JP6083571B2 - 自己ゲル化核酸 - Google Patents
自己ゲル化核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6083571B2 JP6083571B2 JP2013511034A JP2013511034A JP6083571B2 JP 6083571 B2 JP6083571 B2 JP 6083571B2 JP 2013511034 A JP2013511034 A JP 2013511034A JP 2013511034 A JP2013511034 A JP 2013511034A JP 6083571 B2 JP6083571 B2 JP 6083571B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- gel
- sol
- concentration
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
- A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
(1−1):一部が互いに相補的な、核酸、核酸誘導体、修飾型核酸、核酸と相補的に結合する化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択される2本以上の核酸モノマーから構成され、一本の核酸モノマーが、接着性突出末端を構成する部分、1本以上の別の核酸モノマーと二重鎖を形成し得る相補的塩基配列部、を含み、かつ、核酸連結酵素を含有しない、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するための核酸ゾル状組成物。
(1−1)に記載の第2の核酸モノマーを含む、核酸連結酵素を含有しない、第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1の核酸モノマー中の接着性突出末端が第1の配列を含み、
該第2の核酸モノマー中の接着性突出末端が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するためのキット。
両末端に接着性一本鎖からなる突出末端を有する二本鎖核酸を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1の核酸モノマー中の接着性突出末端が第1の配列を含み、
該二本鎖核酸の両末端の突出末端が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するためのキット。
(1−13):核酸モノマーが、相補的塩基配列部において相補的に結合し、かつ、接着性突出末端が回文配列構造を含む(1−1)または(1−2)記載のゾル状組成物。
[ここで、
接着性突出末端部は、4〜12ヌクレオチド長であって、少なくとも1つの別のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的となる一本鎖核酸部分であり、
別のオリゴヌクレオチドと相補的に結合する相補的塩基配列部は、8〜45ヌクレオチド長であって、別のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である]。
(2−1)に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
該第2のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、キット。
両端に接着性の一本鎖からなる突出末端部を有し、その間に二本鎖からなる相補的塩基配列部を有する核酸を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
[第2のゾル状組成物において、
突出末端部は、4〜12ヌクレオチド長であって、該第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的となる一本鎖核酸部分であり、
相補的塩基配列部は、8〜45ヌクレオチド長であって、第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である二本鎖核酸部分である]
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
該二本鎖からなる相補的塩基配列部の両端の突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、キット。
特許請求の範囲において、「体温」とは37℃を意味し、「生理条件下」とは塩濃度がNaCl濃度に換算して150mMである条件下をいう。
本明細書および特許請求の範囲において、「核酸モノマー」とは、核酸、核酸誘導体、修飾型核酸、核酸と相補的に結合する化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択され、以下に定義する「核酸単位」を形成しうる化合物をいう。具体的には、一本の「核酸モノマー」は、接着性突出末端を構成する部分(下記模式図におけるx部分)および別の核酸モノマーと二重鎖を形成し得る相補的塩基配列部(下記模式図におけるy部分)を含む。
[核酸単位の模式図]
本発明を以下、上記模式図を利用して簡単に説明する。
(A)1種の核酸単位からのゲルの形成
上記に定義した1種の核酸単位からなるゲルについてまず説明する。
1種の核酸単位からゲルが形成される場合、核酸単位は以下の模式図で表されるものから選択される1種である。
次に上記に定義した2種以上の核酸単位からなるゲルについて説明する。
2種以上の核酸単位からゲルが形成される場合、核酸単位は以下の模式図で表されるものから選択される2種以上であるが、ただし、少なくとも1種はn=2ではない(nが3〜12の)核酸単位である。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は特許請求の範囲により限定されるものであり、上記の発明の概要および以下の発明の詳細な説明の具体的な記載に限定されるわけではない。
本発明において、ゲルを形成するために必要なxの長さは、塩基数として4塩基以上、好ましくは6塩基以上、さらに好ましくは8塩基以上である。上限は特に限定されないが、例えば、12塩基以下であるのが好ましい。好適なxの長さは、nの数にも依存するが、好ましくは4〜12塩基、さらに好ましくは8〜12塩基である。xの長さが長い方がゲルが形成されやすい傾向があるが、xの長さが短い方がゲルの内部構造がより微細(密)になる傾向がある。
本発明において、ゲルを形成するために必要なyの長さは、nの数にも依存するが、塩基数として8塩基以上、好ましくは14塩基以上、さらに好ましくは18塩基以上である。yの長さの上限は特に限定されないが、例えば、nが3の場合、yの長さは8塩基以上、45塩基以下であるのが好ましい。yの長さの上限としては、例えば、45塩基以下、好ましくは30塩基以下、より好ましくは20塩基以下である。nの数が増えるとゲルの形成に必要なyの長さが長くなる傾向があるが、yの長さが短い方がゲルの内部構造がより微細(密)になる傾向がある。
本発明の核酸モノマーは、形成されるゲルに要求される機能に応じて、種々の核酸配列を有していてもよいし、修飾核酸を含んでいたものでも、核酸以外の修飾基を付加したものであってもよい。例えば、DNAからなる核酸モノマーに、CpGモチーフを含めることにより、得られるゲルの免疫活性を高めることができる。なお、「CpGモチーフ」は、ヒトの場合の最適配列はGTCGTT、齧歯類(マウス、ラット)ではGACGTTとされている。マウスの議論では一般化したプリン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジンを使う場合もあるが、これはヒトの最適化配列には合わない。さらにこれ以外にも多数のCpGモチーフが免疫活性化を示すことが報告されている。また、配列中のCpGモチーフの数と免疫活性の間には正の相関があると報告されている。なお、本明細書中において、CpGモチーフは、単にCpGと略称されることがある。
本発明による核酸からなるゲルには、種々の物質を内包させることができる。内包させる物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン等のDNAインターカレーター、インスリン等のペプチドおよびペプチド医薬品、卵白アルブミン、スギ抗原等のタンパク質抗原、成長因子、サイトカイン等のタンパク質およびタンパク質医薬品、細胞、および遺伝子改変細胞などが挙げられるが、特に限定されない。内包のメカニズムは、詳細には明らかではないが、核酸単位間の結合が起こる際にその間に存在する内封物質がゲル内に閉じこめられると考えられる。したがって、まずゾルを調製し、内封物質を添加し、例えば、塩濃度や核酸濃度を上昇させることによって、内封物質を内包したゲルを作成することができる。また、内封物質の添加量は特に限定されず、ゲルと同程度の重量であっても内包させることができる。
上記のように、ゲルを形成しうる本発明のゾル状態の組成物は、塩濃度を上昇させたり、核酸濃度を上昇させたりすることによってゲル化する傾向にある。温度については、高温ではゲルよりもゾル化する傾向があり、低温ではゲル化する傾向がある。また、ゲルを形成する核酸モノマーの配列や接着性突出末端の長さによってもゲル化は制御できる。例えば、生体内でゲルを形成させたい場合は、ゲルを形成する核酸モノマーのそれぞれの二本鎖及び接着性突出末端のTmが生体温度(37℃程度)よりも高くなるよう配列を設計すればよい。
本発明の組成物はゾル状態で投与して生体内でゲルを形成させることができる。投与態様としては、皮膚投与、注射、鼻腔内投与等が挙げられるがこれらに限定されない。皮膚表面に投与した場合は、皮膚上でゲル化が起こり、注射の場合は、注射部位に応じて、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等でゲル化が起こり、鼻腔内投与の場合は、鼻腔にてゲル化が起こる。
また本発明のゲルは、チキソトロピー性を有するので、ゲル状態で投与してもよい。本発明のゲルは、シリンジを通した後も通過前のゲルと同等の粘弾性を有するので、注射での投与が可能である。
核酸単位を形成させるための核酸モノマーの数は、核酸モノマー中の塩基数、ゲルの形成に用いる塩の種類、塩濃度、pHおよび他の緩衝剤に依存する。CpGモチーフ等の免疫刺激性の核酸を含む場合、核酸モノマーの塩基数が多いほど免疫刺激性が高くなる。また、免疫刺激性を有するモチーフを含む核酸モノマーについて、同一の核酸量および同一のモチーフ量からなる核酸単位どうしで比較すると、核酸単位を構成する核酸モノマーの数が多いほど免疫刺激性が高い。しかし、核酸モノマーの数を多くする場合には、生理的な条件において、核酸単位の形成が十分に起こらない可能性がある。非生理的な条件は、核酸単位を用いたゲルの薬理的用途には適さない。また、塩基数が多い核酸モノマーは、コストが高く、精製も困難である。さらに、核酸単位を構成する核酸モノマーの数が増えた場合には、核酸ゲル中の核酸末端の数が増えるため、エキソヌクレアーゼによる分解を受けやすくなり、血清中での安定性が低くなる。したがって、CpGモチーフ等の免疫刺激性を有するモチーフを用いる場合、免疫刺激性を増大させるためには、核酸単位を構成する核酸モノマーの数は、3〜12、さらに4〜8、特に6〜8が適当である。
後述の実施例に示すとおり、CpGモチーフ等の免疫刺激性を有する要素を含有する核酸モノマーは、一本鎖の状態で用いた場合よりも、核酸単位(polypodna)の状態または核酸ゲルの状態で用いた場合に、免疫応答の活性化の程度が高くなる(図28、図34、図35)。このように、本発明の方法のゲル化によれば、生体内に導入した場合に高い細胞の免疫刺激性を示す核酸調製物を得ることができる。
以上、好適な実施態様に言及して本発明の作用機構を含めて説明したが、上記の発明の概要および詳細な説明の具体的な記載により限定されるわけではない。
