JP6698069B2 - 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 - Google Patents
免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6698069B2 JP6698069B2 JP2017508311A JP2017508311A JP6698069B2 JP 6698069 B2 JP6698069 B2 JP 6698069B2 JP 2017508311 A JP2017508311 A JP 2017508311A JP 2017508311 A JP2017508311 A JP 2017508311A JP 6698069 B2 JP6698069 B2 JP 6698069B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lnt
- complex
- oligodeoxynucleotide
- spacer
- spg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims description 44
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title description 6
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 174
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 claims description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 76
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 76
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 claims description 59
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 claims description 59
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 46
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 claims description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 35
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 33
- 229920002305 Schizophyllan Polymers 0.000 claims description 31
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 30
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 28
- WDQLRUYAYXDIFW-RWKIJVEZSA-N (2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-4-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 WDQLRUYAYXDIFW-RWKIJVEZSA-N 0.000 claims description 27
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 26
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 20
- 229910052717 sulfur Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 14
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 14
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 12
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 12
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims description 12
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims description 12
- FEBUJFMRSBAMES-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-{[3,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-phosphanyloxan-4-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-({[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}methyl)oxan-4-yl)oxy]-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl phosphinite Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(OC2C(C(OP)C(O)C(CO)O2)O)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(P)C2O)O)O1 FEBUJFMRSBAMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 9
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 9
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 9
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 7
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 7
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 229920002558 Curdlan Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001879 Curdlan Substances 0.000 claims description 4
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 claims description 4
- 229940078035 curdlan Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019316 curdlan Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 claims description 4
- DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N laminarin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)C(O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N 0.000 claims description 4
- 230000014567 type I interferon production Effects 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010037075 Protozoal infections Diseases 0.000 claims description 2
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims 4
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 208000010362 Protozoan Infections Diseases 0.000 claims 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 116
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 116
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 115
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 40
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 33
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 30
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 25
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 25
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 description 20
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 18
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 101500027983 Rattus norvegicus Octadecaneuropeptide Proteins 0.000 description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 15
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 10
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 6
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 6
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 6
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 6
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 6
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- QIJIUJYANDSEKG-UHFFFAOYSA-N 2,4,4-trimethylpentan-2-amine Chemical class CC(C)(C)CC(C)(C)N QIJIUJYANDSEKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical class C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical class NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 4
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical class CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 4
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 4
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 4
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 4
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 4
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical class CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical class OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000005332 diethylamines Chemical class 0.000 description 4
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 230000018711 interleukin-13 production Effects 0.000 description 4
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 4
- 150000004885 piperazines Chemical class 0.000 description 4
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical class CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N benethamine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCCC1=CC=CC=C1 UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 208000028172 protozoa infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical class F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 101000800479 Homo sapiens Toll-like receptor 9 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical class NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical class NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 240000000599 Lentinula edodes Species 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical class NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 229920000519 Sizofiran Polymers 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000005228 aryl sulfonate group Chemical group 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 102000045710 human TLR9 Human genes 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical class I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000004226 microchip electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000002815 nickel Chemical class 0.000 description 2
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical class OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 229950001403 sizofiran Drugs 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical class C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 2
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVDSFPIEJILRME-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(4-sulfophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)(C)C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 MVDSFPIEJILRME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WAVYAFBQOXCGSZ-UHFFFAOYSA-N 2-fluoropyrimidine Chemical compound FC1=NC=CC=N1 WAVYAFBQOXCGSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N Carbon-12 Chemical compound [12C] OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 235000001715 Lentinula edodes Nutrition 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000222481 Schizophyllum commune Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000004351 endosome localization Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 201000010255 female reproductive organ cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L fumarate(2-) Chemical class [O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000022023 interleukin-5 production Effects 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L malate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 229940098895 maleic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002688 maleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004701 malic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M methanesulfonate group Chemical class CS(=O)(=O)[O-] AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- QPUKANZXOGADOB-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n-methylnitrous amide Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(C)N=O QPUKANZXOGADOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940039748 oxalate Drugs 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- 150000003890 succinate salts Chemical class 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1[C@@H]1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 229960001674 tegafur Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002827 triflate group Chemical class FC(S(=O)(=O)O*)(F)F 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
Description
本発明は、免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途、並びに、当該複合体を形成するためのオリゴヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、免疫賦活活性を有するCpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）及びβ−グルカンを含有する複合体及びその医薬用途、並びに、当該複合体を形成するためのODNに関する。
CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活活性（免疫賦活性）のCpGモチーフ（CpGサイトの出現率が、ゲノム中で他と比べて高い領域のこと）を含有する、短い（約20塩基対）、一本鎖の合成DNA断片であって、Toll様受容体９（TLR9）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（DCｓ）及びB細胞を活性化して、I型インターフェロン（IFNｓ）及び炎症性サイトカインを産生させ（非特許文献１及び２）、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）反応を含む、Th1型の液性及び細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（非特許文献３及び４）。そこで、CpG ODNは、感染症、癌、喘息及び花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（非特許文献２及び５）。
骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、少なくとも4つの型のCpG ODNがある（非特許文献６）。D型（A型とも呼ばれる）CpG ODNは、典型的には、ホスホジエステル（PO）骨格及びホスホロチオエート（PS）ポリGテイルと共に1つの回文構造のCpGモチーフを含み、形質細胞様DCs（pDCs）を活性化して大量のIFN-αを産生させるが、pDC成熟化やB細胞活性化を誘導できない（非特許文献７及び８）。他の３つの型のODNは、PS骨格からなる。K型（B型とも呼ばれる）CpG ODNは、典型的には、非回文構造の、複数のCpGモチーフを含有し、B細胞を強力に活性化してIL-6を産生させ、pDCsを活性化して成熟化させるが、ほとんどIFN−αを産生させない（非特許文献８及び９）。近年、開発されたC型及びP型のCpG ODNはそれぞれ1つ及び2つの回文構造CpG配列を含有しており、双方ともK型の様にB細胞を活性化させ、D型の様にpDCsを活性化させることができるが、P型CpG ODNと比較して、C型CpG ODNは、IFN-α産生をより弱く誘導する（非特許文献１０−１２）。特許文献１に、多数の優れたK型 CpG ODNが記載されている。
D型及びP型CpG ODNは、G-tetradsと呼ばれる平行4本鎖構造を形成するフーグスティーン塩基対、及びシス回文構造部位とトランス回文構造部位との間のワトソン−クリック塩基対、という高次構造をそれぞれ形成することが示されており、これらはpDCsによる強力なIFN-α産生に必要である（非特許文献１２−１４）。このような高次構造は初期エンドソームへの局在化やTLR9を介する情報伝達に必要であるようだが、これらは産物の多型性及び沈殿の影響を受け、その結果その臨床応用を妨げている（非特許文献１５）。従って、K型及びC型CpG ODNのみが、ヒト用の免疫療法剤及びワクチンアジュバントとして一般的に利用可能である（非特許文献１６及び１７）。K型CpG ODNは、ヒト臨床試験において、感染症及び癌を標的とするワクチンの免疫原性を高めるが（非特許文献６及び１６）、最適なアジュバント効果のためには、抗原とK型CpG ODNとの間の化学的及び物理的連結が必要である。これらの結果は、４つの型（K、D、P、及びC）のCpG ODNには長所及び短所があることを示しており、アグリゲーションすることなく、B細胞及びpDCsの両方を活性化する「オール・イン・ワン」CpG ODNの開発が期待されている。
スエヒロタケ（Schizophyllum commune）由来の可溶性β−1,3−グルカンであるシゾフィラン（SPG）は、子宮頸癌患者における放射線療法の賦活薬として日本においてここ３０年に亘り認可されている医薬である（非特許文献１８）。同様に、シイタケ（Lentinula edodes）由来の可溶性β−1,3−グルカンであるレンチナン（LNT）は、１９８５年に承認された医薬であり、手術不能および再発胃癌患者に対しフルオロピリミジン系薬剤との併用で使用されている（非特許文献１９及び２０）。β−1,3−グルカンは、ポリデオキシアデニル酸（dA）と三重螺旋構造の複合体を形成することが示されている（非特許文献２１）。
特許文献２〜４には、シゾフィランを含むβ−1,3−グルカンと核酸（遺伝子）との水溶性複合体の遺伝子キャリアとしての使用が開示されている。これらの文献には、該複合体を形成することにより、遺伝子のアンチセンス作用及び核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）への耐性作用が高められることが記載されている。
特許文献５には、β−1,3−結合を有する多糖類をキャリアー（トランスフェクション剤）として用いることにより、CpG配列を含み、リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの作用が高められることが開示されている。
特許文献６には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、長鎖のβ−1,6−グルコシド結合側鎖を有するβ−1,3−グルカンとからなることを特徴とする免疫刺激性複合体が記載されている。
本発明者らは、以前、SPGと複合体化した、５’末端にリン酸ジエステル結合を有するポリ(ｄA)を連結させたマウス及びヒト化したCpG ODNが、サイトカイン産生を増強し、インフルエンザワクチンアジュバントやTh2細胞関連疾患の予防または治療剤として作用することを示した（非特許文献２２及び２３、並びに特許文献７）。K型及びD型のそれぞれのCpGの5’末端にポリ（dA）を付加し、SPGと複合体を形成すると、それぞれK型及びD型の特性を維持しつつ、その活性が増強された。しかしながら、より効果的で、高い費用効率が求められる、前臨床及び臨床開発へ向けて、CpG-SPG複合体の高収率を達成することが困難であった。近年、CpG ODNにホスホロチオエート結合を有するポリ(ｄA)を連結すると、複合体形成がほとんど１００％にまで上昇することが示された（非特許文献２４）。しかしながら、最適なヒト化CpG配列を同定し、４つの型のCpG ODNの「オール・イン・ワン」活性を得るための因子を最適化するための綿密な試験はなされていない。
特許文献８には、抗原／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法が開示されている。
Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000).
Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006).
Brazolot Millan, C.L., Weeratna, R., Krieg, A.M., Siegrist, C.A. & Davis, H.L. CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 15553-15558 (1998).
Chu, R.S., Targoni, O.S., Krieg, A.M., Lehmann, P.V. & Harding, C.V. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. The Journal of experimental medicine 186, 1623-1631 (1997).
Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004).
Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009).
Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).
Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).
Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).
Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003).
Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motif that optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).
Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatory CpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).
Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005).
Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).
Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN type D: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488-6495 (2006).
Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).
McHutchison, J.G., et al. Phase 1B, randomized, double-blind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).
Okamura, K., et al. Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986).
Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J.Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.
Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi-institutional prospective studyof lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect on prolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668.
Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide-polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the natural polysaccharide schizophyllan in the macromolecular complex with single-stranded RNA and DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).
Shimada, N., et al. A polysaccharide carrier to effectively deliver native phosphodiester CpG DNA to antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007).
Koyama, S., et al. Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).
Minari, J., et al. Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin-1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).
本発明が解決しようとする課題は、従前のCpG-SPG複合体よりも強力な活性を有する免疫賦活剤を提供することである。
本発明者らは鋭意検討を行ったところ、3’末端にポリ（dA）テイルを有するK型CpG ODNであるK3（配列番号２）及びSPGを含む新規の複合体、即ちK3-SPG、並びに、3’末端にスペーサーを介してポリ（dA）テイルを有するK3（以下、K3-spacerとよぶ）及びSPGを含む新規の複合体、即ちK3-spacer-SPGを同定した。これらは、完全に可溶化することのできる、高次ナノ粒子を形成した。同様に、本発明者らは前記K型CpG ODN及びレンチナン(LNT)を含む新規の複合体K3-LNT、並びに、K3-spacer及びLNTを含む新規の複合体、即ちK3-spacer-LNTの作製にも成功した。K3-SPG, K3-spacer-SPG, K3-LNT, K3-spacer-LNTはD型CpG ODN配列を有していないにも係わらず、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）とを併せ持っていた。更に、K3-LNT、K3-spacer-LNT、K3-spacer-SPG及びK3-SPGは強力なワクチンアジュバント活性を有しており、抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導し、実際、RSウイルス又はインフルエンザウイルスに対し非常に強い感染防御効果を示した。これらの知見に基づいて更に検討を進め、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して結合している、オリゴデオキシヌクレオチド。
［２］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、１または複数個の非メチル化CpGモチーフを含む、［１］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［３］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列TCGAまたはTCGTを含む、［１］又は［２］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［４］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［５］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合で置換されている、［１］〜［４］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［６］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［５］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［７］ポリデオキシアデニル酸の長さが、20〜60ヌクレオチド長である、［１］〜［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［８］スペーサーが、式（Ａ）
［１］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して結合している、オリゴデオキシヌクレオチド。
［２］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、１または複数個の非メチル化CpGモチーフを含む、［１］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［３］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列TCGAまたはTCGTを含む、［１］又は［２］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［４］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［５］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合で置換されている、［１］〜［４］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［６］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［５］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［７］ポリデオキシアデニル酸の長さが、20〜60ヌクレオチド長である、［１］〜［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［８］スペーサーが、式（Ａ）
（式中、ｍは２、３、４、５、６、７、８又は９であり、ｎは１、２、３、４、５又は６であり、式（３ｍ＋２）ｎは、８以上６０以下であり、複数のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立して水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｘは酸素原子又は硫黄原子である。）で表される基、又は、式（Ｂ）
（式中、ｓは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２であり、ｔは１、２、３、４、５又は６であり、（ｓ＋３）ｔは、８以上６０以下であり、複数のＲ５及びＲ６は互いに独立して水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｘは酸素原子又は硫黄原子である。）で表される基である、［１］〜［７］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［９］スペーサーが、式（Ａ１）
［９］スペーサーが、式（Ａ１）
（式中、ｍは４、５又は６であり、ｎは１又は２であり、式（３ｍ＋２）ｎは、１４以上４０以下であり、複数のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はいずれも水素原子であり、Ｘは硫黄原子である。）で表される基、又は、式（Ｂ１）
（式中、ｓは８、９、１０、１１又は１２であり、ｔは１又は２であり、（ｓ＋３）ｔは、１４以上４０以下であり、複数のＲ５及びＲ６はいずれも水素原子であり、Ｘは硫黄原子である。）で表される基である、［１］〜［８］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［１０］スペーサーが、式
［１０］スペーサーが、式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基である、［１］〜［９］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1, 3−グルカンを含有する複合体。
［１２］β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである［１１］に記載の複合体。
［１３］β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである［１２］に記載の複合体。
［１４］下記（i）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び（ii）に記載のβ−1, 3−グルカンからなる［１１］に記載の複合体。
（i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
（ii）レンチナン又はシゾフィラン
［１５］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1, 3−グルカンを含有する複合体。
［１２］β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである［１１］に記載の複合体。
［１３］β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである［１２］に記載の複合体。
［１４］下記（i）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び（ii）に記載のβ−1, 3−グルカンからなる［１１］に記載の複合体。
（i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
（ii）レンチナン又はシゾフィラン
［１５］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる［１１］に記載の複合体。
［１６］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜50ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
［１６］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜50ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカンからなる［１５］に記載の複合体。
［１７］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜45ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
［１７］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜45ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカンからなる［１６］に記載の複合体。
［１８］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に40ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
［１８］配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に40ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及び、レンチナン又はシゾフィランからなる［１７］に記載の複合体。
［１９］三重螺旋構造状のものである、［１１］〜［１８］のいずれかに記載の複合体。
［２０］B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、［１１］〜［１９］のいずれかに記載の複合体。
［２１］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
［２２］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］ウイルス感染症の予防又は治療のための、［２２］に記載の医薬組成物。
［２４］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び／又はII型インターフェロン産生誘導剤。
［２６］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
［２７］ワクチンアジュバントである、［２６］の免疫賦活剤。
［２８］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
［２９］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［２８］に記載の予防又は治療剤。
［３０］医薬組成物の製造のための、［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の使用。
［３１］医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、［３０］に記載の使用。
［３２］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３１］に記載の使用。
