CN1294520A - 聚核苷酸组合物及其制备方法与用途 - Google Patents

聚核苷酸组合物及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

一种冷冻干燥的聚核苷酸组合物,包含至少一种聚核苷酸和至少一种冷冻保护剂,其中聚核苷酸与冷冻保护剂的比例为约0.001—0.1份重量聚核苷酸比每1份重量冷冻保护剂。该组合物还含占最终冷冻干燥组合物总重约0.5—6wt%的水。本发明聚核苷酸组合物的特征在于稳定性提高,在37℃,至少10天以上仍保持至少90%超螺旋结构。该冷冻干燥聚核苷酸组合物的溶解度也提高了。一种得到上述稳定的冷冻干燥聚核苷酸组合物的冷冻干燥聚核苷酸的改进方法,采用特殊的首轮干燥。

Description

聚核苷酸组合物及其制备方法与用途
发明领域
本发明涉及稳定性提高的聚核苷酸组合物。本发明还涉及通过冷冻干燥制备聚核苷酸组合物的方法。
发明背景
聚核苷酸组合物在工业、制药、医学、营养和／或农业领域具有广泛用途。例如，聚核苷酸可用于制备这些领域内有用的蛋白质。而且，聚核苷酸本身是用于诊断／造影方法的体内试剂，是用于基因治疗、反义方法和疫苗应用的试剂，或作为药物用于治疗或预防诸如遗传缺陷、传染病、癌症和自身免疫病等疾病。聚核苷酸还是用于诸如生物化学研究试验、医学、诊断和筛选试验，以及污染检测试验等的体外试剂。对以上所述各用途来说，聚核苷酸，例如质粒DNA，必需长时间地留存，而且最好是在非冷藏或非冷冻温度下。阻碍聚核苷酸以上用途开发的一个问题是：如果不冷冻，聚核苷酸会不稳定。例如，聚核苷酸在溶液中，数小时后就活性降低。
测定聚核苷酸稳定性的较好方法是一定时间后聚核苷酸的超螺旋(SC)丧失。“超螺旋”指聚核苷酸的一种物理状态，其中，聚核苷酸的一链相对于另一链欠旋或超旋。一定时间后超螺旋的丧失会降低聚核苷酸组合物的纯度。所以，人们为解决这一问题和提高聚核苷酸稳定性进行了许多尝试。其中之一是先干燥后沉淀的聚核苷酸制备方法。然而，这类方法没能获得理想的聚核苷酸稳定性。现有技术中还包括将聚核苷酸保存在盐溶液中的方法；然而，这些方法仍然造成超螺旋结构的丧失。
稳定聚核苷酸的其他方法包括将聚核苷酸冷冻干燥。冷冻干燥已被用于稳定或保存食品、血浆、活器官、蛋白质、细菌和单细胞真核生物等完整细胞和药物等生物活性物质。冷冻干燥的过程包括：将待冷冻干燥的材料溶于溶剂，溶剂通常是水，冷冻该溶液。通常用一定量的冷冻保护剂来稳定聚核苷酸。将溶液冷冻后，施加真空，逐步加热冻结材料，使溶剂由冻结状态升华。最终得到的冷冻干燥材料通常呈饼状，其形状与大小与冻结时的相同，具有充分的空隙率以允许再生。80年代早期，美国典型培养物保存中心出售以冷冻保护剂乳糖稳定的冻干DNA。
1996年12月27日公开的PCT申请WO96／41873及其相关美国专利No．5，811，406(1998年9月22日)公开了通过冷冻干燥含冷冻保护剂的聚核苷酸复合物来稳定该复合物，但未公开冷冻干燥的方法。然而，冷冻干燥过程的参数对聚核苷酸组合物的稳定性和溶解度具有显著影响。冷冻干燥可能得到低溶解度的聚核苷酸，这就需要较多的溶剂进行再生。以上文献未能解决冷冻干燥的这些问题，因此没有提供得到稳定性或溶解度提高的冷冻干燥组合物的方法。
因此本领域仍未得到稳定性增强、尤其适合药用的聚核苷酸组合物，以及制备此类稳定的聚核苷酸组合物的方法。
发明概述
一方面，本发明提供一种冷冻干燥的聚核苷酸组合物，它包含至少一种聚核苷酸和至少一种冷冻保护剂，其中聚核苷酸与冷冻保护剂之比约为0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷冻保护剂。该组合物还含占最终冷冻干燥组合物总重约0．5-6wt％的水。本发明聚核苷酸组合物的特征在于稳定性提高，在37℃，至少10天以上仍有至少90％保持超螺旋结构。
另一方面，本发明提供制备稳定性提高的冷冻干燥聚核苷酸组合物的方法。该方法的步骤包括：对含冷冻保护剂的聚核苷酸溶液进行首轮干燥，所述组合物已经冷却直至冻结并处于真空中，首轮干燥包括用约5至30小时的时间逐步加热聚核苷酸溶液，至-20℃至20℃，期间避免组合物液化(又称“复熔”)。该首轮改造减少了整个冷冻干燥过程所需的时间，使所得的冷冻干燥聚核苷酸呈基本无定形物理结构，在约37℃经至少10天以上仍保持90％的超螺旋。该产品可在需要时以水溶液再生。
另一方面，本发明提供一种冷冻干燥方法，所设计的参数可提供稳定性和溶解度提高的冷冻干燥聚核苷酸组合物。该方法的步骤包括：
(a)形成聚核苷酸水溶液，pH约6．2至7．8，含约0．1-5mg／ml(按聚核苷酸溶液总体积计)至少一种聚核苷酸，和约0．5-10wt％(按聚核苷酸溶液总重计)至少一种冷冻保护剂；
(b)将聚核苷酸溶液冷却至约-30℃至-70℃，直至冻结；
(c)施加约25mTorr至250mTorr的真空；
(d)第一次用约5至40小时将聚核苷酸溶液逐步加热至约-40℃至约20℃；
(e)将加热步骤(d)后的聚核苷酸溶液在-35℃至10℃，25mTorr至250mTorr，保持大约1至10小时；
(f)在25mTorr至250mTorr，用约1至20小时将保温步骤(e)后的聚核苷酸溶液逐步加热至约20℃至35℃；
(g)回收冷冻干燥的聚核苷酸组合物，含水量占所得组合物总重约0．5-6wt％。
另一方面，本发明提供了用以上方法制得的冷冻干燥组合物。
另一方面，本发明提供一种液态的聚核苷酸组合物，其中包含以水再生的上述冷冻干燥组合物，其特征在于pH约为6．2-7．8。
另一方面，本发明提供一种包含活性成分的药物组合物，它是上述冷冻干燥组合物，或是上述再生的液态溶液。其中的成分与药学上认可的赋形剂或载体组合良好。
另一方面，本发明提供治疗哺乳动物的方法，包括给予有效量的药物组合物。所述给予可以是任意常规给药途径，例如口服、肠胃外、鼻内或肺内。
以下本发明的详细描述和优选实施例将进一步说明本发明的其他内容和优点。
附图简述
图1是本发明冷冻干燥DNA组合物(◆)和相同DNA溶液(●)稳定性随时间变化的曲线图，采用琼脂糖法，以％超螺旋(SC)表示。根据下文方案1中描述DNA降解的速度方程3，得到实施例1优选冷冻干燥聚核苷酸组合物和质粒DNA非冷冻干燥液体组合物(对照)的In(％SC)一时间曲线。用最小二乘回归法计算曲线斜率(-kobs，测得拟一次速度常数)。冷冻干燥组合物的斜线公式是：y=0．001x+4．5369，速度常数(R2)=0．7988。对照的斜线公式是：y=0．014x+4．5611，速度常数(R2)=0．9297。该图显示，优选冷冻干燥组合物的速度常数比液体溶液的速度常数至少低10倍。
图2与图1类似，区别在于，这是本发明的优选冷冻干燥组合物(◆)(含质粒DNA和2％w／w冷冻保护剂海藻糖，含水量为4％)(Lyo2T2H)和相同DNA的非冷冻干燥溶液(●，液体)的时间曲线。冷冻干燥组合物的斜线公式是：y=0．003x+4．52223，R2=0．9998。对照的斜线公式是：y=0．014x+4．5611，R2=0．9297。
图3是柱形图，描述Balb／C小鼠对本发明冷冻干燥DNA组合物(含编码gD2蛋白的单纯疱疹病毒基因的质粒)和对对照的抗原特异性细胞免疫应答。对照之一是冷冻干燥前的后文实施例3表4中的No．6聚核苷酸溶液，不含冷冻保护剂(磷酸盐，冷冻干燥前)。另一对照是冷冻干燥的表4中No．8柠檬酸盐缓冲液组合物，不含冷冻保护剂(柠檬酸盐，冷冻干燥后)。“023对照”是一份冷冻干燥前溶液，其中的DNA具有与其他组合物所用相同的质粒骨架，但没有gD2序列。所用的本发明冷冻干燥组合物含有冷冻干燥的表4No．1聚核苷酸溶液，以磷酸盐缓冲液配制，以海藻糖作为冷冻保护剂(海藻糖／磷酸盐)；冷冻干燥的表4中No．3聚核苷酸溶液，以磷酸盐缓冲液配制，以蔗糖作为冷冻保护剂(蔗糖／磷酸盐)；和冷冻干燥的表4中No．7聚核苷酸溶液，以柠檬酸盐缓冲液配制，以蔗糖作为冷冻保护剂(蔗糖／柠檬酸盐)。各种聚核苷酸组合物对细胞免疫应答的影响如实施例4所述用淋巴细胞增殖试验来测定，表示为刺激指数(SI)。
图4柱形图显示以Balbl／c小鼠血清在450nm处测得的光密度(OD)表示的对图3中本发明冷冻干燥DNA组合物和对照的体液(抗体)应答。阴性对照与023对照相同。各种聚核苷酸组合物对体液免疫应答的影响如实施例4所述用标准ELISA测定。
本发明的详细描述
