BRPI0719445A2 - Composições de ligandos de tlr e antivirais. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES DE LIGANTES DE TLR E ANTIVIRAIS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de modo geral às composições compostas de Iigantes de TLR e antivirais e seu uso em métodos tais como o tratamento de infecções virais e ensaios de avaliação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Receptores tipo dobre de sino (TLRs) são uma família de poli- peptídeos de receptor de reconhecimento de padrão altamente conservado (PRR) polipeptídeos que reconhecem os padrões moleculares associados com patógeno (PAMPs) e desempenham um papel crítico em imunidade ina- ta em mamíferos. Atualmente pelo menos dez membros de família, designa- dos TLR1 - TLR10, foram identificados. Os domínios citoplásmicos dos vá- rios TLRs são caracterizados por um domínio de receptor de interleucina 1- Dobre de sino (TIR). Medzhitov R et al., (1998) Mol Cell 2:253-8. O reconhe- cimento de invasão microbiana por TLRs dispara a ativação de uma cascata de sinalização que é evolucionariamente conservada em Drosophila e mamí- feros. A proteína adaptadora MyD88 contendo o domínio de TIR foi reporta- da associar-se com TLRs e recrutar a cinase associada com o receptor de interleucina 1 (IRAK) e fator 6 (TNF) associado ao receptor de fator de ne- crose de tumor (TRAF6) aos TLRs. A série de reação de sinalização depen- dente de MyD88 é acreditada induzir à ativação de fatores de transcrição de NF-κΒ e proteína cinases ativadas por mitogênio de cinase (MAPKs) termi- nal de NH2 de c-Jun (Jnk)1 etapas críticas em ativação imune e produção de citocinas inflamatórias. Para revisões, vide Aderem A et al., (2000) Nature 406:782-87, and Akira S et al., (2004) Nat Rev Immunol 4:499-511.

Recentemente certos compostos sintéticos de baixo peso mole- cular, as imidazoquinolinas imiquimod (R-837) e resiquimod (R-848), foram reportados serem Iigantes de TLR7 e TLR8. Hemmi H et al., (2002) Nat Im- munol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499.

Começando com a recente descoberto de que DNA bacteriano não-metilados e análogos sintéticos deste (CpG DNA) são Iigarrtes para TLR9 (Hemmi H et al., (2000) Nature 408:740-5; Bauer S et al., (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98, 9237-42), tem sido reportado que Iigantes para certos TLRs incluem certas moléculas de ácido nucléico. Recentemente foi repor- tado que certos tipos de RNA são imunoestimulatória de uma maneira inde- 5 pendente da seqüência ou dependente da seqüência. Além disso, foi repor- tado que estes vários RNAs imunoestimulatórios estimulam TLR3, TLR7, ou TLR8. Além disso, certos compostos sintéticos de baixo peso molecular, as imidazoquinolinas imiquimod (R-837) e resiquimod (R-848), foram reporta- das serem Iigantes de TLR7 e TLR8. Hemmi H et al., (2002) Nat Immunol 10 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499.

O RNA de filamento duplo derivado de vírus (dsRNA) e poli l:C, um análogo sintético de dsRNA, foram recentemente reportados serem Ii- gantes de TLR3. Alexopoulou L et al., (2001) Nature 413:732-8. Ainda mais recentemente, Lipford e co-trabalhadores descreveram que certas sequên- 15 cias de RNA contendo G,U são imunoestimulatórias, agindo através da esti- mulação de ambos TLR7 e TLR8. Heil F et al., (2004) Science 303:1526-9, e Pedido de Patente dos Estados Unidos 2003/0232074 A1.

Heil et al., reportaram que oligonucleotídeos de ssRNA de fosfo- rotioato ricos em guanosina- e uridina, derivados de HIV-1 e complexados 20 com o DOTAP de lipídeo catiônico, estimulam as células dendríticas (DC) e macrófagos para secretar o interferon alfa (IFN-α), fator-de necrose de tumor (TNF), interleucina 12 (IL-12), e interleucina 6 (IL-6). Heil F et al., (2004) Sci- ence 303:1526-9. TLR7 de murino foi reportado conferir sensibilidade ao ss- RNA rico em GU1 e TLR8 humano foi reportado conferir sensibilidade ao ss- 25 RNA rico em GU e rico em U. Embora seqüências específicas fossem testa- das, nenhum motive foi identificado. Ibid.

Diebold et al., recentemente reportou que RNA de filament único (ssRNA) de origem viral ou sintética ativa TLR7. Diebold SS et al., (2004) Science 303:1529-31. Eles reportaram que o ssRNA genômico viral de influ- 30 enza vírus, bem como poliU, dispara a produção de IFN-α por células den- dríticas plasmacitóides (pDC). Nenhum motive específico de seqüência foi identificado além de polyU. Baço de camundongo e Alguns oligos de ssRNA curtos (do tipo utilizado para preparar dsRNA de interferência curto) também induziram IFN-α. Ibid.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Métodos e produtos para a prevenção e/ou tratamento de infec- 5 ções virais são fornecidos de acordo com a invenção. Em um aspecto a in- venção é uma composição de um oligonucleotídeo imunoestimulatório e um agente antiviral, em que o agente antiviral não é uma guanosina C-8 substi- tuída e em que o agente antiviral é ligado ao oligonucleotídeo imunoestimu- latório.

O oligonucleotídeo imunoestimulatório pode ser um oligonucleo-

tídeo de RNA (ORN) ou um oligonucleotídeo de DNA (ODN). O oligonucleo- tídeo de DNA, em algumas modalidades é um oligonucleotídeo de classe A, classe B, classe C, classe P1 classe T, ou classe E e opcionalmente pode incluir pelo menos um dinucleotídeo CpG não-metilado. Em outra modalida- 15 de o oligonucleotídeo de DNA inclui pelo menos três dinucleotídeos CpG não-metilados. O pelo menos um, dois ou três dinucleotídeos CpG não- metilados pode incluir uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster ou tipo-fosfodiéster, e onde o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação de internucleotídeo estabilizada. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo 20 imunoestimulatório compreende uma cadeia principal quimérico.

Uma composição de um oligonucleotídeo de RNA imunoestimu- latório e um agente antiviral em que o agente antiviral está associado com o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulatório são fornecidos de acordo com outros aspectos da invenção.

O oligonucleotídeo imunoestimulatório pode estar ligado ao a-

gente antiviral indiretamente ou diretamente. Em uma modalidades, o oligo- nucleotídeo imunoestimulatório e o agente antiviral são parte da mesma mo- lécula. O agente antiviral pode estar ligado a um nucleotídeo interno ou um nucleotídeo terminal, opcionalmente um nucleotídeo terminal 3' ou um nu- cleotídeo terminal 5'.

A composição pode incluir um sítio suscetível à nuclease entre oligonucleotídeo imunoestimulatório e o agente antiviral. Em algumas modalidades O oligonucleotídeo imunoestimulató- rio contém pelo menos uma ligação 3'-3' e/ou ligação 5-5'.

A composição pode incluir um veículo farmaceuticamente acei- tável. Em algumas modalidades a composição é estéril.

O agente antiviral pode ser, por exemplo, um ou mais análogos

de nucleotídeo, loxoribina, isatoribina, ribavirina, valopicitabina, BILN 2061, VX-950.

Em algumas modalidades a composição inclui um segundo a- gente antiviral formulado com o oligonucleotídeo imunoestimulatório. O se- 10 gundo agente antiviral pode estar ligado ao oligonucleotídeo imunoestimula- tório. Em outras modalidades a composição inclui uma micropartículaou Ii- possoma alojando o oligonucleotídeo imunoestimulatório e os agentes antivi- rais.

Em algumas modalidades o agente antiviral é uma guanosina Ο- Ι 5 8 substituída. A guanosina C-8 substituída pode ser incorporada no oligonu- cleotídeo de RNA ou ele pode estar ligado ao RNA. Em algumas modalida- des a guanosina C-8 substituída é posicionada na extremidade 5’ do oligo- nucleotídeo de RNA. Em outras modalidades a guanosina C-8 substituída é posicionada um, dois ou três nucleotídeos 3' da extremidade 5'do oligonu- 20 cleotídeo de RNA.

Em algumas modalidades o oligonucleotídeo de DNA não é um oligonucleotídeo contendo abásico ou um oligonucleotídeo adaptador.

Em outros aspectos a invenção é uma composição de um Iigan- te de TLR7/8/9 ligado a um agente antiviral. Em algumas modalidades o Ii- 25 gante TLR7/8/9 é um oligonucleotídeo imunoestimulatório. O Iigante TLR7/8/9 é ligado ao agente antiviral diretamente ou indiretamente. Em al- gumas modalidades a composição inclui um sítio suscetível à nuclease entre o Iigante TLR7/8/9 e o agente antiviral.

Um método para tratar doença viral é fornecido de acordo com outros aspectos da invenção. O método envolve administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma composição da invenção descrita aqui em uma quantidade eficaz para tratar a doença viral. Em algumas mo- dalidades a doença viral é vírus da imunodeficiência humana (HIV)1 vírus da hepatite C (HCV)1 ou vírus da hepatite B (HBV). O veículo pode ser um tam- pão.

Em algumas modalidades o paciente é não-responsivo a uma terapia não-CpG. Em outras modalidades o paciente é não-responsivo à te- rapia com o agente antiviral.

Uma composição de uma célula capaz de expressar uma prote- ína viral inibitória e um TLR e um veículo é fornecido de acordo com outros aspectos da invenção.

Em uma modalidade a célula é transfectada com uma constru-

ção repórter de TLR. O TLR pode ser TLR 7, TLR 8, or TLR9.

Em outra modalidade a célula é transfectada com uma constru- ção de expressão de proteína viral inibitória. A proteína viral inibitória pode ser por exemplo NS3/4 protease.

Em algumas modalidades a célula é uma célula imune de um

paciente viralmente infectado.

Em outras modalidades a proteína viral inibitória é endogena- mente expressa pela célula.

Um método para identificar uma composição antiviral imunoes- 20 timulante, é fornecido de acordo com outros aspectos da invenção. O méto- do envolve contatar uma célua descrita aqui com um composto teste e medir a produão de citocina e leitura repórter antiviral, em que um aumento em produção de citocina e um aumento em leitura repórter antiviral indica que o composto teste é uma composição antiviral imunoestimulante.

Em todavia outros aspectos a invenção é um método para iden-

tificar uma composição antiviral imunoestimulante, compreendendo contatar uma célula descrita aqui com um composto teste e medir uma resposta de Th1, uma resposta tipo Th-1, ou produção de citocina pró-inflamatória, em que um aumento em uma resposta Th1, uma resposta tipo Th-1, ou produ- 30 ção de citocina pró-inflamatória indica que o composto teste é uma composi- ção antiviral imunoestimulante.

Em todavia outro aspecto a invenção é um método para identifi- car uma composição antiviral imunoestimulante, isolar células imunes de um paciente infectado pelo vírus, contatar as células com um composto teste e medir a produção de citocina e título viral, onde um aumento em produção de citocina Th1 e um decréscimo em título viral indica que o composto teste é uma composição antiviral imunoestimulante.

Em outros aspectos a invenção é um método para analisar quanto às moléculas que contêm um agente antiviral e um oligonucleotídeo imunoestimulatório que tem atividade antiviral, isolar células imunes de um paciente infectado pelo vírus, contatar as células com a molécula e medir o 10 título viral, onde uma redução em título viral indica que a molécula tem ativi- dade antiviral.

Em algumas modalidades as células mononucleares de sangue periférico compreendem células dendríticas. As células dendríticas podem ser células dentríticas plasmacitóides.

A etapa de contatar pode ocorrer in vitro e as células mononu-

cleares de sangue periférico podem ser cultivadas.

Utilização de uma composição da invenção para estimular uma resposta imune é também fornecida como um aspecto da invenção.

É também fornecido um método para fabricar um medicamento de uma composição da invenção para estimular uma resposta imune.

É também fornecido um método para tratar cancer, de acordo com os aspectos da invenção. O método envolve administrar a um paciente que tem cancer uma composição de um oligonucleotídeo imunoestimulatório e um agente antiviral em uma quantidade eficaz para tratar o câncer.

Em outros aspectos a invenção inclui um método para tratar in-

fecção bacteriana administrando a um paciente que tem uma infecção bacte- riana uma composição de um oligonucleotídeo imunoestimulatório e um a- gente antiviral em uma quantidade eficaz para tratara infecção bacteriana.

Em algumas modalidades o agente antiviral é ligado ao oligonu- cleotídeo imunoestimulatório. O agente antiviral pode ser ribavirina. A com- posição pode também incluir uma guanosina C-8 substituída.

Em algumas modalidades o oligonucleotídeo imunoestimulatório é um oligonucleotídeo de RNA. Em outras modalidades o oligonucleotídeo imunoestimulatório é um oligonucleotídeo de DNA tal como um oligonucleo- tídeo classe A, classe B, classe C, classe P, classe T, ou classe Ε. O oligo- nucleotídeo de DNA inclui pelo menos um dinucleotídeo CpG não-metilado.

É também fornecida uma composição como descrita aqui para

tratar um câncer, ou uma infecção viral ou bacteriana.

E também fornecida a utilização de uma composição como pro- vido aqui em combinação com um antígeno, para a fabricação de um medi- camento para vacinar um paciente. A invenção também inclui a utilização de uma composição como

fornecido aqui para a fabricação de um medicamento para tratar câncer, in- fecção viral ou uma infecção bacteriana em um paciente.

Cada das limitações da invenção pode abranger várias modali- dades da invenção. É, portanto, antecipado que cada das limitações da in- venção envolvendo qualquer um elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção. Esta invenção não está limi- tada neste pedido aos detalhes de construção e à disposição de components mencionados na seguinte descrição ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou de ser realizada de várias maneiras. Além disso, a fraseologia e terminologia utilizadas aqui são para o propósito de descrição e não devem ser consideradas como Iimitan- tes. A utilização de "incluindo," "compreendendo," ou "tendo," "contendo", "involvendo", e variações destes aqui, é entendida abranger os itens listados a seguir e equivalents destes, bem como itens adicionais. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é de três gráficos demonstrando o impacto positive de 8-Oxo-rG sobre a estimulação imune mediada por ORN. A estimulação de citocina por ORN modificado por 8-Oxo-rG (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:8) foi comparada àquela do ORN de controle (SEQ ID NO:11). Citocinas IFN- alfa (Figura 1a), IL-12p40 (Figura 1b) e TNF-alfa (Figura 1c) foram avaliadas. Os eixos-x são concentração de ORN em μΜ e os eixos-y são concentração de citocina em pg/ml. A Figura 2 é um gráfico demonstrando que o impacto positive de G 8-modificado depende da posição na seqüência de RNA. A estimulação de IFN-alfa por ORN com um único 8-Oxo-rG em diferentes posições do ORN (SEQ ID NO: 1-4) e um ORN não-modificado (SEQ ID N0:8). O eixo-x é concentração de ORN em μΜ e o eixo-y é concentração de IFN-alfa em pg/ml.

