CN103596594A - 自身凝胶化核酸 - Google Patents
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Abstract
本申请发明旨在提供制备基本上仅由核酸构成的水凝胶的方法。本申请发明提供由选自一部分互相互补的，与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物的2个以上的核酸单体构成，一个核酸单体含构成粘性突出末端的部分、可与1个以上的别的核酸单体形成双链的互补性碱基序列部，并且不含有核酸连结酶的，用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的核酸溶胶状组合物及使用其制成的核酸凝胶。
Description
【技术领域】
本发明涉及自身凝胶化核酸。具体而言，本发明涉及不使用连接酶等的核酸连结酶，制备基本上仅由核酸组成的水凝胶的方法。
【背景技术】
核酸、特别是，使用DNA制备凝胶的尝试已经有报告（非专利文献1）。在非专利文献1中公开的方法中，将DNA单体的末端使用DNA连接酶共有结合。更具体而言，在非专利文献1中，合成具有与末端互补的序列的各DNA链，使用T4连接酶制备X型DNA、Y型DNA、T型DNA，及使用这些DNA制备水凝胶已有报告。但是，在使用非专利文献1中公开的DNA制备的凝胶中，由于凝胶化中使用的酶（DNA连接酶）残留，安全性及抗原性成为问题。
另外，在非专利文献1中公开的方法中，由于凝胶化中酶反应是必要的，从而在向活体施用凝胶之时，不得不预先在活体外制备凝胶，以得到的凝胶的形状施用，施用上、这成为大的限制。再者，对比文件1中公开的凝胶化反应由于是使用酶的反应，为了将比较大的物质封入凝胶之中，有在凝胶化、即连接反应时加封入物质的必要，而这损害封入物质的功能的危险性高。另外，在使用连接酶制备的凝胶中，得不到充分高度的粘弹性。
此外，制成以DNA作为构成要素的水凝胶的尝试也多，有化学交联或热·pH依赖性等多的报告（非专利文献2、3及专利文献1）。
例如，在非专利文献2中报告，将从鲑鱼精巢提取的DNA化学（通过使用乙二醇二缩水甘油基醚）交联之后，添加1M NaOH和TEMED，加热（50℃）2小时左右而制成凝胶。但是，在涉及的方法中，除核酸外，由于使用对活体的安全性受到质疑的有机化合物，从而向活体的施用其安全性受到在疑。再者，由于在凝胶化中加热是必要的，无法含有易变性的物质。
另外，非专利文献3涉及pH依赖性的Y型DNA制备。涉及的方法利用依赖于pH变化的，DNA分子的状态的变化。在此方法中，可向DNA溶液添加HCl而使成为酸性来凝胶化，一旦凝胶化的则也可通过添加NaOH使其回到溶液的状态。但是，为了维持凝胶状态，不得不使环境维持在酸性，从而有凝胶对周围的环境不稳定的问题。
专利文献1公开了提供不伴随化学反应或聚合反应，在人的体温（37℃）附近，在生理的条件下简便、迅速地得到充分的强度的水凝胶的合成水凝胶的方法。但是，由该方法得到的凝胶由于是将多糖类等的水溶性高分子与核酸混合而制成的水凝胶，温度依赖性地凝胶-溶胶转移是可能的，但由于大量地含多糖类等，很难说是由核酸组成的水凝胶。
另一方面，利用明胶或合成聚合物等开发了各种各样的水凝胶制剂。由这些制备的凝胶的情况也是施用前凝胶化，施用后，凝胶化的系统少。注射可能的凝胶也有报告，但这是通过注射针的亚微米～微米尺寸的凝胶。从而，在通过注射等的施用的情况中，使用微细化的凝胶，在此时缓慢释放化等的凝胶特性被大幅地损害。
另外，多处报告了利用由温度的溶胶-凝胶转移的水凝胶（专利文献2等）。但是，使用的化合物利用一部分化学修饰，不是由核酸等的纯粹的天然原料构成的凝胶。
再有，进行多个以CpG DNA作为佐剂的尝试。也报告了由胆甾醇修饰或硫代化的活化能的增强。但是，在这时，佐剂（CpG DNA）和抗原即使同时施用，在活体内的行为也被怀疑是独立的。另外，在硫代型DNA的情况中，由高的蛋白结合性的组织障碍是问题。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开2002-18270号公报
专利文献2:特开2005-239860号公报
【非专利文献】
非专利文献1:Nat.Mater.5：797-801,2006
非专利文献2:J Phys Chem B.2007Sep20；111（37）:10886-96
非专利文献3:Angew Chem Int Ed Engl.2009；48（41）:7660-3
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
使水凝胶等的生理活性物质缓慢释放化的受控的释放系统对于得到持续的的治疗效果或副作用的减轻有效。本发明的目的是提供通过以DNA或RNA的核酸单体作为基本单位，制备各种结构的核酸单位，将其不使用DNA连接酶等的酶连接来制备基本上仅由核酸构成，并且，比使用连接酶的凝胶粘弹性高的水凝胶的方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人发现，通过调节盐浓度和核酸浓度－核酸单位中的突出末端的碱基数，可提供基本上仅由核酸构成的粘弹性高的水凝胶。即，由本发明提供不使用连接酶等的酶而制备基本上仅由核酸构成的粘弹性高的水凝胶的方法。
以往的方法取将在末端结合磷酸基的寡核苷酸用DNA连接酶结合的方法。对此，在本发明的方法中，通过调节突出末端的碱基数或盐浓度、核酸浓度等，可无需酶反应而制备水凝胶。由本发明的方法，不仅不使用酶，不利用热或pH变化等，所以可在溶胶状态下施用，施用后可在活体内凝胶化。另外，通过设计多种核酸单体，可通过混合构建凝胶化的系统。此时，在凝胶化中由于不需要酶或热等，化学－物理不稳定的物质的内包也可能。
即，本发明，在第一实施方式中，提供以下技术方案：
（1-1）：用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的核酸溶胶状组合物，其由选自一部分互相互补的，与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物的2个以上的核酸单体构成，一个核酸单体含构成粘性突出末端的部分、可与1个以上的别的核酸单体形成双链的互补性碱基序列部，并且不含有核酸连结酶。
（1-2）：（1-1）所述的溶胶状组合物，其用于在活体内制成凝胶。
（1-3）：（1-1）或（1-2）记载的溶胶状组合物，其中核酸单体包括在互补性碱基序列部中互补地结合，并且以粘性突出末端在生理的条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的序列结构。
（1-4）：不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的方法，其包括提高上述（1-1）～（1-3）任何的核酸溶胶状组合物的核酸浓度及/或盐浓度。
（1-5）：用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含上述（1-1）所述的第1核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含（1-1）中记载的第2核酸单体，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该第2核酸单体中的粘性突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（1-6）：制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过混合上述（1-5）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物来形成凝胶。
（1-7）：用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含上述（1-1）所述的核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有在两末端具有包括粘性单链的突出末端的双链核酸，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该双链核酸的两末端的突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（1-8）：制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过混合上述（1-7）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物，形成凝胶。
（1-9）：不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其通过上述（1-4）、（1-6）及（1-8）所述的任何方法制成。
（1-10）：封入内封物质，并且制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括在上述（1-4）、（1-6）及（1-8）所述的任何方法中，将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中。
（1-11）：（1-10）所述的方法，其中内封物质选自：低分子量化合物、蛋白质及细胞。
（1-12）：含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其由上述（1-10）或（1-11）记载的方法制成。
另外，本发明也可提供以下技术方案：
（1-13）：（1-1）或（1-2）记载的溶胶状组合物，其中核酸单体在互补性碱基序列部中互补地结合，并且，粘性突出末端含回文序列结构。
本发明，在再第二的实施方式中，也可提供以下技术方案：
（2-1）：用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的溶胶状组合物，其在组合物中以核酸浓度0.3mM+1.6/x（突出末端部碱基数）mM以下含有由粘性突出末端部和互补性碱基序列部组成的2个以上的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶，盐浓度以NaCl浓度换算在80mM/x（突出末端部碱基数）以下，
［其中，
粘性突出末端部是4～12个核苷酸长，以与至少1个别的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的单链核酸部分，
与别的寡核苷酸互补地结合的互补性碱基序列部是8～45个核苷酸长，以与别的寡核苷酸中的互补性碱基序列部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补］。
（2-2）：（2-1）所述的溶胶状组合物，其用于在活体内制成凝胶。
（2-3）：（2-1）记载的溶胶状组合物，其中粘性突出末端含回文序列结构。
（2-4）：制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过分别将上述（2-3）所述的溶胶状组合物中的核酸浓度提高到3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度以NaCl浓度换算提高到640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上来形成凝胶。
（2-5）：用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含有上述（2-1）所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有（2-1）所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列，
该第2寡核苷酸的粘性突出末端部含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（2-6）：制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过将上述（2-5）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶。
（2-7）：用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含有上述（2-1）所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有在两端具有包括粘性的单链的突出末端部，其间具有由双链构成的互补性碱基序列部的核酸，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
［在第2溶胶状组合物中，
突出末端部是4～12个核苷酸长，以与该第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的单链核酸部分，
互补性碱基序列部是8～45个核苷酸长，以与第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的互补性碱基序列部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的双链核酸部分］
其中
该第1溶胶状组合物中的寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列，
该由双链构成的互补性碱基序列部的两端的突出末端部含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（2-8）：制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过将上述（2-7）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶。
（2-9）：不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其由上述（2-4）、（2-6）及（2-8）所述的任何方法制成。
（2-10）：封入内封物质，并且制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括在上述（2-4）、（2-6）及（2-8）所述的任何方法中，将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中。
（2-11）：（2-10）所述的方法，其中内封物质选自：低分子量化合物、蛋白质及细胞。
（2-12）：含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其由上述（2-10）或（2-11）记载的方法制成。
（3-1）：（1-12）及（2-12）之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶，其中核酸单体含CpG基序。
（3-2）：（1-12）、（2-12）及（3-1）之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶，其中核酸单体的种类数是3～8。
（3-3）：（1-1）～（1-3）、及（2-1）～（2-3）之任一项所述的溶胶状组合物，其中核酸单体含CpG基序，所述核酸溶胶状组合物用于制成免疫佐剂。
（3-4）：免疫佐剂，其是含（1-9）、（1-12）、（2-9）、及（2-12）之任一项所述的核酸凝胶的免疫佐剂，核酸单体含CpG基序。
【发明效果】
由本发明，因为可不添加连接酶等的核酸连结酶，通过调节盐浓度－核酸浓度或突出末端的碱基数来凝胶化各种序列的核酸，从而可制成添加物含有量少的水凝胶。另外，在本发明中，没必要使用给凝胶制成带来安全性隐患的有机化合物。再者，也克服了由连接酶等的酶的使用所至的安全性－抗原性的问题。另外发现，通过使用连接酶的以往的方法，难以制备粘弹性优良的核酸凝胶，但通过本发明的方法，可制备示优良的粘弹性的核酸凝胶。
