CN101553249A - 用于疟疾的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的脂蛋白颗粒，用于制备和纯化其的方法，其用于药物的用途，特别是在预防疟疾感染中的用途，包含该颗粒或抗该蛋白颗粒的抗体例如单克隆或多克隆抗体的组合物/疫苗，和其用途，特别是在治疗中的用途。特别地，本发明涉及包含下列单体的免疫原性蛋白颗粒：a.包含源自间日疟原虫CS蛋白和乙型肝炎病毒S抗原的序列的融合蛋白(CSV－S)，和b.包含源自恶性疟原虫CS蛋白和乙型肝炎病毒S抗原的序列的融合蛋白(RTS)，和c.任选源自乙型肝炎病毒的S抗原。

Description

用于疟疾的疫苗

本发明涉及新的脂蛋白颗粒，用于制备和纯化其的方法，它在药物中的用途，特别是在预防疟疾感染中的用途，包含该蛋白或抗该蛋白颗粒的抗体例如单克隆或多克隆抗体的组合物/疫苗和其的用途，特别是在治疗中的用途。

疟疾是一种世界主要健康问题，每年超过2到4百万的人死于该疾病。这种疾病最流行的形式之一是由原生动物寄生虫间日疟原虫(P.vivax)引起的，其在热带和亚热带区域发现。令人感兴趣的是该寄生虫可在15℃的温度下完成它的蚊子周期，这允许疾病在温和的气候中传播。

该疾病最急性的形式之一是由原生动物寄生虫，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(P.falciparum)引起的，其是造成大多数可归因于疟疾的死亡的原因。

疟原虫的生活周期是复杂的，为完成需要两种宿主，人和蚊子。人的感染起始于子孢子引入被感染的蚊子的唾液。子孢子迁移到肝并且在那里感染肝细胞，在那里它们通过红细胞外细胞内阶段分化为裂殖子阶段，其感染红血细胞(RBC)以起始在无性血阶段的循环复制。这一循环通过RBC中的大量裂殖子分化为有性阶段配子母细胞而完成，其被蚊子摄取，在那里它们发育经过中肠中的一系列阶段以产生迁移入唾液腺的子孢子。

由于由间日疟原虫引起的疾病很少是致命的的事实，预防和治疗疟疾的努力聚焦于由恶性疟原虫(P.falciparum)引起的更致命形式的疾病。

尽管由间日疟原虫引起的疾病通常不导致患者的死亡，由于病例的数量，其看起来是逐渐增长的，对于患者生命质量的显著影响，导致贫血症和死亡的疾病的严重发生的渐增的报道，和经济影响，仍然需要用于该疾病的有效的接种。而且，能够提供针对这两种疾病原因的保护的单个疫苗是有利的。

间日疟原虫的特征是一些株能够通过在进入外周循环显示出临床症状之前保持潜伏在肝中导致延迟的感染。因此个体，例如当旅游经过受感染区域，可能被感染并且几个月内不显示出症状。这具有导致疾病的扩散的潜能，并且由于此原因旅行到受感染区域的人在旅行到受感染区域之后的限定的时期内不允许捐赠用于输血的血液。

当寄生虫经历pre-erthrocytic shizogony时，间日疟原虫疟疾感染保持潜伏在肝中。如果该寄生虫控制在此阶段，在它逃离肝之前，在患者中没有观察到疾病的临床症状。

疟原虫的子孢子阶段已被鉴定为疟疾疫苗的潜在靶标。用失活的(照射的)子孢子接种已经显示出诱导针对试验的人疟疾的保护(Am.J，Trop.Med.Hyg 24：297-402，1975)。然而，利用照射的子孢子制备基于此方法的用于普通人群的疟疾疫苗在实际上和逻辑上是不可能的。

子孢子的主要表面蛋白称作环子孢子蛋白(CS蛋白)。它被认为在它从蚊子接种的起始位点传代到循环的过程中涉及子孢子的运动和侵入，在那里它迁移到肝。

疟原虫种的CS蛋白特征为中央重复域(重复区域)，侧翼连接非重复氨基片段(N-末端)和羧基片段(C-末端)。间日疟原虫的中央区域由几段通常为9个串联氨基酸的重复单位组成。

在某些亚洲株中，在中央重复区域之后，存在大约12个氨基酸的另外的序列(见SEQ ID No：11)。后者的功能是未知的。然而，一些人假定所述氨基酸可能与疾病临床症状的延迟出现有关，尽管这还没有被研究。据认为N-末端特征为称作区域I的5个氨基酸的序列(见SEQ ID No：1)。还认为C-末端特征为包含称作区域II的18个氨基酸的序列。后者包含细胞粘附基序，其在所有疟疾CS蛋白中是高度保守的(见SEQ ID No：2)。

几个组已经建议了基于环子孢子蛋白的亚单位疫苗。两种这些疫苗已经经历了临床测试：一个是合成肽，另一是重组蛋白(Ballou等，Lancet：i1277 (1987)和Herrington等，Nature 328：257(1987))。这些疫苗在刺激抗-子孢子响应中是成功的。但是，响应的大小是令人失望的，一些疫苗根本不产生响应。而且，缺少在接下来的感染之后的抗体水平的“加强”和体外淋巴细胞增殖测定的结果显示了大多数这些自愿者的T-细胞不识别免疫显性重复区域。然而，每个研究中一个接种的自愿者没有发展出寄生虫血症。

WO 93/10152和WO 98/05355描述了源自恶性疟原虫的CS蛋白的疫苗，并且看起来利用本文所述方法对于抗恶性疟原虫的疫苗取得了一些进展，还可见Heppner等，2005，Vaccine 23，2243-50。

恶性疟原虫中的CS蛋白具有保守的中央重复区域。对比之下，对于间日疟原虫已知至少两种形式的CS蛋白(称作VK210或I型和VK247或II型)。这使得鉴定具有所有期望性质例如免疫原性的CS蛋白的构建体是更困难的，所述构建体提供针对间日疟原虫的一般保护而不论CS蛋白的特定类型，因为针对I型的中央重复区域的抗体不必然识别II型的对应区域的表位，反之亦然。

重组间日疟原虫CS蛋白在1980-1990′s有限成功地作为疫苗被表达和测试(Collins等，1989.Am.J.Trop.Med.Hyg.40，455-64)。已经进行了利用交联的一种或多种表位发展基于多抗原肽(MAP)的疫苗的一些工作(Nardelli和Tarn，1995，Pharm.Biotechnol.6，803-19)。

本发明提供了用于疟疾疫苗的抗原颗粒，其据信产生体液应答并且还有细胞免疫应答。抗原颗粒据信诱导针对恶性疟原虫和间日疟原虫I型和II型CS蛋白的抗体的产生。抗原还可诱导T辅助细胞，例如Th1和/或Th2细胞。

相应地，本发明提供了包含下列单体的免疫原性蛋白颗粒：

a.包含源自间日疟原虫的CS蛋白和乙型肝炎S抗原的序列的融合蛋白(CSV-S)，和

b.包含源自恶性疟原虫的CS蛋白和乙型肝炎的S抗原的序列的融合蛋白(RTS)，和任选地

c.源自乙型肝炎病毒的S抗原。

序列表

SEQ ID No：1    N-末端中的I区

SEQ ID No：2    C-末端中的II区

SEQ ID No：3-9  I型CS蛋白的不同重复单位

SEQ ID No：10   来自II型CS蛋白的主要重复单位

SEQ ID No：11   发现于亚洲株的另外的氨基酸

SEQ ID No：12   杂合蛋白CSV的核苷酸序列

                (为在大肠杆菌(E.Coli)中表达而最优化)

SEQ ID No：13    杂合蛋白CSV的氨基酸序列

SEQ ID No：1     来自II型CS蛋白的次要重复单位

SEQ ID No：5     杂合蛋白CSV的核苷酸序列

                 (为在酵母中表达而最优化)

SEQ ID No：16    杂合融合蛋白CSV-S的核苷酸序列

SEQ ID No：17    杂合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列

SEQ ID No：18    RTS表达盒和预测的RTS，S蛋白的核苷酸

                 序列

附图

图1 pRIT1 5546的质粒图谱是酵母游离型载体。

图2 pGF 1-S2，GSK制备的质粒，应用于“融合”期望的抗原和来自乙型肝炎的S抗原，的质粒图谱。在SmaI位点之间克隆异源DNA序列(在切除12bp的SmaI DNA片段之后)产生了与S基因的符合读框的融合。