・一部が互いに相補的な、核酸、核酸誘導体、修飾型核酸、核酸と相補的に結合する化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択される2本以上の核酸モノマーから構成され、一本の核酸モノマーが、接着性突出末端を構成する部分、1本以上の別の核酸モノマーと二重鎖を形成し得る相補的塩基配列部、を含み、かつ、核酸連結酵素を含有しない、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するための核酸ゾル状組成物、および、
・接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる2以上のオリゴヌクレオチドの混合物を、組成物中に核酸濃度0.3mM+1.6/x(突出末端部塩基数)mM以下にて含有し、核酸連結酵素を含有せず、塩濃度がNaCl濃度に換算して80mM/x(突出末端部塩基数)以下である、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのゾル状組成物:
[ここで、
接着性突出末端部は、4〜12ヌクレオチド長であって、少なくとも1つの別のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的となる一本鎖核酸部分であり、
別のオリゴヌクレオチドと相補的に結合する相補的塩基配列部は、8〜45ヌクレオチド長であって、別のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である]。
・生体内でゲルを作成するための、(1−1)に記載のゾル状組成物、および、
・生体内でゲルを作成するための、(2−1)に記載のゾル状組成物。
・核酸モノマーが、相補的塩基配列部において相補的に結合し、かつ、接着性突出末端が生理的条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である配列構造からなる(1−1)または(1−2)記載のゾル状組成物、および、
・接着性突出末端部が回文配列構造を含む(2−1)記載のゾル状組成物。
・上記(1−1)〜(1−3)いずれかの核酸ゾル状組成物の核酸濃度および/または塩濃度を高めることにより、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成する方法、および、
・上記(2−3)に記載のゾル状組成物中の、核酸濃度を3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度をNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上にそれぞれ上昇させることにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
・上記(1−1)に記載の第1の核酸モノマーを含む、核酸連結酵素を含有しない、第1のゾル状組成物;および
(1−1)に記載の第2の核酸モノマーを含む、核酸連結酵素を含有しない、第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1の核酸モノマー中の接着性突出末端が第1の配列を含み、
該第2の核酸モノマー中の接着性突出末端が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するためのキット、および、
・上記(2−1)に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第1のゾル状組成物;および
(2−1)に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
該第2のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、キット。
・上記(1−5)に記載のキットにおける、第1のゾル状組成物と第2のゾル状組成物とを混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法、および、
・上記(2−5)に記載のキットにおける、第1のゾル状組成物と第2のゾル状組成物とを、核酸濃度が3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度がNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上となる条件下で混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
・上記(1−1)に記載の核酸モノマーを含む、核酸連結酵素を含有しない、第1のゾル状組成物;および
両末端に接着性一本鎖からなる突出末端を有する二本鎖核酸を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1の核酸モノマー中の接着性突出末端が第1の配列を含み、
該二本鎖核酸の両末端の突出末端が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、核酸連結酵素を用いることなく核酸ゲルを作成するためのキット、および、
・上記(2−1)に記載のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第1のゾル状組成物;および
両端に接着性の一本鎖からなる突出末端部を有し、その間に二本鎖からなる相補的塩基配列部を有する核酸を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物;
[第2のゾル状組成物において、
突出末端部は、4〜12ヌクレオチド長であって、該第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的となる一本鎖核酸部分であり、
相補的塩基配列部は、8〜45ヌクレオチド長であって、第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である二本鎖核酸部分である]
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
該二本鎖からなる相補的塩基配列部の両端の突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する程度に相補的である、キット。
・上記(1−7)に記載のキットにおける、第1のゾル状組成物と第2のゾル状組成物とを混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法、および、
・上記(2−7)に記載のキットにおける、第1のゾル状組成物と第2のゾル状組成物とを、核酸濃度が3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度がNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上となる条件下で混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
・上記(1−4)、(1−6)および(1−8)に記載のいずれかの方法により作成された核酸連結酵素を含有しない核酸ゲル、および、
・上記(2−4)、(2−6)および(2−8)に記載のいずれかの方法により作成された核酸連結酵素を含有しない核酸ゲル。
・上記(1−4)、(1−6)および(1−8)に記載のいずれかの方法において、ゲルの形成前にゲルに封入させるべき内封物質をゾル状組成物に添加することを含む、内封物質を封入し、かつ、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法、および、
・上記(2−4)、(2−6)および(2−8)に記載のいずれかの方法において、ゲルの形成前にゲルに封入させるべき内封物質をゾル状組成物に添加することを含む、内封物質を封入し、かつ、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
・内封物質が、低分子化合物、タンパク質、および細胞から選択される、(1−10)に記載の方法、および、
・内封物質が、低分子化合物、タンパク質、および細胞から選択される、(2−10)に記載の方法。
・上記(1−10)または(1−11)記載の方法により作成された、内封物質を含有し、かつ、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲル、および、
・上記(2−10)または(2−11)記載の方法により作成された、内封物質を含有し、かつ、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲル。
・核酸モノマーが、相補的塩基配列部において相補的に結合し、かつ、接着性突出末端が回文配列構造を含む(1−1)または(1−2)記載のゾル状組成物。
(3−1):核酸モノマーが、CpGモチーフを含む、(1−1)〜(1−12)および(2−1)〜(2−12)のいずれか1に記載の核酸ゾル状組成物、方法、キット、または核酸ゲル。
(3−2):核酸モノマーの種類数が、3〜8である、(1−1)〜(1−12)、(2−1)〜(2−12)、および(3−1)のいずれか1に記載の核酸ゾル状組成物、方法、キット、または核酸ゲル。
(3−3):核酸モノマーがCpGモチーフを含むことを特徴とする、免疫アジュバントを作成するための、(1−1)〜(1−3)、および(2−1)〜(2−3)のいずれか1に記載のゾル状組成物。
(3−4):(1−9)、(1−12)、(2−9)、および(2−12)のいずれか1に記載の核酸ゲルを含む、免疫アジュバントであって、核酸モノマーがCpGモチーフを含むことを特徴とする免疫アジュバント。
化学物質
RPMI1640 培地は、日水製薬 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan)から得た。胎児ウシ血清 (FBS)は、Equitech-Bio, Inc (Kerrville, TX, USA)から得た。Opti-MEM(Opti-modified Eagle’s 培地)は、Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)から購入した。20-bp DNAラダーは、タカラバイオ株式会社(Takara Bio Inc. Otsu, Japan)から購入した。その他のすべての試薬・物質は利用可能な最高等級のものであり、さらに精製せずに用いた。
ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチド (ODN) はIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA)から購入した。ODNの配列を表1に列挙する。表1において、各ODNは「Xpodna-Y-Z」と命名した。ここで、Xは、トリ(tri(3))、テトラ(tetra(4))、ペンタ(penta(5))、ヘキサ(hexa(6))またはオクタ(octa(8))を表し、Yは、各Xpodnaの番号付けを表し(1、2等)、Zは各Xpodnaを構成するODNの番号付けを表す。細胞取り込み研究については、5’-末端をAlexa Fluor 488で標識したODNをJBioS (Saitama, Japan)から購入し、蛍光標識Polypodnaの調製に用いた。
各ODNを5 mM 塩化ナトリウム(NaCl)を含有するTEバッファー (10 mM Tris-HCl, 1 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA), pH 8)に溶解した。混合物を次いで、サーマルサイクラーを用いて95℃で5分、65℃で2分、62℃で1分インキュベートし、そしてゆっくりと4℃まで冷却した。生成物を12 % ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により室温で (約22-25℃)、200 Vにて45分間泳動して分析した。
