CN105233296B - 用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用,属于兽用生物制品制造领域。所述耐热冻干保护剂,含有蔗糖70~100 g/L、普鲁兰糖1~10g/L、明胶6~10g/L、还原型谷胱甘肽10~20g/L、磷酸氢二钾10~20g/L、磷酸二氢钾5~10g/L、牛血清白蛋白10~30g/L、甲硫氨酸10~20g/L。本发明还要求保护该耐热冻干保护剂的制备方法、含有该耐热冻干保护剂的活疫苗。本发明保护剂在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活性,而且对鸭是安全的,有效解决了疫苗在保存、运输中的低温冷链问题,尤其是解决了偏远地区农村低温冷链问题;同时还降低了疫苗保存、运输的成本。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品制造技术领域,尤其是涉及用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(duck hepatitisvirus,DHV;属于小核糖核酸病毒)引起的雏鸭的一种以肝脏出血性炎症为特征的急性、烈性、高度致死性传染病。临床表现为痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状,以肝脏肿胀、出血为特征性病变。雏鸭感染后的死亡率可达90%~95%,已经成为危害养鸭业的主要疾病之一,会造成养鸭业极大的经济损失。
鸭肝炎病毒(DHV)有4个独立的血清型,1型、2型、3型和新型。范书才等(范书才,李虹,袁率珍等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定.中国预防兽医学报,2009,10)通过试验证明目前在我国同时存在1型和新型DHV流行。血清中和试验表明,1型和新型之间缺乏交叉保护作用。在4个型的DHV中,1型与新型DHV流行最广泛,毒力最强;对3周龄内的雏鸭致死率可在80%以上。2型DHV仅在英国,3型仅在美国有报道;二者均呈散发性流行,致死率低(约20%)。近年来我国大陆、台湾及韩国分别有1型DHV变异株和新型鸭肝炎的报道,不同学者通过分子生物学和血清学试验证实我国虽有鸭肝炎变异株或新型鸭肝炎的存在,但鸭肝炎的流行仍以经典的1型肝炎为主。
目前我国鸭的年饲养量已达40亿只,占全世界鸭饲养总量的70%以上。此前,我国对鸭病毒性肝炎的防治主要加强消毒和常规疫苗免疫,由于被动免疫持续时间短,预防和治疗效果不佳,常常需要多次免疫,造成防治费用高、费时费力。鸭病毒性肝炎活疫苗是预防本病最经济和最有效的方法。
鸭肝炎病毒属小RNA病毒,无脂蛋白包膜,一般不耐受冷冻干燥。目前,鸭病毒性肝炎活疫苗在2℃~8℃条件下的保存期只有3~6个月,大多需要在-15℃以下保存。因此,鸭病毒性肝炎活疫苗在长期保存和长途运输过程中需要严格控制温度,不仅成本较高,而且增加了疫苗失效的风险。现有技术中,鸭病毒性肝炎活疫苗常用的耐热冻干保护剂的主要成分是乳糖、牛奶、明胶等,虽然组方简单、产品外形稳定、易溶性好、成本低,但在冷冻干燥及高温储存过程中对抗原活性保护能力较差。
发明内容
本发明的目的是提供用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂,在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活性,而且成本较低、对鸭安全。
本发明的另一目的是提供耐热冻干保护剂的制备方法,该方法操作方便、安全。
本发明的再一目的是提供上述耐热冻干保护剂在制备鸭病毒性肝炎活疫苗方面的应用,制备的鸭病毒性肝炎活疫苗,其病毒含量几乎与湿毒相当,能够耐受较高温度储存。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂,含有下述成分:蔗糖70~100g/L、普鲁兰糖1~10g/L、明胶6~10g/L、还原型谷胱甘肽10~20g/L、磷酸氢二钾10~20g/L、磷酸二氢钾5~10g/L、牛血清白蛋白10~30g/L、甲硫氨酸10~20g/L。
在本发明中,所述耐热冻干保护剂的溶剂为无菌的生理盐水、注射用水、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Hank’s液。缓冲液的pH选择7.0~7.5。
本发明还提供所述耐热冻干保护剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)将含有蔗糖、明胶和普鲁兰糖的溶液,采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌;
(2)将含有还原型谷胱甘肽、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白和甲硫氨酸的溶液,采用过滤法进行除菌;
(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合,得到所述耐热冻干保护剂。
本发明还提供所述耐热冻干保护剂在制备鸭病毒性肝炎活疫苗方面的应用以及采用所述耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗。
本发明还提供所述鸭病毒性肝炎活疫苗的制备方法,包括如下步骤:将耐热冻干保护剂和鸭肝炎病毒液按照体积比为0.5~1.5:1混合,冷冻干燥后得到所述鸭病毒性肝炎活疫苗。
在本发明中,所述冷冻干燥方法如下:将耐热冻干保护剂和鸭肝炎病毒液的混合物放入真空干燥机内,在常压、0~6℃条件下预冷20~40min,然后按照0.2~0.5℃/min的速度降温至-38~-42℃并维持2~5h,抽真空至300~500mTorr,然后以0.02-0.04℃/min的速度升温至-18~-22℃并维持1.5~3h,再以0.4~0.6℃/min的速度升温至20~24℃并维持5~7h。
在本发明中,鸭肝炎病毒为1型、2型、3型或新型。
经过多次试验发现,分子量在10000-20000范围内的普鲁兰糖均可以用于制备本发明耐热冻干保护剂,且对抗原活性的保护效果相似。
与现有技术相比,本发明用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂具有以下优势:
(1)本发明耐热冻干保护剂在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活性,而且对鸭是安全的,有效解决了疫苗在保存、运输中的低温冷链问题,尤其是解决了偏远地区农村低温冷链问题;同时还降低了疫苗保存、运输的成本。
(2)本发明耐热冻干保护剂,制备过程操作方便,安全。采用本发明耐热冻干保护剂制备鸭病毒性肝炎活疫苗,冻干时间短。由于本发明耐热冻干保护剂的主要成分主为蔗糖,避免使用大量海藻糖,有效降低鸭病毒性肝炎活疫苗的冻干成本。
(3)采用本发明耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗,其病毒含量几乎与湿毒相当,能够耐受较高温度储存,37℃储存10d病毒含量仅为损失100.33~100.36ELD50/0.1ml,37℃储存30d病毒含量损失仅为100.61~100.64ELD50/0.1ml,显著低于对照疫苗。因此,采用本发明耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗将大大降低制备、储存成本,降低失活风险。
具体实施方式
实施例1制备鸭肝炎病毒液
取生产用鸭肝炎病毒1型A66株,用灭菌生理盐水作100倍稀释,接种发育良好的9~10d SPF鸡胚尿囊腔,每胚0.2ml,封孔后,置37℃继续孵育,弃去24h内死亡的鸡胚,每隔4h照胚一次,及时收获24~72h死亡的鸡胚,置4℃冷却24h后,取出用碘酊消毒气室,以无菌手术剪除去蛋壳,收获病变鸡胚绒毛尿囊膜、胚液(尿囊液及羊水)、胚体并混合,高速匀浆制成悬液,作为鸭肝炎病毒液。将鸭肝炎病毒液置于灭菌容器中,加入终浓度为10000U/ml青霉素和10mg/ml链霉素,作用1~2h,留样后置于-80℃冻结保存。经检验无菌,病毒含量≥106.5ELD50/0.1ml,方可用于配苗。
实施例2制备耐热冻干保护剂
本实施例中普鲁兰糖分子式为C37H62O30,分子量为10000。牛血清白蛋白缩写为BSA。
1.耐热冻干保护剂A
耐热冻干保护剂A含有下述成分:蔗糖70g/L、普鲁兰糖1g/L、明胶6g/L、还原型谷胱甘肽10g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾5g/L、BSA10g/L、甲硫氨酸10g/L,溶剂为pH7.2、20mmol/L Tris-HCl缓冲液。
耐热冻干保护剂A的制备方法,包括如下步骤:
(1)以pH7.2、20mmol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂,配制含有140g/L蔗糖和12g/L明胶、2g/L普鲁兰糖的溶液,在110℃条件下进行高压蒸气灭菌20min;
(2)以pH7.2、20mmol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂,配制含有20g/L还原型谷胱甘肽、20g/L磷酸氢二钾、10g/L磷酸二氢钾、20g/LBSA和20g/L甲硫氨酸的溶液,采用0.22μm的滤膜除菌;
(3)将步骤(1)和(2)所得溶液按照体积比为1:1混合,得到耐热冻干保护剂A。
2.耐热冻干保护剂B
耐热冻干保护剂B含有下述成分:蔗糖85g/L、普鲁兰糖5g/L、明胶8g/L、还原型谷胱甘肽15g/L、磷酸氢二钾15g/L、磷酸二氢钾5g/L、BSA 20g/L、甲硫氨酸15g/L,溶剂为生理盐水。制备方法参照耐热冻干保护剂A。
3.耐热冻干保护剂C
耐热冻干保护剂C含有下述成分:蔗糖100g/L、普鲁兰糖10g/L、明胶10g/L、还原型谷胱甘肽20g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾10g/L、BSA 30g/L、甲硫氨酸20g/L,溶剂为pH7.5、20mmol/L Tris-HCl缓冲液。制备方法参照耐热冻干保护剂A。
实施例3
为更好的设定冻干曲线,将耐热冻干保护剂B(实施例2制备)分别与生理盐水和鸭肝炎病毒液(实施例1制备)按照体积比1:1混合,测定塌陷温度、共晶点和共溶点。
表1 耐热冻干保护剂B的塌陷温度、共晶点和共溶点
编号 | 组成 | 共晶点 | 共熔点 | 塌陷温度 |
(℃) | (℃) | (℃) | ||
1 | 耐热冻干保护剂B和生理盐水 | -23.8 | -24.6 | -35 |
2 | 耐热冻干保护剂B和鸭肝炎病毒液 | -24 | -24.8 | -34 |
从表1可以看出,耐热冻干保护剂B的塌陷温度为-34~-35℃;共晶点温度为-23.8~-24℃;共熔点温度为-24.6~-24.8℃,参照此条件设定最佳冻干工艺。
实施例4鸭病毒性肝炎活疫苗的制备
分别用耐热冻干保护剂A、B和C制备鸭病毒性肝炎活疫苗。
鸭病毒性肝炎活疫苗A的制备:取耐热冻干保护剂A与鸭肝炎病毒液(实施例1制备)按照体积比为1:1混合,分装至7ml西林瓶中,2ml/瓶,用丁基胶塞半加塞后,置入冻干机箱体内进行冷冻干燥。具体方法如下:在常压、4℃条件下预冷30min,以0.37℃/min的速度将温度降至-40℃,然后在-40℃条件下维持2.5h使疫苗冻实;抽真空至500mTorr,再以0.03℃/min的速度将温度逐步升直至-20℃,在-20℃条件下维持2小时;再以0.5℃/min的速度升温至22℃,在22℃条件下维持6h,加塞出箱,冻干全程为25h。
鸭病毒性肝炎活疫苗B的制备:取耐热冻干保护剂B与鸭肝炎病毒液(实施例1制备)按照体积比为1:1体积混合、分装至7ml西林瓶中,2ml/瓶,用丁基三叉塞半加塞后,置入冻干机箱体内进行冷冻干燥。具体方法如下:在常压、3℃条件下预冷30min,以0.4℃/min的速度将温度降至-42℃,在-42℃条件下维持3.5h使疫苗冻实,抽真空至400mTorr后,再以0.04℃/min的速度将温度逐步升直至-20℃,在-20℃条件下维持2.5h;再以0.45℃/min的速度升温至20℃,在20℃维持5h加塞出箱,冻干全程为24h。
鸭病毒性肝炎活疫苗C的制备:取耐热保护剂C与鸭肝炎病毒液(实施例1制备)按照体积比为1:1混合,分装至7ml西林瓶中,2ml/瓶,用丁基胶塞半加塞后,置入冻干机箱体内进行冷冻干燥。具体方法如下:在常压、4℃预冷30min,以0.37℃/min的速度将温度降至-40℃,在-40℃条件下维持4.5h使疫苗冻实;抽真空至500mTorr后,再以0.03℃/min的速度将温度逐步升直至-20℃,在-20℃条件下维持2小时;再以0.5℃/min的速度升温至22℃,在22℃维持6h,加塞出箱,冻干全程为27h。
上述鸭病毒性肝炎活疫苗免疫鸭只的方法如下:用灭菌生理盐水将鸭病毒性肝炎活疫苗复溶,每瓶稀释到12.5ml,免疫剂量为滴鼻或点眼0.025ml/只,该剂量也称为常规免疫剂量。
若进行安全性试验,可以用10倍常规免疫剂量免疫,滴鼻、点眼或肌肉注射。
实施例5对照耐热保护剂及对照鸭病毒性肝炎活疫苗
对照耐热保护剂(公开于CN103007289B),按照质量百分含量含有下述成分:明胶5%、D-山梨醇8%、尿素3%、油酸钠0.5%、维生素C3%、谷氨酸单钠2%、磷酸氢二钾2%、磷酸二氢钾0.52%、灭菌双蒸水补足至100%。制备方法如下:(1)将明胶、D-山梨醇溶于灭菌双蒸水中,控制温度为108~121℃高压灭菌15~30min;(2)将尿素、油酸钠、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶于灭菌双蒸水中,用0.22μm的滤膜除菌,然后其与步骤(1)中制备的溶液混合,配制成耐热保护剂。
对照鸭病毒性肝炎活疫苗:取对照耐热保护剂与鸭肝炎病毒液(实施例1制备)按照体积比为1:1混合,分装至7ml西林瓶中,2ml/瓶,用丁基胶塞半加塞后,冻干机箱体内。在3h缓慢降至-45℃,维持6h;抽真空至10-4pa后,在7h内升温至-20℃,之后以2℃/h的速度升温至20℃,维持6h加塞出箱,冻干全程为42h。
实施例6鸭病毒性肝炎活疫苗的检测
测定实施例4、5中各鸭病毒性肝炎活疫苗的物理性状、剩余水分,在37℃条件下储存0d、10d、30d对活疫苗病毒含量的影响,在2~8℃条件下储存不同时间对活疫苗病毒含量的影响。
冻干制品的物理性状、剩余水分测定按照现行《中华人民共和国兽药典》附录的方法和标准进行。具体结果见表2。从表2可以看出,均符合《中华人民共和国兽药典》附录的规定,且鸭病毒性肝炎活疫苗A、B和C含水量低于对照鸭病毒性肝炎活疫苗。
表2 为鸭病毒性肝炎活疫苗的物理性状、剩余水分测定结果
组别 | 物理性状 | 剩余水分(﹤4%,n=4) | 真空度 |
鸭病毒性肝炎活疫苗A | 疏松海绵状 | 1.66±0.08 | 符合规定 |
鸭病毒性肝炎活疫苗B | 疏松海绵状 | 1.71±0.02 | 符合规定 |
鸭病毒性肝炎活疫苗C | 疏松海绵状 | 1.56±0.06 | 符合规定 |
对照鸭病毒性肝炎活疫苗 | 疏松海绵状 | 1.92±0.2 | 符合规定 |
鸭病毒性肝炎活疫苗冻干制品病毒含量检测方法:用1mL灭菌生理盐水将疫苗复溶后,再用生理盐水作10倍比稀释,取10-5~10-7三个稀释度,分别于尿囊腔接种9~10日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.1ml,置37℃继续孵育120h,弃去24h内死亡的鸡胚,计算ELD50,病毒含量应≥105.5ELD50/0.1ml。
表3 为鸭病毒性肝炎活疫苗于37℃保存不同时间后病毒含量的测定结果
表3中:湿毒是指鸭肝炎病毒液的毒价。冻干损失是指湿毒和冻干后0d疫苗病毒含量的差值。耐热损失是指疫苗冻干0d后与37℃保存后疫苗病毒含量的差值。
从表3可以看出,鸭病毒性肝炎活疫苗A、B和C在冻干过程中病毒含量损失很小,均在100.12ELD50/0.1ml以下;在37℃条件下储存10d后,病毒含量损失均<100.5ELD50/0.1ml;在37℃条件下储存30d后,病毒含量损失均<100.7ELD50/0.1ml。鸭病毒性肝炎活疫苗A、B和C在冻干过程中的病毒含量损失显著低于对照鸭病毒性肝炎活疫苗。因此本发明冻干保护剂不仅较好的解决鸭病毒性肝炎在冻干过程中不耐受同时还解决长途运输中所缺少的冷链问题,而且冻干时间较短,成本较低。
表4 为鸭病毒性肝炎活疫苗于2~8℃保存不同时间后的病毒含量测定结果
从表4可以看出,鸭病毒性肝炎活疫苗A、B和C在2~8℃保存不同时间后,病毒含量损失为100.13~100.5ELD50/0.1ml,显著低于对照鸭病毒性肝炎活疫苗。
另外,申请人还采用了名称为一种耐热保护剂及其应用的发明专利(CN103041399A)中的保护剂来制备鸭病毒性肝炎活疫苗,发现在冻干及高温储存时并不能保护抗原活性,原因在于CN 103041399A中保护剂只适用于病毒溶液并不适用于悬浊液状态的鸭病毒性肝炎活疫苗抗原。
在冻干及高温储存过程中,本发明耐热冻干保护剂对鸭肝炎性病毒为3型、2型或新型抗原的保护效果与鸭肝炎性病毒为1型相似。
实施例7耐热冻干保护剂的安全性动物试验
用生理盐水将鸭病毒性肝炎活疫苗A复溶成溶液,每羽份按照10倍常规免疫剂量进行免疫,考察耐热冻干保护剂的安全性。
耐热冻干保护剂的安全性动物试验:试验共分为3组(表7),分别是肌肉注射、滴鼻/点眼10倍剂量鸭病毒性肝炎活疫苗A,以及空白对照组(不免疫)。试验选取2日龄的雏鸭,每组20只。
表7 为耐热冻干保护剂的安全性动物试验分组(雏鸭日龄:2日龄)
组别 | 鸭只数量(只) | 免疫途径 | 免疫剂量 | 免疫体积 |
1 | 20 | 滴鼻/点眼 | 10× | 0.025ml |
2 | 20 | 肌肉注射 | 10× | 0.025ml |
3 | 20 | 空白对照 | / | 0 |
耐热冻干保护剂的安全性动物试验方法和研究的指标:
(1)临床观察:在接种后的24h内,每隔2h观察一次鸭只有无不良反应;48h~72h,每隔8h观察一次鸭只有无不良反应;接种后3~14d内,每24h观察有无不正常反应。如有非特异性死亡,免疫组与对照组均应不超过1只。
(2)剖检观察:在接种后14d时,将所有鸭用颈脱位法处死,并进行剖检,检查鸭的所有异常情况,特别注意鼻腔组织、气管组织、肝脏、肌肉注射部位病变以及鸭肝炎特征性病变。
(3)对生产性能的影响:对免疫组、对照组在接种前、接种后10d对鸭进行称重。
结果:采用鸭病毒性肝炎活疫苗A免疫雏鸭后,鸭群精神状况、采食、饮水、生长发育情况均正常,均未发现鸭肝炎和其他不良反应。从表8中可以得到:大剂量(10倍推荐免疫剂量)分两种免疫途径注射免疫后鸭只无死亡;对照组与免疫组相比,鸭只增重的差异不显著(p>0.05)。因此本发明耐热冻干保护剂对动物具有安全性。
表8 为耐热冻干保护剂的安全性动物试验结果
注:表8中“a”表示差异不显著。
Claims (8)
1.用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂,由下述成分组成:蔗糖70~100g/L、普鲁兰糖1~10g/L、明胶6~10g/L、还原型谷胱甘肽10~20g/L、磷酸氢二钾10~20g/L、磷酸二氢钾5~10g/L、牛血清白蛋白10~30g/L、甲硫氨酸10~20g/L和溶剂。
2.根据权利要求1所述用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂,其特征在于所述耐热冻干保护剂的溶剂为无菌的生理盐水、注射用水、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Hank’s液。
3.权利要求1-2之一所述耐热冻干保护剂的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将含有蔗糖、明胶和普鲁兰糖的溶液,采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌;
(2)将含有还原型谷胱甘肽、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白和甲硫氨酸的溶液,采用过滤法进行除菌;
(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合,得到所述耐热冻干保护剂。
4.权利要求1-2之一所述耐热冻干保护剂在制备鸭病毒性肝炎活疫苗方面的应用。
5.采用权利要求1-2之一所述耐热冻干保护剂制备的鸭病毒性肝炎活疫苗。
6.权利要求5所述鸭病毒性肝炎活疫苗的制备方法,其特征包括如下步骤:将耐热冻干保护剂和鸭肝炎病毒液按照体积比为0.5~1.5:1混合,冷冻干燥后得到所述鸭病毒性肝炎活疫苗。
7.根据权利要求6所述鸭病毒性肝炎活疫苗的制备方法,其特征在于所述冷冻干燥方法如下:将耐热冻干保护剂和鸭肝炎病毒液的混合物放入真空干燥机内,在常压、0~6℃条件下预冷20~40min,然后按照0.2~0.5℃/min的速度降温至-38~-42℃并维持2~5h,抽真空至300~500mTorr,然后以0.02-0.04℃/min的速度升温至-18~-22℃并维持1.5~3h,再以0.4~0.6℃/min的速度升温至20~24℃并维持5~7h。
8.根据权利要求6-7之一所述鸭病毒性肝炎活疫苗的制备方法,其特征在于鸭肝炎病毒为1型、2型、3型或新型。
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