图3 pRIT15582的质粒图谱

用Xhol消化释放了带有插入了LEU2选择标记的CSV-S表达盒的8.5kb的线性DNA片段，用于插入酵母染色体。

图4 用于整合CSV-S盒的线性Xhol片段的限制性图谱。

图5 在Y 1835株中表达的重组蛋白的Western印迹。

    A组：用抗-S抗体显示的WB

         装载的样品(100μg总蛋白/孔)：

         1：Y1631(RTS，S生产株，作为对比)

         2：Y1835

         3：Y1835

         4：Y1834

    B组：用抗-CSV抗体显示的WB

         装载的样品(100μg总蛋白/孔)：

         1：Y1631(RTS，S生产株，作为对比)

         2：Y1295

         3：Y1835

         4：Y1834

          5：nr(另一构建体CSVS)

          6：nr(另一构建体-仅仅S抗原)

图6 在Y1835株中产生的CSV-S，S混合颗粒的电子显微照片。

    CSV-S，S颗粒从可溶细胞提取物中纯化(基于RTS，S纯化方法)并且进行电子显微镜法分析。在用磷钨酸阴性染色之后，颗粒显现。大小为100nm。

图7 在Y1845株中表达的重组蛋白的Western印迹。

    用抗-S抗体显示WB

    总装载的蛋白量在括号内

        1：Y1835(100μg)

        2：Y1631(100μg-RTS，S生产株，作为对比)

        3：Y1845(100μg)

        4：Y1845(50μg)

        5：Y1845(25μg)

图8 从Y1845株制备的无细胞提取物的CsCl密度分析。

因此应用于本发明的融合蛋白CSV-S包含：源自间日疟原虫的CS蛋白的部分(CSV)。这种CSV抗原可以是天然蛋白例如发现于间日疟原虫的I型CS蛋白中和/或发现于间日疟原虫的II型蛋白中。或者CSV蛋白可以是包含来自所述I型和II型CS蛋白的成分的杂合蛋白或嵌合蛋白。当后者融合于S抗原时，这在本文中称作杂合融合蛋白。

CSV-S在本文中用作覆盖了包含来自间日疟原虫CS蛋白的序列/片段和来自乙型肝炎S-抗原的序列/片段的融合蛋白的通称。

RTS在本文中用作覆盖了包含来自恶性疟原虫CS蛋白的序列/片段和来自乙型肝炎S-抗原的序列/片段的融合蛋白的通称。

杂合/嵌合蛋白将一般地包含：源自间日疟原虫的I型环子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位，和源自间日疟原虫的II型环子孢子蛋白的中央重复部分的至少一个重复单位。

通常，杂合蛋白还将包含来自疟原虫例如间日疟原虫的CS蛋白的N-末端片段，例如包含I区例如SEQ ID No：1所示的氨基酸的片段。

通常，杂合蛋白还将包含来自疟原虫例如间日疟原虫的CS蛋白的C-末端片段，例如包含II区例如SEQ ID No：2所示的基序的片段。

虽然不希望被理论所束缚，据认为N和C末端片段包括几种T和B细胞表位。

任何适当的间日疟原虫株可用于本发明，包括：拉丁间日疟原虫株，美洲(即Sal 1，Belem)间日疟原虫株，韩国间日疟原虫株，中国间日疟原虫株，泰国间日疟原虫株，印尼间日疟原虫株，印度间日疟原虫株和越南间日疟原虫株。SEQ ID No 13中的构建体基于韩国株(更特别地南韩株)。

具有I型CS蛋白的间日疟原虫比具有II型CS蛋白的间日疟原虫更流行。因此在一个方面，本发明利用来自I型的CS蛋白。在另一方面，本发明提供了包含来自I型的重复单位和来自II型的重复单位的杂合蛋白，例如其中比II型重复单位更多的来自I型的重复单位被包括在杂合体中。

更特别地，本发明的杂合蛋白可包括来自I型的1到15个重复单位例如9个重复单位。

来自I型CS蛋白的适当的重复单位的例子在SEQ ID NoS：3到9中给出。

在一个实施方式中，本发明提供了具有不同的I型重复单位，例如SEQ ID NoS 3到9所列的每种的一种的混合体的杂合体。

一个或多个重复单位可在杂合体中复制，例如SEQ ID No 3和/或4的两种重复单位可并入构建体中。

a)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 3的单位。

b)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 4的单位，任选与上述a)段所述的单位组合。

c)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 5的单位，任选与上述a)或b)段所述的单位组合。

d)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 6的单位，任选与上述a)到c)段所述的一个或多个单位组合。

f)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 7的单位，任选与上述a)到d)段所述的一个或多个单位组合。

g)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 8的单位，任选与上述a)到f)段所述的一个或多个单位组合。

h)在一个方面，CS蛋白包含SEQ ID No 9的单位，任选与上述a)到g)段所述的一个或多个单位组合。

来自II型CS蛋白的适当的组成的重复单位的例子在SEQ ID NoS10和14，例如10，中给出。

在本发明的一个方面，提供了具有源自II型的5种或更少种重复单位，例如一种重复单位，例如如SEQ ID No.10所示，的杂合蛋白。

杂合体还可包括发现于间日疟原虫的某些亚洲株中的重复区域的末端的12个氨基酸插入，例如如SEQ ID No.11所示。

在一个实施方式中，杂合蛋白包含源自间日疟原虫CS蛋白的大约257个氨基酸。

本发明的CSV源抗原成分通常融合于S蛋白的氨基末端。

据信来自乙型肝炎的表面抗原的存在增加了CS蛋白部分的免疫原性，酸稳定性，和/或辅助了蛋白的可复制性制备。

在一个实施方式中，杂合融合蛋白包含大约494个氨基酸，例如其的大约257个源自间日疟原虫CS蛋白。

杂合融合蛋白还可进一步包括源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的抗原，例如其中抗原选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP或其片段。

其他例子，源自恶性疟原虫的抗原包括PfEMP-I、Pfs 16抗原、MSP-I、MSP-3、LSA-I、LSA-3、AMA-I和TRAP。其他的疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、Pf332、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230和它们在其他疟原虫种中的类似物。

在一个实施方式中，杂合融合蛋白(CSV-S)具有SEQ ID No.17所示的氨基酸序列。在该序列中氨基酸6到262源自CSV并且269到494源自S。通过基因构建引入剩下的氨基酸(其，特别地当适当时可改变)。这四种氨基酸，Met、Met、Ala、Pro，特别地源自质粒pGF1-S2(见图4)。

SEQ ID No.17的CSV-S融合蛋白的性质在下表中提供

分析	完整蛋白
		分子量	51794.75m.w.
长度	494
		1毫克＝	19.307 pMol
摩尔消光系数	90780+/-5％
		1A(280)	0.57 mg/ml
等电点	7.33
		在pH 7的电荷	1.05

完整蛋白组成分析

氨基酸	数量	％重量	％频率
				带电荷的(RKHYCDE)酸性的(DE)碱性的(KR)极性的(NCQSTY)疏水性的(AILFWV)	1063839134167	26.358.8210.6828.1534.68	21.467.697.8927.1333.81
A AlaC CysD AspE GluF PheG GlyH HisI IleK LysL LeuM MetN AsnP ProQ GlnR ArgS SerT ThrV ValW TrpY Tyr	5218241417644172042832402119302625147	7.143.585.333.494.837.051.063.714.959.182.037.057.505.205.735.045.084.785.032.21	10.533.644.862.833.4412.960.813.444.058.501.626.488.104.253.856.075.265.062.831.42
				B AsxZ GlxX XxxTer	0001	0.000.000.000.00	0.000.000.000.20

SEQ ID No 17的蛋白的核苷酸序列在SEQ ID No 16中给出。

命名为RTS的本发明的蛋白颗粒的成分(即源自恶性疟原虫)可如WO 93/10152中所述地制备，其包括RTS^*(来自恶性疟原虫NF54/3D7株)的描述。

在本发明的一个或多个实施方式中，应用于融合蛋白的源自恶性疟原虫的抗原可以是其基本完整的CS蛋白。在本发明的一个实施方式中，应用了全长S-抗原。在另一实施方式中，应用了所述S-抗原的片段。