ODNの溶液(polypodna)に、NaCl 溶液を最終Na+濃度が5-150 mMとなるように添加した。ゲルの形成とゲル強度をゲル強度分析器(ゲル強度計、中山電機、大阪)において測定した。
DNA ハイドロゲルの内部構造を観察するために、それらを2%グルタルアルデヒドを用いて室温で一晩固定し、徐々に上昇する濃度のエタノールを用いて脱水し、そしてエタノールをブチルアルコールに置換し、凍結乾燥した。乾燥した材料をナイフで破断し、DNA ハイドロゲルの内部構造を電界放射型走査電子顕微鏡 (FE-SEM: S4700, HITACHI, Japan)を用いて観察した。
(1−1)DNAからなるハイドロゲルの作成
室温、5mM〜150mM塩化ナトリウム濃度(150mMは、ほぼ生理的濃度)、DNAリガーゼ不含の条件下で、ハイドロゲルになる構造(核酸モノマーおよび推定核酸単位)を明らかにした。この際、核酸単位を構成しうると考えられる核酸モノマーの数を増加することにより、より温和な条件(低塩濃度)でゲル化することも見出した。簡便のため、核酸単位を構成しうる核酸モノマー数に応じて、形成が推定される核酸単位をxxxpodna(xxxpod-like structure forming nucleic acid、xxxには、核酸単位を構成しうる核酸モノマーの数に応じてtri(3)、tetra(4)等が入る)と表記する。下記表2において、xxxpodnaは推定核酸単位、xxx-Y-Nはそれぞれ、その上に標記する核酸単位(xxxpodna)の構成要素となりうる核酸モノマーであり、Yの標記が相異なると、相異なる核酸単位を形成しうることを表し、Nは、各推定核酸単位を構成する核酸モノマーの番号付けを示す。
上記(1−1)とは異なり、それ自身とは接着しない(即ち回文配列ではない)接着性突出末端を有する核酸モノマーを用いることで、ゲル化を制御することが可能である。例えば、下記のtetrapodna(G)とtetrapodna(H)を混合することで、ハイドロゲルが調製可能であった。また、tetrapodna(H)に代えて、2本鎖DNA(dsDNA)でも同様のゲルが調製できた。図4に示す模式図において、上側は、2種類の回文配列ではない互いに相補的な接着性突出末端を有するTetrapodonaを用いたハイドロゲルの形成を示すのに対し(以下のTetrapodona(G)とtetrapodna (H)の混合に対応)、下側は、回文配列ではない接着性突出末端を有するTetrapodna(A)と、当該接着性突出末端に相補的な接着性突出末端を有するdsDNAを用いたハイドロゲルの形成を示す(以下のTetrapodna(G)とdsDNAとの混合に対応)。使用した核酸モノマーを表3に示す。
抗原タンパク質や細胞を内包するハイドロゲルの調製
実施例1により、核酸モノマーを利用した核酸ハイドロゲルの調製が可能となったので、これを利用して、抗原タンパク質や細胞を内包するハイドロゲルの調製を試みた。具体的には、表1に記載のTetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)をDNA濃度0.5mM、NaCl濃度5mMとなるような水溶液を調製し、そこに目的の内封物質(ドキソルビシン、卵白アルブミン、またはRAW264.7細胞)を加え、NaCl濃度を150mMまで上昇させた。その結果、抗原タンパク質や細胞を内包するハイドロゲルの調製が可能となった。図5に得られた内封物質を内包するハイドロゲルの走査型電子顕微鏡写真を示す。
生存細胞のDNAハイドロゲルへの組み込み
サイトメガロウイルス/ニワトリβ−アクチンプロモーターで制御下で強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するeGFPトランスジェニックマウス(5週齢)を日本エスエルシー株式会社(静岡、日本)から購入した。ペントバルビタールを用いた麻酔によってマウスを屠殺し、大腿骨および脛骨から全ての結合組織を除去した。26ゲージ針を用いて、10%加熱不活性化ウシ胎児血清を含有するRPMIで大腿骨および脛骨を洗い流して、骨髄細胞を単離した。40μm細胞ろ過器(BD Falcon、Franklin Lakes、NJ、USA)を通して細胞混合物をろ過し、その後、0.1%塩化アンモニウムの低浸透圧溶液中、室温で5分間インキュベーションして、混入した赤血球を溶解させた。残存細胞を、450×gで10分間、遠心分離機にかけ、ペレットに回収された細胞を骨髄由来細胞(BMDC)として用いた。96ウェルプレート中のそれぞれのウェルに、1×106細胞/ウェルの密度でGFP−BMDCを添加した。
次に、表1中のODN(Hexapodna(8−16−16)−2−01〜06、およびHexapodna(8−16−16)−3−01〜06)を用いて、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中でDNAハイドロゲルを調製した。
そして、350μg/ウェルの最終濃度で、GFP−BMDC−含有ウェルにDNAサンプルを添加した。ハイドロゲルのための2セットのhexapodnaを、ウェル中で混合した。蛍光顕微鏡Biozero(キーエンス、大阪、日本)を用いて蛍光画像を得た。
x−z切片の画像を、図21に示す。図21中、棒および矢印は、hexapodna溶液(上の図)またはDNAハイドロゲル(下の図)の高さを表す。図21に示されるように、細胞は、ハイドロゲル中に組み込まれていた。
ゲル化による核酸の免疫細胞活性化能の増強可能性
CpGモチーフを含むTripodna(配列番号1、2、3)を用いて、図6に示すように、まずアニーリングにより推定Tripodna構造であるY型DNAを作成し(Ys)、次いで、それをさらに4単位アニーリングさせてG1、さらに10単位アニーリングさせてG2の推定構造を有するデンドリマー様DNAを得た。これらを用いて、TNF-α放出刺激能および細胞への取り込み率を調べた。結果を図6に示す。高分子量化することにより、TNF-α放出活性および細胞取り込み率の両方が格段に向上することが理解できる。
実施例1で作成したハイドロゲルは、条件を適当に調節することで、ゾル状態で調製することができる。従って、生体への注射での投与が可能である。図7に示すように、末端に非接着性突出末端を有するコントロールのTetrapodnaおよび、本発明による末端に接着性突出末端を有するTetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)の総DNA濃度2mM、NaCl濃度5mMのゾル状溶液を作成し、それぞれマウスの背中左側および右側の皮下に注射により投与した。結果は、図7および図8−1に示すように、コントロールのTetrapodnaでは生体内でゲルが形成されなかったのに対し、本発明によるTetrapodnaを用いた場合、ゾル状の低塩濃度水溶液からの水分の吸収によるDNA濃度の上昇および生体内の塩濃度への塩濃度の上昇により、投与後、生体内でゲル化することが確認された。これにより、本発明によるハイドロゲルはゾル状態で調製して生体内に投与するだけで、生体内でゲルを形成することが確認された。図8−1には、生体内で形成されたゲルの走査型電子顕微鏡写真も示す。
(4−2−1)シリンジ通過後のDNAハイドロゲルの様子
DNA(hexapodna)およびDNAハイドロゲルの作製には、それぞれ表1の配列のうちの下記のODNを用いた。
DNA (hexapodna): hexapodna (8-16-16)-2-01〜06, hexapodna (8-16-16)-4-01〜06;
DNAハイドロゲル: hexapodna (8-16-16)-2-01〜06, hexapodna (8-16-16)-3-01〜06;
Hexapodna (8-16-16)-2-01〜06、hexapodna (8-16-16)-3-01〜06、hexapodna (8-16-16)-4-01〜06を95℃まで加熱後、徐々に冷却することで、それぞれhexapodna-2、hexapodna-3、hexapodna-4を調製し、ヨウ化プロピジウム(PI)でDNAを染色した。このとき、ODNは1.5M NaClを含むTEバッファー(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8)で溶解し、各ODNの終濃度が0.5mMとなるように調製した。29G針付きシリンジに、hexapodna-2溶液を吸い取り、次いでhexapodna-4(DNA)またはhexapodna-3(DNAハイドロゲル)を吸い、シリンジ内で撹拌した。ゲル化の有無を目視により確認後、DNA溶液またはDNAハイドロゲルをシリンジから押しだした。
図8−2Aに、シリンジ内、および押し出し後のDNA溶液およびDNAハイドロゲルの様子の写真を示す。図8−2Aに示されるように、DNAハイドロゲルは、シリンジからの押し出し後も、ゲル状態であった。
(4−2−2)ゲル粘弾性の測定
ゲル粘弾性測定器(株式会社中山電機製)にゲルの入ったチューブをセットした。測定棒をゲルの上端まで降下させ、その後、測定棒を500μm降下させたときの荷重値を経時的に測定した。測定には、(4−2−1)においてチューブ内で作製したDNAハイドロゲルと、シリンジ内で形成後シリンジから押し出したDNAハイドロゲルを用いた。
粘弾性の結果を図8−2Bに示す。図8−2Bに示されるように、シリンジを通したゲルは、通過前のゲルと同程度の粘弾性を有していた。
(4−2−3)シリンジを通したマウス皮内への投与
(4−2−1)と同様の方法で、PI標識DNA(hexapodna)またはDNAハイドロゲルを29G針付シリンジ内で調製した。ICRマウスをイソフルランで麻酔し、背部を除毛後、皮内に各サンプルを注射投与した。投与3時間後にマウスを屠殺し、背部皮膚を剥がし、投与部位の様子を観察した。
投与3時間後の投与部位の写真を図8−2Cに示す。図8−2Cに示されるように、本発明のハイドロゲルは、シリンジを通した投与後、体内でゲル状態であった。
(4−2−1)〜(4−2−3)の結果から、本発明のハイドロゲルは、チキソトロピー性を有し、ゲル状態でシリンジを通して注射投与しても体内で再度ゲル化するため、ゲル状態でシリンジを通して注射投与できることが明らかになった。
種々の配列の核酸(DNAのみならずRNAも含む)を用いたハイドロゲルの作成
(5−1)免疫学的に活性のゲルおよび免疫学的に不活性なゲルの作成
図9に示すように、CpGモチーフを含まないTetrapodna(4-18-18)(配列番号14、15、16、17)およびCpGモチーフを含むTetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)(図9中、CpGモチーフの存在を下線で示す)を用いて上記のようにしてゲルを作成した。作成したゲルをマウス樹状細胞DC2.4と接触させたところ、CpGモチーフを含まないTetrapodnaにより作成されたゲルは、図9の右側の写真から明らかなようにマウス樹状細胞を免疫学的に刺激せず、CpGモチーフを含むTetrapodnaにより作成されたゲルは、図9の中央の写真から明らかなように、マウス樹状細胞を免疫学的に顕著に刺激した。このことから、本発明の核酸モノマーの配列を制御することにより、具体的にはCpGモチーフを含めることにより、免疫学的に活性のゲルを作成することができることが判明した。また、同様にCpGモチーフを含めないことにより、免疫学的に不活性のゲルを作成することができることも判明した。
図10に示すように、末端に回文配列である4塩基から12塩基の長さの接着性突出末端を含む、Tripodna(4-18-18)(配列番号1、2、3)、Tetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)、Tetrapodna(6-17-17)(配列番号18、19、20、21)、Tetrapodna(8-16-16)(配列番号22、23、24、25)、Tetrapodna(10-15-15)(配列番号26、27、28、29)、Tetrapodna(12-14-14)(配列番号30、31、32、33)、Pentapodna(4-18-18)(配列番号2、3、4、7、8)、Hexapodna(4-18-18)(配列番号2、3、4、7、9、10)を用いてゲルを調製することができることを確認した。図10の下の図は、それぞれTripodna、Tetrapodna、Pentapodna、Hexapodnaのゲル中での推定構造である。