［３３］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
［３４］疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、［３３］に記載の方法。
［３５］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３４］に記載の方法。
［３６］温血動物がヒトである、［３３］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
［３８］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体。
［３９］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３８］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
［４０］(a)［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。
［４１］該抗原に対する免疫反応を誘導するための、［４０］に記載の組成物。
［４２］抗原が病原体由来の抗原である、［４１］に記載の組成物。
［４３］病原体の感染症の予防又は治療用である、［４２］に記載の組成物。
［４４］病原体がウイルスである、［４３］に記載の組成物。
［４５］ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、［４４］に記載の組成物。
［１９］三重螺旋構造状のものである、［１１］〜［１８］のいずれかに記載の複合体。
［２０］B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、［１１］〜［１９］のいずれかに記載の複合体。
［２１］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
［２２］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］ウイルス感染症の予防又は治療のための、［２２］に記載の医薬組成物。
［２４］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び／又はII型インターフェロン産生誘導剤。
［２６］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
［２７］ワクチンアジュバントである、［２６］の免疫賦活剤。
［２８］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
［２９］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［２８］に記載の予防又は治療剤。
［３０］医薬組成物の製造のための、［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の使用。
［３１］医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、［３０］に記載の使用。
［３２］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３１］に記載の使用。
［３３］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
［３４］疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、［３３］に記載の方法。
［３５］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３４］に記載の方法。
［３６］温血動物がヒトである、［３３］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
［３８］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体。
［３９］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３８］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
［４０］(a)［１］〜［１０］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［１１］〜［２０］のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。
［４１］該抗原に対する免疫反応を誘導するための、［４０］に記載の組成物。
［４２］抗原が病原体由来の抗原である、［４１］に記載の組成物。
［４３］病原体の感染症の予防又は治療用である、［４２］に記載の組成物。
［４４］病原体がウイルスである、［４３］に記載の組成物。
［４５］ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、［４４］に記載の組成物。
本発明により、優れた免疫賦活活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。特に、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、本発明の複合体は強力なワクチンアジュバント活性を有しており、本発明の複合体を抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激し、非常に強い感染防御効果を示す。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして有用である。
１．オリゴデオキシヌクレオチド
本発明は、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸（dA）を含む、オリゴデオキシヌクレオチド（以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。）を提供するものである。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾（例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換）されているものを含む。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
なお、本明細書においてオリゴデオキシヌクレオチドとODNは同義である。また、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」と、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、交換可能に用いられる。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸（残基）は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
本発明は、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸（dA）を含む、オリゴデオキシヌクレオチド（以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。）を提供するものである。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾（例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換）されているものを含む。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
なお、本明細書においてオリゴデオキシヌクレオチドとODNは同義である。また、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」と、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、交換可能に用いられる。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸（残基）は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活性の非メチル化CpGモチーフを含有する一本鎖DNAであり、TLR9のアゴニストである。CpG ODNには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、K型（B型とも呼ばれる）、D型（A型とも呼ばれる）、C型及びP型の４つの型がある（Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)）。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、これらのうちK型CpG ODNを含む。
K型CpG ODNは、典型的には非回文構造の、複数の非メチル化CpGモチーフを含有し、B細胞を活性化してIL-6を産生させるが、形質細胞様樹状細胞（pDCs）のIFN-α産生をほとんど誘導しないという構造的及び機能的特性を有するCpG ODNである。非メチル化CpGモチーフとは少なくとも１つのシトシン（C）−グアニン（G）配列を含む短いヌクレオチド配列であって、該シトシン−グアニン配列におけるシトシンの５位がメチル化されていないものを差す。なお、以下の説明において、CpGとは、特にことわらなり限り非メチル化CpGを意味する。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODNを含むことにより、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する。当該技術分野において多数のヒト化K型CpG ODNが知られている（Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001)；Journal of immunology 164, 944-953 (2000)；US 8, 030, 285 B2）。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、好ましくはヒト化されている。「ヒト化」とは、ヒトTLR9に対するアゴニスト活性を有することを意味する。従って、ヒト化K型CpG ODNを含む本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒトに対してK型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、ヒトB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する。
本発明において好適に用いられるK型CpG ODNは、10ヌクレオチド以上の長さであり、１つまたは複数の非メチル化CpGモチーフを含む。
本発明においてより好適に用いられるK型CpG ODNは１つまたは複数のCpGモチーフを含む非回文構造を含有する。更に好適に用いられるK型CpG ODNは１つまたは複数のCpGモチーフを含む非回文構造からなる。
ヒト化K型CpG ODNは、一般的に、TCGA又はTCGTからなる４塩基のCpGモチーフを特徴とする。また、多くのケースにおいて、一つのヒト化K型CpG ODN中にこの４塩基のCpGモチーフが２又は３個含まれる。従って、好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、少なくとも１個、より好ましくは２以上、更に好ましくは２又は３個、TCGA又はTCGTからなる４塩基のCpGモチーフを含む。該K型CpG ODNが２又は３個の４塩基のCpGモチーフを有する場合、これらの４塩基のCpGモチーフは同一であっても異なっていてもよい。ただし、ヒトTLR9に対するアゴニスト活性を有する限り、特に限定されない。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む。
K型CpG ODNの長さは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、好ましくは100ヌクレオチド長以下（例えば、10-75ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、より好ましくは50ヌクレオチド長以下（例えば、10-40ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、更に好ましくは30ヌクレオチド長以下（例えば、10-25ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、最も好ましくは、12-25ヌクレオチド長である。
ポリデオキシアデニル酸（dA）の長さは、β−1,3−グルカン（好ましくは、レンチナン、又はシゾフィラン）鎖とともに三重螺旋構造を形成するのに十分な長さであれば特に限定されるものではないが、安定な三重螺旋構造を形成する観点からは、通常20ヌクレオチド長以上、好ましくは40ヌクレオチド長以上、より好ましくは60ヌクレオチド長以上である。ポリdAは、長ければ長いほどβ−1,3−グルカンと安定な三重螺旋構造を形成するので、理論的には上限はないが、長すぎると、オリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さにバラつきが生じる原因となるので、通常、100ヌクレオチド長以下、好ましくは80以下である。一方、前記安定な三重螺旋構造の形成に加え、単位量のβ−1,3−グルカンあたりに結合する本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量を増大させ、且つオリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さのばらつきの回避、複合化効率の観点からは、ポリdAの長さは、好ましくは、20〜60ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長 ）、より好ましくは、30〜50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30〜45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長）である。特に、30ヌクレオチド長以上の場合、良好な複合化効率を示す。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリdAを含むことにより、2本のシゾフィラン鎖とともに三重螺旋構造を形成する活性を有する。なお、ポリデオキシアデニル酸を「ポリ（dA）」又は「poly(dA)」と表記することもある。
１分子の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、複数個のK型CpG ODN及び／又はポリdAが含まれていてもよいが、好ましくは、K型CpG ODN及びポリdAが１つずつ含まれ、最も好ましくは、K型CpG ODN及びポリdAが１つずつからなる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリdAがK型CpG ODNの3’側に配置されていることを特徴とする。この配置により、本発明の複合体（詳細は下に述べる）が、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性に加えて、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性を有することとなる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、K型CpG ODNとポリdAとは、スペーサーを介して連結される。本発明においてスペーサーとは、８〜６０個の原子が直線状に連結した基を意味し、本発明においてスペーサーとして用いられる原子は、直鎖状に連結することができる原子であれば特に限定はなく、例えば、炭素原子、窒素原子、酸素原子、珪素原子、リン原子、硫黄原子が挙げられ、好適には炭素原子、酸素原子、リン原子である。本発明に用いられるスペーサーの直鎖を形成する原子には、水素原子、酸素原子、硫黄原子、水酸基、C1-6アルキル基などの置換基が結合していてもよく、当該置換基は、好適には、水素原子、硫黄原子、水酸基又はメチル基であり、より好適には、水素原子、硫黄原子又は水酸基である。本発明に用いられるスペーサー基は、より好ましくは、式（Ａ）
（式中、ｍは２、３、４、５、６、７、８又は９（好適には４、５又は６）であり、ｎは１、２、３、４、５又は６（好適には１又は２）であり、式（３ｍ＋２）ｎは、８以上６０以下（好適には１４以上４０以下）であり、複数のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立して水素原子又はＣ１−６アルキル基（好適にはいずれも水素原子）であり、Ｘは酸素原子又は硫黄原子（好適には硫黄原子）である。）で表される基、又は、式（Ｂ）
（式中、ｓは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２（好適には８、９、１０、１１又は１２）であり、ｔは１、２、３、４、５又は６（好適には１又は２）であり、（ｓ＋３）ｔは、８以上６０以下（好適には１４以上４０以下）であり、複数のＲ５及びＲ６は互いに独立して水素原子又はＣ１−６アルキル基（好適にはいずれも水素原子）であり、Ｘは酸素原子又は硫黄原子（好適には硫黄原子）である。）で表される基であり、更により好ましくは、式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回（好ましくは２回）繰り返して結合した基である。ここで、２回繰り返して結合した基は、例えば、式