A Figura 3 é um gráfico demonstrando que diferentes deóxi- e ribonucleotídeos 8-modificados na extremidade 5' de ORN 5' aumentam a atividade imunoestimulatória. A estimulação de IFN-alfa por ORN com um único 8-Oxo-rG/Dg

(SEQ ID N0:1, 5), 8-Bromo-dG (SEQ ID N0:7) ou Imunosina (Isatoribina) (SEQ ID N0:6) (com uma ligação 5'-5') na extremidade 5' do ORN foi com- parada ao ORN modificado por 8-Bromo-dA (SEQ ID NO: 10), a SEQ ID ΝΟ.Ί 1 de ORN de controle, e um ORN não-modificado (SEQ ID NO:8) (Figu- ra 3). O eixo-x é concentração de ORN em μΜ e o eixo-y é concentração de IFN-alfa em pg/ml.

A Figura 4 é um grupo de gráficos representando os efeitos de combinação de RBV e produção de IFN-γ de célula T de CpG ODN (SEQ ID NO: 14) (Figura 4B) e RBV em produção de IFN-γ na ausência de CpG ODN (Figura 4A).

A Figura 5 é um grupo de gráficos representando o efeito ex vivo de RBV sobre a produção de IFN-γ mediada por CD3 independentemente de tratamento de ODN/RBV anterior. Baixas concentrações de RBV in vitro au- mentaram os níveis de IFN-γ independentemente de tratamentos in vivo an- teriores (Figura 5A). O efeito de uma combinação com CpG ODN (SEQ ID N0 14) é mostrado na Figura 5B.

A Figura 6 é um gráfico demonstrando que RBV diminuiu a IL-10 induzida por SEQ ID NO: 14.

A Figura 7 é um grupo de gráficos representando um experiment realizado utilizando células dendríticas (DCs) derivadas da medula óssea (BM). DC derivada de BM mantida em GM-CSF foi tratada com SEQ ID NO: 14, RBV (1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, ou 120 μΜ) ou com SEQ ID NO: 14 e RBV e testada quanto à IL-12p40 (Figura 7A), IL-12p70 (Figura 7B). A Figura 8 é um gráfico representando os resultados de um es- tudo in vivo sobre os efeitos de uma combinação de CpG ODN (SEQ ID NO: 14) e RBV em um modelo de câncer de camundongo. DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção refere-se a métodos e produtos para o tratamento de infecção viral, infecção bacteriana ou câncer utilizando uma combinação de agentes antivirais e Iigantes de TLR tais como oligonucleotídeos imunoesti- mulatórios. A invenção também inclui ensaios in vitro utilizando a combina- ção de agentes.

A coadministração de uma composição pode ser realizada ou combinando-se os componentes em uma molécula ou em um veículo de li- beração que os liberará simultaneamente para a célula-alvo. Os Iigantes de TLR combinados e agentes antivirais da invenção são úteis para o tratamen- to de distúrbios virais, tais como infecções virais agudas ou infecções virais crônicas. A infecção viral aguda refere-se a um curso curto de infecção, ge- ralmente menos do que 6 meses em que pode auto-resolver-se. Uma infec- ção crônica é aquela que recorre ou demora mais do que 6 meses de dura- ção e requer intervenção para resolução.

Vírus são pequenos agentes infecciosos que geralmente contêm um núcleo de ácido nucleico e uma camada de proteína, porém não são in- dependentemente organismos vivos. Vírus podem também tomar a forma de ácidos nucleicos infecciosos sem uma proteína. Um vírus não pode sobrevi- ver na ausência de uma célula viva dentro da qual ele pode replica-se. Vírus entram nas células vivas específicas ou por endocitose ou injeção direta de DNA (fago) e multiplamente, causando doença. O vírus multiplicado pode então ser liberado e infetar células adicionais. Alguns vírus são vírus conten- do DNA et al. são vírus contendo RNA. Os vírus de DNA incluem Pox, Her- pes, Adeno, Papova, Parvo, e Hepadna. Os vírus de RNA incluem Picorna, Calici, Astro, Toga, Flavi, Corona, Paramyxo, Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, Filo, Borna, Reo, e Retro. Em alguns aspectos, a invenção também destina-se a tratar doenças nas quais priônios são implicados em progresso de doença tal como, por exemplo, encefalopatia espongiforme bovina (isto é, doença de vaca hidrófoba, BSE) ou infecção por encefalopatia espongiforme em animais, ou doença Creutzfeldt-Jakob em humanos.

Os vírus incluem, porém não estão limitados a, enteroviroses (incluindo, porém não-limitadas a, viroses da família picornaviridae, tais co- mo poliovírus, Coxsackie vírus, echo vírus), rotavírus, adenovírus, e hepatite vírus, tal como hepatite A, B, C D e E. Exemplos específicos de viroses que foram encontrados em humanos incluem, porém não estão limitados a: Re- troviridae (por exemplo, viroses da imunodeficiência humana, tal como HIV-1 (também referida como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV, ou HIV-III; et al. iso- lados, tal como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, polioviroses, hepatite A vírus; enteroviroses, Coxsackie viroses humanas, rhinoviroses, echoviruses); Calciviridae (por exemplo, cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, viroses da encefalite eqüina, viroses da rubéola); Fiaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, viroses da encefalite, viroses da febre ama- rela); Coronaviridae (por exemplo, coronaviroses); Rhabdoviridae (por e- xemplo, viroses da estomatite vesicular, viroses da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, viroses da parainflu- enza, vírus da cachumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório); Or- thomyxoviridae (por exemplo, viroses da influenza); Bunyaviridae (por exem- plo, Hantaan viroses, bunya viroses, fleboviroses e Nairo viroses); Arenaviri- dae (viroses da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reoviroses, orbiviurses e rotaviroses); Birnaviridae', Hepadnaviridae (vírus da Hepatite B); Parvoviridae (parvoviroses); Papovaviridae (papilomaviroses, polioma viroses); Adenoviridae (a maior das adenoviroses); Herpesviridae (herpes vírus simples (HSV) 1 e 2, vírus da varicela zóster, citomegalovírus (CMV)); Poxviridae (vírus da varíola, viroses da vacínia, pox viroses); Iridoviridae (por exemplo, vírus da febre suína africana); e outras viroses de vírus da Iaringo- traqueobronquite aguda, Alfavírus, herpesvírus associado com sarcoma de Kaposi, vírus da doença Newcastle, vírus Nipah, vírus Norwalk, Papilomaví- rus, vírus da parainfluenza, influenza aviária, vírus SARs, vírus West Nile.

Os métodos da invenção são particularmente úteis, em algumas modalidades, para o tratamento de vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da hepatite. HIV, uma espécie de retrovírus também conhecido como vírus linfotrópico Ill de célula T (HTLV III), é responsável por causar a deteri- oração resultando no distúrbio conhecido como AIDS. HIV infecta e destrói as células T, prejudicando o equilíbrio geral do sistema imune, resultando em uma perda na capacidade dos pacientes para combater outras infecções e predispondo o paciente às infecções oportunísticas que freqüentemente mostram-se fatais.

A hepatite viral é uma inflamação do fígado que pode produzir inchação, maciez, e algumas vezes dano permanente ao fígado. Se a infla- mação do fígado continua pelo menos seis meses ou mais, ele é referida como hepatite crônica. Existe pelo menos cinco diferentes viroses conheci- das causarem hepatite viral, incluem hepatite A, B, C D e E.

Hepatite A é geralmente transmitida pelo alimento ou água po- tável contaminada com fezes humanas. A hepatite B geralmente é transmiti- da através de fluidos corporais tais como sangue. Por exemplo, a hepatite pode ser transmitida da mãe para a criança ao nascer, pelo contato sexual, transfusões de sangue contaminado e agulhas contaminadas. A hepatite C é muito comum e com a Hepatite B é geralmente transmitida por transfusões de sangue e agulhas contaminadas. Hepatite D é encontrada mais geral- mente em usuários de fármaco IV que sejam veículos do vírus da hepatite B vírus com o qual ele se co-associa. A Hepatite E é similar a hepatite A viral e é geralmente associada com péssimo saneamento.

Como usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um vertebrado humano ou não-humano. Os vertebrados não-humanos incluem animais de criação de gado, animais de estimação, e animais de laboratório. Os indiví- duos não-humanos também especificamente incluem primatas não-humanos como também roedores. Os indivíduos não-humanos também especifica- mente incluem, sem limitação, frangos, cavalos, vacas, porcos, cabras, cães, gatos, cobaias, hamsters, visom, e coelhos. Em algumas modalidades o in- divíduo é um paciente. Como usado aqui, um "paciente" se refere a um indi- víduo que esteja sob o cuidado de um médico ou outro trabalhador de cui- dado com a saúde, incluindo alguém que tenha se consultado, que tenha recebido informação de ou recebido uma prescrição ou outra recomendação de um medido ou outro trabalhador de cuidado com a saúde. Um paciente é tipicamente um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção viral.

Um "indivíduo tendo uma infecção viral" é um indivíduo que tem

ou está em risco de ter um distúrbio que surge da invasão do indivíduo, su- perficialmente, localmente, ou sistemicamente, por um vírus infeccioso. Um indivíduo em risco de ter a infecção viral pode ser alguém que se saiba estar exposto a um vírus particular, tal como aqueles que viajam para lugares on- de se sabe que o vírus é encontrado, aqueles vivendo em lugares onde se sabe que o vírus é encontrado, e aqueles próximos de alguém que se saiba estar infectado com um vírus. O método para tratar uma infecção viral em um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção viral de acordo com a invenção envolve administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento uma composição da invenção em uma quantidade efetiva para tratar a infecção viral.

As composições de agente antiviral-ligante de TLR funcionam em alguns aspectos por indução simultânea inata e respostas imunes espe- cíficas de antígeno que levam a um ataque multifacetado pelo sistema imune no vírus. Os agentes antivirais especificamente atacam o vírus, ao mesmo tempo em que os oligonucleotídeos imunoestimuladores fornecem efeitos de longa duração. A combinação é designada para reduzir os regimes de dosa- gem, melhorar a complacência e terapia de conservação, reduzir situações de emergência; e melhorar a qualidade de vida. Os Iigantes de TLR estimulam o sistema imune a tratar infecção

viral. As respostas imunes humorais e celulares fortes e ainda equilibradas que resultam da capacidade estimuladora imune do oligonucleotídeo refletir o sistema de defesa natural do indivíduo contra vírus invasores. Como usado aqui, o termo "tratar" quando usado em referência a uma doença ou condi- ção deve significar intervir em tal doença ou condição de modo a prevenir ou retardar o desenvolvimento, prevenir, inibir, ou retardar a progressão, deter a progressão de, ou eliminar a doença ou condição. Como usado aqui, o termo "inibir" significaria reduzir um resultado ou efeito comparado ao normal.

As composições da invenção incluem Iigantes de TLR ligados a um ou mais agentes antivirais. Os receptores semelhantes a dobre de sino (TLRs) são uma família de polipeptídeos altamente conservados que de- sempenham um papel crítico em imunidade inata em mamíferos. Atualmente dez membros da família, designados TLR1 - TLR10, foram identificados. Os domínios citoplasmáticos dos vários TLRs são caracterizados por um domí- nio de receptor (TIR) de interleucina 1 (IL-1) de dobre de sino. Medzhitov R et al. (1998) Mol Cell 2:253-8. O reconhecimento de invasão microbiana por TLRs ativa ativação de uma cascata de sinalização que é evolucionariamen- te conservada em Drosophila e mamíferos. A proteína adaptadora MyD88 contendo domínio de TIR foi reportada se associar com TLRs e recrutar fator 6 associado ao receptor de fator de necrose de tumor (TNF) (TRAF6) e cina- se associada ao receptor de IL-1 (IRAK) para os TLRs. Acredita-se que as séries de reação de sinalização dependente de MyD88 induza a ativação de fatores de transcrição de NF-κΒ e proteína cinase ativada por mitógeno (MAPKs) de cinase de terminal de NH2 de c-Jun (Jnk), etapas críticas em ativação imune e produção de citocinas inflamatórias. Para uma revisão, vi- de Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-87. Acredita-se que TLRs sejam diferencialmente expressados em

vários tecidos e em vários tipos de células imunes. Por exemplo, TLR7 hu- mano foi reportado ser expresso na placenta, pulmão, baço, linfonodos, ton- sila e em células dendríticas precursoras de plasmacitóide (pDCs). Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8); Kadowaki N et al., (2001) J Exp Med 194:863-9. TLR8 humano foi reportado ser expresso no pulmão, leucócitos do sangue periférico (PBL)1 placenta, baço, linfonodos, e em mo- nócitos. Kadowaki N et al., (2001) J Exp Med 194:863-9; Chuang T-H et al., (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8. TLR9 humano é reportadamente ex- presso no baço, linfonodos, medula óssea, PBL, e em pDCs, e células B cel- Is. Kadowaki N et al., (2001) J Exp Med 194:863-9; Bauer S et al., (2001) Proc NatIAcad Sci USA 98:9237-42; Chuang T-H et al., (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de TLR7 humano e de murino são conhecidas. Vide, por exemplo, GenBank N°s de Acessão AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211; e AAF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191, e AAL73192, os conteúdos de todos dos quais estão incorporados aqui por referência. TLR7 humano é reportado ser 1049 aminoácidos de comprimento. TLR7 de murino é reportado ser 1050 aminoácidos de comprimento. Os polipeptídeos TLR7 incluem um do- mínio extracelular tendo uma região de repetição rica em leucina, um domí- nio de transmembrana, e um domínio intracelular que inclui um domínio de TIR.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de TLR8 de murino e humano são conhecidas. Vide, por exemplo, GenBank N0S de Acessão AF246971, AF245703, NM_016610, XM_045706, AY035890, NM_133212; e AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677, e NP_573475, os conteúdos de todos dos quais estão incorporados aqui por referência. TLR8 humano é reportado existir em pelo menos duas isoformas, uma de 1041 aminoácidos de comprimento e a outra de 1059 aminoácidos de com- primento. TLR8 de murino é 1032 aminoácidos de comprimento. Os polipep- tídeos de TLR8 incluem um domínio extracelular tendo uma região de repeti- ção rica em leucina, um domínio de transmembrana, e um domínio intracelu- lar que inclui um domínio de TIR.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de TLR9 humano e de murino são conhecidas. Vide, por exemplo, GenBank N°s de Acessão NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178; e NP_059138, AAF72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488, e NP_112455, os conteúdos de todos dos quais estão incorporados aqui por referência. TLR9 humano é reportado existir em pelo menos duas isoformas, uma de 1032 aminoácidos de com- primento e a outra de 1055 aminoácidos. TLR9 de murino é 1032 aminoáci- dos de comprimento. Os polipeptídeos de TLR9 incluem um domínio extra- celular tendo uma região de repetição rica em leucina, um domínio de transmembrana, e um domínio intracelular que inclui um domínio de TIR. Como usado aqui, o termo "sinalização de TLR" se refere a qualquer aspecto de sinalização intracelular associada com a sinalização através de um TLR. Como usado aqui, o termo "resposta imune mediada por TLR" se refere à resposta imune que está associada com a sinalização de TLR.

Uma resposta imune mediada por TLR7 é uma resposta associ- ada com sinalização de TLR7. A resposta imune mediada por TLR7 é geral- mente caracterizada pela indução de citocinas induzíveis por IFN-α e IFN tais como IP-10 e l-TAC. Os níveis de citocinas IL-1 α/β, IL-6, IL-8, ΜΙΡ-1α/β e ΜΙΡ-3α/β induzidos em uma resposta imune mediada porTLR7 são meno- res do que aqueles induzidos em uma resposta imune mediada por TLR8.

Uma Resposta imune mediada por TLR8 é uma resposta asso- ciada com a sinalização de TLR8. Esta resposta é também caracterizada pela indução de citocinas pró-inflamatórias tais como IFN-γ, IL-12p40/70, TNF-a, IL-la/β, IL-6, IL-8, MIP-1 α/β e MIP-3 α/β.

Uma resposta imune mediada por TLR9 é uma resposta associ- ada com sinalização de TLR9. Esta resposta é também caracterizada pelo menos pela produção/secreção de IFN-γ e IL-12, embora em níveis menores do que são encontrados através de uma resposta imune mediada por TLR8. Como usado aqui, um "ligante de TLR7/8" ou "agonista de

TLR7/8" coletivamente se refere a qualquer agente que seja capaz de au- mentar a sinalização de TLR7 e/ou TLR8 (isto é, um agonista de TLR7 e/ou TLR8). Alguns Iigantes de TLR7/8 induzem a sinalização de TLR7 apenas (por exemplo, Iigantes específicos de TLR7), alguns induzem a sinalização de TLR8 apenas (por exemplo, Iigantes específicos de TLR8), et al. induzem a sinalização tanto de TLR7 quanto de TLR8.

Como usado aqui, o termo "ligante de TLR7" ou "agonista de TLR7" se refere a qualquer agente que seja capaz de aumentar a sinaliza- ção de TLR7 (isto é, um agonista de TLR7). Neste respeito, o nível de sinali- zação de TLR7 pode ser realçado em um nível pré-existente de sinalização ou pode ser induzido em um nível antecedente de sinalização. Os Iigantes de TLR7 incluem, sem limitação, análogos de guanosina tais como guanosi- nas C8-substituída, misturas de ribonucleosídeos que consistem essencial- mente em G e U, ribonucleotídeos de guanosina e RNA ou moléculas seme- lhantes a RNA (PCT/US03/10406), e compostos com base em adenosina (por exemplo, 6-amino-9-benzil-2-(3-hidróxi-propóxi)-9H-purin-8-ol, e com- postos similares feitos por Sumitomo (por exemplo, CL-029)). Os Iigantes TLR7 são também descritos em Gorden et al., J. Immunol. 2005, 174:1259- 1268 (por exemplo, 3M-001, /V-[4-(4-amino-2-etil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin- 1-il)butil-]metanossulfonamida; C17H23N502S; mw 361).

Como usado aqui, o termo "análogos de guanosina" se refere a um nucleotídeo semelhante à guanosina (excluindo guanosina) tendo uma modificação química que envolve a base de guanina, açúcar de nucleosídeo de guanosina, ou tanto a base de guanina quanto o açúcar de nucleosídeo de guanosina. Os análogos de guanosina especificamente incluem, sem limi- tação, 7-deaza-guanosina. Os análogos de guanosine também incluem guanosinas C8-

substituídas tais como 7-tia-8-oxoguanosina (imunosina), 8-mercaptogua- nosina, 8-bromoguanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-di-hidroguanosina, C8-arilamino-2'-deoxiguanosina, C8-propinil-guanosina, ribonucleosídeos de guanina C8- e N7-substituída tais como 7-alil-8-oxoguanosina (Ioxoribina) e 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidróxi-2'-deoxiguanosina,-8- hidroxiguanosina, e guanosine 8-substituída 7-deaza.

Como usado aqui, o termo "ligante de TLR8" ou "agonista de TLR8" se refere a qualquer agente que seja capaz de aumentar a sinaliza- ção de TLR8 (isto é, um agonista de TLR8). Neste respeito, o nível de sinali- zação de TLR8 pode ser realçado em um nível pré-existente de sinalização ou pode ser induzido em um nível antecedente de sinalização. Os Iigantes de TLR8 incluem misturas de ribonucleosídeos que consistem essencial- mente em G e U, ribonucleotídeos de guanosina e RNA ou moléculas seme- lhantes à RNA (PCT/US03/10406). Os Iigantes de TLR8 adicionais são tam- bém descritos em Gorden et al., J. Immunol. 2005, 174:1259-1268).

Alguns Iigantes de TLR7/8 são Iigantes tanto de TLR7 quanto de TLR8. Estes incluem imidazoquinolinas, misturas de ribonucleosídeos que consistem essencialmente em G e U, ribonucleotídeos de guanosina e RNA ou moléculas semelhantes à RNA (PCT/US03/10406). Os Iigantes TLR7/8 adicionais são também descritos em Gorden et al., J. Immunol. 2005, 174:1259-1268 (por exemplo, 3M 003, hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)- α,α- dimetil-6,7,8,9-tetra-hidro-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1 -etanol, C17H26N402; mw318).

Imidazoquinolinas são modificadores de resposta imune consi- derados induzir a expressão de várias citocinas incluindo interferons (por exemplo, IFN-α), TNF-a e algumas interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-6 e IL-12). Imidazoquinolinas são capazes de estimular uma resposta imune de Th1, como evidenciado em parte por sua capacidade de induzir aumento em níveis de lgG2a. Os agentes de imidazoquinolina de acordo com o reportado são também capazes de inibir a produção de citocinas Th2 tais como IL-4, IL-5, e IL-13. Algumas das citocinas induzidas por imidazoquinolinas são produzidas por macrófagos e células dendríticas. Algumas espécies de imi- dazoquinolinas foram reportadas aumentar a atividade lítica de célula NK e estimular a proliferação e diferenciação de células B, desse modo induzindo a secreção e produção de anticorpo.

Como usado aqui, um agente de imidazoquinolina inclui aminas de imidazoquinolina, aminas de imidazopiridina, aminas de cicloalquilimida- zopiridina 6,7-fundidas, e aminas de imidazoquinolina 1,2 em ponte. Estes compostos foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos N0S 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5494916, 5482936, 5525612, 6039969 e 6110929. Espécies parti- culares de agentes de imidazoquinolina incluem R-848 (S-28463); 4-amino- 2etoximetil-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolinas-1 -etanol; 1 -(2-metilpro- pil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (R-837 ou Imiquimod), e S-27609. Imiquimod é atualmente usado no tratamento tópico de verrugas tais como verrugas genitais e anais e também tem sido testado no tratamento tópico de carcinoma de célula basal.

Como usado aqui, o termo "ligante de TLR9" ou "agonista de TLR9" se refere a qualquer agente que seja capaz de aumentar a sinaliza- ção de TLR9 (isto é, um agonista de TLR9). Os Iigantes de TLR9 especifi- camente incluem, sem limitação, ácidos nucleicos imunoestimuladores, e em particular ácidos nucleicos imunoestimuladores de CpG.

Como usado aqui, o termo "ácidos nucleicos imunoestimulado- res de CpG" ou "oligonucleotídeos de CpG imunoestimuladores" se refere a qualquer ácido nucleico contendo CpG que seja capaz de ativar uma célula imune. Pelo menos o C do dinucleotídeo de CpG é tipicamente, porém não necessariamente, desmetilado. Os ácidos nucleicos de CpG imunoestimula- dores são descritos em várias patentes emitidas e pedidos de patentes pu- blicados, incluindo as Patentes dos Estados Unidos N0S 6.194.388; 6.207.646; 6.218.371; 6.239.116; 6.339.068; 6.406.705; e 6.429.199.

Em algumas modalidades o Iigante de TLR é um oligonucleotí- deo imunoestimulador. Um "oligonucleotídeo imunoestimulador" como usado aqui é qualquer ácido nucleico (DNA ou RNA) contendo um motivo imunoes- timulador ou cadeia principal que seja capaz de induzir uma resposta imune. Uma indução de uma resposta imune se refere a qualquer aumento no nú- mero ou atividade de uma célula imune, ou um aumento na expressão ou níveis absolutos de um fator imune, tal como uma citocina. As células imu- nes incluem, porém não estão limitadas a, células NK, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, células B, células dendríticas, macrófagos e outras células de apresentação de antígeno. As citocinas incluem, porém não estão limita- das a, interleucinas, TNF-a, IFN-α,β e γ, Flt-ligante, e moléculas co- estimuladoras. Os motivos imunoestimuladores incluem, porém não estão limitados aos motivos de CpG e motivos ricos em Τ. A cadeia principal imu- noestimuladores incluem, porém não estão limitadas a, cadeia principal mo- dificadas de fosfato, tais como cadeia principal de fosforotioato. Os oligonu- cleotídeos imunoestimuladores foram descritos extensivamente na técnica anterior e um breve resumo destes ácidos nucleicos é apresentado abaixo.

Os termos "oligonucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados al- ternadamente para significar nucleotídeos múltiplos (isto é, moléculas com- preendendo um açúcar (por exemplo, ribose ou deoxirribose) ligado a um grupo fosfato e a uma base orgânica permutável, que é ou uma pirimidina substituída (por exemplo, citosina (C)1 timidina (T) ou uracila (U)) ou uma purina substituída (por exemplo, adenina (A) ou guanina (G)). Desse modo, o termo abrange ambos oligonucleotídeos de DNA e RNA. Os termos tam- bém devem incluir polinucleosídeos (isto é, um polinucleotídeo menos o fos- fato) e qualquer outro polímero contendo base orgânica. Os oligonucleotí- deos podem ser obtidos de fontes de ácido nucleico existentes (por exemplo, genômico ou cDNA), porém são preferivelmente sintéticos (por exemplo, produzido por síntese de ácido nucleico).

Os oligonucleotídeos podem ser de filamento duplo ou filamento único. Em certas modalidades, ao mesmo tempo em que o oligonucleotídeo é de filamento único, ele é capaz de formar estruturas secundárias e terciá- rias (por exemplo, dobrando-se sobre si mesmo ou por hibridização com ele próprio ou em toda sua totalidade ou em segmentos selecionados ao longo de seu comprimento). Consequentemente, ao mesmo tempo em que a estru- tura primária de um tal oligonucleotídeo pode ser de filamento único, suas estruturas de ordem superior podem ser de filamento duplo ou triplo.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores podem possuir moti- vos imunoestimuladores tais como motivos de CpG desmetilados e motivos de não CpG tais como motivos ricos em T. Dependendo da modalidade da invenção, alguns motivos imunoestimuladores são preferidos mais que ou- tros. Em algumas modalidades da presente invenção, os oligonucleotídeos imunoestimuladores não contêm motivos poli-G. Em algumas modalidades, qualquer ácido nucleico, independente se possui um motivo identificável, pode ser combinado com o agente antiviral. Os oligonucleotídeos imunoes- timuladores também incluem ácidos nucleicos tendo uma cadeia principal modificada, tal como uma cadeia principal modificada de fosforotioato. Em modalidades particulares, os oligonucleotídeos imunoestimuladores tendo uma cadeia principal modificada de fosforotioato também não têm um motivo identificável, todavia é também imunoestimulador. As seqüências de CpG, ao mesmo tempo em que relativamente

raras em DNA humano, são geralmente encontradas no DNA de organismos infecciosos tais como bactérias. O sistema imune humano aparentemente envolve reconhecer as seqüências de CpG como um sinal de advertência precoce de infecção e para iniciar uma resposta imune imediata e poderosa contra invasão de patógenos sem causar reações adversas freqüentemente vistas com outros agentes estimuladores imunes. Desse modo, os ácidos nucleicos contendo CpG1 que dependem do mecanismo de defesa imune inato podem utilizar uma série de reações única e natural para terapia imu- ne. Os efeitos de ácidos nucleicos CpG em modulação imune foram descri- tos extensivamente na Patente dos Estados Unidos N0 6.194.388, e Pedidos de Patente Publicado, tais como PCT US95/01570), PCT/US97/19791, PCT/US98/03678; PCT/US98/10408; PCT/US98/04703; PCT/US99/07335; e PCT/US99/09863.

Um "oligonucleotídeo de CpG" é um ácido nucleico que inclui pelo menos um dinucleotídeo de CpG desmetilado. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico inclui três ou mais dinucleotídeos de CpG desmetila- dos. Um ácido nucleico contendo pelo menos um "dinucleotídeo de CpG desmetilado" é uma molécula de ácido nucleico que contém uma citosina desmetilada em uma seqüência de dinucleotídeo de citosina-guanina (isto é "DNA de CpG" ou DNA contendo uma citosina 5' seguido por 3' guanosina e ligado por uma ligação de fosfato) e ativa o sistema imune.

