化性聚集(孔5)；

·在有一硫代甘油0.01％的条件下：该浓度足够使RTS，S在37℃下储存时稳定7天(孔7)，但是在加速氧化试验(AOT)累积下该浓度不足够(孔9)，除了与琥珀色玻璃组合使用之外(孔8)；

·在有一硫代甘油0.04％的条件下：该浓度足够使RTS，S在37℃下储存时稳定7天(孔10)，当使用加速氧化试验累积时也是如此(孔12)；在这种情况下，不要求填充到琥珀色玻璃小瓶中(孔11)；

·与AS01混合对RTS，S特性没有影响，即使在25℃储存24小时之后。

图7显示需要一硫代甘油来避免RTS，S聚集，但是两个浓度都能够使RTS，S在37℃储存时稳定至少14天(孔11和12，相对于孔10)。

图8显示在37℃历时5周之后，在全部制剂中都发生RTS，S聚集和降解；AS01在全部制剂中加重聚集。

实施例5

对于包含0、0.01％或0.04％的一硫代甘油的制剂，通过混合ELISAαCSP-αS，在T0(±AOT)或在37℃储存7天(±AOT)或5周时，测定RTS，S抗原性；已经在与AS01重新构成之前、刚刚重新构成之后和重新构成之后在25℃24小时测量RTS，S抗原性。

图9表明

·在没有一硫代甘油的条件下：

о暴露于675W下历时15小时(AOT)促使抗原性增加50-60％(这可以与在SDS-Page中观察到的氧化性聚集相关联)，但是装入琥珀色玻璃小瓶将这一抗原性增加限制到～20％；

о在37℃储存7天促使抗原性增加～30-40％(这也可以与在SDS-Page中观察到的氧化性聚集相关联)；

о在37℃下7天到5周之间，抗原性降低～30％；

о在25℃历时24小时之后，AS01促使抗原性增加～20％(这也可以与在SDS-Page中观察到的聚集增加相关联)；

·在有0.01％一硫代甘油的条件下：

о一硫代甘油保护RTS，S避免发生由于在37℃储存7天、AOT诱导的(使琥珀色玻璃无用)或与AS01混合所诱导的抗原性增加(但是当在AS01中在25℃储存24小时累积到在37℃储存7天时，该增加为～20％)；

о在37℃下7天和5周之间抗原性降低～20％(→不合格(out ofspec))；

·在有0.04％一硫代甘油的条件下：

о一硫代甘油保护RTS，S避免发生由AOT诱导的抗原性增加，使褐色玻璃无用；

о在37℃储存7天促使抗原性降低～20％；

о在37℃下7天到5周之间不发生抗原性降低；

о在25℃历时24小时之后，AS01促使抗原性增加～30-40％。

实施例6

为了考察一硫代甘油被固定到RTS，S上对单克隆抗体识别RF1-表位(S)的影响，在使用或未使用一硫代甘油(MTG)进行稳定的RTS，S液体制剂中，在T0(时间0)或在37℃储存7天之后(7天)，通过ELISA抑制试验测定了RTS，S对RF1腹水的反应性(参见表1)。

表1

在所述试验中使用的单克隆抗体对表位RF1如表1所示。

在表1中，仅有两个样品具有的RF1-表位比其它显著更好地被识别：

·在37℃储存7天的RTS，S经纯化的体积；

·在不包含一硫代甘油并在37℃储存7天的液体制剂中的RTS，S。

这意味着在这些样品中发生构象变化，增加了RF1-表位的可达性。这些结果毫无疑问地被认为与混合ELISA αCPS-αS的结果是平行的(在不含一硫代甘油的制剂中，在37℃储存7天之后，RTS，S抗原性增加)。

因此，我们得出以下结论：

·一硫代甘油看来在T0时对RF1-表位的识别/可达性没有消极影响(与在“新鲜的”经纯化的体积中的水平相同)；

·识别水平在包含一硫代甘油并在37℃储存7天的RTS，S液体制剂中保持稳定，表明了RTS，S构象被一硫代甘油所稳定。

免疫原性数据

实施例7

在小鼠中评价并比较了几种RTS，S制剂的免疫原性。在这些实验中，RTS，S、AS01、50mM PO₄、NaCl 100mM、pH 6.1疫苗制剂被用作用于评价3种其它的RTS，S制剂的基准标记，所述3种其它的RTS，S制剂为：