で表される基である。
本発明に用いられるスペーサーは、例えば、対応するアミダイトを用いて製造することができる。式（Ａ）で表されるスペーサーに対応するアミダイトとしては、例えばPEGアミダイト（市販のものを用いるか、又は、特開２００２−１７６９８７号公報に記載の方法に準じて製造することができる）を挙げることができる。式（Ｂ）で表されるスペーサーに対応するアミダイトは、例えば両末端に水酸基を有するアルキレンジオールを、国際公開公報WO９９／１９４７４に記載の方法に準じてアミダイトに変換して入手することができる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、例えば、Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Pressに記載の方法に準じて製造することができ、具体的には、dA30、dA35、dA40などのポリdAの5'位に、上記スペーサーに対応するアミダイトをｎ回カップリングさせ、その後、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドに対応する部分をカップリングさせることにより製造することができる。
最も好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODN(具体的には、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチド)、スペーサー及びポリdAからなり、K型CpG ODNが該オリゴデオキシヌクレオチドの5’末端に、ポリdAが3’末端に、それぞれ位置し、K型CpG ODNとポリdAとがスペーサーを介して連結される。具体的には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’末端に20〜60ヌクレオチド長（より好ましくは、30〜50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49又は50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30〜45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44又は45ヌクレオチド長））のポリdAがスペーサーを介して結合したオリゴデオキシヌクレオチドである。例えば、以下の表に列挙したオリゴデオキシヌクレオチドである。
上記表に列挙されたオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列（スペーサー部分を除く）を配列番号２〜１７にそれぞれ示す。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの全長（スペーサー以外の部分のヌクレオチド長の合計）は、通常30〜200ヌクレオチド長、好ましくは35〜100ヌクレオチド長、より好ましくは40〜80ヌクレオチド長（具体的には、40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 又は80ヌクレオチド長）、より好ましくは、50〜70ヌクレオチド長（具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69又は70ヌクレオチド長）、最も好ましくは、50〜65ヌクレオチド長（具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64又は65ヌクレオチド長）である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、インビボにおける分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよい。好ましくは、該改変はホスホロチオエート修飾又はホスホロジチオエート修飾を含む。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合により置換されている。
好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の修飾を含み、より好ましくは、リン酸ジエステル結合の修飾は、ホスホロチオエート結合（即ち、WO 95/26204に記載されているように、非架橋酸素原子のうちの１つが、硫黄原子に置換される）である。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合により置換されている。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、K型CpG ODNにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合による修飾を含み、より好ましくは、該K型CpG ODNのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、ポリdAにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含み、より好ましくは、該ポリdAのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。更に好ましくは、本発明のヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含むオリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。最も好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（例、配列番号１）の3’末端に20〜60ヌクレオチド長（より好ましくは、30〜50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49又は50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30〜45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44又は45ヌクレオチド長））のポリdAがスペーサーを介して結合したオリゴデオキシヌクレオチドであって、当該オリゴデオキシヌクレオチドに含まれる全てのリン酸ジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されている。ホスホロチオエート結合により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、分解に対する抵抗性のみならず、免疫賦活活性（例えば、B細胞を活性化させてIL-6を産生させる活性）の増強、及びCpG-β-1,3-グルカン複合体の高収率が期待されるからである。なお、本明細書におけるホスホロチオエート結合はホスホロチオエート骨格と、リン酸ジエステル結合はリン酸骨格と同義である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、上記オリゴデオキシヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類を含む。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適な塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；及び、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩を挙げることができる。さらにより好適な塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、トリエチルアミン塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を挙げることができる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、水和物としても存在することができ、そのような水和物も本発明に包含される。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれの形態でもよいが、好ましくは１本鎖である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、分子内の不斉中心に基づく光学異性体が存在する場合がある。特に断りのない限り、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいては、これらの異性体及びこれらの異性体の任意の比率の混合物が全て本発明に含まれるものとする。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたオリゴデオキシヌクレオチド」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とするオリゴデオキシヌクレオチド重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、優れた免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有するので、免疫賦活剤等として有用である。更に、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、2本のβ−1,3−グルカン（好ましくは、レンチナン、シゾフィラン、又はスクレログルカン）とともに三重螺旋構造を形成する性質を有するので、下記の本発明の複合体の調製に有用である。
２．複合体
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1,3−グルカンを含有する複合体（以下、本発明の複合体と称する。）を提供するものである。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1,3−グルカンを含有する複合体（以下、本発明の複合体と称する。）を提供するものである。
上述の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODNを含むので、それ単独では、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を発揮し、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）に乏しい。しかしながら、驚くべきことに、β−1,3−グルカン（好ましくは、レンチナン、又はシゾフィラン）と複合体を形成することにより、D型CpG ODNの配列を要することなく、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を獲得する。即ち、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してIFN-αを産生させる活性）の両方を有する。
本発明で用いられるβ−1,3−グルカンとしては、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β−1,3−グルカンは、好ましくは、レンチナン、シゾフィランまたはスクレログルカンのように、１，６−グルコピラノシド分枝を多く含有する（側鎖率３３〜４０％）β−1,3−グルカンであり、より好ましくはレンチナン、又はシゾフィランであり、最も好ましくはレンチナンである。
レンチナン（LNT）は、シイタケ由来の公知のβ−1,3−1,6−グルカンであり、分子式は(C6H10O5)n、分子量は約30〜70万である。水、メタノール、エタノール（95）、又はアセトンにはほとんど溶けないが、極性有機溶媒であるDMSOや水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。
レンチナンは活性化マクロファージ、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞及び抗体依存性マクロファージ仲介性細胞障害作用(ADMC)活性の増強作用を有する（Hamuro, J., et al.：Immunology, 39, 551-559, 1980、Hamuro, J., et al.：Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980、 Herlyn, D., et al.：Gann, 76, 37-42, 1985）。動物実験においては同系腫瘍及び自家腫瘍に対して化学療法剤との併用投与により腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。また、レンチナンの単独投与によっても腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。臨床試験においては手術不能又は再発胃癌患者に対して、テガフール経口投与との併用により生存期間の延長が認められ（医薬品インタビューフォーム「レンチナン静注用1mg「味の素」」）、日本で承認されている。レンチナンの単独投与による効果は現在のところ確認されていない。
シゾフィラン（SPG）は、スエヒロタケ由来の公知の可溶性β−グルカンである。SPGは、β−（1→3）−D−グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当り１個のβ−（1→6）−D−グルコシル側鎖からなる（Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A.,「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（清水, 陳, 荷見, 増淵，「Biotherapy」, 1990, 4, p.1390，長谷川，「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p.225）、生体内での安全性が確認されている（Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909）。
本明細書において「複合体」とは、複数の分子が、静電結合、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合又は共有結合を介して会合することにより得られる産物を意味する。
本発明の複合体は薬学的に許容可能な塩を形成していてもよく、そのような塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適な塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；及び、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩を挙げることができる。さらにより好適な塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、トリエチルアミン塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を挙げることができる。
本発明の複合体は、好ましくは、三重螺旋構造状である。好ましい態様において、当該三重螺旋構造を形成する３本の鎖のうち、２本はβ−1,3−グルカン鎖であり、１本は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖である。なお、当該複合体は一部に、三重螺旋構造を形成していない部分を含んでいても良い。
本発明の複合体における、オリゴデオキシヌクレオチドとβ−1,3−グルカンの組成比は、オリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖長、及びβ−1,3−グルカンの長さ等に応じて、変化しうる。例えば、β−1,3−グルカン鎖と、ポリデオキシアデニル酸の鎖の長さが同等の場合には、２本のβ−1,3−グルカン鎖と、１本の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが会合し、三重螺旋構造を形成し得る。一般的には、β−1,3−グルカン鎖に対して、ポリデオキシアデニル酸の鎖長は短いので、２本のβ−1,3−グルカン鎖に対して、複数の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸を介して会合し、三重螺旋構造を形成し得る（図１０参照）。