図11に示すように、末端に回文配列ではない、12塩基の長さの接着性突出末端を含むTetrapodna(A) (12-14-14)(配列番号34、35、36、37)を総DNA濃度2mMにて、NaClを濃度150mMにて含む水溶液と、Tetrapodna(A) の接着性突出末端と相補的な12塩基の長さの接着性突出末端を含むTetrapodna(B) (12-14-14)(配列番号38、39、40、41)を総DNA濃度2mMにて、NaClを濃度150mMにて含む水溶液を調製した。これらTetrapodna(A)およびTetrapodna(B)は、DNA濃度および塩濃度を上昇させても、単独ではゲルを形成することができないが、それぞれの水溶液を混合して最終DNA濃度2mMおよびNaCl濃度150mMとした場合、ゲルが形成された。図11の右下に示すように、Tetrapodna(A) およびTetrapodna(B)はそれぞれ単独ではゲルを形成せず、これらを単に混合することによってゲルを形成することができた。
図12に示すように、末端に回文配列ではない、12塩基の長さの接着性突出末端を含むTetrapodna(A) (12-14-14)(配列番号34、35、36、37)を総DNA濃度2mMにて、NaClを濃度150mMにて含む水溶液と、Tetrapodna(A)の接着性突出末端と相補的な12塩基の長さの接着性突出末端を含むdsDNA(12-14)(配列番号42および43)を総DNA濃度1mMにて、NaClを濃度150mMにて含む水溶液を調製した。これらTetrapodna(A)およびdsDNAは、DNA濃度および塩濃度を上昇させても、単独ではゲルを形成することができないが、それぞれの水溶液を単に混合して最終DNA濃度1.5mMおよびNaCl濃度150mMとした場合、ゲルが形成された。図12の右下に示すように、Tetrapodna(A) およびdsDNAはそれぞれ単独ではゲルを形成せず、これらを単に混合することによってゲルを形成することができた。
図13に示すように、本発明のxxxpodna、例えばtetrapodnaにデコイDNAや、siRNAを含めることにより、核酸医薬としての機能をゲル内部あるいは末端部位に有する核酸からなるハイドロゲルも作成可能である。このように、DNA、RNAをはじめ種々の核酸配列を利用することにより、本発明のゲルの機能を改変することができる。
免疫学的に活性なゲルに卵白アルブミン(OVA)を内包させたゲルを用いた免疫応答の増強
図14に示すように、コントロールとしてOVA100μgを含むゾル状水溶液(OVA濃度2.5μg/μl、NaCl濃度5mM)、または、OVA100μgに加えて、本発明のTetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)を100μg含むゾル状水溶液DNA(OVA濃度2.5μg/μl、NaCl濃度5mM、総DNA濃度2mM)をそれぞれマウスに注射し(0d免疫)、免疫14日目に脾臓を摘出し、得られた脾細胞をOVAで刺激してIFN-γの産生を測定した。図14の右側に示すように、コントロールのOVAのみ投与したマウスからの脾細胞と比較して、本発明のTetrapodnaをOVAと共に投与したマウスからの脾細胞では、IFN-γの産生量が格段に上昇していた。これにより、本発明のTetrapodnaから形成されるゲルの免疫応答の増強効果が示された。
ゲルの内部構造の調節
図15に、本発明の核酸単位、Tripodna、Tetrapodna、PentapodnaおよびHexapodnaを形成しうる核酸モノマーから得られるゲル内部の推定立体構造を示す。図15から理解されるように、核酸単位を構成しうる核酸モノマーの数が多いほど、即ち、TripodnaよりもHexapodnaの方が、より複雑なゲルの内部構造をとると推定される。また、接着性突出末端の長さによってもゲルの構造が調整できる。
ゲルの内部構造の調節によるゲル強度の調節
(8−1)DNA濃度の調節
Tetrapodna(12-14-14)(配列番号30、31、32、33)を、DNA濃度として0.1mM、0.25mM、または0.5mM含む水溶液の、NaCl濃度を150mMとすることによりゲルを形成させ、時間の経過と共に残存するゲルのパーセンテージを測定した。結果を図17の左上のグラフに示す。横軸は時間の経過を示す。低濃度のDNA(0.1mM)では25%程度しかゲルとならず、DNA濃度を0.25mMに上昇させることにより最初のゲルのパーセンテージは上昇したが、時間の経過と共に残存するゲルのパーセンテージは低下した。一方、高濃度のDNA(0.5mM)では、最初のゲルのパーセンテージがほぼ100%であり、時間と共にわずかにゲルのパーセンテージが低下したのみであった。これにより、塩濃度が一定の場合、DNA濃度が高いほど、ゾルではなくゲルとして存在しやすい傾向があることが判明した。
様々な接着性突出末端の長さ(4、6、8、10または12塩基)を有するTetrapodna(それぞれ、配列番号2、4、5、6、配列番号18、19、20、21、配列番号22、23、24、25、配列番号26、27、28、29、配列番号30、31、32、33)を用いて一定DNA濃度(0.5mM)および一定NaCl濃度(150mM)の条件でゲルを形成させ、時間の経過と共に残存するゲルのパーセンテージを測定した。結果を図17の左下のグラフに示す。横軸は時間の経過を示す。接着性突出末端の長さが短い(4塩基)場合、時間の経過と共にゲルがゾル化し、12時間経過後では残存ゲルのパーセンテージがほぼ50%となった。一方、接着性突出末端の長さが長い(6、8、10または12塩基)場合、最初のゲルのパーセンテージがほぼ100%であり、時間と共にわずかに残存ゲルのパーセンテージが低下したのみであった。これにより、DNA濃度、塩濃度が一定の場合、接着性突出末端の長さが長いほど、ゾルではなくゲルとして存在しやすい傾向があることが判明した。
Tetrapodna(12-14-14)(配列番号30、31、32、33)を、DNA濃度として0.5mM含む水溶液の、NaCl濃度を様々に変えることにより(5mM、50mM、100mMまたは150mM)、ゲルを形成させ、時間の経過と共に残存するゲルのパーセンテージを測定した。結果を図17の右上のグラフに示す。横軸は時間の経過を示す。低塩濃度(5mM)では、約6時間経過すると形成されたゲルのほとんどがゾル化し、塩濃度を50mMに上昇させると、ゾル化の傾向は弱まり、より穏やかにゲルからゾルへと変化した(12時間経過にて約40%)。一方、高塩濃度(100mMまたは150mM)では、最初のゲルのパーセンテージがほぼ100%であり、時間と共にわずかに残存ゲルのパーセンテージが低下したのみであった。これにより、DNA濃度が一定の場合、塩濃度が高いほど、ゾルではなくゲルとして存在しやすい傾向があることが判明した。
Tetrapodna(12-14-14)(配列番号30、31、32、33)の代わりに、Tetrapodna(4-18-18) (配列番号2、4、5、6)を用いることの他は、(8−3)と同様にして時間の経過と共に残存するゲルのパーセンテージを測定した。結果を図17の右下のグラフに示す。横軸は時間の経過を示す。(8−3)と同様に、DNA濃度が一定の場合、塩濃度が高いほど、ゾルではなくゲルとして存在しやすい傾向があることが判明した。また、(8−3)ではTetrapodna(12-14-14)(接着性突出末端の長さが12塩基)に対して(8−4)では、Tetrapodna(4-18-18) (接着性突出末端の長さが4塩基)を用いたが、これらを比較すると、DNA濃度および塩濃度が同じ場合、接着性突出末端の長さが長いほど、ゾルではなくゲルとして存在しやすい傾向があることが判明した。
ゲルの内部構造、ゲル化の程度およびゲル強度の制御による、ゲルの内封化合物の放出速度の制御
Tetrapodnaの突出末端の性質と塩濃度の制御により、ゲルの内封化合物の放出速度がどのように変化するかを調べた。具体的には、接着性突出末端を有するTetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)およびコントロールとして非接着性突出末端を有するTetrapodna(4-18-18)(配列番号58、59、60、61)を用いた。これらTetrapodnaを0.5mMのDNA濃度となるように調製した水溶液のNaCl濃度を、5mMまたは150mMに調整した。NaCl濃度を上昇させる際に、内封物質として卵白アルブミン(OVA、濃度2.5μg/μl)を加え、ゲル化させた後、時間の経過とともにゲルから放出されるOVAのパーセンテージを測定した。結果を図18のグラフに示す。コントロールの非接着性突出末端を有するTetrapodnaでは、ほとんどゲル化がみられず、最初からOVAがほぼ100%放出された。一方、NaCl濃度5mMで接着性突出末端を有するTetrapodnaを用いて作成されたゲルからは急速にOVAが放出され短時間ですべてのOVAが放出された。それに対してNaCl濃度150mMで接着性突出末端を有するTetrapodnaを用いて作成されたゲルからは、OVAが緩やかに放出され、24時間で約60%のOVAが放出された。
修飾基を有する核酸の利用
修飾基を有する核酸の利用可能性を調べるために、コレステロールにより修飾されたDNAを用いたTetrapodnaを調製した。図19に示すように、コレステロール修飾された核酸モノマーを含み、かつ、核酸中にCpGモチーフを含むTetrapodna(配列番号2、4、5、6:図19中Chol-CpG DNAと示す)またはコレステロール修飾されていない同様のTetrapodna(配列番号2、4、5、6:図19中、CpG DNAと示す)を含む溶液を、アトピー性皮膚炎モデルマウスに塗布した。また、RAW264.7細胞によるそれぞれのTetrapodnaの取り込みを測定した。図19の右下に示すように、コレステロール修飾を有するTetrapodnaは、コレステロール修飾を有さないコントロールのTetrapodnaと比較して、組織移行性が増大しており、マウスの皮膚の炎症がよりよく抑制された。また、図19の左下のグラフに示すように、コレステロール修飾を有するTetrapodnaは、コレステロール修飾を有さないコントロールのTetrapodnaと比較してより良好にRAW264.7細胞に取り込まれた。
ゾルの鼻腔内投与によるゲルの形成
Tetrapodna(G)(12-14-14)(配列番号34、35、36、37)を総DNA濃度として2mM、NaClを150mMを含むゾル状水溶液と、Tetrapodna(H)(12-14-14) (配列番号38、39、40、41)を総DNA濃度として2mM、NaClを150mM含むゾル状水溶液をマウスの鼻腔内へ同時に投与した。結果を図20に示す。鼻腔内に投与することにより、塩濃度が上昇し、ゾル状水溶液がゲル化し、鼻腔内にゲルが良好に付着することが判明した。
ゲルを形成する塩濃度および核酸濃度条件の検討
以上により、ゲルを形成するか否かには、DNA濃度、塩濃度および接着性突出末端の長さ(塩基数として以下、Xと表す)が重要な因子であることが明らかとなった。そこで、ゲルの形成条件をより詳細に評価することを試みた。
(1)ゾルとして維持される条件:Xの関数として、
NaCl濃度=80mM/x以下、かつ、
DNA濃度=0.3mM+1.6/xmM以下
(2)ゲルとして維持される条件:Xの関数として、
NaCl濃度=640mM/x−60mM以上、かつ、
DNA濃度=3.2/xmM以上。
即ち(1)の条件を満たすようなゾル状溶液のDNA濃度およびNaCl濃度を(2)の条件を満たすようにそれぞれ上昇させることにより、ゲル化が起こると考えられる。
ゲルを形成する温度条件の検討
さらにゲル化には温度条件も関与している可能性を検討した。Tetrapodna(4-18-18)(配列番号2、4、5、6)、Hexapodna(4-18-18)(配列番号2、3、4、7、9、10)、およびTetrapodna(8-16-16)(配列番号22、23、24、25)を用い、NaCl濃度を150mMにて固定し、DNA濃度を様々に変更し、どのような温度条件でゲルとして存在するかあるいはゾルとして存在するかを調べた。
リガーゼを用いて調製したゲルとの特性の比較:
(14−1)リガーゼを用いないDNAハイドロゲルの調製:
表1に示すTetrapodna(8−16−16)−1−01〜04を、1.5M NaClを含むTEバッファー(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8)で溶解し、各ODNの終濃度が0.5mMとなるように調製した。各ODN混合物を、95℃まで加熱後、徐々に冷却することでDNAハイドロゲルを得た。
以下の表6に示すP−tetrapodna(4−18−18)−1−01〜04(表1中の配列の5’末端にリン酸基が付されたもの)を、50mM NaClを含むTEバッファー(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8)で溶解し、各ODNの終濃度が0.75mMとなるように調製した。各ODN混合物を、95℃まで加熱後、徐々に冷却することでP−tetrapodnaを得た。生成物にT4DNAリガーゼ(200ユニット;Promega、WI、USA)とライゲーションバッファー(300mM Tris−HCl、100mM MgCl2、100mM DTT、10mM ATP)を加え、16℃で16時間反応させ、DNAハイドロゲル(リガーゼ使用)を得た。
得られたゲルまたは溶媒をチューブに入れ、ゲル粘弾性測定器(株式会社中山電機製)にセットした。測定棒をゲルの上端まで降下させ、その後、測定棒を500μm降下させたときの荷重値(重量)を経時的に測定した。
結果を図22に示す。図中のピーク値は、ゲルの固さに対応するパラメータである。同じDNA濃度条件では、自己ゲル化核酸を用いて調製したDNAハイドロゲルのほうが高値を示した(約1600mgと約400mg)。リガーゼを用いない自己ゲル化核酸は、リガーゼを用いて作製するDNAハイドロゲルよりも強固であることが明らかになった。また、図22中の緩和曲線の傾きは、ゲルの粘弾性に対応するパラメータである。自己ゲル化核酸を用いて調製したDNAハイドロゲルのほうが緩やかであり、粘弾性に優れることが明らかになった。リガーゼを用いて作製したDNAハイドロゲルは、もろいものであった。
3〜12のpodを有するpolypodna調製物のPAGE分析:
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、ssDNA、dsDNAおよび各poolypodna調製物を調製し、20分間、200Vで6%ポリアクリルアミドゲル上にそれぞれを泳動した。
結果を図23に示す。図23AおよびBにおける各レーンと、泳動物の対応を以下の表7に示す。
図23Bのレーン2〜5は、30、60、または90ヌクレオチドからなるtripodnaについてのPAGE分析を示す。tripodna中のODN長が増えることで泳動度は高くなった。泳動度は、polypodna調製物中の塩基数によって変わるようである。240塩基からなる各種のpolypodnaの泳動度(図23B、レーン6〜8)はほぼ同じであった。このことから、泳動度がヌクレオチド数に依存するものであり、立体構造には依存しないと考えられる。
CDスペクトル(円二色性スペクトル):
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、dsDNA36、A36、(CG)6、および各poolypodna調製物を調製した。5mM塩化ナトリウムを含有するTEバッファーで、アニーリング後の各DNAサンプルを、最終DNA濃度25μg/mlまで希釈した。そして、25℃で0.1cm経路長の石英セルを用いて4℃でJASCO−820型分光偏光計(JASCO、東京、日本)を用いて、DNAのCDスペクトル(円二色性スペクトル)を記録した。DNAのCDスペクトル(円二色性スペクトル)は、200nmから320nmの範囲で計測した。比較を促すために、モル楕円率が得られるように、CDスペクトル(円二色性スペクトル)につき、バックグラウンド除去、平滑化、および濃度調整を行った。
結果を図24に示す。dsDNA36の場合、280nmおよび240nm近辺にそれぞれ陽性および陰性ピークが観察された。これは、B型DNAの典型的なスペクトルである。全てのpolypodnaは、dsDNA36と同様のピークを示した(図24A)。図24Bにおける(CG)6のスペクトルは、Z型DNAの典型である。hexapodna36は、これと異なるピークを示した。これらのことから、各polypodnaは、二本鎖DNAの通常条件下での構造であるB型DNA構造をとることが明らかになった。
Tm値および見かけのサイズ:
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、各DNA調製物を調製した。TMSPC−8温度調節器18を備えた島津UV−1600PC分光計(京都、日本)を用いて、260nmでpolypodnaまたは他のDNA調製物の吸光度を計測した。5mMのナトリウム濃度での融解曲線から、それぞれについての融解温度(Tm)を求めた。
また、20℃でMalvern Zetasizer 3000HS(Malvern Instruments、Malvern、UK)を用いて動的光散乱法により、それぞれのpolypodnaの見かけのサイズを測定した。計測を少なくとも3回繰り返し、結果を、再現可能な結果の平均±標準誤差(S.E.)として表した。サイズの結果は、3つ(tripodna36、tetrapodna36、pentapodna36、hexapodna36、tripodna80、tetrapodna60、pentapodna48、hexapodna40)または6つ(octapodna36、tripodna60、tripodna90)の計測の平均±SEとして表した。
それぞれの結果を表8に示す。
また、表8に示されるように、ODN長が30から90に増えると、tripodna調製物の見かけのサイズが増すことが明らかになった。240塩基を有するpolypodna(Tripodna80、Tetrapodna60、Pentapodna48、Hexapodna40)のサイズも、ODN長に依存した。36merのODNからなるpolypodna調製物については、pod数が増えると、そのサイズは、わずかに増えた。これは、pod数が多い調製物では、塩基のスタッキング(stacking)が減少し、構造が膨張したためであろうと推測される。
血清中のPolypodnaの安定性:
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、各poolypodna調製物を調製した。RPMI1640培地で希釈した20%マウス血清とともに、37℃で10μg/100μlの濃度で、各Polypodna調製物をインキュベートした。インキュベーションの0、2、4、8、12または24時間後、サンプル溶液の10μlアリコートを、プラスチックチューブに移し、20μlの0.5M EDTA溶液と混合して分解を停止させ、使用まで−20℃で保存した。これらのサンプルを、4℃で12%PAGEに泳動し、SYBR Gold(Molecular Probes、Eugene、OR、SA)で染色した。Multi Gauge software(富士フィルム、東京、日本)を用いてDNAバンドの密度を定量的に評価した。
結果を図25A〜Dに示す。これらの実験は、3回行い、同様の結果が得られた。図25AおよびCは、1つの代表的なゲルである。図25AおよびBに示されるように、tripodnaのpod長が長いほど、分解率が高いことが明らかになった。また、図25CおよびDに示されるように、pod数が多いほど、マウス血清中での安定性は低いことが明らかになった。これは、DNAが、体液中では主にエキソヌクレアーゼで分解されるため、pod数が多く末端数が多いとDNAは分解されやすいためであろうと推測される。
局所リンパ節へのDNAハイドロゲルの移行:
表1におけるHexapodna(8−16−16)−2−01を32Pで末端標識した。すなわち、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(T4 PNK;タカラバイオ、大津、日本)を用いて、37℃で30分間、ODNを、γ−32P ATPと反応させ、80℃で12分間加熱してT4 PNKを変性させた。NAP5カラム(GEヘルスケア、東京、日本)を用いて標識産物を精製した。トレーサー量の32P−hexapodna(8−16−16)−2−01および以下の表9に示す他のODNを用いて32P−標識サンプルを調製した。
次に、サンプルに100μlの5M塩化水素溶液および5mlのClear−sol I(ナカライテスク株式会社、京都、日本)を添加した。サンプルの放射線を、Tri−Carb 3110TR液体シンチレーション分光計(パーキンエルマー、Norwalk、CT、USA)で計数した。結果を、サンプルごとの放射線の注入量のパーセンテージとして計算し、3匹のマウスの平均±S.D.として表す。
結果を図26に示す。図26に示されるように、DNAハイドロゲルは、hexapodnaやssDNAよりも長く注入部位に残り、長期間をかけて局所リンパ節に移行することが明らかになった。このことは、DNAハイドロゲルの徐放性の高さを裏付ける。
DNAハイドロゲルの崩壊、DNAハイドロゲルからのDXR放出、およびマウスにおける腫瘍増殖:
表1に示すODN(hexapodna(8−16−16)−2−01〜06、およびhexapodna(8−16−16)−3−01〜06)を用いて、実施例1と同様にしてDNAハイドロゲルを調製した。
ドキソルビシン(DXR)/DNAハイドロゲルを調製するため、Mili−Q水中でDXRを注射器に添加し、2つのhexapodna調製物を、連続的にDXRに添加した。室温での1時間のインキュベーションの後、混合物をDXR/DNAハイドロゲルとして用いた。DXRおよびDNAの混合率を、1:40重量率に固定した。
DXR/DNAハイドロゲル(300μg/10μl)に、10μl生理食塩水または20%マウス血清を添加し、37℃でインキュベートした。所定の時間経過後に、サンプルを採取した。2000×gでの5秒間の遠心分離の後、上清を採取し、分光光度計(UV−1600、島津、日本)およびマルチラベルカウンター(ARVOTM MX 1420、Wallac、Finland)で、それぞれ485および560nmの励起および発光波長で、DNAの吸光度およびDXRの蛍光を測定し、それぞれ、DNAおよびDXRの濃度を推定した。
結果を図27の左上図および左下図に示す。DNAハイドロゲルは、生理食塩水中よりもマウス血清中で早く分解した(図27左上)。また、DNAハイドロゲル中DXRは、マウス血清中において、生理食塩水よりも多く放出された(図27左下)。
表1に示すODN(hexapodna(8−16−16)−2−01〜06、およびhexapodna(8−16−16)−3−01〜06)を用いて、実施例1と同様にしてハイドロゲルを調製し、上と同様にしてDXR/DNAハイドロゲルを調製した。一方、Colon26/Luc細胞(5×105細胞/マウス)をBALB/cマウスの背面皮膚に接種した。そして、腫瘍接種の9日後、生理食塩水、DXR(7.5μg/マウス)、DNAハイドロゲル(300μg/マウス)、またはDXR/DNAハイドロゲル(7.5μgDXRおよび300μgDNA/マウス)をマウスの腫瘍内に注入した。キャリパーを用いて定期的に腫瘍サイズを測定した。
結果を図27の右図に示す。DXRは、DNAハイドロゲル中に含めることで、高い腫瘍増殖抑制能を示すことが明らかになった(図27の右図)。
IL−6誘導:
表1に示す配列のうち、以下の表10のODNを用いて、DNAサンプルを調製した。
続いて、上清を採取し、計測まで−80℃で保存した。製造者のプロトコール(BD Biosciences、San Diego、CA、USA)にしたがい、IL−6の濃度を酵素結合免疫測定法(ELISA)によって測定した。
結果を図28に示す。図28に示されるように、ハイドロゲルの状態のCpGDNAは、一本鎖やhexapodnaのCpGDNAよりも、高い免疫刺激性を示すことが明らかになった。
DNA調製物によるRAW264.7細胞からのサイトカイン放出:
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、各サンプルを調製した。
10%加熱不活性化FBS、0.15%重炭酸ナトリウム、100ユニット/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、および2mML−グルタミンを添加したRPMI1640培地において、5%CO2を含有する加湿空気中、37℃でネズミマクロファージ様細胞RAW264.7を増殖させた。続いて、24ウェルまたは96ウェル培養プレート上に、5×105細胞s/mlの密度で細胞を撒き、使用に先立ち24時間培養した。
2.5×105細胞/ウェルの密度でRAW264.7細胞を24ウェルプレートに撒き、処置前に24時間インキュベートした。そして、0.5mlOpti−MEM中に希釈したssDNA、dsDNA、または数種類のpolypodnaを、0.5、1または2μg/mlの最終濃度で細胞に添加した。細胞を、8時間インキュベートし、上清を回収し、使用まで−70℃で保存した。OptEIATMセット(Pharmingen、San Diego、CA、USA)を用いる酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって、上清中のTNF−αおよびIL−6の濃度を測定した。
結果を3つの測定の平均±SDとして表し、図29に示す。データは、4つ(TNF−α)または2つ(IL−6)の独立の実験の代表である。図中の*は、値が検出限界を下回ったことを示す。ssDNA、dsDNAの場合には、ほとんどTNF−α放出がなかった。これに対し、polypodna調製物は、DNAの濃度依存的に、RAW264.7細胞からのサイトカイン放出を誘導した(図29A)。また、pod数が多いと、TNF−α放出量が増えることも明らかになった。同様の結果は、IL−6放出についての図29Bにも示される。このことから、polypodna調製物は、pod数が多いほど、CpGDNAの免疫刺激活性が高くなることが明らかになった。
polypodna調製物によるRAW264.7細胞からのTNF−α放出:
表1中の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、各poolypodna調製物を調製したほかは、実施例22と同様の実験を行った。但し、添加したDNAは、それぞれの場合で等量にした。
結果を、3つの測定の平均±SDとして、図30に示す。データは、4つ(図30A)または3つ(図30B)の独立の実験の代表である。図中の*は、値が検出限界を下回ったことを示す。図30Aに示されるように、tripodnaにおいてヌクレオチド数が増えると、TNF−α放出も増えた。また、図30Bに示されるように、240ヌクレオチドからなるpolypodna調製物のうち、hexapodna40が、最も高いTNF−α放出を示した。これらのことから、pod数を増大させることが、CpGDNAの免疫刺激活性を増大させるために有効であることが分かった。
RAW264.7細胞におけるDNAの取り込み:
表1中の配列を用いて、前述の材料および方法、ならびに実施例1と同様の方法によって、Alexa Fluor 488−標識DNAサンプルを調製した。96ウェルプレート上で5×104細胞/ウェルの密度でRAW264.7細胞を、Alexa Fluor 488−標識ssDNA、dsDNA、またはpolypodnaとともに、37または4℃で8時間、インキュベートした。その後、200μlリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で二度細胞を洗浄し採取した。そして、CellQuestソフトウェア(version 3.1、BD Biosciences)を用いて、フローサイトメトリー(FACS Calibur、BD Biosciences、NJ、USA)によって細胞の平均蛍光強度(MFI)を測定した。
結果を図31Aに示す。平均蛍光強度は、octapodna、hexapodna、pentapodna、tetrapodna、tripodnaの順に高く、細胞放出は、サイトカイン放出の場合と同傾向であった。このことから、pod数が増えれば、サイトカイン誘導が増えることがわかった。
DNA取り込みの蛍光顕微鏡観察:
RAW264.7細胞を、13mm直径ガラスカバースリップ上に撒き、24時間インキュベートした。培養培地を、Alexa Fluor 488−標識hexapodna36を含有するOpti−MEMに置換した。37℃での3時間のインキュベーションの後、細胞を、PBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、再び、PBSで3回洗浄した。そして、核を染色するために、60nMの4’,6−ジアミノ−2−フェニルインドール(DAPI)を加え、10分のインキュベーションの後に、PBSで3回洗浄した。そして、カバースリップをSlowFade(登録商標)Gold(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)でガラススライド上に載せ、蛍光顕微鏡(Biozero BZ−8000、キーエンス、大阪、日本)を用いて観察した。
結果を図31B〜Eに示す。図中、Bは、DAPI染色、Cは、Alexa Fluor 488−標識hexapodna36、Dは、重ね合わせ画像、Eは、明視野を示す。図31B〜Eに示すように、蛍光シグナルは、細胞内で点状に検出された。このことから、細胞取り込みは、エンドサイトーシスにより行われることが示唆された。
TLR9依存的活性化:
表1の配列のうち、配列番号86〜95の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、DNAサンプルを調製した。
その後、10%加熱不活性化FBS、0.2%重炭酸ナトリウム、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mML−グルタミン、0.5mMモノチオグリセロール、および100ng/mlマウス組換えFlt−3リガンド(Peprotech、Rocky Hill、NJ、USA)を補充したRPMIに、5×106細胞/mlの密度で8日間、残存細胞を培養した。5%CO2含有加湿空気において、37℃で細胞を増殖させた。培養の7日目、非接着性細胞を採取し、これをBMDCとして用いた。サイトカイン放出実験のために、細胞を、3×105細胞/ウェルの密度で96ウェル培養プレート上に再プレートした。細胞を、2μg/mlのssDNA(Tripodna(0−18−18)−1−02)またはpolypodnaとともに24時間インキュベートした。その後、培養上清を採取し、酵素結合免疫測定法(ELISA)に用いるまで−80℃で保存した。マウスIL−6の濃度を、OptEIATMセット(Pharmingen、San Diego、CA、USA)を用いて測定した。
結果を図32に示す。CpGを含むpolypodnaで調製したハイドロゲルによるIL−6放出は、TLR9依存的であることが明らかになった。
単球依存的polypodna取り込み:
表1の配列のうち、配列番号96〜104の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、DNAサンプルを調製した。
結果を図33に示す。polypodnaの取り込みは、単球によるものであることが明らかになった。
IL−6 mRNA発現の誘導:
表1中の配列のうち、以下の表11に示されるODNを用いて、実施例1と同様の方法によって、各DNAサンプルを調製した。
OVA/CpGDNAハイドロゲルによる適応免疫反応の誘導:
(28−1)血清サンプルの採取
表1の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、DNAサンプルを調製した。イソフルランでの麻酔下、200μgDNAサンプルおよび50μgOVA(10μl/投与)、または50μgOVA(20μl/投与)を含有する完全フロインドアジュバント(CFA)を、C57BL/6マウスの背面皮膚に注入した。0、7、および14日目の3回、マウスに免疫付与した。最後の免疫付与の7日後、マウスを屠殺し、血清および脾臓を採取した。血清サンプルを計測まで−80℃で保存した。
(28−2)OVA−特異的IgG:
ELISAによってOVA特異的総IgGレベルを測定するために、血清サンプルを連続的に希釈した。すなわち、4℃で8〜16時間、96ウェル平底プレートをOVA(1mg/ml)で被覆した。そして、5%BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水(T−PBS)中の0.5w/w%Tween−20でウェルをブロックした。T−PBSでの洗浄の後、希釈した100μl血清サンプルを連続的にそれぞれのウェルに添加した。37℃での2時間のインキュベーションの後、T−PBSで5回、ウェルを洗浄し、そして、5%BSA−含有T−PBSで3000:1に希釈した100μlのanti−IgG−HRP conjugate(Sigma、St.Louis、MO、USA)を、それぞれのウェルに添加した。37℃での1時間のインキュベーションの後、それぞれのウェルを、T−PBSで洗浄し、その後、クエン酸リン酸塩緩衝液(pH5)中の20μl過酸化水素を含有する200μlの新たに調製したo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬工業株式会社、大阪、日本)溶液を、それぞれのウェルに添加した。インキュベーションの4分後、50μlの1M硫酸を添加し、その後、490nmで吸光度を測定した。
結果を図35の左図に示す。ハイドロゲルにすることによって、IgG力価が上昇することが明らかになった。
(28−3)脾臓細胞からのIFN−γ:
最後の免疫付与の7日後、機械的解剖によって、脾臓細胞を単離した。混入した赤血球を1.5M塩化アンモニウムで溶解した。OVA(1mg/ml)の存在下で、5×106細胞/mlの密度で、96ウェル培養プレート中で、4日間、脾臓細胞を培養した。上清を採取して、計測まで−80℃で保存した。製造者のプロトコールに従って、ELISAによって、IFN−γの濃度を測定した(Ready−SET−Go! mouse IFN−γ ELISA、eBioscience、San Diego、CA、USA)。
結果を図35の中央図に示す。ハイドロゲルにすることによって、IFN−γの濃度が上昇することが分かる。
(28−4)CTLアッセイ:
最後の免疫付与の7日後、機械的解剖によって、脾臓細胞を単離した。1.5M塩化アンモニウムで混入赤血球を溶解した。CTLを準備するために、37℃で5%CO2中で5日間、マイトマイシンCで処理した5×106EG7−OVA細胞とともに脾細胞(5×107細胞)を共培養した。標的細胞、すなわち、EG7−OVAおよびEL4を、51Cr−標識クロム酸ナトリウム(Na2 51CrO4、富士フイルムRIファーマ、東京、日本)で標識した。ブーストした脾細胞を、連続的に希釈し、37℃で4時間、標的細胞とともに共インキュベートした。エフェクター細胞(脾細胞)なしの、および1%Triton−Xありのインキュベーションから、それぞれ、51Crの自然放出および最大放出を評価した。上清の放射線をガンマ計数器で測定した。特異的溶解のパーセンテージを、次の方程式にしたがって計算した:
特異的溶解の% = (観察放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)
結果を図35の右図に示す。一本鎖の状態や核酸単位(polypodna)の状態で用いた場合よりも、ハイドロゲルの場合には、特異的溶解が高いことが分かる。
副作用:
表1の配列を用いて、実施例1と同様の方法によって、DNAサンプルを調製した。
イソフルランでの麻酔下、C57BL/6マウスの背面皮膚に、200μgDNAサンプルおよび50μgOVA(10μl)、50μgOVA(10μl)を含有するCFA、または100μgAlumおよび50μgOVA(20μl)を注入した。注入の7日後、注入部位を含む皮膚を摘出し、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに組み込み、薄切りにして5μm切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色したサンプルを、組織学的評価のために、顕微鏡(Biozero BZ−8000、キーエンス、大阪、日本)下で、観察した。上述のように1週間間隔での第三の免疫付与の7日後、異なる組のC57BL/6マウスから脾臓を採取した。脾臓の重量を測定し、脾腫を評価した。
結果を図36に示す。図36の左図に示すように、ハイドロゲルの場合には、注入部位への免疫細胞の浸潤が少なく、局所的な副作用が少ないことが明らかになった。また、図36の右図に示すように、ハイドロゲルの場合には、脾臓の肥大化が小さく、全身性の副作用も少ないことが明らかになった。
Claims (19)
- 1種の核酸単位または2種以上の核酸単位から形成される、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのゾル状組成物であって、接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる3種以上のオリゴヌクレオチドの混合物を、0.3mM+1.6/x(突出末端部塩基数)mM以下の核酸濃度で含有し、核酸連結酵素を含有せず、NaCl濃度に換算して80mM/x(突出末端部塩基数)以下の塩濃度で塩を含有する、核酸連結酵素を含有しないゾル状組成物:
[ここで、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部は、少なくとも1つの別の種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成し、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成し、
核酸ゲルが1種の核酸単位から形成される場合、核酸単位は3種以上のオリゴヌクレオチドから形成され、核酸ゲルが2種以上の核酸単位から形成される場合、少なくとも1種の核酸単位は3種以上のオリゴヌクレオチドから形成される]。 - 接着性突出末端が回文配列構造を含む請求項1に記載のゾル状組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの1種以上が、CpGモチーフを含む、請求項1または2に記載のゾル状組成物。
- 前記核酸単位を形成するオリゴヌクレオチドの種類数が2〜8種である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のゾル状組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のゾル状組成物中の、核酸濃度を3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度をNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上にそれぞれ上昇させることにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
- 接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる3種以上のオリゴヌクレオチドの混合物を、0.3mM+1.6/x(突出末端部塩基数)mM以下の核酸濃度で含有し、NaCl濃度に換算して80mM/x(突出末端部塩基数)以下の塩濃度で塩を含有し、核酸連結酵素を含有しない第1のゾル状組成物:
[ここで、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する]、および
接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる2種以上のオリゴヌクレオチドの混合物を、0.3mM+1.6/x(突出末端部塩基数)mM以下の核酸濃度で含有し、NaCl濃度に換算して80mM/x(突出末端部塩基数)以下の塩濃度で塩を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物:
[ここで、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する]
を別々に含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成するためのキットであって、
該第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
該第2のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
該第1の配列と該第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する、キット。 - 第2のゾル状組成物が2種のオリゴヌクレオチドの混合物を含有する、請求項6記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドの1種以上が、CpGモチーフを含む、請求項6または7に記載のキット。
- 前記第1または第2のゾル状組成物に含まれるオリゴヌクレオチドの種類数が、2〜8種である、請求項6〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 請求項6〜9のいずれか1項に記載のキットにおける、第1のゾル状組成物と第2のゾル状組成物とを、核酸濃度が3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度がNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上となる条件下で混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
- 接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる3種以上のオリゴヌクレオチドを含み、かつ、核酸連結酵素を含有しない、チキソトロピー性を有する核酸ゲル:
[ここで、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部は、少なくとも1つの別の種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成しており、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成している]。 - 請求項5または10に記載の方法において、ゲルの形成前にゲルに封入させるべき内封物質をゾル状組成物に添加することを含む、内封物質を封入し、かつ、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
- 内封物質が、低分子化合物、タンパク質、および細胞から選択される、請求項12に記載の方法。
- 接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる3種以上のオリゴヌクレオチドを含み、内封物質を含有し、かつ、核酸連結酵素を含有しない、チキソトロピー性を有する核酸ゲル:
[ここで、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部は、少なくとも1つの別の種のオリゴヌクレオチドにおける接着性突出末端部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成しており、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成している]。 - 前記オリゴヌクレオチドの1種以上が、CpGモチーフを含む、請求項11または14に記載の核酸ゲル。
- 2〜8種のオリゴヌクレオチドから形成される核酸単位を含む、請求項11、14および15のいずれか1項に記載の核酸ゲル。
- 前記オリゴヌクレオチの1種以上がCpGモチーフを含むことを特徴とする、免疫アジュバントを作成するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載のゾル状組成物。
- 請求項11および14〜16のいずれか1項に記載の核酸ゲルを含む、免疫アジュバントであって、前記オリゴヌクレオチドの1種以上がCpGモチーフを含むことを特徴とする免疫アジュバント。
- 接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる3種以上のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第1のゾル状組成物、および接着性突出末端部と相補的塩基配列部よりなる2種以上のオリゴヌクレオチドの混合物を含有し、核酸連結酵素を含有しない第2のゾル状組成物:
[ここで、第1および第2のゾル状組成物中、
接着性突出末端部は、4以上のヌクレオチド長の一本鎖部分であり、相補的塩基配列部は、8以上のヌクレオチド長であり、
1種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部は、別の種のオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基配列部と生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成し、
第1のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第1の配列を含み、
第2のゾル状組成物中のオリゴヌクレオチドの接着性突出末端部が第2の配列を含み、かつ、
第1の配列と第2の配列が互いに生理条件下で体温以上の融解温度を示す二本鎖配列を形成する]
を、核酸濃度が3.2/x(突出末端部塩基数)mM以上、塩濃度がNaCl濃度に換算して640mM/x(突出末端部塩基数)−60mM以上となる条件下で混合することにより、ゲルを形成させることを含む、核酸連結酵素を含有しない核酸ゲルを作成する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011093082 | 2011-04-19 | ||
JP2011093082 | 2011-04-19 | ||
PCT/JP2012/060613 WO2012144560A1 (ja) | 2011-04-19 | 2012-04-19 | 自己ゲル化核酸 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012144560A1 JPWO2012144560A1 (ja) | 2014-07-28 |
JP6083571B2 true JP6083571B2 (ja) | 2017-02-22 |
Family
ID=47041665
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013511034A Active JP6083571B2 (ja) | 2011-04-19 | 2012-04-19 | 自己ゲル化核酸 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9393309B2 (ja) |
EP (1) | EP2700414B1 (ja) |
JP (1) | JP6083571B2 (ja) |
CN (1) | CN103596594B (ja) |
WO (1) | WO2012144560A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018174158A1 (ja) | 2017-03-22 | 2018-09-27 | 国立大学法人京都大学 | 細胞質送達ペプチド |
CN109554331B (zh) * | 2017-09-27 | 2022-09-27 | 清华大学 | L-核酸水凝胶 |
CN109913977B (zh) * | 2019-03-15 | 2020-12-04 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种核酸凝胶纤维及其制备方法 |
CN110951723B (zh) * | 2019-12-06 | 2023-12-12 | 天津大学 | 一种纯dna双链缠结水凝胶及制备方法及应用 |
BR112023003459A2 (pt) * | 2020-09-10 | 2023-03-21 | United Immunity Co Ltd | Complexo |
CN113774055B (zh) * | 2021-09-16 | 2024-05-10 | 湖南大学 | 核酸纳米凝胶及其制备方法和应用 |
WO2024027171A1 (zh) * | 2022-08-01 | 2024-02-08 | 清华大学 | 一种包含或由核酸水凝胶组成的佐剂及其用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002018270A (ja) * | 2000-07-03 | 2002-01-22 | Hiroshi Yoshioka | 合成ハイドロゲル |
JP2004521109A (ja) * | 2001-01-17 | 2004-07-15 | ザイコス インク. | 核酸輸送用製剤 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60137104D1 (de) * | 2000-03-31 | 2009-02-05 | Sanko Junyaku Kk | Sonde zur herstellung einer polymersonde, verfahren zur herstellung einer polymersonde sowie verwendung derselben |
JP2005239860A (ja) * | 2004-02-26 | 2005-09-08 | Teijin Ltd | 温度応答性ハイドロゲル |
US8486621B2 (en) * | 2005-08-11 | 2013-07-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Nucleic acid-based matrixes |
JP2009543591A (ja) | 2006-07-11 | 2009-12-10 | タイコ ヘルスケア グループ リミテッド パートナーシップ | 生体適合性ヒドロゲル |
-
2012
- 2012-04-19 US US14/112,648 patent/US9393309B2/en active Active
- 2012-04-19 CN CN201280027322.4A patent/CN103596594B/zh active Active
- 2012-04-19 JP JP2013511034A patent/JP6083571B2/ja active Active
- 2012-04-19 EP EP12774101.5A patent/EP2700414B1/en active Active
- 2012-04-19 WO PCT/JP2012/060613 patent/WO2012144560A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002018270A (ja) * | 2000-07-03 | 2002-01-22 | Hiroshi Yoshioka | 合成ハイドロゲル |
JP2004521109A (ja) * | 2001-01-17 | 2004-07-15 | ザイコス インク. | 核酸輸送用製剤 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6016003085; Yongzheng Xing et al., Self-Assembled DNA Hydrogels with Designed Thermal and Enzymatic Responsivene * |
JPN6016003086; Enjun Cheng et al., A pH-Triggered, Fast-Responding DNA Hydrogel, Angew. Chem. Int. Ed., 2009, Vol. * |
JPN6016003087; Makiya Nishikawa et al., Biodegradable CpG DNA hydrogels for sustained delivery of doxorubicin and i * |
JPN6016003088; 毛利浩太 他, オリゴ核酸を基盤とするナノサイズDDS 開発, Drug DeliverySystem, 2010.11.25, Vol. 25, No. * |
JPN6016003090; Michael G. Fried et al., Biopolymers, 1984, Vol.23, p.2141-2155 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103596594B (zh) | 2016-08-17 |
WO2012144560A1 (ja) | 2012-10-26 |
JPWO2012144560A1 (ja) | 2014-07-28 |
EP2700414B1 (en) | 2019-11-13 |
CN103596594A (zh) | 2014-02-19 |
EP2700414A1 (en) | 2014-02-26 |
US9393309B2 (en) | 2016-07-19 |
EP2700414A4 (en) | 2014-11-26 |
US20140079738A1 (en) | 2014-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6083571B2 (ja) | 自己ゲル化核酸 | |
Qu et al. | Self-assembled DNA dendrimer nanoparticle for efficient delivery of immunostimulatory CpG motifs | |
Nishikawa et al. | Injectable, self-gelling, biodegradable, and immunomodulatory DNA hydrogel for antigen delivery | |
CN109476718B (zh) | 编码免疫调节多肽的mrna的组合及其用途 | |
Mohsen et al. | Delivering adjuvants and antigens in separate nanoparticles eliminates the need of physical linkage for effective vaccination | |
JP2020532955A5 (ja) | ||
Black et al. | Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on toll-like receptor agonists | |
CN102439148B (zh) | siRNA缀合物及其制备方法 | |
JP2019524766A (ja) | 免疫応答を調節するための生体材料 | |
EP3676380B1 (en) | Rna nanostructures and methods of making and using rna nanostructures | |
Du et al. | Innate immune stimulation using 3D wireframe DNA origami | |
WO2017007027A1 (ja) | 免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体 | |
Sun et al. | Immunostimulatory DNA nanogel enables effective lymphatic drainage and high vaccine efficacy | |
JP2022190026A (ja) | Pd-1ペプチド阻害剤 | |
Zhang et al. | Sulfonium-driven neoantigen-released DNA nanodevice as a precise vaccine for tumor immunotherapy and prevention | |
CN117210480A (zh) | 用作疫苗的表达外泌体锚定蛋白的核苷酸序列 | |
JP6715775B2 (ja) | 非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチド | |
Huang et al. | Acidic microenvironment triggered in situ assembly of activatable three-arm aptamer nanoclaw for contrast-enhanced imaging and tumor growth inhibition in vivo | |
Hu et al. | A Self-Immolative DNA Nanogel Vaccine toward Cancer Immunotherapy | |
CN107773527B (zh) | 以核酸水凝胶作为载体的疫苗组合物 | |
Jin et al. | Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo | |
VanKeulen-Miller et al. | Messenger RNA Therapy for Female Reproductive Health | |
KR102529194B1 (ko) | 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 백신 | |
Yip | Exploring RNA Origami as a Vaccine Assembly Platform for Cancer Immunotherapy | |
Liu | Properties of Nucleic Acid Amphiphiles and Their Biomedical Applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150409 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150409 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150501 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160404 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160906 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161104 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161213 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170111 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6083571 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |