JP6715775B2 - 非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
(1)ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤。
(2)前記核酸は、グアニンに起因する高次凝集体の形成を防ぐものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(3)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約25%以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(4)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約33%以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(5)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%以上である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(6)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%より高い、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(7)前記核酸は、約5塩基長以上のものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(8)前記核酸は、約100塩基長以下のものである、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(9)前記核酸は、約9〜約100塩基長である、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(10)前記送達剤は、生物活性を有する部分と結合されている、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(11)前記生物活性を有する部分は、A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはB/K型、C型もしくはP型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(12)前記生物活性を有する部分は、A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を有する、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(13)前記生物活性を有する部分は、D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA)(配列番号22)、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56))またはA2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))を含む、上記項目のいずれかに記載の送達剤。
(14)A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤。
(15)前記免疫賦活剤は、A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドにおいて、前記コア部分以外に由来する配列を含まない、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(16)前記生物活性はインターフェロン(IFN)α産生誘導活性および/またはインターロイキン−6(IL−6)産生誘導活性である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(17)前記コア部分は、A/D型の全長配列のうち、連続するGを取り除いた部分である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(18)前記コア部分は、D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA(配列番号22))、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56))またはA2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))を含む、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(19)前記コア部分は、細胞導入用のビヒクルに含まれる、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(20)前記ビヒクルは、リポソームまたは項目1〜13のいずれかに記載の送達剤である、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(21)免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチド。
(22)前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(23)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約25%以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(24)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約33%以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(25)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%以上である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(26)前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%より高い、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(27)前記核酸は、5塩基長以上のものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(28)前記核酸は、約100塩基長以下のものである、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(29)前記核酸は、約9〜約100塩基長である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(30)前記生物活性を有する部分は、A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分、またはB/K型、C型もしくはP型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの全長を含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(31)前記免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、A/D型であり、前記生物活性はインターフェロン(IFN)α産生誘導活性および/またはインターロイキン−6(IL−6)産生誘導活性である、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(32)前記コア部分は、A/D型のうち、連続するGを取り除いた部分である、上記項目のいずれかのオリゴヌクレオチド。