本発明の複合体は、ヒト化K型CpG ODN及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン）を含有する複合体であり、好ましくは、ヒト化K型CpG ODN及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン）からなる複合体である。より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、K3-spacer-dA20〜60-LNT、K3-spacer-dA20〜60-SPG）であり、更に好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜50ヌクレオチド長（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49又は50ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、K3-spacer-dA30〜50-LNT、K3-spacer-dA30〜50-SPG）であり、更により好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜45ヌクレオチド長（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44又は45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基又は当該基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−1,3−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（K3-spacer-dA30〜45-LNT、K3-spacer-dA30〜45-SPG）であり、最も好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に40ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
のいずれかで表される基を２又は３回繰り返して結合した基からなるスペーサーを介して結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及び、レンチナン又はシゾフィランからなる複合体（K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-SPG）である。
本発明の複合体の調製は、非特許文献21〜24や、特開2008-100919号公報に記載された条件と同様に行うことができる。すなわち、本来は、天然で三重螺旋構造として存在するβ−1,3−グルカンを非プロトン性有機極性溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等）またはアルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等）に溶解して一本鎖に解く。このようにして得られた一本鎖のβ−1,3−グルカンの溶液と本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの溶液（水溶液、中性付近のpHの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のpHの緩衝水溶液）とを混合し、必要に応じて再度pHを中性付近に調整後、適当時間保持する。例えば、5℃で一夜保持する。その結果、２本のβ−1,3−グルカン鎖と該オリゴデオキシヌクレオチド中のポリdA鎖が三重螺旋構造を形成することにより、本発明の複合体が形成される。生成した複合体に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製、限外濾過、透析等を行うことにより、複合体未形成のオリゴデオキシヌクレオチドを除くことができる。また、生成した複合体に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、複合体未形成のβ−1,3−グルカンを除くことができる。上記の方法により、複合体を適宜精製することができる。
本発明の複合体の形成は、例えばＣＤ（円偏光二色性）スペクトルによるコンフォメーション変化、サイズ排除クロマトグラフィーによるUV吸収シフト、ゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動、キャピラリー電気泳動を測定することにより確認することができるが、これに限らない。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ−1,3−グルカンとの混合比は、ポリdA鎖の長さ等を考慮して適宜設定することができるが、通常モル比（β−1,3−グルカン(LNT等)/ODN）が0.02〜2.0、好ましくは0.1〜0.5である。更なる態様において、モル比（β−1,3−グルカン(LNT等)/ODN）が例えば0.005〜1.0、好ましくは0.020〜0.25である。
更なる局面において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ−1,3−グルカンとの混合比は、ポリdA鎖の長さ等を考慮して適宜設定することができ、例えば、ポリdA鎖のアデノシン数（dA）とβ−1,3−グルカンの主鎖グルコース数（mG）の比率により設定することができる。通常、mG/dA比が2.0〜10であり、好ましくは2.0〜6.0であり、より好ましくは2.0〜4.0であり、更に好ましくは2.0〜3.0である。
本発明の複合体の調製方法についてCpG-spacer-ODNとLNT複合体を例に説明する。LNTを０．０５〜２Ｎ、好ましくは０．１〜１．５Ｎのアルカリ水溶液（例えば、0.25Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）に溶解させ、1℃〜40℃で10時間〜4日間放置し（例えば、室温で一晩放置する）、一本鎖のLNT水溶液（例えば、50mg/mlのLNT水溶液）を調製する。前記LNT水溶液と別途調製したCpG-spacer-ODN水溶液（例えば、100μMの CpG水溶液）をモル比（LNT/ODN）0.005〜1.0で混合し、続いて、前記LNT、CpG-spacer-ODN混合液に酸性の緩衝水溶液（例えば、NaH2PO4）を加えて中和し、1〜40℃で6時間〜4日間（例えば、4℃で一晩）維持することで複合体化を完了させる。なお、前記複合化のためにLNT水溶液を最後に加え混合しても良い。複合体の形成は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、CpG-spacer-ODNの高分子量側へのシフトを240〜280nm（例えば、260nm）における吸収をモニタリングすることによって確認することができる。
一態様において、本発明の複合体は、竿状の粒子の形態を呈する。粒子径は、材料として用いるβ−1,3−グルカン（例、シゾフィラン）が天然で三重螺旋構造を呈することにより形成する粒子の径と同等であり、通常平均粒子径が10-100 nm、好ましくは20-50 nmである。該粒子径は、複合体を水に溶解又は分散し、Malvern Instruments Zeta Sizerを用いて80℃の条件で動的光散乱法により計測することができる。
本発明の複合体は、好ましくは単離されている。「単離された複合体」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とする複合体重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
本発明の複合体は、優れた免疫賦活活性を有し、特に、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してIFN-αを産生させる活性）の両方を有するので、免疫賦活剤等として有用である。例えば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、配列番号２〜１７）とLNTを含む複合体（例、K3-spacer-LNT）及び本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、配列番号２〜１７）とSPGを含む複合体（例、K3-spacer-SPG）は、炎症応答誘導能（pan-IFN-a、IL-6等）、ウイルス接種個体における血清中抗原特異的IgG抗体価（Total IgG, IgG2c等）の増強作用、ウイルス接種個体における抗原特異的サイトカイン産生能（IFN-γ,IL2等）、ウイルスに対する感染防御効果を有する。K3-spacer-LNTについてはウイルス接種個体においてTh2型サイトカイン（IL-13等）の産生増強能も有する。従って、新規ワクチンアジュバント候補として有用である。
３．医薬組成物
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のpHは5〜10が挙げられ、好ましくは6〜8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の粉末製剤を調製することもできる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
医薬組成物中の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1〜100重量%、好ましくは約1〜99重量%、さらに好ましくは約10〜90重量%程度である。
本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を単独で含有していてもよく、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を他の有効成分と組み合わせて含有していてもよい。
４．医薬用途
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、D型CpG ODNの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン（Pan-IFN-α、IFN-α２等）及びII型インターフェロン（IFN-γ）の両方を大量に産生させるので、I型インターフェロン産生誘導剤、II型インターフェロン産生誘導剤、I型及びII型インターフェロン産生誘導剤として有用である。I型及びII型インターフェロンの両方の産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型及びII型インターフェロンのいずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが有効な疾患としては、ウイルス感染症（例えば、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等）、癌等を挙げることが出来る。II型インターフェロンが有効な疾患としては、アレルギー疾患、細胞内寄生性の原虫（リーシュマニア等）や細菌（リステリア、結核菌等）等の感染症等を挙げることが出来る。RSウイルスやインフルエンザウイルスを含む急性ウイルス感染症に対しては、I型インターフェロン及びII型インターフェロン共に、ウイルス排除に関する免疫応答を高めるので、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、急性ウイルス感染症に対する有効性が期待できる。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、D型CpG ODNの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン（Pan-IFN-α、IFN-α２等）及びII型インターフェロン（IFN-γ）の両方を大量に産生させるので、I型インターフェロン産生誘導剤、II型インターフェロン産生誘導剤、I型及びII型インターフェロン産生誘導剤として有用である。I型及びII型インターフェロンの両方の産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型及びII型インターフェロンのいずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが有効な疾患としては、ウイルス感染症（例えば、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等）、癌等を挙げることが出来る。II型インターフェロンが有効な疾患としては、アレルギー疾患、細胞内寄生性の原虫（リーシュマニア等）や細菌（リステリア、結核菌等）等の感染症等を挙げることが出来る。RSウイルスやインフルエンザウイルスを含む急性ウイルス感染症に対しては、I型インターフェロン及びII型インターフェロン共に、ウイルス排除に関する免疫応答を高めるので、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、急性ウイルス感染症に対する有効性が期待できる。
また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体、特に、本発明の複合体は、強力なワクチンアジュバント活性を有し、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体を、抗原と共に、哺乳動物へ投与すると、該抗原に対する免疫反応を強力に誘導することが出来る。したがって、本発明は、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物をも提供するものである。特に、本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）と細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導する。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体、及び医薬組成物、特に本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、ワクチンアジュバントとして有用である。
本明細書において、アジュバントとは免疫応答を促す補助剤のことであり、抗原とともに生体に投与されたとき、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質を意味する。
抗原としては、投与対象の哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）にとって抗原性を有しており、抗体又は細胞傷害性Tリンパ球（CTL, CD8+T細胞）が抗原として認識し得る限り、特に限定されるものではなく、抗原となるあらゆる物質（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質、ならびに前記物質の修飾体（例えば、一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加等（以下、変異等）を導入した修飾体など）を用いることができる。抗原としては、原虫、真菌、細菌、ウイルスなどの病原体由来の抗原、癌、または特定の疾患に関係する抗原も用いられ得る。
本明細書において、「抗原Aが、病原体Xに由来する」とは、抗原Aが、当該病原体Xに構成因子として含まれることを意味する。例えば、抗原Aがポリペプチドである場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、病原体Xのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸配列中に存在することを意味する。
病原体由来の抗原としては、病原体そのもの又はその一部、不活化又は弱毒化した病原体そのもの又はその一部、あるいはそれらの変異等を導入した修飾体等が挙げられる。
抗原として病原体由来の抗原を用いると、当該抗原に対する免疫反応が惹起され、該抗原を含む病原体を免疫学的に生体外へ排除する仕組みが構築される。従って、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 病原体由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、当該病原体に起因する疾患（例、病原体の感染症）の予防又は治療のために有用である。
本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）とともに、細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導する。従って、細胞傷害性Tリンパ球により認識されることが知られている細胞内感染性の病原体（ウイルス、原虫、真菌、細菌等）由来の抗原や、癌化した細胞に関連した抗原（例えば、腫瘍抗原）等が抗原として好適に用いられる。
細胞内感染性ウイルスとしては、特に限定されないが、RSウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス（HCV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンパーウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-1）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス等が挙げられる。細胞内感染性バクテリアとしては、マイコプラズマ等が挙げられる。細胞内感染性原虫としては、マラリア原虫、住血吸虫等が挙げられる。細胞内感染性病原体は好ましくはウイルス（具体的には、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス等）である。
癌化した細胞に関連した抗原としては、癌化した細胞において特異的に発現する蛋白質、糖鎖、ペプチド、ならびに前記物質の変異体（欠失、置換、及び／又は付加）又はその修飾体などが挙げられる。
本発明の複合体は、I型及びII型インターフェロンの両方を強力に誘導するので、一態様において、ウイルスとして、I型インターフェロン及びII型インターフェロンの両方が有効な急性ウイルス感染症を引き起こすウイルス（例、RSウイルス、インフルエンザウイルス）が選択される。