Para facilitar a captação em células, os oligonucleotídeos imu- noestimuladores são preferivelmente na faixa de 6 a 100 bases em compri- mento. Entretanto, os ácidos nucleicos de qualquer tamanho maior do que 6 nucleotídeos (mesmo muitos kb de comprimento) são capazes de induzir uma resposta imune de acordo com a invenção se motivos imunoestimula- dores suficientes estiverem presentes. Preferivelmente o ácido nucleico imu- noestimulador está na faixa dentre 8 e 100 e em algumas modalidades entre 8 e 50 ou 8 e 30 nucleotídeos em tamanho.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores podem conter um pa- líndromo ou repetição invertida (isto é, uma seqüência tal como ABCDE- E1D1CB1A' na qual A e A1 são bases capazes de formar os pares de base de Watson-Crick usuais). In vivo, tais seqüências podem formar estruturas de filamento duplo. Em uma modalidade, o ácido nucleico de CpG contém uma seqüência palindrômica. Uma seqüência palindrômica usada neste contexto se refere a um palíndromo no qual o CpG é parte do palíndromo, e preferi- velmente é o centro do palíndromo. Em outra modalidade o ácido nucleico de CpG é livre de um palíndromo hexamérico. Um ácido nucleico imunoes- timulador que é livre de um palíndromo hexamérico é um no qual o dinucleo- tídeo de CpG não é parte de um palíndromo que seja pelo menos 6 nucleo- tídeos em comprimento. Um tal oligonucleotídeo pode incluir um palíndromo no qual o CpG não está no palíndromo.

Em algumas modalidades da invenção, um ácido nucleico imu- noestimulador de não CpG é usado. Um ácido nucleico imunoestimulador de não CpG é um ácido nucleico que não tem um motivo de CpG em sua se- qüência, independente se o resíduo de C do dinucleotídeo ser metilado ou desmetilado. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores de não CpG podem induzir respostas imunes de Th1 ou Th2, dependendo de sua seqüência, seu modo de liberação, e da dose na qual eles são administrados.

Em aspectos selecionados da invenção, os oligonucleotídeos imunoestimuladores de não CpG podem ser ácido nucleicos ricos em T. Os ácido nucleicos ricos em T são ácidos nucleicos tendo motivos ricos em T. Os motivos ricos em T e ácido nucleicos possuindo tais motivos são descri- tos no Pedido de Patente dos Estados Unidos N0 09/669.187, depositado em de setembro de 2000, por Krieg et al., os conteúdos totais dos quais es- tão incorporados aqui por referência. Outros ácidos nucleicos de não CpG úteis na presente invenção são descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos N0 09/768.012, depositado em 22 de janeiro de 2001, os conteúdos totais dos quais estão incorporados aqui em sua totalidade por referência.

Em algumas modalidades os oligonucleotídeos imunoestimula- dores têm uma cadeia principal modificada tal como uma cadeia principal de fosforotioato. As Patentes dos Estados Unidos N0S 5.723.335 e 5.663.153 emitida por Hutcherson, et al., e publicação PCT relacionada W095/26204 descrevem a estimulação imune usando análogos de oligonucleotídeo de fosforotioato. Estas patentes descrevem a capacidade da cadeia principal de fosforotioato em estimular uma resposta imune de uma maneira não especí- fica de seqüência. Desse modo, algumas modalidades da invenção depen- dem do uso de oligonucleotídeos de cadeia principal de fosforotioato que necessitam de motivos ricos em T e CpG metilado e desmetilado.

Os métodos da invenção podem abranger o uso de classes pre- viamente descritas de oligonucleotídeos imunoestimuladores incluindo clas- ses de ODN tais como classe A, classe B1 classe C, classe E, classe T e classe P. Em algumas modalidades da invenção os oligonucleotídeos imu- nomoduladores incluem motivos imunoestimuladores que são "dinucleotí- deos CpG". Um dinucleotídeo de CpG pode ser metilado ou desmetilado. Um imunoestimulador de ácido nucleico contendo pelo menos um dinucleo- tídeo de CpG desmetilado é uma molécula de ácido nucleico que contém uma seqüência de dinucleotídeo de citosina-guanina desmetilada (isto é, uma 5' citidina desmetilada seguido por 3' guanosina e ligada por uma liga- ção de fosfato) e que ativa o sistema imune; um tal ácido nucleico imunoes- timulador é um ácido nucleico de CpG. O ácido nucleicos de CpG foi descrito em várias patentes emitidas, pedidos de patentes publicados, e outras publi- cações, incluindo as Patentes dos Estados Unidos N0S 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Um ácido nucleico imunoestimulador contendo pelo menos um dinucleotídeo de CpG metilado é um ácido nucleico que contém uma seqüência de dinucleotídeo de citosina- guanina metilada (isto é, uma 5' citidina metilada seguido por uma 3' guano- sina e ligada por uma ligação de fosfato) e que ativa o sistema imune. Em outras modalidades os oligonucleotídeos imunoestimuladores são livres de dinucleotídeos de CpG. Estes oligonucleotídeos que são livres de dinucleotí- deos de CpG são referidos como oligonucleotídeos de não CpG1 e eles têm motivos imunoestimuladores de não CpG. Preferivelmente esses são ODN ricos em T, tais como ODN tendo pelo menos 80% de T.

ODN de "classe B" são potentes na ativação de células B1 porém são relativamente fracos na indução de ativação de célula NK e IFN-α. Os ácido nucleicos de CpG de classe B tipicamente são completamente estabi- lizados e incluem um dinucleotídeo de CpG desmetilado em certos contextos de base preferidos. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos N0S 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Outra classe é potente para induzir ativação de célula NK e IFN-α, porém é relati- vamente fraca ao estimular células B; esta classe foi chamada a "classe A". Os ácido nucleicos de CpG de classe A tipicamente têm seqüências poli-G estabilizadas nas terminações 5' e 3' e uma seqüência contendo dinucleotí- deo de CpG de fosfodiéster palindrômica de pelo menos 6 nucleotídeos. Vi- de, por exemplo, o pedido de patente publicado PCT/US00/26527 (WO 01/22990). Ainda outra classe de ácidos nucleicos de CpG ativa células B e células NK e induz IFN-α; esta classe foi chamada de classe C. Os ácidos nucleicos imunoestimuladores de "classe C" contêm

pelo menos dois motivos distintos que têm efeitos estimuladores únicos e desejáveis em células do sistema imune. Alguns destes ODN têm ambos uma seqüência de CpG tradicional "estimuladora" e um motivo "rico em GC" ou de "neutralização de célula B". Estes ácido nucleicos de motivo de com- binação têm efeitos de estimulação imunes que se incluem em algum lugar entre aqueles efeitos associados com ODN de CpG de "classe B" tradicional, que são indutores fortes de ativação de célula B e ativação de célula dendrí- tica (DC), e aqueles efeitos associados com uma classe mais recentemente descrita de ácido nucleicos estimuladores imunes (ODN de CpG de "classe A") que são fortes indutores de ativação de célula exterminadora natural (NK) e IFN-α porém indutores relativamente fracos de ativação de célula B e DC. Krieg AM et al., (1995) Nature 374:546-9; Bailas ZK et al„ (1996) J Im- munol 157:1840-5; Yamamoto S et al., (1992) J Immunol 148:4072-6. Ao mesmo tempo em que ODN de CpG de classe B preferido geralmente tem cadeia principal de fosforotioato e ODN de CpG de classe A preferidos têm cadeia principal misturadas ou quiméricas, a classe C de ácido nucleicos de estimuladores imunes de motivo de combinação podem ter cadeia principal estabilizadas, por exemplo, fosforotioato, quiméricós, ou de fosfodiéster, e em algumas modalidades preferidas, eles têm cadeia principal semimoles. Esta classe foi descrita no Pedido de Patente dos Estados Unidos US10/224.523 depositado em 19 de agosto de 2002, os conteúdos totais dos quais estão incorporados aqui por referência. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores de "classe P" têm vá- rios domínios, incluindo um domínio de ativação de 5TLR, 2 regiões de for- mação duplex e um espaçador opcional e 3' cauda. Esta classe de oligonu- cleotídeos tem a capacidade em alguns casos de induzir níveis muito supe- riores de secreção de IFN-α do que a classe C. Os oligonucleotídeos de classe P têm a capacidade de espontaneamente automontar em concatâme- ros ou in vitro e/ou in vivo. Sem desejar está presa a qualquer teoria particu- lar para o método de ação destas moléculas, uma hipótese potencial é que esta propriedade favorece os oligonucleotídeos da classe P com a capaci- dade de mais altamente reticular TLR9 dentro de certas células imunes, in- duzindo um padrão distinto de ativação imune comparado com as classes previamente descritas de oligonucleotídeos de CpG. A reticulação de recep- tores de TLR9 pode induzir a ativação de secreção de IFN-α mais forte atra- vés da alça de realimentação de IFNR tipo I em células dendríticas plasmaci- tóides. Os oligonucleotídeos de classe P são descritos pelo menos no Pedi- do dos Estados Unidos Número de Série 11/706.561.

Os oligonucleotídeos de "classe T" induzem a secreção de níveis menores de IFN-alfa quando não-modificados como nos ODNs da invenção e citocinas e quimiocinas relacionadas com IFN do que os oligonucleotídeos de classe B ou classe C, ao mesmo tempo em que mantendo a capacidade de induzir níveis de IL-10 similares aos oligonucleotídeos de classe B. Os oligonucleotídeos de classe T são descritos pelo menos no Pedido de Paten- te Publicado dos Estados Unidos N0 11/099.683, os conteúdos totais dos quais estão desse modo incorporados por referência. Os oligonucleotídeos de "classe E" têm uma capacidade realça-

da de induzir a secreção de IFN-alfa. Estes ODN têm um análogo 5' e/ou 3' de nucleotídeo substituído lipofílico de um motivo de YGZ. O composto da fórmula de classe E pode ser, por exemplo, qualquer dentre os seguintes análogos de nucleotídeo substituídos lipofílicos: uma pirimidina substituída, uma uracila substituída, um análogo de T hidrofóbico, um tolueno substituí- do, um imidazol substituído ou pirazol, um triazol substituído, 5-cloro-uracila, 5-bromo-uracila, 5-iodo-uracila, 5-etil-uracila, 5-propil-uracila, 5-propinil- uracila, (E)-5-(2-bromovinil)-uracila, ou 2.4-diflúor-tolueno. Oligonucleotídeos de classe E são descritos pelo menos no pedido de patente provisório US 60/847.811.

Em algumas modalidades da invenção, o oligonucleotídeo imu- noestimulador é um oligorribonucleotídeo (ORN). ORNs imunoestimuladores incluem por exemplo, aqueles que estimulam motivos de TLR7/8. Um ORN estimulador de TLR7/8 pode incluir, por exemplo, uma seqüência de ribonu- cleotídeo, por exemplo, tal como 5'-C/U-U-G/U-U-3\ 5-R-U-R-G-Y-3', 5'-G-U-U-G-B-3', 5'-G-U-G-U-G/U-3', ou 5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3\ C/U is citosina (C) ou uracila (U), G/U é guanina (G) ou U, R é purina, Y é pirimidi- na, B é U, G, ou C, G/C é G ou C, e A/C é adenina (A) ou C. O 5-C/U-U-G/U-U-3' pode ser CUGU, CUUU, UUGU, ou UUUU. Em várias modalidades 5-R-U-R-G-Y-3' é GUAGU, GUAGC, GUGGU, GUGGC, AUA- GU, AUAGC, AUGGU, ou AUGGC. Em uma modalidade, a seqüência bási- ca é GUAGUGU. Em várias modalidades, 5-G-U-U-G-B-3' é GUUGU, GUUGG, ou GUUGC. Em várias modalidades, 5-G-U-G-U-G/U-3' é GUGUG ou GUGUU. Em uma modalidade, a seqüência básica é GUGUUUAC. Em várias outras modalidades, 5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3' é GUAGGCAC, GUCGGCAC, CUAGGCAC, ou CUCGGCAC.

Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos não são oligo- nucleotídeos adaptadores ou oligonucleotídeos abásicos.

Oligonucleotídeos adaptadores compreendem a fórmula 5'Xg - TTTTT - Xb 3', em que Xa e Xb podem ser independentemente qualquer nu- cleotídeo e podem estar presentes ou ausentes. Xa e Xb representam um ou mais nucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotídeos). O oligonucleotídeo pode ter 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotídeos no comprimento. O oligonucleotídeo pode compreender 6, 7 ou mais T contíguos. Preferivelmente1 o oligonucleotídeo adaptador é um ho- mopolímero de dT (isto é, oligo dT de um comprimento relacionado aqui). Ainda mais preferivelmente, o oligonucleotídeo adaptador é um homopolíme- ro de timidina (dT) de 17 nucleotídeos no comprimento. Ainda mais preferi- velmente, compreende pelo menos uma ligação de internucleotídeo fosforo- tioado (até e incluindo uma cadeia principal completamente fosforotioado).

O oligonucleotídeo adaptador pode ser compreendido de 100% de T, 99% de T, 98% de T, 97% de T, 96% de T, 95% de T1 94% de T, 93% de T, 92% de T, 91% de T, 90% de T, 85% de T, 80% de T, 75% de T1 70% de T, 65% de T1 60% de T1 55% de T1 50% de T, 45% de T ou menos, de- pendendo da modalidade.

Outra classe de oligonucleotídeos adaptadores compreende a fórmula 5' Xa - UUUUU - Xb 3' em que Xa e Xb podem ser independentemen- te qualquer nucleotídeo e podem estar presentes ou ausentes. Xa e Xb re- presentam um ou mais nucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotídeos). O oligonucleotídeo pode ser 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotídeos no comprimento. O oligonucleotídeo pode compreender 6, 7 ou mais U contíguos. Em uma modalidade importante, o oligonucleotídeo é um homopolímero de dU que tem preferivelmente 17 nu- cleotídeos no comprimento e tendo pelo menos uma ligação de internucleo- tídeo fosforotioado (até e incluindo uma cadeia principal completamente fos- forotioado).

O oligonucleotídeo adaptador pode ser compreendido de 100% de U, 99% de U, 98% de U, 97% de U, 96% de U, 95% de U, 94% de U, 93% de U, 92% de U, 91% de U, 90% de U, 85% de U, 80% de U, 75% de U, 70% de U, 65% de U, 60% de U, 55% de U, 50% de U, 45% de U ou me- nos, dependendo da modalidade.

Ainda outra classe de oligonucleotídeos adaptadores compreen- de a fórmula 5' Xa - AAAAA - Xb 3' em que Xa e Xb podem ser independen- temente qualquer nucleotídeo e podem estar presentes ou ausentes. Xa e Xb representam um ou mais nucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotídeos). O oligonucleotídeo pode ter 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotídeos no comprimento. O oligonucleotídeo pode compreender 6, 7 ou mais A contíguos. Em uma modalidade importante, o oligonucleotídeo é um homopolímero de dA que tem preferivelmente 17 nu- cleotídeos no comprimento e tendo pelo menos uma ligação de internucleo- tídeo fosforotioado (até e incluindo uma cadeia principal completamente fos- forotioado).

O oligonucleotídeo adaptador pode ser compreendido de 100% de A, 99% de A, 98% de A, 97% de A1 96% de A1 95% de A, 94% de A1 93% de A, 92% de A, 91% de A, 90% de A, 85% de A1 80% de A, 75% de A, 70% de A, 65% de A, 60% de A, 55% de A, 50% de A, 45% de A ou menos, de- pendendo da modalidade.

Outra classe de oligonucleotídeos adaptadores compreende a fórmula 5' Cn-Tm- Cp 3', em que η é um número inteiro que varia de 0-100 (por exemplo, 3-7), ρ é um número inteiro que varia de 0-100 (por exemplo, 4-8), e m é um número inteiro que varia de 0-100 (por exemplo, 2-10). Prefe- rivelmente, a soma de η e ρ é igual a ou menor que o valor de m tal que o teor de C é menor que 60%, menor que 55%, menor que 50%, menor que 45%, menor que 40%, menor que 35%, menor que 30%, menor que 25%, menor que 20%, menor que 15%, menor que 10%, menor que 5%, ou me- nor. Em algumas modalidades, η varia de 3-7, m varia de 2-10 e ρ varia de 4-8, contanto as porcentagens citadas acima sejam satisfeitas.

Um oligonucleotídeo abásico se assemelha a uma cadeia princi- pal de uma molécula de RNA ou de DNA, em que as nucleobases (por e- xemplo, adenina, citosina, timina, uracila, e guanina) e opcionalmente os resíduos de açúcar são ausentes. O oligonucleotídeo abásico é desse modo um polímero de unidades conectadas por ligações contendo fosfato. Cada unidade do oligonucleotídeo abásico polimérico inclui um grupo fosfato, ou um derivado tioado deste, covalentemente ligado a um resíduo orgânico que contém pelo menos três átomos de carbono. O resíduo orgânico compreen- de um grupo alquila, linear ou cíclico, sendo saturado ou insaturado que po- de conter heteroátomos de O, N e S, e além disso pode incluir substituintes que contém C, Η, N, O, S1 átomos de halogênio, e qualquer combinação do mesmo.

O resíduo orgânico é preferivelmente derivado de propano-1,3- diol ou resíduos de açúcar, tal como β-D-desoxirribofuranose ou β-D-ribofu- ranose. Outros resíduos incluem butano-1,4-diol, unidades de trietileno gli- col, ou unidades de hexaetileno glicol ((OCH2CH2)pO onde ρ é 3 ou 6), Iigan- tes de hidroxil-alquil-amino, tais como C3, C6, C12 aminoligadores, e tam- bém da mesma forma Iigantes de alquiltiol, tais como Iigantes de C3 ou C6 tiol. Os derivados de açúcar podem da mesma forma conter expansões de anel, tal como piranose.

O oligonucleotídeo abásico pode da mesma forma conter uma

unidade Doubler ou Trebler (Glen Research, Sterling, VA), em particular compreendendo uma ligação 3'3\ A ramificação dos oligonucleotídeos por unidades duplicadoras, trebler, ou outras multiplicadoras leva aos dendríme- ros que são uma modalidade adicional desta invenção.

Uma unidade pode ser um desoxirribonucleotídeo abásico re-

presentado como

R-P=O

ΟνΛΛΛ

em que R representa oxigênio, enxofre, metila, ou O-alquila.

Uma unidade pode ser um ribonucleotídeo abásico representado

como

R-P=O

ΟΛΛΛ

em que R representa oxigênio, enxofre, metila, ou O-alquila.

Uma unidade pode ser um fosfato/espaçador de C3 representa- do como wv^o-CH2

H2C.

n^CH2

R-

ÕvAAA.

em que R representa oxigênio, enxofre, metila, ou O-alquila.

O oligonucleotídeo abásico pode ser um homopolímero de deso- xirribonucleotídeo abásico (poli-D). Cada unidade nesta modalidade inclui um resíduo de açúcar de 2'-desoxirribose abásico e um grupo fosfato 5'. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo abásico é um homopolímero de ribonu- cleotídeos abásicos. Cada unidade nesta modalidade inclui um resíduo de açúcar de 2'-hidroxirribose abásico e um grupo fosfato 5'. Em outra modali- dade, o oligonucleotídeo abásico é um heteropolímero de ribonucleotídeos abásico e desoxirribonucleotídeos abásicos. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores úteis de acordo com a

invenção podem ter cadeia principal modificadas. Por exemplo, eles podem compreender pelo menos uma ligação de internucleotídeo que não é uma ligação de fosfodiéster. Uma tal ligação pode ser uma ligação de fosforotioa- to. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ter cadeia princi- pai quiméricas (isto é, cadeia principal compreendidas de pelo menos dois tipos diferentes de ligações de internucleotídeo).

Quando aqui utilizado, o termo "cadeia principal de fosforotioato" refere-se a uma cadeia principal de fosfato de açúcar estabilizado de um oligonucleotídeo no qual um oxigênio de fosfato não ligado com ponte é substituído por enxofre em pelo menos uma ligação de internucleotídeo. Em uma modalidade, um oxigênio de fosfato não ligado com ponte é substituído por em cada e toda a ligação de internucleotídeo.

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem abranger substituições e modificações químicas, em comparação ao RNA e DNA na- tural, envolvendo uma ponte de internucleosídeo de fosfodiéster, uma unida- de de β-D-ribose e/ou uma base de nucleosídeo natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracila). Exemplos de modificações químicas são conheci- dos pela pessoa versada e são descritos, por exemplo, em Uhlmann E et al., (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" sín- tese and Properties & síntese and Analytical Techniques, S., Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-29; e Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Metho- dos 7:331- 417. Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode ter uma ou mais modificações, em que cada modificação fica localizada em uma ponte de internucleosídeo de fosfodiéster particular e/ou em uma unidade de β-D-ribose particular e/ou em uma posição de base de nucleotídeo natural particular em comparação a um oligonucleotídeo da mesma seqüência que é composta de DNA ou RNA natural.

Por exemplo, os oligonucleotídeos podem incluir uma ou mais modificações e em que cada modificação é independentemente selecionada a partir:

(a) da substituição de uma ponte de internucleosídeo de fosfodiéster lo- calizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleosídeo por uma ponte de internucleosídeo modificada,

b) da substituição de ponte de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleosídeo por uma ponte de defosfo,

c) da substituição de uma unidade de fosfato de açúcar a partir da ca- deia principal de fosfato de açúcar por outra unidade,

d) da substituição de uma unidade de β-D-ribose por uma unidade de açúcar modificada, e,

e) da substituição de uma base de nucleosídeo natural por uma base de nucleosídeo modificada.

Exemplos mais detalhados para a modificação química de um oligonucleotídeo seguem.

Os oligonucleotídeos podem incluir ligações de internucleotídeo modificadas, tais como aquelas descritas em a ou b acima. Estas ligações modificadas podem ser parcialmente resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizadas). Uma "molécula de oligonucleotideo estabilizada" signifi- cará um oligonucleotideo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, por meio de uma exo- or endo-nuclease) resultante de tais modificações. Oligonucleotídeos tendo ligações de fosforotioato, em al- gumas modalidades, podem fornecer atividade máxima e proteger o oligonu- cleotideo da degradação por exo- e endo-nucleases intracelulares.

Uma ponte de internucleosídeo de fosfodiéster localizada na ex- tremidade 3' e/ou 5' de um nucleosídeo pode ser substituída por um ponte de internucleosídeo modificada, em que a ponte de internucleosídeo modifi- cada é selecionada, por exemplo, de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2- fosforamidato, boranofosfato, α-hidroxibenzil fosfonato, fosfato-(C-i-C2i)-0- alquil éster, fosfato-[(C6-C12)aril-(C1-C2i)-0-alquil]éster, (Ci-C8)alquilfosfonato e/ou pontes de (C6-Ci2)arilfosfonato, (C7-C12)-a-hidroximetil-arila (por exem- plo, descrito em WO 95/01363), em que (C6-C12)arila, (C6-C20)arila e (C6- Ci4)arila são opcionalmente substituídas por halogênio, alquila, alcóxi, nitro, ciano, e onde R1 e R2 são, independentemente um do outro, hidrogênio, (Cr Ci8)-alquila, (C6-C2o)-arila, (Ce-C^y-anHCrCe^alquila, preferivelmente hi- drogênio, (C-i-CsJ-alquila, preferivelmente (CrC4)-alquila e/ou metoxietila, ou Í 2

ReR formam, junto com o átomo de nitrogênio que os transporta, um anel heterocíclico de 5 - 6 membros que adicionalmente pode conter um outro heteroátomo a partir do grupo 0, S e N.

A substituição de uma ponte de fosfodiéster localizada na extre- midade 3' e/ou 5' de um nucleosídeo por uma ponte de defosfo (pontes de defosfo são descritas, por exemplo, em Uhlmann E e Peyman A em "Me- thods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Ana- logs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, pp. 355 ff), em que uma ponte de defosfo é selecionada por exemplo a partir de pontes de defosfo formacetal, 3'-tioformacetal, metilidroxilamina, oxima, metilenodi- metol-hidrazo, dimetilenossulfona e/ou grupos silila.

Uma unidade de fosfato de açúcar (isto é, uma β-D-ribose e pon- te de internucleosídeo de fosfodiéster conjuntamente formando uma unidade de fosfato de açúcar) da cadeia principal de fosfato de açúcar (isto é, uma cadeia principal de fosfato de açúcar é composto de unidades de fosfato de açúcar) pode ser substituída por outra unidade, em que a outra unidade é por exemplo adequada para construir um oligômero "derivado de morfolino" (como descrito, por exemplo, em Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade derivada de morfolino; ou construir um ácido nucleico de poliamida ("PNA"; como descrito por exemplo, em Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade de cadeia principal PNA, por exemplo, por 2-aminoetilglicina. O oligonucleotídeo pode ter outras subs- tituições e modificações da cadeia principal de carboidrato, tais como ácidos nucleicos de peptídeo com grupos fosfato (PHONA), ácidos nucleico bloque- ados (LNA), e oligonucleotídeos que têm seções da cadeia principal com Iigantes de alquila ou Iigantes de amino. O Iigante de alquila pode ser ramifi- cado ou não-ramificado, substituído ou não-substituído, e quiralmente puro ou uma mistura racêmica.

A unidade de β-ribose ou uma unidade de p-D-2'-desoxirribose pode ser substituída por uma unidade de açúcar modificada, em que um u- nidade de açúcar modificada é selecionada, por exemplo, de β-D-ribose, a,- D-2'-desoxirribose, L-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxirribose, 2-F-arabinose, 2'-0-(C-i-C6)aIquil-ribose, 2'-0-metilrribose, 2,-0-(C2-C6)alquenil-ribose, 2'-[0- (Ci-C6)alquil-0-(CrC6)alquil]-ribose, 2,-NH2-2,-desoxirribose, β-D-xilo-furano- se, α-arabinofuranose, 2,4-didesóxi-p-D-eritro-hexo-piranose, carbocíclico (descrito, por exemplo, em Froehler (1992) J Am Chem Soc 114:8320) e/ou análogos de açúcar de cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Vanden- driessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) e/ou análogos de bicicloaçúcar (descritos, por exemplo, em Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Aeta 76:481). Em algumas modalidades, o açúcar modificado é uma ribose 2' modificada.

Em algumas modalidades, o açúcar é 2'-0-metilrribose, particu- larmente para um ou ambos nucleotídeos ligados por uma ligação de fosfo- diéster ou de intemucleosídeo semelhante a fosfodiéster.

Ácidos nucleicos da mesma forma incluem pirimidinas e purinas substituídas tais como C-5 propina pirimidina e bases modificadas de purina 7-deaza-7-substituídas. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Purinas e pirimidinas incluem porém não são limitadas a adenina, citosina, guanina, e timina, e outras nucleobases de ocorrência natural e não-natural, porções substituídas e não-substituídas.

Uma base modificada é qualquer base que é quimicamente dis- tinta das bases de ocorrência natural tipicamente encontrada em DNA e RNA tais como T, C, G, A1 e U, porém que compatilham estruturas químicas básicas com estas bases de ocorrência natural. A base de nucleosídeo mo- dificada pode, por exemplo, ser selecionada a partir de hipoxantina, uracila, di-hidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5- (Ci-C6)-alquiluracila, 5-(C2-C6)-alqueniluracila, 5-(C2-C6)-alquiniluracila, 5- (hidroximetil)uracila, 5-clorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-hidro- xicitosina, 5-(CrC6)-alquilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alqui- nilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilgua- nina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, uma 7-deazapurina substituída, prefe- rivelmente purina 7-deaza-7-substituída e/ou 7-deaza-8-substituída, 5-hidro- ximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por exemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxide- soxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, N4-alquildesoxicitidina, por exemplo, N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina, e desoxirribonucleosídeos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina, e diaminopurina, por exemplo, 2,6-diamino- purina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipo- xantina ou outras modificações de uma base de nucleosídeo natural. Esta lista é pretendida ser exemplar e não deve ser interpretada como limitante.

Em fórmulas particular descritas aqui, bases modificadas podem ser incorporadas. Por exemplo, uma citosina pode ser substituída com uma citosina modificada. Uma citosina modificada como utilizada aqui é um aná- logo de base de pirimidina de ocorrência natural ou de ocorrência não- natural de citosina que pode substituir esta base sem prejudicar a atividade imunoestimuladora do oligonucleotídeo. Citosinas modificadas incluem po- rém não são limitadas a citosinas 5-substituídas (por exemplo, 5-metil- citosina, 5-flúor-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina, e 5-alquinil- citosina não-substituída ou substiuída), citosinas 6-substituídas, citosinas N4-substituídas (por exemplo, N4-etila-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto- citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anel condensados (por exemplo, Ν,Ν'-propileno citosina ou fenoxazina), e uracila e seus derivados (por exemplo, 5-flúor-uracila, 5-bromo-uracila, 5- bromovinil-uracila, 4-tio-uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-propinil-uracila). Algumas dentre as citosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-flúor-citosina, 5- hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, e N4-etila-citosina. Em outra modali- dade da invenção, a base de citosina é substituída por uma base universal (por exemplo, 3-nitropirrol, P-base), um sistema de anel aromático (por e- xemplo, fluorobenzeno ou difluorobenzene) ou um átomo de hidrogênio (dS- pacer).

Uma guanina pode ser substituída com uma base de guanina modificada. Uma guanina modificada quando aqui utilizada é um análogo de base de purina de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural de guani- na que pode substituir esta base sem prejudicar a atividade imunoestimula- dora do oligonucleotídeo. Guaninas modificadas incluem porém não são limi- tadas a 7-deazaguanina, guanina 7-deaza-7-substituída (tal como 7-deaza-

7-(C2-C6)alquinilguanina), guanina 7-deaza-8-substituída, hipoxantina, gua- ninas N2-substituídas (por exemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil- 3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil-ade- nina, 8-oxo-adenina), guanina 8-substituída (por exemplo, 8-hidroxiguanina e

8-bromoguanina), e 6-tioguanina. Em outra modalidade da invenção, a base de guanina é substituída por uma base universal (por exemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol, e base de K), um sistema de anel aromático (por exemplo, ben- zimidazol ou dicloro-benzimidazol, amida de ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3- carboxílico) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer).

Para uso na presente invenção, os oligonucleotídeos da inven- ção podem ser sintetizados de novo utilizando quaisquer de vários procedi- mentos conhecidos na técnica, por exemplo, o método de β-cianoetil fosfo- ramidita (Beaucage SL et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); ou o método de H-fosfonato de nucleosídeo (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler BC et al., (1986) Nucleic Acids Res 14:5399 407; Ga- regg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055 8; Gaffney et al. (1988) Tetrahe- dron Lett 29:2619 22). Estas químicas podem ser realizadas por uma varie- dade de sintetizadores de ácido nucleico automatizados disponíveis no mer- cado. Estes oligonucleotídeos são chamados oligonucleotídeos sintéticos. Um oligonucleotídeo isolado geralmente refere-se a um oligonucleotídeo que é separado dos componentes que normalmente estão associados na nature- za. Como um exemplo, um oligonucleotídeo isolado pode ser aquele que é separado de uma célula, de um núcleo, das mitocôndrias ou da cromatina.

Cadeia principal modificadas tais como fosforotioatos podem ser sintetizadas utilizando técnicas automatizadas que empregam químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Aril e alquil fosfonatos podem ser feitos, por exemplo, como descrito na Patente norte-americana N0 4.469.863; e alquil- fosfotriésteres (em que a porção de oxigênio carregado é alquilada como descrito na Patente norte-americana N0 5.023.243 e Patente Européia N0 092.574) podem ser preparados por síntese de fase sólida automatizada utilizando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para preparar outras modificações e substituições de cadeia principal de DNA foram des- critos (por exemplo, Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioeonjugate Chem 1:165).

Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser oli- gonucleotídeos macios ou semimacios. Um oligonucleotídeo macio é um oligonucleotídeo imunoestimulador que tem uma cadeia principal parcial- mente estabilizada, em que as ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster ocorrem apenas dentro e imediatamente adja- cente a pelo menos um dinucleotídeo de pirimidina - purina interno (YZ). Pre- ferivelmente, YZ é YG, um dinucleotídeo de pirimidina-guanosina (YG). O pelo menos um dinucleotídeo de YZ interno propriamente dito tem uma liga- ção de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster. Uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster que ocorre imediatamente adjacente ao pelo menos um dinucleotídeo de YZ in- terno pode ser 5', 3', ou ambos 5' e 3' para ao pelo menos um dinucleotídeo de YZ interno.

Em particular, ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster envolvem "dinucleotídeos internos". Um dinucleo- tídeo interno em geral significará qualquer par de nucleotídeos adjacentes conectados por uma ligação de internucleotídeo, em que nenhum nucleotí- deo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo terminal, isto é, nenhum nucle- otídeo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo que define a extremidade 5' ou 3' do oligonucleotídeo. Desse modo, um oligonucleotídeo linear que é η nucleotídeos longos tem um total de n-1 dinucleotídeos e apenas n-3 dinu- cleotídeos internos. Cada ligação de internucleotídeo em um dinucleotídeo interno é uma ligação de internucleotídeo interno. Desse modo, um oligonu- cleotídeo linear que é η nucleotídeos longos tem um total de n-1 ligações de internucleotídeo e só n-3 ligações de internucleotídeo interno. O fosfodiéster estrategicamente colocado ou ligações de internucleotídeo semelhantes a fosfodiéster, portanto, refere-se a ligações de internucleotídeo de fosfodiés- ter ou semelhantes a fosfodiéster posicionadas entre qualquer par de nu- cleotídeos na seqüência de ácido nucleico. Em algumas modalidades, as ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhantes a fosfodiéster não estão posicionadas entre qualquer par de nucleotídeos mais próximo as extremidades 5' ou 3'.

Preferivelmente, uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster que ocorre imediatamente adjacente ao pelo menos um dinucleotídeo de YZ interno é uma ligação de internucleotídeo interno propriamente dita. Desse modo, para uma seqüência Ni YZ N2, em que Ni e N2 são cada qual, independente do outro, qualquer nucleotídeo Cí- nico, o dinucleotídeo de YZ tem uma ligação de internucleotídeo de fosfodi- éster ou semelhante a fosfodiéster, e além disso (a) Ni e Y são ligados por uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster quando Ni for um nucleotídeo interno, (b) Z e N2 são ligados por uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster quando N2 for um nucleotídeo interno, ou (c) N1 e Y são ligados por uma ligação de in- ternucleotídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster quando N1 for um nucleotídeo interno e Z e N2 são ligados por uma ligação de internucleo- tídeo de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster quando N2 for um nucleo- tídeo interno.

Acredita-se que oligonucleotídeos macios de acordo com a pre-

sente invenção são relativamente suscetíveis à clivagem de nuclease com- parados aos oligonucleotídeos completamente estabilizados. Sem pretender estar ligado a uma teoria particular ou mecanismo, acredita-se que oligonu- cleotídeos macios da invenção são cliváveis aos fragmentos com atividade reduzido ou não-imunoestimuladora relativo aos oligonucleotídeos macios de tamanho natural. A incorporação de pelo menos uma ligação de internucleo- tídeo sensível à nuclease, particularmente perto do meio do oligonucleotí- deo, acredita-se fornecer um "off switch" que altera as farmacocinéticas do oligonucleotídeo para reduzir a duração de atividade imunoestimuladora má- xima do oligonucleotídeo. Isto pode ser de valor particular em tecidos e em aplicações clínicas nas quais é desejável evitar a lesão relacionada à imu- noestimulação ou inflamação local crônica, por exemplo, o rim.

Um oligonucleotídeo semimacio é um oligonucleotídeo imunoes- timulador que tem uma cadeia principal parcialmente estabilizada, em que as ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhantes a fosfodiéster ocorrem apenas dentro de pelo menos um dinucleotídeo de pirimidina-purina interno (YZ). Oligonucleotídeos semimacios geralmente possuem potência imunoestimuladora aumentada relativo aos oligonucleotídeos imunoestimu- Iadores completamente estabilizados correspondentes. Devido à maior potência de oligonucleotídeos semimacios, oligonucleotídeos semimacios podem ser utilizados, em alguns exemplos, em concentrações eficazes inferiores e têm doses eficazes mais baixas que os oligonucleotídeos imuno- estimuladores completamente estabilizados convencionais para alcançar um efeito biológico desejado. Acredita-se que as propriedades precedentes de oligonucleo-

tídeos semimacios geralmente aumentam com "dose" crescente de ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhantes a fosfodiéster que envolvem dinucleotídeos de YZ internos. Desse modo acredita-se, por exemplo, que geralmente para uma determinada seqüência de oligonu- cleotídeo com cinco dinucleotídeos de YZ internos, um oligonucleotídeo com cinco ligações de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster internas são mais imunoestimuladoras do que um oligonucleo- tídeo com quatro ligações de internucleotídeo de YG de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster internas, que por sua vez são mais imunoesti- muladoras que um oligonucleotídeo com três ligações de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster internas, que por sua vez são mais imunoestimuladoras do que um oligonucleotídeo com duas liga- ções de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster internas, que por sua vez são mais imunoestimuladoras do que um oligo- nucleotídeo com uma ligação de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster interna. Importantemente, a inclusão de até mesmo uma ligação de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou seme- lhante a fosfodiéster interna não é acreditada ser vantajosa sobre a ligação de internucleotídeo de YZ de fosfodiéster ou semelhante a fosfodiéster interna. Além do número de ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhantes a fosfodiéster, a posição ao longo do comprimento do ácido nucleico pode da mesma forma afetar a potência.

Os oligonucleotídeos macios e semimacios geralmente incluirão, além das ligações de internucleotídeo de fosfodiéster ou semelhantes a fos- fodiéster em posições internas preferidas, extremidades 5' e 3' que são re- sistentes à degradação. Tais extremidades resistentes à degradação podem envolver qualquer modificação adequada que resulta em uma resistência aumentada contra a digestão de exonuclease em extremidades inalteradas correspondentes. Por exemplo, as extremidades 5' e 3' podem ser estabili- zadas pela inclusão de pelo menos uma modificação de fosfato da cadeia principal. Em uma modalidade preferida, a pelo menos uma modificação de fosfato da cadeia principal em cada extremidade é independentemente uma ligação de internucleotídeo de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, ou metilfosforotioato. Em outra modalidade, a extremidade resistente à de- gradação inclui uma ou mais unidades de nucleotídeo conectadas por liga- ções de peptídeo ou amida na extremidade 3'.

Uma ligação de internucleotídeo de fosfodiéster é o tipo de liga- ção característica de ácidos nucleicos encontrados na natureza. Como mos- trado na Figura 20, a ligação de internucleotídeo de fosfodiéster inclui um átomo de fósforo flanqueado por dois átomos de oxigênio de ligação com ponte e ligados da mesma forma por dois átomos de oxigênio adicionais, um carregado e o outro não carregado. Ligação de internucleotídeo de fosfodi- éster é particularmente preferida quando for importante reduzir a meia-vida de tecido do oligonucleotídeo.

Uma ligação de internucleotídeo semelhante a fosfodiéster é um grupo de ligação de com ponte contendo fósforo que é quimicamente e/ou diastereomericamente similar a fosfodiéster. Medidas de semelhança para fosfodiéster incluem suscetibilidade à digestão de nuclease e capacidade de ativar a RNAse H. Desse modo, por exemplo fosfodiéster, porém não fosfo- rotioato, oligonucleotídeos são suscetíveis à digestão de nuclease, enquanto tanto o fosfodiéster quanto os oligonucleotídeos de fosforotioato ativam a RNAse H. Em uma modalidade preferida, a ligação de internucleotídeo se- melhante a fosfodiéster é ligação de boranofosfato (ou equivalentemente, boranofosfonato). Patente norte-americana N0 5.177.198; Patente norte- americana N0 5.859.231; Patente norte-americana N0 6.160.109; Patente norte-americana N0 6.207.819; Sergueev et al„ (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. Em outra modalidade preferida, a ligação de internucleotídeo semelhante a fosfodiéster é fosforotioato de Rp diasteromericamente puro. Acredita-se que fosforotioato de Rp diasteromericamente puro é mais susce- tível à digestão de nuclease e é melhor na ativação de RNAse H do que fos- forotioato de Sp diastereomericamente puro ou misturado. Estereoisômeros de oligonucleotídeos de CpG são o objeto do pedido de Patente norte- americana copendente 09/361.575 27 depositado em julho de 1999, e pedi- do PCT publicado PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Deve ser notado que para propósitos da presente invenção, o termo "ligação de internucleotídeo semelhante a fosfodiéster" especificamente exclui ligações de internucleotí- deo de metilfosfonato e fosforoditioato.

Como descrito acima, os oligonucleotídeos macios e semimacios da invenção podem ter ligações semelhantes a fosfodiéster entre C e G. Um exemplo de uma ligação semelhante a fosfodiéster é uma ligação de fosforo- tioato em uma conformação de Rp. p-quiralidade de oligonucleotídeo pode ter efeitos aparentemente opostos sobre a atividade imune de um oligonu- cleotídeo de CpG1 dependendo do ponto de tempo no qual a atividade é me- dida. Em um ponto de tempo precoce de 40 minutos, o estereoisômero de Rp porém não o de SP do oligonucleotídeo de CpG de fosforotioato induz a fosforilação de JNK em células de baço de camundongo. Em comparação, quando analisado em um ponto de tempo recente de 44 h, o estereoisômero de Sp porém não o de Rp é ativo na estimulação da proliferação de célula de baço. Esta diferença nas cinéticas e bioatividade do e dos estereoisômeros de Rp e Sp não resulta de qualquer diferença na captação da célula, porém de preferência mais provável ser devido a dois papéis biológicos opostos da p-quiralidade. Primeiro, a atividade realçada do estereoisômero de Rp com- parada ao Sp para estimular células imunes em pontos de tempo precoces indica que o Rp pode ser mais eficaz na interação com o receptor de CpG, TLR9, ou induzir as séries de reações de sinalização de a jusante. Por outro lado, a degradação mais rápida dos PS-oligonucleotídeos de Rp comparada ao Sp resulta em uma duração muito mais curta de sinalização, de forma que os PS-oligonucleotídeos de Sp pareçam ser mais biologicamente ativos quando testados em pontos de tempo posteriores.

Um efeito surpreendentemente forte é obtido pela p-quiralidade no próprio dinucleotídeo de CpG. Em comparação a um oligonucleotídeo de CpG estéreo-aleatório, congênere em que o único dinucleotídeo de CpG foi ligado em Rp foi ligeiramente mais ativo, enquanto o congênere que contém uma ligação de Sp foi quase inativo para induzir a proliferação de célula de baço.

Em cada um dos aspectos anteriores da invenção, a composição

pode da mesma forma também incluir um portador farmaceuticamente acei- tável, tal que a invenção da mesma forma fornece composições farmacêuti- cas que contêm os Iigantes de TLR e o agente antiviral da invenção.

As composições da invenção podem da mesma forma ser utili- zadas para a preparação de um medicamento para uso no tratamento de uma condição viral em um indivíduo. O uso de acordo com este aspecto da invenção envolve a etapa de colocar uma quantidade eficaz de uma compo- sição da invenção em um portador farmaceuticamente aceitável.

Em certas modalidades, os Iigantes de TLR e agente antiviral são isolados. Uma molécula isolada é uma molécula que é substancialmente pura e está livre de outras substâncias com que é ordinariamente encontra- da na natureza ou em sistemas in vivo de certa forma práticos e apropriados para seu uso planejado. Em particular, os agentes são suficientemente puros e são suficientemente livres de outros constituintes biológicos de células a ser úteis, por exemplo, na produzindo de preparações farmacêuticas. Porque um agente isolado da invenção pode ser misturado com um portador farma- ceuticamente aceitável em uma preparação farmacêutica, o(s) agente(s) po- de(m) compreender apenas uma porcentagem pequena em peso da prepa- ração. O agente é no entanto isolado visto que foi substancialmente separa- do das substâncias com que pode estar associado em sistemas vivos.