本发明为本领域提供了，如本文所述，一种稳定性提高的聚核苷酸组合物，一种溶解度提高的聚核苷酸组合物，得到稳定化聚核苷酸组合物的冷冻干燥方法。I．本发明的聚核苷酸组合物
本发明的“聚核苷酸组合物”稳定性和溶解度高于现有技术的聚核苷酸混合物。较好的是，本发明的聚核苷酸组合物一般是基本为无定形结构的粉末，只有微量晶体结构，通过对聚核苷酸溶液进行本发明冷冻干燥过程而得到。A．聚核苷酸溶液
“聚核苷酸溶液”在此表示冷冻干燥前的聚核苷酸水性混合物。被冷冻干燥的聚核苷酸水溶液是至少一种聚核苷酸与至少一种冷冻保护剂形成的水性混合物。较好的是，聚核苷酸溶液中聚核苷酸与冷冻保护剂之比约为0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷冻保护剂。聚核苷酸溶液还可以含非水溶剂和其他添加剂。调节聚核苷酸、冷冻保护剂、溶剂(包括水)和可选添加剂的浓度，使得足量的聚核苷酸被冷冻干燥，而且这些聚核苷酸在冷冻干燥过程中无明显降解。1．聚核苷酸
任意聚核苷酸都可用于本发明，包括修饰聚核苷酸。合适的聚核苷酸例如BDNA、ADNA、ZDNA、RNA、tRNA和mRNA。聚核苷酸还可以是任意形式的。例如，聚核苷酸可以呈环状或线形。聚核苷酸可以含单链或多链。例如，可使用单链DNA或RNA，双链DNA，双链的DNA-RNA杂交体，或三链、四链聚核苷酸。双链DNA例如染色体DNA，R因子，PCR产物，质粒DNA，噬菌体，病毒RNA和DNA载体，这包括α病毒、腺病毒、牛痘病毒、逆病毒、腺伴随病毒、正链和负链RNA病毒、疱疹病毒、类病毒、δ病毒和脊髓灰质炎病毒。较好的是，DNA包括：编码蛋白质的编码序列，它们最好与调控元件操作性连接，包括操纵控制和终止区的基因，以及诸如质粒DNA的自身复制系统。单链聚核苷酸包括反义聚核苷酸，形成核酶和三链体的寡核苷酸。聚核苷酸可被修饰成硫酯、硫代磷酸酯和磷酸酯等。本发明药用组合物中的单链聚核苷酸最好制备成聚核苷酸组合物中治疗链的互补链或“接头链”。接头链可以是单独的另一链，或与治疗链共价连接，或是治疗链的延伸部分，这样，治疗链回折成双并自身杂交。或者，接头链有许多臂，使它可与许多聚核苷酸链杂交。
在优选实施例中，所述聚核苷酸是超螺旋质粒DNA表达载体，所编码的免疫原与在人细胞内有效的调控元件操作性连接。部分优选实施例中，由编码序列编码的免疫原是病原蛋白，例如单纯疱疹病毒gD2蛋白或HIV-lgag、pol或env基因所编码的人免疫缺陷病毒蛋白。编码序列与诸如巨细胞病毒(CMV)中早期启动子等合适启动子，以及SV40聚腺苷酸化信号操作性连接。例如，美国专利5，593，972描述了可用于本发明的质粒。
聚核苷酸可包含裸露的聚核苷酸，例如质粒DNA，同一聚核苷酸的多份拷贝，或不同的聚核苷酸，或者，可以包含与“辅助-试剂”结合的聚核苷酸，所述“辅助-试剂”例如局部麻醉剂、肽、阳离子脂等脂类、脂质体或脂类颗粒、聚赖氨酸等聚阳离子、例如树状体的支链三维聚阳离子、糖、两性阳离子、除垢剂、苄基铵类表面活性剂，或有助于聚核苷酸向细胞内转移的其他化合物。本发明所用辅助-试剂包括，例如，美国专利5，593，972，5，703，055，5，739，118，5，837，533和国际专利申请WO96／10038(1996年4月4日公开)和国际专利申请WO94／16737(1994年8月8日公开)中所述，等等。当所用试剂是局部麻醉剂时，以布比卡因为佳，其含量以聚核苷酸溶液总重的约0．1-1．0％为佳。还可参见国际专利申请PCT／US98／22841，它以苄基铵表面活性剂作为辅助试剂，给予量为0．001-0．03wt％。
此外，作为本发明溶液中的聚核苷酸，聚核苷酸的碱基、糖或键可用已知技术进行修饰。
较好的是，聚核苷酸在溶液中的浓度为约0．1-5．0mg／ml。其他实施例中，聚核苷酸在溶液中的浓度约为1．0-3．0mg／ml。另一些实施例中，聚核苷酸在溶液中的浓度约为1．0-2．0mg／ml。2．冷冻保护剂
“冷冻保护剂”指一种冷冻保护剂或多种冷冻保护剂的混合物。冷冻保护剂可以是任意能在冷冻过程中或其后稳定聚核苷酸的化合物。常规教科书中记载了多种冷冻保护剂，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Vol．2，第19版(1995)。
实施例之一中，本发明所用冷冻保护剂是糖醇，例如多羟糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇，及它们的混合物。特别好的是聚乙二醇。另一实施例中，冷冻保护剂是糖酸，包括醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸(aldaric)及它们的混合物。
本发明的冷冻保护剂还可以是糖。合适的糖是含有2个以上羟基的醛或酮。这些糖可以是环状或线形，例如醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸，或它们的混合物。糖也可以是单糖、二糖或多糖，例如二糖或多糖。合适的糖例如甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神经氨酸，或它们的衍生物。合适的多糖例如阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如土木香粉)、左聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、半乳糖卡诺糖(galactocarolose)、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、胶淀粉、纤维素、葡聚糖、石脐素、几丁质、琼脂躺、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、花黄素或淀粉。特别有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它们的混合物。蔗糖是特别有用的冷冻保护剂。
较好的是，本发明的冷冻保护剂是糖或“糖”醇，可能是多元醇。多元醇化合物即含有一个以上羟基的化合物。较好的是线形的多元醇化合物。合适的多元醇化合物例如乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇；甘油；或季戊四醇；或它们的混合物。
部分优选实施例中的冷冻保护剂是蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇。其他优选实施例中，冷冻保护剂是蔗糖。根据需要，以上任意冷冻保护剂都可以与至少一种其他冷冻保护剂混合存在。
冷冻保护剂或冷冻保护剂混合物在聚核苷酸溶液中的浓度以约0．5-10wt％为佳。部分实施例中，冷冻保护剂在溶液中的浓度约为1．0-8．0wt％。另一些实施例中，冷冻保护剂在溶液中的浓度约为1．0-5．0wt％。3．聚核苷酸溶液中的可选添加剂
聚核苷酸溶液最好以水为基础。然而，如果需要，也可以在溶液中加入一种或多种与水、聚核苷酸和冷冻保护剂相容的溶剂。例如，可向溶液中加入乙二醇、丙二醇或甘油等可溶于水的醇。
最好用缓冲液来制备聚核苷酸溶液，这样，冷冻干燥聚核苷酸组合物再生后即可达到等渗。聚核苷酸溶液的pH以约6．2-7．8为佳。实施例之一中，聚核苷酸溶液的pH约为6．2-7．4。另一些实施例中，本发明聚核苷酸溶液的pH为6．2-6．9。这一范围的pH有助于避免聚核苷酸在本发明冷冻干燥过程中降解。所以，可用的缓冲液包括任意能够在冷冻干燥过程中维持上述pH范围的化合物。优选的缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液，浓度通常为5-60mM。较好的是，缓冲液占聚核苷酸溶液总重的约0．1-1．2wt％。
其他可选添加剂，例如促进剂(如前文所述)、表面活性剂或盐，或它们的混合物也可加入聚核苷酸溶液中。可加盐调节聚核苷酸溶液的等渗性。例如，可用氯化钠等盐。较好的是，盐的用量是聚核苷酸溶液总重的约0．1-1．0wt％。
总之，这些可选添加剂宜占聚核苷酸溶液总重的约0．1-3wt％。
然后，对混合以上组分制备而成的聚核苷酸溶液进行本发明的冷冻干燥过程，得到本发明的冷冻干燥聚核苷酸组合物。B．冷冻干燥组合物
由上述聚核苷酸溶液制备而成的本发明冷冻干燥组合包含：
(a)至少一种聚核苷酸；