(33)前記コア部分は、D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA(配列番号22))、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56))またはA2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))を含む、上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(34)上記項目のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活剤。
(35)前記免疫賦活剤は、インターフェロン(IFN)αおよび/またはインターロイキン−6(IL−6)産生誘導のためのものである、上記項目のいずれかに記載の免疫賦活剤。
(36)免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達において使用するためのホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸。
(37)項目2〜13のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目36に記載の核酸。
(38)免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を送達するための方法であって、該方法は、該免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を項目1〜13のいずれかに記載の送達剤またはホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸と直接または例えばスペーサー等を介して結合させて被験体に投与する工程を包含する、方法。
(39)前記ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸は、項目1〜13のいずれか1項または複数の項に記載される特徴をさらに備える、項目38に記載の方法。
(40)被験体の免疫を賦活する方法であって、該方法は、有効量の項目14〜20、34および35のいずれかに記載の免疫賦活剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
(41)免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の製造における、項目21〜33のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。 本発明において、上記1または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
本発明は、上記種々の形態の医薬(治療薬または予防薬)として提供される。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤(本明細書において、その各実施形態を含め「本発明の送達剤」とも称する。)を提供する。したがって、本発明はまた、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を送達するための方法であって、該方法は、上記免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬を、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む送達剤またはホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸と直接または例えばスペーサー等を介して結合させて被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。この局面は、Tailユニットのみに着目したものである。このような核酸は、本明細書において「Tail核酸」ともいうことがある。1つの実施形態では、前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである。しかしながら、代表的なCpGであるD35についてみると、グアニンを他の塩基(A、T、C等)に変更するとGをA、T、Cに変更すると核酸単独での細胞導入が不可能になるため、医薬としての利用に限界があることが示された。そこで、Core(コア)配列を抽出したところ、Core配列のみでIFN−α産生誘導活性があることが示されていることから、これを効率的に細胞導入することができれば、有用な医薬になる。リポソーム化が従来技術であったが、煩雑な技術であったことから、簡便な技術の提供が待たれていた。また、Core配列を用いた場合に送達がうまくできないという現象が観察されていた。これらからコア配列のみでは、送達が十分にできないため、せっかくの薬効が発揮されないという問題もあった。そこで、本発明は、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を提供することによって、送達を防止する現象を防ぎ、自己導入能を示すTailユニットが提供され、送達ないし細胞導入が可能となり、有効なIFN−α活性を提供するCpG ODNユニットを提供することができた。ここで、単剤で細胞に導入され、IFN-α産生能を得るためにはTailの部分におけるホスホロチオエート化が有利なことが判明した。このように、A/Dタイプの核酸アジュバントが活性本体と細胞導入の2つのユニットに分かれるという着想はこれまでに知られておらず、本発明における一つの特徴であるといえる。また、本発明では、構造活性相関試験を行い、どのパラメータがどのように活性に影響を与えるかが理解され、最適化が可能である。
D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA(配列番号22))、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56)、