1)甘露醇-蔗糖冻干的RTS，S(要与助剂重新构成)，

2)包含0.02％一硫代甘油的液体制剂，和

3)包含0.08％一硫代甘油的液体制剂(在注射前各自都要与AS01混合)。

需要注意的是，在液体RTS，S制剂与AS01混合之后，一硫代甘油的最终浓度是0.01％和0.04％。

分别在如下所述的两个不同类型的免疫原性实验中和在实施例8中测定了由不同的RTS，S制剂引起的体液应答和细胞免疫应答。

小鼠体液免疫应答实验

a.引言

评价和比较了在用不同的RTS，S制剂免疫的小鼠中被引起的抗CS和抗HBs抗体应答(总免疫球蛋白)。

b.实验设计

所述试验设计遵循得自目前的RTS，S/AS01疫苗的体内效能测定的一种试验设计，即，Balb/C小鼠株，得自体内效能测定的剂量释放的单次腹膜内注射(0.25μg RTS，S)，和通过ELISA测量在免疫后第28天血清中的抗CS和抗HBs抗体应答(总免疫球蛋白)。

为了定义实验的样本量，使用了用与AS01助剂进行配制的RTS，S进行的体内效能测定进行评估的抗CS和抗HBs抗体应答的变异性。基于此，统计学家确定了每组25只小鼠的样本量(在2个不同的实验中)将允许以具有90.9％功效的双向方差分析检测组平均值之间的2倍差异。

c.结果

使用在免疫后第28天收集的血清进行抗CS血清学(总Ig)。得自50只小鼠/组的滴度用Log表示并示于图10中。

与抗CS血清学结果有关的统计分析(Dunnett)概括在表4中。

表4.在多种RTS，S制剂之间的抗CS GMTs的统计比较

第1组	第2组	调整	Prob_Adj
				RTS，S甘露醇-蔗糖lyo	RTS，S蔗糖lyo	Dunnet	0.2529
RTS，S液体0.02％一硫代甘油	RTS，S蔗糖lyo	Dunnet	0.6070
				RTS，S液体0.08％一硫代甘油	RTS，S蔗糖lyo	Dunnet	0.6025

这些结果指示，由甘露醇-蔗糖lyo或液体RT S，S制剂引起的抗CS总Ig应答与由被配制在MPL和QS21的脂质体助剂制剂中的RTS，S所诱导的抗CS总Ig应答没有统计学不同(92.7％的统计功效以检测Ab滴度的2倍差异)。

使用在免疫后28天收集的血清进行抗HBs血清学(总Ig)。得自50只小鼠/组的滴度用Log表示并示于图11中。

与抗HBs血清学结果有关的统计分析(Dunnett)概括在表5中。

表5.在单独的备选RTS，S制剂和目前RTS，S制剂之间的抗HBsGMTs的统计比较

第1组	第2组	调整	Prob_Adj
				RTS，S甘露醇-蔗糖lyo	RTS，S蔗糖yo	Dunnet	0.1332
RTS，S液体0.02％一硫代甘油	RTS，S蔗糖lyo	Dunnet	0.9857

RTS，S液体0.08％一硫代甘油

RTS，S蔗糖lyo

Dunnet

0.1105

这些结果指示，由甘露醇-蔗糖lyo或液体RT S，S制剂引起的抗HBs总Ig应答与由被配制在MPL和QS21的脂质体制剂中的RTS，S所诱导的抗HBs总Ig应答没有统计学不同(91.4％的统计功效以检测Ab滴度的2倍差异)。

d.结论

全部三种供选择的测试的RTS，S制剂在小鼠中都引起抗CS和抗HBs抗体应答。另外，统计分析指示，由甘露醇-蔗糖RTS，S lyo、临时在MPL和QS21的脂质体制剂中重新构成的液体RTS，S 0.02％一硫代甘油或者液体RTS，S 0.08％一硫代甘油引起的抗CS和抗HBs抗体应答，与由在AS01中重新构成的目前的RTS，S冻干制剂所诱导的抗CS和抗HBs抗体应答没有统计显著差异。与抗CS和抗HBs抗体应答的分析有关的功效分别至少是92.7％和91.4％，以显示比率为2(初始标度，即抗体滴度)或差异为0.301(对数标度)

实施例8

小鼠细胞免疫应答实验：

a.引言

在第二种类型的实验中，使用基于流式细胞术的检测技术，测量在用覆盖HBs和CS序列的肽的混合物进行短期的离体刺激之后表达T细胞的细胞因子对HBs和CS抗原的由细胞介导的免疫(CMI)应答。

b.实验设计

供试组与上述在实施例7的实验中的供试组相同。然而，该实验设计是不同的，即，用一定剂量范围(5μg和2.5μg)的在AS01中的RTS，S抗原进行3次肌内注射使C57BL/6小鼠免疫，根据得自先前的针对评价抗原特异性细胞免疫应答的小鼠免疫原性研究的规程进行。该实验进行两次，并且确定了样本量，以便收集足够的细胞以进行基于流式细胞术的试验。实际上，在各组中，对从4只小鼠收集的血细胞(即，3个收集物/组)进行了CMI分析。这一读数被认为是探索性的，因为只使用每个实验每组中可获得的三个值(pools)以及因为这种基于细胞的试验的公知的变异性，不能得出统计学结论。

c.结果

在第三次免疫后第7天的CS特异性和HBs特异性的CD4和CD8T细胞应答如图12、13、14和15所示。

各图内的每个三角形(i)代表在用覆盖CS或HBs序列的肽的混合物(pools)在体外对外周血淋巴细胞进行再刺激之后得自4只小鼠的应答，和(ii)代表在对体外再刺激中所使用的肽的混合物产生应答中产生IL-2和/或IFN-γ的CD4或CD8T细胞的百分数。

这些结果指示了CS和HBs特异性的CD4T细胞应答由全部进行试验的RTS，S制剂所引起。这些抗原特异性CD4T细胞应答是可比较的，无论使用RTS，S和AS01(目前的冻干制剂)、RTS，S甘露醇-蔗糖lyo、包含0.02％或0.08％一硫代甘油(MTG)的液体RTS，S用于免疫(在全部试验剂量下，应答都是可比较的)。

这些结果指示了CS和HBs特异性的CD8T细胞应答由全部试验的RTS，S制剂所引起。这些抗原特异性CD8T细胞应答是可比较的，无论使用RTS，S和AS01(目前的冻干制剂)、RTS，S甘露醇-蔗糖lyo、包含0.02％或0.08％一硫代甘油(MTG)的液体RTS，S用于免疫(在全部试验剂量下，应答都是可比较的)。值得注意的是，对于液体RTS，S制剂而言存在这样一种趋势，即在两个试验剂量(2.5和5μg)下都诱导更高百分数的Ag特异性CD8T细胞。然而，如上所述，这一读数被认为是探索性的，因为只使用每个试验每组中可获得的三个值(pools)以及因为这种基于细胞的试验的公知变异性，不能得出统计学结论。

d.结论

由RTS，S甘露醇-蔗糖lyo、液体RTS，S 0.02％一硫代甘油和液体RTS，S 0.08％一硫代甘油所引起的CS和HBs特异性CD4和CD8T细胞应答，与在AS01中重新构成的目前的RTS，S冻干制剂所引发的那些是可比较的。

参考文献

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(9)In SS，Kee-Hoyung L，Young RK，et al.，“comparison of ImmunologicalResponses to Various Types of Circumsporozoite Proteins of Plasmodium vivaxin Malaria Patients of Korea”，Microbiol.Immunol.48(2)：119-123，2004；Microbiol.Immunol.2004；48(2)：119-123.

(10)Rathore D，Sacci JB，de la Vega P，et al.，”Binding and Invasion of Liver Cells byPlasmodium falciparum Sporozoites”，J.Biol.Chem.277(9)：7092-7098，2002.Rathore et al.，2002，J.Biol.Chem.277，7092-8.