例えば、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 病原体や癌由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物を、当該病原体感染症や癌の患者、当該病原体感染症や癌に罹患する可能性のあるヒトに投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を抗原特異的に活性化させ、該抗原特異的な抗体産生を誘導し、即ち、温血動物（好ましくは、ヒト）の防御免疫反応を誘導することにより、該感染症や癌を予防・治療することが出来る。即ち、該組成物は、上記感染症、癌等の疾患の予防又は治療のためのワクチンとして有用である。
また、本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）と細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導することができるので、抗原として、病原体や癌細胞の表面抗原と内部抗原のいずれを用いることも可能であり、表面抗原と内部抗原とを混合して用いることも、また望ましい。
(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b)抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、上記本発明の医薬組成物に準じて調製することができる。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１−３及び参考例１］
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40の合成
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40は、表２に示し、以下のような方法で合成した。
［実施例１−３及び参考例１］
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40の合成
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40は、表２に示し、以下のような方法で合成した。
表２中、左端が5'末端を表し、右端が3'末端を表す。X部分（スペーサー部分ともいう）は、S18, S12, S9又はC12から選択され、nは、その繰り返しの数を表す。n=1の場合は、特に記載しない場合もある。スペーサー及びdA40を有するK3（K3-spacerとも表記する）であって、スペーサーとしてS18を2回繰り返したもの（又は、S18を2ユニット含むもの）は、K3-(S18)2-dA40と表記される。
As、Cs、Gs、Ts、A、S18、S12、S9及びC12は、以下の構造で表される。
本オリゴデオキシヌクレオチドは、常法である固相ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press）を用いて合成した。S18の部分を合成する際には、Spacer 18（DMT-Hexa-ethoxy-glycol phosphoramidite、ChemGene、カタログ番号：CLP-9765）を用い、S12の部分を合成する際には、Spacer 12（DMT-Tetraethoxy-glycol phosphoramidite、ChemGene、 カタログ番号：CLP-1368）を用い、S9の部分を合成する際には、Spacer 9（DMT-Triethoxy-glycol phosphoramidite、 ChemGene、カタログ番号：CLP-1113）を用い、C12の部分を合成する際には、Carbon 12（DMT-Dodecane-Diol phosphoramidite、ChemGene、カタログ番号：CLP-1114）を用いた。
表３に表２記載のK3-spacerの分子量（計算値）、質量分析による測定値、及び、以下の条件で逆相HPLCで分析した場合の保持時間を示す（カラム:Waters-, X-Bridge C18 2.5μm, 4.6 x 75 mm、A溶液：100 mM ヘキサフルオロイソプロパノール、8 mM トリエチルアミン、B溶液：メタノール、B%:5%→30%（20 min， linear gradient）;60℃;1 ml/min;260 nm）。
［参考例２］
K3-dA40とSPGとの複合体（K3-SPG複合体）の調製
［その１］
7.22 mgのK3-dA40を水(3.7mL)に溶解した。SPG（三井製糖）15 mgを0.25 N NaOH (1 mL)に溶解した。1 mLの330 mM NaH2PO4をDNA溶液に加え、次にSPG溶液をDNA/NaH2PO4溶液に加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。モル比（MSPG/MDNA）は、0.27に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置（SHIMADZU：MultiNA）によって確認した。
K3-dA40とSPGとの複合体（K3-SPG複合体）の調製
［その１］
7.22 mgのK3-dA40を水(3.7mL)に溶解した。SPG（三井製糖）15 mgを0.25 N NaOH (1 mL)に溶解した。1 mLの330 mM NaH2PO4をDNA溶液に加え、次にSPG溶液をDNA/NaH2PO4溶液に加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。モル比（MSPG/MDNA）は、0.27に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置（SHIMADZU：MultiNA）によって確認した。
［その２］
SPG（三井製糖）を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-dA40は100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG 8.12mgとK3-dA40 4.17mgを混合し、続いて、SPGと同体積（541.4μl）の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-dA40の高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。K3-dA40の保持時間が30.35minであったのに対し、K3-SPG複合体の保持時間は21.99minであった。また、そのピークシフトは100%であったことから、K3-SPG複合体の形成が確認された（System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer: 100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃）。
SPG（三井製糖）を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-dA40は100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG 8.12mgとK3-dA40 4.17mgを混合し、続いて、SPGと同体積（541.4μl）の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-dA40の高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。K3-dA40の保持時間が30.35minであったのに対し、K3-SPG複合体の保持時間は21.99minであった。また、そのピークシフトは100%であったことから、K3-SPG複合体の形成が確認された（System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer: 100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃）。
［実施例４］
K3-spacerとLNTとの複合体（K3-spacer-LNT複合体）の調製
レンチナン（LNT：味の素株式会社、ロット番号：2D8X1）を50mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。LNT水溶液とK3-spacer水溶液を表４に示す比率で混合し、続いて、添加したLNTと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した（以後、K3-spacer-LNTと表記する）。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件A
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GF7M-HQ (Shodex) 2本連結、Flow rate:0.8mL/min、Buffer:10mM EDTA PBS, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
K3-spacerとLNTとの複合体（K3-spacer-LNT複合体）の調製
レンチナン（LNT：味の素株式会社、ロット番号：2D8X1）を50mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。LNT水溶液とK3-spacer水溶液を表４に示す比率で混合し、続いて、添加したLNTと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した（以後、K3-spacer-LNTと表記する）。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件A
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GF7M-HQ (Shodex) 2本連結、Flow rate:0.8mL/min、Buffer:10mM EDTA PBS, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
上記の分析条件における、各種K3-spacer、及び各種K3-spacer-LNT複合体の保持時間、K3-spacer-LNT複合体の含量(%)を表５に示した。いずれも、K3-spacerのピークシフトが確認されたことから、K3-spacer-LNT複合体の形成が証明された。
［実施例５］
K3-spacerとSPGとの複合体（K3-spacer-SPG複合体）の調製
シゾフィラン（SPG：三井製糖株式会社）を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG水溶液とK3-spacer水溶液を表６に示す比率で混合し、続いて、添加したSPGと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した（以後、K3-spacer-SPGと表記する）。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
K3-spacerとSPGとの複合体（K3-spacer-SPG複合体）の調製
シゾフィラン（SPG：三井製糖株式会社）を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG水溶液とK3-spacer水溶液を表６に示す比率で混合し、続いて、添加したSPGと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した（以後、K3-spacer-SPGと表記する）。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
上記の分析条件における、各種K3-spacer、及び各種K3-spacer-SPG複合体の保持時間、K3-spacer-SPG複合体の含量(%)を表７に示した。いずれも、90%以上の割合で、K3-spacerのピークシフトが確認されたことから、K3-spacer-SPG複合体の形成が証明された。
［試験例１］
（１）方法
動物
C57BL/6Jマウスは、日本クレアから購入した。全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実施した。
（１）方法
動物
C57BL/6Jマウスは、日本クレアから購入した。全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実施した。
ヒトPBMCsの調製及び刺激（図１、４、７）
凍結ヒトPBMCs（Lonza社、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517）を融解し、コンプリートRPMI（10% FCS、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたRPMI 1640）で1 x 107 個/mlの細胞密度に調製した。U底96 well細胞培養プレートに100 μL/wellで播種し、各ワクチンアジュバントで24時間刺激した。刺激後、培養上清中のpan-IFN-α (Mabtech)およびIL-6 (R&D)をサイトカインELISAによって定量した。図1におけるK3-spacer-LNTに付される＃１または＃２は、それぞれmG/dAモル比が2.5または3.0の条件で作製されたアジュバント複合体を指す。
凍結ヒトPBMCs（Lonza社、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517）を融解し、コンプリートRPMI（10% FCS、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたRPMI 1640）で1 x 107 個/mlの細胞密度に調製した。U底96 well細胞培養プレートに100 μL/wellで播種し、各ワクチンアジュバントで24時間刺激した。刺激後、培養上清中のpan-IFN-α (Mabtech)およびIL-6 (R&D)をサイトカインELISAによって定量した。図1におけるK3-spacer-LNTに付される＃１または＃２は、それぞれmG/dAモル比が2.5または3.0の条件で作製されたアジュバント複合体を指す。
RSV Fワクチン抗原に対する抗体価測定（図２、５、８）
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μg（核酸アジュバントでは核酸用量で10 μg）の混合製剤を2週間隔で2回接種した。最終免疫から1週後に末梢血の回収と血清の調製を行い、評価試料とした。血清中のRSV Fワクチン抗原に結合するtotal IgGおよびIgGサブクラスは、ELISA法を用いて測定した。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μg（核酸アジュバントでは核酸用量で10 μg）の混合製剤を2週間隔で2回接種した。最終免疫から1週後に末梢血の回収と血清の調製を行い、評価試料とした。血清中のRSV Fワクチン抗原に結合するtotal IgGおよびIgGサブクラスは、ELISA法を用いて測定した。
RSV Fワクチン抗原特異的T細胞サイトカイン産生能（図３、６、９）
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から1週後に脾臓を回収し、脾臓細胞を調製した。96 well培養プレートに播種した脾臓細胞を、RSV F抗原のMHC class I拘束性エピトープペプチド、MHC class II拘束性エピトープペプチド、ワクチン抗原タンパク質それぞれで刺激し、24時間もしくは48時間、培養した。RSV F抗原特異的サイトカイン産生能は、培養上清を試料とし、サイトカインELISA法を用いて評価した。本検討では、Th1型サイトカインであるIFN-g、活性化T細胞から産生されるIL-2、Th2型サイトカインであるIL-5およびIL-13の４種のサイトカインについて評価した。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から1週後に脾臓を回収し、脾臓細胞を調製した。96 well培養プレートに播種した脾臓細胞を、RSV F抗原のMHC class I拘束性エピトープペプチド、MHC class II拘束性エピトープペプチド、ワクチン抗原タンパク質それぞれで刺激し、24時間もしくは48時間、培養した。RSV F抗原特異的サイトカイン産生能は、培養上清を試料とし、サイトカインELISA法を用いて評価した。本検討では、Th1型サイトカインであるIFN-g、活性化T細胞から産生されるIL-2、Th2型サイトカインであるIL-5およびIL-13の４種のサイトカインについて評価した。
（２）結果
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能
K3-spacer単独（K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40）、およびK3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)2-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)3-dA40-LNT#1/#2）について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図1に示す。K3-spacer単独刺激においては、pan-IFN-a産生は検出限界レベルであるのに対し、K3-spacer-LNT複合体は高いpan-IFN-a誘導能を有していることが示唆された。また、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、K3-SPG複合体に比べて高い結果であった。更に、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、spacerの長さに依存しないことが示唆された。一方、IL-6誘導活性においては、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体は同等であることが認められた。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能
