CN101522212A - 用于疟疾的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及源自间日疟原虫(P.vivax)CS蛋白的新的杂合/融合蛋白，制备和纯化其的方法，其用于药物中的用途，特别是在预防疟疾感染，例如由间日疟原虫引起的那些感染中的用途，包含该蛋白或抗该蛋白的抗体例如单克隆或多克隆抗体的组合物/疫苗，及其用途，特别是在治疗中的用途。本发明还涉及所述杂合蛋白的脂蛋白颗粒和包含其的制剂/疫苗和其用途。特别地，本发明涉及免疫原性杂合融合蛋白，其包含：a.源自间日疟原虫I型环子孢子蛋白的重复区域的至少一个重复单位，b.源自间日疟原虫的II型环子孢子蛋白的重复区域的至少一个重复单位，和c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S或其片段。

Description

用于疟疾的疫苗

本发明涉及新的杂合/融合蛋白，用于制备和纯化其的方法，它在药物中的用途，特别是在预防疟疾感染，例如由间日疟原虫(Plasmodium vivax)(P.vivax))引起的那些感染中的用途，包含该蛋白或抗该蛋白的抗体例如单克隆或多克隆抗体的组合物/疫苗和其用途，特别是在治疗中的用途。本发明还涉及所述杂合/融合蛋白的脂蛋白颗粒和包含其的制剂/疫苗及其用途。

疟疾是一种世界主要健康问题，每年超过2到4百万的人死于该疾病。这种疾病最流行的形式之一是由原生动物寄生虫间日疟原虫(P.vivax)引起的，其在热带和亚热带区域发现。令人感兴趣的是该寄生虫可在15℃的温度下完成它的蚊子周期，这允许疾病在温和的气候中传播。

间日疟原虫的生活周期是复杂的，为完成需要两种宿主，人和蚊子。人的感染起始于子孢子引入被感染的蚊子的唾液。子孢子迁移到肝并且在那里感染肝细胞，在那里它们通过红细胞外细胞内阶段分化为裂殖子阶段，其感染红血细胞(RBC)以起始在无性血阶段的循环复制。这一循环通过RBC中的大量裂殖子分化为有性阶段配子母细胞而完成，其被蚊子摄取，在那里它们发育经过中肠中的一系列阶段以产生迁移入唾液腺的子孢子。

由于由间日疟原虫引起的疾病很少是致命的的事实，预防和治疗疟疾的努力集中于由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(P.falciparum))引起的更致命形式的疾病。

尽管由间日疟原虫引起的疾病通常不导致患者的死亡，由于病例的数量，其看起来是逐渐增长的，对于患者生命质量的显著影响，导致贫血症和死亡的疾病的严重发生的渐增的报道，和经济影响，仍然需要用于该疾病的有效的接种。

间日疟原虫的特征是一些株能够通过在进入外周循环显示出临床症状之前保持潜伏在肝中导致延迟的感染。因此个体，例如当旅游经过受感染区域，可能被感染并且几个月内不显示出症状。这具有导致疾病的扩散的潜能，并且由于此原因旅行到受感染区域的人在旅行到受感染区域之后的限定的时期内不允许捐赠用于输血的血液。

当寄生虫经历pre-erthrocytic shizogony时，间日疟原虫疟疾感染保持潜伏在肝中。如果该寄生虫控制在此阶段，在它逃离肝之前，在患者中没有观察到疾病的临床症状。

间日疟原虫的子孢子阶段已被鉴定为疟疾疫苗的潜在靶标。用失活的(照射的)子孢子接种已经显示出诱导针对试验的人疟疾的保护(Am.J，Trop.Med.Hyg 24：297-402，1975)。然而，利用照射的子孢子制备基于此方法的用于普通人群的疟疾疫苗在实际上和逻辑上是不可能的。

子孢子的主要表面蛋白称作环子孢子蛋白(CS蛋白)。它被认为在它从蚊子接种的起始位点传代到循环的过程中涉及子孢子的运动和侵入，在那里它迁移到肝。

疟原虫种的CS蛋白特征为中央重复域(重复区域)，侧翼连接非重复氨基片段(N-末端)和羧基片段(C-末端)。间日疟原虫的中央区域由几段通常为9个串联氨基酸的重复单位组成。

在某些亚洲株中，在中央重复区域之后，存在大约12个氨基酸的另外的序列(见SEQ ID No：11)。后者的功能是未知的。然而，一些人假定所述氨基酸可能与疾病临床症状的延迟出现有关，尽管这还没有被研究。据认为N-末端特征为称作区域I的5个氨基酸的序列(见SEQ ID No：1)。还认为C-末端特征为包含称作区域II的18个氨基酸的序列。后者包含细胞粘附基序，其在所有疟疾CS蛋白中是高度保守的(见SEQ ID No：2)。

几个组已经建议了基于环子孢子蛋白的亚单位疫苗。两种这些疫苗已经经历了临床测试：一个是合成肽，另一是重组蛋白(Ballou等，Lancet：i 1277(1987)和Herrington等，Nature 328：257(1987))。这些疫苗在刺激抗-子孢子响应中是成功的。但是，响应的大小是令人失望的，一些疫苗根本不产生响应。而且，缺少对接下来的感染的抗体水平的“加强”和体外淋巴细胞增殖测定的结果显示了大多数这些自愿者的T-细胞不识别免疫显性重复区域。然而，每个研究中一个接种的自愿者没有发展出寄生虫血症。

WO 93/10152和WO 98/05355描述了源自恶性疟原虫的CS蛋白的疫苗，并且看起来利用本文所述方法对于抗恶性疟原虫的疫苗取得了一些进展，还可见Heppner等，2005，Vaccine 23，2243-50。

恶性疟原虫中的CS蛋白具有保守的中央重复区域。对比之下，对于间日疟原虫已知至少两种形式的CS蛋白(称作VK210或I型和VK247或II型)。这使得鉴定具有所有期望性质例如免疫原性的CS蛋白的构建体是更困难的，所述构建体提供针对间日疟原虫的一般保护而不论CS蛋白的特定类型，因为针对I型的中央重复区域的抗体不必然识别II型的对应区域的表位，反之亦然。

重组间日疟原虫CS蛋白在1980-1990′s有限成功地作为疫苗被表达和测试(Collins等，1989.Am.J.Trop.Med.Hyg.40，455-64)。已经进行了利用交联的一种或多种表位发展基于多抗原肽(MAP)的疫苗的一些工作(Nardelli和Tarn，1995，Pharm.Biotechnol.6，803-19)。

本发明提供了用于疟疾疫苗的新的，改进的抗原，其据信产生体液应答并且还有细胞免疫应答。抗原/颗粒据信诱导抗I型和II型CS蛋白的抗体的产生。抗原/颗粒还可诱导T辅助细胞，例如Th1和/或Th2细胞。

相应地，本发明提供了免疫原性杂合融合蛋白，其包含：

a.源自间日疟原虫I型环子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，

b.源自间日疟原虫II型环子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，和

c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S。

序列表

SEQ ID No：1                 N-末端中的I区(上述)

SEQ ID No：2                 来自C-末端中的II区的基序(上述)

SEQ ID No：3-9               I型CS蛋白的不同单体

SEQ ID No：10                来自II型CS蛋白的主要单体

SEQ ID No：11                发现于亚洲株的另外的氨基酸

SEQ ID No：12                杂合蛋白的核苷酸序列

                             (为在大肠杆菌(E.Coli)中表达而最优化)

SEQ ID No：13                杂合蛋白CSV的氨基酸序列

SEQ ID No：14                来自II型CS蛋白的次要单体

SEQ ID No：15                杂合蛋白CSV的核苷酸序列

                             (为在酵母中表达而最优化)

SEQ ID No：16                杂合融合蛋白CSV-S的核苷酸序列

SEQ ID No：17                杂合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列

SEQ ID No：18                RTS表达盒和预测的RTS，S蛋白的核苷酸序列

SEQ ID No：19                杂合融合基因CSV-S的核苷酸序列

                             (克隆pHIL-D2整合性巴斯德毕赤酵

                             母(Pichia pastoris)表达载体内)

SEQ ID No：20                在巴斯德毕赤酵母中表达的杂合融合蛋白

                             CSV-S的氨基酸序列

SEQ ID No：21                图12所示的是全长重组CSV-S蛋白和截

                             短蛋白的序列比较

附图

图1  显示了在酵母株酿酒酵母(S.cerevisiae)(具有组成型启动子)中产生的本发明的杂合蛋白的多聚体脂蛋白颗粒的电子显微照片。

图2  本发明杂合蛋白和比较蛋白(凝胶的部分)的western印迹。

图2a 本发明杂合蛋白和比较蛋白(图2全部凝胶，其中图2中的1，2和3道是图2a中的1，2和8道)的western印迹。

图3  用于将编码CSV-S融合蛋白的序列导入酵母宿主细胞的pRIT15546重组载体的质粒图谱(游离型载体)。

图4  用于形成期望的抗原与来自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白的GSK制备的pGF1-S2质粒的质粒图谱。

在SmaI位点之间克隆异源DNA序列(在切除12bp SmaIDNA片段之后)产生与S基因的符合读框的融合。

图5  用于形成期望的抗原与来自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白的Prit 15607的质粒图谱。用NotI消化释放了携带附加了HIS4选择标记的CSV-S表达盒的6.8kb的线性DNA片段，其用于插入酵母染色体。

图6  显示了在Y1840中表达的重组蛋白的western印迹。

图7  显示了在巴斯德毕赤酵母(一种“非常规”酵母，甲基营养酵母，其中重组表达被甲醇可诱导启动子驱动)中产生的本发明的杂合蛋白的多聚体脂蛋白颗粒的电子显微照片。

CSV-S颗粒从可溶提取物(基于RTS，S纯化方法)中纯化并且进行电子显微镜法分析。用磷钨酸阴性染色之后，颗粒显现。大小为100nm。

图8  pRIT15582的质粒图谱。

用XhoI消化释放了携带附加了LEU2选择标记的CSV-S表达盒的8.5kb线性DNA片段，其用于插入酵母染色体。

图9  用于整合CSV-S盒的线性XhoI片段的限制性图谱。

图10 在Y1835株中表达的重组蛋白的western印迹。

A组：用抗-S抗体显示的WB

装载的样品(100μg总蛋白/孔)：

1：Y1631(RTS，S生产株，作为对比)

2：Y1835

3：Y1835

4：Y1834

B组：用抗-CSV抗体显示的WB

装载的样品(100μg总蛋白/孔)：

1：Y1631(RTS，S生产株，作为对比)

2：Y1295

3：Y1835

4：Y1834

5：nr(另一构建体CSVS)

6：nr(另一构建体-仅仅S抗原)

图11 在Y1835株中产生的CSV-S，S混合颗粒的电子显微照片。

CSV-S，S颗粒从可溶细胞提取物中纯化(基于RTS，S纯化方法)并且进行电子显微镜法分析。在用磷钨酸阴性染色之后，颗粒显现。大小为100nm。

图12 显示了重组全长CS蛋白和CS蛋白截短形式(CSVtr-S)的对比。

本文的杂合蛋白指源自间日疟原虫I型和II型的蛋白。

本文的杂合融合蛋白指融合于另一蛋白的源自间日疟原虫I型和II型的蛋白或其片段。

在一个方面，本发明的杂合融合蛋白包含源自间日疟原虫的CS蛋白(CSV)的杂合蛋白和来自乙型肝炎的表面抗原，通常是称为S抗原的主要表面蛋白，例如源自adw血清型的S抗原。

本发明的CSV源的抗原成分(即，杂合蛋白)通常融合于S蛋白的氨基末端。更特别地，CSV片段的C末端与所述S抗原的N末端融合。

据信来自乙型肝炎的表面抗原的存在加强了杂合蛋白的CS蛋白部分的免疫原性，酸稳定性，和/或辅助蛋白的可复制的生产。

通常杂合蛋白还包含来自疟原虫例如间日疟原虫(I型或II型)的CS蛋白的N末端片段，例如包含I区如SEQ ID No.1所示氨基酸的片段。

替代地，杂合蛋白可包含来自恶性疟原虫CS蛋白的N-末端片段。

在一个方面，杂合蛋白可包含来自恶性疟原虫中央区域的一个或多个重复单位。例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或更多个重复单位。

通常，杂合蛋白还将包含来自疟原虫例如间日疟原虫(I或II型)的CS蛋白的C-末端片段，例如包含II区例如SEQ ID No：2所示的片段。

替代地，杂合蛋白可包含来自恶性疟原虫CS蛋白的C-末端片段。

虽然不希望被理论所束缚，据认为N和C末端片段包括几种T和B细胞表位。

在重组蛋白中，通常非天然氨基酸在克隆程序中引入并且在最后的表达蛋白中观察到。例如几个如1，2，3，4或5个氨基酸可在蛋白的起始(N-末端)插入。如果4个氨基酸在蛋白的起始插入，它们可以例如是MMAP。另外地，或者替代地，1，2或3例如1个氨基酸可在大约氨基酸259，260，261或262插入蛋白体/中间。氨基酸插入可以是具有标记符号P的氨基酸。在一个方面，利用的蛋白不包括通过克隆方法在蛋白体/中间插入的任何氨基酸。

本发明还延伸到所谓的杂合蛋白的“截短”形式，例如图2所示并且标记为CSVtr-S。

因此本发明提供了截短的杂合蛋白，其中至少发现于CS蛋白N-末端的精氨酸富集区(大约氨基酸60)被去除/删除。

在一个方面，本发明提供了截短的杂合蛋白，其中至少氨基酸1到55(或1到56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70)被删除。截短的杂合蛋白可包括在蛋白的起始的多至4个氨基酸的插入例如MMAP。

在一个方面，本发明涉及杂合蛋白，其排除了全长重组蛋白的氨基5到64(包含端点)。

这种/这些截短的杂合蛋白可用于下述本发明的其他方面。

任何适当的间日疟原虫株可用于本发明，包括：拉丁间日疟原虫株，美洲/南美(即Sal 1，Belem)间日疟原虫株，韩国间日疟原虫株，中国间日疟原虫株，泰国间日疟原虫株，印尼间日疟原虫株，印度间日疟原虫株和越南间日疟原虫株。SEQ ID No 13中的构建体基于韩国株(更特别地南韩株)。

具有I型CS蛋白的间日疟原虫比具有II型CS蛋白的间日疟原虫更流行。因此在本发明的一个方面，比II型重复单位更多的来自I型的重复单位被包括在杂合体中。

更特别地，本发明的杂合蛋白可包括来自I型的1到15个重复单位例如9个重复单位。

来自I型CS蛋白的适当的单体的例子在SEQ ID NoS：3到9中给出。

在一个实施方式中，本发明提供了包含不同的I型重复单位，例如SEQ ID NoS 3到9所列每种中的一种的混合体的杂合蛋白SEQ IDNo。

一个或多个重复单位可在杂合体中复制，例如SEQ ID No 3和/或4的两种单体可并入构建体中。

a)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 3的单位。

b)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 4的单位，任选与上述a)段所述的单位组合。

c)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 5的单位，任选与上述a)或b)段所述的单位组合。

d)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 6的单位，任选与上述a)到c)段所述的一个或多个单位组合。

f)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 7的单位，任选与上述a)到d)段所述的一个或多个单位组合。

g)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 8的单位，任选与上述a)到f)段所述的一个或多个单位组合。

h)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 9的单位，任选与上述a)到g)段所述的一个或多个单位组合。

来自II型CS蛋白的适当的组成的重复单位的例子在SEQ ID No.s10和14，例如SEQ ID No.10，中给出。

在本发明的一个方面，提供了具有源自II型的5个或更少种重复单位，例如一种单体，例如如SEQ ID No.10所示，的杂合蛋白。

杂合蛋白还可包括发现于间日疟原虫的某些亚洲株中的重复区域的末端的12个氨基酸插入，例如如SEQ ID No.11所示。

在一个实施方式中，杂合蛋白包含源自间日疟原虫CS蛋白的257个氨基酸。

在一个实施方式中，杂合融合蛋白包含494个氨基酸，例如其的257个源自间日疟原虫CS蛋白。

在一个方面，CS蛋白包含全长蛋白。

在一个方面，应用的CS蛋白是截短形式，例如如图12所示或对应的截短的，其中氨基酸大约1到大约67被删除。

在一个实施方式中，作为克隆方法的结果，1到5个另外的氨基酸插入序列的起始，例如MMAP或MMAPG被插入。

杂合蛋白和/或融合蛋白还可进一步包括源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的抗原，例如其中抗原选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP或其片段。

在一个实施方式中，杂合融合蛋白(CSV-S)基本上具有SEQ IDNo.17所示的氨基酸序列。在该序列中氨基酸6到262源自CSV并且269到494源自S。通过基因构建引入剩下的氨基酸(其，特别地如果期望时可改变)。

SEQ ID No.17的CSV-S融合蛋白的性质在下表中提供：

 

分析	完整蛋白
		分子量	51794.75m.w.
长度	494
		1毫克＝	19.307pMol
摩尔消光系数	90780+/-5％
		1A(280)	0.57mg/ml
等电点	7.33
		在pH 7的电荷	1.05

完整蛋白组成分析

 

氨基酸	数量	％重量	％频率
				带电荷的(RKHYCDE)酸性的(DE)碱性的(KR)极性的(NCQSTY)疏水性的(AILFWV)	1063839134167	26.358.8210.6828.1534.68	21.467.697.8927.1333.81
A AlaC CysD AspE GluF PheG GlyH HisI IleK LysL LeuM MetN AsnP ProQ GlnR ArgS SerT ThrV ValW TrpY Tyr	5218241417644172042832402119302625147	7.143.585.333.494.837.051.063.714.959.182.037.057.505.205.735.045.084.785.032.21	10.533.644.862.833.4412.960.813.444.058.501.626.488.104.253.856.075.265.062.831.42
				B AsxZ GlxX Xxx.Ter	0001	0.000.000.000.00	0.000.000.000.20

SEQ ID No.20的CSV-S融合蛋白的性质在下表中提供：

Nishikawa & Ooi 1987

 

分析	完整蛋白
		分子量	51762.69m.w.
长度	494
		1毫克＝	19.319pMol
摩尔消光系数	90780±5％
		1A(280)	0.57mg/ml
等电点	7.33
		在pH 7的电荷	1.05

完整蛋白组成分析

 

氨基酸	数量	％重量	％频率
				带电荷的(RKHYCDE)酸性的(DE)碱性的(KR)极性的(NCQSTY)疏水性的(AILFWV)	1063839134168	26.378.8310.6928.1734.89	21.467.697.8927.1334.01
A AlaC CysD AspE GluF PheG GlyH HisI IleK LysL LeuM MetN AsnP ProQ GlnR ArgS SerT ThrV ValW TrpY Tyr	5218241417644172042732402119302626147	7.143.595.343.494.837.051.063.724.959.181.777.057.505.205.735.055.084.985.042.21	10.533.644.862.833.4412.960.813.444.058.501.426.488.104.253.856.075.265.262.831.42
				B AsxZ GlxX Xxx.Ter	0001	0.000.000.000.00	0.000.000.000.20

杂合融合蛋白CSV-S可例如利用质粒pGF1-S2(见图4并且为获得进一步的细节见实施例)制备，其当对应于CSV的适当序列插入SmaI克隆位点时，加工插入序列以产生融合蛋白CSV-S。

SEQ ID No 17的杂合蛋白的核苷酸序列在SEQ ID No 16中给出。该序列的CSV部分被密码子最优化以最优化在酵母中的表达。

替代地，杂合融合蛋白CSV-S可例如如实施例2所述那样制备。

本发明的杂合融合蛋白的一种替代核苷酸序列在SEQ ID No 19中给出并且其氨基酸序列在SEQ ID No 20中给出。

本发明还提供了编码本发明蛋白的核苷酸序列，例如DNA。

在一个实施方式中，编码本发明的蛋白的核苷酸序列侧翼连接转录控制元件，优选源自酵母基因并且并入表达载体中。

本发明杂合蛋白的表达盒可例如构建为包含下列特征：

-启动子序列，源自例如酿酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。

-编码适当的CSV-S杂合融合蛋白的序列。

-包含在序列中的转录终止序列，源自例如，酿酒酵母ARG3基因。

特定启动子的例子是来自酿酒酵母TDH3基因的启动子(Musti等)。

本发明还涉及杂合融合蛋白的制备中利用的载体。

然后可应用适当的质粒以将编码杂合融合蛋白的序列引入到适当的宿主中合成。适当的质粒的例子是pRIT15546，一种用于携带适当的表达盒的基于2微米的载体，见图3中其质粒图谱。

替代的质粒是本领域技术人员已知的和/或在实施例中进行了描述。

质粒通常将包含辅助筛选的内在标记，例如编码抗生素抗性或LEU和/或HIS营养缺陷型的基因。

在一个方面，质粒是游离型的，即蛋白的基因不整合入宿主的DNA中。

本发明还涉及用根据本发明的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核的，但优选是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)如ATCC数据库中的DC5(登录号20820)，名称为RIT DC5 cir(o)，保藏者：Smith Kline-RIT)和非酵母属酵母。这包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))，毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，耶氏酵母(Yarrowia)(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))和许旺酵母属(Schwanniomyces)(例如，西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis))。

在一个方面，本发明涉及用于表达SCV-S杂合融合蛋白和/或其免疫原性颗粒的重组酵母株Y1834(及其用途)，其制备见实施例。

在一个方面，本发明涉及重组酵母株Y1835(及其用途)，其表达CSV-S杂合融合蛋白和/或其免疫原性颗粒，其制备见实施例。

在一个替代的方面，本发明涉及重组酵母株Y1840(及其用途)，其表达CSV-S杂合融合蛋白和/或其免疫原性颗粒。

更特别地，本发明涉及包含编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的所述酵母(或另一酵母)，该酵母用于制备所述融合蛋白的用途，和涉及所述融合蛋白的制备的方法。

核苷酸序列(或其部分，例如编码杂合蛋白的部分但任选不为编码蛋白S的部分)可以为在相关宿主例如酵母中的表达而密码子最优化。

上下文中的密码子最优化表示密码子被修饰以使得它们适合在相关宿主中表达。这可以是或可以不是最佳的密码子选择，例如可选择次最佳优化形式，如果其表达比最佳形式更好的话。

在酵母细胞中，一旦表达，杂合融合蛋白(包含S抗原)能够自发地装配为由所述蛋白的多种单体组成的脂蛋白结构/颗粒。

这些颗粒还可涉及病毒样颗粒(VLP)。颗粒还可描述为多聚体(multimeric)脂蛋白颗粒。

这些颗粒可以多种方式制备，例如通过将每种疟原虫源抗原与另一融合伴侣(例如乙型肝炎病毒抗原或病毒结构蛋白)融合并在适当的宿主例如酵母或细菌中表达其。

当选择的受体酵母株在其基因组中还携带了一种或多种乙型肝炎S表达盒的整合拷贝时，产生的株合成作为融合蛋白的杂合蛋白，以及非融合S抗原。这些可自发地装配为包含杂合融合蛋白单体和S抗原单体的脂蛋白颗粒。

尽管不希望被理论束缚，例如当在Y1834中表达时，颗粒被认为基本上由杂合融合蛋白的单位/单体组成，虽然可能颗粒组分根据利用的特定酵母而改变。

因此在一些例子中，脂蛋白颗粒还可包含未融合的S抗原的单体，例如如在酵母Y1835中制备产生的颗粒中那样。

因此在一个方面，本发明提供了包含本发明杂合融合蛋白的免疫原性颗粒。

因此，在一个方面，颗粒是“所谓”简单颗粒，其中它基本上由杂合融合蛋白的单位组成。在本发明的一个替代方面，免疫原性脂蛋白颗粒在所谓双或混合颗粒中包含一个或多个杂合融合蛋白和一个或多个未融合的蛋白S单位。

图1和7是根据本发明的这一方面的脂蛋白颗粒的电子显微照片，虽然在不同酵母中制备。

显微照片中显示的颗粒利用氯化铯和蔗糖梯度通过经典技术纯化，特别是利用连续的氯化铯和蔗糖梯度，更特别地：1蔗糖梯度，然后是3个连续CsCl梯度。

本发明包括纯化所述颗粒的方法，例如利用氯化铯和蔗糖梯度。

另外，假定用于从细胞释放蛋白的表面活性剂可辅助脂蛋白颗粒的稳定化。在一个进一步的方面，脂蛋白颗粒包含表面活性剂。表面活性剂可例如选自Tween(例如Tween 20)、briji、聚乙二醇。颗粒可例如包含1％或更少，例如0.5％或0.1％重量的表面活性剂。

假定本发明的脂蛋白颗粒可促成在体内进一步刺激对杂合融合蛋白的免疫应答。

本发明还涉及疫苗，其包含与适当稀释剂或载体混合的免疫保护量的根据本发明的蛋白或颗粒。

本发明还涉及组合物，其包含根据本发明的杂合/融合蛋白或颗粒，以及涉及病毒载体，所述病毒载体包含疟疾抗原，特别是与所述颗粒共同的疟疾抗原，和任选佐剂。

在本说明书的上下文中，赋形剂指药物制剂中的组分，其自身没有治疗效果。稀释剂或载体落入赋形剂的定义。

在一个方面，本发明的组合物包含如本文所述的杂合融合蛋白和/或颗粒和佐剂。

在一个实施方式中，病毒载体构建体如WO2004/055187所述。

在一个实施方式中，所述融合蛋白在混合物中，并且因此可作为单个制剂而获得。在另一实施方式中，融合蛋白制备为复数个单独的制剂并且分别给予患者。

在一个进一步的方面，本发明涉及对恶性疟原虫和间日疟原虫的组合治疗，包含：

包含源自间日疟原虫CS蛋白的抗原的免疫原性融合蛋白，和

包含源自恶性疟原虫CS蛋白的抗原的免疫原性融合蛋白。

在本发明的这一方面，融合蛋白的源自间日疟原虫CS蛋白的抗原成分可以是天然存在的(天然的)CS蛋白例如I型和/或II型或其片段。或者，抗原可以是杂合(嵌合)蛋白，如上所述，例如SEQ ID No13和/或15所示蛋白。

源自恶性疟原虫的融合蛋白抗原成分可根据WO93/10152制备，例如作为RTS，S(其中”S”代表未融合单体)或作为RTS，两者都适于用于本发明的这一方面。

在一个实施方式中，源自恶性疟原虫的抗原包含至少4重复单位的中央重复区域。更特别地，该抗原包含了含有至少160个氨基酸的序列，所述序列与CS蛋白C-末端部分基本上同源。CS蛋白可缺乏C-末端最后12到14个氨基酸。

更特别地，包含恶性疟原虫CS蛋白的部分的相关融合蛋白可基本上对应于通过线性连接体符合读框地融合于S抗原N-末端的恶性疟原虫7G8氨基酸207-395。该连接体可包含来自S抗原的preS2的部分。

更特别地，利用的源自恶性疟原虫的融合蛋白是被如SEQ ID No18提供的RTS表达盒的核苷酸序列所编码的蛋白。

适当的S抗原可包含preS2。适当的血清型的例子是adw(Nature280：815-819，1979)。

在一个方面，本发明的杂合融合蛋白包含源自突变S蛋白的部分，例如如公开的美国申请号2006/194196(也公开为WO 2004/113369)中所述。该文献描述了标记为HDB05的突变体。特别是，它在图1和6中描述了突变体和野生型蛋白的对比，并且在图4和5中描述了突变体的基因。其序列12到22描述了突变S蛋白的特定多肽。上述的每种引入本文作为参考。

本发明还涉及所述治疗组合的用途，更特别地用作用于预防疟疾的疫苗，和治疗易感染疟原虫感染的患者的方法，包括同时或序贯给予有效量的每种成分，由此治疗或预防疟疾。

在一个进一步的方面，本发明提供了治疗组合，其包括：免疫原性杂合抗原，其包含

a.源自间日疟原虫I型子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，

b.源自间日疟原虫II型子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，和免疫原性融合蛋白，其包含源自恶性疟原虫CS蛋白的抗原。

例如，其中所述杂合抗原和所述融合蛋白伴随给予，例如它们可为同时给予而混合，或替代地为序贯给予而配制。

在一个进一步的方面，提供了治疗组合，其包含：免疫原性杂合抗原，其包含：

a源自间日疟原虫I型子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，

b.源自间日疟原虫II型子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，和编码疟疾抗原例如所述杂合抗原的病毒载体。

例如，其中所述杂合抗原和所述病毒载体伴随给予，例如它们可为同时给予而混合，或替代地可为序贯给予而配制。

如本文使用的，术语“伴随”表示其中所述成分组合在不超过12小时例如在不超过1小时的时期内给予，典型地在一种时刻，例如在其到健康专业人员处就诊时，例如其中它们序贯或同时给予。

本发明还包括包含这些实施方式中每种的所述成分的疫苗组合物。

本发明还包括包含用于治疗疟疾的所述成分的疫苗试剂盒。

本发明还涉及包含所述成分的初免-加强(prime boost)计划，例如用来自恶性疟原虫的抗原和/或颗粒初始免疫(priming)并且用来自间日疟原虫的抗原和/或颗粒加强，并且反之亦然。

初免-加强方案可例如包含唯一或仅仅源自间日疟原虫的成分。

在另一实施方式中，可用质粒/裸DNA实现初始免疫，并且用根据本发明的抗原加强，或反之亦然。

一般的初免-加强计划如下所述。

例如：

·可用包含来自间日疟原虫CS蛋白的至少一个I型重复单位和来自间日疟原虫CS蛋白的至少一个II型重复单位的抗原(例如佐剂抗原(adjuvanted antigen))初始免疫(priming)，并且可用编码其/相应抗原的病毒载体加强，

·可用包含来自间日疟原虫的至少一个重复单位或表位和来自恶性疟原虫CS蛋白的至少一个重复单位或表位的抗原(例如佐剂抗原)初始免疫(priming)，并且可用编码其/相应抗原的病毒蛋白加强，

·可用编码抗原的病毒载体初始免疫，所述抗原包含来自间日疟原虫CS蛋白的至少一个I型重复单位和来自间日疟原虫CS蛋白的至少一个II型重复单位或包含来自间日疟原虫的至少一个重复单位或表位和来自恶性疟原虫CS蛋白的至少一个重复单位或表位，并且可用蛋白和/或免疫原性颗粒形式的其/相应佐剂抗原加强。

上下文中的抗原包括本发明的杂合融合蛋白和/或免疫原性颗粒。在这些初免-加强计划中，抗原通常是带佐剂的(adjuvanted)。

在本发明的这一/这些方面，上述对源自间日疟原虫的杂合蛋白描述的优选也是适用的。因此在一个方面，杂合蛋白具有SEQ ID No 13的序列。

来自恶性疟原虫的RTS，S和抗原(以免疫原性颗粒的形式)可如WO93/10152所述制备。

在一个方面，本发明提供了编码根据本发明的杂合蛋白(或替代地杂合融合蛋白)的复制缺陷病毒载体。适当的病毒载体可源自腺病毒载体，腺伴随病毒载体(AAVs)，麻疹(measles)，慢病毒(lentiviruses)，甲病毒(alphaviruses)，bacloviruses，单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus)，和痘病毒(poxviruses)例如牛痘(cowpox)，鸟痘(fowlpox)，鸽痘(pigeonpox)，金丝雀痘(canarypox)，猪痘(suipox)，绵羊痘(sheeppox)/山羊痘(goatpox)。制备编码疟疾抗原的腺病毒载体的方法例如描述于WO 2004/055187。

载体编码的蛋白可例如被修饰以预防在表达过程中的蛋白的糖基化，例如某些丝氨酸可被丙氨酸残基取代以降低糖基化。

腺病毒

本发明的腺病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸(DNA)，其编码一种或多种免疫原性多肽。

用于本发明的腺病毒载体可以是源自一系列的哺乳动物宿主。

腺病毒(本文表示为“Ad”或“Adv”)具有特有的形态学，所述特有的形态学具有由三种主要蛋白，六邻体(II)(hexon(II))，五邻体基(III)(penton base(III))和突出的纤维(IV)(knobbed fibre(IV))，与许多其他次要蛋白，VI，VIII，IX，IIIa和IVa2一起组成的二十面的(icosohedral)衣壳(Russell W.C.2000，Gen Viriol，81：2573-2604)。病毒基因组是线性，双链DNA，末端蛋白共价附着于5’末端，其具有反向的末端重复序列(ITRs)。病毒DNA与高度碱性蛋白VII和名称为mu的小肽密切相关。另一蛋白，V，与这种DNA-蛋白复合体包装并且提供了通过蛋白VI与衣壳的结构性连接。病毒还包含病毒-编码蛋白酶，其对于加工一些结构蛋白以产生成熟感染病毒是必要的。

超过100种独特血清型的腺病毒已被分离，其感染不同哺乳动物种，其的51种是人源的。因此一种或多种腺病毒载体可源自人腺病毒。所述人源腺病毒的例子是Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad24、Ad34、Ad35、Ad50/51，特别是Ad5、Ad11和Ad35。基于大量生物，化学，免疫和结构标准人血清型已被分类为六种亚属(A-F)。

尽管基于Ad5的载体已被广泛使用于大量基因治疗试验中，对于Ad5和其他C组腺病毒载体的使用可能有限制，因为由于天然感染在一般群体中的预存的免疫性。Ad5和其他C组成员倾向于为最大血清阳性率的血清型。对于现存载体的免疫性可作为在治疗过程中暴露于载体的结果而发展。这些类型的预存的或已发展的对于血清阳性载体的免疫性可限制基因治疗或接种工作的有效性。替代的腺病毒血清型，因此在能够规避宿主免疫应答的基因递送系统的研究中成为非常重要的靶标。

替代血清型的一种所述领域是源自非人灵长类的那些，特别是黑猩猩腺病毒。见美国专利6,083,716，其描述了两种黑猩猩腺病毒基因组。

已经显示黑猩猩(＂Pan＂或＂C＂)腺病毒载体如人腺病毒载体一样有效地诱导对于转基因产物的强的免疫应答(Fitzgerald等，J.Immunol.170：1416)。

非人灵长类腺病毒可从黑猩猩的肠系膜淋巴结中分离。黑猩猩腺病毒与人腺病毒C亚型充分类似足以允许E1缺失的病毒在HEK293细胞中的复制。然而黑猩猩腺病毒在系统发育上与更普通的人血清型(Ad2和Ad5)不同。Pan6与Pans5、7和9更不密切相关并且血清学上不同于Pans5、7和9。

因此一种或多种腺病毒载体可源自非人灵长类腺病毒，例如黑猩猩腺病毒，如选自血清型Pan5、Pan6、Pan7和Pan9中的一种。

腺病毒载体还可源自多于一种的腺病毒血清型，并且每种血清型可来自相同或不同来源。例如，它们可源自多于一种的人血清型和/或多于一种的非人灵长类血清型。构建嵌合腺病毒载体的方法公开于WO2005/001103。

存在与将异源DNA插入腺病毒相关的某些大小限制。人腺病毒具有包装多至105％野生型基因组长度的能力(Bett等，1993，J Virol 67(10)，5911-21)。对于人腺病毒更低的包装限制已经显示为75％的野生型基因组长度(Parks等，1995，J Virol 71(4)，3293-8)。

本发明中有用的腺病毒的一个例子是不同于在人群中流行的天然存在的血清型例如Ad2和Ad5的腺病毒。这避免了诱导针对载体的有效免疫应答，所述针对载体的有效免疫应答通过中和抗体和影响毒性而阻断载体吸收而限制了接下来给予相同血清型的功效。

因此，腺病毒可以是不为流行的天然存在的人病毒血清型的腺病毒。分离自动物的腺病毒具有免疫学不同的衣壳，六邻体，五邻体和纤维组分，但是是系统发育上紧密相关的。特别地，病毒可以是非人腺病毒例如猿腺病毒，并且特别是黑猩猩腺病毒例如Pan 5、6、7或9。所述株的例子描述于WO 03/000283并且可获自美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209及其他来源。期望的黑猩猩腺病毒株是Pan 5[ATCC VR-591]，Pan 6[ATCC VR-592]，和Pan 7[ATCC VR-593]。

黑猩猩腺病毒的利用被认为比人腺病毒血清型有利，因为缺少对于靶群体中的腺病毒预存的免疫性，特别是缺少交叉中和抗体。黑猩猩腺病毒与预存的中和抗体应答的交叉反应仅仅存在于2％的靶群体中，与之相比，在某些候选人腺病毒载体的例子中为35％。黑猩猩腺病毒与更普通的人亚型Ad2和Ad5不同，但更紧密相关于E亚组的人Ad4，其不是流行的亚型。Pan6与Pan 5、7和9不紧密相关。

本发明的腺病毒可以是复制缺陷的。这意味着它具有与野生型病毒相比降低的在非补足细胞(non-complementing cell)中复制的能力。这可通过将病毒突变而获得，例如通过删除复制中涉及的基因，例如删除E1a、E1b、E3或E4基因。

根据本发明的腺病毒载体可源自包含功能性E1缺失的复制缺陷腺病毒。因此根据本发明的腺病毒载体可以是复制缺陷的，由于没有表达腺病毒E1a和E1b的能力，即，是E1a和E1b功能缺失的。重组腺病毒还可具有其他基因的功能缺失(见WO 03/000283)，例如，E3或E4基因的缺失。腺病毒延迟早期基因E3可从组成重组病毒的部分的腺病毒序列中排除。E3的功能对于产生重组腺病毒颗粒是不必要的。因此，取代这种基因产物的功能以包装本发明中有用的重组腺病毒是不必要的。在一个特定实施方式中，重组腺病毒具有功能缺失的E1和E3基因。所述载体的构建描述于Roy等，Human Gene Therapy 15：519-530，2004。

重组腺病毒还可构建为具有E4基因的功能缺失，尽管保持E4ORF6功能是期望的。根据本发明的腺病毒载体还可包含延迟早期基因E2a的缺失。还可产生腺病毒基因组晚期基因L1到L5中任何的缺失。类似地，中期基因IX和IVa的缺失可以是有用的。

可在其他结构或非结构腺病毒基因中产生其他的缺失。上述缺失可单独使用，即，用于本发明的腺病毒序列可仅仅包含E1缺失。或者，对于破坏其生物活性有效的整个基因或其部分的缺失可以任何组合利用。例如，在一个示例性载体中，腺病毒序列可具有E1基因和E4基因的缺失，或E1、E2a和E3基因的缺失，或E1和E3基因的缺失(例如E1a和E1b中的功能缺失，和E3的至少部分的缺失)，或具有或不具有E3缺失的E1、E2a和E4基因的缺失等等。所述缺失可以是这些基因的部分或全部的缺失，并且可与其他突变组合，例如温度敏感突变，以获得期望的效果。

腺病毒载体可在任何适当的细胞系上产生，在其中病毒能够复制。特别地，提供在病毒载体中缺少的导致其受损害的复制特性的因素(例如E1和/或E4)的补足细胞系可被利用。不受限制，所述细胞系可以是HeLa[ATCC登录号CCL 2]，A549[ATCC登录号CCL 185]，HEK293，KB[CCL 17]，Detroit[例如，Detroit 510，CCL 72]和WI-38[CCL75]细胞，等等。这些细胞系都获自美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209。其他适当的亲本细胞系可获自其他来源，例如PER.C6

细胞，如应用微生物和研究中心(CAMR，UK)的欧洲动物细胞培养保藏中心(ECACC)的ECACCno.96022940保藏的细胞所代表的，或Her96细胞(Crucell)。

本发明涉及用于制备编码本发明蛋白的病毒载体的已知细胞系的用途。

编码免疫原性多肽的多核苷酸序列可为哺乳动物细胞进行密码子最优化。所述密码子最优化在WO 05/025614中详细描述，例如从第37页开始。

在本发明的一个实施方式中，其中病毒载体包含多核苷酸构建体，其中所述构建体包含N-末端前导序列。信号序列，跨膜域和胞质域都分别任选存在或删除。在本发明的一个实施方式中，所有这些区域都存在但被修饰。

用于根据本发明的腺病毒载体的启动子可以是来自HCME IE基因的启动子，例如如WO 02/36792所述，其中包含外显子1的HCMV IE基因的5’未翻译区域被包括并且内含子A完全或部分被排除。

当几种抗原融合入融合蛋白时，所述蛋白将在单个启动子的控制下被多核苷酸编码。

在本发明的另一实施方式中，几种抗原可通过独立的启动子分别表达，每种所述启动子可以是相同或不同的。在本发明的另一实施方式中，一些抗原可形成融合体，与第一启动子相连并且其他抗原可与第二启动子相连，其可以与第一启动子相同或不同。

因此，腺病毒载体可包含一种或多种表达盒，其每种在启动子的控制之下编码抗原。替代地或另外地，它可包含一种或多种表达盒，其每种在启动子之下编码多于一种的抗原，所述抗原由此作为融合体表达。每种表达盒可存在于腺病毒载体的多于一种的位点中。

编码待表达的免疫原性多肽的单个多核苷酸或复数个多核苷酸可插入任何腺病毒缺失区域，例如插入E1缺失区域。

尽管编码免疫原性多肽的两种或更多种多核苷酸可连接为融合体，产生的蛋白可表达为融合蛋白，或者它可表达为独立的蛋白产物，或者它可表达为融合蛋白并且然后接着分解为更小的亚单位。

在本说明书的上下文中免疫原性意指引发(illicit)免疫应答的能力。这种应答可以是当脂蛋白颗粒以可包括/需要适当的佐剂的适当制剂给予时的。可需要包含类似于或少于原始剂量的剂量的加强剂量(booster)以获得需要的免疫原性应答(包括用不同的实体加强即异源加强)。

根据本发明的组合物/药物制剂还可在混合物中包括一种或多种另外的抗原例如源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的那些，例如其中抗原选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP或其片段。

其他的例子，源自恶性疟原虫的抗原包括PfEMP-1、Pfs 16抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1和TRAP。其他的疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、Pf332、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230和它们在其他疟原虫种中的类似物。

在本发明的疫苗中，杂合抗原的水溶液可直接使用。或者，进行或不进行先前的冻干化的蛋白可与佐剂混合或吸收，所述已知的佐剂包括但不限于明矾，胞壁酰二肽，皂苷例如Quil A。

特定的佐剂选自金属盐，水包油乳剂，Toll样受体激动剂(特别是，Toll样受体2激动剂，Toll样受体3激动剂，Toll样受体4激动剂，Toll样受体7激动剂，Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)，皂苷，或其组合，条件是金属盐仅仅与另一佐剂组合使用并且不单独使用除非它们制剂为使得不超过大约60％的抗原吸附到金属盐上。更特别地，不超过大约50％，例如40％的抗原吸附到金属盐上，并且在一个实施方式中，不超过大约30％的抗原吸附到金属盐上。吸附到金属盐上的抗体的水平可通过本领域熟知的技术确定。可通过例如在磷酸盐离子如磷酸盐缓冲盐存在下制剂组合物，或通过增加抗原与金属盐的比例而增加游离抗原的水平。在一个实施方式中，佐剂不包括作为唯一佐剂的金属盐。在一个实施方式中，佐剂不包括金属盐。

在一个实施方式中，佐剂是Toll样受体(TLR)4配体，例如激动剂例如脂质A(lipid A)衍生物特别是单磷酰基脂质A或更特别是3脱酰单磷酰基脂质A(3D-MPL)。

3脱酰单磷酰基脂质A已知于美国专利No.4,912,094和英国专利申请No.2,220,211(Ribi)，并且可获自Ribi Immunochem，Montana，USA。

3D-MPL为Corixa corporation以商标

出售，并且主要以IFN-g(Th1)表型促进CD4+T细胞应答。可根据GB2 220 211 A中公开的方法产生它。化学上，它是3-脱酰单磷酰基脂质A与3、4、5或6个酰化链的混合物。通常在本发明的组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有使得它可通过0.22μm滤器无菌过滤的颗粒大小。所述制剂在国际专利申请No.WO 94/21292中进行了描述。

脂质A的合成衍生物是已知的并且被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-O-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294 DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

典型地，当使用3D-MPL时，抗原和3D-MPL与明矾一起递送或以一种水包油乳剂或多种水包油乳剂呈递。3D-MPL的引入是有利的，因为它是效应T-细胞应答的刺激剂。或者3D-MPL可以配制为脂质体。

其他的可使用的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，例如在WO 9850399或US 6303347中公开的那些(制备AGPs的方法也被公开)，或US 6764840中公开的药学上可接受的AGPs盐。一些AGPs是TLR4激动剂，并且一些是TLR4拮抗剂。两者都被认为作为佐剂是有用的。

另一用于本发明的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美树Quilaja Saponaria Molina的皂苷制剂并且首先被Dalsgaard等在1974年(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamteVirusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)描述为具有佐剂活性。Quil A的纯化片段已通过HPLC分离，其保持佐剂活性而没有与Quil A(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)，有关的毒性。QS-21是源自Quillaja saponaria Molina的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)，Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答。

QS21的特定制剂已被描述，其进一步包含甾醇(WO 96/33739)。QS21:甾醇的比例典型地为大约重量比1:100到1:1。

通常存在过量的甾醇，QS21:甾醇的比例为至少1:2w/w。典型地对于人，QS21和甾醇的给药以每剂大约1μg到大约100μg范围例如大约10μg到大约50μg的范围的疫苗存在。

脂质体通常包含中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下通常是非结晶的，例如卵黄磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱或二月桂基磷脂酰胆碱。脂质体还可包含带电荷脂质，其对于由饱和脂质组成的脂质体增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些例子中，带电荷脂质的量通常是1-20％w/w，例如5-10％。甾醇比磷脂的比例是1-50％(mol/mol)，例如20-25％。

这些组合物可包含MPL(3-脱酰单磷酰基脂质A，也称作3D-MPL)。3D-MPL在GB 2 220 211(Ribi)中已知为3种类型的脱-O-酰化单磷酰基脂质A与4、5或6个酰化链的混合物，并且其被Ribi Immunochem，Montana生产。

通常在本发明的组合物中，利用了小颗粒3D-MPL，其具有一定的颗粒大小使得它可无菌过滤通过0.22μm的滤器。所述制剂描述于WO94/21292。

皂苷可以胶束，混合胶束(通常，但不排他地具有胆汁盐)的形式分离，或当与胆固醇和脂质一起制剂时，可以是下列形式：ISCOM基质(EP 0 109 942B1)，脂质体或相关胶质结构例如蠕虫样或环样多聚体复合体或脂质/分层的结构和薄片，或者为水包油乳剂的形式(例如，如WO 95/17210中所述)。皂苷经常可与金属盐联合，例如氢氧化铝或磷酸铝(WO 98/15287)。

通常皂苷以脂质体，ISCOM或水包油乳剂的形式存在。

免疫刺激寡核苷酸也可使用。用于本发明的佐剂或疫苗的寡核苷酸的例子包括CpG，其包含寡核苷酸，通常包含通过至少三种，更通常至少六种或更多种核苷酸分离的两种或更多种二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸，接着鸟嘌呤核苷酸。CpG寡核苷酸典型地是脱氧核苷酸。在一个实施方式中，在寡核苷酸中的核苷酸间(internucleotide)是二硫代磷酸酯，或更优选地是硫代磷酸酯键，然而磷酸二酯和其他核苷酸间键在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US 5,278,302和WO95/26204。

寡核苷酸的例子如下：

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)

TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)，

序列可包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。

替代的CpG寡核苷酸可包含具有无关紧要的缺失或添加的上述一种或多种序列。

CpG寡核苷酸可通过本领域任何已知的方法合成(例如见EP468520)。便利地，所述寡核苷酸可利用自动合成仪合成。

TLR2激动剂的例子包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如Imiquimod和Resiquimod是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(人中的TLR8和小鼠中的TLR7)，然而双链RNA和聚IC(聚肌苷-聚胞苷酸-一种商业上合成的病毒RNA模拟物)是示例性的TLR3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的例子，同时CpG是TLR9激动剂的例子。

免疫刺激剂可替代地或另外地包括。在一个实施方式中，这种免疫刺激剂将是3脱酰化单膦酰基脂质A(3D-MPL)。

佐剂组合包括3D-MPL和QS21(EP 0 671 948 B1)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO 95/17210，WO 98/56414)，或用包括脂质体的其他载体配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)。其他优选的佐剂系统包含如US 6558670和US 6544518中描述的3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合。

在一个方面，佐剂包含3D-MPL。

在一个方面，佐剂包含QS21。

在一个方面，佐剂包含CpG。

在一个方面，佐剂包含QS21和3D-MPL。

在一个方面，佐剂包含QS21，3D-MPL和CpG。

在一个方面，佐剂配制为水包油乳剂。

在一个方面，佐剂配制为脂质体。

在本发明的一个实施方式中，提供了包含与3D-MPL和载体组合的本文所述杂合蛋白的疫苗，如CSV-S。典型地载体将是水包油乳剂或明矾。更特别地，杂合蛋白呈现为本文所述的颗粒或混合颗粒。

本发明的蛋白还可包封为微颗粒例如脂质体。

疫苗制剂一般地描述于New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.，1978。在脂质体中的包封被Fullerton描述于例如，美国专利4,235,877。

存在于每个疫苗剂量的本发明蛋白的量选自在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有显著的不利副作用的量。所述量将根据利用的特定免疫原和疫苗是否具有佐剂而改变。通常，预期每个剂量将包含1-1000μg的蛋白，例如1-200μg，如10-100μg，更特别地10-40μg。对于特定疫苗的最佳量可通过涉及观察受试者中的抗体滴度和其他应答的标准研究而确定。在初次疫苗接种之后，受试者优选在大约4周内接受加强(boost)，然后只要存在感染风险每六个月重复加强。对本发明蛋白的免疫应答通过利用佐剂和/或免疫刺激剂而增强。

使用的3D-MPL的量通常是小的，但依赖于疫苗制剂可以在每剂1-1000μg的范围，通常每剂1-500μg，并且更例如在每剂1到100μg之间(每剂10、20、30、40、50、60、70、80或90μg)。

在本发明的佐剂或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常是小的，但依赖于疫苗制剂可以在每剂1-1000μg的范围内，通常每剂1-500μg，并且更例如在每剂1到100μg之间(每剂10、20、30、40、50、60、70、80或90μg)。

用于本发明的佐剂中的皂苷的量可以在每剂1-1000μg的范围内，通常每剂1-500μg，更例如每剂1-250μg，并且更特别地在每剂1到100μg之间(每剂10、20、30、40、50、60、70、80或90μg)。

在一个进一步的方面，本发明提供了疫苗组合，其提供针对由恶性疟原虫和/或间日疟原虫引起的疟疾的免疫保护，其包含源自间日疟原虫CS蛋白的杂合蛋白例如本文所述的。

在一个方面，提供了包含如本文所述的免疫原性颗粒，和任选进一步包含混合的TRS，S的免疫原性颗粒(如WO 93/10152所述)和适当的免疫刺激佐剂的疫苗。

本发明的制剂可用于预防和治疗目的。

相应地，本发明提供了本文所述的本发明的任何方面用于治疗的用途，特别是用于药物的如本文所述的疫苗组合物。

本发明的进一步方面是提供用于制备本发明的杂合蛋白的方法，所述方法包含在适当的宿主中表达编码所述蛋白的核苷酸序列，优选在酵母中，并且回收产物。

本发明还涉及利用本文所述一种或多种方面制备药物组合物例如疫苗的方法。

本发明的进一步的方面是治疗易感染疟原虫感染的患者的方法，通过给予如本文前述的有效量的疫苗。

疫苗包括肠胃外用疫苗。

因此本发明涉及抗原，例如本发明的杂合融合蛋白和/或脂蛋白颗粒和包含其的组合物用于治疗的用途，特别是用于制备治疗/预防疟疾例如由间日疟原虫和/或恶性疟原虫引起的疟疾的药物中的用途。

编码其的蛋白和/或病毒载体可在初免-加强计划中给予，例如特别地如WO 2004/037189中所述。

在本说明书的上下文中，“包含”解释为“包括”。

包含某些成分的本发明的方面也意图涉及由或基本上由相关成分组成的所述方面。

实施例

实施例1

Y1834株的描述

酵母重组株Y1834表达CSV-S融合蛋白。它由用重组表达载体pRIT15546转化的酿酒酵母宿主株DC5组成。

DC5是具有下列基因型的实验室酵母株(ATCC No：20820)：leu2-3、leu2-112、his3、canl-11。双leu-2突变允许选择pRIT15546载体的吸收和保持，所述pRIT15546载体携带功能性LEU-2基因拷贝。仅仅携带了具有LEU-2基因的那些细胞当亮氨酸不存在于生长培养基时能够生长。

载体pRIT15546是携带CSV-S表达盒的酵母游离表达载体(基于2μ的载体)。重组表达被源自酵母TDH3基因(组成型表达)的启动子驱动。pRIT15546载体的构建在下面详细描述。

pRIT15546载体的构建。

具有用于酵母表达的适当密码子的CSV合成基因被构建，并且亚克隆入pUC57载体(GenBank/EMBL登录号Y14837)。产生的质粒pUC57/CSV和酵母表达载体pGf1-S2都被适当的酶限制性酶切。通过多步骤的克隆程序构建了载体pGf1-S2(在GSK中)。这种载体，其已经携带了S表达盒，允许融合基因的构建，N-末端符合读框地与乙型肝炎病毒S基因融合。最后的表达载体，在序列验证之后，命名为pRIT15546(图3)。

DC5株的转化

leu-和his-营养缺陷型DC5株用重组质粒pRIT15546转化，通过利用酵母标准方案。转化的细胞平板接种于琼脂选择性平板。一种转化体被选择并接受正式命名Y1834。

重组蛋白的表达

Y1834在30℃在补充到终浓度8μg/ml的组氨酸到大约0.5(此处0.770)的O.D.(620nm)的YNB(可获自Kracker Scientific Inc的酵母氮基)基本培养基上生长。然后收获细胞并且制备细胞提取物。

提取物制备：

细胞重悬浮在破裂(Breaking)缓冲液中并且机械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下离心5-10分钟。上清液部分进行SDS-PAGE4-20％。

破裂缓冲液：                   50mM磷酸钠缓冲液(PH：7.5)

                                     4mMEDTA

                                     Tween-20 0.5％

                                     +蛋白酶抑制剂混合物

(Complete/ROCHE)

细胞浓度：                           在5ml破裂缓冲液中的100ml

培养物(OD：0.5)＝10OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：                       提取物离心5-10分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 4-20％，蛋白转移到硝化纤维素膜并且进行免疫染色。见图2。

western印迹分析：

试剂＝小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals制备)-(稀释：1/500)

商业上可获得的抗-S抗体可替代本方法使用的那些。或者可使用抗-CSV抗体，例如可获自NIH称为MR4的那些。

CSV-S融合蛋白：

理论MW：51794道尔顿

表观MW：55kDa

实施例2

Y1840株的描述

巴斯德毕赤酵母株Y1840表达CSV-S融合蛋白。Y1840株包含整合入基因组的四拷贝的CSV-S融合基因。为获得表达CSV-S融合蛋白的株，用携带了CSV-S盒和功能性HIS4基因的整合性线性DNA片段转化巴斯德毕赤酵母株GS115。

GS115是具有下列基因型的实验室酵母株(ATCC No：20864)：his4。his4突变允许选择携带CSV-S盒和功能性HIS4基因的pRIT15607源的线性DNA片段的吸收。

载体pRIT15607是携带CSV-S表达盒的巴斯德毕赤酵母整合性表达载体。重组表达被强的紧密调节的甲醇可诱导AOX1启动子驱动。

pRIT15607载体的构建在下面详细描述。

pRIT15607载体的构建

CSV-S融合基因，存在于pRIT15546上，用PCR扩增并且克隆入pGEM-T Easy中间载体(Promega，cat N°：#A1360)。序列验证之后，重组质粒被用适当的限制性酶消化并且克隆入pHIL-D2巴斯德毕赤酵母整合性载体中。最终的表达载体，在序列验证之后，命名为pRIT15607(图5)。被pRIT15607质粒编码的CSV-S融合蛋白几乎与SEQ ID No 17所述的序列同一，除了甲硫氨酸2被缬氨酸取代之外(见SEQ ID No 19和SEQ ID No 20)。用NotI内切酶消化pRIT15607释放了6816bp的线性片段，其可通过在内在的AOX1位点的同源重组被整合入酵母基因组。

GS115株的转化

用重组质粒pRIT15607转化GS115宿主株。转化整合性质粒之前用NotI限制性酶切，以释放携带表达盒和HIS4选择性标记的线性DNA片段。NotI限制性酶切将促成在AOX1位点的整合。转化的细胞平板接种于琼脂选择平板上。通过定量斑点印迹选择多拷贝整合克隆。在已经具有高拷贝数量的整合的CSV-S表达盒的选择的克隆中，选择其中对于CSV-S重组蛋白显示出最高表达水平的一种，并且给予其正式命名Y1840。这种克隆携带四拷贝的CSV-S融合基因。

重组蛋白的表达：

YY1840在30℃在补充1％甘油作为碳源到大约0.5(在此例子中为0.709)的O.D.(620nm)的YNB(可获自Kracker Scientific Inc的酵母氮基)基本培养基中生长。然后细胞被收获并重悬浮于补充了1％甲醇作为碳源(作为诱导剂)的相同体积的YNB培养基中，并且在30℃下培养大约16小时。

提取物制备：

甲醇诱导的细胞被离心，细胞团重悬浮于破裂缓冲液中并机械裂解(玻璃珠或French press)。提取物以5000rpm离心5-10分钟。上清液部分进行SDS-PAGE 12.5％。

破裂缓冲液         60mM Na₂HPO₄

                   40mM NaH₂PO₄

                   1mM MgSO₄

                   10Mm KCl

                   Tween-20 0.5％

                   2Mm PMSF

细胞浓度：         在2.5ml破裂缓冲液中的100ml培养物(OD：

                   0.5)＝20OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：     提取物离心5-10分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 12.5％，蛋白转移到硝化纤维素膜上并进行免疫染色。见图6。

western印迹分析：

试剂＝小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals制备)-(稀释：1/250)

商业上可获得的抗-S抗体可替代本方法中利用的那些。或者可利用抗-CSV抗体，例如可获自NIH称为MR4的那些。

CSV-S融合蛋白：理论MW：51762道尔顿

               表观MW：55kDa

实施例3

Y1835株的描述

酵母重组株Y1835同时表达CSV-S融合蛋白和S抗原。为获得共表达CSV-S和S蛋白的株，酿酒酵母Y1295株，其已经携带5整合拷贝的S表达盒，被用重组整合性表达载体pRIT15582转化。

Y1295株在GSK中通过多步骤转化程序构建。Y1295的构建描述于WO 93/10152。Y1295株具有下列基因型：leu2-3、leu2-112、gall。leu-2突变允许选择携带CSV-S盒和功能性LEU2基因的源自pRIT15582的线性DNA片段的吸收。

载体pRIT15582是酵母整合性表达载体(基于Ty的载体)，其携带CSV-S表达盒。重组表达被源自酵母TDH3基因的启动子驱动(组成型表达)。pRIT15582载体的构建在下面详细描述。

pRIT15582整合性载体的构建

用于构建pRIT15582载体的起始材料是表达质粒pRIT15546(图3)。这种质粒的构建描述于实施例1。用HindIII内切核酸酶的pRIT15546消化释放了对应于完整CSV-S表达盒(pTDH3+CSV-S+tARG3)的3706bp长DNA片段。HindIII DNA片段(用T4DNA聚合酶填充之后)在独特的SalI克隆位点(SalI限制性酶切/T4处理)插入基于Ty的整合性载体pRIT13144中。产生的质粒pRIT15582包含，除了表达盒之外，作为选择性标记的酵母LEU2基因(图8)。用XhoI内切核酸酶的pRIT15582消化释放了图4所示的8500bp的线性片段，其可通过游离末端与内在的Ty成分同源重组整合入酵母基因组。

Y1295株的转化

为获得表达S和CSV-S蛋白的株，用8500bp线性XhoI片段(图9)转化Y1295株以选择Leu+集落。获得了包含以不同比例存在于基因组中的多组两种表达盒的几种整合体。选择携带四拷贝CSV-S盒的一种转化体并且给予正式命名Y1835。

重组蛋白的表达

Y1835在30℃在大约0.5(0.8)的O.D.(620nm)的YNB(可获自Kracker Scientific Inc的酵母氮基)基本培养基上生长。然后收获细胞并且制备细胞提取物。

通过免疫印迹的表达产物分折：

提取物制备：

细胞重悬浮于破裂缓冲液中并且机械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下离心5-10分钟。上清液组分进行SDS-PAGE 12.5％。

破裂缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液(PH：7.5)

            4mMEDTA

            Tween-20 0.5％

              +蛋白酶抑制剂混合物(Complete/ROCHE)

细胞浓度：    在2.5ml破裂缓冲液中的100ml培养物

(OD：0.5)＝20OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：提取物离心5-10分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 12.5％，蛋白转移到硝化纤维素膜并进行免疫染色。

western印迹分析(图10)：

试剂：1/小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals

      制备)-(稀释：1/250)

      2/兔多克隆抗体抗-CSV(WRAIR惠赠)-

      稀释1/20,000。

商业上可获得的抗-S抗体以及抗-间日疟原虫/CSP抗体可替代本方法中使用的那些。

参考文献：

(1)Harford N，Cabezon T，Colau B，等人，“表达乙型肝炎病毒表面抗原的酿酒酵母株(RIT4376)的构建和表征”，Postgrad Med J 63，Supp.2：65-70，1987.

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(3)Vieira J and Messing J，“pUC质粒，一种用于通过合成通用引物来插入诱变和测序的M13mp7-衍生系统”，*_Gene 19：259-268，1982.

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(5)Broach JR，Strathern JN，and Hicks JB，“发育杂合克隆载体和CAN1基因的酵母转化”，Gene 8：121-133，1979.

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序列表

SEQ ID NO：1

1区

SEQ ID NO：2

附加的II区

SEQ ID NO：3

VK210重复

SEQ ID NO：4

VK210重复

SEQ ID NO：5

VK210重复

SEQ ID NO：6

VK210重复

SEQ ID NO：7

VK210重复

SEQ ID NO：8

VK210重复

SEQ ID NO：9

VK210重复

SEQ ID NO：10

主要VK247重复

SEQ ID NO：11

12氨基酸插入

SEQ ID NO：12

Pv-CS核苷酸序列

SEQ ID NO：13

Pv-CS蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO：14

次要2型重复

核苷酸序列

SEQ ID No17

氨基酸序列

SEQ ID NO.18

RTS表达盒和RTS-HBsAg杂合蛋白的预测翻译产物的核苷酸序列.

在DNA序列之下显示了从TDH3 ATG密码子起始的翻译产物.

SEQ.ID.No 19：

CSV-S融合基因(克隆入pHIL-D2整合性巴斯德毕赤酵母表达载体)

核苷酸序列

SEQ.ID.No 20：

在巴斯德毕赤酵母中表达的CSV-S融合蛋白.

氨基酸序列

Claims (43)

1.免疫原性杂合融合蛋白，其包含：

a.源自间日疟原虫I型环子孢子蛋白重复区域的至少一个重复单位，

b.源自间日疟原虫II型环子孢子蛋白的重复区域的至少一个重复单位，和

c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S或其片段。

2.根据权利要求1的蛋白，其中该蛋白进一步包含来自间日疟原虫CS蛋白的N-末端片段。

3.根据权利要求2的蛋白，其中该N-末端片段包含称为(I)区的片段，例如SEQ ID No 1所示的(I)区的片段。

4.根据任何前述权利要求的蛋白，其中该蛋白进一步包含来自间日疟原虫CS蛋白的C-末端片段。

5.根据权利要求4的蛋白，其中C-末端片段包含称为(II)区的部分，例如SEQ ID No 2所示的基序。

6.根据前述权利要求任一项的蛋白，其中I型重复单位源自一种或多种下列间日疟原虫株：拉丁间日疟原虫株、美洲(即Sal 1，Belem)间日疟原虫株、韩国间日疟原虫株、中国间日疟原虫株、泰国间日疟原虫株、印尼间日疟原虫株、印度间日疟原虫株和越南间日疟原虫株。

7.根据前述权利要求任一项的蛋白，其中I型重复单位选自SEQID No 3到9中所示的一种或多种单体。

8.根据权利要求6或7的蛋白，其包含至少9个I型重复单位。

9.根据前述权利要求任一项的蛋白，其中II型单体选自SEQ IDNo 10或14中所示的一种或多种单体。

10.根据前述权利要求任一项的蛋白，其包含1个II型重复单位。

11.根据前述权利要求任一项的蛋白，其进一步包含位于在间日疟原虫的某些亚洲株中发现的重复区域末端的12个氨基酸插入。

12.根据权利要求11的蛋白，其中氨基酸是SEQ ID No 11所示的那些。

13.根据前述权利要求任一项的蛋白，其中乙型肝炎S抗原源自adw血清型。

14.根据前述权利要求任一项的蛋白，其进一步包含源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的一种或多种另外的抗原。

15.根据权利要求14的蛋白，其中抗原选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP。

16.根据权利要求1到15中任一项的蛋白，其包含SEQ ID No 13所示的杂合环子孢子蛋白序列。

17.组合物，其包含根据权利要求1到16中任一项的杂合融合蛋白和佐剂。

18.根据权利要求17的组合物，其中佐剂选自：

·金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝，

·水包油乳剂，

·toll样受体激动剂，(例如toll样受体2激动剂、toll样受体3激动剂、toll样受体4激动剂、toll样受体7激动剂、toll样受体8激动剂和toll样受体9激动剂)，

·皂苷，例如Quil A及其衍生物如QS7和/或QS21，

·包含寡核苷酸的CpG，

·3D-MPL，

·(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，

·DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸酯)，和

·MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)，

或其组合。

19.根据权利要求17或18的组合物，其中佐剂选自：

·与金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝缔合的皂苷，

·3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸，例如作为水包油制剂，

·脂质体形式的皂苷，例如进一步包含甾醇如QS21和甾醇，和

·ISCOM。

20.根据权利要求17到19中任一项的组合物，其进一步包含混合的源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的一种或多种另外的抗原。

21.根据权利要求17到20中任一项的组合物，其进一步包含表面活性剂。

22.根据权利要求21的组合物，其中表面活性剂选自Tween(例如Tween 20)、briji、聚乙二醇。

23.根据权利要求17到20中任一项的组合物，其中组合物是疫苗例如肠胃外用疫苗。

24.多聚体脂蛋白颗粒，其包含如权利要求1到16任一项中定义的杂合蛋白。

25.组合物，其包含如权利要求24中定义的颗粒和至少一种赋形剂/载体。

26.根据权利要求25的组合物，其进一步包含佐剂。

27.根据权利要求26的组合物，其中佐剂选自：

·金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝，

·水包油乳剂，

·toll样受体激动剂，(例如toll样受体2激动剂、toll样受体3激动剂、toll样受体4激动剂、toll样受体7激动剂、toll样受体8激动剂和toll样受体9激动剂)，

·皂苷，例如QuilA及其衍生物如QS7和/或QS21，

·包含寡核苷酸的CpG，

·3D-MPL，

·(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，

·DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸酯)，和

·MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)，

或其组合。

28.根据权利要求26或27的组合物，其中佐剂选自：

·与金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝缔合的皂苷，

·3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸，例如作为水包油制剂，

·脂质体形式的皂苷，例如进一步包含甾醇如QS21和甾醇，和

·ISCOM。

29.根据权利要求25到28中任一项的组合物，其进一步包含混合的源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的一种或多种另外的抗原。

30.根据权利要求25到29中任一项的组合物，其进一步包含表面活性剂。

31.根据权利要求30的组合物，其中表面活性剂选自Tween(例如Tween 20)、briji、聚乙二醇。

32.根据权利要求25到31中任一项的组合物，其中组合物是疫苗例如肠胃外用疫苗。

33.用于治疗的如权利要求1到16任一项中定义的蛋白或如权利要求17到23任一项中定义的组合物或如权利要求25到32任一项中定义的组合物。

34.如权利要求1到16任一项中定义的蛋白或如权利要求24中定义的颗粒在制备用于治疗/预防疟疾的药物中的用途。

35.根据权利要求34的用途，其中疟疾是由间日疟原虫引起的。

36.治疗易感染疟原虫感染的患者的方法，其包括给予有效量的如权利要求1到16任一项中定义的蛋白或如权利要求17到23或23到32任一项中定义的组合物，特别是作为疫苗，由此治疗或预防疟疾。

37.编码权利要求1到16任一项中定义的蛋白的核苷酸序列。

38.包含如权利要求37中定义的核苷酸序列的宿主。

39.用于生产如权利要求1到16任一项中定义的蛋白的方法，所述方法包括在适当的宿主中表达编码所述蛋白的核苷酸序列并且回收产物。

40.根据权利要求39的方法，其中所述宿主是酵母。

41.根据权利要求40的方法，其中所述酵母选自：酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，耶氏酵母(Yarrowia)，许旺酵母属(Schwanniomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，结合酵母(Zygoaccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，卡尔斯伯酵母(S.carlsberoensis)，乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)，Y1834和DC5。

42.根据权利要求40或41任一项的方法，其中通过用包含表面活性剂的适当组合物裂解宿主细胞而回收产物。

43.根据权利要求42的方法，其中表面活性剂选自：Tween(例如Tween 20)、briji、聚乙二醇。

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