序列表

SEQ ID NO：1

1区

KLKQP

SEQ ID NO：2

II区+

CSVTCG

SEQ ID NO：3

VK210重复单元

GDRAAGQPA

SEQ ID NO：4

VK210重复单元

GDRADGQPA

SEQ ID NO：5

VK210重复单元

GDRADGQAA

SEQ ID NO：6

VK210重复单元

GNGAGGQPA

SEQ ID NO：7

VK210重复单元

GDGAAGQPA

SEQ ID NO：8

VK210重复单元

GDRAA GQAA

SEQ ID NO：9

VK210重复单元

GNGAGGQAA

SEQ ID NO：10

主要VK247重复单元

ANGAGNQPG

SEQ ID NO：11

12个氨基酸插入

GGNAANKKAEDA

SEQ ID NO：12

Pv-CS核苷酸序列

Acacattgcggacataatgtagatttatctaaagctataaatttaaatggtgtaaacttc

aataacgtagacgctagttcactcggggctgcg

cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaagaa

ggtgatgctaaaaagaaaaaggacg

gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatcgcg

cggatggtcaagcggcgggtaatggg

gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcggct

ggtcagccagcgggggatggtgc

ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcggatgg

tcaaccagccggtgatcgcgcggct

ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaaccag

ccaggcggcggtaacgctgcga

ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtcaga

acaacgaaggggctaatgcaccaaa

cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatggac

gccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt

acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaatga

tctcgaaacggatgtctgcaca

SEQ ID NO：13

Pv-CS蛋白的氨基酸序列

THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN

PDDEEGDAKKKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGG

QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG

QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG

NAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT

CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT

SEQ ID NO：14

次要2型重复单元

ANGAGDQPG

ACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTGAACGGTGTTAATTTC 60

AACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAATCTGCTTCAAGAGGT 120

AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAGAAGAAGAAGGACGGT 180

AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC 240

GACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGTGACAGAGCTGCCGGT 300

CAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGTGCCGCCGGTCAACCT 360

GCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGACGGACAGCCAGCCGGC 420

GATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCTGCTGCTAACGGT 480

GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCTGGTGGT 540

AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCTAACGCTCCAAAC 600

GAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTCGGTACTGAATGGACT 660

CCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC 720

AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT 771

核苷酸序列

ATGATGGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG 60

AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAA 120

TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAG 180

AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAA 240

CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT 300

GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT 360

GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC 420

GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA 480

GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT 540

GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT 600

GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC 660

GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA 720

GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT 780

TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG 840

CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA 900

GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT 960

TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT 1020

CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC 1080

TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA 1140

TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT 1200

ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC 1260

CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG 1320

CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT 1380

TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT 1440

ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA 1485

SEO ID No 17

氨基酸序列

THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK 60

KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG 120

AAGQPAGDRADGQPAGDRADGQPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKA 180

EDAGGNAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVTCGVGVRVRRR 240

VNAANKKPEDLTLNDLETDVCT

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSL 300

DSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLI 360

FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI 420

PSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPF 480

IPLLPIFFCLWVYI 494

SEQ ID NOs.18和19

RTS表达盒的核苷酸序列和RTS-HbsAg杂合蛋白的预期翻译产物。

起源于TDH3ATG密码子的翻译产物如以下的DNA序列所示。

AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACAAATTCGAAATACTTTGACC

CTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTTCCTATG

ACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAGACATAT

TTGACCTCTTAACTGGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTTGAAAAGAACT

TACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTA

ATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTT

GAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGA

ATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAATTAGCCTTT

TAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAAC

ATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATCCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCTCGC

TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACC

AACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAG

GCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACAC

AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGC

TCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCC

CCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTGTAAATCTAT

TTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA

AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGATGGCTCCCGATCCTAATG

MetMetAlaProAspProAsnA

CAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA

CAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA

CAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsna

CAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATAAAAACAATCAAG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnLysAsnAsnGlnG

GTAATGGACAAGGTCACAATATGCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTA

LyAsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAlaA

ATGCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAAC

snAlaAsnAsnAlaValLysAsnAsnAsnAsnGluGluProSerAspLysHisIleGluG

AATATTTAAAGAAAATAAAAAATTCTATTTCAACTGAATGGTCCCCATGTAGTGTAACTT

LnTyrLeuLysLysIleLysAsnSerIleSerThrGluTrpSerProCysSerValThrC

GTGGAAATGGTATTCAAGTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCTAATAAACCTAAAGACGAAT

YsGlyAsnGlyIleGlnValArgIleLysProGlySerAlaAsnLysProLysAspGluL

TAGATTATGAAAATGATATTGAAAAAAAAATTTGTAAAATGGAAAAGTGCTCGAGTGTGT

euAspTyrGluAsnAspIleGluLysLysIleCysLysMetGluLysCysSerSerValP

TTAATGTCGTAAATAGTCGACCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAG

HeAsnValValAsnSerArgProValThrAsnMetGluAsnIleThrSerGlyPheLeuG

GACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGC

LyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProG

AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTG

LnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlySerProValCysLeuG

GCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTC

LyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProIleCysP

CTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT

RoGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPheIleIlePheLeuPheIleLeuLeuLeuC

GCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAA

YsLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuI

TTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAG

LeProGlySerThrThrThrAsnThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAlaGlnG

GCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTA

LyAsnSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProThrAspGlyAsnCysThrCysI

TTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTT

LeProIleProSerSerTrpAlaPheAlaLysTryLeuTrpGluTrpAlaSerValArgP

TCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTG

HeSerTrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProThrV

TTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGA

AlTrpLeuSerAlaIleTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerIleValS

GTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAACGAATTC

ErProPheIleProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpValTyrIleEnd

CAAGCTGAAACAATTCAAAGGTTTTCAAATCAATCAAGAACTTGTCTCTGTGGCTGATCC

AAACTACAAATTTATGCATTGTCTGCCAAGACATCAAGAAGAAGTTAGTGATGATGTCTT

TTATGGAGAGCATTCCATAGTCTTTGAAGAAGCAGAAAACAGATTATATGCAGCTATGTC

TGCCATTGATATCTTTGTTAATAATAAAGGTAATTTCAAGGACTTGAAATAATCCTTCTT

TCGTGTTCTTAATAACTAATATATAAATACAGATATAGATGCATGAATAATGATATACAT

TGATTATTTTGCAATGTCAATTAAAAAAAAAAAATGTTAGTAAAACTATGTTACATTCCA

AGCAAATAAAGCACTTGGTTAAACGAAATTAACGTTTTTAAGACAGCCAGACCGCGGTCT

AAAAATTTAAATATACACTGCCAACAAATTCCTTCGAGTTGTCCAATTTCACCACTTTTA

TATTTTCATCAACTTCAGCAGATTCAACCTTCTCACATAGAACATTGGAATAAACAGCCT

TAACACCACTTTCAAGTTTGCACAGCGTAATATGAGGAATTTTGTTTTGACAACACAACC

CTTTAATTTTCTCATTGTTTTCATCAATTATGCATCCATCTTTATCTTTAGACAGTTCCA

CTACAATAGCAATAGTTTTTTCATCCCAACATAGTTTTTCGAGCCTAAAATTCAGTTTGT

CGGTCGTTTTACCTGCGTATTTTGGTTATTACCAGAGCCTTGTGCATTTTCTATGCGGT

TGTTATTGTACTCCGTTATCTGGTCAGTGTATCTGTTACAATATGATTCCACAACTTTTT

TGCCTCTTTTTCACGGGACGACATGACATGACCTAATGTTATATGAAGTTCCTTCTGAAC

TTTTCCACTAGCTAGTAAATGCTTGAATTTCTCAGTCAGCTCTGCATCGCTAGCAATACA

CCTCTTGACCAATCAATAATTTCATCGTAGTTTTCTATTTAGCTGAGATATATGTAGGT

TTAATTAACTTAGCGTTTTTTGTTGATTATTGTTGCCTTTACCAACTATTTTTCTCACAG

TAGGTTTGTAATCTAAGCTCCTTCTGAACGCTGTCTCAATTTCATCATCTTTCGGGATCT

CTGGTACCAAAATTGGATAAGCTT

Claims

1.疟疾疫苗用组分，其包括

a)免疫原性粒子RTS，S和/或

b)来源于一种或多种间日疟原虫虫株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，或

c)包含RTS、CSV-S和任选的未融合S抗原的免疫原性粒子，和

d)包括具有至少一个硫醇官能团的稳定剂或其混合物的稳定剂。

2.权利要求1所述的组分，其中所述稳定剂是N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘油，半胱氨酸，还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠，或其混合物。

3.权利要求2所述的组分，其中所述稳定剂是一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物。

4.权利要求1到3中任一项所述的组分，其中所述组分是液体制剂。

5.权利要求4所述的组分，其中所述液体制剂的pH为约6.5到7.2。

6.权利要求1到3中任一项所述的组分，其中所述组分经过冻干。

7.权利要求1到6中任一项所述的组分，其中所述稳定剂是半胱氨酸并在0.1到1.0％w/w的范围内存在。

8.权利要求1到7中任一项所述的组分，其中所述稳定剂是一硫代甘油，其在所述制剂中在0.01到1％w/w的范围内存在。

9.权利要求1到8中任一项所述的组分，其中所述组分被储存在玻璃小瓶中。

10.权利要求9所述的组分，其中所述玻璃小瓶是琥珀色的。

11.权利要求9或10所述的组分，其中所述玻璃小瓶是硅化的。

12.权利要求9或10所述的组分，其中所述玻璃小瓶是非硅化的。

13.权利要求1到12中任一项所述的组分，其中所述组分包含除助剂组分以外的一个剂量的注射用成分。

14.权利要求13所述的组分，其中所述一个剂量包括25μg的RTS，S。

15.权利要求14所述的组分，其进一步包含2.25mg的氯化钠。

16.权利要求14或15所述的组分，其进一步包括125μg的一硫代甘油。

17.权利要求13到16中任一项所述的组分，其进一步包含250μL的注射用水。

18.权利要求1到12中任一项所述的组分，其中所述组分包含除助剂组分以外的两个剂量的注射用成分。

19.权利要求1到12和18所述的组分，其中所述一个剂量包含50μg的RTS，S。

20.权利要求19所述的组分，其进一步包含4.5mg的氯化钠。

21.权利要求19或20所述的组分，其进一步包含250μg的一硫代甘油。

22.权利要求1到12或19到21中任一项所述的组分，其进一步包含500μL的注射用水。

23.权利要求1到23中任一项所述的组分，其进一步包含其它的疟疾抗原。

24.权利要求23所述的组分，其中所述其它的疟疾抗原源自于恶性疟原虫和/或间日疟原虫，其中所述抗原选自：DBP诸如Pv RII，即DBP的受体结合结构域，PvTRAP，PvMSP2，PvMSP4，PvMSP5，PvMSP6，PvMSP7，PvMSP8，PvMSP9，PvAMA，RBP或其片段，PfEMP-1，Pfs16抗原，MSP-1，MSP-3，LSA-1，LSA-3，AMA-1和TRAP，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白，Pf332，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs48/45，Pfs230以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。

25.疟疾用疫苗，其包含权利要求1到23中任一项所述的组分和选自以下的助剂：

a.包含QS21和3D-MPL的水包油型制剂，或

b.包含QS21和3D-MPL的脂质体制剂。

26.用于制备权利要求1到24中任一项所述的组分的方法，包括在适合的寄主中表达编码所述蛋白的DNA序列，回收产物并将所回收的产物与稳定剂混合。

27.权利要求1到24中任一项所述的疟疾疫苗用组分或权利要求25所述的疫苗，其用于预防或治疗疟疾。

28.权利要求1到24中任一项所述的组分或权利要求25所述的疫苗在制备用于预防或治疗疟疾的药物中的应用。

29.通过给予有效量的权利要求25所述的疫苗来治疗易感疟原虫感染的患者的方法。