(b)至少一种冷冻保护剂，其中，聚核苷酸与冷冻保护剂之比约为0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷冻保护剂；
(c)占聚核苷酸组合物总重约0．5-6wt％的水。
在部分实施例中，以上冷冻干燥聚核苷酸组合物含约6％或以下的水。部分实施例中，聚核苷酸组合产物含约5％或以下的水。另一些实施例中，冷冻干燥组合物含约2-3wt％水。
本发明聚核苷酸组合物的特征在于其稳定性比现有技术中的聚核苷酸组合物高。超螺旋百分比反映了聚核苷酸的纯度。因此，以一定时间后保留的纯度确定聚核苷酸的稳定性。“稳定性提高或增强”表示在37℃至少10天以上，聚核苷酸至少保留90％的超螺旋。部分实施例中，本发明聚核苷酸，最好是DNA，在37℃至少20天以上仍保留至少90％的超螺旋。更好的是，部分实施例中，本发明的聚核苷酸在37℃至少30天以上仍保留至少90％的超螺旋。
除稳定性之外，本发明聚核苷酸组合物的溶解度也比现有技术聚核苷酸组合物提高。“溶解度提高”表示本发明聚核苷酸组合物25℃(即室温)时在水中的溶解度至少为1mg／ml。较好的是，本发明聚核苷酸组合物25℃时在水中的溶解度至少为2mg／ml。另一些优选实施例中，本发明聚核苷酸组合物25℃时在水中的溶解度至少为10mg／ml。甚至可能达到高达约20mg／ml的溶解度。较好的是，通过以本发明方法冷冻干燥聚核苷酸溶液得以提高本发明聚核苷酸组合物的稳定性和溶解度。
本发明冷冻干燥聚核苷酸组合物的特征还在于基本上呈无定形物理结构。部分实施例中，含聚核苷酸的组合物主要是无定形的，但也含微量或少量晶体，例如晶格结构。C．药物组合物
可将冷冻干燥的聚核苷酸组合物配制成各种形式，以便保存，或在体外或体内使用。本发明聚核苷酸组合物尤其适合的体内用途包括用质粒DNA进行的免疫接种和基因治疗，例如美国专利5，593，972，5，703，055，5，676，954，5，580，859，5，589，466，5，739，118和5，837，533，国际专利申请WO96／41873(1996年12月27日公开)和国际专利申请WO94／16737(1994年8月8日公开)中所述。
本发明冷冻干燥的聚核苷酸组合物可配制成各种无水或液体形式。如果需要，可对本发明的无水冷冻干燥聚核苷酸组合物进行研磨、粉碎或过筛，用已知技术制成粉末。例如，可用造粒机、喷射磨、破块机或切碎机将冷冻干燥的聚核苷酸组合物转变成粉末。较好的是，聚核苷酸组合物的平均粒径小于约100μm。如果组合物要用做肺给予的药物，则粒径需小于等于10μm。部分优选实施例中，本发明的聚核苷酸组合物制备成粉剂、片剂、胶囊、肠溶片剂或胶囊、或栓剂等形式给予哺乳动物。
另一实施例中，可通过冷冻干燥组合物以水再生制备液体聚核苷酸组合物，和／或制成液体组合物。再生组合物的pH以约6．2-7．8之间为佳，这和前文就原初聚核苷酸溶液所述相同。
上述无水组合物或液体溶液适合用做药物组合物。因此，本发明的另一实施例是药物组合物，其中包含上述冷冻干燥的组合物或再生的液体组合物作为活性成分，混合以药学上认可的赋形剂或载体。根据药物组合物的用途，赋形剂或载体需适合诸如口服、肠胃外、鼻内和肺内等给药途径。可将冷冻干燥的聚核苷酸组合物作为起始材料，与其他药学上认可的赋形剂一起制成粉末、液体或悬浮剂型，包括鼻内或肺内使用的那些剂型。参见，例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，Vol．2，第19版(1995)，第95章汽雾剂。
采用以上活性成分的一优选实施例是肠溶包衣片剂。优选实施例之一中，聚核苷酸组合物是肠溶包衣胶囊形式的口服疫苗。其中的聚核苷酸是质粒DNA。较好的是，硬明胶胶囊(例如Warner Lambert Parke-Davis下属的Capsugel制造的那些)中含约1mg DNA。聚核苷酸组合物中可加有滑石粉、硬脂酸镁等流动润滑剂。类似的，还可加有纤维素等蓬松剂。明胶胶囊以肠溶包衣材料，例如EUDRAGIT，进行肠溶包裹。根据另一些实施例，本发明的聚核苷酸组合物可用来形成以汽雾剂形式用于向肺递送的粉末。例如，可制备传递基因以治疗肺病的聚核苷酸组合物。此外，例如，所含DAN编码囊纤维跨膜传导调节物的本发明聚核苷酸组合物可用于治疗囊性纤维化。D．使用方法
因此，本发明另一实施例提供了一种治疗哺乳动物的方法，包括给予受治者有效量的上述药物组合物。根据组合物的给药目的，所述治疗方法包括通过所需途径给予组合物，所述途径包括口服、肠胃外、鼻内和肺内。例如，可将聚核苷酸组合物配制成规定等渗性的液体，通过肌内、静脉内、皮内或皮下给予。聚核苷酸组合物也可以通过鼻内或肺内给予(吸服)粉末来使用。聚核苷酸组合物还可以栓剂的形式用于阴道、直肠和口等人体腔隙。使用上述组合物的方法包括基因治疗，例如治疗囊性纤维化。II．本发明的冷冻干燥
为了生产本发明冷冻干燥的聚核苷酸组合物和药物产品，对以上制备的聚核苷酸溶液进行冷冻干燥，其中的步骤受到精确控制，冷冻干燥的结果提高了所得冷冻干燥聚核苷酸组合物的稳定性和溶解度。用于冷冻干燥的可以是任意能够在真空下逐步冷却和逐步加热聚核苷酸溶液的装置。“保持”在此表示在一段时间内保持给定的温度和／或真空度。“渐变”在此表示在一段时间改变温度和／或真空条件。在冷冻干燥过程中，有些是保持步骤，有些是渐变步骤。
本发明冷冻干燥过程详细描述如下：
聚核苷酸水溶液的pH约为6．2-7．8，含约0．1-5mg／ml(根据聚核苷酸溶液总体积)至少一种聚核苷酸，约0．5-10wt％(根据聚核苷酸溶液总重)至少一种冷冻保护剂，通过第一次冷却固化或冷冻。实施例之一中，将溶液冷却至-30℃至-70℃。另一实施例中，将溶液冷却至-40℃至-60℃。另一些实施例中，将溶液冷却至-40至-50℃。这一冷却步骤以逐步缓慢进行为佳，或者进行约1-5小时，更好的是1-3小时。部分实施例中，溶液冷却时间约为1-2小时。部分实施例中，溶液冷却时间约为2-3小时。较好的是，在要求的时间内以线性速度冷却溶液。虽然以逐步冷却为佳，但也可以进行在冷冻干燥过程中不显著降解聚核苷酸的快速(10分钟以内)冷却。
当到达所需的冷冻温度时，立即抽真空，将压力降至约25-250mTorr。部分实施例中，真空使压力降至约50-100mTorr。可将组合物在此温度和压力下保持约30分钟至5小时，以1小时以上为佳。在一特别好的实施例中，真空是如下施加的：迅速降压至300-200mTorr，然后逐步降压至约150mTorr，然后在约1-2小时内降压至约40mTorr。
冷却后，对聚核苷酸溶液进行“首轮干燥或加热”，这一步对该方法的效率影响重大。在这首轮加热中，冻结溶液首次用5-40小时的时间逐步加热至约-40℃至20℃。在优选实施例中，冻结溶液首次用5-20小时的时间逐步加热至约-10℃至20℃。另一实施例中，冻结溶液逐步加热至-40℃至10℃。另一实施例中，冻结溶液首次用8-20小时的时间逐步加热至约-5℃至5℃。一特别好的实施例中，冻结溶液首次加热至0℃。首轮加热时间最好用约5-40小时完成，约5-20小时为佳，约6-15小时更好。部分实施例中，首次加热约需10小时。
首轮干燥中除了加热聚核苷酸溶液之外还需使被加热溶液处于真空。较好的是，首轮加热一开始就采用真空。加热步骤中的真空压力宜低于约250mTorr，低于约25-150mTorr更好。部分实施例中，真空压约为40-150mTorr。另一些实施例中，加热步骤的真空压约为60-150mTorr。一优选实施例中，如下施加真空：压力在5分钟内降至200mTorr，然后在约1-2小时内降至要求的压力。
首轮加热后，将聚核苷酸溶液保持在恒温恒压下以平衡聚核苷酸溶液。这一保持步骤以进行约1-10小时为佳，约2-6小时更好。较好的是，保持步骤的温度在约-35℃至10℃。部分实施例中，该温度在约-10℃至10℃维持约2-10小时。另一些实施例中，温度在约-5℃至5℃维持约5-7小时。一优选实施例中，该温度维持在约0℃。较好的是，该保持步骤的真空压力在约200mTorr，更好的是25-250mTorr，维持约1-10小时。部分实施例中，保持步骤的真空压力维持在约40-150mTorr。部分实施例中，保持步骤的真空压力维持在约60-150mTorr。较好的是，所选温度和压力是首轮加热步骤最后达到的压力和温度。在由该保持步骤进入下一步时最好保持真空。