再者，DNA或RNA可为以人为首的哺乳类细胞中表达的Toll-样受体（TLR）的配体，如水凝胶一样的微粒子易摄取入表达TLR的免疫活性细胞，所以基于核酸形成的本发明的系统除了生理活性物质的缓慢释放化之外，作为有效活化免疫活性细胞的免疫佐剂发挥功能。再者由本发明也可克服佐剂和抗原的在活体内的行为独立的问题。另外，通过本发明的方法的凝胶化，例如，由CpG基序的使用，导入活体内时可得到示高的细胞的免疫刺激性的核酸制备物。而且，由本发明可制备副作用少的免疫佐剂。
一般而言，施用凝胶制剂时有必要切开等成为问题，但在本发明的系统中，在溶胶状态下施用后，在体内的凝胶化也可能。由此，由注射或喷雾、滴下、涂布的施用也可能。另外，与微细化凝胶不同，由于在溶胶状态下施用后，在体内凝胶化，无损害缓慢释放化等的凝胶特性的担忧。另外，本发明的凝胶有触变性，通过注射器施用也能在体内再度凝胶化，所以不损害缓慢释放化等的凝胶特性。
另外，随着核酸浓度或盐浓度的变化进行凝胶化，在凝胶化中无需加热等，所以对于热或化学反应弱的物质、例如抗原蛋白质或细胞之内封也可能，内封不稳定的物质时变性的可能性也少。从而，将比较大的物质封入凝胶之中，损害封入物质的功能的危险也少。再者，本发明的凝胶对周围环境也稳定。
再者，将反义DNA或siRNA、CpG DNA等的核酸医药掺入构造中也可能。关于免疫活化，也可通过选择适当的碱基序列而构建不活化免疫的系统。凝胶的强度可通过核酸单位的结构、突出末端数控制，可通过调节核酸浓度、盐浓度、突出末端碱基数来控制凝胶化。由这些的调节，也可控制凝胶内部的结构、凝胶强度、内封物质的释放速度。另外，也可向核酸单位的末端之一部分插入各种功能性分子，由此可更大幅度改变性质。也可利用各种修饰核酸。
【附图说明】
【图1】是根据本发明从寡核苷酸形成水凝胶的推定模式图。
【图2】是示由本发明形成的水凝胶的概观的照片。
【图3】是由本发明形成的水凝胶的扫描型电子显微镜像。
【图4】是通过混合可形成两种核酸单位的核酸单体的组形成凝胶的推定模式图。
【图5】是内包内封物质的水凝胶的形成的流程及涉及的凝胶的扫描型电子显微镜像。
【图6】是示由寡核苷酸制成的Y型单位及连结Y型单位制备的树状聚体样DNA的模式图及它们的TNF-α释放活性及由细胞的摄取的坐标图。
【图7】是示施用本发明的溶胶状组合物之后，在活体内形成凝胶的照片。
【图8-1】是示施用溶胶状组合物之后，在活体内形成凝胶的照片及在活体内形成的凝胶的扫描型电子显微镜像。
【图8-2】是示在注射器内、及从注射器的压出后的DNA溶液或DNA水凝胶的照片（A）、将这些皮内施用的部位的照片（C）、以及注射器通过前（B左）及注射器通过后（B右）的水凝胶的粘弹性的坐标图（B）。
【图9】是示含或不含CpG基序的，免疫学有活性或免疫学无活性的寡核苷酸的序列及使用它们得到的凝胶的树突细胞的刺激活性的照片。
【图10】示各种序列的寡核苷酸的例。
【图11】是示通过混合两种四足DNA形成凝胶的推定模式图和通过混合形成的水凝胶的概观的照片。
【图12】是示通过混合四足DNA和双链DNA（dsDNA）形成凝胶的推定模式图和通过混合形成的水凝胶的概观的照片。
【图13】是含诱饵DNA及siRNA的四足DNA的设计图。
【图14】是示由免疫学有活性的四足DNA用OVA刺激的免疫应答的增强的流程及坐标图。
【图15】是本发明的凝胶的推定立体结构。
【图16】是示使用各种核酸单位得到的凝胶之内部结构的差异的扫描型电子显微镜像。
【图17】是示由DNA浓度、粘性突出末端的长度及盐浓度控制凝胶的特性的坐标图。
【图18】是示由四足DNA的突出末端的性质及盐浓度控制从凝胶释放内封物质的特性的坐标图。
【图19】是示使用胆甾醇修饰寡核苷酸的凝胶的细胞摄取及组织迁移性的增大的模式图、坐标图及照片。
【图20】是示在活体外将溶胶状的溶液施用到小鼠的鼻腔内的结果，变成凝胶的照片。
【图21】是示DNA水凝胶中掺入GFP标记骨髓来源细胞（BMDC）的荧光显微镜图像。
【图22】是对比使用连接酶制备的DNA水凝胶和不使用连接酶制备的DNA水凝胶的凝胶粘弹性的坐标图。
【图23】是示对有3～12个足的多足DNA制备物的PAGE分析的结果的照片。
【图24】是示DNA制备物的CD光谱的坐标图。
【图25】是示小鼠血清中的多足DNA制备物的分解的照片（A及B）及坐标图（C及D）。
【图26】是示向小鼠注入的32P-DNA水凝胶的注入部位或排出淋巴节中的检测量的经时变化的坐标图。
【图27】是示小鼠血清中的DNA水凝胶的经时分解（左上图）、从内包DXR的DNA水凝胶的DXR释放的经时变化（左下图）、及内包DXR的CpGDNA水凝胶的肿瘤增殖抑制效果的坐标图（右图）。
【图28】是示由CpGDNA水凝胶的IL-6释放诱导效果的坐标图。
【图29】是示由含有CpG的多足DNA制备物的TNF-α（A）及IL-6（B）释放诱导的坐标图。
【图30】是示由含有CpG的多足DNA制备物的TNF-α释放诱导的坐标图。
【图31】是示含有CpG的多足DNA制备物的向细胞内的摄取的坐标图。
【图32】是示由多足DNA制备物的IL-6释放的活化以TLR9依赖性地进行的坐标图。
【图33】是示单核细胞进行多足DNA制备物的向细胞内的摄取的坐标图。
【图34】是示含有CpG的DNA水凝胶持续强力地诱导IL-6mRNA表达的坐标图。
【图35】是示内包OVA的CpGDNA水凝胶强诱导适应免疫反应的坐标图。
【图36】是将注入部位中的免疫细胞的浸润（左图）、及脾肿重量（右图）以各种佐剂对比的照片及坐标图。
【实施方式】
1.定义
在专利权利要求中，“体温”是指37℃，“生理条件下”是指盐浓度以NaCl浓度换算150mM的条件下。
在本说明书及专利权利要求中，“核酸单体”是指选自与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物，可形成接下来定义的“核酸单位”的化合物。具体而言，一个“核酸单体”含构成粘性突出末端的部分（下述模式图中的x部分）及可与别的核酸单体形成双链的互补性碱基序列部（下述模式图中的y部分）。
在本说明书及专利权利要求中，“核酸单位”是指构成将含上述核酸单体的水溶液中的核酸单体浓度及盐浓度升高到一定浓度以上时形成的水凝胶（以下简称为凝胶）的推定结构单位，有以下的模式图所示的结构（n=2～12）。但是，由本发明得到的凝胶之内部结构不是实际确认的，是在估计形成的凝胶内推测各核酸单体经取以下的结构的核酸单位的形成而成为凝胶的。再有，“核酸单位”为方便起见、如下述模式图以平面显示，但实际推测为取如图10之下部所示的复杂的立体结构。这些“核酸单位”由构成其的核酸单体中的粘性突出末端的相互之间的互补性连结，推定形成有如图15所示的复杂的高级结构的凝胶。
【核酸单位的模式图】
【化1】
【化2】
上述模式图中，x是构成将1个核酸单位与其他核酸单位通过其互补性连结的“粘性突出末端”的部分，y是使构成1个核酸单位的核酸单体和其他核酸单体的双链的形成可能的“互补性碱基序列部”。以下，将“粘性突出末端”简称为x、“互补性碱基序列部”简称为y。
在本说明书及专利权利要求中，有时将推定形成到凝胶中的“核酸单位”或溶胶中的“可形成核酸单位的核酸单体的集合体”简称为“xxx足DNA”。在xxx部分中，表示上述核酸单位中的n的数的用语包括、例如，三、四、七、六等。即，在上述模式图中，可形成n=3的情况的核酸单位或核酸单位的核酸单体的集合体称为“三足DNA”，同样地，n=4时，将其称为“四足DNA”。另外，在“xxx足DNA（a-b-b）”的用语中，a表示形成上述模式图中的x部分的寡核苷酸的碱基数，b表示形成上述y部分的寡核苷酸的碱基数。但是，n=2时，例外地表示为“双链核酸”或“ds”或“dsDNA”。
本说明书及专利权利要求中，将“互补性”或“互补的”的用语用带%的数值表示时，构成相同的长度的2个核酸单体的部分、例如，比较2个x或2个y时，是指以互相形成碱基对的碱基数/全碱基数x100给出的数值。
2.发明的概要
接下来将本发明利用上述模式图简单地说明。
（A）从1种核酸单位的凝胶的形成
首先对由上述定义的1种核酸单位构成的凝胶进行说明。
当凝胶由1种核酸单位形成时，核酸单位是选自用以下的模式图表示的中的1种。
【化3】
在上述模式图中，n的范围是3～12，优选为3～8，再优选为3～6。n的值过小或过大均有形成凝胶难的倾向。
由本发明，含可构成上述核酸单位的核酸单体的水溶液在低盐浓度并且低核酸浓度中，作为溶胶存在，但在一定的高盐浓度和高核酸浓度的组合的条件下，通过构成核酸单体的y部分互相通过其互补性形成双链，形成取上述推定结构的核酸单位，并且，通过构成1个核酸单位中的核酸单体的x部分与构成别的核酸单位中的核酸单体的x部分通过它们的互补性形成双链，多数的核酸单位连结而形成凝胶。此机制示于图1，凝胶的推定内部结构示于图15。
（B）从2种以上的核酸单位的凝胶的形成
接下来对由上述定义的2种以上的核酸单位构成的凝胶进行说明。
当凝胶由2种以上的核酸单位形成时，核酸单位是选自以下的模式图所表示的中的2种以上，但是，至少1种不是n=2（n是3～12的）的核酸单位。
【化4】
【化5】
即，在上述模式图中，n的范围是2～12，优选为2～8，再优选为2～6。1种核酸单位的n是2时，至少别的种核酸单位的n是3～12，优选为3～8，再优选为3～6。
含可构成这2种以上的核酸单位的核酸单体的水溶液，在低盐浓度并且低核酸浓度中作为溶胶存在。另外，在2种以上的核酸单位中，1种核酸单位的x和别的种核酸单位的x有互补的必要，但没必要与其自身互补（自身互补的、例如，回文序列）。2种以上的核酸单位的x部分不自身互补时，含1种这些核酸单位的水溶液在高盐浓度、高核酸浓度下也无形成凝胶，常常作为溶胶存在。另一方面，含2种这些核酸单位的水溶液在低盐浓度并且低核酸浓度中作为溶胶存在，在一定的高盐浓度和高核酸浓度的组合的条件下，通过构成核酸单体的y部分互相通过其互补性形成双链，形成取上述推定结构的核酸单位，并且，通过构成1个核酸单位中的核酸单体的x部分与构成别的核酸单位中的核酸单体的x部分通过它们的互补性形成双链，多数的核酸单位连结而形成凝胶。
从而，将可构成2种以上的核酸单位的核酸单体作为含可构成各自1种核酸单位的核酸单体的分离的水溶液提供时，它们单独，无论盐浓度、核酸浓度，是溶胶状。但是，将它们在成一定的高盐浓度和高核酸浓度的组合的条件下混合，则形成凝胶。即，以高浓度含可构成各自的核酸单位的核酸单体，并且作为高盐浓度的水溶液单独是溶胶，但仅通过互相混合，可形成凝胶。此由混合形成凝胶的机制示于图4、图11及图12。
3.发明的详细的说明
以下，详细地说明本发明，本发明由专利权利要求限定，不限于上述的发明的概要及以下的发明的详细的说明的具体性的记载。
●对于粘性突出末端（模式图中的x）
在本发明中，为了形成凝胶而必要的x的长度是作为碱基数4碱基以上、优选为6碱基以上、再优选为8碱基以上。上限不特别限定，但例如，12碱基以下是优选的。适宜的x的长度也依赖于n的数，优选为4～12碱基、再优选为8～12碱基。x的长度长的方有易形成凝胶的倾向，但x的长度短的有凝胶之内部结构更微细（密）的倾向。
作为x的序列，不特别限定，但如上述（A）中记载的一样，从1种核酸单位制备凝胶时，例如，x可与其自身互补（自身互补），涉及的x的序列可举出回文序列。如上述（B）中记载一样，从2种以上的核酸单位制备凝胶时，x有与可形成至少1种其他核酸单位的核酸单体中的x互补的必要。在两种的情况中，互补性的程度以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补即可。x的互补性以数值表示则是，例如，90%以上互补是优选的，95%以上互补更优选，100%互补（回文序列）是最优选的。核酸单体中的粘性突出末端在可构成1种核酸单位的全部的种核酸单体之间相同也可。另外，核酸单体中的粘性突出末端也有由全部相同的回文序列结构组成的情况。用于构成某核酸单位的核酸单体中的粘性突出末端有时与用于构成别的核酸单位的全部或一部分的核酸单体中的粘性突出末端互补。另外，核酸单体中的粘性突出末端有时与其核酸单体一同与用于构成相同的核酸单位的别的全部或一部分的核酸单体中的粘性突出末端不互补。
●对于互补性碱基序列部（模式图中的y）
在本发明中，为了形成凝胶必要的y的长度也依赖于n的数，但作为碱基数是8碱基以上、优选为14碱基以上、再优选为18碱基以上。y的长度之上限不特别限定，但例如，n是3的情况中，y的长度是8碱基以上、45碱基以下是优选的。作为y的长度之上限，例如，45碱基以下，优选为30碱基以下，更优选为20碱基以下。n的数增加，则对于凝胶的形成必要的y的长度有变长的倾向，但y的长度短的有凝胶之内部结构更微细（密）的倾向。
作为y的序列，不特别限定，但如可形成上述模式图中的核酸单位，1个核酸单体中的y的序列有与作为其所构成的核酸单位的构成要素的别的核酸单体中的y的序列互补的必要。互补性的程度以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补即可。在相同的核酸单位中形成双链的2个y之间的互补性也依赖于n的数，但以数值表示则是，例如，85%以上互补是优选的，90%以上互补更优选，95%以上互补更优选，100%互补最优选。例如，n的数是6的情况中，确认y之间的互补性是89%则可形成凝胶。
形成核酸单位的n个臂（由2个y的双链构成）的序列是互相不同的序列的是优选的。例如，n是4的情况中，核酸单体的序列可表示为x-a-b（此时，a、b分别是y）、x-c-d、x-e-f、x-g-h，但为了形成完全的核酸单位，有b和c、d和e、f和g、及h和a分别互补的必要。例如，在活体内形成凝胶时，它们的互补性有以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链的程度分别互补的必要。其以外的序列间（例如，b和e）的互补性高时，有不形成均一的核酸单位的担忧。但是，凝胶的形成阶段可严密设定条件，（例如，考虑非常缓慢地降低温度）、n个臂的序列近似也可。
1个核酸单体中的2个y的序列是，预测预先与其他核酸单体的互补性或可由1个核酸单体形成的发夹结构的稳定性而适宜设计即可。即，使和发夹结构或与目的以外的核酸单体中的序列的结合相关的自由能相比与目的臂（双链）的形成相关的自由能更大即可。即，适宜设计y的序列，使得在凝胶形成条件下，相比核酸单体零乱地或以推定核酸单位以外的结构形态存在，形成核酸单位的能量更稳定即可。
●对于考虑核酸单体的功能的序列－修饰
本发明的核酸单体，根据形成的凝胶要求的功能，具有各种核酸序列也可，含修饰核酸，附加核酸以外的修饰基也可。例如，通过由DNA构成的核酸单体中含CpG基序，可提高得到的凝胶的免疫活性。再有，“CpG基序”，在人的情况的最适序列是GTCGTT、在啮齿类（小鼠、大鼠）中是GACGTT。在小鼠的议论中，也有使用一般化的嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶时，但这不符合在人的优化。再者这以外也报告多数的CpG基序示免疫活化。另外报告，在序列中的CpG基序的数和免疫活性之间有正的相关。再有，在本说明书中，CpG基序简称为CpG。
或者，除了DNA序列以外，利用RNA序列也可。例如，也可制成含作为功能核酸被知的siRNA的凝胶。另外，在核酸单体中含修饰核酸也可。作为涉及的修饰核酸，2’-O-甲基修饰、硫代磷酸修饰、吗啉代核酸、LNA、PNA等，至今开发的衍生物－类似物均可在凝胶的制备中利用。使用天然型的仅核酸也可，从稳定性的观点来看，使用修饰核酸也可。
再者，除了修饰核酸以外，将胆甾醇或其他脂质等的修饰基直接附加到核酸单体也可。例如，通过将胆甾醇附加到核酸单体，可升高得到的凝胶的目的组织（例如，皮肤施用的情况中，向皮肤组织）的迁移性或由细胞的摄取率。
●对于含内封物质的凝胶的形成
在由本发明的核酸构成的凝胶中，可内包各种物质。作为内包的物质的例，可举出多柔比星、道诺霉素等的DNA嵌入剂、胰岛素等的肽及肽药品、卵清蛋白、柳杉抗原等的蛋白质抗原、生长因子、细胞因子等的蛋白质及蛋白质药品、细胞、及基因改变细胞等，不特别限定。内包的机制不十分明了，认为是核酸单位间的结合发生之时，其间存在的内封物质被闭合在凝胶内。从而，首先制备溶胶，添加内封物质，例如，通过升高盐浓度或核酸浓度，可制成内包内封物质的凝胶。另外，内封物质的添加量不特别限定，与凝胶同程度的重量也可内包。
再有，本发明的凝胶的尺寸不特别限定，基本上无上限。例如，如果用0.5mM的DNA制备500μl的凝胶，则成0.5×10-3（mol/l）×500×10-6（l）×6×1023（分子/mol）=1.5×1017的数值，但更严谨的尺寸不明。
●对于与凝胶化相关的因子