Como utilizado aqui, um "agente antiviral" é um composto que previne a infecção de células por vírus ou replicação do vírus dentro da célu- la. Há muito menos fármacos antivirais do que os fármacos antibacterianas porque o processo de réplica viral está desse modo intimamente relacionado à replicação de DNA dentro da célula hospedeira, em que agentes antivirais não específicos seriam freqüentemente tóxicos ao hospedeiro. Há vários estágios dentro do processo de infecção viral que pode ser bloqueada ou inibida por agentes antivirais. Estes estágios incluem, ligação do vírus à cé- lula hospedeira (imunoglobulina ou peptídeos de ligação), não-revestimento do vírus (por exemplo, amantadina), síntese ou translação do mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação de RNA ou DNA viral (por exemplo, a- nálogos de nucleosídeo), maturação de novas proteínas de vírus (por exem- plo, inibidores de protease), e brotamento e liberação do vírus.

Análogos de nucleosídeo são compostos sintéticos que são simi- lares aos nucleotídeos, porém que têm um grupo ribose ou desoxirribose anormal ou incompleto. Logo que os análogos de nucleotídeo estão na célu- la, eles são fosforilados, produzindo o trifosfato formado que compete com nucleotídeos normais para incorporação no DNA ou RNA viral. Logo que a forma de trifosfato do análogo de nucleotídeo é incorporada na cadeia de ácido nucleico crescente, causa associação irreversível com a polimerase viral e assim a terminação da cadeia. Análogos de nucleotídeo incluem, po- rém não são limitados a, aciclovir (utilizado para o tratamento de vírus do herpes simples e vírus de varicela-zoster), ganciclovir (útil para o tratamento de citomegalovírus), idoxuridina, ribavirina (útil para o tratamento de vírus sincicial respiratório), didesoxi-inosina, didesoxicitidina, e zidovudina (azido- timidina).

Os interferons são citocinas que são segregadas por células in- fectadas por vírus bem como células imunes. Os interferons funcionam por ligação aos receptores específicos em células adjacentes às células infecta- das, causando a mudança na célula que protege da infecção pelo vírus. A e β-interferon da mesma forma induz a expressão de moléculas de MHC de Classe I e Classe Il na superfície de células infectadas, resultando na apre- sentação de antígeno aumentada para o reconhecimento de célula imune hospedeira. A e β-interferons estão disponíveis como formas recombinantes e foram utilizadas para o tratamento de infecção por hepatite BeC crônica. Nas dosagens que são eficazes para terapia antiviral, interferons têm efeitos colaterais severos tais como febre, mal-estar e perda de peso.

Várias Patentes norte-americanas descrevem compostos antivi- rais. Por exemplo, Patente norte-americana N0 7.094.768 descrevem deriva- dos de -hidroxiamino- ou uma 6-alcoxiamino-7-deazapurina-ribofuranose para tratar HCV; Patente norte-americana N0 7.041.698 descreve compostos de tripeptídeo, composições e métodos para o tratamento de HCV; Patente norte-americana N0 6.995.174 descreve inibidores de HCV; Patente norte- americana N0 7.022.736 descreve Dicetoácidos como inibidores virais; Pa- tente norte-americana N0 6.909.000 descreve inibidores de NS3-NS4A seri- na protease de HCV bicíclicos ligados com ponte; Patente norte-americana N0 6.867.185 descreve inibidores macrocíclicos de HCV; Patente norte- americana N0 6.869.964 descreve inibidores de HCV de sulfonamida hetero- cíclicos; Patente norte-americana N0 6.846.810 descreve derivado de nucle- osídeo Antivirais; e PCT Publicado No.: WO 0248157 descreve imidazolidi- nonas e seus derivados relacionados como Inibidores de NS3 Protease de HCV.

Vários fármacos foram ou estão sendo desenvolvidos para blo- quear a entrada de um vírus em uma célula hospedeira. Estes incluem a- mantadina e rimantadina que são utilizados contra gripe; pleconaril para tra- tamento de rinovírus, enterovírus, meningite, conjuntivite, e encefalite.

Como mencionado acima, nucleotídeo ou análogos de nucleosí- deo são uma classe de fármacos que alvejam os processos que sintetizam componentes de vírus depois que um vírus invade uma célula. Aciclovir, é um análogo de nucleosídeo que é eficaz contra infecções por herpesvírus. Zidovudina (AZT), para tratar o HIV1 é da mesma forma um análogo de nu- cleosídeo. Lamivudina é utilizado para tratar hepatite B, que utiliza transcrip- tase reversa como parte de seu processo de replicação.

Outros antivirais a ser desenvolvidos incluem alvos de Rnase H e integrase, compostos com base em ribozimas, inibidores de protease e fármacos que interferem com a liberação de vírus a partir da célula hospe- deira tais como zanamivir e oseltamivir para o tratamento da gripe.

Exemplos de antivirais que são atualmente utilizados incluem:

Lamivudina (2\3'-didesóxi-3'-tiacitidina, 3TC) utilizada para o tra- tamento de HIV e hepatite B crônica é um inibidor de transcriptase reversa comercializado por GIaxoSmithKIine sob as marcas Epivir® e Epivir-HBV®. É da mesma forma chamado de 3TC. É é um análogo de citidina.

Abacavir (ABC) é um inibidor de transcriptase reversa de análo- go de nucleosídeo (NARTI) utilizado para tratar HIV e AIDS. Está disponível sob o nome comercial Ziagen® (GIaxoSmithKIine) e os fármacos de combi- nação Trizivir® (abacavir, zidovudina e lamivudina) e Kivexa®/Epzicom™ (abacavir e lamivudina). ABC é um análogo de guanosina (uma purina). Seu alvo é a enzima transcriptase reversa viral. Aciclovir (INN) ou acyclovir(acyclovir) (USAN), nome químico acicloguanosina, é um fármaco antiviral de análogo de guanina utilizado para o tratamento de, por exemplo, vírus do herpes simples tipo I (HSV-1), vírus do herpes simples tipo Il (HSV-2), vírus de Varicella zoster (VZV)1 vírus de Epstein-Barr (EBV), e Citomegalovírus (CMV). É um dos fármacos antivi- rais mais geralmente utilizados, e é mais geralmente comercializado sob o nome comercial Zovirax (GSK). Aciclovir difere-se dos análogos de nucleo- sídeo anteriores em que contém apenas uma estrutura de nucleosídeo par- cial - o anel de açúcar é substituído por uma estrutura de cadeia aberta. Aci- clo-GTP é um inibidor muito potente de DNA polimerase viral.

Amantadina (1-aminoadamantano, vendido como Symmetrel®) é um fármaco antiviral para o tratamento de vírus da gripe A.

Didanosina (2'-3'-didesoxi-inosina, ddl) é vendido sob os nomes comerciais Videx® e Videx EC®. É um inibidor de transcriptase reversa, efi- caz contra HiV e utilizado com outra terapia de fármaco antirretroviral como parte de terapia antirretroviral altamente ativa (HAART). Didanosina (ddl) é um análogo de nucleosídeo de adenosina que tem hipoxantina ligada ao a- nel de açúcar.

Entricitabina (FTC), com nome comercial Emtriva® (anteriormen- te Coviracil), é um inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeo (NRTI) para o tratamento de infecção por HIV em adultos. Entricitabina é um análo- go de citidina.

Enfuvirtida (INN) é um inibidor de fusão de HIV1 comercializada sob o nome comercial Fuzeon (Roche).

Entecavir é uma fármaco antiviral oral utilizado no tratamento de infecção por hepatite B, comercializado sob o nome comercial Baraclude (BMS). Entecavir é um análogo de guanina que inibe todas as três etapas no processo de replicação viral.

Ganciclovir é um medicamento antiviral utilizado para tratar ou prevenir as infecções por citomegalovírus (CMV). Ganciclovir é um análogo sintético de 2'-desóxi-guanosina.

Nevirapina, da mesma forma comercializada sob o nome comer- ciai Viramune® (Boehringer Ingelheim), é um inibidor de transcriptase rever- sa de não-nucleosídeo (NNRTI) utilizado para tratar infecção por HIV-1 e AIDS, porém, é um inibidor de protease.

Oseltamivir é uma fármaco antiviral que é utilizado no tratamento e profilaxia tanto vírus da gripe A e vírus da gripe B. É um inibidor de neura- minidase que age como um inibidor de análogo em estado de transição de gripe neuraminidase, impedindo novos vírus novos emergirem das células infectadas. Oseltamivir é indicado para o tratamento de infecções devido a gripe A e vírus de B bem como contra parvovírus canino, panleucopenia feli- na, o complexo respiratório canino conhecido como "tosse de canil", e a do- ença emergente "gripe canina" dubbed.

Ribavirina (Copegus®; Rebetol®; Ribasphere®; Vilona®, Virazo- le®, também os genéricos de Sandoz, Teva1 Warrick) é uma fármaco antivi- ral que é ativo contra vários vírus de DNA e RNA. É um membro dos fárma- cos antimetabólitos de nucleosídeo que interferem com a duplicação de ma- terial genético viral. Ribavirina tem uma ampla faixa de atividade, incluindo atividades importantes contra gripe, flavivírus e agentes de muitas febres hemorrágicas virais hepatite C, doenças relacionadas ao vírus sincicial respi- ratório. Em uma modalidade, a administração de ribavirina com Iigantes de TLR7,8,9 tal como CpG ODNs ou ORNs diminuem a quantidade de IL-10 relativo a IFN-alfa produzida como resultado do Iigante de TLR.

AICA-Ribosida é uma fármaco antiviral similar à Ribavirina. Em uma modalidade, administração de AICA-Ribosida com Iigantes de TLR7,8,9 tal como CpG ODNs ou ORNs diminui a quantidade de IL-10 relativo a IFN- alfa produzida como resultado do Iigante de TLR.

Rimantadina nome comercial Flumadine® é um medicamento oralmente administrado utilizado para tratar, e em casos raros prevenir, in- fecção por vírus da gripe A.

Estavudina (2'-3'-didesidro-2,-3'-didesoxitimidina, d4T, marca Zerit®) é um inibidor de transcriptase reversa de análogo de nucleosídeo (NARTI) ativo contra HIV. Estavudina é um análogo de timidina.

Valaciclovir (INN) ou valaciclovir (USAN) é uma fármaco antiviral utilizado na administração de herpes simples e herpes zóster.

Vidarabina é uma fármaco antiviral que é ativo contra o vírus do herpes simples e varicela zoster. Vidarabina (9-p-D-ribofuranosiladenina) é um análogo de adenosina com o açúcar D-ribose, substituído por D- arabinose.

Zalcitabina (2'-3'-didesoxicitidina, ddC), da mesma forma cha- mada de didesoxicitidina, é um inibidor de transcriptase reversa análogo de nucleosídeo (NARTI) vendido sob o nome comercial Hivid®. Zalcitabina é um análogo de pirimidina. Em alguns aspectos da invenção, um agente antiviral tal como

um análogo de nucleosídeo pode ser incorporado no oligonucleotídeo imu- noestimulador durante a síntese do oligonucleotídeo em uma ou várias posi- ções na molécula, tais como as terminações 3' ou 5'. Isto pode da mesma forma incluir a incorporação de sítios suscetíveis à nuclease na lateral do(s) análogo(s) de nucleosídeo para permitir a clivagem do composto antiviral depois da administração para permitir sua atividade antiviral independente do oligonucleotídeo imunoestimulador. O agente antiviral pode da mesma forma ser ligado por outras ligações (por exemplo, 3' - 3') ou Iigantes (por exemplo, Iigantes de não-nucleotídeo) ao ON estimulador imune. Além disso, a conjugação de Iigantes para TLRs diferentes em

uma molécula pode levar à multimerização de receptores que resultam na estimulação imune realçada ou um perfil imunoestimulador diferente daquele resultante resultante de qualquer único tal ligante.

A invenção fornece uma composição incluindo um ligante de TLR ligado a um agente antiviral. Como utilizado aqui, o termo "ligado" refe- re-se a qualquer combinação de duas ou mais partes de componente que são ligadas juntas, diretamente ou indiretamente, por qualquer interação fisi- coquímica. Em uma modalidade, a ligação é uma combinação de duas ou mais partes de componente que são ligadas juntas, diretamente ou indireta- mente, por ligação covalente. Desse modo, em algumas modalidades, os Iigantes de TLR da invenção podem ser administrados juntos com, porém fisicamente separados dos agentes antivirais. Entretanto, em outras modali- dades, os conjugados de ligante-agente antiviral são considerados.

Os Iigantes podem ser ligados a qualquer porção reativa no oli- gonucleotídeo incluindo porém podem não-limitados a um grupo de fosfato da cadeia principal ou um grupo hidroxila de açúcar. Por exemplo, eles po- dem ser incorporados por ligações de fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfo- nato e/ou amida. As moléculas diferentes são sintetizadas por métodos es- tabelecidos e podem ser ligadas juntas em linha durante a síntese de fase sólido. Alternativamente, elas podem ser ligadas juntas seguindo a síntese das seqüências parciais individuais. Os Iigantes podem ser não-nucleotídeo na natureza. Ligantes

não-nucleotídicos são, por exemplo, resíduos abásicos (Espaçador d), oligo- etilenoglicol, tal como trietilenoglicol (espaçador 9) ou hexaetilenoglicol (es- paçador 18), ou alcano-diol, tal como butanodiol. As unidades espaçadoras são preferivelmente ligadas por ligações de fosfodiéster ou fosforotioato. As unidades Iigantes podem aparecer apenas uma vez na molécula ou podem ser incorporadas várias vezes, por exemplo, por ligações de fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, ou amida. Outros Iigantes preferidos são Iigan- tes de alquilamino, tais como C3, C6, C12 aminoligadores, e da mesma for- ma Iigantes de alquiltiol, tais como Iigantes de tiol de C3 ou C6. Os oligonu- cleotídeos podem da mesma forma ser ligados por resíduos aromáticos que podem ser também substituídos por grupos alquila ou alquila substituída. Os oligonucleotídeos podem da mesma forma conter uma unidade Duplicadora ou Trebler, que permite a conjugação de Iigantes múltiplos de um ou tipos diferentes ao oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos podem da mesma for- ma conter unidades Iigantes resultantes de reagentes modificadores de pep- tídeo ou reagentes modificadores de oligonucleotídeo (www.glenres.com). Além disso, pode conter um ou mais resíduos de aminoácido naturais ou antinaturais que são conectados por ligações de peptídeo (amida). Tipos diferentes de Iigantes podem da mesma forma em novos ligantes. Os oligo- nucleotídeos diferentes são sintetizados por métodos estabelecidos e podem ser ligados juntos em linha durante a síntese de fase sólido. Alternativamen- te, eles podem ser ligados conjuntamente pós-síntese das seqüências parei- ais individuais.