保持后，进行二次干燥步骤。在约25-250mTorr的压力下，用约1-20小时将聚核苷酸溶液第二次逐步加热至约20-35℃。一优选实施例中，在约25-250mTorr的压力下，用约1-10小时将溶液第二次逐步加热至约20-30℃。另一实施例中，第二次加热用约2-3小时将温度升至约23-27℃。一优选的二次加热步骤中，温度被提高至25℃。二次加热步骤的真空压力以低于约250mTorr为佳，低于约25-150mTorr更好，部分实施例中低于约40-110mTorr。二次加热的时间以约1-5小时为宜，约2-3小时更好。
本发明冷冻干燥过程一特别好的实施例中，首次加热时间约为7-11小时，其后保持步骤的时间约为1小时，二次加热的时间约2小时。
二次加热后，可以(任选)将聚核苷酸溶液保持在恒温恒压下以平衡聚核苷酸溶液。较好的是，这二次保持进行约1-10小时，约2-5小时更好。部分实施例中，二次保持约2-3小时。较好的是，这次保持的温度维持在约20-30℃，约23-27℃更好，约25℃最好。较好的是，这次保持的真空压力维持低于约150mTorr，低于约20-100mTorr更好。较好的是，所选温度和压力是二次加热步骤最后达到的压力和温度。
一优选实施例中，首轮加热用约5-30小时将溶液逐步加热至约-20℃至20℃，避免溶液的复熔(液化)。这一步加热的时间优选约5-20小时，约5-10小时更好。这一步加热的温度优选约-10℃至20℃，约0℃更好。这优选的首轮干燥缩短了冷冻干燥全过程所需的时间。实际上，优选的首轮干燥使得二次干燥(聚核苷酸溶液在这一步被加热至约23-27℃)只进行约2-3小时，并形成基本上呈无定形物理结构的冷冻干燥聚核苷酸，在37℃至少10天以上仍保持至少90％的超螺旋。
总之，本发明过程适宜在真空下进行，始终保持真空，直至完成最后步骤(即，二次加热和可选的二次保持)。然而，可以在改变各加热阶段的真空压力，只要真空始终低于约200mTorr。
在完成可选的最后保持后，回收所得聚核苷酸组合物，其含水量为所回收组合物总重的约0．5-6wt％。按聚核苷酸组合物总重计，所回收的聚核苷酸组合物含水约0．5-6wt％，约1-5wt％为佳，约2-4wt％更好。冷冻干燥的聚核苷酸组合物以含约0．001-1份重量聚核苷酸比1份重量冷冻保护剂为宜。实施例之一中，聚核苷酸组合物宜含约0．001-0．5份重量聚核苷酸比1份重量冷冻保护剂。聚核苷酸组合物以无定形结构为佳，这可提高组合物的溶解度。提高溶解度可更快地再生和得到更浓的组合物。
以下实施例将详细说明本发明的部分实施方式。这些实施例只用于说明本发明而不限定本发明的范围。实施例1：本发明的一种优选冷冻干燥组合物
本发明的一种优选冷冻干燥组合物以质粒DNA为聚核苷酸，以蔗糖为冷冻保护剂，用上述方法制备该组合物。组合物所用的DNA含：编码gD2蛋白的单纯性疱疹病毒基因，该基因与巨细胞病毒启动子和SV40句腺苷酸化位点连接。国际专利申请WO97／41892(1997年11月13日公开)和美国专利5，593，972的图8对该质粒，又称质粒24，进行了描述。
表1列出了冷冻干燥前聚核苷酸溶液和一种液体对照组合物的组成。
表1
    成分 冷冻干燥前的聚核苷酸溶液     液体对照组合物
    质粒DNA     0．2％w／v     0．2％w／v
    蔗糖     2．0％w／v     ---
磷酸盐缓冲液(5mM)  0．045％w／v磷酸二氢钠，0．047％w／v磷酸氢钠     ---
    注射用水(qs)     100ml     100ml
布比卡因(促进剂)     ---     0．25％w／v
    EDTA     ---     0．01％w／v
柠檬酸盐缓冲液     ---     30mM
    pH     6．7     6．4
对表1中的冷冻干燥前溶液进行本发明冷冻干燥，其特征在于冷冻、首次干燥和二次干燥步骤的特定参数。这些参数按顺序列于表2，包括2次连续的首次干燥和4次连续的二次干燥。表2
冷冻干燥周期 温度(℃) 真空(mTorr) 时间(分钟) 渐变／保持
冷冻步骤    -40     200     30     保持
首次干燥(2)     0     100     30     渐变
    0     100     720     保持
二次干燥(4)     30      75      20     渐变
    30      75     180     保持
    25      50       5     渐变
    25      50     120     保持
根据以％超螺旋(％SC)表示的衰变监测以上冷冻干燥聚核苷酸组合物和液体对照37℃的稳定性。用琼脂糖凝胶法分析各样品的％SC。琼脂糖凝胶法是分子生物学常用于分离不同形式DNA的一种电泳过程。琼脂糖凝胶法检测依赖于染料溴乙锭嵌入DNA内。该方法使用荧光染料与双链(ds-)DNA结合进行检测，荧光是间接测定的。在含溴乙锭(EtBr)的琼脂糖凝胶上进行DNA电泳。嵌入DNA后，EtBr的荧光大大增强。用CCD(电荷-偶合装置)采集荧光信号。积分造影(AlphaInnotech TM软件)，计算样品中开环和超螺旋质粒的相对量。结果取决于EtBr与质粒的结合是否一致和均匀。然而，结果显示，当％SC低于93％时，凝胶法得出人为的低结果。因此，发展产生了一种取代它的HPLC法，参见Montgomery等，Pharmsci．，(增刊，1998)“测定疫苗产品中质粒DNA纯度(％超螺旋)的HPLC试验”，摘要2503。质粒DNA纯度根据T形超螺旋含量来测定。仅一步骨架内磷酸二酯键水解就足以将超螺旋DNA(SC)转化成开环形式(OC)。这一拓扑改变反映在琼脂糖凝胶上迁移率的改变。目前，最常用的质粒DNA纯度试验(％SC试验)以琼脂糖凝胶为基础。
表3给出描述DNA降解的速度方程。表3
方程1-是测得速度常数，代表DNA的总体降解(SC=超螺旋；OC=开环)KobsDNA(SC)→DNA(OC) d [ DNA ] dt = - k obs [ DNA ] t
方程2-拟一次条件下，DNA降解速度方程可写成如下：其中，[DNA]是DNA的纯度(％SC)或强度
方程3-用t=0的初始条件[DNA]=[DNA]0积分以上方程，得以下方程：
In[DNA]=In[DNA]0-kobst
用方程3，代入特定温度下的％SC(DNA纯度)稳定性数据，得到In(％SC)-时间曲线，根据该曲线的斜率可算出kobs。
方程4-在任意给定温度，如下计算保存期(t90，达到90％SC的时间)： t 90 = ln ( [ % SC ] 0 90 ) k obs 其中，[％SC]0表示t=0时的DNA纯度。方程5-假设方程4中的[％SC]0=95，给定温度下质粒DNA的保存期可如下计算： t 90 = 0.0541 k obs
根据表2中的方程3，得到了上述表1中冷冻干燥聚核苷酸组合物和对照的In(％SC)-时间曲线。结果见图1。用最小二乘回归法计算曲线斜率(-kobs，测得拟一次速度常数)。图1显示，优选冷冻干燥组合物的速度常数比液体对照组合物的速度常数至少低10倍。以上结果还显示，在37℃，冷冻干燥组合物的保存期比液体至少长10倍(根据方案1中的方程5计算，为54天和4天)。
然后，通过X光衍射，将表1的冷冻干燥聚核苷酸组合物与一种DNA溶液(即含0．2％w／v前文所述含gD2的质粒DNA的柠檬酸盐缓冲液，pH6．4)比较，用乙醇沉淀该溶液[Sambrook，J．等，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor，NY，pp．E10=E11，“核酸的浓缩：乙醇或异丙醇沉淀”]。以常规方法获得两组合物的X光衍射图案，显示，冷冻干燥组合物的X光衍射图案呈无定形结构特征，沉淀DNA的衍射图案呈高度结晶结构特征。因为本发明冷冻干燥聚核苷酸组合物的物理特性为无定形结构和高度孔隙率，本发明的组合物具有高度水溶性(高达约20mg／ml)。用常规HPLC法进行溶解度试验。实施例2：本发明的一种优选冷冻干燥组合物
用本发明方法制备本发明的另一种冷冻干燥组合物，它以实施例1所述质粒DNA为聚核苷酸，以海藻糖为冷冻保护剂和稳定剂。
液体对照与实施例1所用的相同。表4记录了冷冻干燥前溶液和液体质粒对照的组成。表4
    成分 冷冻干燥前的聚核苷酸溶液     液体对照组合物
    质粒DNA     0．2％w／v     0．2％w／v
    海藻糖     2．0％w／v     ---
磷酸盐缓冲液(5mM) 0．045％w／v磷酸二氢钠，0．047％w／v磷酸氢钠     ---
    注射用水(qs)     100ml     100ml
布比卡因(促进剂)     ---     0．25％w／v
    EDTA     ---     0．01％w／v
柠檬酸盐缓冲液     ---     30mM
    pH     6．7     6．4
如实施例1所述对冷冻干燥前溶液进行冷冻干燥，如实施例1所述根据以％超螺旋(％SC)表示的衰变测定该组合物的稳定性。用琼脂糖凝胶法分析各样品的％SC。图2显示表4冷冻干燥聚核苷酸组合物和液体对照组合物的In(％SC)-时间曲线。如实施例1所述，用最小二乘回归法计算曲线的斜率(-kobs，测得速度常数)。图2的结果显示，本发明冷冻干燥组合物的速度常数比液体对照低4倍。该结果还显示，37℃下，本发明冷冻干燥组合物的保存期比液体长4倍。实施例3：冷冻保护剂的筛选
对含有质粒DNA和不同冷冻保护剂(蔗糖、海藻糖、PVP和山梨醇)的几种聚核苷酸溶液进行本发明的冷冻干燥。这些实验所用的质粒DNA与实施例1所用的相同，即表达2型单纯性疱疹病毒gD2抗原的质粒。
表5列出了接受评价的8种冷冻干燥前聚核苷酸溶液的组成。冷冻干燥参数与实施例1表2中的相同。在如本发明所述冷冻干燥这些溶液之前和之后，如实施例1所述以琼脂糖凝胶法测定％SC。因此，表5还显示各聚核苷酸溶液冷冻干燥前的％SC和进行本发明冷冻干燥后的％SC。
表5
组成或特征                                                  聚核苷酸溶液
    1     2     3     4     5     6     7     8
质粒DNA(mg/ml)     1.1     1.1     1.1     1.1     1.1     1.1     1.1     1.1
海藻糖(％w/v)     2     -     -     -     -     -     -     -
PVP(％w/v)     -     5     -     -     -     -     -     -
蔗糖(％w/v)     -     -     2     2     -     -     2     -
山梨醇(％w/v)     -     -     -    -     5     -     -     -
磷酸盐缓冲液(mM)     10     10     10    10     10     10     -     -
柠檬酸盐缓冲液(mM)     -     -     -    -     -     -     10     10
EDTA(％)     -     -     -    0.01     -     -     -     -
注射用水(qs)    100ml     100ml     100ml    100ml    100ml    100ml    100ml    100ml
pH  6.9±0.2    6.9±0.2    6.9±0.2   6.9±0.2   6.9±0.2   6.9±0.2   6.9±0.2   6.9±0.2
含水量(％)冷冻干燥后    1-2％    ＞＞1％     1-2％    1-2％    1-2％    1-2％    1-2％    1-2％
    ％SC冷冻干燥前 96．8±0．7  96．8±0．7  96．8±0．7  96．8±0．7  96．8±0．7  96．8±0．7  96．4±0．6  96．4±0．6
    ％SC冷冻干燥后 93．8±0．7  81．2±0．7  92．0±0．2  92．7±0．6  92．4±0．7  66．1±1．0  92．7±1．0  90．7±0．9
根据以上结果，作为冷冻保护剂，海藻糖和蔗糖比PVP和山梨醇更有效。没有冷冻保护剂时，按照本发明冷冻干燥溶液6得到的磷酸盐缓冲液冷冻干燥对照的超螺旋损失超过30％，冷冻干燥溶液8得到的柠檬酸盐缓冲液冷冻干燥对照的损失低于5％。这是因为，二元酸盐晶体先于无定形一元酸盐冻结，所以磷酸盐样品的pH可能向酸性pH漂移。然而，在有冷冻保护剂蔗糖的冷冻干燥聚核苷酸组合物中则没有这一现象(参见溶液3和7)。所以，有冷冻保护剂时，缓冲液种类对冷冻干燥聚核苷酸组合物没有任何影响。
冷冻干燥聚核苷酸组合物的含水量显示，PVP没有任何良好的冷冻保护剂特性，因为，与含其他冷冻保护剂的冷冻干燥组合物相比(含水量1-2％)，含PVP的冷冻干燥组合物几乎完全干燥(＜＜1％)。含PVP的冷冻干燥组合物还显示超螺旋损失在15％以上。因此，对于本发明的冷冻干燥质粒DNA组合物来说，蔗糖和海藻糖是优良的冷冻保护剂。实施例4：本发明冷冻干燥组合物对免疫应答的影响
为了评价本发明冷冻干燥聚核苷酸组合物作为药物或研究试剂的用途，评价了冷冻干燥聚核苷酸组合物和对照对免疫应答的影响，使用的是实施例3制备的冷冻干燥组合物。
对照之一是冷冻干燥前的表5中聚核苷酸溶液6，不含冷冻保护剂(磷酸盐，冷冻干燥前)。另一对照是冷冻干燥的表5溶液8，柠檬酸盐缓冲液组合物，不含冷冻保护剂(柠檬酸盐，冷冻干燥后)。该实验中评价的本发明冷冻干燥组合物是冷冻干燥的表5聚核苷酸溶液1，以磷酸盐缓冲液配制，以海藻糖为冷冻保护剂(海藻糖／磷酸盐)；冷冻干燥的表5聚核苷酸溶液3，以磷酸盐缓冲液配制，以蔗糖为冷冻保护剂(蔗糖／磷酸盐)；和冷冻干燥的聚核苷酸溶液7，以柠檬酸盐缓冲液配制，含蔗糖为冷冻保护剂(蔗糖／柠檬酸盐)。图3和4的对照(023对照和阴性对照)相同，含有质粒骨架，没有gD2序列和缓冲液。
将各冷冻干燥组合物以磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液再生，所述缓冲液都与原冷冻干燥前溶液所用相同。Balb／C小鼠(5个一组)肌内接种各实施例3冷冻干燥组合物的再生溶液，100μl 50μgDNA／剂。组合物中未加其他组分。3周后杀死动物。A．细胞免疫评价
取出上述小鼠的脾脏，用于以淋巴细胞增殖试验测定抗原特异性细胞免疫应答。用收获的脾脏制备单细胞悬液，然后在有或没有20ng／ml纯化gD2蛋白存在下，培养这些细胞，2×105细胞／格。培养物在37℃、5％CO2中培养4天，然后每格加入20μl含1μCi3[H]胸腺嘧啶的RPMI-1640完全培养基(ICN Inc．，Costa Mesa，Ca)，再培养18小时。用多头样品收获器将细胞收获在玻璃纤维板上，在β计数器(Wallac，Finland)中以常规液体闪烁法测定放射性掺入。B．体液免疫应答评价
收集血清样品分析对HSV gD2的抗体(体液)应答。用ELSIA分析血清内的gD2特异性IgG抗体。简而言之，在4℃，以0．4μg／ml纯化gD2蛋白涂覆96格平底测试板(Co-star，Cambridge，MA)，放置过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，用4％牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭1小时。然后将50μl适当稀释的血清加至板上，4℃过夜。用BPST洗涤5次后，加入1∶2000稀释的过氧化物酶偶联抗小鼠IgG(Sigma，St．Louis，MO)，培养1小时。用BPST洗板，然后加入底物3，3′，5，5′，-四甲基二氨基联苯(TMB)-H2O2(Biotecx，Houston，Tx)。显色30分钟，然后在Emax微滴板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上450nm读数。C结果
图3和4分别显示了对以上组合物的细胞应答和体液应答。结果显示，对本发明冷冻干燥柠檬酸盐／蔗糖组合物的细胞应答和体液应答高于对本发明冷冻干燥磷酸盐／柠檬酸盐组合物和冷冻干燥的柠檬酸盐／无冷冻保护剂对照的应答。就本发明冷冻干燥组合物的结果与冷冻干燥前磷酸盐缓冲液对照相比，本发明冷冻干燥过程和在聚核苷酸组合物中加入冷冻保护剂(蔗糖或海藻糖)显然对细胞和体液应答没有不利影响。本发明的冷冻干燥组合物保留了所含质粒或聚核苷酸的活性。实施例5：对本发明冷冻干燥组合物的评价
对16种不同的冷冻干燥前溶液进行了评价，并在表6中进行了描述。各溶液所用的DNA即实施例1中的含gD2质粒。这些溶液在表中以不同的编号表示，其区别在于：DNA浓度(由编号的第一个数字表示)，所用的冷冻保护剂(由编号的第一个字母表示)，冷冻保护剂的浓度(由编号的第二个数字表示)，和冷冻干燥后的含水量(编号中，以L表示低，H表示高)。用注射用水将冷冻干燥前溶液定容至100ml，用表2中的冷冻干燥周期参数，进行本发明的冷冻干燥。
对表6中的全部冷冻干燥组合物和液体对照(组合物编号：#96F0254，即实施例1表1中含1mg／ml质粒DNA的液体对照制剂)进行37℃的加速稳定性试验。稳定性实验还包括不加冷冻保护剂的冷冻干燥质粒组合物作为另一对照。从首日至第30日，间隔不同时间采集样品，如实施例1所述以琼脂糖凝胶法分析％SC。用％SC数据进行最小二乘回归分析(表3中的方程3)，计算出不同组合物中DNA降解的拟一次速度常数(kobs)。表6还包括不同组合物的置信区间(CI)95％的kobs和R2(拟和度)。表6
组合物编号#    DNA(mg／ml)   冷冻保护剂(％w／w) 含水量(％)冷冻后 kobs(95％CI)×10-4天-1冷冻干燥后     R2冷冻干燥后
96F-0254     1     ---     ---     139．8±117     0．93
  1S1L     1     蔗糖1％     2      12．3±20．39     0．77
  1S2L     1     蔗糖2％     2        4．0±6．4     0．77
  1T1L     1    海藻糖1％     2       66．5±46．2     0．95
  1T2L     1    海藻糖2％     2       94．1±28．9     0．99
  2S1L     2     蔗糖1％     2        11．2±8．6     0．94
  2S2L     2     蔗糖2％     2        10．2±15．5     0．80
  2T1L     2    海藻糖1％     2        40．5±28．2     0．95
  2T2L     2    海藻糖2％     2        55．0±7．6     1．00
  1S1H     1     蔗糖1％     4        18．9±43．1     0．64
  1S2H     1     蔗糖2％     4         3．1±10     0．47
  1T1H     1    海藻糖1％     4        48．5±24．9     0．97
  1T2H     1    海藻糖2％     4        41．9±41     0．91
  2S1H     2     蔗糖1％     4         6．1±20     0．47
  2S2H     2     蔗糖2％     4        21．6±19．2     0．92
  2T1H     2    海藻糖1％     4        26．1±20．1     0．94
  2T2H     2    海藻糖2％     4        32．5±1．4     1．00
％SC结果显示，本发明所有含蔗糖的冷冻干燥组合物在37℃至少4周内保持稳定(即，实验周期)。表5中95％置信区间的拟一次速度常数(kobs)和R2(拟和度)清楚地显示，目前临床组合物(96F-0254)的kobs比含蔗糖为冷冻保护剂的大多数本发明冷冻干燥聚核苷酸组合物高至少10倍。类似地，目前临床组合物的kobs比含海藻糖为冷冻保护剂的本发明冷冻干燥聚核苷酸组合物高至少1．5倍。因此，对本发明的冷冻干燥聚核苷酸组合物来说，蔗糖是最好的冷冻保护剂和最好的稳定剂。
含蔗糖冷冻干燥组合物(编号2S2L)37℃的保存期(％超螺旋为95％至90％)为54天，相比之下，液体组合物96F0254的保存期为4天。然而，在5℃，目前的临床组合物可稳定2年。所以，可以推断，本发明冷冻干燥组合物的保存期可以非常长。常温(25℃)下，估计可在至少6个月内保持稳定。本发明含海藻糖为冷冻保护剂的高含水量冷冻干燥组合物比含海藻糖的低含水量类似组合物表现出更好的稳定性。
本发明含蔗糖的低含水量冷冻干燥组合物的速度常数低于本发明含蔗糖的高含水量冷冻干燥组合物。因此，挑选实施例1的冷冻干燥组合物(含2％蔗糖)作为下一步实验的优选组合物。实施例6：高浓度DNA产品
用本发明优选冷冻干燥组合物冷冻干燥大量DNA，用于制备含促进剂的高浓度最终药物产品。该组合物含实施例1所述的质粒DNA，在冷冻干燥前溶液中的浓度为0．2％w／v，含2．0％w／v蔗糖冷冻保护剂，柠檬酸盐缓冲液(5mM，pH6．7)，100ml注射用水。用实施例1和表2描述的周期冷冻干燥该组合物。促进剂布比卡因以柠檬酸盐缓冲液(5mM，pH6．7)配制成不同浓度(0．25，0．6，1．0％w／v)，用于再生以上冷冻干燥产物。为了获得要求的DNA浓度，在冷冻干燥粉末中加入不同量的布比卡因缓冲溶液。所得“药物”制剂如表7所示，该表记录了再生后高浓度DNA产品稳定性随时间(天)的变化(测定％SC)。表7
组合物# DNA浓度(mg／ml) 布比卡因浓度(％w／v) 时间(天) 纯度(％SC)
0 95
1 5．3 - 18 92
0 95
2 5．3 0．6 18 93
0 95
3 10 1．0 1 95
3 95
4 10 - 0 95
18 94
5 20 - 0 95
18 93
以上结果显示，根据纯度，至少20mg／ml的本发明再生冷冻干燥聚核苷酸组合物可保持稳定18天。还应该注意到的是，根据物理外观，再生溶液是均匀的。
前文中的所有参考文献和专利都在此作为参考。以上说明函盖了许多修改，这些对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。应该认为，上述对本发明组合物和方法的修改包括在后文权利要求的范围之内。

Claims (56)

1．一种冷冻干燥聚核苷酸组合物，它包含：
(a)至少一种聚核苷酸；
(b)至少一种冷冻保护剂，其中，聚核苷酸与冷冻保护剂之比约为0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷冻保护剂；
(c)占聚核苷酸溶液总重约0．5-6wt％的水；
所述聚核苷酸组合物在37℃至少10天以上保持至少90％超螺旋。
2．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的水占1-5wt％。
3．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的水占2-3wt％。
4．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的聚核苷酸选自：ADNA，BDNA，ZDNA，RNA，tRNA，mRNA，以及它们的混合物。
5．根据权利要求4所述的组合物，其中的聚核苷酸是双链DNA。
6．根据权利要求4所述的组合物，其中的聚核苷酸是质粒DNA。
7．根据权利要求4所述的组合物，其中的聚核苷酸是病毒载体。
8．根据权利要求1所述的组合物，还包含两种或两种以上冷冻保护剂的混合物。
9．根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述的冷冻保护剂是糖醇。
10．根据权利要求9所述的组合物，其中所述的醇选自：糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇，和他们的混合物。
11．根据权利要求10所述的组合物，其中的冷冻保护剂是聚乙二醇。
12．根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述的冷冻保护剂是糖酸。
13．根据权利要求12所述的组合物，其中的糖酸选自醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸(aldaric)及它们的混合物。
14．根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述的冷冻保护剂是糖。
15．根据权利要求14所述的组合物，其中所述的糖选自：醛糖、酮糖、氨基糖、二糖、多糖，和它们的混合物。
16．根据权利要求15所述的组合物，其中所述的糖选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它们的混合物。
17．根据权利要求16所述的组合物，其中的冷冻保护剂是蔗糖。
18．根据权利要求1所述的组合物，它基本上呈无定形物理结构。
19．根据权利要求6所述的组合物，其中所述的质粒DNA在37℃至少20天以上保持至少90％超螺旋。
20．一种液体聚核苷酸组合物，它包含以水再生的权利要求1至19中任一项所述的冷冻干燥组合物，其pH为6．2-7．8。
21．一种药物组合物，包含的活性成分选自：
(a)权利要求1至19中任一项所述的冷冻干燥组合物；
(b)权利要求20所述的液体组合物；
和任选的药学上认可的赋形剂或载体。
22．根据权利要求21所述的组合物，其中所述的赋形剂或载体适合以下给药途径：口服、肠胃外、鼻内或肺内。
23．一种治疗哺乳动物的方法，包括给予有效量的权利要求21所述组合物。
24．根据权利要求23所述的方法，还包括通过以下途径给予所述组合物：口服、肠胃外、鼻内或肺内。
25．一种制备冷冻干燥聚核苷酸组合物的方法，包括以下步骤：
(a)形成聚核苷酸水溶液，pH为6．2至7．8，含0．1-5mg／ml至少一种聚核苷酸，按聚核苷酸溶液总体积计；和0．5-10wt％至少一种冷冻保护剂，按聚核苷酸溶液总重计；
(b)将聚核苷酸溶液冷却至-30℃至-70℃，直至冻结；
(c)施加25mTorr至250mTorr的真空；
(d)第一次用5至40小时将聚核苷酸溶液逐步加热至-40℃至20℃；
(e)将加热步骤(d)后的聚核苷酸溶液在-35℃至10℃，25mTorr至250mTorr，保持1至10小时；
(f)在25mTorr至250mTorr，用1至20小时将保温步骤(e)后的聚核苷酸溶液逐步加热至20℃至35℃；
(g)回收冷冻干燥的聚核苷酸组合物，含水量占所得组合物总重0．5-6wt％。
26．根据权利要求25所述的方法，其中所述步骤(a)的聚核苷酸溶液还含有缓冲液。
27．根据权利要求25所述的方法，在所述步骤(f)后，还包括将聚核苷酸溶液在25mTorr至150mTorr，20-30℃保持1至10小时的步骤。
28．根据权利要求25所述的方法，其中的步骤(d)包括第一次用5-20小时将所述聚核苷酸溶液逐步加热至-10℃至20℃。
29．根据权利要求27所述的方法，在步骤(e)中，所述聚核苷酸溶液在-10℃至10℃保持2-10小时。
30．根据权利要求29所述的方法，在保持步骤(e)中，所述聚核苷酸溶液在-5℃至5℃保持5-7小时。
31．根据权利要求30所述的方法，在保持步骤(e)中，所述聚核苷酸溶液保持在40-150mTorr下。
32．根据权利要求25所述的方法，在冷却步骤(b)中，用1-5小时将所述聚核苷酸溶液逐步冷却至-30℃至-70℃。
33．根据权利要求25所述的方法，在步骤(c)中，将压力降至50-100mTorr。
34．根据权利要求25所述的方法，步骤c)和(d)之间，将所述聚核苷酸组合物在步骤(b)的温度和步骤(c)的压力下保持0．5-5小时。
35．根据权利要求25所述的方法，在加热步骤(d)中，用8-20小时将所述聚核苷酸溶液逐步加热至-5℃至5℃。
36．根据权利要求35所述的方法，加热步骤(d)的压力为40-150mTorr。
37．根据权利要求25所述的方法，在步骤(c)中，如下施加真空：由迅速降压至300-200mTorr，然后然后在1-2小时内逐步降压至150m-40mTorr。
38．根据权利要求25所述的方法，在加热步骤(f)中，用2-3小时将聚核苷酸溶液加热至23-27℃。
39．根据权利要求38所述的方法，加热步骤(f)的压力为40-110mTorr。
40．根据权利要求25所述的方法，加热步骤(d)进行7-11小时；保持步骤(e)进行1小时，加热步骤(f)进行2小时。
41．根据权利要求25所述的方法，其中的冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇，和它们的混合物。
42．根据权利要求41所述的方法，其中所述的冷冻保护剂是蔗糖和聚乙二醇。
43．一种用权利要求25至42中任一项所述方法制备的冷冻干燥聚核苷酸产品。
44．根据权利要求43所述的产品，其中所述的聚核苷酸在37℃至少10天以上保留至少90％超螺旋。
45．一种液体聚核苷酸组合物，它包含以水溶液中再生的权利要求43所述的冷冻干燥聚核苷酸产品，其pH为6．2-7．8。
46．一种药物组合物，包含的活性成分选自：
(a)权利要求43所述的冷冻干燥组合物；
(b)权利要求45所述的液体组合物；
和任选的药学上认可的赋形剂或载体。
47．根据权利要求46所述的组合物，其中所述的赋形剂或载体适合以下给药途径：口服、肠胃外、鼻内或肺内。
48．一种治疗哺乳动物的方法，包括给予有效量的权利要求46所述组合物。
49．根据权利要求48所述的方法，还包括通过以下途径给予所述组合物：口服、肠胃外、鼻内或肺内。
50．一种冷冻干燥聚核苷酸组合物的改进方法，该方法包括冷冻所述组合物，让所述冻结组合物处于真空，进行首轮干燥，提高以上干燥步骤产物所处的压力，进行二次干燥步骤，回收冷冻干燥产物，改进在于以下步骤：
对含有冷冻保护剂的聚核苷酸溶液进行首轮干燥，所述溶液已被冷却至冻结并处于真空下，所述首轮干燥包括用5-30小时将溶液逐步加热至-20℃至20℃，避免所述溶液的复熔；
所述首轮干燥缩短了整个冷冻干燥过程所需的时间，得到基本为无定形物理结构的冷冻干燥聚核苷酸，它在37℃至少10天以上保留至少90％超螺旋。
51．根据权利要求50所述的方法，其中所述的加热时间是5-20小时。
52．根据权利要求50所述的方法，其中所述的加热时间是5-10小时。
53．根据权利要求50所述的方法，其中所述的温度是-10℃至20℃。
54．根据权利要求50所述的方法，其中所述的温度是0℃。
55．根据权利要求50所述的方法，还包括二次干燥，期间，用2-3小时将聚核苷酸溶液加热至23-27℃。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208094A (zh) * 2014-12-29 2017-09-26 株式会社博纳克 稳定含有核酸分子的组合物

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100600464B1 (ko) * 1998-05-22 2006-07-13 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤 안정한 유전자 제제
JP4538150B2 (ja) * 1998-08-14 2010-09-08 ヴァレンティス，インコーポレイテッド 核酸分子の保護された単一バイアル調製物、インライン混合によってそれを形成する方法、及び関連する生成物及び方法
ATE319810T1 (de) * 1999-11-19 2006-03-15 Zycos Inc Durchflussverfahren zur herstellung von mikropartikeln
JP2001316297A (ja) * 2000-02-23 2001-11-13 Kaken Pharmaceut Co Ltd 遺伝子包埋リポソーム製剤及びその製法
PT1456377T (pt) 2001-12-20 2019-09-10 Merck Sharp & Dohme Composições de syn3 e processos
AU2003218168A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 University Of Southern California Ophthalmic solutions for delivery of expression vectors
CN100593544C (zh) 2002-03-15 2010-03-10 惠氏控股有限公司 酶活性减少的非典型流感嗜血杆菌的p4蛋白突变体
US7381422B2 (en) 2002-12-23 2008-06-03 Vical Incorporated Method for producing sterile polynucleotide based medicaments
WO2004060059A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-22 Vical Incorporated Method for freeze-drying nucleic acid/block copolymer/cationic surfactant complexes
TW200613554A (en) 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
EP1954252B1 (en) 2005-12-02 2016-02-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Nanoparticles for use in immunogenic compositions
KR100777249B1 (ko) 2006-02-14 2007-11-28 (주)바이오니아 건조 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 제조 방법
DE102006038240A1 (de) * 2006-08-07 2008-02-14 Biotronik Vi Patent Ag Verfahren zur Herstellung eines Komposits aus Oligo- oder Polynucleotiden und hydrophoben biodegradierbaren Polymeren sowie nach dem Verfahren erhaltenes Komposit
GB0701253D0 (en) * 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
EP1970441A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-17 BioAlliance Pharma Plasmid containing a sequence encoding a disintegrin domain of metargidin (RDD)
MX2010010993A (es) * 2008-04-09 2010-11-05 Viromed Co Ltd Formulaciones liofilizadas de adn para expresion mejorada de adn de plasmido.
EP3336082B1 (en) 2011-06-08 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
AU2013292617A1 (en) 2012-07-19 2015-01-22 Zoetis Llc Bovine influenza C virus compositions
RU2542385C2 (ru) * 2012-08-31 2015-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека
MX2016005006A (es) 2013-10-22 2016-07-14 Viromed Co Ltd Composicion para prevenir a tratar la esclerosis lateral amiotrofica usando dos o mas isoformas del factor de crecimiento de hepatocito.
RU2612497C2 (ru) 2015-05-26 2017-03-09 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf
ES2933623T3 (es) 2015-08-14 2023-02-10 Zoetis Services Llc Composiciones de Mycoplasma Bovis
CA3042689A1 (en) * 2016-11-04 2018-07-12 Baxalta Incorporated Adeno-associated virus formulations
CA3106297A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 Helixmith Co., Ltd. Lyophilized pharmaceutical compositions for naked dna gene therapy
CN110596227B (zh) * 2019-08-08 2021-11-23 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法
KR102460006B1 (ko) * 2021-11-22 2022-10-27 주식회사 리엔젠 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000807A1 (en) * 1991-07-03 1993-01-21 Cryolife, Inc. Method for stabilization of biomaterials
US5709076A (en) * 1992-09-14 1998-01-20 Lawlor; Shawn P. Method and apparatus for power generation using rotating ramjet which compresses inlet air and expands exhaust gas against stationary peripheral wall
AU2215995A (en) * 1994-04-07 1995-10-30 Akzo Nobel N.V. Freeze-dried compositions comprising rna
WO1996027393A1 (en) * 1995-03-07 1996-09-12 University Of Pittsburgh A dry powder formulation for gene therapy
US5811406A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
CA2252565C (en) * 1996-04-26 2010-11-23 David B. Volkin Dna vaccine formulations
ZA973642B (en) * 1996-04-26 1997-11-25 Merck & Co Inc DNA vaccine formulations.
DE19716154A1 (de) * 1997-04-18 1998-10-22 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile pharmazeutische Darreichungsform für Peptide, Proteine und Nukleinsäuren

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107208094A (zh) * 2014-12-29 2017-09-26 株式会社博纳克 稳定含有核酸分子的组合物

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Publication number Publication date
KR20010074441A (ko) 2001-08-04
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KR100625385B1 (ko) 2006-09-18
PT1061955E (pt) 2005-08-31

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