如上述一样，可形成凝胶的本发明的溶胶状态的组合物有可通过升高盐浓度，或升高核酸浓度不凝胶化的倾向。对于温度而言，在高温有相比凝胶更溶胶化的倾向，在低温有凝胶化的倾向。另外，通过形成凝胶的核酸单体的序列或粘性突出末端的长度也可控制凝胶化。例如，想在活体内形成凝胶时，设计序列而使得形成凝胶的核酸单体的各自的双链及粘性突出末端的Tm相比活体温度（37℃左右）更高即可。
作为盐，实施例中使用作为一价的阳离子的钠离子，但不限于此，也可利用镁离子或钙离子等的二价的阳离子，二价的阳离子的方可以比一价的阳离子低浓度使核酸凝胶化。
本发明的组合物必须不含核酸连结酶，作为组合物中含的成分，除水之外，可举出核酸单体、盐类（上述一价或二价的阳离子或其对阴离子）、缓冲剂、上述内封物质等，只要不抑制本发明的目的，含其他成分也可。
●对于在活体内的凝胶形成
本发明的组合物可在溶胶状态下施用而在活体内形成凝胶。作为施用实施方式，可举出皮肤施用、注射、鼻腔内施用等，但不限于这些。施用于皮肤表面时，在皮肤上发生凝胶化，注射时，根据注射部位，在皮下、皮内、肌肉内、腹腔内等发生凝胶化，在鼻腔内施用时，在鼻腔发生凝胶化。
如上述（A）一样，从1种核酸单位在活体内形成凝胶时，活体内施用用的本发明的溶胶状组合物，为使施用前不凝胶化，维持在低盐浓度、低核酸浓度是优选的。在施用低盐浓度、低核酸浓度的本发明的溶胶状组合物时，由于相比活体盐浓度（以NaCl浓度换算大概150mM）而盐浓度低，由施用后在活体内水分的吸收及盐分的分泌引起的核酸浓度增大、盐浓度增大驱动凝胶化。
如上述（B）一样，从2种以上的核酸单位在活体内形成凝胶时，如上述一样，施用维持在低盐浓度、低核酸浓度的2种以上的溶胶状组合物也可，但由于含可形成各1种别的核酸单位的单体的各自的溶胶状组合物单独在高盐浓度、高核酸浓度也不凝胶化，作为高盐浓度、高核酸浓度的溶胶状组合物施用也可。使用低盐浓度、低核酸浓度的2种以上的溶胶状组合物时，无论同时施用还是分别施用，由于在活体内成高盐浓度、高核酸浓度而形成凝胶。但是，使用高盐浓度、高核酸浓度的2种以上的溶胶状组合物时，由于仅通过混合而凝胶化，分别施用而在活体内开始混合而使凝胶化是优选的。
●对于在凝胶状态的施用
另外，本发明的凝胶由于有触变性，在凝胶状态下施用也可。本发明的凝胶在通过注射器之后也与通过前的凝胶具有同等的粘弹性，在注射时的施用是可能的。
●对于构成核酸单位的核酸单体的数
用于形成核酸单位的核酸单体的数依赖于核酸单体中的碱基数、凝胶的形成中使用的盐的种类、盐浓度、pH及其他缓冲剂。含CpG基序等的免疫刺激性的核酸时，核酸单体的碱基数越多，免疫刺激性越。另外，对于含具有免疫刺激性的基序的核酸单体，包括相同的核酸量及相同的基序量的核酸单位之间比较，则构成核酸单位的核酸单体的数越多，免疫刺激性越高。但是，在使核酸单体的数变多时，在生理性的条件中，有核酸单位的形成不充分地发生的可能性。非生理性的条件不适宜于使用核酸单位的凝胶的药理的用途。另外，碱基数多的核酸单体成本高，纯化也困难。再者，在构成核酸单位的核酸单体的数增加时，由于核酸凝胶中的核酸末端的数增加，变得易受外切核酸酶的分解，在血清中的稳定性变低。从而，使用CpG基序等的具有免疫刺激性的基序时，为了使免疫刺激性增大，构成核酸单位的核酸单体的数是3～12、再者4～8、特别是6～8是适当的。
●由本发明的凝胶化的免疫刺激性的升高
如后述的实施例所示，含有CpG基序等的具有免疫刺激性的要素的核酸单体，相比在单链的状态下使用时，在核酸单位（多足DNA）的状态或核酸凝胶的状态下使用时，免疫应答的活化的程度更高（图28、图34、图35）。如此，通过本发明的方法的凝胶化，导入活体内时可得到示高的细胞的免疫刺激性的核酸制备物。
4.对各发明的详细
以上、举出适宜的实施方式而对包括本发明的作用结构进行说明，但不限于上述的发明的概要及详细的说明的具体性的记载。
本发明可提供（1-1）及（2-1）、即，以下技术方案：
用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的溶胶状组合物，其
●由选自一部分互相互补的，与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物的2个以上的核酸单体构成，一个核酸单体含构成粘性突出末端的部分、可与1个以上的别的核酸单体形成双链的互补性碱基序列部，并且不含有核酸连结酶的，用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的核酸溶胶状组合物、及，
●在组合物中以核酸浓度0.3mM+1.6/x（突出末端部碱基数）mM以下含有由粘性突出末端部和互补性碱基序列部组成的2个以上的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶，盐浓度以NaCl浓度换算在80mM/x（突出末端部碱基数）以下
［其中，
粘性突出末端部是4～12个核苷酸长，以与至少1个别的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的单链核酸部分，
与别的寡核苷酸互补地结合的互补性碱基序列部是8～45个核苷酸长，以与别的寡核苷酸中的互补性碱基序列部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补］。
（1-1）及（2-1）中涉及的发明涉及用于不使用核酸连结酶而制成核酸凝胶的核酸溶胶状组合物，其以本发明的不含有核酸连结酶为特征。
在（1-1）中，“核酸单体”、“互补的”等的用语如先前定义。核酸单体由“粘性突出末端”和“互补性碱基序列部”构成。另外，优选为如在（2-1）中，“核酸单体”是所谓的“寡核苷酸”。
在（1-1）及（2-1）的两方中，“粘性突出末端”是在上述详细的说明中使用模式图说明的与x相当的部分，某“核酸单体”2个以上集合而形成推定的某“核酸单位”时，是核酸单位中作为单链部分残留的部分，当与在形成别的“核酸单位”的核酸单体的核酸单位中作为单链部分残留的同样的部分具有互相互补性时，是在特定条件下可形成双链的部分。
在（1-1）及（2-1）的两方中，“互补性碱基序列部”是上述详细的说明中使用模式图说明的与y（y是2个）相当的部分，某“核酸单体”集合2个以上而形成推定的某“核酸单位”时在核酸单位中与构成相同的核酸单位的别的核酸单体中的同样的部分具有互相互补性，在特定条件下形成双链的部分。
在（1-1）中，“核酸单体”选自与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物。核酸是指天然存在的DNA或RNA或它们的混合物。如优选在（2-1）中，核酸单体是寡核苷酸。核酸衍生物是指通过对天然存在的DNA或RNA或它们的混合物附加修饰基而得到的衍生物。修饰基不特别限定，可举出脂质、例如，胆甾醇等。修饰型核酸是指对天然存在的DNA或RNA或它们的混合物，向糖部分、碱基部分或磷酸结合部分之任一种以上实施本领域技术人员知道的改变。修饰型核酸不特别限定，可举出2’-O-甲基修饰、硫代磷酸修饰、吗啉代核酸、LNA等。另外，与核酸互补地结合的化合物是指可与DNA或RNA等的核酸分子由非共价键，由其结构特性而结合的化合物，例如，可举出PNA。
（1-1）及（2-1）的溶胶状组合物含分别“核酸单体”及“寡核苷酸”的2种以上的混合物。如上述（A）中记载一样，在用于从1种核酸单位形成凝胶的溶胶状组合物中，“核酸单体”及“寡核苷酸”的种类如对上述（A）的n进行说明，是3～12、优选为3～8、更优选为3～6。如上述（B）中记载一样，在用于从2种以上的核酸单位形成凝胶的溶胶状组合物中，“核酸单体”及“寡核苷酸”的种类如对上述（B）的n进行说明，是2～12、优选为2～8、更优选为2～6。
（1-1）及（2-1）的溶胶状组合物中含的“核酸单体”及“寡核苷酸”的“粘性突出末端”及“互补性碱基序列部”的结构、即，长度及序列、互相的互补性等不特别限定，但优选如对上述详细的说明的x及y的说明的记载。
（2-1）的溶胶状组合物是对（1-1）的溶胶状组合物进行的进一步限定，特征在于在组合物中以核酸浓度0.3mM+1.6/x（突出末端部碱基数）mM以下含有2个以上的寡核苷酸的混合物，盐浓度以NaCl浓度换算在80mM/x（突出末端部碱基数）以下。其中使用的“x”是指形成寡核苷酸的突出末端部的碱基数。对于盐浓度而言，“以NaCl浓度换算80mM/x以下”是指，当组合物中的盐是1价的阳离子是80mM/x以下，当是2价的阳离子时，是其2分之1的浓度。
（2-1）的溶胶状组合物再特征在于，寡核苷酸的粘性突出末端部的长度是4～12个核苷酸长，粘性突出末端部的序列与至少1个别的寡核苷酸中的粘性突出末端部以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。另外，（2-1）的溶胶状组合物再特征在于，寡核苷酸的互补性碱基序列部的长度是8～45个核苷酸长，互补性碱基序列部的序列与别的寡核苷酸中的互补性碱基序列部以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。其中，生理条件下是指37℃、盐浓度是指以NaCl浓度换算150mM的条件。
在（1-1）中，不是像在（2-1）中限定盐浓度及核酸浓度，但根据构成其的核酸单体的性质，通过是不于室温形成凝胶的程度的低盐浓度及低核酸浓度，作为溶胶存在。
本发明可提供（1-2）及（2-2）、即，以下技术方案：
●用于在活体内制成凝胶的，（1-1）所述的溶胶状组合物、及，
●用于在活体内制成凝胶的，（2-1）所述的溶胶状组合物。
（1-2）及（2-2）的发明是将（1-1）及（2-1）的溶胶状组合物的用途限定于“在活体内的凝胶的制成”，具体而言具备，构成组合物的“核酸单体”及“寡核苷酸”分别在生理条件下、即，37℃及盐浓度150mM的条件下凝胶化的特征。
本发明可提供（1-3）及（2-3）、即，以下技术方案：
●（1-1）或（1-2）记载的溶胶状组合物，其中核酸单体包括在互补性碱基序列部中互补地结合，并且以粘性突出末端在生理的条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的序列结构、及，
●（2-1）记载的溶胶状组合物，其中粘性突出末端部含回文序列结构。
在（2-3）的发明中，构成核酸单体及寡核苷酸的粘性突出末端部是全部相同的回文序列结构也可。（1-3）的发明特征在于，在（1-1）或（1-2）的发明中，核酸单体在互补性碱基序列部中互补地结合。其中，互补地结合是指可形成核酸单位的，核酸单体中的互补性碱基序列部与可形成相同的核酸单位的别的核酸单体中的互补性碱基序列部至少85%互补、优选为90%以上互补、更优选为95%以上互补、特别优选为100%互补。
本发明可提供（1-4）及（2-4）、即，以下技术方案：
●通过提高上述（1-1）～（1-3）任何的核酸溶胶状组合物的核酸浓度及/或盐浓度，不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的方法、及，
●包括通过分别将上述（2-3）所述的溶胶状组合物中的，核酸浓度提高到3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度以NaCl浓度换算提高到640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上来形成凝胶的，制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法。
（1-4）及（2-4）均涉及通过提高本发明的核酸溶胶状组合物的核酸浓度及/或盐浓度，不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的方法。本发明特征在于，在核酸凝胶的制成中不使用核酸连结酶。即，（1-4）及（2-4）的发明是通过仅提高本发明之上述溶胶状组合物的核酸浓度及/或盐浓度来形成凝胶的方法。
在（1-4）中，用于形成凝胶的核酸浓度及/或盐浓度不特别限定，本领域技术人员可根据构成溶胶状组合物的核酸单体的性质适宜选择。（2-4）的凝胶的制成方法包括分别将上述（2-3）所述的溶胶状组合物中的核酸浓度提高到3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、将盐浓度提高到以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上。其中“x”及“以NaCl浓度换算”如在（2-1）的发明中说明。
本发明可提供（1-5）及（2-5）、即，以下技术方案：
●用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含上述（1-1）所述的第1核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含（1-1）所述的第2核酸单体，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该第2核酸单体中的粘性突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补，及，
●用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含有上述（2-1）所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有（2-1）中所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列，
该第2寡核苷酸的粘性突出末端部含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（1-5）及（2-5）涉及用于从上述（B）的2种以上的核酸单位形成凝胶的溶胶状组合物。
具体而言，（1-5）的发明是分别含互相不同的（1-1）中规定的第1溶胶状组合物及第2溶胶状组合物（这些分别含互相不同的第1及第2核酸单体，不含有核酸连结酶）的，用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒。在再（1-5）的发明中，该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，该第2核酸单体中的粘性突出末端含第2序列。其中，该第1序列和该第2序列的特征在于，以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。再有，该第1序列和该第2序列的互补性的程度的定义中的“生理条件下”是指37℃、NaCl浓度150mM的条件。互补性的百分率是指，该第1序列和该第2序列、即，根据粘性突出末端的长度而不同，但优选为90%以上互补，再优选为95%以上互补，特别优选为100%互补。
另外，（2-5）的发明是对（1-5）的发明的进一步限定，其限定的特征与（2-1）中的相同。
本发明可提供（1-6）及（2-6）、即，以下技术方案：
●包括通过混合上述（1-5）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物而形成凝胶的，制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法、及，
●包括通过将上述（2-5）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶的，制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法。
（1-6）及（2-6）的发明是包括混合分别（1-5）及（2-5）的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物的，核酸凝胶的制成方法。在（1-6）的发明中，用于形成凝胶的核酸浓度及/或盐浓度不特别限定，本领域技术人员可根据构成2种溶胶状组合物的核酸单体的性质适宜选择。（2-6）的凝胶的制成方法包括通过将上述（2-5）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶。其中“x”及“以NaCl浓度换算”如在（2-1）的发明中说明。
再有，模式化显示（1-6）及（2-6）的方法的机制的是图11，但不限于此模式图所示的实施方式。
本发明可提供（1-7）及（2-7）、即，以下技术方案：
●用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含上述（1-1）所述的核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有在两末端具有包括粘性单链的突出末端的双链核酸，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该双链核酸的两末端的突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补，及，
●用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含有上述（2-1）所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有在两端具有包括粘性的单链的突出末端部，其间具有由双链构成的互补性碱基序列部的核酸，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
［在第2溶胶状组合物中，
突出末端部是4～12个核苷酸长，以与该第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的单链核酸部分，
互补性碱基序列部是8～45个核苷酸长，以与第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的互补性碱基序列部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的双链核酸部分］
其中
该第1溶胶状组合物中的寡核苷酸的粘性突出末端部含第1序列，
该由双链构成的互补性碱基序列部的两端的突出末端部含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
（1-7）的发明除了将（1-5）的发明中的“第2溶胶状组合物”中含的“第2核酸单体”变更为“在两末端具有包括粘性单链的突出末端的双链核酸”之外，与（1-5）的发明同样。即，将（1-5）的发明的“核酸单体”可形成的“核酸单位”变更为当上述模式图中n是2时的，“在两末端具有包括粘性单链的突出末端的双链核酸”。
（2-7）的发明除了将（2-5）的发明中的“第2溶胶状组合物”中含的“第2寡核苷酸”变更为“在两端具有包括粘性的单链的突出末端部，其间具有由双链构成的互补性碱基序列部的核酸”之外，与（2-5）的发明同样。即，将（2-5）的发明的“寡核苷酸”可形成的“核酸单位”变更为上述模式图中n是2时的，“在两端具有包括粘性的单链的突出末端部，其间具有由双链构成的互补性碱基序列部的核酸”。再者（2-7）的发明是在第2溶胶状组合物的特征中，将“突出末端部”限定为“4～12核苷酸长，与第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部以在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的单链核酸部分”，并且，将“互补性碱基序列部”限定为“8～45核苷酸长，以与第1溶胶状组合物中的寡核苷酸中的互补性碱基序列部在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的双链核酸部分”。
本发明可提供（1-8）及（2-8）、即，以下技术方案：
●包括通过混合上述（1-7）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物来形成凝胶的，制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法、及，
●包括通过将上述（2-7）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶的，制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法。
（1-8）及（2-8）的发明是包括混合分别（1-7）及（2-7）的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物的，核酸凝胶的制成方法。在（1-8）的发明中，用于形成凝胶的核酸浓度及/或盐浓度不特别限定，适宜本领域技术人员可根据构成2种溶胶状组合物的核酸单体及双链核酸的性质选择。（2-8）的凝胶的制成方法包括通过将上述（2-7）所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物在核酸浓度成3.2/x（突出末端部碱基数）mM以上、盐浓度成以NaCl浓度换算640mM/x（突出末端部碱基数）-60mM以上的条件下混合来形成凝胶。其中“x”及“以NaCl浓度换算”如在（2-1）的发明中说明。
再有，模式化显示（1-8）及（2-8）的方法的机制的是图12，但不限于此模式图所示的实施方式。
本发明可再提供（1-9）及（2-9）、即，以下技术方案：
●由上述（1-4）、（1-6）及（1-8）所述的任何方法制成的不含有核酸连结酶的核酸凝胶、及，
●由上述（2-4）、（2-6）及（2-8）所述的任何方法制成的不含有核酸连结酶的核酸凝胶。
由（1-9）及（2-9）的发明的核酸凝胶以不含有核酸连结酶作为特征。
本发明可提供（1-10）及（2-10）、即，以下技术方案：
●在上述（1-4）、（1-6）及（1-8）所述的任何方法中，包括将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中，封入内封物质，并且制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法、及，
●在上述（2-4）、（2-6）及（2-8）所述的任何方法中，包括将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中，封入内封物质，并且制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法。
（1-10）及（2-10）的发明涉及不含有核酸连结酶的核酸凝胶，还内包内封物质的核酸凝胶的制成方法。涉及的方法是，在（1-4）、（1-6）及（1-8）～（2-4）、（2-6）及（2-8）的核酸凝胶的制成方法中，还包括将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中。作为内封物质，只要是想要内包于凝胶中的核酸连结酶以外的物质就不特别限定，可举出例如，多柔比星、道诺霉素等的DNA嵌入剂、胰岛素等的肽及肽药品、卵清蛋白、柳杉抗原等的蛋白质抗原、生长因子、细胞因子等的蛋白质及蛋白质药品、细胞、及基因改变细胞等，不特别限定。
由（1-10）及（2-10）的发明，通过首先制备溶胶，添加内封物质，例如，升高盐浓度或核酸浓度，可制成内包内封物质的凝胶。另外，内封物质的添加量不特别限定，就算是与凝胶同程度的重量，也可内包。
本发明可提供（1-11）及（2-11）、即，以下技术方案：
●（1-10）所述的方法，其中内封物质选自：低分子量化合物、蛋白质及细胞，及，
●（2-10）所述的方法，其中内封物质选自：低分子量化合物、蛋白质及细胞。
（1-11）及（2-11）的发明分别将（1-10）及（2-10）的发明中的，内封物质限定为低分子量化合物、蛋白质、及细胞，但是，蛋白质不是核酸连结酶。低分子量化合物、蛋白质、及细胞的例如上述。
本发明可提供（1-12）及（2-12）、即，以下技术方案：
●由上述（1-10）或（1-11）记载的方法制成的，含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶、及，
●由上述（2-10）或（2-11）记载的方法制成的，含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶。
（1-12）及（2-12）的发明涉及由（1-10）、（1-11）、（2-10）或（2-11）的方法制成的含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶。涉及的核酸凝胶在凝胶的复杂的微细结构之中内包希望得到之内封物质，例如，可在活体内缓慢地释放内封物质。
本发明可提供（1-13）、即以下技术方案：
●（1-1）或（1-2）记载的溶胶状组合物，其中核酸单体在互补性碱基序列部中互补地结合，并且，粘性突出末端含回文序列结构。
本发明可提供（3-1）～（3-4）、即，以下技术方案：
（3-1）：核酸单体含CpG基序的，（1-1）～（1-12）及（2-1）～（2-12）之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶。
（3-2）：核酸单体的种类数是3～8的，（1-1）～（1-12）、（2-1）～（2-12）、及（3-1）之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶。
（3-3）：核酸单体含CpG基序，所述核酸溶胶状组合物用于制成免疫佐剂的，（1-1）～（1-3）、及（2-1）～（2-3）之任一项所述的溶胶状组合物。
（3-4）：免疫佐剂，其是含（1-9）、（1-12）、（2-9）、及（2-12）之任一项所述的核酸凝胶的免疫佐剂，核酸单体含CpG基序。
【实施例】
以下，使用实施例及附图详细地说明本发明，这些实施例及附图不旨在限定本发明的范围。
【材料及方法】
【化学物质】
RPMI1640培养基获自日水制药（Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）。胎儿牛血清（FBS）获自Equitech-Bio，Inc（Kerrville，TX，USA）。Opti-MEM（Opti-modified Eagle’s培养基）购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。20-bp DNA阶梯购自宝生物株式会社(Takara Bio Inc.Otsu，Japan)。其其他全部的试剂－物质是利用可能的最高等级的试剂－物质，不进一步纯化而使用。
【寡脱氧核苷酸（也称为ODN）】
磷酸二酯寡脱氧核苷酸（ODN）购自Integrated DNATechnologies，Inc.（Coralville，IA，USA）。ODN的序列列于表1。在表1中，各ODN被命名为“X足DNA-Y-Z”。其中，X表示三（三（3））、四（四（4））、五（五（5））、六（六（6））或八（八（8）），Y表示各X足DNA的编号（1、2等）、Z表示构成各X足DNA的ODN的编号。对于细胞摄取研究而言，将5’-末端用AlexaFluor488标记的ODN购自JBioS（Saitama，Japan），用于荧光标记多足DNA的制备。
【ODN的溶液（也称为多足DNA）的制备】
将各ODN溶解于含有5mM氯化钠（NaCl）的TE缓冲液（10mMTris-HCl，1mM乙二胺四醋酸（EDTA），pH8）。将混合物相继，使用热循环仪于95℃温育5分钟、于65℃温育2分钟、于62℃温育1分钟，然后缓慢地冷却至4℃。将生成物由12%聚丙烯酸类树脂酰胺凝胶电泳（PAGE）于室温（约22-25℃）、以200V电泳45分钟而进行分析。
【凝胶的形成和凝胶强度的评价】
向ODN的溶液（多足DNA）添加NaCl溶液至最终Na+浓度达到5-150mM。在凝胶强度分析器（凝胶强度计、中山电机、大阪）中测定凝胶的形成和凝胶强度。
【由DNA水凝胶的扫描型电子显微镜的观察】
为了观察DNA水凝胶之内部结构，将它们使用2%戊二醛于室温固定一晚，使用缓慢地升高的浓度的乙醇脱水，然后将乙醇置换为丁醇，冷冻干燥。将干燥的材料用刀断开，使用场致发射型扫描电子显微镜（FE-SEM：S4700，HITACHI，Japan）观察DNA水凝胶之内部结构。
表1：实施例中使用的寡核苷酸的名称－序列
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
四足DNA（I）
| 四-I-01 | AGTC TCGCTGACGTTGCAGACA TCACGTTGACGCTGTCGA（SEQ ID NO:58） |
| 四-I-02 | AGTC TCGACAGCGTCAACGTGA AACGTGAAGCGTCTGCGA（SEQ ID NO:59） |
| 四-I-03 | AGTC TCGCAGACGCTTCACGTT GCAGACAGACGTTGACGA（SEQ ID NO:60） |
| 四-I-04 | AGTC TCGTCAACGTCTGTCTGC TGTCTGCAACGTCAGCGA（SEQ ID NO:61） |
【表1-4】
| 名称 | 序列（5’→3’）（序列编号） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-01 | gcagacga cgttgaatccatgacg ttgtatgactgcaacg（62） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-02 | gcagacga cgttgcagtcatacaa tcctgacgctctgacg（63） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-03 | gcagacga cgtcagagcgtcagga cgttcatcagtatacg（64） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-04 | gcagacga cgtatactgatgaacg aagtgacgtctcaacg（65） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-05 | gcagacga cgttgagacgtcactt atcgacgtctgagacg（66） |
| 六足DNA(8-16-16)-4-06 | gcagacga cgtctcagacgtcgat cgtcatggattcaacg（67） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-01 | tcctgagc ttgctagagcctgtca ggagcagctagtgcaa（68） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-02 | tcctgagc ttgcactagctgctcc agcagagctcgatcaa（69） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-03 | tcctgagc ttgatcgagctctgct tgagcctcagctgcaa（70） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-04 | tcctgagc ttgcagctgaggctca gagcctgatctagcaa（71） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-05 | tcctgagc ttgctagatcaggctc ctcagcttgactacaa（72） |
| 六足DNA(8-16-16)-5-06 | tcctgagc ttgtagtcaagctgag tgacaggctctagcaa（73） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-01 | gctcagga gcttgaatccatgagc ttgtatgactgcaagc（74） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-02 | gctcagga gcttgcagtcatacaa tcctgagcctctgagc（75） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-03 | gctcagga gctcagaggctcagga gcttcatcagtatagc（76） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-04 | gctcagga gctatactgatgaagc aagtgagctctcaagc（77） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-05 | gctcagga gcttgagagctcactt atgcagctctgagagc（78） |
| 六足DNA(8-16-16)-6-06 | gctcagga gctctcagagctgcat gctcatggattcaagc（79） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-01 | gctgtcca gcttgaatccatgagc ttgtatgactgcaagc（80） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-02 | gctgtcca gcttgcagtcatacaa tcctgagcctctgagc（81） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-03 | gctgtcca gctcagaggctcagga gcttcatcagtatagc（82） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-04 | gctgtcca gctatactgatgaagc aagtgagctctcaagc（83） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-05 | gctgtcca gcttgagagctcactt atgcagctctgagagc（84） |
| 六足DNA(8-16-16)-7-06 | gctgtcca gctctcagagctgcat gctcatggattcaagc（85） |
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
表中，作为各ODN的名称的XXX足DNAy-Z（其中，XXX是三、四、五等，y及Z是数字）是指，其序列是用于制作XXX足DNAy的ODN。例如，三足DNA30使用三足DNA30-1、三足DNA30-2、及三足DNA30-3制作。
【实施例1】
【（1-1）DNA构成的水凝胶的制成】
在室温、5mM～150mM氯化钠浓度（150mM是大致生理的浓度）、DNA连接酶不含的条件下阐明成为水凝胶的结构（核酸单体及推定核酸单位）。这时发现，通过增加被认为可构成核酸单位的核酸单体的数，能在更温和的条件（低盐浓度）下凝胶化。为简便起见，根据可构成核酸单位的核酸单体数，将推定形成的核酸单位表示为xxx足DNA（xxx足-样结构形成核酸、在xxx中，根据可构成核酸单位的核酸单体的数包括三（3）、四（4）等）。在下述表2中，xxx足DNA是推定核酸单位、xxx-Y-N分别是可成为其上标记的核酸单位（xxx足DNA）的构成要素的核酸单体，Y的标记相不异，则表示可形成相异的核酸单位，N表示构成各推定核酸单位的核酸单体的编号。
表2：实施例1-1中使用的寡核苷酸的名称－序列
【表2-1】
三足DNA
| 三-A-01 | ACGT TCGTCAACGTCTGTGCTC TCACGTTGACGCTGTCGA（SEQ ID NO:1） |
| 三-A-02 | ACGT TCGACAGCGTCAACGTGA AACGTGAAGCGTCTGCGA（SEQ ID NO:2） |
| 三-A-03 | ACGT TCGCAGACGCTTCACGTT GAGCACAGACGTTGACGA（SEQ ID NO:3） |
【表2-2】
四足DNA
| 四-A-01 | ACGT TCGCTGACGTTGCAGACA TCACGTTGACGCTGTCGA（SEQ ID NO:4） |
| 四-A-02 | ACGT TCGACAGCGTCAACGTGA AACGTGAAGCGTCTGCGA（SEQ ID NO:2） |
| 四-A-03 | ACGT TCGCAGACGCTTCACGTT GCAGACAGACGTTGACGA（SEQ ID NO:5） |
| 四-A-04 | ACGT TCGTCAACGTCTGTCTGC TGTCTGCAACGTCAGCGA（SEQ ID NO:6） |
| 四-B-01 | AACGTT TACGCACGACATCAGCG TCTGGACGCTTCGTCGA（SEQ ID NO:18） |
| 四-B-02 | AACGTT TCGACGAAGCGTCCAGA TCTCGTCAACGCTGCGA（SEQ ID NO:19） |
| 四-B-03 | AACGTT TCGCAGCGTTGACGAGA CAGACGCTGTGACGCTA（SEQ ID NO:20） |
| 四-B-04 | AACGTT TAGCGTCACAGCGTCTG CGCTGATGTCGTGCGTA（SEQ ID NO:21） |
| 四-C-01 | ACGTACGT TAGCACGACATCAGCG TCTGACGCTTCGTCGA（SEQ ID NO:22） |
| 四-C-02 | ACGTACGT TCGACGAAGCGTCAGA TCTCGTCAACGCTGCA（SEQ ID NO:23） |
| 四-C-03 | ACGTACGT TGCAGCGTTGACGAGA CAGACGCTTGACGCTA（SEQ ID NO:24） |
| 四-C-04 | ACGTACGT TAGCGTCAAGCGTCTG CGCTGATGTCGTGCTA（SEQ ID NO:25） |
| 四-D-01 | ACGTTAACGT TGCACGACATCAGCG TCTGACGCTCGTCGA（SEQ ID NO:26） |
| 四-D-01 | ACGTTAACGT TCGACGAGCGTCAGA TCTCGCAACGCTGCA（SEQ ID NO:27） |
| 四-D-01 | ACGTTAACGT TGCAGCGTTGCGAGA CAGACGCTTGACGCA（SEQ ID NO:28） |
| 四-D-01 | ACGTTAACGT TGCGTCAAGCGTCTG CGCTGATGTCGTGCA（SEQ ID NO:29） |
| 四-E-01 | ACGTCATGACGT TGCACGACATCACGT TGACGCTCGTCGA（SEQ ID NO:30） |
| 四-E-01 | ACGTCATGACGT TCGACGAGCGTCAAT CTCGCAACGTGCA（SEQ ID NO:31） |
| 四-E-01 | ACGTCATGACGT TGCACGTTGCGAGAC AGACGCTTGACGA（SEQ ID NO:32） |
| 四-E-01 | ACGTCATGACGT TCGTCAAGCGTCTGC GTGATGTCGTGCA（SEQ ID NO:33） |
| 四-F-01 | AGCT AGGCACCGTAGTCAATCG CCGATGTGTCCAAAGCCT（SEQ ID NO:14） |
| 四-F-02 | AGCT AGGCTTTGGACACATCGG TGCTCCTACCGTACTCCT（SEQ ID NO:15） |
| 四-F-03 | AGCT AGGAGTACGGTAGGAGCA GTTTCGGCATGTCCACCT（SEQ ID NO:16） |
| 四-F-04 | AGCT AGGTGGACATGCCGAAAC CGATTGACTACGGTGCCT（SEQ ID NO:17） |
【表2-3】
五足DNA
| 五-A-01 | ACGT TCGCTGACGTTGCAGACA TCACGTTGACGCTGTCGA（SEQ ID NO:4） |
| 五-A-02 | ACGT TCGACAGCGTCAACGTGA AACGTGAAGCGTCTGCGA（SEQ ID NO:2） |
| 五-A-03 | ACGT TCGCAGACGCTTCACGTT GAGCACAGACGTTGACGA（SEQ ID NO:3） |
| 五-A-04 | ACGT TCGTCAACGTCTGTGCTC GCAGCGTCTTAACGTCGA（SEQ ID NO:7） |
| 五-A-05 | ACGT TCGACGTTAAGACGCTGC TGTCTGCAACGTCAGCGA（SEQ ID NO:8） |
【表2-4】
六足DNA
| 六-A-01 | ACGT TCGCTGACGTTGCAGACA TCACGTTGACGCTGTCGA（SEQ ID NO:4） |
| 六-A-02 | ACGT TCGACAGCGTCAACGTGA AACGTGAAGCGTCTGCGA（SEQ ID NO:2） |
| 六-A-03 | ACGT TCGCAGACGCTTCACGTT GAGCACAGACGTTGACGA（SEQ ID NO:3） |
| 六-A-04 | ACGT TCGTCAACGTCTGTGCTC GCAGCGTCTTAACGTCGA（SEQ ID NO:7） |
| 六-A-05 | ACGT TCGACGTTAAGACGCTGC TGTCTGCAACGTCAGCGA（SEQ ID NO:9） |
| 六-A-06 | ACGT TCGTAGTCCTGAACGTCT TGTCTGCAACGTCAGCGA（SEQ ID NO:10） |
从使用这些核酸单体的以上的检查发现，粘性突出末端是4个碱基以上、构成核酸单位的寡核苷酸数是3个以上时，可无关于碱基序列而制备水凝胶。图1示4个核酸单体（寡核苷酸）经推定的核酸单位四足DNA而形成DNA水凝胶的推定模式图，在图2示使用四足DNA时形成的水凝胶的概观。另外在图3示，用扫描型电子显微镜观察的凝胶之内部结构。图3中右侧是左侧的扩大图，知形成网目结构的凝胶。再有，在本实施例中，构成xxx足DNA的核酸单体的粘性突出末端均为回文序列，推定为1种核酸单位互相经回文序列连接。
【（1-2）利用多个核酸单位的核酸水凝胶】
与上述（1-1）不同，通过使用具有不与其自身连接（即不是回文序列）的粘性突出末端的核酸单体，可控制凝胶化。例如，通过将下述的四足DNA（G）和四足DNA（H）混合，可制备水凝胶。另外，代替四足DNA（H）而使用双链DNA（dsDNA）也可制备同样的凝胶。在图4所示的模式图中，上侧示使用2种具有不是回文序列的互相互补的粘性突出末端的四足DNA的水凝胶的形成（对应于以下的四足DNA（G）和四足DNA（H）的混合）、与此相比，下侧示使用具有不是回文序列的粘性突出末端的四足DNA（A）和具有与所述粘性突出末端互补的粘性突出末端的dsDNA的水凝胶的形成（对应于以下的四足DNA（G）和dsDNA的混合）。使用的核酸单体示于表3。
表3：实施例1-2中使用的寡核苷酸的名称－序列
【表3】
四足DNA(G)
| 四-G-01 | TCAGAGTCAGTC TGCACGACATCACG TTGACGCTCGTCGA（SEQ ID NO:34） |
| 四-G-01 | TCAGAGTCAGTC TCGACGAGCGTCAA TCTCGCAACGTGCA（SEQ ID NO:35） |
| 四-G-01 | TCAGAGTCAGTC TGCACGTTGCGAGA CAGACGCTTGACGA（SEQ ID NO:36） |
| 四-G-01 | TCAGAGTCAGTC TCGTCAAGCGTCTG CGTGATGTCGTGCA（SEQ ID NO:37） |
四足DNA(H)
| 四-H-01 | GACTGACTCTGA TGCACGACATCACG TTGACGCTCGTCGA（SEQ ID NO:38） |
| 四-H-01 | GACTGACTCTGA TCGACGAGCGTCAA TCTCGCAACGTGCA（SEQ ID NO:39） |
| 四-H-01 | GACTGACTCTGA TGCACGTTGCGAGA CAGACGCTTGACGA（SEQ ID NO:40） |
| 四-H-01 | GACTGACTCTGA TCGTCAAGCGTCTG CGTGATGTCGTGCA（SEQ ID NO:41） |
ds
| ds-01 | GACTGACTCTGA ACGTCAGCGTTA（SEQ ID NO:42） |
| ds-02 | GACTGACTCTGA TAACGCTGACGT（SEQ ID NO:43） |
【实施例2】
【实施例2-1】
【内包抗原蛋白质或细胞的水凝胶的制备】
由实施例1可利用核酸单体的核酸水凝胶的制备，所以利用其尝试了内包抗原蛋白质或细胞的水凝胶的制备。具体而言，用表1中记载的四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）制备DNA浓度成0.5mM、NaCl浓度成5mM的水溶液，向该处加目的内封物质（多柔比星、卵清蛋白、或者RAW264.7细胞），将NaCl浓度升高至150mM。结果，内包抗原蛋白质或细胞的水凝胶的制备变得可能。图5示内包得到的内封物质的水凝胶的扫描型电子显微镜照片。
【实施例2-2】
【生存细胞的向DNA水凝胶的掺入】
在巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白启动子控制下表达强化绿色荧光蛋白质（eGFP）的eGFP转基因小鼠（5周龄）从日本SLC株式会社（静冈、日本）购入。通过使用戊巴比妥的麻醉处死小鼠，自大腿骨及胫骨除去全部的结缔组织。使用26号针，用含有10%加热失活牛胎儿血清的RPMI冲洗大腿骨及胫骨，单离骨髓细胞。通过40μm细胞过滤器（BDFalcon、FranklinLakes、NJ、USA）过滤细胞混合物，其后，在0.1%氯化铵的低渗透压溶液中，于室温温育5分钟，溶解混入的红细胞。将残留细胞用离心机以450×g离心10分钟，将回收沉淀的细胞作为骨髓来源细胞（BMDC）使用。向96孔板中的各自的孔以1×106细胞/孔的密度添加GFP-BMDC。
接下来，使用表1中的ODN（六足DNA（8-16-16）-2-01～06、及六足DNA（8-16-16）-3-01～06），用Hanks平衡盐类溶液（HBSS）中制备DNA水凝胶。
然后，以350μg/孔的最终浓度向含有GFP-BMDC-的孔添加DNA样品。将用于水凝胶的2组的六足DNA在孔中混合。使用荧光显微镜Biozero（KEYENCE、大阪、日本）得到荧光图像。
x-z切片的图像示于图21。图21中，棒及箭头表示六足DNA溶液（上的图）或DNA水凝胶（下的图）的高度。如图21所示，细胞掺入水凝胶中。
【实施例3】
【由凝胶化的核酸的免疫细胞活化能的增强可能性】
使用含CpG基序的三足DNA（SEQ ID NO:1、2、3），如图6所示，首先通过退火制成推定作为三足DNA结构的Y型DNA（Ys）、接下来，将其再4单位退火而得到具有G1的推定结构的树状聚体样DNA、再10单位退火而得到具有G2的推定结构的树状聚体样DNA。使用这些研究TNF-α释放刺激能及向细胞的摄取率。结果示于图6。通过高分子量化，可理解TNF-α释放活性及细胞摄取率的两者显著地升高。
【实施例4-1】
实施例1中制成的水凝胶，通过适当调节条件，可在溶胶状态下制备。从而，向活体的注射施用是可能的。如图7所示，制成末端具有非粘性突出末端的对照的四足DNA及，由本发明的末端具有粘性突出末端的四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）的总DNA浓度2mM、NaCl浓度5mM的溶胶状溶液，分别注射到小鼠的背中左侧及右侧的皮下而施用。结果如图7及图8-1所示，在对照的四足DNA中在活体内不形成凝胶，与此相比，使用由本发明的四足DNA时，由从溶胶状的低盐浓度水溶液的水分的吸收的DNA浓度的升高及由向活体内的盐浓度的盐浓度的升高，确认施用后，在活体内凝胶化。由此确认，由本发明的水凝胶通过仅在溶胶状态下制备而在活体内施用，在活体内形成凝胶。在图8-1也示在活体内形成的凝胶的扫描型电子显微镜照片。
【实施例4-2】
【（4-2-1）注射器通过后的DNA水凝胶的样式】
在DNA（六足DNA）及DNA水凝胶的制备中，分别使用表1的序列之中的下述的ODN。
将DNA（六足DNA）：六足DNA(8-16-16)-2-01～06，六足DNA(8-16-16)-4-01～06；
DNA水凝胶：六足DNA(8-16-16)-2-01～06，六足DNA(8-16-16)-3-01～06；
六足DNA(8-16-16)-2-01～06、六足DNA(8-16-16)-3-01～06、六足DNA(8-16-16)-4-01～06加热至95℃后，缓慢地冷却而分别制备六足DNA-2、六足DNA-3、六足DNA-4，用碘化丙啶（PI）将DNA染色。此时，ODN用含1.5M NaCl的TE缓冲液（10mM Tris-HCl、1mMEDTA、pH8）溶解，制备成各ODN的终浓度为0.5mM。用带29G针的注射器吸取六足DNA-2溶液，接下来吸六足DNA-4（DNA）或六足DNA-3（DNA水凝胶），用注射器内搅拌。通过目测确认凝胶化的有无后，将DNA溶液或DNA水凝胶从注射器压出。
图8-2A示注射器内、及压出后的DNA溶液及DNA水凝胶的样式的照片。如图8-2A所示，DNA水凝胶从注射器的压出后在凝胶状态下。
【（4-2-2）凝胶粘弹性的测定】
向凝胶粘弹性测定器（株式会社中山电机制）设置导入了凝胶的管。将测定棒降低到凝胶的至上端，其后，经时测定将测定棒降低500μm之时的荷重值。在测定中，使用在（4-2-1）中管内制备的DNA水凝胶和在注射器内形成后从注射器压出的DNA水凝胶。
粘弹性的结果示于图8-2B。如图8-2B所示，通过注射器的凝胶与通过前的凝胶有同程度的粘弹性。
【（4-2-3）通过注射器的向小鼠皮内的施用】
通过与（4-2-1）同样的方法在带29G针的注射器内制备PI标记DNA（六足DNA）或DNA水凝胶。将ICR小鼠用异氟烷麻醉，背部除毛后，向皮内注射施用各样品。施用3小时后，处死小鼠，剥离背部皮肤，观察施用部位的样式。
施用3小时后的施用部位的照片示于图8-2C。如图8-2C所示，本发明的水凝胶通过注射器的施用后在体内处在凝胶状态下。
从（4-2-1）～（4-2-3）的结果知，由于本发明的水凝胶具有触变性，在凝胶状态下通过注射器注射施用也在体内再度凝胶化，可在凝胶状态下通过注射器注射施用。
【实施例5】
【使用各种序列的核酸（不仅由DNA构成，也含RNA）的水凝胶的制成】
【（5-1）免疫学有活性的凝胶及免疫学无活性的凝胶的制成】
如图9所示，使用不含CpG基序的四足DNA（4-18-18）（SEQID NO:14、15、16、17）及含CpG基序的四足DNA（4-18-18）（SEQID NO:2、4、5、6）（图9中，以下划线示CpG基序的存在）如上述一样制成凝胶。使制成的凝胶与小鼠树突细胞DC2.4接触时，由不含CpG基序的四足DNA制成的凝胶，如图9之右侧的照片所示，不免疫学刺激小鼠树突细胞，由含CpG基序的四足DNA制成的凝胶，如图9之中央的照片所示，免疫学显著地刺激小鼠树突细胞。因此确证，通过控制本发明的核酸单体的序列，具体而言通过使含CpG基序，可制成免疫学有活性的凝胶。另外也确证，通过同样地不含CpG基序，可制成免疫学无活性的凝胶。
【（5-2）使用具有各种序列的xxx足DNA的凝胶的制备例】
如图10所示确认，使用末端含是回文序列的4碱基～12碱基的长度的粘性突出末端的，三足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:1、2、3）、四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）、四足DNA（6-17-17）（SEQ ID NO:18、19、20、21）、四足DNA（8-16-16）（SEQ ID NO:22、23、24、25）、四足DNA（10-15-15）（SEQ ID NO:26、27、28、29）、四足DNA（12-14-14）（SEQ ID NO:30、31、32、33）、五足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、3、4、7、8）、六足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、3、4、7、9、10）可制备凝胶。图10的下方的图分别是三足DNA、四足DNA、五足DNA、六足DNA的在凝胶中的推定结构。
【5-3】
如图11所示，制备以总DNA浓度2mM含末端含不是回文序列的12碱基的长度的粘性突出末端的四足DNA（A）（12-14-14）（SEQID NO:34、35、36、37），以浓度150mM含NaCl的水溶液，和以总DNA浓度2mM含有含与四足DNA（A）的粘性突出末端互补的12碱基的长度的粘性突出末端的四足DNA（B）（12-14-14）（SEQ IDNO:38、39、40、41），以浓度150mM含NaCl的水溶液。这些四足DNA（A）及四足DNA（B）即便升高DNA浓度及盐浓度，单独也无法形成凝胶，但当各自的水溶液混合而使最终DNA浓度为2mM及NaCl浓度为150mM时形成凝胶。如图11之右下所示，四足DNA（A）及四足DNA（B）各自单独不形成凝胶，但通过简单混合这些可形成凝胶。
【5-4】
如图12所示，制备以总DNA浓度2mM含末端含不是回文序列的12碱基的长度的粘性突出末端的四足DNA（A）（12-14-14）（SEQID NO:34、35、36、37），以浓度150mM含NaCl的水溶液，和以总DNA浓度1mM含有含与四足DNA（A）的粘性突出末端互补的12碱基的长度的粘性突出末端的dsDNA（12-14）（SEQ ID NO:42及43），以浓度150mM含NaCl的水溶液。这些四足DNA（A）及dsDNA即便升高DNA浓度及盐浓度，单独也无法形成凝胶，但当简单混合各自的水溶液而使最终DNA浓度为1.5mM及NaCl浓度为150mM时，形成凝胶。如图12之右下所示，四足DNA（A）及dsDNA各自单独不形成凝胶，但通过简单混合这些可形成凝胶。
【5-5】
如图13所示，通过使本发明的xxx足DNA、例如四足DNA含诱饵DNA或siRNA，也可制成由在凝胶内部或末端部位具有作为核酸医药的功能的核酸组成的水凝胶。如此，通过利用以DNA、RNA为首的各种核酸序列，可改变本发明的凝胶的功能。
【实施例6】
【使用免疫学有活性的凝胶中内包卵清蛋白（OVA)的凝胶的免疫应答的增强】
如图14所示，作为对照将含OVA100μg的溶胶状水溶液（OVA浓度2.5μg/μl、NaCl浓度5mM）、或者，除了OVA100μg之外，含100μg本发明的四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）的溶胶状水溶液DNA（OVA浓度2.5μg/μl、NaCl浓度5mM、总DNA浓度2mM）分别注射到小鼠（0d免疫）、免疫第14天摘出脾脏，将得到的脾细胞用OVA刺激而测定IFN-γ的产生。如图14之右侧所示，与自对照的仅施用OVA的小鼠的脾细胞比较，在自将本发明的四足DNA与OVA一同施用的小鼠的脾细胞中，IFN-γ的产生量显著地升高。由此示，由本发明的四足DNA形成的凝胶的免疫应答的增强效果。
【实施例7】
【凝胶之内部结构的调节】
图15示，自可形成本发明的核酸单位、三足DNA、四足DNA、五足DNA及六足DNA的核酸单体得到的凝胶内部的推定立体结构。如从图15可以看出，可构成核酸单位的核酸单体的数越多，即，相比三足DNA，六足DNA，被推定为取越复杂的凝胶之内部结构。另外，通过粘性突出末端的长度也可调节凝胶的结构。
图16示，以DNA浓度1.5mM含三足DNA（4-18-18）（SEQ IDNO:1、2、3）（粘性突出末端的长度是4碱基）的凝胶之内部结构、以DNA浓度0.5mM含四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）（粘性突出末端的长度是4碱基）的凝胶之内部结构、以DNA浓度0.5mM含六足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、3、4、7、9、10）（粘性突出末端的长度是4碱基）的凝胶之内部结构、及以DNA浓度0.5mM含四足DNA（12-14-14）（SEQ ID NO:30、31、32、33）（粘性突出末端的长度是12碱基）的凝胶之内部结构的扫描型电子显微镜照片。从照片可以看出，相比三足DNA，使用四足DNA得到的凝胶的凝胶之内部结构更微细、相比其，使用六足DNA得到的凝胶的凝胶之内部结构更微细。另外，使用相同的四足DNA时，使用粘性突出末端的长度长的，得到的凝胶的凝胶之内部结构更微细。
【实施例8】
【由凝胶之内部结构的调节的凝胶强度的调节】
【（8-1）DNA浓度的调节】
通过使以DNA浓度0.1mM、0.25mM、或者0.5mM含四足DNA（12-14-14）（SEQ ID NO:30、31、32、33）的水溶液的NaCl浓度成为150mM而形成凝胶，经时测定残留的凝胶的百分率。结果示于图17之左上的坐标图。横轴示经过的时间。低浓度的DNA(0.1mM）仅25%左右成凝胶，通过使DNA浓度升高到0.25mM而最初的凝胶的百分率升高，残留的凝胶的百分率经时降低。另一方面，高浓度的DNA(0.5mM）时，最初的凝胶的百分率是大致100%，凝胶的百分率仅经时略微降低。由此确证，在盐浓度一定的情况中，DNA浓度越高，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。
【（8-2）粘性突出末端的长度的调节】
使用有各种各样的粘性突出末端的长度（4、6、8、10或12碱基）的四足DNA（分别SEQ ID NO:2、4、5、6、SEQ ID NO:18、19、20、21、SEQ ID NO:22、23、24、25、SEQ ID NO:26、27、28、29、SEQ ID NO:30、31、32、33）在一定DNA浓度(0.5mM）及一定NaCl浓度（150mM）的条件下形成凝胶，经时测定残留的凝胶的百分率。结果示于图17之左下的坐标图。横轴示经过的时间。粘性突出末端的长度短（4碱基）时，经时凝胶溶胶化，经过12小时后残留凝胶的百分率成大致50%。另一方面，粘性突出末端的长度长（6、8、10或12碱基）时，最初的凝胶的百分率大致是100%，残留凝胶的百分率仅经时略微降低。由此确证，在DNA浓度、盐浓度一定的情况中，粘性突出末端的长度越长，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。
【（8-3）盐浓度的调节-1】
通过改变以0.5mM的DNA浓度含四足DNA（12-14-14）（SEQID NO:30、31、32、33）的水溶液的NaCl浓度（5mM、50mM、100mM或150mM）、形成凝胶，经时测定残留的凝胶的百分率。结果示于图17之右上的坐标图。横轴示经过的时间。在低盐浓度（5mM），经过约6小时则形成的凝胶的绝大部分溶胶化，将盐浓度升高到50mM，则溶胶化的倾向弱，更稳定地从凝胶向溶胶变化（经过12小时约40%）。另一方面，在高盐浓度(100mM或150mM），最初的凝胶的百分率是大致100%，残留凝胶的百分率仅经时略微降低。由此确证，在DNA浓度一定的情况中，盐浓度越高的，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。
【（8-4）盐浓度的调节-2】
除了代替四足DNA（12-14-14）（SEQ ID NO:30、31、32、33）使用四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）之外，与（8-3）同样经时测定残留的凝胶的百分率。结果示于图17之右下的坐标图。横轴示经过的时间。与（8-3）同样地确证，在DNA浓度一定的情况中，盐浓度越高，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。另外确证，相对于（8-3）中四足DNA（12-14-14）（粘性突出末端的长度是12碱基），在（8-4）中使用四足DNA（4-18-18）（粘性突出末端的长度4碱基），将这些进行比较，则当DNA浓度及盐浓度相同时，粘性突出末端的长度越长，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。
由这些确证，当使其他条件一定时，DNA浓度越高，盐浓度越高，粘性突出末端的长度越长，越有易以凝胶（而非溶胶）的形态存在的倾向。即确证，通过适宜调节DNA浓度、盐浓度、及粘性突出末端的长度，可控制凝胶之内部结构、凝胶化的程度、及凝胶强度。
【实施例9】
【通过凝胶之内部结构、凝胶化的程度及凝胶强度的控制来控制凝胶之内封化合物的释放速度】
由四足DNA的突出末端的性质和盐浓度的控制，研究了凝胶之内封化合物的释放速度如何变化。具体而言，使用有粘性突出末端的四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）及作为对照有非粘性突出末端的四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:58、59、60、61）。将这些四足DNA制备至达到0.5mM的DNA浓度的水溶液的NaCl浓度调节为5mM或150mM。在升高NaCl浓度之时，作为内封物质加卵清蛋白（OVA、浓度2.5μg/μl），凝胶化之后，经时测定从凝胶释放的OVA的百分率。结果示于图18的坐标图。在对照的有非粘性突出末端的四足DNA中，几乎见不到凝胶化，从最初OVA大致100%释放。另一方面，从以NaCl浓度5mM使用有粘性突出末端的四足DNA制成的凝胶OVA急速释放而在短时间内全部的OVA释放。与此相比，从以NaCl浓度150mM使用有粘性突出末端的四足DNA制成的凝胶OVA缓慢释放，经24小时释放约60%的OVA。
因此确证，通过适宜控制突出末端的性质和盐浓度，可调节凝胶之内部结构、凝胶化的程度及凝胶强度，结果可控制内封物质的释放速度。另外示，在活体中的盐浓度（150mM）内封物质缓慢地释放，通过在活体内形成本发明的凝胶，药剂的释放控制（缓慢释放性的达成）变得可能。
【实施例10】
【有修饰基的核酸的利用】
为了研究有修饰基的核酸的利用可能性，制备使用由胆甾醇修饰的DNA的四足DNA。如图19所示，将含有含胆甾醇修饰的核酸单体，并且，核酸中含CpG基序的四足DNA（SEQ ID NO:2、4、5、6：图19中示为Chol-CpG DNA）或未胆甾醇修饰的同样的四足DNA（SEQ ID NO:2、4、5、6：图19中，示为CpG DNA）的溶液涂布于特应性皮肤炎模型小鼠。另外，测定由RAW264.7细胞的各自的四足DNA的摄取。如图19之右下所示，有胆甾醇修饰的四足DNA与无胆甾醇修饰的对照的四足DNA相比，组织迁移性增大，小鼠的皮肤的炎症被更好地抑制。另外，如图19之左下的坐标图所示，有胆甾醇修饰的四足DNA与无胆甾醇修饰的对照的四足DNA相比，更良好地被摄入RAW264.7细胞。
由此确证，通过有胆甾醇等的修饰基的核酸单体的使用，可改变－升高凝胶的特性。
【实施例11】
【由溶胶的鼻腔内施用的凝胶的形成】
将以总DNA浓度2mM含四足DNA（A）（12-14-14）（SEQ IDNO:34、35、36、37）、含150mM的NaCl的溶胶状水溶液和以总DNA浓度2mM含四足DNA（B）（12-14-14）（SEQ ID NO:38、39、40、41）、含150mM的NaCl的溶胶状水溶液同时施用到小鼠的鼻腔内。结果示于图20。通过施用到鼻腔内确证，盐浓度升高，溶胶状水溶液凝胶化，凝胶良好地附着在鼻腔内。
【实施例12】
【形成凝胶的盐浓度及核酸浓度条件的检查】
由以上知，对于是否形成凝胶而言，DNA浓度、盐浓度及粘性突出末端的长度（碱基数接下来表示为X）是重要的因子。从而，试着更详细地评价凝胶的形成条件。
具体而言，如表4的行所示改变含三足DNA（4-18-18）（X=4）（SEQ ID NO:1、2、3）、四足DNA（4-18-18）（X=4）（SEQ ID NO:2、4、5、6）、六足DNA（4-18-18）（X=4）（SEQ ID NO:2、3、4、7、9、10）及四足DNA（8-16-16）（X=8）（SEQ ID NO:22、23、24、25）的水溶液的DNA浓度，另外，如表4的列所示改变NaCl浓度，在各种DNA浓度和NaCl浓度中，评价是否形成凝胶。结果示于表4-1～4-4。以观察到凝胶化时是○、观察到溶液状（溶胶状）时是×显示结果。
表4：各种DNA浓度和NaCl浓度中的凝胶化的评价
【表4-1】
三足DNA（4-18-18）X=4
【表4-2】
四足DNA（4-18-18）X=4
【表4-3】
六足DNA（4-18-18）X=4
【表4-4】
四足DNA（8-16-16）X=8
以表4-1～4-4可以看出，三足DNA的情况比四足DNA或六足DNA，有难凝胶化的倾向，粘性突出末端的碱基数X大时，有更易凝胶化的倾向。从表4-1～4-4的结果将此倾向综合为数式，则如下：
（1）作为溶胶维持的条件：作为X的函数，
NaCl浓度=80mM/x以下，并且
DNA浓度=0.3mM+1.6/xmM以下
（2）作为凝胶维持的条件：作为X的函数，
NaCl浓度=640mM/x-60mM以上、并且
DNA浓度=3.2/xmM以上。
即，通过将满足（1）的条件的溶胶状溶液的DNA浓度及NaCl浓度分别升高至满足（2）的条件，认为发生凝胶化。
【实施例13】
【形成凝胶的温度条件的检查】
再检查凝胶化也与温度条件相关的可能性。使用四足DNA（4-18-18）（SEQ ID NO:2、4、5、6）、六足DNA（4-18-18）（SEQID NO:2、3、4、7、9、10）、及四足DNA（8-16-16）（SEQ ID NO:22、23、24、25），将NaCl浓度固定于150mM，变更DNA浓度为各浓度，研究在何温度条件下作为凝胶存在，或作为溶胶存在。
将结果示于以下的表5。
【表5】
四足DNA(4-18-18)
| DNA浓度 | 0.4-0.5mM | 在45℃以下凝胶 | 在55℃以上溶胶 |
| DNA浓度 | 0.6-0.8mM | 在55℃以下凝胶 | 在65℃以上溶胶 |
六足DNA(4-18-18)
| DNA浓度 | 0.3-0.8mM | 在55℃以下凝胶 | 在65℃以上溶胶 |
| DNA浓度 | 1.0mM | 在65℃以下凝胶 | 在75℃以上溶胶 |
四足DNA(8-16-16)
| DNA浓度 | 0.5mM | 在55℃以下凝胶 | 在75℃以上溶胶 |
从以上确证，在任何情况中，温度变高，则溶胶化，越高DNA浓度越容易凝胶化，X的长度越长，越有易凝胶化的倾向。
【实施例14】
【与使用连接酶制备的凝胶的特性的比较】
【（14-1）不使用连接酶的DNA水凝胶的制备】
将表1所示的四足DNA（8-16-16）-1-01～04用含1.5MNaCl的TE缓冲液（10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8）溶解，制备为各ODN的终浓度达到0.5mM。将各ODN混合物加热至95℃后，缓慢地冷却而得到DNA水凝胶。
【（14-2）使用连接酶的DNA水凝胶的制备】
将以下的表6所示的P-四足DNA（4-18-18）-1-01～04（表1中的序列的5’末端带磷酸基的）用含50mMNaCl的TE缓冲液（10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8）溶解，制备成各ODN的终浓度为0.75mM。将各ODN混合物加热至95℃后，通过缓慢地冷却得到P-四足DNA。向生成物加T4DNA连接酶（200单位；Promega、WI、USA）和连接缓冲液（300mMTris-HCl、100mMMgCl2、100mMDTT、10mMATP），于16℃反应16小时而得到DNA水凝胶（使用连接酶）。
【表6】
/5Phos/表示5’末端的磷酸基。
【（14-3）凝胶粘弹性的测定】
将得到的凝胶或溶剂放入管中，设置到凝胶粘弹性测定器（株式会社中山电机制）中。将测定棒降低至凝胶的上端，其后，经时测定将测定棒500μm降低之时的荷重值（重量）。
结果示于图22。图中的峰值是对应于凝胶的凝固的参数。在相同的DNA浓度条件下，使用自身凝胶化核酸制备的DNA水凝胶示更高的值（约1600mg和约400mg）。得知不使用连接酶的自身凝胶化核酸相比使用连接酶制备的DNA水凝胶更强固。另外，图22中的缓和曲线的斜率是对应于凝胶的粘弹性的参数。得知使用自身凝胶化核酸制备的DNA水凝胶更缓，粘弹性优良。使用连接酶制备的DNA水凝胶脆。
【实施例15】
【有3～12个足的多足DNA制备物的PAGE分析】
使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法，制备ssDNA、dsDNA及各多足DNA制备物，以200V在6%聚丙烯酸类树脂酰胺凝胶上将各自电泳20分钟。
结果示于图23。将图23A及B中的各泳道与电泳物的对应示于以下的表7。
【表7】
| 图23A | |
| 泳道1 | 100bp DNA阶梯 |
| 泳道2 | ssDNA36 |
| 泳道3 | dsDNA36 |
| 泳道4 | 三足DNA36 |
| 泳道5 | 四足DNA36 |
| 泳道6 | 五足DNA36 |
| 泳道7 | 六足DNA36 |
| 泳道8 | 八足DNA36 |
| 泳道9 | 十二足DNA36 |
| 图23B | |
| 泳道1 | 100bp DNA阶梯 |
| 泳道2 | 三足DNA30 |
| 泳道3 | 三足DNA60 |
| 泳道4 | 三足DNA90 |
| 泳道5 | 三足DNA80 |
| 泳道6 | 四足DNA60 |
| 泳道7 | 五足DNA48 |
| 泳道8 | 六足DNA40 |
如图23A所示，在三足DNA36、四足DNA36、五足DNA36、六足DNA36、及八足DNA36中观察到主要的单一的条带。因此知，多足样结构以高的效率形成。另一方面，对于十二足DNA36而言，不形成主要的条带。十二足DNA热稳定性低，在8个足和12个足之间认为有临界点。另外，足数增加则电泳度降低。
图23B的泳道2～5示对含30、60、或者90核苷酸的三足DNA的PAGE分析。当三足DNA中的ODN长增加时电泳度变高。电泳度随多足DNA制备物中的碱基数而变。含240碱基的各种多足DNA的电泳度（图23B、泳道6～8）是大致相同的。因此认为，电泳度依赖于核苷酸数，不依赖于立体结构。
【实施例16】
【CD光谱（圆二色性光谱）】
使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法，制备dsDNA36、A36、（CG）6、及各多足DNA制备物。用含有5mM氯化钠的TE缓冲液将退火后的各DNA样品稀释至最终DNA浓度25μg/ml。然后，于25℃使用0.1cm途径长的石英池，于4℃使用JASCO-820型分光偏光计（JASCO、东京、日本）记录DNA的CD光谱（圆二色性光谱）。DNA的CD光谱（圆二色性光谱）在200nm～320nm的范围测量。为了促进比较，对CD光谱（圆二色性光谱）进行背景除去、平滑化、及浓度调节，以得到摩尔椭圆率。
结果示于图24。在dsDNA36的情况中，在280nm及240nm近边分别观察到阳性及阴性峰。这是B型DNA的典型光谱。全部的多足DNA与dsDNA36示同样的峰（图24A）。在图24B（CG）6的光谱是Z型DNA的典型。六足DNA36示与这不同的峰。从这些得知，各多足DNA取作为在双链DNA的通常条件下的结构的B型DNA结构。
【实施例17】
【Tm值及表观尺寸】
使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法，制备各DNA制备物。使用具备TMSPC-8温度调节器18的岛津UV-1600PC分光计（京都、日本），在260nm处测量多足DNA或其他DNA制备物的吸光度。从在5mM的钠浓度的融解曲线，求出对各自的融解温度（Tm）。
另外，在20℃使用MalvernZetasizer3000HS（MalvernInstruments、Malvern、UK）由动态光散射法，测定各自的多足DNA的表现尺寸。将测量至少重复3次，将结果以可再现的结果的平均±标准误差（S.E.）表示。尺寸的结果以3个（三足DNA36、四足DNA36、五足DNA36、六足DNA36、三足DNA80、四足DNA60、五足DNA48、六足DNA40）或6个（八足DNA36、三足DNA60、三足DNA90）的测量的平均±SE表示。
各自的结果示于表8。
【表8】
| DNA制备物 | Tm（℃） | 尺寸（nm） |
| dsDNA36 | 66.5 | N.D. |
| 三足DNA36 | 54.6 | 6.16±0.04 |
| 四足DNA36 | 50.8 | 7.39±0.15a |
| 五足DNA36 | 47.9 | 7.68±0.06a |
| 六足DNA36 | 44.8 | 8.16±0.08a |
| 八足DNA36 | 43.9 | 8.33±0.42a |
| 三足DNA30 | 46.5 | N.D. |
| 三足DNA60 | 61.2 | 8.87±0.13b |
| 三足DNA80 | 64.9 | 10.7±0.2d,e,f |
| 三足DNA90 | 68.3 | 12.1±0.4 |
| 四足DNA60 | 59.8 | 9.14±0.17c,f |
| 五足DNA48 | 53.2 | 8.48±0.31c,f |
| 六足DNA40 | 48.5 | 6.47±0.30c,d,e |
a P<0.05三足DNA36；
b P<0.05三足DNA90；
c P<0.05三足DNA80；
d P<0.05四足DNA60；
e P<0.05五足DNA48；
f P<0.05六足DNA40；
N.D.：不可检测
如表8所示，dsDNA36的Tm值相比使用36聚体的ODN的其他制备物更高。知Tm值是足数的函数，足数增加，则Tm值下降。另外知，三足DNA制备物的Tm值依赖于ODN长，三足DNA90示最大的Tm值。
另外知，如表8所示，ODN长增加到30～90，则三足DNA制备物的表观尺寸增加。有240个碱基的多足DNA（三足DNA80、四足DNA60、五足DNA48、六足DNA40）的尺寸也依赖于ODN长。对于包括36聚体的ODN的多足DNA制备物而言，足数增加，则其尺寸略微增加。这推测是由于，在足数多的制备物中，碱基堆叠（stacking）减少，结构膨胀。
【实施例18】
【血清中的多足DNA的稳定性】
使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法，制备各多足DNA制备物。于37℃以10μg/100μl的浓度，将各多足DNA制备物与用RPMI1640培养基稀释的20%小鼠血清温育。温育的0、2、4、8、12或24小时后，将样品溶液的10μl等份移到塑料管，与20μl的0.5MEDTA溶液混合而停止分解，于-20℃保存直到使用。将这些的样品于4℃在12%PAGE中电泳，用SYBRGold（MolecularProbes、Eugene、OR、SA）染色。使用MultiGaugesoftware（富士膜、东京、日本）定量评价DNA条带的密度。
结果示于图25A～D。这些的实验进行3次，得到同样的结果。图25A及C是1个代表性的凝胶。如图25A及B所示，三足DNA的足长越长，分解率越高。另外，如图25C及D所示，足数越多，在小鼠血清中的稳定性越低。这被推测为，由于DNA在体液中主要被外切核酸酶分解，足数多末端数多则DNA易分解。
【实施例19】
【向局部淋巴节的DNA水凝胶的迁移】
将表1中的六足DNA（8-16-16）-2-01用32P末端标记。即，使用T4多核苷酸激酶（T4PNK；宝生物、大津、日本），于37℃、使ODN与γ-32PATP反应30分钟，于80℃加热12分钟而使T4PNK变性。使用NAP5柱（GE HEALTHCARE、东京、日本）将标记产物纯化。使用痕量的32P-六足DNA（8-16-16）-2-01及以下的表9所示的其他ODN制备32P-标记样品。
【表9】
将各自的32P-DNA样品以10mg/kg的施用量注入4周龄雄ICR小鼠的背面皮肤。自注入起指定间隔后，将小鼠用异氟烷麻醉，将背面皮肤以及鼠径及腋窝淋巴节分别从注入部位及局部淋巴节采集。将各自的样品放入含有700μl的Soluene-350（PerkinElmer日本株式会社、神奈川、日本）的20ml聚丙烯闪烁瓶，于60℃温育一晚而消化。向该瓶连续地添加2-丙醇（200μl）及过氧化氢（200μl、30%w/v；三德化学工业株式会社、东京、日本）。将样品于室温放置至泡沫消失。
接下来，向样品添加100μl的5M氯化氢溶液及5ml的Clear-solI（Nacalai tesque株式会社、京都、日本）。将样品的放射线用Tri-Carb3110TR液体闪烁分光计（PerkinElmer、Norwalk、CT、USA）计数。将结果作为每样品的放射线的注入量的百分率计算，以3只小鼠的平均±S.D.表示。
结果示于图26。如图26所示，DNA水凝胶相比六足DNA或ssDNA更长地留在注入部位，经长期间迁移到局部淋巴节。这证实DNA水凝胶的缓慢释放性高。
【实施例20】
【DNA水凝胶的崩解、从DNA水凝胶的DXR释放、及小鼠中的肿瘤增殖】
使用表1所示的ODN（六足DNA（8-16-16）-2-01～06、及六足DNA（8-16-16）-3-01～06），与实施例1同样地制备DNA水凝胶。
为了制备多柔比星（DXR）/DNA水凝胶，在Mili-Q水中将DXR添加到注射器，将2个六足DNA制备物连续地添加到DXR。在室温温育1小时之后，将混合物作为DXR/DNA水凝胶使用。将DXR及DNA的混合率固定于1:40重量率。
向DXR/DNA水凝胶（300μg/10μl）添加10μl生理盐水或20%小鼠血清，于37℃温育。经过指定的时间后，采集样品。以2000×g离心分离5秒钟之后，采集上清，用分光光度计（UV-1600、岛津、日本）及多标记计数器（ARVOTMM×1420、Wallac、Finland），以分别485及560nm的激发及发光波长，测定DNA的吸光度及DXR的荧光，分别推定DNA及DXR的浓度。
将结果示于图27之左上图及左下图。DNA水凝胶，相比在生理盐水中，在小鼠血清中更快速地分解（图27左上）。另外，DNA水凝胶中DXR在小鼠血清中相比生理盐水释放更多（图27左下）。
使用表1所示的ODN（六足DNA（8-16-16）-2-01～06、及六足DNA（8-16-16）-3-01～06），与实施例1同样地制备水凝胶，如同上述制备DXR/DNA水凝胶。另一方面，将结肠26/Luc细胞（5×105细胞/小鼠）接种到BALB/c小鼠的背面皮肤。然后，肿瘤接种9天后，将生理盐水、DXR（7.5μg/小鼠）、DNA水凝胶（300μg/小鼠）、或者DXR/DNA水凝胶（7.5μgDXR及300μgDNA/小鼠）注入小鼠的肿瘤内。使用弯脚规定期测定肿瘤尺寸。
结果示于图27之右图。DXR通过含在DNA水凝胶中而示高的肿瘤增殖抑制能力（图27之右图）。
【实施例21】
【IL-6诱导】
表1所示的序列之中，使用以下的表10的ODN，制备DNA样品。
【表10】
将小鼠树状DC2.4细胞以5×104细胞/孔的密度接种于96孔培养板，5%CO2中，于37℃温育一晚。以表示的浓度将DNA样品添加到细胞，将细胞温育16小时。
接下来，采集上清，于-80℃保存直至测量。根据生产商的流程（BDBiosciences、SanDiego、CA、USA），用酶联免疫测定法（ELISA）测定IL-6的浓度。
结果示于图28。如图28所示，水凝胶的状态的CpGDNA相比单链或六足DNA的CpGDNA示更高的免疫刺激性。
【实施例22】
【由DNA制备物从RAW264.7细胞的细胞因子释放】
使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法制备各样品。
在添加10%加热失活的FBS、0.15%碳酸氢钠、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、及2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中，含有5%CO2的加湿空气中，于37℃增殖鼠巨噬细胞样细胞RAW264.7。接下来，向24孔或96孔培养板上以5×105细胞s/ml的密度接种细胞，在使用之前培养24小时。
以2.5×105细胞/孔的密度将RAW264.7细胞接种于24孔板，处置前温育24小时。然后，将在0.5mlOpti-MEM中稀释的ssDNA、dsDNA、或者数种多足DNA以0.5、1或2μg/ml的最终浓度添加到细胞。将细胞温育8小时，回收上清，于-70℃保存至使用。通过使用OptEIATM组（Pharmingen、SanDiego、CA、USA）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定上清中的TNF-α及IL-6的浓度。
将结果以3个测定的平均±SD表示，示于图29。数据是4个（TNF-α）或2个（IL-6）的独立的实验的代表。图中的＊表示值低于检测限界。在ssDNA、dsDNA的情况中，几乎无TNF-α释放。对此，多足DNA制备物DNA的浓度依赖性地诱导从RAW264.7细胞的细胞因子释放（图29A）。另外知，pod数多则TNF-α释放量增加。同样的结果也示于对IL-6释放的图29B。因此知，多足DNA制备物是，pod数越多，CpGDNA的免疫刺激活性越高。
【实施例23】
【由多足DNA制备物的从RAW264.7细胞的TNF-α释放】
除了使用表1中的序列，通过与实施例1同样的方法，制备各多足DNA制备物之外，进行与实施例22同样的实验。但是，使添加的DNA在各自的情况中是等量。
将结果作为3个测定的平均±SD示于图30。数据是4个（图30A）或3个（图30B）独立的实验的代表。图中的＊表示值低于检测限界。如图30A所示，在三足DNA中，核苷酸数增加，则TNF-α释放也增加。另外，如图30B所示，在包括240个核苷酸的多足DNA制备物之中，六足DNA40示最高的TNF-α释放。从这些知，增大足数对于增大CpGDNA的免疫刺激活性有效。
【实施例24-1】
【RAW264.7细胞中的DNA的摄取】
使用表1中的序列，前述的材料及方法、以及通过与实施例1同样的方法，制备AlexaFluor488-标记DNA样品。在96孔板上，以5×104细胞/孔的密度，将RAW264.7细胞与AlexaFluor488-标记ssDNA、dsDNA、或者多足DNA一同于37或4℃温育8小时。其后，用200μl磷酸缓冲生理盐水（PBS）将细胞清洗二次而采集。然后，使用CellQuest软件（version3.1、BDBiosciences），通过流式细胞术（FACSCalibur、BDBiosciences、NJ、USA）测定细胞的平均荧光强度（MFI）。
将结果示于图31A。平均荧光强度从高到低为八足DNA、六足DNA、五足DNA、四足DNA、三足DNA的顺序，细胞释放与细胞因子释放的情况是相同倾向。因此知，pod数增加，则细胞因子诱导增加。
【实施例24-2】
【DNA摄取的荧光显微镜观察】
将RAW264.7细胞接种到13mm直径玻璃盖玻片上，温育24小时。将培养基用含有AlexaFluor488-标记六足DNA36的Opti-MEM取代。在37℃的3小时的温育之后，将细胞用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定20分钟，再用PBS清洗3次。然后，为了染色核，加60nM的4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），10分钟的温育之后，用PBS清洗3次。然后，将盖玻片用SlowFade（注册商标）Gold（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）加载到玻璃载玻片上，使用荧光显微镜（BiozeroBZ-8000、KEYENCE、大阪、日本）观察。
结果示于图31B～E。图中，B示DAPI染色、C示AlexaFluor488-标记六足DNA36、D示重合图像、E示明视野。如图31B～E所示，荧光信号在细胞内被检测为点状。因此提示，细胞摄取由胞吞进行。
【实施例25】
【TLR9依赖性的活化】
表1的序列之中，使用SEQ ID NO:86～95的序列，通过与实施例1同样的方法，制备DNA样品。
接下来，如同文献（Blood、2000；96：3029-39）记载，从8～10周龄雄C57BL/6小鼠、及有C57BL/6的遗传背景的TLR9敲除小鼠（TLR9-/-）造出骨髓来源树突细胞（BMDC）。即，使用26号针用RPMI冲洗大腿骨及胫骨，单离骨髓细胞。通的40μm细胞过滤器（BDFalcon、FranklinLakes、NJ、USA）过滤之后，将骨髓细胞再悬浮于5分钟0.86%氯化铵中，溶解红细胞。
其后，向补充10%加热失活的FBS、0.2%碳酸氢钠、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺、0.5mM单硫代甘油、及100ng/ml小鼠重组Flt-3配体（Peprotech、RockyHill、NJ、USA）的RPMI，以5×106细胞/ml的密度、将残留细胞培养8天。在含有5%CO2的加湿空气中，于37℃增殖细胞。在培养的第7天、采集非粘接性细胞，将其作为BMDC使用。为了细胞因子释放实验，将细胞以3×105细胞/孔的密度再平铺于96孔培养板上。将细胞与2μg/ml的ssDNA（三足DNA（0-18-18）-1-02）或多足DNA一同温育24小时。其后，采集培养上清，于-80℃保存至用于酶联免疫测定法（ELISA）。使用OptEIATM组（Pharmingen、SanDiego、CA、USA）测定小鼠IL-6的浓度。
结果示于图32。知通过用含CpG的多足DNA制备的水凝胶的IL-6释放是TLR9依赖性的。
【实施例26】
【单核细胞依赖性的多足DNA摄取】
表1的序列之中，使用SEQ ID NO:96～104的序列，通过与实施例1同样的方法，制备DNA样品。
通过Ficoll-PaquePLUS（GEhealthcare、Piscataway、NJ、USA）密度梯度离心分离，根据生产商的流程，从健康自愿者的末梢血单离人末梢血单核细胞（PBMC）。将采集的PBMC以6×105细胞/孔的密度再平铺于48孔培养板上，用于细胞因子释放实验。在96孔培养板上，将6×105细胞/孔的浓度的PBMC与2μg/ml的AlexaFluor488-标记多足DNA制备物一同温育4小时。其后，将细胞使用200μl磷酸缓冲生理盐水清洗二次而采集。然后，将细胞的荧光强度使用CellQuest软件（version3.1、BDBiosciences），通过流式细胞术（FACSCalibur、BDBiosciences、FranklinLakes、NJ、USA）分析。为了PBMC的调查，基于前方散射（FSC）及侧方散射（SSC）特性（ClinChem、1998；44：966-72.）对细胞选通。其后，测定富含单核细胞的区域1及富含淋巴细胞的区域2中的细胞的MFI。
结果示于图33。知由单核细胞进行多足DNA的摄取。
【实施例27】
【IL-6mRNA表达的诱导】
表1中的序列之中，使用以下的表11所示的ODN，通过与实施例1同样的方法，制备各DNA样品。
【表11】
在异氟烷的麻醉下，向C57BL/6小鼠的背面皮肤以200μg/小鼠的施用量注入各自的DNA样品。在注入后的指定间隔中，将小鼠用异氟烷麻醉，然后，将背面皮肤以及鼠径及腋窝淋巴节分别作为注入部位及局部淋巴节而采集。使用RNeasyminikit（QIAGENGmbH、Hilden、Germany），根据生产商的流程提取皮肤样品的总RNA。使用SepasolRNAIsuper（Nacalai tesque）提取淋巴节的总RNA。使用ReverTraAce（注册商标）qPCRRTKit（TOYOBO、大阪、日本）逆转录提取的RNA。为了进行mRNA表达的定量的分析，使用KAPASYBRFASTABIPrism2×qPCRMasterMix（KAPABIOSYSTEMS、Boston、MA、USA）对总RNA进行RT-PCR。扩增中使用的ODN引物如以下的表12所示。使用StepOnePlusRealTimePCRSystem（AppliedBiosystems、FosterCity、CA、USA），经作为荧光染料的SYBRGREEN的嵌入，在线检测扩增产物。将IL-6mRNA表达用β-肌动蛋白的mRNA水平标准化。
【表12】
将结果示于图34。知CpG水凝胶持续强诱导IL-6mRNA的表达。
【实施例28】
【由OVA/CpGDNA水凝胶的适应免疫反应的诱导】
【（28-1）血清样品的采集】
使用表1的序列，通过与实施例1同样的方法，制备DNA样品。在异氟烷的麻醉下、将含有200μgDNA样品及50μgOVA（10μl/施用）、或者50μgOVA（20μl/施用）的完全弗氏佐剂（CFA）注入C57BL/6小鼠的背面皮肤。在第0、7、及14天给小鼠免疫3次。最后的免疫施加的7天后，处死小鼠，采集血清及脾脏。于-80℃保存至测量血清样品。
【（28-2）OVA-特异性IgG】
为了由ELISA测定OVA特异性总IgG水平，连续地稀释血清样品。即，于4℃将96孔平底板用OVA（1mg/ml）包被8～16小时。然后，用含有5%BSA的磷酸缓冲生理盐水（T-PBS）中的0.5w/w%吐温-20阻断孔。在T-PBS清洗之后，将稀释的100μl血清样品连续地添加到各孔中。在37℃温育2小时之后，用T-PBS将孔清洗5次，然后，将用含有5%BSA-的T-PBS以3000:1稀释的100μl的抗-IgG-HRP缀合物（Sigma、St.Louis、MO、USA）添加到各自的孔中。在37℃的1小时的温育之后，将各自的孔用T-PBS清洗，其后，将含有柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH5）中的20μl过氧化氢的200μl的新制备的o-苯二胺二盐酸盐（和光纯药工业株式会社、大阪、日本）溶液添加到各自的孔中。温育的4分钟后，添加50μl的1M硫酸，其后，测定在490nm处的吸光度。
结果示于图35之左图。知处于水凝胶状态时IgG效价升高。
【（28-3）来自脾脏细胞的IFN-γ】
最后的免疫施加的7天后，通过机械解剖将脾脏细胞单离。将混入的红细胞用1.5M氯化铵溶解。在OVA（1mg/ml）的存在下，以5×106细胞/ml的密度，在96孔培养板中将脾脏细胞培养4天。采集上清，于-80℃保存至测量。根据生产商的流程，由ELISA测定IFN-γ的浓度（Ready-SET-Go！小鼠IFN-γELISA、eBioscience、SanDiego、CA、USA）。
结果示于图35之中央图。知在处于水凝胶的状态时，IFN-γ的浓度升高。
【（28-4）CTL测定】
最后的免疫施加的7天后，由机械解剖，单离脾脏细胞。用1.5M氯化铵溶解混入红细胞。为了准备CTL，于37℃5%CO2中将脾细胞（5×107细胞）与用丝裂霉素C处理的5×106EG7-OVA细胞一同共培养5天。将目标细胞、即，EG7-OVA及EL4用51Cr-标记铬酸钠（Na2 51CrO4、富士胶卷RIPharma、东京、日本）标记。为追加的脾细胞连续地稀释，于37℃与目标细胞一同共温育4小时。从无效应子细胞（脾细胞），且有1%Triton-X的温育，分别评价51Cr的自然释放及最大释放。将上清的放射线用γ计数器测定。根据以下的方程式计算特异性溶解的百分率：
特异性溶解的%=（观察释放-自然释放）/（最大释放-自然释放）
结果示于图35之右图。知相比在单链的状态或核酸单位（多足DNA）的状态下使用，在水凝胶的情况中特异性溶解更高。
【实施例29】
【副作用】
使用表1的序列，通过与实施例1同样的方法，制备DNA样品。
在异氟烷的麻醉下、向C57BL/6小鼠的背面皮肤注入200μgDNA样品及50μgOVA（10μl）、含有50μgOVA（10μl）的CFA、或者100μgAlum及50μgOVA（20μl）。注入的7天后，摘出含注入部位的皮肤，在4%多聚甲醛中固定，掺入石蜡中，5μm切片为薄切，用苏木精及伊红染色。为了对染色的样品进行组织学评价，在显微镜（BiozeroBZ-8000、KEYENCE、大阪、日本）下观察。在如上所述1周间隔的第三次的免疫施加的7天后，从不同的组的C57BL/6小鼠采集脾脏。测定脾脏的重量，评价脾肿。
结果示于图36。如图36之左图所示，在水凝胶的情况中，向注入部位的免疫细胞的浸润少，局部的副作用少。另外，如图36之右图所示，在水凝胶的情况中，脾脏的肥大化小，全身性的副作用也少。
【工业实用性】
在缓慢释放剂、免疫增强剂、组织迁移性DNA等的各种用途中都可利用。由本发明的组合物制备的凝胶被认为，对于广泛的物质（药物、抗原、细胞）作为受控的释放系统利用。另外，通过掺入以CpG基序为代表的免疫活化结构，也可赋予作为免疫佐剂的功能，可期待与抗癌剂或抗原蛋白质、免疫细胞的协同效果。另外认为，由于在溶胶（溶液）状态的施用是可能的，也可作为喷雾剂开发，对于向鼻腔等的抗原施用也有用，可在必要免疫应答的控制的治疗中广泛利用。
Claims (16)
1.用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的核酸溶胶状组合物，其由选自一部分互相互补的，与核酸、核酸衍生物、修饰型核酸、核酸互补地结合的化合物、及它们的混合物的2个以上的核酸单体构成，一个核酸单体含构成粘性突出末端的部分、可与1个以上的别的核酸单体形成双链的互补性碱基序列部，并且不含有核酸连结酶。
2.权利要求1所述的溶胶状组合物，其用于在活体内制成凝胶。
3.权利要求1或2所述的溶胶状组合物，其中核酸单体包括在互补性碱基序列部中互补地结合，并且以粘性突出末端在生理的条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补的序列结构。
4.不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的方法，其包括提高权利要求1～3之任一项的核酸溶胶状组合物的核酸浓度及/或盐浓度。
5.用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别含：
含权利要求1所述的第1核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含权利要求1所述的第2核酸单体，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该第2核酸单体中的粘性突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
6.制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过混合权利要求5所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物来形成凝胶。
7.用于不使用核酸连结酶制成核酸凝胶的试剂盒，其为用于制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的试剂盒，其分别包括：
含权利要求1所述的核酸单体，不含有核酸连结酶的第1溶胶状组合物；及
含有在两末端具有包括粘性单链的突出末端的双链核酸，不含有核酸连结酶的第2溶胶状组合物；
其中
该第1核酸单体中的粘性突出末端含第1序列，
该双链核酸的两末端的突出末端含第2序列，并且
该第1序列和该第2序列以互相在生理条件下形成表现出体温以上的融解温度的双链序列的程度互补。
8.制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括通过混合权利要求7所述的试剂盒中的第1溶胶状组合物和第2溶胶状组合物来形成凝胶。
9.不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其通过权利要求4、6及8之任一项所述的方法制成。
10.封入内封物质，并且制成不含有核酸连结酶的核酸凝胶的方法，其包括在权利要求4、6及8之任一项所述的方法中，将要在凝胶形成前封入凝胶的内封物质添加到溶胶状组合物中。
11.权利要求10所述的方法，其中内封物质选自：低分子量化合物、蛋白质及细胞。
12.含有内封物质，并且不含有核酸连结酶的核酸凝胶，其通过权利要求10或11所述的方法制成。
13.权利要求1～12之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶，其中核酸单体含CpG基序。
14.权利要求1～13之任一项所述的核酸溶胶状组合物、方法、试剂盒、或者核酸凝胶，其中核酸单体的种类数是3～8。
15.权利要求1～3之任一项所述的溶胶状组合物，其中核酸单体含CpG基序，所述核酸溶胶状组合物用于制成免疫佐剂。
16.免疫佐剂，其特征在于，是含权利要求9或12所述的核酸凝胶的免疫佐剂，核酸单体含CpG基序。
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