K3-spacer単独（K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40）、およびK3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)2-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)3-dA40-LNT#1/#2）について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図1に示す。K3-spacer単独刺激においては、pan-IFN-a産生は検出限界レベルであるのに対し、K3-spacer-LNT複合体は高いpan-IFN-a誘導能を有していることが示唆された。また、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、K3-SPG複合体に比べて高い結果であった。更に、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、spacerの長さに依存しないことが示唆された。一方、IL-6誘導活性においては、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体は同等であることが認められた。
K3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40のK3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT）、およびK3-SPGの抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図2に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer単独（F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40）、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA40-LNTおよびF+K3-(S18)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体、K3-SPG複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い増強活性が示された。以上の結果から、（S18）、（S18）2、(S18)3スペーサーを含むK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同様のTh1型アジュバント活性を示す一方、リン酸アラムと同様のTh2型の免疫増強活性も有することが示唆された。
K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40のK3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT）、およびK3-SPGの抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図2に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer単独（F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40）、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA40-LNTおよびF+K3-(S18)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体、K3-SPG複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い増強活性が示された。以上の結果から、（S18）、（S18）2、(S18)3スペーサーを含むK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同様のTh1型アジュバント活性を示す一方、リン酸アラムと同様のTh2型の免疫増強活性も有することが示唆された。
K3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
K3-spacer単独（K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40）、K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT）、およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図3に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、K3-spacer単独に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA40-LNT、 F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT）において高く、K3-LNT複合体とK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）の活性は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント接種群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。興味深いことに、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT）において、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG複合体接種群（F+K3-dA40-SPG）に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体が有する高いTh1応答増強効果に加え、Th2応答増強能も有することが示唆された。
K3-spacer単独（K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40）、K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT）、およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図3に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、K3-spacer単独に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA40-LNT、 F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT）において高く、K3-LNT複合体とK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）の活性は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント接種群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。興味深いことに、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT）において、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG複合体接種群（F+K3-dA40-SPG）に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体が有する高いTh1応答増強効果に加え、Th2応答増強能も有することが示唆された。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図４に示す。K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体においては、pan-IFN-a誘導能は検出限界以下であった。IL-6産生量においては、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTを除くK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体と同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図４に示す。K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体においては、pan-IFN-a誘導能は検出限界以下であった。IL-6産生量においては、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTを除くK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体と同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図5に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-SPG）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等以上のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPGを接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等の抗体増強活性を有している可能性が示唆された。
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図5に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-SPG）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等以上のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPGを接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等の抗体増強活性を有している可能性が示唆された。
K3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
K3-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図６に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。K3-spacer-LNT複合体においては、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG接種群（F+K3-dA40-SPG）に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1およびTh2サイトカイン産生増強活性を有することが示唆された。
K3-LNT複合体（K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図６に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。K3-spacer-LNT複合体においては、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG接種群（F+K3-dA40-SPG）に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1およびTh2サイトカイン産生増強活性を有することが示唆された。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能の検討
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図７に示す。全てのK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、IL-6産生量は、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体で、同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図７に示す。全てのK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、IL-6産生量は、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体で、同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図８に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、最もspacer長が長いK3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT複合体投与群（F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT）においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、全K3-spacer-LNT複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1増強活性を有しており、中でもK3-(S18)2-dA35-LNTおよびK3-(S18)2-dA40-LNTは高いTh2増強活性も有していることが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図８に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群（F）に比べて高いことが認められ、最もspacer長が長いK3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT複合体投与群（F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT）においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、全K3-spacer-LNT複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1増強活性を有しており、中でもK3-(S18)2-dA35-LNTおよびK3-(S18)2-dA40-LNTは高いTh2増強活性も有していることが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図９に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT）で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-5およびIL-13産生増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められた。K3-spacer-LNT複合体においては、K3-(S18)2-dA40-LNT投与群（F+K3-(S18)2-dA40-LNT）で高いIL-5およびIL-13産生増強効果を示した。以上の結果から、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同等の自然免疫活性化能とTh1増強活性を有しており、その中でも、K3-(S18)2-dA40-LNT においては、高いTh2増強活性も有することが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体（K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT）のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図９に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-LNT複合体（F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT）で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-5およびIL-13産生増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められた。K3-spacer-LNT複合体においては、K3-(S18)2-dA40-LNT投与群（F+K3-(S18)2-dA40-LNT）で高いIL-5およびIL-13産生増強効果を示した。以上の結果から、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同等の自然免疫活性化能とTh1増強活性を有しており、その中でも、K3-(S18)2-dA40-LNT においては、高いTh2増強活性も有することが示唆された。