A2216の全長部分(ggggGACGA:TCGTCgggggg(配列番号65);大文字はコア部分を示す。)
A2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))、
A2336の全長部分(ggggACGAC:GTCGTggggggg(配列番号66);大文字はコア部分を示す。)
B2006の全長(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT配列番号60)、
C2395の全長(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(配列番号62))、
P21889の全長(TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(配列番号64))、
CPG 7909:TsCsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsT(配列番号67;B/K型)
PF−3512676:TsCsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsT(配列番号68;B/K型)
CYT003−QBG10:GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号69;A/D型)
1018 ISS:TsGsAsCsTsGsTsGsAsAsCsGsTsTsCsGsAsGsAsTsGsA(配列番号70;B/K型)
Kappaproct (DIMS 0150):GsGsAsACAGTTCGTCCATsGsGsC(配列番号71;A/D型)
を含むがこれらに限定されない(sはホスホロチオエート結合を意味する)。
1つの局面において、本発明はA/D型、B/K型、C型またはD型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む、免疫賦活剤(本明細書において、その各実施形態を含め「本発明の免疫賦活剤」ということがある。)を提供する。理論に束縛されることを望まないが、コア部分のみで、免疫賦活化でき、IFN−α産生誘導活性および/またはインターロイキン6産生誘導活性があることが見出されたことから、本発明は、設計範囲が広い、免疫賦活剤を提供することができる。したがって、本発明はまた、被験体の免疫を賦活する方法であって、該方法は、A/D型、B/K型、C型またはD型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を含む免疫賦活剤の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
さらなる局面において、本発明は、免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチド(本明細書において「本発明のオリゴヌクレオチド」ということがある)を提供する。
D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA(配列番号22))、
A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56)、
A2216の全長部分(ggggGACGA:TCGTCgggggg(配列番号65);大文字はコア部分を示す。)
A2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))、
A2336の全長部分(ggggACGAC:GTCGTggggggg(配列番号66);大文字はコア部分を示す。)
B2006の全長(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT配列番号60)、
C2395の全長(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(配列番号62))、
P21889の全長(TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(配列番号64))、
CPG 7909:TsCsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsT(配列番号67)
PF−3512676:TsCsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsTsTsTsGsTsCsGsTsT(配列番号68)
CYT003−QBG10:GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号69)
1018 ISS:TsGsAsCsTsGsTsGsAsAsCsGsTsTsCsGsAsGsAsTsGsA(配列番号70)
Kappaproct (DIMS 0150):GsGsAsACAGTTCGTCCATsGsGsC(配列番号71)
から選択され得る(sはホスホロチオエート結合を意味する)。
別の局面では、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の製造における、本発明のオリゴヌクレオチドの使用が提供される。この局面において使用されるオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の形態を用いることができることが理解される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下、本実施例において、代表的な免疫賦活剤であるD35(配列番号31)を用いて、ポリdAs40テイル付加A/DタイプODNは元のD35と同様の免疫賦活化潜在能力を有することを実証した。
インフォームド・コンセントを得た日本人の健康な成人ボランティアからPBMCを調製した。ヒトPBMCを用いた実験はすべて、独立行政法人医薬基盤研究所研究倫理審査委員会による承認を受けた(承認番号44)。Ficoll−Paque PLUS(GE Healthcare)とLeucoSep(Greiner)を用いてPBMCを調製した後、これらのPBMCを、10% 胎仔ウシ血清、100単位/mL ペニシリンおよび100μg/mL ストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地(すべて、ナカライテスク株式会社(京都)製)中に、2×107細胞/mL(96ウェル平底プレート、合計100μL容量/ウェル)の濃度でプレーティングした。
以下の表1に列挙するODNを株式会社ジーンデザイン(大阪、日本)により合成した。
汎IFN−α ELISAキット(MabtechまたはPBL製)およびヒトIL−6 ELISAキット(DuoSet;R&D Systems製)を、製造業者の説明書に従って用いて、上清中のサイトカインを測定した。ELISAは、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)(KPL製)で発色させた。一部の実験では、Milliplexアッセイ(MPXHCYTO60KPMX26;Millipore製)もまた、製造業者の説明書に従って実施した。