在一个实施方式中，源自恶性疟原虫的抗原包含中央重复区的至少4种重复单位。更特别地，这种抗原包含含有至少160个氨基酸的序列，其与CS蛋白的C-末端部分基本上同源。CS蛋白可缺乏从C末端的后12到14个(例如12个)氨基酸。

特别地，在颗粒中应用了一种融合蛋白，其包含通过线性连接体符合读框地融合于S抗原的N-末端的基本上对应于恶性疟原虫(NF54[3D7]株)7G8的CS蛋白的氨基酸207-395的CS蛋白的部分。连接体可包含来自S-抗原的preS2部分。

更特别地，应用的源自恶性疟原虫的融合蛋白是被SEQ ID No 18中所提供的用于RTS表达盒的核苷酸序列编码。

适当的S抗原，可包含preS2。适当的血清型的例子是adw(Nature280：815-819，1979)。

在一个方面，本发明的杂合融合蛋白包含源自突变s蛋白的部分，例如如公开的美国申请No.2006/194196(也公开为WO 2004/113369)中所述的。该文献描述了命名为HDB05的突变体。特别地，它在图1和6中描述了突变体和野生型蛋白的对比，在图4和5中描述了突变体的基因。其中的序列12到22描述了突变S蛋白的特定多肽。上述中的每种引入本文作为参考。

融合蛋白CSV-S可例如利用质粒pGF1-S2(见图2并且为获得进一步的细节见实施例)制备，当对应于CSV的适当序列插入SamI克隆位点时，其可在适当条件下产生融合蛋白CSV-S。

在一个实施方式中，编码本发明的蛋白的DNA序列侧翼连接转录控制元件，优选源自酵母基因并且并入表达载体中。

本发明杂合蛋白的表达盒可例如构建为包含下列特征：

-启动子序列，源自例如酿酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。

-编码适当的融合蛋白的序列。

-包含在序列中的转录终止序列，源自例如，酿酒酵母ARG3基因。

特定启动子的例子是来自酿酒酵母TDH3基因的启动子(Musti等)。

本发明还涉及杂合融合蛋白的制备中利用的载体。

然后可应用适当的质粒以将编码杂合融合蛋白的序列插入到适当的宿主中合成。适当的质粒的例子是pRIT15546，一种用于携带适当的表达盒的基于2微米的载体，见图1并且为获得进一步的细节见实施例。

质粒通常将包含辅助筛选的内在标记，例如编码抗生素抗性或LEU2或HIS营养缺陷型的基因。

通常，宿主将具有颗粒中每种融合蛋白的表达盒，并且还可具有整合入它的基因组的S抗原的一种或多种表达盒。

本发明还涉及用根据本发明的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核的，但优选是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)如ATCC数据库中的DC5(登录号20820)，名称为RIT DC5 cir(o)，保藏者：Smith Kline-RIT)和非酵母属酵母。这包括裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))，毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，耶氏酵母(Yarrowia)(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))和许旺酵母属(Schwanniomyces)(例如，西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis))。

在一个方面，本发明涉及用于表达融合蛋白的重组酵母株Y1834(及其用途)，其制备见实施例。

在另一实施方式中，本发明提供了用于表达本发明融合蛋白的重组酵母株Y1835或Y1845(及其用途)，进一步的细节见实施例。

本文应用的核苷酸序列或其部分(例如编码CS/杂合蛋白的部分但任选不为编码蛋白S的部分)可以为在宿主例如酵母中的表达而密码子最优化。

本发明还涉及应用于本发明的包含多核苷酸例如编码颗粒的两种或多种成分的DNA的宿主。

在一个实施方式中，宿主细胞包含源自间日疟原虫的融合蛋白的表达盒和源自恶性疟原虫的融合蛋白的表达盒。

在某些宿主中，例如酵母细胞，一旦表达，融合蛋白(包含S抗原)自发地装配为由所述融合蛋白的多种单体组成的蛋白结构/颗粒。当酵母表达两种不同的融合蛋白时，这些据信在颗粒中共组装。

当选择的受体酵母株已经在其基因组中携带了乙型肝炎S表达盒的几种整合的拷贝时，然后组装的颗粒还可包括未融合的S抗原的单体。

这些颗粒还可涉及病毒样颗粒(VLP)。颗粒还可描述为多聚体(multimeric)脂蛋白颗粒。

或者这些颗粒可以多种方式制备，例如通过将每种疟原虫源抗原与另一融合伴侣(例如乙型肝炎病毒抗原或病毒结构蛋白)融合并在适当的宿主例如酵母或细菌中表达其。

因此，提供了包含下列单体的免疫原性蛋白颗粒：

a.包含源自间日疟原虫的CS蛋白的序列的融合蛋白，和

b.包含源自恶性疟原虫的CS蛋白的序列的融合蛋白。

在一个进一步的方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含：

a)源自间日疟原虫的CS蛋白的序列(例如来自I型和/或II型的重复区域的序列)，

b)源自恶性疟原虫的CS蛋白的序列(例如来自其重复区域的序列)，和

c)来自乙型肝炎S-抗原的序列。

因此，本发明涉及蛋白颗粒，其包含源自间日疟原虫的CS蛋白的融合蛋白和源自恶性疟原虫的CS蛋白的融合蛋白，其中选择与疟原虫抗原融合的抗原以当所述融合蛋白在适当的宿主中表达时诱导脂颗粒的形成/装配。

因此，本发明提供了包含CSV-S和RTS单位的VLP。在一个方面，本发明提供了基本上由CSV-S和RTS单位组成的颗粒。在另一方面，产生的颗粒包含CSV-S，RTS和S单位或基本上由这些组分组成。

可利用不同的方法操纵用于制备所述颗粒的酵母，例如，融合蛋白的表达盒可插入已经包含一种需要的融合蛋白和/或S抗原的表达盒的酵母基因组。然而，本领域熟练技术人员能够制备用于制备根据本发明的颗粒的适当的宿主。

因此，在一个方面，本发明提供了适当的宿主例如包含编码CSV-S，RTS和任选S的DNA的酵母。在另一方面，适当的宿主是能够表达CSV-S，RTS和任选S的一种或多种质粒。例如，质粒可以用于与例如酵母协力表达蛋白。

尽管不希望被理论所束缚，据认为用于将蛋白从细胞释放的表面活性剂也可辅助脂蛋白颗粒的稳定化。

假定本发明的脂蛋白颗粒可促成在体内进一步刺激对抗原蛋白的免疫应答。

在一个方面，本发明提供了编码一种或多种CS蛋白的复制缺陷病毒载体，例如对应于包含在根据本发明的颗粒中的一种或多种CS蛋白。

适当的病毒载体可源自腺病毒载体，腺伴随病毒载体(AAVs)，麻疹(measles)，慢病毒(lentiviruses)，甲病毒(alphaviruses)，bacloviruses，单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)，和痘病毒(poxviruses)例如牛痘(cowpox)，鸟痘(fowlpox)，鸽痘(pigeonpox)，金丝雀痘(canarypox)，猪痘(suipox)，绵羊痘(sheeppox)/山羊痘(goatpox)。制备编码疟疾抗原的腺病毒载体的方法例如描述于WO 2004/055187。

载体编码的蛋白可例如被修饰以预防在表达过程中的蛋白的糖基化，例如某些丝氨酸可被丙氨酸残基取代以降低糖基化。

应用于本发明的病毒载体可以是重组的。

腺病毒

本发明的腺病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸(DNA)，其编码一种或多种免疫原性多肽。

用于本发明的腺病毒载体可以是源自一系列的哺乳动物宿主。

腺病毒(本文表示为“Ad”或“Adv”)具有特有的形态学，所述特有的形态学具有由三种主要蛋白，六邻体(II)(hexon(II))，五邻体基(III)(penton base(III))和突出的纤维(IV)(knobbed fibre(IV))，与许多其他次要蛋白，VI，VIII，IX，IIIa和IVa2一起组成的icosohedral衣壳(Russell W.C.2000，Gen Viriol，81：2573-2604)。病毒基因组是线性，双链DNA，末端蛋白共价附着于5’末端，其具有反向的末端重复序列(ITRs)。病毒DNA与高度碱性蛋白VII和名称为mu的小肽密切相关。另一蛋白，V，与这种DNA-蛋白复合体包装并且提供了通过蛋白VI与衣壳的结构性连接。病毒还包含病毒-编码蛋白酶，其对于加工一些结构蛋白以产生成熟感染病毒是必要的。

超过100种独特血清型的腺病毒已被分离，其感染不同哺乳动物种，其的51种是人源的。因此一种或多种腺病毒载体可源自人腺病毒。所述人源腺病毒的例子是Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad24、Ad34、Ad35、Ad50/51，特别是Ad5、Ad11和Ad35。基于大量生物，化学，免疫和结构标准人血清型已被分类为六种亚属(A-F)。

尽管基于Ad5的载体已被广泛使用于大量基因治疗试验中，对于Ad5和其他C组腺病毒载体的使用可能有限制，因为由于天然感染在一般群体中的预存的免疫性。Ad5和其他C组成员倾向于为最大血清阳性率的血清型。对于现存载体的免疫性可作为在治疗过程中暴露于载体的结果而发展。这些类型的预存的或已发展的对于血清阳性载体的免疫性可限制基因治疗或接种工作的有效性。替代的腺病毒血清型，因此在能够规避宿主免疫应答的基因递送系统的研究中成为非常重要的靶标。

替代血清型的一种所述领域是源自非人灵长类的那些，特别是黑猩猩腺病毒。见美国专利6,083,716，其描述了两种黑猩猩腺病毒基因组。

已经显示黑猩猩(″Pan″或″C″)腺病毒载体如人腺病毒载体一样有效地诱导对于转基因产物的强的免疫应答(Fitzgerald等，J.Immunol.170：1416)。

非人灵长类腺病毒可从黑猩猩的肠系膜淋巴结中分离。黑猩猩腺病毒与人腺病毒C亚型充分类似足以允许E1缺失的病毒在HEK293细胞中的复制。然而黑猩猩腺病毒在系统发育上与更普通的人血清型(Ad2和Ad5)不同。Pan6与Pans 5、7和9更不密切相关并且血清学上不同于Pans 5、7和9。

因此一种或多种腺病毒载体可源自非人灵长类腺病毒，例如黑猩猩腺病毒，如选自血清型Pan5、Pan6、Pan7和Pan9中的一种。

腺病毒载体还可源自多于一种的腺病毒血清型，并且每种血清型可来自相同或不同来源。例如，它们可源自多于一种的人血清型和/或多于一种的非人灵长类血清型。构建嵌合腺病毒载体的方法公开于WO2005/001103。

存在与将异源DNA插入腺病毒相关的某些大小限制。人腺病毒具有包装多至105％野生型基因组长度的能力(Bett等，1993，J Virol 67(10)，5911-21)。对于人腺病毒更低的包装限制已经显示为75％的野生型基因组长度(Parks等，1995，J Virol 71(4)，3293-8)。

本发明中有用的腺病毒的一个例子是不同于在人群中流行的天然存在的血清型例如Ad2和Ad5的腺病毒。这避免了诱导针对载体的有效免疫应答，所述针对载体的有效免疫应答通过中和抗体和影响毒性而阻断载体吸收而限制了接下来给予相同血清型的功效。

因此，腺病毒可以是不为流行的天然存在的人病毒血清型的腺病毒。分离自动物的腺病毒具有免疫学不同的衣壳，六邻体，五邻体和纤维组分，但是是系统发育上紧密相关的。特别地，病毒可以是非人腺病毒例如猿腺病毒，并且特别是黑猩猩腺病毒例如Pan 5、6、7或9。所述株的例子描述于WO 03/000283并且可获自美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，及其他来源。期望的黑猩猩腺病毒株是Pan 5[ATCC VR-591]、Pan 6[ATCC VR-592]和Pan 7[ATCC VR-593]。

黑猩猩腺病毒的利用被认为比人腺病毒血清型有利，因为缺少对于靶群体中的腺病毒预存的免疫性，特别是缺少交叉中和抗体。黑猩猩腺病毒与预存的中和抗体应答的交叉反应仅仅存在于2％的靶群体中，与之相比，在某些候选人腺病毒载体的例子中为35％。黑猩猩腺病毒与更普通的人亚型Ad2和Ad5不同，但更紧密相关于E亚组的人Ad4，其不是流行的亚型。Pan6与Pan 5、7和9不紧密相关。

本发明的腺病毒可以是复制缺陷的。这意味着它具有与野生型病毒相比降低的在非补足细胞(non-complementing cell)中复制的能力。这可通过将病毒突变而获得，例如通过删除复制中涉及的基因，例如删除E1a、E1b、E3或E4基因。

根据本发明的腺病毒载体可源自包含功能性E1缺失的复制缺陷腺病毒。因此根据本发明的腺病毒载体可以是复制缺陷的，由于没有表达腺病毒E1a和E1b的能力，即，是E1a和E1b功能缺失的。重组腺病毒还可具有其他基因的功能缺失(见WO 03/000283)，例如，E3或E4基因的缺失(或其部分例如E3的部分)。腺病毒延迟早期基因E3可从组成重组病毒的部分的腺病毒序列中排除。E3的功能对于产生重组腺病毒颗粒是不必要的。因此，取代这种基因产物的功能以包装本发明中有用的重组腺病毒是不必要的。在一个特定实施方式中，重组腺病毒具有功能缺失的E1和E3基因。所述载体的构建描述于Roy等，Human Gene Therapy 15：519-530，2004。在一个方面，腺病毒具有E1和E4缺失和E3部分缺失。

重组腺病毒还可构建为具有E4基因的功能缺失，尽管保持E4ORF6功能是期望的。根据本发明的腺病毒载体还可包含延迟早期基因E2a的缺失。还可产生腺病毒基因组晚期基因L1到L5中任何的缺失。类似地，中期基因IX和IVa的缺失可以是有用的。

可在其他结构或非结构腺病毒基因中产生其他的缺失。上述缺失可单独使用，即，用于本发明的腺病毒序列可仅仅包含E1缺失。或者，对于破坏其生物活性有效的整个基因或其部分的缺失可以任何组合利用。例如，在一个示例性载体中，腺病毒序列可具有E1基因和E4基因的缺失，或E1、E2a和E3基因的缺失，或E1和E3基因的缺失(例如E1a和E1b中的功能缺失，和E3的至少部分的缺失)，或具有或不具有E3缺失的E1、E2a和E4基因的缺失等等。所述缺失可以是这些基因的部分或全部的缺失，并且可与其他突变组合，例如温度敏感突变，以获得期望的效果。

腺病毒载体可在任何适当的细胞系上产生，在其中病毒能够复制。特别地，提供在病毒载体中缺少的导致其受损害的复制特性的因素(例如E1和/或E4)的补足细胞系可被利用。不受限制，所述细胞系可以是HeLa[ATCC登录号CCL 2]，A549[ATCC登录号CCL 185]，HEK293，KB [CCL 17]，Detroit[例如，Detroit 510，CCL 72]和WI-38[CCL75]细胞，等等。这些细胞系都获自美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia  20110-2209。其他适当的亲本细胞系可获自其他来源，例如PER.C6

细胞，如应用微生物和研究中心(CAMR，UK)的欧洲动物细胞培养保藏中心(ECACC)的ECACCno.96022940保藏的细胞所代表的，或Her96细胞(Crucell)。

本发明涉及用于制备编码本发明蛋白的病毒载体的已知细胞系的用途。

编码免疫原性CS多肽的多核苷酸序列可为哺乳动物细胞进行密码子最优化。所述密码子最优化在WO 05/025614中详细描述。

本发明还涉及包含免疫保护量的根据本发明的蛋白颗粒与适当的稀释剂或载体混合的疫苗。

本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含根据本发明的颗粒和病毒载体，所述病毒载体包含疟疾抗原，特别是与所述颗粒共同的疟疾抗原，和任选的佐剂。

在本说明书的上下文中，赋形剂指自身不具有治疗效果的在药物制剂中的成分。稀释剂或载体落入赋形剂的定义。

在本说明书的上下文中免疫原性意指引发(illicit)免疫应答的能力。这种应答可以例如是当脂蛋白颗粒以可包括/需要适当的佐剂的适当制剂给予时的。可需要包含类似于或少于原始剂量的剂量的加强剂量(booster)以获得需要的免疫原性应答。根据本发明的组合物/药物制剂还可在混合物中包括一种或多种另外的抗原例如源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的那些，例如其中抗原选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP或其片段。