［試験例２］
試験例１と同様にして、次の評価を行った。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-SPG複合体の炎症応答誘導能の検討
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図１１に示す。K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6の誘導活性は検出限界レベルであった。
試験例１と同様にして、次の評価を行った。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-SPG複合体の炎症応答誘導能の検討
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図１１に示す。K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6の誘導活性は検出限界レベルであった。
K3-spacer-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図１２に示す。RSV F抗原特異的な抗体誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、K3-spacer-SPG複合体投与群（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）で増強されていることが明らかとなった。
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図１２に示す。RSV F抗原特異的な抗体誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、K3-spacer-SPG複合体投与群（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）で増強されていることが明らかとなった。
K3-spacer-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図１３に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-SPG複合体（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）で高い結果となった。一方、IL-5は抗原単独投与群（F）に比べて同等以下の誘導レベルであったが、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べ、K3-spacer-SPG複合体（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）において高い結果となった（図１３）。
K3-spacer-SPG複合体（K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG）のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図１３に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べて、K3-spacer-SPG複合体（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）で高い結果となった。一方、IL-5は抗原単独投与群（F）に比べて同等以下の誘導レベルであったが、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群（F）に比べ、K3-spacer-SPG複合体（F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG）において高い結果となった（図１３）。
本発明により、優れた免疫賦活活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。特に、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、K3-spacer-SPG及びK3-spacer-LNTは強力なワクチンアジュバント活性を有しており、K3-spacer-SPG又はK3-spacer-LNTを抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激する。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして医薬分野において有用である。
本出願は日本で出願された特願２０１５−０５７８６１（出願日：２０１５年３月２０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (25)
- 配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に、式（Ａ）
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項２に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- ポリデオキシアデニル酸の長さが、20〜60ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- スペーサーが、式（Ａ１）
- スペーサーが、式
- 請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1, 3−グルカンを含有する複合体。
- β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである、請求項７に記載の複合体。
- β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである請求項８に記載の複合体。
- 下記（i）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び（ii）に記載のβ−1, 3−グルカンからなる複合体。
（i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に、式（Ａ）
（ii）レンチナン又はシゾフィラン - 配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
- ポリデオキシアデニル酸が30〜50ヌクレオチド長であり、スペーサーが式
- ポリデオキシアデニル酸が30〜45ヌクレオチド長であり、スペーサーが式
- ポリデオキシアデニル酸が40ヌクレオチド長であり、スペーサーが式
- 三重螺旋構造状のものである、請求項７〜１４のいずれかに記載の複合体。
- B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、請求項７〜１５のいずれかに記載の複合体。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７〜１６のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
- ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症の予防又は治療のための、請求項１８に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項１９に記載の医薬組成物。
- 請求項７〜１６のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び／又はII型インターフェロン産生誘導剤。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７〜１６のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
- ワクチンアジュバントである、請求項２２に記載の免疫賦活剤。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７〜１６のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
- ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である請求項２４に記載の予防又は治療剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015057861 | 2015-03-20 | ||
| JP2015057861 | 2015-03-20 | ||
| PCT/JP2016/058668 WO2016152767A1 (ja) | 2015-03-20 | 2016-03-18 | 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2016152767A1 JPWO2016152767A1 (ja) | 2018-03-15 |
| JP6698069B2 true JP6698069B2 (ja) | 2020-05-27 |
Family
ID=56978496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017508311A Active JP6698069B2 (ja) | 2015-03-20 | 2016-03-18 | 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6698069B2 (ja) |
| TW (1) | TW201639583A (ja) |
| WO (1) | WO2016152767A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3044789A1 (en) * | 2016-11-28 | 2018-05-31 | Napajen Pharma, Inc. | Chemically-modified sirna |
| JP7184366B2 (ja) | 2017-03-30 | 2022-12-06 | 公立大学法人北九州市立大学 | 免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物 |
| BR112021005601A2 (pt) * | 2018-09-28 | 2021-06-29 | The University Of Kitakyushu | indutor de imunidade que compreende conjugado de nucleotídeo de peptídeo adjuvante antigênico e composição farmacêutica que compreende o mesmo |
| EP4085974A4 (en) * | 2019-12-25 | 2024-01-17 | Napajen Pharma Inc | SHORT CHAIN CPG CONTAINING OLIGODESOXYNUCLEOTIDES WITH LINKED POLYDEOXYADENYLIC ACID, COMPLEX WITH THIS OLIGODEOXYNUCLEOTIDE AND USE THEREOF |
| WO2023068104A1 (ja) * | 2021-10-20 | 2023-04-27 | 国立大学法人京都大学 | がん特異的細胞表面分子に対する結合性分子および光感受性分子の複合体ならびにアジュバントを含む医薬 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003035836A2 (en) * | 2001-10-24 | 2003-05-01 | Hybridon Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends |
| US7276489B2 (en) * | 2002-10-24 | 2007-10-02 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends |
| BRPI0719445A2 (pt) * | 2006-09-27 | 2013-12-10 | Coley Pharm Group Inc | Composições de ligandos de tlr e antivirais. |
| CA2667297A1 (en) * | 2006-10-26 | 2008-11-20 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Oligoribonucleotides and uses thereof |
| AU2008252577A1 (en) * | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Class A oligonucleotides with immunostimulatory potency |
| JP5035808B2 (ja) * | 2009-01-28 | 2012-09-26 | 公益財団法人北九州産業学術推進機構 | 三元複合体の製造方法 |
| MX2016003668A (es) * | 2013-09-20 | 2016-06-24 | Nat Inst Of Biomedical Innovation Health And Nutrition | Complejo que contiene oligonucleotido que tiene actividad potenciadora inmune, y uso del mismo. |
-
2016
- 2016-03-18 TW TW105108478A patent/TW201639583A/zh unknown
- 2016-03-18 WO PCT/JP2016/058668 patent/WO2016152767A1/ja active Application Filing
- 2016-03-18 JP JP2017508311A patent/JP6698069B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016152767A1 (ja) | 2016-09-29 |
| JPWO2016152767A1 (ja) | 2018-03-15 |
| TW201639583A (zh) | 2016-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7278551B2 (ja) | 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 | |
| JP6698069B2 (ja) | 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 | |
| JP6536964B2 (ja) | 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用 | |
| US20230053708A1 (en) | Short-chain cpg-containing oligodeoxynucleotide with linked polydeoxyadenylic acid, complex containing said oligodeoxynucleotide, and use thereof | |
| JP7048102B2 (ja) | 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用 | |
| BR122020017002B1 (pt) | Usos de oligodesoxinucleotídeos na fabricação de agentes para tratamento ou profilaxia de câncer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20171005 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171005 |
|
| AA64 | Notification of invalidation of claim of internal priority (with term) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764 Effective date: 20171128 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190924 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191122 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200123 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200407 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200427 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6698069 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |