KR20100109556A

KR20100109556A - 말라리아 백신

Info

Publication number: KR20100109556A
Application number: KR1020107016404A
Authority: KR
Inventors: 도미니크 잉그리드 레모이네; 플로렌스 에밀리 쟌느 프랑소와즈 워터스
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2010-10-08
Also published as: CL2008003808A1; IL206308A0; UY31569A1; MX2010006984A; MA32030B1; CO6300963A2; AR071741A1; BRPI0822098A2; WO2009080715A2; TW200940086A; CN102026657A; CA2708716A1; US20100272745A1; AU2008339980A1; ZA201004304B; DOP2010000189A; AP2010005296A0; CR11577A; WO2009080715A3; JP2011507816A

Abstract

본 발명은 하기를 포함하는 말라리아 백신용 성분에 관한 것이다: a) 면역원성 입자 RTS,S 및/또는 b) 1개 이상의 삼일열원충(P. vivax) 균주의 CS 단백질에서 유래된 면역원성 입자 및 B형 간염균(Hepatitis B)으로부터의 S 항원 및 임의로 비융합된 S 항원, 또는 c) RTS, CSV-S 및 임의로 비융합된 S 항원을 포함하는 면역원성 입자 및 d) 1개 이상의 티올 작용기를 지닌 안정화제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 안정화제. 또한 본 발명은 상기 성분의 제조 방법, 이의 의약으로서의 용도(특히 말라리아 감염의 예방에서), 상기 성분을 포함하는 조성물/백신 및 백신의 용도(특히 치료적 용도)를 개시한다.

Description

말라리아 백신{VACCINES FOR MALARIA}

본 발명은 말라리아의 치료를 위한 안정화된 리포단백질 입자, 이 입자의 제조 방법, 이 입자의 의약(medicine), 특히 말라리아 감염의 예방 의약으로의 용도, 상기 입자를 포함하는 조성물/백신 및 백신의 용도, 특히 치료적 용도에 관한 것이다.

말라리아는 전세계의 주요한 건강 문제 중 하나로, 이 질병으로 매년 2 내지 4백만 명 이상의 사람들이 사망하고 있다. 이 질병의 가장 만연한 형태 중의 하나는 원생생물 기생충 삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발되는데, 상기 삼일열원충은 열대 및 아열대 지역에서 발견된다. 흥미롭게도, 이 기생충은 섭씨 15도 정도의 낮은 온도에서 이의 모기 주기(mosquito cycle)를 완성할 수 있는데, 모기는 온화한 기후에서 이 질병을 퍼트린다.

이 질병의 가장 급성 형태 중 하나는 원생생물 기생충인 열대열원충(Plasmodium falciparum)에 의해 유발되며 상기 기생충은 말라리아로 인한 대부분의 사망에 관여한다.

플라스모디움(Plasmodium)의 생활 주기(life cycle)는 복잡하며, 이의 완성을 위해 2가지 숙주, 인간과 모기를 필요로 한다. 인간에 대한 감염은 감염된 모기의 타액내 종충(sporozoites)의 도입으로 개시된다. 이 종충은 간으로 이동하고 간세포를 감염시키는데, 여기서 이들은, 적혈구외 세포내 단계(exoerythrocytic intracellular stage)를 통해, 낭충(merozoite) 단계로 분화되며, 이 낭충 단계에서 적혈구 세포(RBC)를 감염시켜 무성생식 혈액 단계에서 주기적 복제를 개시한다. RBC내 수많은 종충이 유성생식 단계 생식모세포(gametocytes)로 분화됨으로써 상기 주기가 완성되는데, 상기 생식모세포는 모기에 의해 섭취되며, 이들 생식모세포는 중장(midgut)내에서 일련의 단계를 거쳐 침샘으로 이동하는 종충을 생산하게 된다.

삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발되는 질병이 거의 치명적이지 않다는 사실로 인해, 말라리아를 예방 및 치료하려는 노력은 열대열원충(P. falciparum)에 의해 유발된 더욱더 치명적인 형태의 질병에 집중되어 왔다.

삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발된 질병이 일반적으로 환자의 사망을 초래하지는 아니할지라도, 증가 일로에 있는 것으로 생각되는, 환자의 규모, 환자의 삶의 질에 대한 심각한 손상, 빈혈과 사망을 초래하는 질병의 심각한 발병률에 대한 보고의 증가, 및 경제적 손실로 인해, 이 질병에 대한 효과적인 백신접종(vaccination)이 여전히 요구되고 있다. 게다가, 이 질병의 두 가지 원인에 대한 예방을 제공할 수 있는 단일 백신이 유익할 것이다.

삼일열원충(P. vivax)의 특징은 일부 종들이 말초 순환내로 출현하여 임상 증상을 나타내기 전에 간(liver) 내에서 잠복기를 유지함으로써 지연된 감염을 유발할 수 있다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 감염 지역을 통과하여 여행할 때, 개체들은 감염될 수 있으나 수개월 동안 증상을 나타내지 아니할 수 있다. 이것은 질병의 전파를 초래할 수 있는 잠재력을 지니며, 이러한 이유로 감염 지역을 여행한 사람들은 상기 감염 지역을 여행한 후, 규정된 기간 동안 수혈용 혈액을 제공하는 것이 허용되지 않는다.

삼일열원충(P. vivax) 말라리아 감염은 이 기생충이 전-적혈구성(pre-erthrocytic) 무성생식(shizogony)을 겪는 동안 간 내부에서 잠복 상태로 유지된다. 간을 벗어나기 전에, 상기 단계에서 이 기생충이 조절되는 경우, 환자에서 질병의 임상 증상은 관찰되지 아니한다.

플라스모디움의 종충 단계는 말라리아 백신의 잠재적 표적으로서 확인되었다. 불활성화된(방사선 조사된) 종충을 이용한 백신접종은 실험 인간 말라리아에 대한 예방을 유도하는 것으로 드러났다(Am. J. Trop. Med. Hyg 24: 297-402, 1975). 그러나, 방사선 조사된 종충을 이용하는, 이러한 방법에 기초하여 대중을 위한 말라리아 백신을 제조하는 것은 실제적으로 또한 논리적으로 불가능하다.

종충의 주요 표면 단백질은 포자소체(circumsporozoite) 단백질(CS 단백질)로 알려져 있다. 상기 단백질은 모기에 의한 초기 접종 부위로부터 순환으로 종충의 통과가 진행되는 동안 종충의 운동성 및 침입(invasion)에 관여하는 것으로 생각되며, 여기서 상기 종충은 간으로 이동한다.

플라스모디아(Plasmodia)종의 CS 단백질은 비-반복성 아미노(N-말단) 및 카르복시(C-말단) 단편이 플랭킹(flanking)되어 있는 중심부(central) 반복 도메인(반복부 영역)에 의해 특징지어진다. 삼일열원충(P. vivax)의 중심부 도메인은 일반적으로 9개의 탠덤(tandem) 아미노산의, 반복 단위의 수개의 블록으로 이루어져 있다.

특정 아시아 균주에서, 중심부 반복 영역 다음에, 대략 12개 아미노산의 추가 서열이 존재한다(서열번호 11 참조). 상기 추가 서열의 기능은 알려져 있지 않다. 그러나, 일부에 의해, 비록 조사가 이루어진 것은 아니지만, 상기 아미노산이 질병의 임상적 증상의 지연된 발병과 연관되어 있을 것으로 가정되고 있다. N-말단은 영역 I로 공지된 5개 아미노산의 서열에 의해 특징화되는 것으로 생각되고 있다(서열번호 1 참조). 또한 C-말단은 영역 II로 공지된 12개 아미노산의 서열을 포함함으로써 특징화되는 것으로 생각되고 있다. C-말단은 세포-부착 모티프를 함유하는데, 이 모티프는 모든 말라리아 CS 단백질중에서 고도로 보존되어 있다(서열번호 2 참조).

몇몇 그룹은 포자소체 단백질에 기초한 소단위체 백신을 제안하였다. 이러한 백신들 중 중심부 반복 영역에 전적으로 기초한 2개의 백신을 1980년대 초기에 임상 실험하였다; 한가지는 합성 펩티드였고, 다른 한가지는 재조합 단백질이었다(Ballou et al Lancet: June 6 (1987) page 1277 onwards and Herrington et al Nature 328:257 (1987)). 이러한 백신에 항-종충 반응을 성공적으로 자극시켰다. 그럼에도 불구하고, 반응의 규모는 실망스러웠는데, 일부 백신은 전혀 반응을 나타내지 아니하였다. 더욱이, 후속 주입후 항체 수준의 "부스팅(boosting)" 부재 및 시험관내 림프구 증식 검정 결과는 이러한 자원자 대부분의 T-세포가 면역-우성 반복부(immuno-dominant repeat)를 인지하지 않았음을 제시하였다. 더욱이, 상기 두 백신의 효력은 기생충혈증(parasitemia)을 발달시키는데 실패한 오직 단 한명의 백신접종된 지원자에서 미미하였다. 이 백신은 더 이상 추구되지 않았다.

WO 93/10152호 및 WO 98/05355호는 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 백신에 대해 기재하고 있으며 상기 특허공개공보에 기재된 접근법을 이용한 열대열원충(P. falciparum)에 대한 예방접종에서 일부 진척이 있는 것으로 보인다(문헌[Heppner et al. 2005, Vaccine 23, 2243-50]도 참조하라).

현재까지 의료업계에서 가장 진보한 말라리아 백신은 RTS,S로 지칭되는 리포단백질 입자(바이러스 유사 입자로도 알려짐)에 기초한다. 이 입자는 B형 간염균(Hepatitis B)으로부터의 S 항원 N-말단까지 선형 링커를 통해 프레임내에 융합된, 열대열원충(P. falciparum)(균주 NF54/3D7)의 CS 단백질의 아미노산 207-395에 실질적으로 상응하는, 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질의 부분을 포함한다. 상기 링커는 S-항원으로부터의 preS2 부분을 포함할 수 있다. 하기 추가 상세한 설명의 논의를 참조하라.

열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질은 보존된 중심부 반복 영역을 지닌다. 대조적으로, 적어도 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질의 2가지 형태(VK210 또는 타입 I 및 VK247 또는 타입 II로 지정됨)가 공지되어 있다. 이것은, 타입 I의 중심 반복 영역으로 유도되는 항체가 반드시 타입 II의 상응하는 영역의 에피토프를 인지하는 것은 아니며 반대의 경우도 그러하기 때문에, 특이적인 CS 단백질 유형에 관계없이 삼일열원충(P. vivax)에 대한 일반적인 보호를 제공하는, 면역원성(immogenicity)과 같은 모든 요망되는 특성을 지닌 CS 단백질의 작제물을 식별하는 것을 더 어렵게 만든다.

본 발명자가 인식하는 한, RTS,S에 상응하는 입자는 삼일열원충(P. vivax)의 단일 균주에 기초하도록 제안되지 않았다.

하이브리드(hybrid) 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질은 WO 2006/088597호에 기재되어 있다.

WO 2006/088597호의 하이브리드 단백질 및 B형 간염균에서 유래된 S항원을 포함하는 융합 단백질(본원에서 CSV-S로 지칭됨) 및 동일한 것을 포함하는 리포단백질 입자가 PCT/EP2007/057301에 기재되어 있다.

CSV-S, RTS 및 임의로 S 유닛을 포함하는 리포단백질 입자가 PCT/EP2007/057296에 기재되어 있다.

요즘에는, RTS,S 말라리아 백신이 동결건조된 항원으로서 제공되고, 이 항원은 운반되기 직전에 애쥬번트와 함께 재구성된다. 이는 상기 항원은 상당한 기간동안 저장되는 경우, 특히 애쥬번트의 존재하에서 저장되는 경우, 불안정하기 때문이다. 불안정성은 응집 및/또는 분해 그 자체로서 나타난다.

2018/2019년에 83백만 용량의 말라리아 백신이 필요할 것이라는 추정이 존재한다. 현재 냉동-건조(동결 건조) 과정은 약 40시간이 소요된다. 따라서, 현재 과정이 추가적 수요를 충족할 수 있을 가능성이 없다. 상기 사이클을 약 28시간 아래로 감소시킬 가능성이 있을 수 있으나, 여전히 그 수요를 충족시키는 것은 불가능하다. 더욱이 추가적으로 사이클 시간을 감소시키는 것은 불만족스러운 생산물을 야기하는 것으로 보인다.

말라리아 백신은 주로 낙후한 인프라-구조 및 설비시설을 가진 나라 내에서 운송되므로, 제공되는 백신의 형태는, 특히 액체 제형이 제공된다면, 투여시까지 안정한 것이 참으로 중요하다.

본 발명자에 의해 생성된 초기 데이타는 인산염 완충 식염수에서 제조되었고, 추가 부형제 없이, pH 6.1에서 잔여량의 폴리소르베이트(polysorbate) 80(0.0062% w/w)를 함유하는 RTS,S 정제 벌크가 가속화된 안정성 시험 후에, 즉, 37℃에서 7일 동안 저장 후에 상당한 분해 및 산화적 응집을 나타내었음을 제시하였다. 약간의 응집 및 분해가 4℃에서 2달 동안 저장한 후 관찰되었다.

하기 옵션을 조사하였다:

● 6.1에서 7.4까지 증가된 pH는 S 항원 분해를 감소시키지만, CS 단백질 분해는 증가시키는 것으로 보였다.

● 폴리소르베이트 80( Tween 80으로도 지칭됨) 농도의 0.05, 0.5 및 1.0%까지의 증가는 응집 및 분해 둘 모두를 증가시키는 것으로 보였고, 일반적으로 Tween 80은 항원의 응집을 감소시키기 때문에 이 사실은 놀랍다(본 발명자들은 이러한 효과가 단백질/항원에서 티올기의 산화를 촉매할 수 있는 상기 Tween 내의 잔여 퍼옥사이드의 존재에 기인하는 것으로 가정하였다 - 본 발명에 따른 환원제의 이용은 이 효과를 방해하는 것으로 보인다); 및

● 수크로오스(6.2% w/w)의 첨가는 응집 또는 분해에 영향을 미치지 않았다.

상기 응집 과정은 다수의 단계로 일어나고, 이 단계들 중 한 단계가 성공적으로 방해될 수 있다면, 상기 응집 및/또는 분해가 방해될 수 있다고 가정되었다(참조: "Minimizing protein inactivation" by D.B. Volkin & A.M. Klibanov in "Protein function: a practical approach", edited by T.E.Creighton - IRL Press at Oxford University Press)

제 1 단계는 천연 단백질의 언폴딩으로, 그에 따라 상기 천연 단백질의 더 많은 소수성 영역이 노출된다. 소수성 영역의 노출로 몇가지 단백질이 함께 그룹화된다. 최종 단계는 이황화 결합의 형성에 의한 상기 단백질의 비가역 변성이다.

또한, 상기 항원을 가용성으로 만들기 위해 첨가된, 폴리소르베이트 80이 응집 및/또는 분해를 촉매하는 잔여 퍼옥사이드를 포함할 수도 있다.

본 발명자들은 다수의 안정화제/방법, 예컨대 당, 폴리알코올, 공-용매(co-solvents), 폴리머, 이온, pH, 완충용액, 항산화제, 킬레이트 시약 및 계면활성제를 시도하였고, 이것은 원하는 효과를 제공하지 않았다. 예컨대, 아스코르브산의 첨가는 상당한 응집체를 생산하였다. EDTA 단독 또는 항산화제의 존재하에서의 이용은 응집을 방해하지 않았다. 더욱이, 아황산염의 첨가는 요구된 안정화를 제공하지 않았다. 몇 가지 일반적인 안정화제는 최종 말라리아 제형에서 사용된 애쥬번트 제형과 호환되지 않았다. 본 발명자들은 현재 플라스모디움 CS 단백질(falciparum 및/또는 vivax)의 리포단백질 입자가 특정 안정화제, 예컨대, 적어도 1개 이상의 티올(-SH)기를 포함하는 환원제, 예컨대, 티오황산염, N-아세틸 시스테인, 모노티오글리세롤, 시스테인, 환원된 글루타치온 및 소듐 티오글리콜레이트 또는 이들의 혼합, 특히 N-아세틸 시스테인, 모노티오글리세롤, 시스테인, 소듐 티오글리콜레이트 및 이의 혼합, 특히 모노티오글리세롤, 시스테인, 및 이의 혼합을 이용하여 저장을 위해 안정화될 수 있다고 믿고 있다.

대안적으로 또는 1개 이상의 티올(-SH)기를 포함하는 이러한 환원제와 조합하여, 본 발명에서 사용된 리포단백질 입자는 이 입자가 저장된 용기로부터 산소를 제거함으로서 안정화될 수 있거나, 추가적으로 안정화될 수 있고/있거나, 빛으로부터 상기 제형을 보호하는 것은 항원을 보호/추가적으로 보호할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 말라리아 백신의 성분을 제공한다:

a) 면역원성 입자 RTS,S 및/또는

b) 1개 이상의 삼일열원충(P. vivax) 균주의 CS 단백질에서 유래된 면역원성 입자 및 B형 감염균으로부터의 S 항원 및 임의로 비융합된 S 항원 및/또는

c) RTS, CSV-S 및 임의로 비융합된 S 항원을 포함하는 면역원성 입자 및

d) 1개 이상의 티올 작용기를 지닌 환원제, 예컨대 위에서 나열한 것과 같은, 예컨대, 모노티오글리세롤, 시스테인, N-아세틸 시스테인 또는 이들의 혼합물을 포함하는(또는 이들로 이루어진 군에서 선택된) 안정화제.

제 1 양태에서, 본 발명은 a), b), c) 및 임의로 상기 d)를 포함하는 말라리아 백신을 위한 성분을 제공하고, 예컨대, 용기로부터 산소를 제거하고/제거하거나 예를들어 갈색 유리 용기를 이용함으로써 빛으로부터 제형을 보호하는, 보호 조치가 상기 성분의 제조에 이용된다.

유리하게도, 플라스모디움으로부터의 CS 단백질 및 간염으로부터의 S 항원을 포함하는 리포단백질 입자 항원은 모노티오글리세롤, 시스테인 또는 이들의 혼합을 이용하고/하거나 보호 조치, 예컨대 바이알(vial)로부터 산소를 제거하고/제거하거나, 예를들어, 갈색 유리 용기를 이용함으로서 빛으로부터 제형을 보호하여 적당하게 안정화될 수 있다.

서열 목록

SEQ. ID. No. 1 삼일열원충(P. vivax)의 N-말단 내 영역 Ⅰ

SEQ. ID. No. 2 삼일열원충(P. vivax)의 C-말단내 영역Ⅱ의 고도로 보존된 부분

SEQ. ID. No. 3-9 삼일열원충(P. vivax)의 유형Ⅰ CS 단백질의 가변 반복 단위

SEQ. ID. No. 10 삼일열원충(P. vivax)의 유형Ⅱ CS 단백질로부터의 주(major) 반복 단위

SEQ. ID. No. 11 삼일열원충(P. vivax)의 아시아 균주에서 발견된 추가적 아미노산

SEQ. ID. No. 12 삼일열원충(P. vivax)의 하이브리드 단백질 CSV의 뉴클레오티드 서열

(대장균(E. Coli)에서 발현되도록 최적화됨)

SEQ. ID. No. 13 삼일열원충(P. vivax)의 하이브리드 단백질 CSV의 아미노산 서열

SEQ. ID. No. 14 삼일열원충(P. vivax)의 유형Ⅱ CS 단백질로부터의 부(minor) 반복 단위

SEQ. ID. No. 15 삼일열원충(P. vivax)의 하이브리드 단백질 CSV에 대한 뉴클레오티드 서열

(효모(yeast)에서 발현되도록 최적화됨)

SEQ. ID. No. 16 하이브리드 융합 단백질 CSV-S에 대한 뉴클레오티드 서열

SEQ. ID. No. 17 하이브리드 융합 단백질 CSV-S에 대한 아미노산 서열

SEQ. ID. No. 18 RTS 발현 카세트에 대한 뉴클레오티드 서열

SEQ. ID. No. 19 SEQ ID No. 18로부터 예상된 RTS 융합 단백질

SEQ ID. Nos. 20 내지 25 CpG 함유 올리고뉴클레오티드의 예시

도면

도 1 pRIT15546 효모 에피솜(episomal) 벡터에 대한 플라스미드 맵

도 2 B형 간염균으로부터의 S 항원에 원하는 항원을 "융합"시키는데 이용 된, GSK사에 의해 제조된 pGFl-S2 플라스미드의 플라스미드 맵. SmaI 부위 사이의 이종기원 DNA 서열 클로닝(12bp SmaI DNA 단편의 절단후)은 S 유전자와 인-프레임 융합을 발생시킨다.

도 3 pRIT15582의 플라스미드 맵

XhoⅠ으로의 절단은 효모 염색체내로의 삽입에 이용된, CSV-S 발현 카세트를 비롯한 LEU2 선별 마커를 지니는 8.5 kb 선형 DNA 단편을 유리시킨다.

도 4 CSV-S 카세트를 통합시키는데 사용된 선형 XhoⅠ 단편의 제한효소 맵

도 5 균주 Y1835에서 생산된 CSV-S,S 혼합 입자의 전자현미경 사진

CSV-S,S 입자는 가용성 세포 추출물로부터 정제되었고(RTS,S 정제 공정에 기초함), 전자현미경 분석에 제출되었다. 입자는 인텅스텐산(phosphotungstic acid)으로 음성 염색된 후 가시화되었다. 크기는 1OOnm에 상당한다.

도 6 +/-AOT; 37℃에서 7일 동안 저장 후 SDS-PAGE 분석을 보여준다 - 비- 환원성 조건 하(좌) 및 환원성 조건하(우), ASO1과 혼합 전(위) 또는 혼합 후 25℃에서 24시간 경과 후(아래) Novex 겔. 여기서:

도 7 37℃에서 14일 동안 저장 후 SDS-PAGE 분석을 보여준다 - 비-환원성 조건 하(좌) 및 환원성 조건하(우), ASO1과 혼합 전 또는 혼합 후 25℃에서 24시간 경과 후 Novex 겔.

도 8 37℃에서 5주 동안 저장 후 SDS-PAGE 분석을 보여준다 - 환원성 조건 하(좌) 및 비-환원성 조건하(우), ASO1과 혼합 전 또는 혼합 후 25℃에서 24시간 경과 후 Novex 겔.

도 7 및 8의 경우:

도 9 혼합된 ELISA αCSP-α-S에 의한 모노티오글리세롤을 포함하거나 불포함하는 액체 제형 중의 RTS,S 항원성을 도시한다.

도 10 항-CS 혈청테스트 결과를 도시한다.

도 11 항-HBS 혈청테스트 결과를 도시한다.

도 12 CS 특이적 CD4 T 세포 반응을 도시한다.

도 13 HBs 특이적 CD4 T 세포 반응을 도시한다.

도 14 CS 특이적 CD8 T 세포 반응을 도시한다.

도 15 HBs 특이적 CD8 T 세포 반응을 도시한다.

N-아세틸 시스테인, 모노티오글리세롤, 시스테인, 환원된 글루타치온 및 소듐 티오글리콜레이트 또는 이들의 혼합을 이용하는 본 발명의 양태는 이 구체예가 황산나트륨(이의 사용을 피하는 것이 바람직할 것임)에 대안적인 실용적인 제조를 제공한다는 점에서 추가적 이점을 갖는다

이론에 구속되는 것을 원하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 안정화제/환원제 내의 티올 작용기가 항원 내의 티올 작용기에 결합함으로서 그 부위를 블로킹하고 상기 부위와 서로 다른 항원 분자상의 티올 작용기의 결합/상호작용을 방해한다고 가정한다. 더욱이, 안정화제/환원제가 비교적 작기때문에, 또한 에피토프 및 특히 항원 내 에피토프 배좌(conformation)가 파괴되지 않고 따라서 항원의 면역원성이 유지되고 응집이 방지된다고 생각된다.

대안적으로 또는 추가하여 tween내 퍼옥사이드가 켄칭된다(quenched).

본 발명의 제 1 양태에서, 안정화제는 모노티오글리세롤이다.

본 발명의 제 1 양태에서, 안정화제는 시스테인이다.

본 발명의 제 1 양태에서, 안정화제는 N-아세틸 시스테인이다.

안정화제는, 예를들어, 0.01 내지 10% w/v, 예컨대 1 내지 5%, 2 내지 6%, 4 내지 7%, 3 내지 8%, 예컨대 0.01 내지 1%, 0.2 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.5%, 0.3 내지 0.8%, 0.6 내지 0.9%, 예컨대 실질적으로 0.2, 0.4, 0.5 및 0.8 %, 또는 예컨대 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.02%, 0.01 내지 0.05%, 0.01 내지 0.08%, 0.02 내지 0.05%, 0.02 내지 0.08% 또는 0.05 내지 0.08% w/v 범위의 양으로 사용될 수 있다.

대안적으로, 안정화제는 0.01 내지 10% w/w, 예컨대 1 내지 5%, 2 내지 6%, 4 내지 7%, 3 내지 8%, 예컨대 0.01 내지 1%, 0.2 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.5%, 0.3 내지 0.8%, 0.6 내지 0.9%, 예컨대 실질적으로 0.2, 0.4, 0.5 및 0.8 %, 또는 예컨대 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.02%, 0.01 내지 0.05%, 0.01 내지 0.08%, 0.02 내지 0.05%, 0.02 내지 0.08% 또는 0.05 내지 0.08% w/w 범위의 양으로 사용될 수 있다.

시스테인의 적합한 양은 전체 제형의 0.1 내지 1.0 중량% 범위이다. 따라서, 예컨대, 500㎕의 일 인간 용량에서, 시스테인의 양은 100μg 내지 5000μg 범위 이내, 예컨대 500μg이다.

제 1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 말라리아 백신에 대한 성분을 제공한다:

a) 면역원성 입자 RTS,S 및/또는

b) 1개 이상의 삼일열원충(P. vivax) 균주의 CS 단백질로부터 유래된 면역원성 입자 및 B형 감염균으로부터의 S 항원 및 임의로 비융합된 S 항원, 및

c) 모노티오글리세롤을 포함하는 안정화제.

본 발명의 상기 양태는 용기/바이알로부터 산소를 제거하는 것 및/또는 예컨대, 갈색 유리 용기를 이용함으로서 빛으로부터 상기 제형을 보호하는 것과 같은 보호조치를 추가적으로 이용할 수 있다.

모노티오글리세롤은 화학식 HSCH₂CH(OH)CH₂OH을 가지며, 또한 3-머캅토-l,2-프로판디올 또는 1-티오글리세롤로도 알려져 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 양은 하기의 범위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 0.01 내지 10%, 예컨대 0.01 내지 1% 또는 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.02%, 0.01 내지 0.05%, 0.01 내지 0.08%, 0.02 내지 0.05%, 0.02 내지 0.08% 또는 0.05 내지 0.08% w/v, 예컨대 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.016, 0.017, 0.018, 0.019, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 또는 0.08% w/v. 250㎕의 단일 인간 용량은, 예컨대 10 내지 2500μg, 예컨대 25 내지 250μg의 모노티오글리세롤, 예컨대 50, 125 또는 200μg의 모노티오글리세롤을 포함할 수 있다.

대안적으로, 본 발명에서 사용되기 적합한 양은 하기의 범위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 0.01 내지 10%, 예컨대 0.01 내지 1%, 0.01 내지 0.1%, 0.01 내지 0.02%, 0.01 내지 0.05%, 0.01 내지 0.08%, 0.02 내지 0.05%, 0.02 내지 0.08% 또는 0.05 내지 0.08% w/w, 예컨대, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.016, 0.017, 0.018, 0.019, 0.02, 0.025, 0.04, 0.05 또는 0.08% w/w.

유리하게도, 모노티오글리세롤이 본 발명에 따라 사용되는 경우, 애쥬번트 제형, 예컨대 수중유 에멀젼(oil in water emulsion) 또는 MPL 및/또는 QS21를 함유하는 리포좀 입자와 호환가능한 것으로 보인다.

더욱이, 모노티오글리세롤은 MPL 및 QS21의 리포좀 애쥬번트 제형에 의해 유도된 리포단백질 입자 응집을 감소시킴으로서, 제조 직후 정제된 벌크(bulk)의 제형과 유사한 액체 제형을 제공한다.

본 명세서의 본문 중의 정제된 벌크는 2 용량 이상인 벌크량 중의 정제된 항원을 지칭한다.

본 명세서의 본문 중의 최종 벌크는 1 또는 2 이상의 용량의 정제된 항원 및 부형제(예컨대 애쥬번트 성분을 제외한 인산염 완충 식염수)를 지칭한다.

애쥬번트의 부재하에서 0.01% 모노티오글리세롤과 함께 50 μg/ml로 제형화된 경우, RTS,S는 37℃에서 7일 동안 저장된 후 신선한 벌크(fresh bulk)와 동일한 프로파일을 가졌다. 또한 0.01%의 모노티오글리세롤은 빛에 의해 촉매된 응집으로부터 RTS,S를 보호하기에 충분하였다.

그럼에도 불구하고 플라스모디움 CS 단백질의 리포단백질 입자의 액체 제형, 예컨대 100μg/ml의 항원 및 예컨대, 최대 1.0% w/v, 예컨대 0.02, 0.05 또는 0.08%의 모노티오글리세롤에 대해 약 2 또는 3년의 저장 수명을 획득할 것으로 예상된다.

본 발명의 제 1 양태에서, 환원제는 디티오트레이톨(dithiotreitol)이 아니다.

백신의 액체 성분(이의 애쥬번트 성분을 포함함)은 약 4℃에서의 저장을 필요로 할 수 있다.

본 발명의 제형은 주입에 적합한 pH 및 삼투압(osmolality)을 갖는다. 적합하게, 액체 제형의 pH는 약 6.5 내지 7.2, 예컨대 약 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0 또는 7.1이다.

본 발명의 제형은, 예컨대 10 용량 이상이 함께 제공되는 경우, 보존제, 예컨대, 티오머살(thiomersal)을 추가적으로 포함할 수 있다. 그러나, 적어도 하나의 구체예에서, 본원에 기재된 제형은 티오머살을 포함하지 않는다.

연구는 예컨대 0.01 또는 0.04%의 모노티오글리세롤과 함께 저장된 50μg/ml의 RTS,S가 4℃ 또는 37℃에서 5주 후에, 비-특이적 흡착에 의한 검출가능한 항원 손실을 나타내지 않았음을 밝혀내었다.

더욱이 RTS,S 입자 크기 분포는, 가속화된 안정성 시험 후, 즉 7일 동안 37℃에서 저장한 후 약 15시간 동안 강한 빛에 노출시(본원에서 가속화된 산화 시험, AOT로 지칭됨), 변화를 보이지 않았다.

제 1 양태에서, 본 발명은 말라리아 백신의 성분으로서, 개별 액체 제형 및 이것에 추가하기에 적합한 애쥬번트로서, 임의로 각 요소의 개별 바이알을 포함하는 키트로서 제공된다. 이 구체예의 제 1 양태에서, 각각의 바이알은 시각적으로 구별되는데, 예컨대 한 개의 바이알 상의 크림프 캡(crimped cap)이 색칠되어 다른 바이알과 구별되고/되거나 바이알 하나는 갈색이고(예컨대, 항원 함유 바이알) 바이알 하나는 투명(예컨대, 애쥬번트 함유 바이알)이다.

적합한 바이알은 예컨대, 3mL 유리 바이알을 포함한다.

제 1 양태에서, 본 발명은 항원 및 안정화제(또는 본원에 기재된 바와 같은 환원제)를 포함하는 동결건조된 성분을 제공하고, 이는 그 후 액체 애쥬번트와 함께 재구성될 수 있다. 동결건조된 성분 및 액체 애쥬번트(예컨대, 수중유 또는 MPL 및 QS21의 리포좀 제형)는 키트로서 제공될 수 있다. 본 발명의 이 양태는 재구성된 후에 즉시 사용될 필요는 없으나, 적어도 24시간 동안 저장되기에 적합하다는 이점을 갖는데, 예컨대 항원의 항원성이, 혼합 후 25℃에서 저장되는 경우 적어도 24시간 동안 유지된다. 애쥬번트는 하기에서 상세히 논의되고 있다.

본 발명의 제 1 양태에서, 최종 액체 제형이 제공된다. 최종 액체 제형은 최대 10 용량, 예컨대 1 또는 2 용량을 포함하고, 애쥬번트 성분 이외의 모든 부형제를 포함하는 액체 제형을 지칭한다.

제 1 양태에서, 최종 백신의 성분은 단일 용량으로 제공된다.

본 명세서의 본문 중 백신은 인간에게 주입하기에 적합한 애쥬번트 성분을 포함하는 성분을 모두 포함하는 면역원성 제형이다.

제 1 양태에서, 성분 또는 최종 백신은 2 용량(bidose)으로 제공된다. 2 용량으로 제공되는 것은 최종 제형의 재구성 및/또는 투여시에, 필수 성분의 손실을 최소화할 수 있기 때문에, 유익할 수 있다(예컨대, 1 용량의 양이 적은 경우).

따라서, 백신은, 하기를 포함하는 2 용량 방식으로, 예컨대 2-바이알 제형으로 제공된다:

● 바이알 1: 500μl(2 용량)의 RTS,S 2x 농축(lOOμg/ml) + 모노티오글리세롤(0.02, 0.05 또는 0.08%)

● 바이알 2: 500μl(2 용량)의 애쥬번트 2x 농축(ASOl)

재구성 후, 상기 제형은 ASOl 중 1ml(2 용량)의 RTS,S + 모노티오글리세롤 0.01, 0.025 또는 0.04%을 제공한다.

삼일열원충 ( P. vivax ) 항원

본 발명에서 사용된 CSV-S 단백질은 하기의 것을 포함할 수 있다: 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터 유래된 부분(CSV). 이 CSV는, 예컨대, 삼일열원충(P. vivax)의 유형Ⅰ CS 단백질에서 발견되고/발견되거나 삼일열원충(P. vivax)의 유형Ⅱ 단백질에서 발견되는 천연 단백질일 수 있다. 대안적으로, 상기 CSV 단백질은 상기 유형 Ⅰ 및 Ⅱ CS 단백질로부터의 요소를 포함하는 하이브리드 단백질 또는 키메라 단백질일 수 있다. 후자가 S 항원과 융합되는 경우, 이를 본원에서 하이브리드 융합 단백질로 지칭될 것이다.

CSV-S는 본원에서 일반적 용어로 사용되어, 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터의 서열/단편 및 B형 간염균의 S-항원으로부터의 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

하이브리드/키메라 단백질은 일반적으로 하기의 것을 포함할 것이다: 삼일열원충(P. vivax)의 유형 Ⅰ 포자소체 단백질의 중심부 반복 섹션으로부터 유래된 1개 이상의 반복 단위, 및 삼일열원충(P. vivax)의 유형 Ⅱ 포자소체 단백질의 중심부 반복 섹션으로부터 유래된 1개 이상의 반복 단위.

일반적으로 상기 하이브리드 단백질은 또한 플라스모디움, 예컨대 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터의 N-말단 단편, 예컨대 영역 Ⅰ을 포함하는 단편, 예컨대 SEQ ID No. 1에 제시된 아미노산을 포함할 것이다.

보통 상기 하이브리드 단백질은 플라스모디움, 예컨대 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터의 C-말단 단편, 예컨대 영역 Ⅱ를 포함하는 단편, 예컨대 SEQ ID No. 2에 제시된 모티프를 포함할 것이다.

이론에 구속되는 것을 원하는 것은 아니지만, 상기 N 및 C 말단 단편은 몇개의 T 및 B 세포 에피토프를 포함한다고 생각된다.

하기를 포함하는 삼일열원충(P. vivax)의 임의의 적합한 균주는 본 발명에서 사용될 수 있다: 라티나(Latina), 미국(즉, Sal 1, Belem), 한국, 중국, 태국, 인도네시아, 인도 및 베트남. SEQ ID No 13의 작제물은 한국 균주(더 자세하게는, 남한 균주)에 기초하고 있다.

유형 Ⅰ CS 단백질을 동반한 삼일열원충(P. vivax)은 유형 Ⅱ CS 단백질을 동반한 삼일열원충(P. vivax)보다 더욱 우세하다. 따라서 제 1 양태에서, 본 발명은 유형 Ⅰ로부터의 CS 단백질을 사용한다. 대안적인 양태에서, 본 발명은 유형 Ⅰ로부터의 반복 단위 및 유형 Ⅱ로부터의 반복 단위를 포함하는 하이브리드 단백질을 제공하는데, 예컨대 상기 유형 Ⅰ로부터의 반복 단위가 유형 Ⅱ의 반복 단위보다 하이브리드 내에 더욱 포함되어 있다.

더 자세하게는, 본 발명의 하이브리드 단백질은 1 내지 15 반복 단위, 예컨대, 유형 Ⅰ로부터의 9 반복 단위를 포함할 수 있다.

유형 Ⅰ CS 단백질로부터의 적합한 반복 단위의 예는 SEQ ID No. 3 내지 9로 제시된다.

제 1 구체예에서, 본 발명은 유형 Ⅰ의 상이한 반복 단위(예컨대, SEQ ID No. 3 내지 9에 나열된 각각의 것들 중 한가지)의 혼합물을 지니는 하이브리드를 제공한다.

한 개 이상의 반복 단위는 하이브리드에서 중복(duplicated) 될 수 있는데, 예컨대 SEQ ID No 3 및/또는 4의 2개의 반복 단위가 작제물 내로 통합될 수 있다.

a) 제 1 양태에서, CS 단백질은 SEQ ID No 3의 단위를 포함한다.

b) 제 1 양태에서, CS 단백질은 바로 위의 단락 a)에 기재된 것과 같은 단위와 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 4의 단위를 포함한다.

c) 제 1 양태에서, CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 또는 b)에 기재된 것과 같은 단위들과 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 5의 단위를 포함한다.

d) 제 1 양태에서, CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 c)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 6의 단위를 포함한다.

f) 제 1 양태에서, CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 d)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 7의 단위를 포함한다.

g) 제 1 양태에서, CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 f)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 8의 단위를 포함한다.

h) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 g)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, SEQ ID No 9의 단위를 포함한다.

유형 II CS 단백질의 적합한 성분 반복 단위의 예는 SEQ ID No 10 및 14(예컨대 10)로 제시된다.

본 발명의 제 1 양태에서, 유형 II에서 유래된 5개 이하의 반복 단위, 예컨대 1개의 반복 단위(예컨대, SEQ ID No 10으로 제시된 것과 같은)를 지니는 하이브리드 단백질이 제공된다.

또한, 하이브리드 단백질은, 예를 들어, SEQ ID No 11로 제시된 것과 같은, 삼일열원충(P. vivax)의 특정 아시아 종에서 발견된 반복 영역의 말단에서 확인된 12개 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.

제 1 구체예에서, 하이브리드 단백질은 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질에서 유래된 약 257개의 아미노산을 포함할 수 있다.

본 발명의 CSV 유래 항원 성분은 일반적으로 S 단백질의 아미노 말단에 융합된다.

B형 간염균으로부터의 표면 항원의 존재는 CS 단백질 부분의 면역원성을 증강시키고, 안정성에 도움이 되고/되거나 상기 단백질의 재생가능한 제조를 돕는다고 생각된다.

제 1 구체예에서, 하이브리드 융합 단백질은 약 494개의 아미노산을 포함하며, 예컨대, 그 중 약 257개는 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질에서 유래된다.

하이브리드 융합 단백질은 또한 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 항원을 추가적으로 포함할 수 있는데, 예컨대 상기 항원은 DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 및 RBP 또는 이의 단편 중에서 선택된다.

또 다른 예로, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 PfEMP-1, Pfs 16 항원, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 및 TRAP를 포함한다. 또 다른 플라스모디움 항원은 열대열원충(P. falciparum) EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린(Sequestrin), Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 및 다른 플라스모디움 종 내의 이들의 유사체(analogues)를 포함한다.

제 1 구체예에서, 하이브리드 융합 단백질(CSV-S)은 SEQ ID No. 17에 제시된 아미노산 서열을 지닌다. 상기 서열에서, 아미노산 6 내지 262는 CSV로부터 유래되고, 269 내지 494는 S에서 유래된다. 나머지 아미노산은 유전자 작제에 의해 도입된다(특별히, 적절하게 변형될 수 있다). 특히 이 4가지 아미노산, Met, Met, Ala, Pro는 플라스미드 pGFl-S2에서 유래된다(도 4 참조).

SEQ ID No 17의 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No 16에 제시되어 있다.

면역원성 CS 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 포유류 세포를 위해 코돈 최적화될 수 있다. 이러한 코돈-최적화는 WO 05/025614에 상세히 기재되어 있다.

RTS ,S

RTS(즉, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래됨)로 명명된 본 발명의 단백질 입자의 성분은, RTS*(열대열원충(P. falciparum) NF54/3D7 균주에서 유래됨-본원에서 RTS로 지칭됨)에 대한 설명을 포함하고 있는 WO 93/10152에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 융합 단백질 내에서 사용된 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 실질적으로 이의 전체 CS 단백질일 수 있다.

본 발명의 제 1 구체예에서, 전장 S-항원이 사용된다. 또 다른 구체예에서 상기 S-항원의 단편이 사용된다.

제 1 구체예에서, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 4개 이상의 반복 단위 중심부 반복 영역을 포함한다. 더욱 자세하게는, 이 항원은 CS 단백질의 C-말단 부분과 실질적으로 상동성이 있는, 160개 이상의 아미노산을 포함하는 서열을 포함한다. 상기 CS 단백질은 C 말단으로부터 마지막 12개 내지 14개(예컨대 12개) 아미노산이 결여될 수 있다.

더 자세하게는, 사용된 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 융합 단백질은 RTS 발현 카세트에 대한 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되고, SEQ ID No 18로 제공된다.

B형 간염균으로부터의 S-항원

적합한 S 항원은 preS2 영역을 포함할 수 있다. 적합한 혈청테스트의 예는 adw(Nature 280:815-819, 1979)이다.

보통 B형 간염균으로부터의 서열은 전장 S-항원일 수 있다. 일반적으로 preS2 영역은 포함되지 않을 것이다.

제 1 양태에서, 본 발명의 하이브리드 융합 단백질은[예컨대, 공개된 US 특허출원 제 2006/194196호에 기재된 바와 같이(또한 공개된 WO 2004/113369)] 돌연변이 S 단백질로부터 유래된 부분을 포함한다. 상기 문헌은 HDB05로 표기된 돌연변이체에 대해 기재하고 있다. 특히, 도 1 및 6에서 돌연변이체와 야생형 단백질의 비교 및 도 4 및 5에서 돌연변이체에 관한 유전자를 기재하고 있다. 거기에서 서열 12 내지 22는 돌연변이체 S 항원의 특정 폴리펩티드를 기재하고 있다. 상기 문헌 각각은 본원에 참조문헌으로서 통합된다.

융합 단백질 CSV-S는 예컨대, 플라스미드 pGFl-S2을 이용하여 제조될 수 있는데(추가 상세한 설명을 위해 도 2 및 실시예를 참조하라), CSV에 상응하는 적당한 서열이 SamⅠ 클로닝 부위에 삽입되는 경우, 이는 적합한 조건하에서 융합 단백질 CSV-S를 생산할 수 있다.

본원 발명의 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은 전사 조절 인자(바람직하게는 효모 유전자로부터 유래된 전자 조절 인자)에 의해 플랭킹(flanked)될 수 있고, 발현 벡터내로 통합될 수 있다.

본 발명에 사용된 하이브리드 단백질에 대한 발현 카세트는, 예컨대 하기 특성을 포함하도록 작제될 수 있다:

● 예컨대 S. 세레비시에(S. cerevisiae) TDH3 유전자로부터 유래된 프로모터 서열,

● 적절한 융합 단백질을 엔코딩하는 서열,

● 예컨대 S. 세레비시에(S. cerevisiae) ARG3 유전자로부터 유래된 서열 내에 포함된 전자 종결 서열.

특정 프로모터의 예는 S.세레비시에(S. cerevisiae) TDH3 유전자 [Musti et al]으로부터의 프로모터이다.

그 다음 적합한 플라스미드를 사용하여 하이브리드 융합 단백질을 엔코딩하는 서열을, 합성을 위해 적합한 숙주내로 삽입시킬 수 있다. 적합한 플라스미드의 예로 적합한 발현 플라스미드로 전달하기 위한 pRIT 15546 2 미크론-기초 벡터가 있다(추가 상세한 설명을 위해 도 1 및 실시예를 참조하라).

플라스미드는 일반적으로 선별을 보조하기 위해 내장(in-built) 마커, 예컨대, 항생제 내성 또는 LEU2 및/또는 HIS 영양요구성(auxotrophy)을 엔코딩하는 유전자를 포함할 것이다.

일반적으로, 상기 숙주는 입자 내에 각 융합 단백질에 대한 발현 카세트를 지닐 것이고, 또한 이의 유전체내에 통합된 S 항원에 대한 1개 이상의 발현 카세트도 지닐 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된(transformed) 숙주 세포와 관련이 있다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으나, 바람직하게는, 효모, 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, RIT DC5 cir(o)라는 명칭으로 ATCC 데이터 베이스에 등재된 DC5(수탁 번호 20820)와 같은 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 기탁자: Smith Kline-RIT) 및 사카로미세스(Saccharomyces)가 아닌 효모이다. 이들은 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)(예를 들어, 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 클루이베로미세스(Kluyveromyces)(예를 들어, 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)), 피치아(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 한세눌라(Hansenula)(예를 들어, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 야로이(Yarrowia)(예를 들어, 야로이 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)) 및 쉬반니오미세스(Schwanniomyces)(예를 들어, 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis))이다.

적합한 재조합 효모 균주는 상기 융합 단백질을 발현하기 위한 Y1834(및 본 발명의 일부를 형성하는 이의 용도)이다(Y1834의 제조에 대한 실시예를 참조하라).

본원에서 이용된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부(예컨대 CS/하이브리드 단백질을 엔코딩하는 부분이지만, 임의로 단백질 S를 엔코딩하는 부분은 아님)는 숙주, 예컨대 효모에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다.

상기 숙주 세포는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 융합 단백질에 대한 발현 카세트 및 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 융합 단백질에 대한 발현 카세트 및 임의로 S 항원을 포함할 수 있다.

특정 숙주, 예컨대 효모 세포에서, 발현시 융합 단백질(S 항원 포함)은 상기 융합 단백질의 수많은 모노머로 이루어진 단백질 구조/입자 내로 자발적으로 조립된다. 효모가 두개의 상이한 융합 단백질(또는 융합(들) 단백질 및 S 항원)을 발현하는 때, 입자 내에서 동시-조립(co-assembled)되는 것으로 생각된다.

선택된 수령체(recipient) 효모 균주가 이미 B형 간염균 S 발현 카세트의 복제물이 통합된 몇몇의 유전체 내로 전달될 때, 그 다음 조립된 입자는 또한 비융합된 S 항원의 모노머를 포함할 수 있다.

이 입자는 또한 바이러스 유사 입자(Virus Like Particles, VLP)로도 지칭될 수 있다. 이 입자는 또한 복합 리포단백질 입자로 기재될 수 있거나, 간단히 면역원성 입자로 기재될 수 있다.

따라서, 하기 모노머를 포함하는 면역원성 단백질 입자가 제공된다:

a. 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(예컨대, CSV-S) 및/또는

b. 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(예컨대, RTS), 및

c. 임의로 비융합된 S 항원.

여기서 상기 입자(들)은 안정화제, 예컨대 상기 정의된 바와 같이, 모노티오글리세롤, 시스테인 또는 이들의 혼합과 연관이 있다.

제 1 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 모노머 a) 및/또는 b) 및 c)를 포함하는 면역원성 단백질 입자 및 산소를 입자가 담긴 용기 또는 바이알로부터 제거하고/하거나 상기 입자를 예컨대, 갈색병 용기를 이용함으로서 빛으로부터 보호하는, 보호조치를 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은,

a) 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터 유래된 서열(예컨대, 유형 I 및/또는 유형 II의 반복 영역으로부터의 서열),

b) 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질로부터 유래된 서열(예컨대, 이의 반복 영역으로부터의 서열), 및

c) B형 간염균의 S-항원으로부터의 서열을 포함하는 융합 단백질의 용도를 제공하는데,

본 발명은 적합한 숙주내에서 발현시, 융합 단백질 및 임의로 비융합된 S 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공하여, 본원에서 정의한 바와 같은 환원제, 예컨대 모노티오글리세롤, 시스테인 또는 이의 혼합물에서 선택된 환원제와 결합된 입자를 생산한다.

추가적 양태에서, 본 발명은,

본 발명은, 적합한 숙주 내에서 발현시, 융합 단백질 및 임의로 비융합된 S 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공하여, 산소가 제거되고/제거되거나 단백질/입자(들)이, 예컨대, 갈색 유리 용기를 사용함으로서 빛으로부터 보호되는, 환경에서 입자(들)을 생산한다.

따라서 본 발명은 1개 이상의 티올 작용기를 함유한 환원제, 예컨대 본원에서 기재한 바와 같은, 예컨대 모노티오글리세롤, 시스테인 또는 이의 혼합 및 특히 모노티오글리세롤을, 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질에서 유래된 융합 단백질 및/또는 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 융합 단백질(예컨대, RTS)을 면역원성 리포단백질 입자 형태로 포함하는 단백질 입자를 안정화시키는 용도에까지 확대된다.

따라서 본 발명은 1개 이상의 티올 작용기를 지닌 환원제, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은, 예컨대 모노티오글리세롤을, CSV-S 및/또는 RTS 단위를 포함하는 VLP를 안정화시키는데 이용하는 용도를 제공한다. 제 1 양태에서, 본 발명은 본질적으로 CSV-S 및/또는 RTS 단위로 이루어진 입자를 제공한다. 대안적인 양태에서, 생산된 상기 입자는 본질적으로 CSV-S 및/또는 RTS 및 S 단위를 포함하거나 이루어진다.

본 발명에서 사용된 리포단백질 입자는 생체내에서 항원성 단백질(들)에 대한 면역 반응을 더욱 자극시키는데 기여할 수 있다고 가정한다.

1개 이상의 티올 작용기를 지닌 안정화제, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은, 예컨대, 모노티오글리세롤, 시스테인 및 이의 혼합물의 첨가는 각각의 입자에 내부 안정화를 제공하고 따라서 상기 시약은 제시된 입자 내에 결합되거나 내재화될 수 있다고 추가적으로 가정한다.

본 발명은 또한 적합한 부형제, 예컨대 희석액(diluent)과 혼합하여 본 발명에 따른 안정화된 단백질 입자의 면역보호적(immunoprotective) 양을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 명세서 본문 중의 "백신"은 애쥬번트 성분을 포함하는 모든 성분을 함유한 제형을 지칭하며 및 인간 환자에 주입하기에 적합하다.

본 발명의 본문 중의 "안정화된"은 상응하는 제형에 대한 참조로서 의미하도록 의도되었는데, 예컨대 본원에 기재된, 1개 이상의 티올 작용기를 지닌 안정화제(또한 본원에서 환원제로도 지칭됨), 예컨대 모노티오글리세롤, 시스테인 및 이들의 혼합물은, 예컨대 37℃에서 7일 또는 14일 동안 저장되는 경우 및/또는 가속화된 안정화 조건(예컨대 37℃에서 7일 후 강한 빛의 존재하에 약 15시간 동안 처리)하에서 저장되는 경우, 제외된다.

안정성은 입자 크기(예컨대, 빛 산란 기법, 크기 배제 크로마토그래피 또는 장 흐름 분획법(Field Flow Fractionation)에 의해 측정) 및/또는 응집/분해(예컨대, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 측정) 및/또는 항원성(ELISA에 의해 측정) 및/또는 면역원성(예컨대, 생체내에서 측정)에 대한 참조가 될 수 있다.

제 1 양태에서, 안정성은 응집 및 분해의 부재를 지칭한다.

조성물

본 명세서의 본문에서, "부형제"는 약제적 제형 내에서 그 자체로 치료적 효과를 보이지 않는 성분을 지칭한다. 애쥬번트는 치료적 성분, 예컨대 항원의 부재하에서 애쥬번트에 의해 생산된 생리적 효과가 존재할 수 있음에도, 이 생리적 효과는 비-특이적이고 그 자체로 치료적이지 않기 때문에, 애쥬번트는 부형제이다. 희석액 또는 액체 담체도 부형제의 정의 내에 포함된다.

본 명세서 본문 중의 "면역원성"은 사용된 융합 단백질의 S 항원 부분 및/또는 CS 부분에 대한 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 지칭한다. 이 반응은, 예컨대 리포단백질 입자가 적합한 애쥬번트를 포함/요구할 수 있는 적절한 제형으로 투여되는 경우 발생한다. 기존 용량과 유사하거나 더 적은 용량을 포함하는 부스터(booster)가 필요한 면역원성 반응을 획득하는데 요구될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물/약제적 제형은 또한 1개 이상의 항원 혼합물, 예컨대 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 것을 포함할 수 있는데, 예컨대 상기 항원은 DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 및 RBP 또는 이의 단편에서 선택된다.

또 다른 예로, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 PfEMP-1, Pfs 16 항원, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 및 TRAP를 포함한다. 다른 플라스모디움 항원은 열대열원충(P. falciparum) EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PO32, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 및 다른 플라스모디움 종 내의 이들의 유사체를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물/약제적 제형은 또한 CSV-S를 포함하는 입자와의 혼합물 내에 RTS,S 입자(WO 93/10152에 기재됨)를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신에서, 상기 입자의 수성 용액은 직접적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 미리 동결건조하거나 하지 않은 단백질은 애쥬번트와 혼합되거나 흡착될 수 있다.

애쥬번트

특정 애쥬번트는 금속염, 수중 유 에멀젼, 톨 유사 수용체 효능제(Toll like receptors agonist)(특히, 톨 유사 수용체 2 효능제, 톨 유사 수용체 3 효능제, 톨 유사 수용체 4 효능제, 톨 유사 수용체 7 효능제, 톨 유사 수용체 8 효능제, 톨 유사 수용체 9 효능제), 사포닌 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것들인데, 단, 금속염은 오직 다른 애쥬번트와 조합되어 사용되고, 약 60% 이하의 항원이 금속염 상에 흡착되는 그러한 방식으로 제형화되지 않는 한, 단독으로 사용되지 아니한다. 제 1 구체예에서, 애쥬번트는 단독 애쥬번트로서 금속염을 포함하지 않는다. 제 1 구체예에서 애쥬번트는 금속염을 포함하지 않는다.

제 1 구체예에서, 애쥬번트는 톨 유사 수용체(TLR) 4 리간드, 예컨대 효능제, 예컨대 지질 A 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 더욱 특히 3-디아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D - MPL)이다.

3-디아실화된 모노포스포릴 지질 A는 미국 특허 제 4,912,094호 및 UK 특허출원 제 2,220,211호(Ribi)로부터 공지되어 있으며, Ribi Immunochem, Montana, USA로부터 이용가능하다.

3D-MPL은 코릭사 코포레이션(Corixa corporation)에 의해 상표 MPL®로 시판되며, 주로 IFN-g(Th1) 표현형을 지니는 CD4+ T 세포 반응을 촉진한다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A호에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있다. 화학적으로, 3D-MPL은 3-디아실화된 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 아실화된 사슬의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서는, 소입자 3D-MPL이 사용된다. 소입자 3D-MPL은 0.22㎛ 필터를 통해 살균 여과될 수 있는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제조물은 WO 94/21292호에 기재되어 있다. 지질 A의 합성 유도체는 공지되어 있고, 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 TLR 4 효능제인 것으로 생각된다:

OM174 (2-데옥시-6-O-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트)(WO 95/14026호),

OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(WO 99/64301호 및 WO 00/0462호),

OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127호).

일반적으로, 3D-MPL이 사용된 경우 항원 및 3D-MPL는 알룸(alum)과 함께 전달되거나 수중유 에멀젼(oil in water emulsion) 또는 복합(multiple) 수중유 에멀젼으로 전달된다. 3D-MPL의 융합은 T-세포 반응 효과기의 자극제(stimulator)가 되므로 유리하다.

사용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 WO9850399호 또는 US6303347호(AGP를 제조하는 방법도 기술되어 있음)에 개시된 것들과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP), 또는 US6764840호에 개시된 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는 TLR4 길항제(antagonist)이다. 이 둘 모두는 애쥬번트로서 유용한 것으로 생각된다.

본 발명에서 사용하기 위한 또 다른 면역자극제(immunostimulant)는 Quil A 및 이의 유도체이다. Quil A는 남아메리카의 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quilaja Saponaria Molina)로부터 분리된 사포닌 제조물이고, 문헌[Dalsgaard et al. in 1974("Saponin adjuvants", Archiv fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)]에서 애쥬번트 활성을 지니는 것으로 처음 기술되었다. Quil A와 관련된 독성이 없이 애쥬번트 활성을 유지하는 Quil A의 정제된 단편, 예를 들어, QS7 및 QS21(QA7 및 QA21로도 공지됨)이 HPLC에 의해 분리되었다(EP 0 362 278호). QS-21은 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 우세한 IgG2a 항체 반응을 유도하는 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이다.

QS21의 특정 제형이 기술되어 있고, 이들 제형은 스테롤을 추가로 포함한다(WO 96/33739호). QS21:스테롤의 비는 일반적으로 대략 1:100 내지 1:1 중량 대 중량일 것이다. 일반적으로 과량의 스테롤이 존재하고, QS21:스테롤의 비는 적어도 1:2 w/w이다. 일반적으로 인간 투여의 경우 QS21 및 스테롤은 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 예컨대 투여량 약 10㎍ 내지 약 50㎍의 범위로 백신 내에 존재할 것이다.

리포좀은 일반적으로 천연 지질, 예컨대 실온에서 보통 비-정질(non-crystalline)인 포스파티딜콜린, 예컨대 난황 포스파티딜콜린, 디올레오일(dioleoyl) 포스파티딜콜린 또는 디라우릴(dilauryl) 포스파티딜콜린을 포함한다. 리포좀은 또한 포화 지질로 구성된 리포좀을 위해 리포좀-QS21 구조의 안정성을 증가시키는 하전된 지질(charged lipid)을 포함할 수 있다. 이 경우, 하전된 지질의 양은 보통 1-20% w/w, 예컨대, 5-10%이다. 포스포지질에 대한 스테롤의 비는 1-50%(mol/mol),예컨대 20-25%이다.

이 조성물은 MPL(3-디아실화된 모노-포스포릴 지질A, 3D-MPL로도 공지됨)을 포함할 수 있다. 3D-MPL은 GB 2 220 211호(Ribi)로부터, 3형 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5, 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물로 알려져 있으며, Ribi Immunochem, Montana에 의해 제조된다.

사포닌은 미셀(micelles), 혼합된 미셀(담즙염을 포함하는 것이 일반적이지만, 전적으로 그렇지 아니함) 형태일 수 있거나, ISCOM 매트릭스(EP 0 109 942호), 리포좀 또는 관련 콜로이드 구조, 예컨대 벌레-유사 형태(worm-like) 또는 고리-형태의 다중 복합체 또는 콜레스테롤 및 지질로 제형화된 경우, 지질성/층(lipidic/layered) 구조 및 라멜라(lamellae), 또는 수중유 에멀젼 형태(예컨대, WO 95/17210)일 수 있다.

보통, 사포닌은 리포좀 제형, ISCOM 또는 수중유 에멀젼 형태로 존재한다.

면역자극 올리고뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 또는 애쥬번트에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드의 예는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이는 일반적으로 3개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 포함한다. CpG 모티프는 구아닌 뉴클레오티드가 뒤따르는 시토신 뉴클레오티드이다. CpG 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 제 1 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드간(internucleotide)은 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 또는 더욱 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스터 및 다른 뉴클레오티드간 결합도 본 발명 범위 내이다. 또한 혼합된 뉴클레오티드간 결합 내의 올리고뉴클레오티드도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트의 생산 방법은 US 5,666,153호, US 5,278,302호 및 WO 95/26204호에 기재되어 있다.

올리고뉴클레오티드의 예는 하기와 같다:

상기 서열은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 개질된 뉴클레오티드간 결합을 포함할 수 있다.

대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 상기 서열을 한개 이상 포함할 수 있고, 상기 서열에 사소한 결손 또는 부가를 지닌다.

CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다(예컨대, EP 468520호 참조). 편리하게는, 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동화 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.

TLR 2 효능제의 예는 펩티도글리칸 또는 리포단백질을 포함한다. 이미다조퀴놀린(Imidazoquinolines), 예컨대 이미퀴모드(Imiquimod) 및 레지퀴모드(Resiquimod)는 TLR7 효능제로 알려져 있다. 또한 단일 가닥 RNA는 TLR 효능제(인간 내에서는 TLR8 및 마우스 내에서는 TLR7)로 알려져 있는 반면, 이중 가닥 RNA 및 폴리 IC(폴리이노시닉-폴리시티딜산-상업적으로 합성된 모방적 바이러스 RNA)는 TLR 3 효능제의 일예이다. 3D-MPL는 TLR4 효능제의 일예인 반면, CpG는 TLR9 효능제의 일예이다.

면역자극제는 대안적으로 또는 추가적으로 포함될 수 있다. 제 1 구체예에서, 이 면역 자극제는 3-디아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)일 것이다.

제 1 양태에서, 애쥬번트는 3D-MPL을 포함한다.

제 1 양태에서, 애쥬번트는 QS21을 포함한다.

제 1 양태에서, 애쥬번트는 CpG를 포함한다.

제 1 양태에서, 애쥬번트는 수중유 에멀젼으로 제형화된다.

제 1 양태에서, 애쥬번트는 리포좀으로 제형화된다.

애쥬번트 조합은 3D-MPL 및 QS21(EP 0 671 948 B1호), 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀젼(WO 95/17210호, WO 98/56414호), 리포좀 제형 내 3D-MPL 및 QS21, 또는 다른 담체와 함께 제형화된 3D-MPL(EP 0 689 454 B1호)을 포함한다. 또 다른 애쥬번트 시스템은 US 6558670호 및 US 6544518호에 기재된 바와 같이 3D-MPL, QS21 및 CpG 올리고뉴클레오티드의 조합을 포함한다.

본 발명의 제 1 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 안정화된 입자를 3D-MPL 및 희석액과 조합된 상태로 포함하는 백신을 제공한다. 일반적으로 상기 희석액은 수중유 에멀전 또는 알룸일 것이다.

백신 제형은 일반적으로 문헌[New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978]에 기재되어 있다. 리포좀 내로의 캡슐화는, 예컨대, 문헌[Fullerton에 의한, U.S. 특허 제 4,235,877호]에 기재되어 있다.

각 백신 용량 내에 존재하는 본 발명의 단백질 입자의 양은 일반적인 백신 내에서 중대하고, 불리한 부작용없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이러한 양은 어떤 특이적 면역원이 사용되고 백신이 애쥬번트화되었는지 여부에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 각 용량은 1-1000μg의 단백질, 바람직하게는 1-200μg, 가장 바람직하게는 10-100μg을 포함할 것으로 예상된다. 특정 백신에 대한 최적화된 양은 항체 역가 및 피실험자 내의 또 다른 반응의 관찰에 관한 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 최초 백신접종에 이어, 피실험자는 바람직하게는 약 4주내에 부스트(boost)를 접종받고, 이어서 감염의 위험이 존재하는 동안 매 6달 동안 반복하여 부스트를 접종받을 것이다. 본 발명의 단백질에 대한 면역 반응은 애쥬번트 및/또는 면역자극제(immunostimulant)를 이용함으로서 강화된다.

사용된 3D-MPL의 양은 일반적으로 소량이지만, 백신 제형에 따라 1회 용량당 1-1000μg의 범위, 예컨대 1회 용량당 1-500μg, 또는 1회 용량당 1 내지 100μg, 예컨대 1회 용량당 50 또는 25μg일 수 있다.

본 발명의 백신 또는 애쥬번트 내에 CpG 또는 면역 자극 올리고뉴클레오티드의 양은 일반적으로 소량이나, 백신 제형에 따라 1회 용량당 1-1000μg의 범위, 예컨대 1회 용량당 1-500μg, 예컨대 1회 용량당 1 내지 100μg 일 수 있다.

본 발명의 애쥬번트내에서 사용하기 위한 사포닌의 양은 1회 용량당 1-1000μg의 범위, 예컨대 1회 용량당 1-500μg, 예컨대 1회 용량당 1-250μg, 특히 1회 용량당 1 내지 100μg, 특히 1회 용량당 50 또는 25μg일 수 있다.

제형화

본 발명의 제형은 예방적 및 치료적 목적 모두를 위해 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 의약(medicine) 용도, 예컨대 말라리아의 치료(또는 예방법)(또는 말라리아의 치료/예방을 위한 약제(medicament)의 제조)를 위한 본원에 기재된 것과 같은 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 양태는 백신 성분의 제조 방법 및 본 발명의 요소를 포함하는 백신 및 키트를 제공하는데, 상기 방법은 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 적합한 숙주, 예컨대 효모에서 발현시키는 단계, 및 리포단백질 입자로서 산물을 회수하는 단계 및 후자를 본원에서 정의된 1개 이상의 안정화제, 특히 모노티오글리세롤, 시스테인 및 이들의 혼합, 예컨대 모노티오글리세롤과 함께 혼합하는 단계를 포함한다.

최종 벌크는 보통 3ml 바이알에 무균상태로 분배한 후, 느슨하게 막고, 동결건조기에 옮겨 약 40시간의 동결-건조 사이클을 시행한다.

항원 성분을 제조하는 과정에서, 부형제는 일반적으로 첨가될 것이고 혼합되고 최종단계에서 항원/리포단백질 입자가 첨가될 것이다. 상기 제조의 경우, 보호조치, 예컨대 바이알로부터 산소를 제거하거나 갈색 유리 용기를 이용하여 백신을 빛으로부터 보호하는 것 역시 안정화제의 이용과 조합하여 또는 이의 대안책으로서 결과적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 양태에서, 산소는 제거되었고, 제형/성분/입자등은 질소하에서 저장될 수 있다.

애쥬번트는 종종 항원의 액체 제형(또는 항원의 동결 건조된 제형)에 백신을 형성하기 위해 첨가될 것이다.

본 발명의 추가 양태는 본원에 기재된 바와 같은 백신의 유효량을 투여함으로서 플라스모디움 감염이 쉬운 환자를 치료하는 방법에 존재한다.

추가적 양태에서, 백신용 항원성 성분 또는 치료용 본 발명에 따른 백신(또는 말라리아의 치료/예방용 약제의 제조를 위한 이의 용도)이 제공된다.

본 발명은 또한 1개 이상의 본원에 기재된 다양한 성분을 포함하는 프라임 부스트 섭생(prime boost regime)을 포함한다.

본 명세서의 본문에서 "구성되는(comprising)"은 "포함하는(including)으로 해석된다.

제 1 양태에서, 본 발명은 3mL 바이알, 예컨대 갈색병 내의 본원에 기재된 안정화된 말라리아 항원을 제공하고, 항원을 채우기 전에 임의로 질소로 씻어내어 바이알 내 산소종을 제거한다.

사용된 바이알은 실리콘처리되거나 실리콘처리되지 않을 수 있다.

본 발명은 또한 특정 요소를 포함하는 본원에 기재된 발명의 양태로 이루어지거나 실질적으로 이루어진 개별 구체예까지 적절하게 확대된다.

하기 실시예는 본 발명의 입자를 제조하기 위해 이용될 수 있는, 방법론을 설명하기 위해 제시되었다.

실시예

실시예 1

RTS,S 말라리아 백신의 단일 소아 투여량을 위한 성분의 처방(2개 바이알 제형)

상기 제형은 주사용 수, NaCl 150OmM, 인산염 완충용액(Na/K₂) 50OmM(50x로 희석된 경우, pH 6.8) 및 모노티오글리세롤의 10%의 수성용액의 혼합물에 RTS,S 항원을 첨가함으로서 제조된다. 최종적으로 pH는 7.0 ± 0.1로 조정된다.

이것은 애쥬번트의 별개의 바이알과 함께 바이알로서, 예컨대, MPL 및 QS21의 리포좀 제형으로 제공될 수 있다.

투여의 경우, 애쥬번트 제형을 예컨대, 시린지(syringe)를 이용하여 상기 성분 제형에 첨가하고, 이후 흔들어 준다. 그 다음 상기 투여량이 일반적인 방법으로 투여된다. 최종 액체 제형의 pH는 약 6.6 +/- 0.1이다.

실시예 1A

본 발명에 따른 최종 소아 액체 제형(1 바이알)은 하기 처방에 따라 제조될 수 있다.

상기 액체 제형의 pH는 7.0 +/- 0.1(이는 항원 안정성에 대해서는 유리하나, MPL 안정성에는 전혀 유리하지 않음) 또는 6.1 +/- 0.1(이는 MPL 안정성에 대해서는 유리하나 RTS,S 안정성에는 전혀 유리하지 않음)로 조정된다. 따라서 상기 제형은 제조 후 조속한 사용이 의도된다.

상기 제형은 주사용 수, NaCl 150OmM, 인산염 완충용액(Na/K₂) 50OmM(50x로 희석된 경우, pH 6.8) 및 모노티오글리세롤의 10%의 수성용액의 혼합물에 RTS,S 항원을 첨가함으로서 제조된다. 그 다음 MPL과 QS21를 함유한 리포좀 예비혼합물(premix)을 첨가하고, 최종적으로 pH를 조정한다.

실시예 1B

본 발명에 따른 RTS,S에 대한 최종 성인 용량(1 바이알 제형)은 하기와 같이 제조될 수 있다:

실시예 1C

실시예 1C는 갈색 바이알, 예컨대 담기 전에 질소로 씻은(flushed) 바이알에 실시예 1, 1A 또는 1B를 넣음으로써 제조될 수 있다.

실시예 2

본 발명에 따른 성분은 또한 소아 집단에서 사용하기 위해 2 용량으로 제조될 수 있다(2 바이알 제형).

상기 제형은 주사용 수, NaCl 150OmM, 인산염 완충용액(Na/K₂) 50OmM(x50로 희석된 경우, pH 6.8) 및 모노티오글리세롤의 10%의 수성용액의 혼합물에 RTS,S 항원을 첨가함으로서 제조된다. 최종적으로 pH를 7.0 ± 0.1로 조정한다.

투여의 경우, 애쥬번트 제형을 예컨대, 시린지를 이용하여 상기 성분 제형에 첨가하고, 이후 흔들어 준다. 그 다음 단일 투여량을 뽑아내고(500μL), 일반적인 방법으로 투여한다.

최종 액체 제형의 pH는 약 6.6 +/- 0.1이다.

실시예 2A

본 발명에 따른 최종 소아 액체 제형(1 바이알)은 하기 처방에 따라 2 용량으로 제조될 수 있다.

상기 제형은 주사용 수, NaCl 150OmM, 인산염 완충용액(Na/K₂) 50OmM(x50로 희석된 경우, pH 6.8) 및 모노티오글리세롤의 10%의 수성용액의 혼합물에 RTS,S 항원을 첨가함으로서 제조된다. 그 다음 MPL과 QS21를 함유한 리포좀 예비혼합물(premix)을 첨가하고, 최종적으로 pH를 조정한다.

실시예 2B

본 발명에 따른 RTS,S에 대한 최종 성인 용량(1 바이알 제형)은 하기와 같이 2 용량으로 제조될 수 있다:

실시예 2C

실시예 2C는 갈색 바이알, 예컨대 담기 전에 질소로 씻은(flushed) 바이알에 실시예 2, 2A 또는 2B를 넣음으로써 제조될 수 있다.

실시예 3

500μl의 부피로 채워진 RTS,S 말라리아 백신의 단일 소아 용량에 대한 성분 처방(2 바이알 제형)

이것은 애쥬번트의 별개의 바이알과 함께 바이알로서, 예컨대 500μl 부피로 채워진 MPL 및 QS21의 리포좀 제형으로 제공될 수 있다.

투여의 경우, 애쥬번트 제형을 예컨대, 시린지를 이용하여 상기 성분 제형에 첨가하고, 이후 흔들어 준다. 그 다음 상기 용량이 일반적인 방법으로 투여된다.

최종 액체 제형의 pH는 약 6.6 +/- 0.1이고, 주입 부피는 1mL이다.

실시예 4

가속화된 안정성 시험 결과는 하기를 나타낸다:

● pH 및 삼투압은 주입에서 호환가능하다;

● RTS,S 양에 관하여; 4℃ 또는 37℃에서 5주 후, 비-특이적 흡착에 의한 항원 손실이 없다;

● 항원 보전성(integrity)에 관하여(도 6, 7 및 8 참조):

● 가속화된 안정성 시험(7일간 37℃±AOT, 14일간 37℃) 후 유의한 분해는 일어나지 않았음

● 불활성화 없이, 항산화제(모노티오글리세롤)는 가속화된 안정성 시험(7일간 37℃±AOT, 14일간 37℃) 후 산화적 응집을 피하는데 필요함:

○ 0.01%는 37℃에서 응집을 피하기 위해 충분함;

○ 0.04%가 37℃±AOT에서 안정성을 위해 필요함;

● 갈색 유리는 빛으로부터의 항원 보호를 보장함(AOT후 보여짐)

● 가속화된 안정성 후 시험(37℃에서 7일) RTS,S 입자 크기 분포의 변화가 없음

● 항원성에 관하여(도 9 참조):

● 불활성화 없이, 항산화제(모노티오글리세롤)는 가속화된 안정성 시험(37℃±AOT에서 7일) 후 산화적 응집 및 항원성 증가를 피하는데 필요함:

○ 0.01%는 매우 안정한 항원성을 제공함(80-120%);

○ 0.04%는 가속화된 안정성 시험 후 항원성의 약간의 감소(-10%)를 유도함;

● ASO1과 혼합시(MPL 및 QS21을 함유한 리포좀 애쥬번트 제형):

● RTS,S의 강도 및 항원성은 혼합 후 25℃에서 24시간 이상 유지된다.

SDS-PAGE 분석은 이 RTS,S 액체 제형을 모노티오글리세롤과 함께 또는 모노티오글리세롤 없이 7일동안, 14일 동안 또는 심지어 37℃에서 5주(도 8) 저장한 후 수행되었다.

도 6은 하기 사항을 보여준다:

● 모노티오글리세롤 부재시: 37℃에서 7일간 저장 후 약간의 RTS,S 응집; AOT에 노출시키기 전 37℃에서 7일동안 저장된 백색 바이알 내에서 완전한 응집 및 약간의 분해(웰 6), 반면에 갈색 유리는 빛에 의해 유도된 산화적 응집 및 분해로부터 RTS,S를 보호함(웰 5);

● 모노티오글리세롤 0.01% 존재시: 이 농도는 37℃에서 7일간 저장 동안 RTS,S를 안정화시키기에 충분하지만(웰 7), 갈색 유리와 결합된 경우(웰 8)를 제외하고, 가속화된 산화 시험(AOT)이 누적된 경우(웰 9)에는 충분하지 않았다;

● 모노티오글리세롤 0.04% 존재시: 이 농도는 37℃에서 7일간 저장 동안 RTS,S를 안정화시키기에 충분하였고(웰 10), 또한 가속화된 산화 시험이 누적된 경우(웰 12)에도 충분하였다; 이 경우 갈색 유리 바이알에 담는 것은(웰 11) 요구되지 않는다;

● ASO1과의 혼합은 심지어 25℃에서 24시간 저장 후에도, RTS,S 프로파일에 영향을 미치지 않는다.

도 7은 모노티오글리세롤이 RTS,S 응집을 피하기 위해 필요하지만, 상기 두 농도는 37℃에서 14일 이상 저장되는 동안 RTS,S를 안정화시킬 수 있음을 나타낸다(웰 11 및 12 대 웰 10).

도 8은 37℃에서 5주 후, RTS,S가 모든 제형에서 응집되고 분해되고; ASO1은 모든 제형에서 응집을 악화시킴을 나타낸다.

실시예 5

RTS,S 항원성은 TO (± AOT)에서 또는 7일(± AOT) 후 또는 37℃에서 5주 저장하여 0, 0.01 또는 0.04%의 모노티오글리세롤을 함유한 제형에 대한, 혼합된 ELISA αCSP-αS를 이용하여 측정되었다; ASO1로 재구성되기 전, 재구성 직후 및 25℃에서 24시간 후 측정하였다.

도 9는 하기 사항을 보여준다:

● 모노티오글리세롤의 부재시:

○ 15시간 동안 675 W에의 노출(AOT)은 50-60%의 항원성의 증가를 유발하지만(이는 SDS-PAGE에서 관찰된 산화적 응집과 연결될 수 있음), 갈색 유리 바이알에 담음으로써 이 항원성 증가가 ~20%까지 제한 시킨다;

○ 7일 동안 37℃에서의 저장은 ~30-40%의 항원성 증가를 유발한다(이는 또한 SDS-PAGE에서 관찰된 산화적 응집과 연결될 수 있음);

○ 37℃에서 7일 내지 5주 사이에 ~30%의 항원성 감소;

○ 25℃에서 24시간 후 ASO1은 ~20%의 항원성 증가를 유발한다(이는 또한 SDS-PAGE에서 관찰된 응집의 증가와 연결될 수 있음);

● 0.01 %의 모노티오글리세롤의 존재시:

○ 모노티오글리세롤은 AOT(갈색 유리를 무용하게 만듦) 또는 ASO1과 혼합하여, 7일 동안 37℃에서의 저장에 의해 유도된 항원성 증가에 대해 RTS,S를 보호한다(그러나 ASO1 내에서 25℃에서 24시간 동안 저장한 경우 ~20%의 증가는 37℃에서 7일 저장까지 누적됨);

○ 7℃에서 7일 내지 35주 사이의 ~20%의 항원성 감소(-> 사양 벗어남);

● 0.04% 모노티오글리세롤의 존재시:

○ 모노티오글리세롤은 AOT에 의해 유도된 항원성 증가에 대해 RTS,S를 보호하며, 이는 갈색 유리를 무용하게 만든다.

○ 7일 동안 37℃에서의 저장은 -20%의 항원성 감소를 유발한다;

○ 7일 및 37℃에서 5주 사이의 항원성 감소는 없음;

○ 25℃에서 24시간 후 ASO1은 ~30-40%의 항원성 증가를 유발한다

실시예 6

모노클로날 항체에 의한 RF1-에피토프(S)의 인지에 대한 모노티오글리세롤의 RTS,S에로의 고착(fixation)의 영향을 조사하기 위해, ELISA 저해 분석에 의한 RF1 복수(ascitic fluid)에 대한 RTS,S의 반응성을 RTS,S 액체 제형에서 측정하였는데, 상기 액체 제형은 TO(0시)에서, 또는 37℃에서 7일간 저장된 후 모노티오글리세롤(MTG)에 의해 안정화되거나 안정화되지 않았다(표 1 참조).

표 1

상기 표 1에서, 오직 2개의 샘플만 다른 샘플들보다 상당하게 더 잘 인지되는 RF1-에피토프를 가진다:

● RTS,S 정제된 벌크는 7일 동안 37℃에서 저장되었다;

● 모노티오글리세롤을 포함하지 않는 액체 제형 내의 RTS,S는 7일 동안 37℃에서 저장되었다.

이것은 상기 샘플내에서 구조적 변화가 발생하였고, RF1-에피토프의 접근성이 증가하였음을 의미한다. 이 결과는 혼합된 ELISA αCPS-αS의 결과(7일 동안 37℃에서 저장된 후 모노티오글리세롤이 없는 제형 내 RTS,S의 항원성의 증가)와 동시에 고려되어 져야 한다.

따라서 본 발명자들은 하기와 같은 결론을 내릴수 있다:

● 이 모노티오글리세롤은 TO에서 RF1-에피토프의 인지/접근성에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다("신선한" 정제된 벌크와 동일한 수준);

● 인지의 수준은 모노티오글리세롤을 함유하고 7일 동안 37℃에서 저장된 RTS,S 액체 제형 내에서 안정적으로 유지되었고, 이는 RTS,S 배좌가 모노티오글리세롤에 의해 안정화됨을 제시한다.

면역원성 데이타

실시예 7

몇가지 RTS,S 제형의 면역원성을 마우스에서 평가하고 비교하였다. 이 실험에서, RTS,S, ASO1, 50mM의 PO₄, NaCl 100mM, pH 6.1의 백신 제형을 3개의 다른 RTS,S 제형,

1) 만니톨-수크로오스 동결건조된 RTS,S(애쥬번트를 이용해 재구성됨),

2) 0.02%의 모노티오글리세롤을 함유한 액체 제형 및

3) 0.08%의 모노티오글리세롤을 함유한 액체 제형

(각각은 주입 전에 ASO1과 혼합됨)의 평가를 위한 기준으로 사용하였다.

그 중에서도, 액체 RTS,S 제형과 ASO1과의 혼합 후, 최종 모노티오글리세롤의 농도는 0.01 % 및 0.04 %이었다.

상이한 RTS,S 제형에 의해 유발된 체액성 및 세포성 면역 반응은 하기와 실시예 8에 각각 기재된 두개의 상이한 유형의 면역원성 실험으로 측정하였다.

마우스 체액성 면역 반응 실험

a. 도입

상이한 RTS,S 제형으로 면역화된 마우스에서 유발된 항-CS 및 항-HBs 항체 반응(전체 면역글로불린)을 평가하고 비교하였다.

b. 실험 설계

실험적 설계는, 현재의 생체 내 RTS,S/AS01 백신의 효능 검정으로부터의 설계, 즉, Balb/C 마우스 계통, 이 생체 내 효능 검정으로부터의 1회 복막 내 주입된 용량의 방출(0.25μg RTS, S) 및 면역화 후 28일째 혈청 내 항-CS&항-HBs 항체 반응(총 면역글로불린)의 ELISA에 의한 측정에 따랐다.

상기 실험의 샘플 크기를 한정하기 위해, ASO1 애쥬번트와 함께 제형화된 RTS,S로 수행된 생체 내 효능 실험으로부터 측정된, 항-CS 및 항-HBs 항체 반응의 변이성을 이용하였다. 이에 기초하여, 통계학자들은 (2개의 상이한 실험에서)한 그룹당 25마리의 마우스의 샘플 크기가 90.9%의 검증력(power)을 지닌 이원 분산 분석(two-way ANOVA)에서 그룹 평균 사이에 2-배 차이점을 검출시킬 수 있다고 결정하였다.

c. 결과

항-CS 혈청테스트(총 Ig)를 면역화 후 28일째 수집된 혈청을 이용하여 수행하였다. 50마리 마우스/그룹으로부터의 역가를 로그로 표현하였고 이를 도 10에 나타내었다.

항-CS 혈청테스트 결과와 관련된 통계학적 분석(Dunnett)을 표 4에 요약하였다.

표 4. 상이한 RTS ,S 제형 사이의 항- CS GMTs 의 통계학적 비교

상기 결과는 만니톨-수크로오스 동결건조(lyo) 또는 액체 RTS,S 제형에 의해 유발된 항-CS 총 Ig 반응이, MPL 및 QS21의 리포좀 애쥬번트 제형에서 제형화된 경우, RTS,S에 의해 유도된 것과 통계학적으로 상이하지 않음을 나타낸다(Ab 역가에서 2배의 차이를 검출하기 위한 92.7 %의 통계적 검증력).

항-HBs 혈청테스트(총 Ig)를 면역화 후 28일째 수집된 혈청을 이용하여 수행하였다. 50마리 마우스/그룹으로부터의 역가를 로그로 표현하였고 이를 도 11에 나타내었다.

항-HBs 혈청테스트 결과와 관련된 통계학적 분석(Dunnett)을 표 5에 요약하였다.

표 5. 개개의 대안적인 RTS ,S 제형 및 현재의 RTS ,S 제형 사이의 항- HBs GMTs의 통계학적 비교

상기 결과는 만니톨-수크로오스 동결건조 또는 액체 RTS,S 제형에 의해 유발된 항-HBs 총 Ig 반응이, MPL 및 QS21의 리포좀 애쥬번트 제형에서 제형화된 경우, RTS,S에 의해 유도된 것과 통계학적으로 상이하지 않음을 나타낸다(Ab 역가에서 2배의 차이점을 감지하기 위한 91.4 %의 통계적 검증력).

d. 결론

테스트된 세개의 대안적인 RTS,S 제형 모두는 마우스에서 항-CS 및 항-HBs 항체 반응을 유도하였다. 또한, 상기 통계학적 분석은 만니톨-수크로오스 RTS,S 동결건조, 액체 RTS,S 0.02 % 모노티오글리세롤 또는 MPL 및 QS21의 리포좀 제형에서 즉석에서 재구성된 액체 RTS,S 0.08 % 모노티오글리세롤에 의해 유발된 항-CS 및 항-HBs 항체 반응이 ASO1에서 재구성된 현재의 RTS,S 동결건조된 제형에 의해 유도된 것과 통계학적으로 유의하게 차이나지 않음을 나타내었다. 항-CS 및 항-HBs 항체 반응의 분석과 관련된 검증력은 2의 비율(본래 스케일, 즉 항체 역가) 또는 0.301의 차이(로그 스케일)를 나타내기 위해 각각 92.7 % 및 91.4 %이상이었다

실시예 8

마우스 세포성 면역 반응 실험:

a. 도입

이 2번째 유형의 실험에서, HBs 및 CS 항원에 대한 세포 매개 면역(CMI)반응을 HBs 및 CS 서열을 포함하는 펩티드 풀로 단시간 생체 외 자극 후 사이토카인을 발현하는 T 세포의 유세포 분석-기초 검출을 이용하여 측정하였다.

b. 실험적 설계

테스트된 그룹은 상기 실시예 7에 기재된 실험에서의 그룹과 동일하다. 그러나, 실험 설계는 상이하였는데, 즉, 항원-특이적 세포성 면역 반응에 평가를 겨냥한, 상기한 마우스의 면역원성 연구로부터의 프로토콜에 따라서, C57BL/6 마우스를 투여량 범위(5μg 및 2.5μg)의 ASO1 중의 RTS,S 항원으로 3회 근육내로 면역화시켰다. 이 실험을 2차례 실험하였고, 상기 샘플 크기를 유세포 분석-기초 분석을 수행하는데 충분한 세포가 수집되도록 결정하였다. 실제로, 각 그룹내에서, CMI 분석을 4마리의 마우스(즉, 3 풀/그룹)로 수집된(pooled) 혈액세포에서 실시하였다. 이 판독은 탐색적인 것으로써 고려되었는데, 그 이유는 실험 당 그룹당 이용가능한 세 개의 값(풀)만으로는 결론을 도출해낼 수 없었기 때문이며, 또한 이러한 세포-기반 분석의 잘 알려진 변이성 때문이다.

c. 결론

3회 면역화 후 7일째의 상기 CS-특이적 및 HBs-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 도 12, 13, 14 및 15에 나타내었다.

각 그래프 내 삼각형은 (i) CS 또는 HBs 서열을 포함하는 펩티트 풀로 말초 혈액 림프구의 체외에서 활성화 후, 4마리의 마우스의 풀로부터의 반응을 나타내고, (ii) 생체외 활성화에 사용된 펩티드 풀에 응하여, IL-2 및/또는 IFN-감마를 생산하는 CD4 또는 CD8 T 세포의 퍼센트를 나타낸다.

이 결과는 CS- 및 HBs-특이적 CD4 T 세포 반응은 테스트된 모든 RTS,S 제형에 의해 유발됨을 나타낸다. 이 항원-특이적 CD4 T 세포 반응은, 면역화를 위해 사용된 RTS,S & ASO1(현재 동결건조된 제형), RTS,S 만니톨-수크로오스 동결건조, 0.02% 또는 0.08% 모노티오글리세롤(MTG)을 포함하는 액체 RTS,S 모두에서 거의 동등하다(반응은 테스트된 모든 용량에서 유사하다).

상기 결과는 CS- 및 HBs-특이적 CD8 T 세포 반응은 테스트된 모든 RTS,S 제형에 의해 유발됨을 나타낸다. 이 항원-특이적 CD8 T 세포 반응은, RTS,S & ASO1(현재 동결건조된 제형), RTS,S 만니톨-수크로오스 동결건조, 0.02% 또는 0.08% 모노티오글리세롤(MTG)을 포함하는 액체 RTS,S 모두에서 거의 동등하다(반응은 테스트된 모든 용량에서 유사하다). 그 중에서도, 액체 RTS,S 제형이 테스트된 두개의 용량에서(2.5 & 5μg) Ag-특이적 CD8 T 세포의 더 높은 퍼센트를 유도하는 경향이 있다. 그러나, 상기 언급하였듯이, 이 판독은 탐색적인 것으로써 고려되었는데, 그 이유는 실험 당 그룹당 이용가능한 세 개의 값(풀)만으로는 결론을 도출해낼 수 없었기 때문이며, 또한 이러한 세포-기반 분석의 잘 알려진 변이성 때문이다.

d. 결론

RTS,S 만니톨-수크로오스 동결건조, 액체 RTS,S 0.02% 모노티오글리세롤 및 액체 RTS,S 0.08 % 모노티오글리세롤에 의해 유발된, CS- 및 HBs-특이적 CD4 및 CD8 T 세포 반응은 ASO1에서 재구성된 경우, 현재의 RTS,S 동결건조된 제형에 의해 유발된 것과 거의 동등하다.

참고문헌

서열목록

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A. <120> Vaccines for Malaria <130> VB62679WO <150> US61/015762 <151> 2007-12-21 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 1 Lys Leu Lys Gln Pro 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 2 Cys Ser Val Thr Cys Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 3 Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 4 Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 5 Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Ala Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 6 Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gln Pro Ala 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 7 Gly Asp Gly Ala Ala Gly Gln Pro Ala 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 8 Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Ala Ala 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 9 Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gln Ala Ala 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 10 Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 11 Gly Gly Asn Ala Ala Asn Lys Lys Ala Glu Asp Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the hybrid protein CSV of Plasmodium Vivax (optimised for expression in E. Coli) <400> 12 acacattgcg gacataatgt agatttatct aaagctataa atttaaatgg tgtaaacttc 60 aataacgtag acgctagttc actcggggct gcgcacgtag gtcagtctgc tagcaggggg 120 cgcggtctcg gggaaaaccc agacgacgaa gaaggtgatg ctaaaaagaa aaaggacggt 180 aaaaaagcgg aaccaaaaaa tccaagggaa aataaattaa aacagcccgg ggatcgcgcg 240 gatggtcaag cggcgggtaa tggggcgggg ggtcaaccag cgggggatcg cgcggctggt 300 cagccagcgg gggatcgcgc ggctggtcag ccagcggggg atggtgcggc tggccaacca 360 gcgggggatc gcgcggatgg tcagccagcg ggggatcgcg cggatggtca accagccggt 420 gatcgcgcgg ctggccaagc ggccggtaat ggggcggggg gtcaagcggc cgcgaacgga 480 gcggggaacc agccaggcgg cggtaacgct gcgaataaaa aagcggaaga tgcgggtggt 540 aacgcgggcg gtaatgcggg cggccaaggt cagaacaacg aaggggctaa tgcaccaaac 600 gaaaaatctg tcaaagaata tctcgataaa gtccgcgcta cagtagggac agaatggacg 660 ccatgctctg taacatgtgg tgtcggggta cgcgtgcgcc gccgtgtcaa tgcggctaac 720 aaaaaaccag aagatctcac gttaaatgat ctcgaaacgg atgtctgcac a 771 <210> 13 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the hybrid protein CSV of Plasmodium Vivax <400> 13 Thr His Cys Gly His Asn Val Asp Leu Ser Lys Ala Ile Asn Leu Asn 1 5 10 15 Gly Val Asn Phe Asn Asn Val Asp Ala Ser Ser Leu Gly Ala Ala His 20 25 30 Val Gly Gln Ser Ala Ser Arg Gly Arg Gly Leu Gly Glu Asn Pro Asp 35 40 45 Asp Glu Glu Gly Asp Ala Lys Lys Lys Lys Asp Gly Lys Lys Ala Glu 50 55 60 Pro Lys Asn Pro Arg Glu Asn Lys Leu Lys Gln Pro Gly Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Gly Gln Ala Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gln Pro Ala Gly Asp 85 90 95 Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala 100 105 110 Gly Asp Gly Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln 115 120 125 Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Ala 130 135 140 Gly Gln Ala Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gln Ala Ala Ala Asn Gly 145 150 155 160 Ala Gly Asn Gln Pro Gly Gly Gly Asn Ala Ala Asn Lys Lys Ala Glu 165 170 175 Asp Ala Gly Gly Asn Ala Gly Gly Asn Ala Gly Gly Gln Gly Gln Asn 180 185 190 Asn Glu Gly Ala Asn Ala Pro Asn Glu Lys Ser Val Lys Glu Tyr Leu 195 200 205 Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys Ser Val 210 215 220 Thr Cys Gly Val Gly Val Arg Val Arg Arg Arg Val Asn Ala Ala Asn 225 230 235 240 Lys Lys Pro Glu Asp Leu Thr Leu Asn Asp Leu Glu Thr Asp Val Cys 245 250 255 Thr <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 14 Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln Pro Gly 1 5 <210> 15 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for the hybrid protein CSV of Plasmodium vivax (optimised for expression in yeast) <400> 15 acccattgtg gtcacaatgt cgatttgtct aaggccatta acttgaacgg tgttaatttc 60 aacaacgtcg atgcttcttc tttaggtgcc gctcatgttg gtcaatctgc ttcaagaggt 120 agaggtttag gtgaaaaccc agacgacgaa gaaggtgacg ctaagaagaa gaaggacggt 180 aagaaggccg aaccaaagaa cccaagagaa aacaagttga aacaaccagg tgacagagcc 240 gacggacaag cagctggtaa tggtgctgga ggtcaaccag ctggtgacag agctgccggt 300 cagcctgctg gtgatagagc tgctggacaa cctgctggag acggtgccgc cggtcaacct 360 gctggtgata gagcagacgg acaaccagct ggtgaccgtg ctgacggaca gccagccggc 420 gatagggctg caggtcaagc cgctggtaac ggtgccggtg gtcaagctgc tgctaacggt 480 gctggtaacc aaccaggtgg tggtaacgct gccaacaaga aagctgaaga cgctggtggt 540 aatgctggag gtaatgcagg tggtcagggt caaaacaacg aaggtgctaa cgctccaaac 600 gaaaagtctg ttaaggaata cttagataag gttagagcta ctgtcggtac tgaatggact 660 ccatgttctg ttacttgtgg tgtcggtgtt agagttagaa gaagagttaa cgccgctaac 720 aagaagccag aagacttgac tctaaacgac ttggaaactg acgtttgtac t 771 <210> 16 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for the hybrid fusion protein CSV-S <400> 16 atgatggctc ccgggaccca ttgtggtcac aatgtcgatt tgtctaaggc cattaacttg 60 aacggtgtta atttcaacaa cgtcgatgct tcttctttag gtgccgctca tgttggtcaa 120 tctgcttcaa gaggtagagg tttaggtgaa aacccagacg acgaagaagg tgacgctaag 180 aagaagaagg acggtaagaa ggccgaacca aagaacccaa gagaaaacaa gttgaaacaa 240 ccaggtgaca gagccgacgg acaagcagct ggtaatggtg ctggaggtca accagctggt 300 gacagagctg ccggtcagcc tgctggtgat agagctgctg gacaacctgc tggagacggt 360 gccgccggtc aacctgctgg tgatagagca gacggacaac cagctggtga ccgtgctgac 420 ggacagccag ccggcgatag ggctgcaggt caagccgctg gtaacggtgc cggtggtcaa 480 gctgctgcta acggtgctgg taaccaacca ggtggtggta acgctgccaa caagaaagct 540 gaagacgctg gtggtaatgc tggaggtaat gcaggtggtc agggtcaaaa caacgaaggt 600 gctaacgctc caaacgaaaa gtctgttaag gaatacttag ataaggttag agctactgtc 660 ggtactgaat ggactccatg ttctgttact tgtggtgtcg gtgttagagt tagaagaaga 720 gttaacgccg ctaacaagaa gccagaagac ttgactctaa acgacttgga aactgacgtt 780 tgtactcccg ggcctgtgac gaacatggag aacatcacat caggattcct aggacccctg 840 ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc gcagagtcta 900 gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct tggccaaaat 960 tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg tcctggttat 1020 cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct atgcctcatc 1080 ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct aattccagga 1140 tcaacaacaa ccaatacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca aggcaactct 1200 atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg tattcccatc 1260 ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg tttctcttgg 1320 ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtttggctt 1380 tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt gagtcccttt 1440 ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaa 1485 <210> 17 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for the hybrid fusion protein CSV-S <400> 17 Met Met Ala Pro Gly Thr His Cys Gly His Asn Val Asp Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ile Asn Leu Asn Gly Val Asn Phe Asn Asn Val Asp Ala Ser Ser 20 25 30 Leu Gly Ala Ala His Val Gly Gln Ser Ala Ser Arg Gly Arg Gly Leu 35 40 45 Gly Glu Asn Pro Asp Asp Glu Glu Gly Asp Ala Lys Lys Lys Lys Asp 50 55 60 Gly Lys Lys Ala Glu Pro Lys Asn Pro Arg Glu Asn Lys Leu Lys Gln 65 70 75 80 Pro Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Ala Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly 85 90 95 Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala 100 105 110 Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp 115 120 125 Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala 130 135 140 Gly Asp Arg Ala Ala Gly Gln Ala Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gln 145 150 155 160 Ala Ala Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Gly Gly Asn Ala Ala 165 170 175 Asn Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gly Gly Asn Ala Gly Gly Asn Ala Gly 180 185 190 Gly Gln Gly Gln Asn Asn Glu Gly Ala Asn Ala Pro Asn Glu Lys Ser 195 200 205 Val Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp 210 215 220 Thr Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly Val Gly Val Arg Val Arg Arg Arg 225 230 235 240 Val Asn Ala Ala Asn Lys Lys Pro Glu Asp Leu Thr Leu Asn Asp Leu 245 250 255 Glu Thr Asp Val Cys Thr Pro Gly Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile 260 265 270 Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe 275 280 285 Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp 290 295 300 Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn 305 310 315 320 Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile 325 330 335 Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu 340 345 350 Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr 355 360 365 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr 370 375 380 Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser 385 390 395 400 Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr 405 410 415 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu 420 425 430 Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 435 440 445 Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp 450 455 460 Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe 465 470 475 480 Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 485 490 <210> 18 <211> 3509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucelotide sequence for an RTS expression cassette <400> 18 aagcttacca gttctcacac ggaacaccac taatggacac aaattcgaaa tactttgacc 60 ctattttcga ggaccttgtc accttgagcc caagagagcc aagatttaaa ttttcctatg 120 acttgatgca aattcccaaa gctaataaca tgcaagacac gtacggtcaa gaagacatat 180 ttgacctctt aactggttca gacgcgactg cctcatcagt aagacccgtt gaaaagaact 240 tacctgaaaa aaacgaatat atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta 300 atgacgcgga ggccaaggca aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt 360 gaataaaaaa cacgcttttt cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga 420 atacgtaaat aattaatagt agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa attagccttt 480 taattctgct gtaacccgta catgcccaaa atagggggcg ggttacacag aatatataac 540 atcgtaggtg tctgggtgaa cagtttatcc ctggcatcca ctaaatataa tggagctcgc 600 ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc 660 aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag 720 gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac 780 aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat taccttctgc 840 tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg aaattattcc 900 cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct gtaaatctgt 960 aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta 1020 aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaaatga tggctcccga 1080 tcctaatgca aatccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca aacgcaaacc ccaatgcaaa 1140 tcctaatgca aaccccaatg caaatcctaa tgcaaatcct aatgccaatc caaatgcaaa 1200 tccaaatgca aacccaaacg caaaccccaa tgcaaatcct aatgccaatc caaatgcaaa 1260 tccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaacccc aatgcaaatc ctaataaaaa 1320 caatcaaggt aatggacaag gtcacaatat gccaaatgac ccaaaccgaa atgtagatga 1380 aaatgctaat gccaacaatg ctgtaaaaaa taataataac gaagaaccaa gtgataagca 1440 catagaacaa tatttaaaga aaataaaaaa ttctatttca actgaatggt ccccatgtag 1500 tgtaacttgt ggaaatggta ttcaagttag aataaagcct ggctctgcta ataaacctaa 1560 agacgaatta gattatgaaa atgatattga aaaaaaaatt tgtaaaatgg aaaagtgctc 1620 gagtgtgttt aatgtcgtaa atagtcgacc tgtgacgaac atggagaaca tcacatcagg 1680 attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac 1740 aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat tttctagggg gatcacccgt 1800 gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc 1860 aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcgcgtttta tcatattcct cttcatcctg 1920 ctgctatgcc tcatcttctt attggttctt ctggattatc aaggtatgtt gcccgtttgt 1980 cctctaattc caggatcaac aacaaccaat acgggaccat gcaaaacctg cacgactcct 2040 gctcaaggca actctatgtt tccctcatgt tgctgtacaa aacctacgga tggaaattgc 2100 acctgtattc ccatcccatc gtcctgggct ttcgcaaaat acctatggga gtgggcctca 2160 gtccgtttct cttggctcag tttactagtg ccatttgttc agtggttcgt agggctttcc 2220 cccactgttt ggctttcagc tatatggatg atgtggtatt gggggccaag tctgtacagc 2280 atcgtgagtc cctttatacc gctgttacca attttctttt gtctctgggt atacatttaa 2340 cgaattccaa gctgaaacaa ttcaaaggtt ttcaaatcaa tcaagaactt gtctctgtgg 2400 ctgatccaaa ctacaaattt atgcattgtc tgccaagaca tcaagaagaa gttagtgatg 2460 atgtctttta tggagagcat tccatagtct ttgaagaagc agaaaacaga ttatatgcag 2520 ctatgtctgc cattgatatc tttgttaata ataaaggtaa tttcaaggac ttgaaataat 2580 ccttctttcg tgttcttaat aactaatata taaatacaga tatagatgca tgaataatga 2640 tatacattga ttattttgca atgtcaatta aaaaaaaaaa atgttagtaa aactatgtta 2700 cattccaagc aaataaagca cttggttaaa cgaaattaac gtttttaaga cagccagacc 2760 gcggtctaaa aatttaaata tacactgcca acaaattcct tcgagttgtc caatttcacc 2820 acttttatat tttcatcaac ttcagcagat tcaaccttct cacatagaac attggaataa 2880 acagccttaa caccactttc aagtttgcac agcgtaatat gaggaatttt gttttgacaa 2940 cacaaccctt taattttctc attgttttca tcaattatgc atccatcttt atctttagac 3000 agttccacta caatagcaat agttttttca tcccaacata gtttttcgag cctaaaattc 3060 agtttgtcgg tcgttttacc tgcgtatttt ggttattacc agagccttgt gcattttcta 3120 tgcggttgtt attgtactcc gttatctggt cagtgtatct gttacaatat gattccacaa 3180 cttttttgcc tctttttcac gggacgacat gacatgacct aatgttatat gaagttcctt 3240 ctgaactttt ccactagcta gtaaatgctt gaatttctca gtcagctctg catcgctagc 3300 aatacacctc ttgaccaatc aataatttca tcgtagtttt ctatttagct gagatatatg 3360 taggtttaat taacttagcg ttttttgttg attattgttg cctttaccaa ctatttttct 3420 cacagtaggt ttgtaatcta agctccttct gaacgctgtc tcaatttcat catctttcgg 3480 gatctctggt accaaaattg gataagctt 3509 <210> 19 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Predicted translation product of the RTS-HBsAg hybrid protein <400> 19 Met Met Ala Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 20 25 30 Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 35 40 45 Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 50 55 60 Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala 65 70 75 80 Asn Pro Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro 85 90 95 Asn Asp Pro Asn Asp Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala 100 105 110 Asn Asn Ala Val Lys Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His 115 120 125 Ile Glu Gln Tyr Leu Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile Ser Thr Glu Trp 130 135 140 Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys 145 150 155 160 Pro Gly Ser Ala Asn Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Glu Asn Asp 165 170 175 Ile Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn 180 185 190 Val Val Asn Ser Arg Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly 195 200 205 Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr 210 215 220 Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu 225 230 235 240 Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser 245 250 255 Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly 260 265 270 Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu 275 280 285 Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met 290 295 300 Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly 305 310 315 320 Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro 325 330 335 Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro 340 345 350 Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser 355 360 365 Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe 370 375 380 Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp 385 390 395 400 Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu 405 410 415 Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 420 425 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide - CpG1826 <400> 20 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide - CpG 1758 <400> 21 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide <400> 22 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide - CpG 2006 <400> 23 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide - CpG 1668 <400> 24 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligonucleotide - CpG 5456 <400> 25 tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22

Claims

하기를 포함하는 말라리아 백신용 성분:
a) 면역원성 입자 RTS,S 및/또는
b) 1개 이상의 삼일열원충(P. vivax) 균주의 CS 단백질에서 유래된 면역원성 입자 및 B형 간염균(Hepatitis B)으로부터의 S 항원 및 임의로 비융합된 S 항원, 또는
c) RTS, CSV-S 및 임의로 비융합된 S 항원을 포함하는 면역원성 입자, 및
d) 1개 이상의 티올 작용기를 지닌 안정화제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 안정화제.
제 1항에 있어서, 상기 안정화제가 N-아세틸 시스테인, 모노티오글리세롤, 시스테인, 환원된 글루타치온 및 티오글리콜산 나트륨 또는 이들의 혼합물인, 성분.
제 2항에 있어서, 상기 안정화제가 모노티오글리세롤, 시스테인 또는 이들의 혼합물인, 성분.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분이 액체 제형인, 성분.
제 4항에 있어서, 상기 액체 제형의 pH가 약 6.5 내지 7.2인, 성분.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 동결건조된, 성분.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제가 시스테인이고, 0.1 및 1.0% w/w 범위로 존재하는, 성분.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제가 제형 내에서 0.01 내지 l% w/w 범위로 존재하는, 모노티오글리세롤인, 성분.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분이 유리 바이알(vial)에 저장되는, 성분.
제 9항에 있어서, 상기 유리 바이알이 갈색(amber)인, 성분.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 유리 바이알이 실리콘 처리된, 성분.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 유리 바이알이 실리콘처리되지 않은, 성분.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분이 애쥬번트 성분을 제외한 주사(injection) 1회 용량(dose)에 대한 요소(elements)를 포함하는, 성분.
제 13항에 있어서, 상기 1회 용량이 25μg의 RTS,S를 포함하는, 성분.
제 14항에 있어서, 2.25mg의 염화나트륨을 추가로 포함하는, 성분.
제 14항 또는 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 125μg의 모노티오글리세롤을 추가로 포함하는, 성분.
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 250μL의 주사용 수(water for injection)를 추가로 포함하는, 성분.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분이 애쥬번트 성분을 제외한 주사용 2 용량에 대한 요소를 포함하는, 성분.
제 1항 내지 제 12항 또는 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1회 용량이 50μg의 RTS,S를 포함하는, 성분.
제 19항에 있어서, 4.5mg의 염화나트륨을 추가로 포함하는, 성분.
제 19항 또는 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 250μg의 모노티오글리세롤을 추가로 포함하는, 성분.
제 1항 내지 제 12항 또는 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 500μL의 주사용 수를 추가로 포함하는, 성분.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 말라리아 항원을 추가로 포함하는, 성분.
제 23항에 있어서, 상기 추가 말라리아 항원이 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 것으로, 상기 항원이 DBP, 예컨대 DBP의 Pv RII 수용체 결합 도메인, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA, RBP 또는 이의 단편, PfEMP-1, Pfs 16 항원, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 및 TRAP, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린, Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 및 다른 플라스모디움종 내의 이들의 유사체(analogues) 중에서 선택된 것인, 성분.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에서 정의된 성분 및 하기에서 선택된 애쥬번트를 포함하는 말라리아 백신:
a. QS21 및 3D-MPL을 포함하는 수중유(an oil in water) 제형, 또는
b. QS21 및 3D-MPL을 포함하는 리포좀 제형.
적합한 숙주 내에서 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 단계, 발현 산물을 회수하는 단계 및 회수된 산물을 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에서 정의된 성분의 제조 방법.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에서 정의된 말라리아 백신의 성분 또는 말라리아의 치료 또는 예방을 위한 제 25항에서 정의된 백신.
말라리아의 치료 또는 예방용 약제(medicament)의 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에서 정의된 성분 또는 제 25항에서 정의된 백신의 용도.
제 25항에서 정의된 백신의 유효량을 투여함으로서, 플라스모디움 감염에 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 방법.