Wyatt DynaPro PlateReader II(Wyatt Technology,USA)を用いてDLSの測定を行った。サンプル(PBS中1mg/mL、18時間以上保存したもの)を、384ウェルプレート(20μL/ウェル)中で測定した(25℃にて20回取得した)。多分散性、流体力学半径および分子量を、Dynamicsソフトウェアv7.1.7.16(Wyatt Technology,USA)によって分析した。
D35(PBS中1mg/mL)をFormvar−カーボンコートグリッドに滴下し(10μL)、グリッドへの付着のために2時間インキュベートした。陰性染色のために、サンプルを蒸留水で3回洗浄し、次いで、2%(wt/vol)の酢酸ウラニル(pH4.0)を一滴グリッド上に置き、風乾させた。このグリッドを、電子顕微鏡(Hitachi H−7650)によって10,000倍の倍率で調べた。
アルカリ変性させたSPG(分子量150,000)の溶液(0.25N NaOH中15mg/mL)をODN溶液(NaH2PO4中100μM)に加え、徹底的に混合した。この混合物を4℃にて一晩置き、複合体形成を完了させた。モル比(SPG:DNA)は0.27に固定した。ODNとSPGとの間の複合体形成効率を、MultiNAマイクロチップ電気泳動装置(島津製作所,京都)を使用することによって、混合溶液中の残留遊離ODNから推定した。
カニクイザル(Macaca fascicularis)を入手し、独立行政法人医薬基盤研究所(NIBIO)のつくば霊長類医科学研究センターで維持した。実験はすべて、NIBIOの動物実験委員会によって承認されたプロトコール(承認番号:DS22−4R1)の下で行い、屠殺を最小限にするためのあらゆる試みを行った。0日目と14日目に、カニクイザルに、K3(4.7nmol)、D35(4.7nmol)、D35−dAs40(4.7nmol)、D35core−dAs40(4.7nmol)、またはD35−SPG(D35−dAs40の量として4.7nmol)と共に、あるいは、これら無しで、インフルエンザスプリットワクチン(SV)(5μg)(A/New Caledonia/20/99,阪大微生物病研究会)を皮下(s.c.)投与した。初回免疫後4週および8週の時点で血清を回収した。血清中の抗SV総IgGをELISAによって測定した。各血清サンプルを連続希釈し、抗体力価をOD450=0.2における希釈の逆数として計算した。
Graphpad Prism 5ソフトウェアを用いて統計的に有意な差を計算した。サイトカインの分析については対応有りのt検定を、そして、抗体力価の分析については両側ノンパラメトリックMann−Whitney U検定を用いた。
(ポリdAs40テイル付加A/DタイプODNは元のD35と同様の免疫賦活化潜在能力を有する)
本発明者らはこれまでに、K3 CpG−ODNとシゾフィラン(SPG)の粒子状可溶性複合体である第二世代のB/KタイプCpGアジュバント、K3−SPGを開発した[Kobiyama Kら,(2014) Proceedings of the National Academy of Sciences,vol.111 no.83086-3091, doi: 10.1073/pnas.1319268111.; Koyama Sら, (2010)Science Translational Medicine 2:25ra24]。K3 ODNとSPGの間で複合体を形成するために、K3 ODNは、3’末端にホスホロチオエートデオキシアデニル酸40マー(dAs40テイル)を追加することによって修飾されなければならず、この3’末端において、SPGとdAs40テイルが三重らせんの複合体を形成する[Kobiyama Kら,(2014)上掲]。これらの実験と並行して、本発明者らはまた、同様のテイルを付加したD35 ODNを合成し、ヒトPBMCに対するその免疫賦活化活性(IFN−αおよびIL−6の誘導)を調べた。サイトカインELISAは、3’末端に追加のdAs40テイルを有するD35(A/DタイプCpG−ODN)が元のD35と同様に活性であることを明らかにした(図1Aの1とD35を比較;本実験で用いた各ODN配列は表1に示される)。その後の実験はさらに、3’のグアニン六量体を、アデニン、チミンおよびシトシンの六量体に置き換えた場合でも、dAs40テイルを持つ一部のD35由来ODNもまた生物学的に活性であることを明らかにした(図1Aの5、9および13を参照)。この結果はどちらかといえば予想外であった。というのも、グアニン六量体は、フーグスティーン塩基対形成により四重鎖構造を形成し、自己凝集を生じ[Costa LTら,(2004)Biochemical and Biophysical Research Communications 313:1065-1072.;Klein DCら,(2010)Ultramicroscopy 110: 689-693.]、そして、グアニン六量体を介した凝集は、A/DタイプCpG ODNの生物学的活性にとって不可避な要件であると考えられていたからである[Verthelyi Dら,(2001)J Immunol 166:2372-2377.; Kerkmann Mら, (2005) J Biol Chem 280:8086-8093.; Wu CCら,(2004) J Biol Chem 279:33071-33078.; Puig Mら, (2006)Nucleic Acids Res 34:6488-6495.]。他方ヒトPBMCに対するD35由来ODNの免疫賦活化活性は、完全にCpG配列の存在に依存しており、非メチル化CpGモチーフ理論[Krieg AM(2002)Annual Review of Immunology 20:709-760.]と一致していた(図1Aの9と10〜12を比較)。これらの結果は、グアニン六量体配列の存在が、A/DタイプODNの免疫賦活化活性にとっての必須の要件ではない一方で、D35由来ODNの活性はCpGモチーフ配列の存在に強く依存することを示した。
ホスホジエステルCpG ODNへのグアニン六量体の付加は、その細胞取り込みを向上させたことが知られている[Bartz Hら, (2004) Vaccine 23:148-155.; Dalpke AHら, (2002)Immunology 106:102-112.]。この事実と軌を一にするように、ホスホロチオエートODNはタンパク質に非特異的に結合することが示された[Brown DAら,(1994)Journal of Biological Chemistry 269:26801-26805.]。さらに、ホスホロチオエートCpG ODNは、ホスホジエステルCpG ODNよりも細胞によって効率的に取り込まれることも示されている。これらの知見は、dAs40テイルの追加がおそらくは、ホスホロチオエート骨格を介した非特異的な結合によってODNの細胞内取り込みを向上させたことを示唆した。これらの報告に基づき、本発明者らは、ヒトPBMCに対するD35T−dAs40とD35T−dA40(元のグアニン六量体をチミン六量体で置き換え、テイルは、ホスホロチオエートまたはホスホジエステルポリA40のいずれかから構成されるもの)の免疫賦活化活性を比較することによって、化学骨格構造の要件を検討した(図1Bの1と2を比較)。ODNの生物学的活性は、ホスホロチオエートテイルの存在に依存しており、ホスホジエステルテイルのODNを追加しても、サイトカイン反応はほとんど観察されなかった(図1Bの1と2を比較)。本発明者らはまた、ポリA(s)40の代わりにポリT(s)40またはポリC(s)40などの他のポリヌクレオチド40マーテイルについても検討し、dTs40テイルよりも、dAs40テイルおよびdCs40テイルを追加した場合に比較的より強いサイトカイン反応が認められた(図1Bの1、3および5を参照のこと)ものの、サイトカイン反応は、ポリヌクレオチドテイルの塩基とは無関係であったが、ホスホロチオエート骨格の存在に依存していたことを見出した(図1Bの3〜6を参照のこと)。
本発明者らはまた、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルを持たない、アデニン、チミンおよびシトシンの六量体を含有するD35のヒトPBMCに対する免疫賦活化活性を試験した(図1C)。これまでの報告[Verthelyi Dら,(2001) J Immunol 166: 2372-2377.; Yamamoto Tら,(1994)Microbiol Immunol 38:831-836.; Lee SWら, (2000) The Journal of Immunology 165:3631-3639.]と一致して、元のD35の免疫賦活化活性は、グアニン六量体の存在に依存していた(図2)。アデニン、チミンおよびシトシンの六量体を含有するD35(D35A、D35TおよびD35C)は、ヒトPBMCに対して効果を有さなかった(図2;黒いバー)。これに対し、これらにDOTAPを追加した場合、同じODNが比較的高活性となった(図2、白いバー)。このDOTAPは、カチオン性脂質(N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルスルファート)であり、TLR9媒介性のシグナル伝達が開始する特定のエンドソーム区画へのCpG−ODNの標的化に使用されている[Yasuda Kら,(2005)Journal of immunology(Baltimore, Md: 1950) 174: 6129-6136.; Honda Kら,(2005)Nature 434: 1035-1040.]。この結果は、ODNをDOTAPによって細胞取り込みおよび適切なエンドソーム区画へと標的化させる場合、A/DタイプODNの生物学的活性が、グアニン六量体の配列を必要としないことを示した。
本発明者らはまた、いくつかのdAs40テイルD35関連のODNについて、動的光散乱法(DLS)を用いてその物理的性質を調べた(図3)。臨床応用可能なA/DタイプODNの医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準(GMP)を満たす品質での合成は、ODN生成物の制御不能な多型、凝集および沈殿につながる、Gテイル依存性の多量体化によって妨げられている[Puig Mら,(2006) Nucleic Acids Res 34: 6488-6495.](図3および5)。元のD35(1mg/mL)は、PBS中で目に種々の不均一な凝集物の形成を示し、24時間以内に目に見える濁りが生じた(図3C)。特に、水中のD35では濁りは観察されなかった。DLS分析は、濁りが、広く分散された凝集物(平均直径約50nm〜1μm超のサイズ範囲)から成ることを明らかにした(図3A〜3B)。これに対し、PBS中の同じ濃度のD35−dAs40およびD35core−dAs40は、目に見える沈殿を形成せず(図3C)、ODNのサイズは、20nm未満であり、DLSにシャープなピークを有していた(図3A〜3B、表2)。
本発明者らはさらに、用量滴定によってこれらのODNの免疫賦活化活性を評価した(図4A)。D35、D35−dAs40(グアニン六量体配列を含む)およびD35core−dAs40(グアニン六量体配列を含まない)を含むすべてのODNが、ヒトPBMCからのIFN−αおよびIL−6反応の増加を用量依存性の様式で誘導した(図4A)。これに対し、最近報告されたPタイプのODN、21889(これは、二量体の構造の凝集物の形成を促進する2つのパリンドローム配列を直列に含むホスホロチオエート骨格から構成される)[Samulowitz Uら,(2010) Oligonucleotides 20: 93-101.]は、より高濃度で使用した場合、IFN−αおよびIL−6反応の減少を示した(図4A)。
本発明者らはまた、5’GG配列および3’チミン六量体のような、D35core 12マーからの隣接配列について、IFN−α産生に対する影響を調べた(図4B)。D35のコア配列(12マー)のみでは、サイトカイン反応を誘導しなかった(図4B)が、この12マーへのdAs40テイルの追加は、匹敵する量のIFN−αを誘導するのに十分であった。重要なことに、これは、DOTAPの非存在下での結果であった。チミン六量体の存在は、生物学的活性を低下させるようであった。これらの結果は、5’GG配列および3’チミン六量体のようなコア隣接配列が、このタイプのODNの免疫賦活化活性にとって必須ではなかったことを示唆した(図4B)。
本発明者らはまた、免疫賦活化活性に対するホスホロチオエートAポリマーテイルの長さの影響を調べた。ヒトPBMCを同量の示したODN(1μM)で刺激した場合、IFN−αおよびIL−6の産生は、dAsテイルの長さと正の相関関係にあった(図4C)。各ODN濃度の影響を調べると、増加する濃度の各ODN(検討した最大濃度は9μM)は、同じレベルのIFN−αおよびIL−6産生を誘導し(図4D)、より長いテイルのODNがより効率的に取り込まれたことが示唆された。しかしながら、長いテイルのODNも、短いテイルのODNも、おそらくは同じ取り込み機構を利用しており、したがって、プラトー様のサイトカイン反応に達した(図4D)。まとめると、これらのデータは、CpGモチーフを含有する短いODNへのホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルの追加が、免疫賦活化A/DタイプODNを生成するのに十分であり、これは、制御された物理的性質を持つGMPを順守したA/DタイプODNを生成するための有用な戦略となる。
本発明者らは、D35 CpG ODNのホスホロチオエートポリヌクレオチドの要件(例えば、テイルの長さ(図9)、テイルのホスホロチオエート化の程度(図10)、およびテイルのヌクレオチド組成(図11)を理解するための一連の実験をさらに行った。まず、D35coreを種々の数(長さ)のdAについて、試験して、IFN−αおよびIL−6の誘導について試験した(図9。IFN−α誘導はD35coreについては観察されず、dAs6で少し観察された。IFN−αの量は、dAの長さがdAs60に達するに従い増加した。興味深いことに、dAsテイルを100までさらに延長しても、改善は見られず、むしろ、IFN−αの誘導は減少した。対照的に、IL−6の産生は、増加し、dAs100まで増加が維持された。次に、D35core−dAs50を用いることによって、ホスホロチオエート化を100%から15%に減らした(図10)。dA40におけるホスホロチオエート化の50%の減少ですら、IFN−α誘導活性の劇的な減少を招いた。IL−6の産生の感受性はそれほどではなかったが、これもまた、ホスホロチオエートの減少に伴い迅速に減少した。25%以下のホスホロチオエート化では、IL−6産生は観察されなかった。第三に、ヌクレオチド組成の要件についてD35−dNs40を用いて試験した。完全にランダムのdNs40テイル化ODNでは、実質的なIFN−α産生は誘導されなかった(図11、核酸番号10(DS35−dNs40))。dNs40−テイルのグアノシンの量を10%から90%に増加させると、dNs40テイルにおけるHoogsteen塩基対形成の増大が期待される。グアノシン量が増大するにつれ、IFN−αの産生が増大したが、D35−dNs40(91%G)ですらIFN−αの誘導は比較的少量にとどまった(図S4、9)。これらの結果すべてをまとめると、1)全長、2)ホスホロチオエート化、および3)ヌクレオチド組成(AポリマーがGリッチランダマーより優れる)のすべてが、ホスホロチオエートポリヌクレオチドテイルODNの免疫刺激剤の活性に重要な因子であり得ることが理解される。これらの結果から、本発明者らは、D35−dAs40およびD35コア−dAs40を、臨床応用のプロトタイプとして選択した。
生理食塩水のような塩含有溶液中への免疫賦活化ODNの直接的な溶解性は、その臨床応用を促進するために重要な要件である。それゆえ、本発明者らは、凍結乾燥したD35−dAs40およびD35core−dAs40の生理食塩水中への直接的な溶解性を調べた。10mgの凍結乾燥ODNを含有するバイアル(図5A)に、1mLの無菌生理食塩水溶液を直接注入した。K3およびD35core−dAs40は生理食塩水中に容易に溶解した(図5B)。D35−dAs40(グアニン六量体配列を含む)は、ゆっくりとではあるが、5分以内に完全に溶解した(図5B)。これらのODN溶液を4℃にて1ヶ月保存した場合でも、目に見える沈殿または凝集物は観察されなかった。これに対し、元のD35は、生理食塩水中に容易に溶解せず、不均質なゼラチン状の凝集物を形成した(図5B)。これらの結果は、D35−dAs40およびD35core−dAs40が、特に臨床応用に関して、元のD35よりも容易に取り扱えることを実証した。
次に、本発明者らは、シゾフィラン(SPG)と複合体化(SPG化)させることによって、D35由来のODNの免疫賦活化プロフィールを向上させることを試みた。D35−SPG、SPG−D35およびD35−SPG−D35を、D35−dAs40、dAs40−D35およびdAs40−D35−dAs40をそれぞれSPGと複合体化させることによって作製した。複合体化の効率をMultiNAマイクロチップ電気泳動装置によって評価したところ、以下のとおりとなった:D35−SPG(99.4%)、SPG−D35(96.7%)およびD35−SPG−D35(49.8%)。これは、D35−SPGまたはSPG−D35のいずれかの溶液中のODNが、ほぼ完全に複合体化されたのに対し、D35−SPG−D35溶液中では50%のODNしか複合体化されなかったことを示す。ヒトPBMCを、SPG化したODNで刺激して、IFN−αおよびIL−6の分泌をELISAにより決定した(図6)。K3−SPG[Kobiyama Kら,(2014)Proceedings of the National Academy of Sciences,vol.111 no. 8 3086-3091,doi: 10.1073/pnas.1319268111.]と対照的に、D35の5’または3’SPG化は、サイトカイン産生を向上させなかったが、非SPG化ODNと比較してIFN−αおよびIL−6の分泌を減少させた(図6)。とりわけ、D35−SPGは、SPG−D35よりも大きな免疫賦活化効果を有した(図6)。特筆すべきことに、D35−dAs40およびdAs40−D35のような5’末端または3’末端にdAs40が追加された非SPG化ODNは、匹敵する免疫賦活化活性を示した(図6)。しかしながら、本発明者らは、別の実験において、dAs40−D35よりもD35−dAs40で、わずかに良好なサイトカイン産生を観察した。興味深いことに、dAs40−D35もまた、PBS中の可視の大きな凝集形成が見られなかった(図12)。D35−SPG−D35はPBMCからのIFN−αおよびIL−6分泌をかなり増強したが、複合体化の効率は、わずか約50%であった。D35−SPG−D35は、K3−SPG[Kobiyama Kら,(2014)上掲]と同様のサイトカインプロフィールの向上を示した。
本発明者らは最後に、サルワクチンモデルにおけるD35−dAs40、D35core−dAs40およびD35−SPGのインビボアジュバント有効性を検討し、K3および元のD35のものと比較した(図7)。6群のサル(n=2または3)を、示したインフルエンザスプリットワクチン(SV)+アジュバントで2回(2週間間隔)皮下免疫し、初回の免疫から8週間後に、血清中のSV特異的なIgG反応をELISAにより調べた(図7A)。D35−dAs40およびD35−SPGは、K3および元のD35よりも良好かつより一貫したアジュバント性を示した(図7B)。本発明者らはまた、別のサルのセットの実験を行って、元のD35とD35core−dAs40を比較したところ、D35core−dAs40もまた、元のD35より優れたアジュバント性を示すことが分かった(図7C)。これらの結果は、D35−dAs40、D35core−dAs40およびD35−SPGが、少なくともインフルエンザスプリットワクチンのワクチン接種に関して、サルにおいてインビボでK3および元のD35と比較して、アジュバントとして同等またはより良好に機能することを示唆した。特筆すべきことに、インビトロでのIFN−αおよびIL−6プロフィールは、インビボでのアジュバント性と十分に相関していなかった。それゆえ、本発明者らは、D35、D35−dAs40またはD35−SPGで刺激した(アッセイに十分な量のサルPBMCを入手できないという制限により、サルのPBMCの代わりに)ヒトPBMCを用いて26多重サイトカインアッセイを実施した(図8)。検出された18種のサイトカインの中では、インビトロでのサイトカインと、インビボでのアジュバント性の間に相関性は見出されなかった(図8)。
本実施例において、本発明者らは、ヒトにおける臨床応用のための2種類の新規プロトタイプ非凝集性免疫賦活化A/DタイプODN、D35−dAs40およびD35core−dAs40に代表される送達剤を開発した。これらのODNは、高IFN−αおよび低IL−6誘導プロフィールを持つ元のD35と同様のヒトPBMCからのサイトカイン誘導プロフィールを示したが、これらのサイトカイン間での全体的なバランスは、B/KタイプODNのものに向かってわずかにシフトした(元のD35と比較して、IFN−αがわずかに減少し、IL−6が増加した;図1)。D35−dAs40とD35core−dAs40の最も重要な特徴は、生理食塩水中へのその優れた溶解性であった。バイアル中に保存された凍結乾燥D35−dAs40およびD35core−dAs40は、生理食塩水溶液を注入することによって直接溶解することが可能であり(図5)、この特徴は、臨床上の投与に必要な特徴であって、その用途は大きく広がる。加えて、D35−dAs40およびD35core−dAs40はともに、インフルエンザSVアジュバントとして用いた場合に、カニクイザルにおいて元のD35よりも良好なアジュバント性を示した(図6)。D35−dAs40およびD35core−dAs40は一般に、インビトロでは元のD35と比べて比較的減少したIFN−αとより多いIL−6を示した(図4)ので、この結果は予想外であった。B細胞の直接的な活性化と強力なIL−6サイトカイン誘導に起因して良好な抗体反応を誘導すると考えられるK3と比較した場合も、D35−dAs40は、サルにおいて、より良好でかつより確実な抗インフルエンザ抗体反応を示した(図7)。このことは、D35−dAs40およびD35core−dAs40がともに、インビボで優れたワクチンアジュバントであることを示唆した。本発明者らはまた、サルにおいて、D35−dAs40とSPGから成るD35−SPGを検討した。D35−SPGは、インビトロにおいてIFN−αおよびIL−6の減少したレベルを示したが、D35−SPGは、インビボにおいてD35−dAs40と匹敵するアジュバント性を有した(図7)。これらのデータは、インビトロでODNによって誘導されるサイトカインの量と品質が、インビボでのそのアジュバント性と相関しないことを示した。体内分布の違いは、修飾ODNのアジュバント性に影響を及ぼす別の重要な因子であり得る。ODNの体内分布に関するさらなる調査が必要とされる。
ヒトPBMCにおけるB/KタイプCpG ODNに対するサイトカイン反応の不均一性が報告されている[Leifer CAら, (2003) J Immunother 26:313-319.]。全体的な反応は、様々なヒトPBMCサンプル間で大きくは一致していたが、本発明者らもまた、本実施例において検討したA/DタイプODNの非凝集性誘導体に対して可変的な反応を認めた。このタイプのODNの臨床応用にとって、これらの個体間での違いの原因のさらなる調査を検討することができる。以上から、D35−dAs40およびD35core−dAs40を含むA/DタイプODNの非凝集形態が、臨床応用可能なA/DタイプODNのさらなる開発のための有望な出発物質であるといえる。
次に、本実施例では、他のCpG ODNでD35と同様の効果が示されるかどうかを確認した。
A2216:g^g^gggacgatcgtc^g^g^g^g^g^g(配列番号55)
A2216core:gacgatcgtc(配列番号56)
A2336:g^g^g^gacgacgtcgtg^g^g^g^g^g^g(配列番号57)
A2336core:acgacgtcgt(配列番号58)
B2006(PS):t^c^g^t^c^g^t^t^t^t^g^t^c^g^t^t^t^t^g^t^c^g^t^t(配列番号59)
B2006(PO):tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt(配列番号60)
C2395(PS):t^c^g^t^c^g^t^t^t^t^c^g^g^c^g^c^g^c^g^c^c^g(配列番号61)
C2395(PO):tcgtcgttttcggcgcgcgccg(配列番号62)
P21889(PS):t^c^g^t^c^g^a^c^g^a^t^c^g^g^c^g^c^g^c^g^c^c^g(配列番号63)
P21889(PO):tcgtcgacgatcggcgcgcgccg(配列番号64)
図13〜図14に結果を示す。図13は、凝集の様子を示すものである。凝集の様子を示すものである。A2216は直接生食に溶解(10mg/mL)させることは可能だが、非常に粘性の高い溶液となり、4℃の場合はゲル化している。37℃ではゾル状となる(粘度は高いが流動性は保たれる)。A2336は直接生食に溶解させることはできないことを示す。
次に、本実施例では、D35以外のA/D型CpG核酸についてもdAs40付加による凝集抑制効果を凍結乾燥バイアルを直接生食で溶解する操作で確認し、ヒトPBMCに対する生物活性としてINFαおよびIL−6を測定し、D35にdAs40を付加した際に認められたのと同様にIFNaおよびIL−6の産生は維持または増強されたことを確認した。
方法および材料としては、実施例1に記載したD35において行ったのと同様の実験(本明細書上記を参照。)に準じた実験を行い、また、実施例1〜2において示した配列と一部かぶるが以下の配列を用いて実験を行った。
A2216:g^g^gggacgatcgtc^g^g^g^g^g^g(配列番号55)
A2216core:gacgatcgtc(配列番号56)
A2216-dAs40:(配列番号76)
A2336:g^g^g^gacgacgtcgtg^g^g^g^g^g^g(配列番号57)
A2336core:acgacgtcgt(配列番号58)
A2336-dAs40:(配列番号78)
D35(配列番号31)
D35-dAs40:(配列番号1)
D35core-dAs40:(配列番号23)
コントロール(刺激なし)
K3:(配列番号30)
結果を図15に示す。図15に示されるように、A2216−dAs40(左)およびA2336−dAs40(右)(いずれも0.5mg/バイアル)が容易にかつ完全に、50μLの生理食塩水に常温で溶解することが示された。また、図15下段に示されるように、ヒトPBMCをそれぞれのオリゴヌクレオチドで24時間刺激した(1μM)結果をELISAで上清におけるIFN−αおよびIL−6の産生を調べたところ、D35以外のDタイプ核酸(A2216とA2336)についてもdAs40を付加することで生理食塩水への溶解性を高めることができること、およびがIFN−αおよびIL−6の産生にも同様の効果があることが実証され、D35のみならず、D型核酸にdAs40を付加することに伴う凝集抑制効果がみられることが実証された。
次に、本実施例では、5‘末端のホスホロチオエート化(s)の個数が1個の場合と2個の場合とで生理食塩水に溶解した場合に凝集する性質およびヒトPBMCからのIFNαおよびIL−6産生について、ほぼ同じであることを実証した。以下にその詳細を示す。
製剤化する場合には、以下のような製法によって製造することができる。
(例1)凍結乾燥したD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の生理食塩水を直接加えて注射用溶液製剤とすることができる。
(例2)凍結乾燥したD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の等張液5%ブドウ糖液を加えて注射用溶液製剤とすることができる。
(例3)水に溶解されたD35-dAs40の適宜の量に適宜の容積の電解質補正液大塚食塩注10%などを加え0.9% NaCl濃度に調製し注射用溶液製剤とすることができる。
(例4)水に溶解されたD35-dAs40の適宜の量を凍結乾燥し、D35-dAs40ナトリウム塩の凍結乾燥製剤とすることができる。
配列番号29:DポリdAs40テイルを示す。
配列番号30:K3(atcgactctc gagcgttctc)を示す。
配列番号31:D35を示す。
配列番号32:D35Aを示す。
配列番号33:D35Tを示す。
配列番号34:D35Cを示す。
配列番号35〜48:図9の配列を示す。
配列番号49〜54:図10の配列を示す。
配列番号55:A2216のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号56:A2216のコア部分を示す。
配列番号57:A2336のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号58:A2336のコア部分を示す。
配列番号59:B2006のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号60:B2006の全長を示す。
配列番号61:C2395のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号62:C2395の全長を示す。
配列番号63:P21889のホスホロチオエート化配列を示す。
配列番号64:P21889の全長を示す。
配列番号65:A2216の全長を示す。
配列番号66:A2336の全長を示す。
配列番号67:CPG 7909を示す。
配列番号68:PF−3512676を示す。
配列番号69:CYT003−QBG10を示す。
配列番号70:1018 ISSを示す。
配列番号71:Kappaproct (DIMS 0150)を示す。
配列番号72:D35−dNs40(GsGsTGCATCGATGCAGGGGsGsGs-Ns40)を示す。
配列番号73:D35βの配列(GsGsで始まる)を示す。
配列番号74:dAs40−D35の配列を示す。
配列番号75:D35−dAs40−D35の配列を示す。
配列番号76:A2216+dAs40を示す。
配列番号77:A2216core+dAs40を示す。
配列番号78:A2336+dAs40を示す。
配列番号79:A2336core+dAs40を示す。
配列番号80:B2006(PS)+dAs40を示す。
配列番号81:B2006(PO)+dAs40を示す。
配列番号82:C2395(PS)+dAs40を示す。
配列番号83:C2395(PO)+dAs40を示す。
配列番号84:P21889(PS)+dAs40を示す。
配列番号85:P21889(PO)+dAs40を示す。
Claims (18)
- ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸を含む、免疫賦活化オリゴヌクレオチド核酸医薬の送達剤であって、該送達剤が、該免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有する部分と結合されており、該核酸は、9〜約100塩基長であり、該免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有する部分は、A/D型の免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分を有する、送達剤。
- 前記核酸は、グアニンに起因する高次凝集体の形成を防ぐものである、請求項1に記載の送達剤。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約25%以上である、請求項1に記載の送達剤。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約33%以上である、請求項1に記載の送達剤。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%以上である、請求項1に記載の送達剤。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%より高い、請求項1に記載の送達剤。
- 前記生物活性を有する部分は、D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA)(配列番号22)、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56))またはA2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))を含む、請求項1に記載の送達剤。
- 免疫賦活化オリゴヌクレオチドの生物活性を有するコア部分または全長と、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む核酸とを含む、オリゴヌクレオチドであって、該核酸は、9〜約100塩基長であり、該免疫賦活化オリゴヌクレオチドは、A/D型である、オリゴヌクレオチド。
- 前記核酸は、グアニンに起因するマルチマーの形成を防ぐものである、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約25%以上である、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約33%以上である、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%以上である、請求項21に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記核酸中のホスホロチオエート化ヌクレオチドの含有率は、約50%より高い、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記生物活性はインターフェロン(IFN)α産生誘導活性および/またはインターロイキン−6(IL−6)産生誘導活性である、請求項8〜13のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記コア部分は、A/D型のうち、連続するGを取り除いた部分である、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記コア部分は、D35オリゴヌクレオチドのコア部分(TGCATCGATGCA(配列番号22))、A2216のコア部分(GACGATCGTC(配列番号56))またはA2336のコア部分(ACGACGTCGT(配列番号58))を含む、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項8〜16のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む免疫賦活剤。
- 前記免疫賦活剤は、インターフェロン(IFN)αおよび/またはインターロイキン−6(IL−6)産生誘導のためのものである、請求項17に記載の免疫賦活剤。
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