其他的例子，源自恶性疟原虫的抗原包括PfEMP-1、Pfs 16抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1和TRAP。其他的疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、Pf332、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230和它们在其他疟原虫种中的类似物。

根据本发明的组合物/药物制剂还可包含与根据本发明的颗粒混合的RTS，S颗粒(如WO 93/10152中所述)。

在一个实施方式中，病毒载体构建体如WO2004/055187中所述。

在本发明的疫苗中，颗粒的水溶液可直接使用。或者，进行或不进行先前的冻干化的蛋白可与任何已知的佐剂混合或吸收，所述已知的佐剂包括但不限于明矾，胞壁酰二肽，皂苷例如Quil A。

特定的佐剂选自金属盐，水包油乳剂，Toll样受体激动剂(特别是，Toll样受体2激动剂，Toll样受体3激动剂，Toll样受体4激动剂，Toll样受体7激动剂，Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)，皂苷，或其组合，条件是金属盐仅仅与另一佐剂组合使用并且不单独使用除非它们制剂为使得不超过大约60％的抗原吸附到金属盐上。更特别地，不超过大约50％，例如40％的抗原吸附到金属盐上，并且在一个实施方式中，不超过大约30％的抗原吸附到金属盐上。吸附到金属盐上的抗体的水平可通过本领域熟知的技术确定。可通过例如在磷酸盐离子如磷酸盐缓冲盐存在下制剂组合物，或通过增加抗原与金属盐的比例而增加游离抗原的水平。在一个实施方式中，佐剂不包括作为唯一佐剂的金属盐。在一个实施方式中，佐剂不包括金属盐。

在一个实施方式中，佐剂是Toll样受体(TLR)4配体，优选激动剂例如脂质A(lipid A)衍生物特别是单磷酰基脂质A或更特别是3脱酰单磷酰基脂质A(3D-MPL)。

3脱酰单磷酰基脂质A已知于美国专利No.4,912,094和英国专利申请No.2,220,211(Ribi)，并且可获自Ribi Immunochem，Montana，USA。

3D-MPL为Corixa corporation以商标

出售，并且主要以IFN-g(Th1)表型促进CD4+T细胞应答。可根据GB2 220 211 A中公开的方法产生它。化学上，它是3-脱酰单磷酰基脂质A与3、4、5或6个酰化链的混合物。优选在本发明的组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有使得它可通过0.22μm滤器无菌过滤的颗粒大小。所述制剂在国际专利申请No.WO 94/21292中进行了描述。脂质A的合成衍生物是已知的并且被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-O-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294 DP(3S，9 R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

典型地，当使用3D-MPL时，抗原和3D-MPL与明矾一起递送或以一种水包油乳剂或多种水包油乳剂呈递。3D-MPL的引入是有利的，因为它是效应T-细胞应答的刺激剂。

其他的可使用的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，例如在WO 9850399或US 6303347中公开的那些(制备AGPs的方法也被公开)，或US 6764840中公开的药学上可接受的AGPs盐。一些AGPs是TLR4激动剂，并且一些是TLR4拮抗剂。两者都被认为作为佐剂是有用的。

另一用于本发明的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美树Quilaja Saponaria Molina的皂苷制剂并且首先被Dalsgaard等在1974年(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die  gesamteVirusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)描述为具有佐剂活性。Quil A的纯化片段已通过HPLC分离，其保持佐剂活性而没有与Quil A(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)，有关的毒性。QS-21是源自Quillaja saponaria Molina的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)，Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答。

QS21的特定制剂已被描述，其进一步包含甾醇(WO 96/33739)。QS21：甾醇的比例典型地为大约重量比1∶100到1∶1。

通常存在过量的甾醇，QS21：甾醇的比例为至少1∶2w/w。典型地对于人，QS21和甾醇的给药以每剂大约1μg到大约100μg范围例如大约10μg到大约50μg的范围的疫苗存在。

脂质体通常包含中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下通常是非结晶的，例如卵黄磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱或二月桂基磷脂酰胆碱。脂质体还可包含带电荷脂质，其对于由饱和脂质组成的脂质体增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些例子中，带电荷脂质的量通常是1-20％w/w，例如5-10％。甾醇比磷脂的比例是1-50％(mol/mol)，例如20-25％。

这些组合物可包含MPL(3-脱酰单磷酰基脂质A，也称作3D-MPL)。3D-MPL在GB 2 220 211(Ribi)中已知为3种类型的脱-O-酰化单磷酰基脂质A与4、5或6个酰化链的混合物，并且其被Ribi Immunochem，Montana生产。

皂苷可以胶束，混合胶束(通常，但不排他地具有胆汁盐)的形式分离，或当与胆固醇和脂质一起制剂时，可以是下列形式：ISCOM基质(EP 0 109 942)，脂质体或相关胶质结构例如蠕虫样或环样多聚体复合体或脂质/分层的结构和薄片，或者为水包油乳剂的形式(例如，如WO 95/17210中所述)。皂苷经常可与金属盐联合，例如氢氧化铝或磷酸铝(WO 98/15287)。

通常皂苷以脂质体，ISCOM或水包油乳剂的形式存在。

免疫刺激寡核苷酸也可使用。用于本发明的佐剂或疫苗的寡核苷酸的例子包括CpG，其包含寡核苷酸，通常包含通过至少三种，更优选至少六种或更多种核苷酸分离的两种或更多种二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸，接着鸟嘌呤核苷酸。CpG寡核苷酸典型地是脱氧核苷酸。在一个实施方式中，在寡核苷酸中的核苷酸间(internucleotide)是二硫代磷酸酯，或更优选地是硫代磷酸酯键，然而磷酸二酯和其他核苷酸间键在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US 5,278,302和WO95/26204。

寡核苷酸的例子如下：

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)

TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)，

序列可包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。

替代的CpG寡核苷酸可包含具有无关紧要的缺失或添加的上述一种或多种序列。

CpG寡核苷酸可通过本领域任何已知的方法合成(例如见EP468520)。便利地，所述寡核苷酸可利用自动合成仪合成。

TLR2激动剂的例子包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如Imiquimod和Resiquimod是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(人中的TLR8和小鼠中的TLR7)，然而双链RNA和聚IC(聚肌苷-聚胞苷酸-一种商业上合成的病毒RNA模拟物)是示例性的TLR3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的例子，同时CpG是TLR9激动剂的例子。

免疫刺激剂可替代地或另外地包括。在一个实施方式中，这种免疫刺激剂将是3脱酰化单膦酰基脂质A(3D-MPL)。

在一个方面，佐剂包含3D-MPL。

在一个方面，佐剂包含QS21。

在一个方面，佐剂包含CpG。

在一个方面，佐剂配制为水包油乳剂。

在一个方面，佐剂配制为脂质体。

佐剂组合包括3D-MPL和QS21(EP 0 671 948 B1)，包含3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO 95/17210，WO 98/56414)，或与其他载体一起制剂的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)。其他优选的佐剂系统包含如US6558670和US 6544518中所述的3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，提供了包含与3D-MPL和载体组合的本文所述颗粒的疫苗。典型地载体将是水包油乳剂或明矾。

本发明的蛋白颗粒还可包封为微颗粒例如脂质体。

疫苗制剂一般地描述于New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.，1978。在脂质体中的包封被Fullerton描述于例如，美国专利4,235,877。

存在于每个疫苗剂量的本发明蛋白颗粒的量选自在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而没有显著的不利副作用的量。所述量将根据利用的特定免疫原和疫苗是否具有佐剂而改变。通常，预期每个剂量将包含1-1000μg的蛋白，优选1-200μg，最优选10-100μg。对于特定疫苗的最佳量可通过涉及观察受试者中的抗体滴度和其他应答的标准研究而确定。在初次疫苗接种之后，受试者优选在大约4周内接受加强(boost)，然后只要存在感染风险每六个月重复加强。对本发明蛋白的免疫应答通过利用佐剂和/或免疫刺激剂而增强。

使用的3D MPL的量通常是小的，但依赖于疫苗制剂可以在每剂1-1000μg的范围，例如每剂1-500μg，并且例如在每剂1到100μg之间。

在本发明的佐剂或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常是小的，但依赖于疫苗制剂可以在每剂1-1000μg的范围内，优选每剂1-500μg，并且更优选在每剂1到100μg之间。

用于本发明的佐剂中的皂苷的量可以在每剂1-1000μg的范围内，优选每剂1-500μg，更优选每剂1-250μg，并且最优选在每剂1到100μg之间。

本发明的制剂可用于预防和治疗目的。治疗包括预防处理。相应地，本发明提供了如本文所述用于药物的疫苗组合物，例如，用于疟疾的治疗(包括预防)。

本发明的进一步方面是提供用于制备本发明的杂合蛋白的方法，所述方法包含在适当的宿主中表达编码所述蛋白的DNA序列，优选在酵母中，并且回收产物。

本发明的进一步的方面是治疗易感染疟原虫感染的患者的方法，通过给予如本文前述的有效量的疫苗。

在一个进一步的方面，提供了治疗组合，包含根据本发明的免疫原性颗粒和编码疟疾抗原例如所述杂合抗原的病毒载体。

例如其中所述颗粒和所述病毒载体伴随给药，例如它们可为同时给药而混合或替代地为序贯给药而制剂。

如本文所用的，术语“伴随”表示其中所述成分的组合在不超过12小时的时期内给予，例如在不超过1小时的时期内，典型地在一种时刻，例如在所述到健康专业人员处就诊的时期内，例如其中它们被序贯或同时给药。

本发明还包括用本文所述的多种成分的初免-加强(prime boost)计划，例如用病毒载体初始免疫(priming)并且用所述颗粒加强或反之亦然。

在本说明书的上下文中，包含解释为包括。

包含某种成分的本发明的方面也意图涉及由或基本上由相关成分组成的所述方面。

下面的实施例用于例示方法，其可被用于制备本发明的颗粒。实施例可以或可以不成为本发明的一个方面。

实施例

实施例1

Y1834株的描述

酵母重组株Y1834可用于表达融合蛋白。它由用重组表达载体pRIT15546转化的酿酒酵母宿主株DC5组成。

DC5是具有下列基因型实验室酵母株(ATCC No：20820)：leu2-3、leu2-112、his3、can1-11。双leu-2突变允许选择pRIT15546载体的吸收和保持，所述pRIT15546载体携带功能性LEU-2基因拷贝。仅仅携带了具有LEU-2基因的那些细胞当亮氨酸不存在于生长培养基时能够生长。

载体pRIT15546是携带表达盒的酵母游离表达载体(基于2μ的载体)。重组表达被源自酵母TDH3基因(组成型表达)的启动子驱动。pRIT15546载体的构建在下面详细描述。

pRIT15546载体的构建。

具有用于酵母表达的适当密码子的合成基因被构建，并且亚克隆入pUC57载体。产生的质粒pUC57/CSV和酵母表达载体pGf1-S2都被适当的酶限制性酶切。通过多步骤的克隆程序构建了载体pGf1-S2(在GSK中)。这种载体，其已经携带了S表达盒，允许融合基因的构建，N-末端符合读框地与乙型肝炎病毒S基因融合。最后的表达载体，在序列验证之后，命名为pRIT15546(图3)。

DC5株的转化

leu-和his-营养缺陷型DC5株用重组质粒pRIT15546转化，通过利用酵母标准方案。转化的细胞平板接种于琼脂选择性平板。一种转化体被选择并接受正式命名Y1834。

重组蛋白的表达

Y1834在30℃在补充了8μg/ml的组氨酸到0.5的O.D.(620nm)的YNB(可获自Kracker Scientific Inc的酵母氮基)基本培养基上生长。然后收获细胞并且制备细胞提取物。

提取物制备：

细胞重悬浮在破裂(Breaking)缓冲液中并且机械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下离心15分钟。上清液部分进行SDS-PAGE 4-20％。

破裂缓冲液：    50mM磷酸钠缓冲液(PH：7.5)

                4mMEDTA

                Tween-20 0.5％

                +蛋白酶抑制剂混合物(Complete/ROCHE)

细胞浓度：      在5ml破裂缓冲液中的100ml培养物

                (OD：0.5)＝10OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：    提取物离心15分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 4-20％，蛋白转移到硝化纤维素膜并且进行免疫染色。

western印迹分析：

试剂＝小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals制备)-(稀释：1/500)

      商业上可获得的抗-S抗体可替代本方法使用的那些。或者

      可使用抗-CSV抗体，例如可获自NIH称为MR4的那些。

实施例2

Y1835株的描述

酵母重组株Y1835同时表达CSV-S融合蛋白和S抗原。为获得共表达CSV-S和S蛋白的株，酿酒酵母Y1295株，其已经携带5整合拷贝的S表达盒，被用重组整合性表达载体pRIT15582转化。

Y1295株在GSK中通过多步骤转化程序构建。Y1295的构建描述于WO 93/10152。Y1295株具有下列基因型：leu2-3，leu2-112，gal1。leu-2突变允许选择携带CSV-S盒和功能性LEU2基因的源自pRIT15582的线性DNA片段的吸收。

载体pRIT15582是酵母整合性表达载体(基于Ty的载体)，其携带CSV-S表达盒。重组表达被源自酵母TDH3基因的启动子驱动(组成型表达)。pRIT15582载体的构建在下面详细描述。

pRIT15582整合性载体的构建

用于构建pRIT15582载体的起始材料是表达质粒pRIT15546(图1)。这种质粒的构建描述于实施例1。用HindIII内切核酸酶的pRIT15546消化释放了对应于完整CSV-S表达盒(pTDH3+CSV-S+tARG3)的3706bp长DNA片段。HindIH DNA片段(用T4 DNA聚合酶填充之后)在独特的SalI克隆位点(SalI限制性酶切/T4处理)插入基于Ty的整合性载体pRIT13144中。产生的质粒pRIT15582包含，除了表达盒之外，作为选择性标记的酵母LEU2基因(图3)。用XhoI内切核酸酶的pRIT15582消化释放了图4所示的8500bp的线性片段，其可通过游离末端与内在的Ty成分同源重组整合入酵母基因组。

Y1295株的转化

为获得表达S和CSV-S蛋白的株，用8500bp线性XhoI片段(图4)转化Y1295株以选择Leu+集落。获得了包含以不同比例存在于基因组中的多组两种表达盒的几种整合体。选择携带四拷贝CSV-S盒的一种转化体并且给予正式命名Y1835。

重组蛋白的表达

Y1835在30℃在大约0.5(0.8)的O.D.(620nm)的YNB(可获自Kracker Scientific Inc的酵母氮基)基本培养基上生长。然后收获细胞并且制备细胞提取物。

通过免疫印迹的表达产物分析：

提取物制备：

细胞重悬浮于破裂缓冲液中并且机械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下离心5-10分钟。上清液组分进行SDS-PAGE 12.5％。

破裂缓冲液：    50mM磷酸钠缓冲液(PH：7.5)

                4mMEDTA

                Tween-20 0.5％

                +蛋白酶抑制剂混合物(Complete/ROCHE)

细胞浓度：      在2.5ml破裂缓冲液中的100ml培养物

                (OD：0.5)＝20 OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：  提取物离心5-10分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 12.5％，蛋白转移到硝化纤维素膜并进行免疫染色。

western印迹分析(图5)：

试剂：    1/小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals制备)-

          (稀释：1/250)

          2/兔多克隆抗体抗-CSV(WRAIR惠赠)-稀释

          1/20,000。

商业上可获得的抗-S抗体以及抗-间日疟原虫/CSP抗体可替代本方法中使用的那些。

实施例3：

Y1845株的描述

酵母重组株Y1845同时表达CSV-S融合蛋白，RTS融合和S抗原。为获得共表达CSV-S，RTS和S蛋白的株，酿酒酵母株Y1295，其已经携带了5整合拷贝的S表达盒，被分别用源自pRIT13540和pRIT15582整合性载体的RTS和CSV-S线性DNA片段的等摩尔溶液转化。

通过多步骤转化程序在GSK中构建Y1295株。Y1295株的构建描述于WO 093/10152文献。Y1295株具有下列基因型：leu2-3、leu2-112、gal1。leu-2突变允许选择携带CSV-S盒以及功能性LEU2基因的源自pRIT15582的线性DNA片段的吸收。

载体pRIT13540和pRIT15582是分别携带RTS和CSV-S表达盒的酵母整合性表达载体(基于Ty的载体)。对于两种载体，重组表达被源自酵母TDH3基因的启动子驱动(组成型表达)。pRIT15582载体的构建在实施例2中详细描述。pRIT13540载体的构建描述于WO 93/10152文献。

线性整合性DNA片段的制备。

整合性载体pRIT13540和pRIT15582都被XhoI内切核酸酶限制性酶切，分别释放了8200 bp和8500bp DNA片段。这些片段可通过游离末端与内在Ty成分的同源重组整合入酵母基因组。

Y1295株的转化。

为获得表达三种RTS，CSV-S和S蛋白的株，用8200bp和8500bp线性XhoI片段的等摩尔溶液转化Y1295株，选择Leu+集落。获得了包含不同比例存在于基因组中的多组两种表达盒的几种整合体。携带四拷贝的CSV-S和两拷贝的RTS(除了五拷贝的S盒之外)的一种转化体被选择并被给予正式命名Y1845。

重组蛋白的表达：

Y1845在30℃在0.5的O.D.(620nm)的YNB(获自Kracker ScientificInc的酵母氮基)基本培养基上生长。然后收获细胞并且制备细胞提取物。

通过免疫印迹的表达产物分析：

提取物制备：

细胞重悬浮在破裂缓冲液中并且机械破裂(玻璃珠)。提取物以5000rpm离心5-10分钟。上清液部分进行SDS-PAGE 12.5％。

破裂缓冲液：    50mM磷酸钠缓冲液(PH：7.5)

                4mMEDTA

                Tween-20 0.5％

                +蛋白酶抑制剂混合物(Complete/ROCHE)

细胞浓度：      在5ml破裂缓冲液中的100ml培养物

                (OD：0.5)＝10OD单位/ml的浓度。

粗提取物澄清：  提取物离心5-10分钟/5000rpm

重组蛋白的检测

澄清的提取物进行SDS-PAGE 12.5％，蛋白转移到硝化纤维素膜上并且进行免疫染色。

western印迹分析：

试剂：小鼠单克隆抗体抗-S(GSK Biologicals制备)-(稀释：1/500)

CsCl密度梯度离心：

在Y1845株中颗粒的形成通过CsCl密度梯度离心而分析。粗提取物(～20mg总蛋白)在12ml 1.5M CsCl梯度上分析(88小时，40.000rpm，+8℃在Beckman 70.1 Ti转子)。组分(～0.6ml)被收集并利用抗-S抗体通过免疫印迹分析。如图8所示，western印迹峰在对应于趋于上升的密度1.21和1.20g/cm3的梯度的所述组分(No.10和11)中出现。三重颗粒形成为梯度分析所支持。

参考文献：

(1)Harford N，Cabezon T，Colau B，等人，“表达乙型肝炎病毒表面抗原的酿酒酵母株(RIT4376)的构建和表征”，Postgrad Med J63，Supp.2：65-70，1987.

(2)Jacobs E，Rutgers T，Voet P，等人，“各种乙型肝炎病毒表面蛋白在酿酒酵母中的同时合成和装配”，Gene 80：279-291，1989.

(3)Vieira J and Messing J，“pUC质粒，一种用于通过合成通用引物来插入诱变和测序的M13mp7-衍生系统”，*_Gene 19：259-268，1982.

(4)Hinnen A，Hicks JB，and Fink GR，“酵母的转化”，Proc Natl Acad Sci USA75：1929-1933，1980.

(5)Broach JR，Strathern JN，and Hicks JB，“发育杂合克隆载体和CAN1基因的酵母转化”，Gene 8：121-133，1979.

(6)Zhang H，等人，“作为DNA测序选择的双链SDNA测序”，Nucleic Acids Research 16：1220，1988.

(7)Dame JB，Williams JL.Mc Cutchan TF，等人，“编码人疟疾寄生虫恶性疟原虫的子孢子上的优势免疫表面抗原的基因结构”，Science 225：593-599，1984.

(8)Valenzuela P，Gray P，Quiroga M，等人，“编码乙型肝炎病毒表面抗原的主要蛋白的基因的核苷酸序列”，Nature 280：815-819，1979.

(9)In SS，Kee-Hoyung L，Young RK，等人，“在韩国疟疾患者中对于各种类型间日疟原虫环子孢子蛋白的免疫反应的比较”，Microbiol.Immunol.48(2)：119-123，2004；Microbiol.Immunol.2004；48(2)：119-123.

(10)Rathore D，Sacci JB，de la Vega P，等人，《通过恶性疟原虫的子孢子的肝细胞结合和侵入”，J.Biol.Chem.277(9)：7092-7098，2002.Rathore等人，2002，J.Biol.Chem.277，7092-8

序列表

SEQ ID NO：1

I区

KLKQP

SEQ ID NO：2

附加的II区

CSVTCG

SEQ ID NO：3

VK210重复序列

GDRAAGQPA

SEQ ID NO：4

VK210重复序列

GDRADGQPA

SEQ ID NO：5

VK210重复序列

GDRADGQAA

SEQ ID NO：6

VK210重复序列

GNGAGGQPA

SEQ ID NO：7

VK210重复序列

GDGAAGQPA

SEQ ID NO：8

VK210重复序列

GDRAA GQAA

SEQ ID NO：9

VK210重复序列

GNGAGGQAA

SEQ ID NO：10

主要VK247重复序列

ANGAGNQPG

SEQ ID NO：11

12个氨基酸的插入序列

GGNAANKKAEDA

SEQ ID NO：12

Pv-CS核苷酸序列

Acacattgcggacataatgtagatttatctaaagctataaatttaaatggtgtaaacttcaataacgtagacgctagttcactcggggctgcg

cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaagaaggtgatgctaaaaagaaaaaggacg

gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatcgcgcggatggtcaagcggcgggtaatggg

gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatggtgc

ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcggatggtcaaccagccggtgatcgcgcggct

ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaaccagccaggcggcggtaacgctgcga

ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtcagaacaacgaaggggctaatgcaccaaa

cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatggacgccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt

acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaatgatctcgaaacggatgtctgcaca

SEQ ID NO：13

Pv-CS蛋白的氨基酸序列

THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN

PDDEEGDAKKKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGG

QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG

QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG

NAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT

CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT

SEQ ID NO：14

次要2型重复序列

ANGAGDQPG

ACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTGAACGGTGTTAATTTC    60

AACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAATCTGCTTCAAGAGGT   120

AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAGAAGAAGAAGGACGGT   180

AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC   240

GACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGTGACAGAGCTGCCGGT   300

CAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGTGCCGCCGGTCAACCT  360

GCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGACGGACAGCCAGCCGGC  420

GATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCTGCTGCTAACGGT  480

GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCTGGTGGT  540

AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCTAACGCTCCAAAC  600

GAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTCGGTACTGAATGGACT  660

CCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC  720

AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT           771

核苷酸序列

ATGATGGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG   60

AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAA  120

TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAG  180

AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAA  240

CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT  300

GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT  360

GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC  420

GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA  480

GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT  540

GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT  600

GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC  660

GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA  720

GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT  780

TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG  840

CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA  900

GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT  960

TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT 1020

CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC 1080

TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA 1140

TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT 1200

ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC 1260

CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG 1320

CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT 1380

TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT 1440

ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA                1485

SEQ ID No 17

氨基酸序列

THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK  60

KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG  120

AAGQPAGDRADGQPAGDRADGQPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKA  180

EDAGGNAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVTCGVGVRVRRR  240

VNAANKKPEDLTLNDLETDVCT

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSL 300

DSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLI  360

FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI  420

PSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPF  480

IPLLPIFFCLWVYI                                                494

SEQ ID NO.18

RTS表达盒和RTS-HBsAg杂合蛋白的预测翻译产物的核苷酸序列.

在DNA序列之下显示了从TDH3 ATG密码子起始的翻译产物.

AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACAAATTCGAAATACTTTGACC

CTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTTCCTATG

ACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAGACATAT

TTGACCTCTTAACTGGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTTGAAAAGAACT

TACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTA

ATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTT

GAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGA

ATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAATTAGCCTTT

TAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAAC

ATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATCCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCTCGC

TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACC

AACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAG

GCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACAC

AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGC

TCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCC

CCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTGTAAATCTAT

TTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA

AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGATGGCTCCCGATCCTAATG

                                     MetMetAlaProAspProAsnA

CAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA

CAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA

CAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsna

CAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATAAAAACAATCAAG

LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnLysAsnAsnGlnG

GTAATGGACAAGGTCACAATATGCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTA

LyAsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAlaA

ATGCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAAC

snAlaAsnAsnAlaValLysAsnAsnAsnAsnGluGluProSerAspLysHisIleGluG

AATATTTAAAGAAAATAAAAAATTCTATTTCAACTGAATGGTCCCCATGTAGTGTAACTT

LnTyrLeuLysLysIleLysAsnSerIleSerThrGluTrpSerProCysSerValThrC

GTGGAAATGGTATTCAAGTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCTAATAAACCTAAAGACGAAT

YsGlyAsnGlyIleGlnValArgIleLysProGlySerAlaAsnLysProLysAspGluL

TAGATTATGAAAATGATATTGAAAAAAAAATTTGTAAAATGGAAAAGTGCTCGAGTGTGT

euAspTyrGluAsnAspIleGluLysLysIleCysLysMetGluLysCysSerSerValP

TTAATGTCGTAAATAGTCGACCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAG

HeAsnValValAsnSerArgProValThrAsnMetGluAsnIleThrSerGlyPheLeuG

GACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGC

LyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProG

AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTG

LnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlySerProValCysLeuG

GCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTC

LyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProIleCysP

CTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT

RoGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPheIleIlePheLeuPheIleLeuLeuLeuC

GCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAA

YsLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuI

TTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAG

LeProGlySerThrThrThrAsnThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAlaGlnG

GCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTA

LyAsnSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProThrAspGlyAsnCysThrCysI

TTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTT

LeProIleProSerSerTrpAlaPheAlaLysTryLeuTrpGluTrpAlaSerValArgP

TCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTG

HeSerTrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProThrV

TTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGA

AlTrpLeuSerAlaIleTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerIleValS

GTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAACGAATTC

ErProPheIleProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpValTyrIleEnd

CAAGCTGAAACAATTCAAAGGTTTTCAAATCAATCAAGAACTTGTCTCTGTGGCTGATCC

AAACTACAAATTTATGCATTGTCTGCCAAGACATCAAGAAGAAGTTAGTGATGATGTCTT

TTATGGAGAGCATTCCATAGTCTTTGAAGAAGCAGAAAACAGATTATATGCAGCTATGTC

TGCCATTGATATCTTTGTTAATAATAAAGGTAATTTCAAGGACTTGAAATAATCCTTCTT

TCGTGTTCTTAATAACTAATATATAAATACAGATATAGATGCATGAATAATGATATACAT

TGATTATTTTGCAATGTCAATTAAAAAAAAAAAATGTTAGTAAAACTATGTTACATTCCA

AGCAAATAAAGCACTTGGTTAAACGAAATTAACGTTTTTAAGACAGCCAGACCGCGGTCT

AAAAATTTAAATATACACTGCCAACAAATTCCTTCGAGTTGTCCAATTTCACCACTTTTA

TATTTTCATCAACTTCAGCAGATTCAACCTTCTCACATAGAACATTGGAATAAACAGCCT

TAACACCACTTTCAAGTTTGCACAGCGTAATATGAGGAATTTTGTTTTGACAACACAACC

CTTTAATTTTCTCATTGTTTTCATCAATTATGCATCCATCTTTATCTTTAGACAGTTCCA

CTACAATAGCAATAGTTTTTTCATCCCAACATAGTTTTTCGAGCCTAAAATTCAGTTTGT

CGGTCGTTTTACCTGCGTATTTTGGTTATTACCAGAGCCTTGTGCATTTTCTATGCGGT

TGTTATTGTACTCCGTTATCTGGTCAGTGTATCTGTTACAATATGATTCCACAACTTTTT

TGCCTCTTTTTCACGGGACGACATGACATGACCTAATGTTATATGAAGTTCCTTCTGAAC

TTTTCCACTAGCTAGTAAATGCTTGAATTTCTCAGTCAGCTCTGCATCGCTAGCAATACA

CCTCTTGACCAATCAATAATTTCATCGTAGTTTTCTATTTAGCTGAGATATATGTAGGT

TTAATTAACTTAGCGTTTTTTGTTGATTATTGTTGCCTTTACCAACTATTTTTCTCACAG

TAGGTTTGTAATCTAAGCTCCTTCTGAACGCTGTCTCAATTTCATCATCTTTCGGGATCT

CTGGTACCAAAATTGGATAAGCTT

Claims (20)

1.免疫原性蛋白颗粒，其包含下列单体：

a.包含源自间日疟原虫CS蛋白和乙型肝炎病毒S抗原的序列的融合蛋白(CSV-S)，和

b.包含源自恶性疟原虫CS蛋白和乙型肝炎病毒S抗原的序列的融合蛋白(RTS)，和

c.任选源自乙型肝炎病毒的S抗原。

2.根据前述权利要求任一项的颗粒，其中乙型肝炎病毒抗原源自adw血清型。

3.根据前述权利要求任一项的颗粒，其进一步包含源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的一种或多种另外的抗原。

4.根据权利要求1到4任一项的颗粒，其中间日疟原虫成分是选自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA1和RBP的杂合多肽。

5.根据权利要求1到4任一项的颗粒，其包含如SEQ ID No：13所示的杂合环子孢子蛋白序列。

6.组合物，其包含根据前述权利要求任一项的颗粒和佐剂。

7.根据权利要求6的组合物，其中佐剂选自：

·金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝，

·水包油乳剂，

·toll样受体激动剂，(例如toll样受体2激动剂、toll样受体3激动剂、toll样受体4激动剂、toll样受体7激动剂、toll样受体8激动剂和toll样受体9激动剂)，

·皂苷，例如Quil A及其衍生物如QS7和/或QS21，

·包含寡核苷酸的CpG，

·3D-MPL，

·(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，

·DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-二(二氢磷酸酯)，和

·MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)，

或其组合。

8.根据权利要求6或7的组合物，其中佐剂选自：

·与金属盐例如氢氧化铝或磷酸铝缔合的皂苷，

·3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸，例如作为水包油制剂，

·脂质体形式的皂苷，例如进一步包含甾醇如QS21和甾醇，和

·ISCOM。

9.根据权利要求6到8任一项的组合物，其进一步包含混合的源自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的一种或多种另外的抗原。

10.根据权利要求6到9任一项的组合物，其中组合物是用于肠胃外使用的疫苗。

11.用于治疗的如权利要求1到5任一项中定义的颗粒或如权利要求6到10任一项中定义的组合物。

12.如权利要求1到5任一项中定义的蛋白或如权利要求6到10任一项中定义的组合物在制备用于治疗/或预防疟疾的药物中的用途。

13.治疗易感染疟原虫感染的患者的方法，包括给予有效量的如权利要求1到5任一项中定义的蛋白或如权利要求6到11任一项中定义的组合物，特别是作为疫苗。

14.编码DNA序列的宿主(载体/质粒)，所述DNA序列是如权利要求1-5任一项中定义的颗粒的成分，其中所述载体质粒适于将DNA插入用于制备相关颗粒的宿主内或者所述质粒能够在适当的条件下制备装配为相关颗粒的成分。

15.用于生产如权利要求1到5任一项中定义的颗粒的方法，所述方法包括在适当的宿主中表达编码所述蛋白的核苷酸序列并且回收产物。

16.根据权利要求15的方法，其中宿主是酵母。

17.根据权利要求16的方法，其中酵母选自：

酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，汉逊酵母属(Hansenula)(例如，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))，耶氏酵母(Yarrowia)，许旺酵母属(Schwanniomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，结合酵母(Zygoaccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，卡尔斯伯酵母(S.carlsberoensis)，乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)，Y1834和DC5。

18.根据权利要求16到17任一项的方法，其中通过用包含表面活性剂的适当组合物处理来裂解宿主细胞而回收产物。

19.根据权利要求18的方法，其中表面活性剂选自：Tween(例如Tween 20)、briji、聚乙二醇。

20.可通过权利要求14到19任一项所述的方法获得的产物。

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