Em algumas modalidades da invenção, o agente antiviral e Iigan- te de TLR são ligados tal que eles fazem parte da mesma molécula. Ligantes de TLR podem ser ligados aos agentes antivirais diretamente ou por Iigantes não-nucleotídicos. Um Iigante de TLR é "ligado diretamente" se for covalen- temente ligado ao oligonucleotídeo sem estruturas intervenientes. Um oligo- nucleotídeo é referido ser "ligado indiretamente" se for conectado ao oligo- nucleotídeo por um ligante.

O ligante que conecta o oligonucleotídeo e o agente antiviral po- de conter um sítio suscetível à nuclease. Um "sítio suscetível à nuclease" como utilizado aqui refere-se a uma seqüência de DNA ou RNA que é reco- nhecida e clivada por um membro da classe de enzimas conhecidas como nucleases. Em algumas modalidades, o sítio suscetível à nuclease é reco- nhecido e clivado por uma nuclease naturalmente presente na célula-alvo.

Em algumas modalidades, o agente antiviral ou o ligante é con- jugado em um nucleotídeo interno do oligonucleotídeo imunoestimulador. Um "nucleotídeo interno" como utilizado aqui refere-se a um nucleotídeo que não está na terminação 3' ou 5' extrema do polímero de ácido nucleico. Um "nucleotídeo terminal", portanto, refere-se a um nucleotídeo nos terminais 3* ou 5' do polímero de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o agente an- tiviral ou o ligante é conjugado em um nucleotídeo terminal. Como utilizado aqui, o "nucleotídeo de terminal 3"' refere-se ao resíduo de nucleotídeo no terminal 3' extremo do polímero de oligonucleotídeo. Semelhantemente, o "nucleotídeo de terminal 5'" refere-se ao resíduo de nucleotídeo no terminal 5' extremo do polímero de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo imunoestimulador pode compreender uma ligação 3'-3' in- terno ou ligação 5-5'. Em tais casos, o oligonucleotídeo imunoestimulador tem duas ligações de 5' ou 3', respectivamente. Se o agente antiviral for um nucleotídeo ou oligonucleotídeo, o agente antiviral pode da mesma forma ser conjugado ao oligonucleotídeo imunoestimulador através de uma ligação de 3-5', 3'-3' ou 5-5'.

Em alguns aspectos da invenção, o ligante de TLR e o agente antiviral não são ligados porém são administrados juntos no contexto de uma micropartícula. Uma "micropartícula" como utilizada aqui é uma micropartícu- Ia biocompatível ou implante que é adequado para implantação ou adminis- tração ao recipiente mamífero. Implantes bioerosíveis exemplares que são úteis de acordo com este método são descritos no pedido Internacional PCT N0 PCT/US/03307 (Publicação N0 W095/24929, intitulado "Polimeric Gene Delivery System", aqui incorporado por referência. PCT/US/0307 descreve uma matriz biocompatível, preferivelmente polimérica biodegradável para conter um gene exógeno sob o controle de um promotor apropriado. A matriz polimérica pode ser utilizada para alcançar liberação prolongada do gene exógeno no paciente.

A matriz polimérica preferivelmente está na forma de um micro- partícula tal como uma microsfera (em que o oligonucleotídeo imunoestimu- Iador e agentes ou agente antiviral são dispersos ao longo de uma matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (em que o oligonucleotídeo imuno- estimulador e agentes ou agente antiviral são armazenados no núcleo de uma casca polimérica). Outras formas da matriz polimérica por conter o oli- gonucleotídeo imunoestimulador e agentes ou agente antiviral incluem pelí- culas, revestimentos, géis, implantes, e stents. O tamanho e composição do dispositivo de matriz polimérica é selecionado para resultar em cinéticas de liberação favorável no tecido no qual a matriz é introduzida. O tamanho da matriz polimérica também é selecionado de acordo com o método de libera- ção que deve ser utilizado, tipicamente injeção em um tecido ou administra- ção de uma suspensão por aerossol nas áreas nasal e/ou pulmonar. Preferi- velmente quando uma rotina por aerossol é utilizada, a matriz polimérica e o ácido nucleico, agente antiviral, e/ou alergênio são abrangidos em um veícu- lo tensoativo. A composição de matriz polimérica pode ser selecionada para ter igualmente taxas de degradação favoráveis e da mesma forma ser for- mada de um material que é bioadesivo, para também aumentar a eficácia da transferência quando a matriz é administrada a uma superfície nasal e/ou pulmonar que tem sustentado uma lesão. A composição da matriz da mes- ma forma pode ser selecionada para não degradar, porém de preferência, liberar por difusão durante um período prolongado de tempo.

Tanto as matrizes poliméricas não-biodegradáveis quanto as biodegradáveis podem ser utilizadas para liberar o Iigante de TLR e/ou anti- viral ao indivíduo. Matrizes biodegradáveis são preferidas. Tais polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. O polímero é selecionado com base no período de tempo em que a liberação é desejada, geralmente na ordem de algumas horas a um ano ou por mais tempo. Tipicamente, a libe- ração durante um período que varia dentre algumas horas e três a doze me- ses é muito desejável. O polímero opcionalmente está na forma de um hi- drogel que pode absorver até cerca de 90% de seu peso em água e tam- bém, opcionalmente é reticulado com íons multivalentes ou outros políme- ros.

Polímeros bioadesivos de interesse particular incluem hidrogéis bioerosíveis descritos por H.S. Sawhney, C.P. Pathak e J.A. Hubell em Ma- cromolecules, (1993) 26:581-587, os ensinamentos dos quais estão aqui incorporados, ácidos poli-ialurônicos, caseína, gelatina, glutina, polianidridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosana, poli(metil metacrilatos), poli(eti) meta- crilatos), poli(butilmetacrilato), poli(isobutil metacrilato), poli(hexilmetacrilato), poli(isodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), po- li(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), e poli(octadecil acrilato).

Como utilizado aqui, o termo "tratar" como utilizado em referên- cia a um indivíduo tendo uma doença ou condição pretenderá prevenir, me- lhorar, ou eliminar pelo menos um sinal ou sintoma da doença ou condição no indivíduo.

As composições descritas aqui podem ser utilizadas no trata- mento de câncer.

Um indivíduo tendo um câncer é um indivíduo que tem células cancerígenas detectáveis. O câncer pode ser um câncer maligno ou não- maligno. "Câncer" como utilizado aqui refere-se a um crescimento descon- trolado de células que interferem com o funcionamento normal dos sistemas e órgãos corporais. Cânceres que migram-se de seu local original e semei- am em órgãos vitais podem levar eventualmente à morte do indivíduo atra- vés da deterioração funcional dos órgãos afetados. Cânceres hemopoiéticos, tal como leucemia, são capazes de superar os compartimentos hemopoiéti- cos normais em um indivíduo, desse modo levando à insuficiência hemopoi- ética (na forma de anemia, trombocitopenia e neutropenia) finalmente cau- sando morte.

Uma metástase é uma região de células cancerígenas, distintas da localização de tumor primário, resultante da disseminação de células cancerígenas do tumor primário para outras partes do corpo. No momento do diagnóstico da massa de tumor primária, o indivíduo pode ser monitorado quanto a presença de metástase. Metástases são detectadas mais freqüen- temente através do uso combinado ou exclusivo de varreduras por imagea- mento de ressonância magnética (MRI), varreduras por tomografia computa- dorizada (CT) varreduras, contagens de sangue e plaqueta, estudos da fun- ção do fígado, raios X de tórax e varreduras ósseas além do monitoramento de sintomas específicos.

Cânceres incluem, porém não são limitados a, carcinoma de cé- lula basal, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer ósseo; câncer ce- rebral e sistema nervoso central (CNS); câncer de mama; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer endometrial; câncer esofágico; câncer de olho; câncer da cabeça e pescoço; neoplasma intraepitelial; câncer renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, cé- lula pequena e não-pequena); Iinfoma incluindo Iinfoma de Hodgkin e Não- Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca, efaringe); câncer ovariano; câncer pancreático; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; cân- cer testicular; câncer da tireóide; câncer uterino; câncer do sistema urinário, bem como outros carcinomas, adenocarcinomas, e sarcomas.

A composição imunoestimuladora da invenção pode da mesma forma ser administrada junto com uma terapia anticâncer. Terapias anticân- cer incluem medicamentos de câncer, radiação, e procedimentos cirúrgicos. Como utilizado aqui, um "medicamento de câncer" se refere a um agente que é administrado a um indivíduo com a finalidade de tratar um câncer. Como utilizado aqui, "tratar câncer" inclui impedir o desenvolvimento de um câncer, reduzindo os sintomas de câncer, e/ou inibindo o crescimento de um câncer estabelecido. Em outros aspectos, o medicamento de câncer é admi- nistrado a um indivíduo em risco de desenvolver um câncer com a finalidade de reduzir o risco de desenvolver o câncer. Vários tipos de medicamentos para o tratamento de câncer aqui são descritos. Para o propósito desta es- pecificação, medicamentos de câncer são classificados como agentes qui- mioterapêuticos, agentes imunoterapêuticos, vacinas de câncer, terapia hormonal e modificadores de resposta biológica.

O agente quimioterapêutico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, clo- roetilnitrosoureias não contendo açúcar, 5-fluorouracila, mitomicina C1 bleo- micina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamine GLA, valrubi- cina, carmustaína e poliferposana, MMI270, BAY 12-9566, inibidor de RAS famesil transferase, inibidor de famesil transferase, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hicantina/Topotecana, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxantrona, Metarete/Suramina, Batimastate, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-CA, AG3340, AG3433, Incel/VX- 710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistate, BB2516/Marmistate, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, DC 32/Valrubicina, Metastrona/ derivado de estrôncio, Temodal/Temozolomida, Evacete/ doxorrubicina lipossômica, Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulo- na/Doxifluridina, Ciclopax/ paclitaxel oral, Taxóide Oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, inibidor de oncogene de RAS/ CP-609 (754), BMS-182751/ platina oral, UFT(Tegafur/Uracila), Ergami- sol/Levamisol, realçador de Eniluracil/776C85/5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/lrinotecana, Tumodex/Ralitrexede, Leustatina/Cladribina, Pa- xex/Paclitaxel, Doxil/doxorrubicina lipossômica, Caelyx/doxorrubicina Iipos- sômica, Fludara/Fludarabina, Farmarrubicina/Epirrubicina, DepoCyt1 ZD1839, LU 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastaína, Caetyx/ doxorru- bicina lipossômica, Genzar/Gencitabina, ZD 0473/Anormede, YM 116, se- mentes de lodo, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/lfosamida, Vumona/Teniposídeo, Parapla- tina/Carboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepesida/Etoposídeo, ZD 9331, Taxo- tero/Docetaxel, pró-fármaco de guanina arabinosídeo, Análogo de Taxano, nitrosoureias, agentes de alquilação tais como melfalana e ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginase, Bussulfano, Carboplatina, Clorombucila, HCI de Citarabina, Dactinomicina, HCI de Daunorrubicina, fosfato sódico de Estramustina, Etoposídeo (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracila (5-FU), Flu- tamida, Hidroxiureia (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferon Alfa-2a, Alfa- 2b, acetato de Leuprolida (análogo de fator Iiberador de LHRH), Lomustina (CCNU), HCI de Mecloretamina (mostarda nitrogenada), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano (ο.ρ'-DDD), HCI de Mitoxantrona, Octreotídeo, Plicamicina, HCI de Procarbazina, Estreptozocina, citrato de Tamoxifeno, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vimblastina, Ansacrina (m-AMSA), Azacitidina, Ertropoie- tina, Hexametilmelamina (HMM), Interleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilidrazona; MGBG), Pentostatina (2'desoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU), Teniposídeo (VM-26) e sulfato de Vindesina, po- rém não são desse modo limitados.

O agente imunoterapêutico pode ser selecionado a partir do gru- po consistindo em 3622W94, 4B5, ANA Ab, anti-FLK-2, anti-VEGF, ATRA- GEN, AVASTIN (bevacizumabe; Genentech), BABS, BEC2, BEXXAR (tosi- tumomabe; GIaxoSmithKIine), C225, CAMPATH (alentuzumabe; Genzyme Corp.), CEACIDE, CMA 676, EMD-72000, ERBITUX (cetuximabe; ImCIone Systems, Inc.), Gliomab-H, GNI-250, HERCEPTIN (trastuzumabe; Genente- ch), IDEC-Y2B8, ImmuRAIT-CEA1 ior c5, ior egf.r3, ior t6, LDP-03, Lympho- Cide, MDX-11, MDX-22, MDX-210, MDX-220, MDX-260, MDX-447, MELIM- MUNE-1, MELIMMUNE-2, Monopharm-C, NovoMAb-G2, Oncolym, OV103, Ovarex1 Panorex1 Pretarget1 Quadramet1 Ributaxina1 RITUXAN (rituximabe; Genentech), 1D10 Ab1 SMART ABL1 SMART 364 Ab1 SMART M195, TNT1 e ZENAPAX (daclizumabe; Roche), porém não é desse modo limitado.

A invenção da mesma forma envolve métodos de tratar infec- ções bacterianas. Um "sujeito tendo uma infecção" é um indivíduo que tem um distúrbio que surge a partir da invasão do indivíduo, superficial, local, ou sistemicamente, por um micro-organismo infeccioso. O micro-organismo in- feccioso pode ser um vírus ou bactéria.

Bactérias são organismos unicelulares que multiplicam assexu- almente por fissão binária. Elas são classificados e nomeadas com base em sua morfologia, reações de manchamento, nutrição e requerimentos metabó- licos, estrutura antigênica, composição química, e homologia genética. Bac- térias podem ser classificadas em três grupos com base em suas formas morfológicas, esféricas (coco), straight-rod (bacilo) e vara curvada ou espiral {vibrio, campylobacter, spirillum, e spirochaete). Bactérias são da mesma forma mais comumente caracterizadas com base em suas reações de man- chamento em duas classes de organismos, gram-positivos e gram-nega- tivos. Gram se refere ao método de manchamento que é geralmente realiza- do em laboratórios de microbiologia. Organismos gram-positivos retêm a mancha seguindo o procedimento de manchamento e parecem uma cor vio- leta profunda. Organismos gram-negativos não retêm a mancha porém ab- sorvem a contadora-mancha e desse mdo parece rosa.

Bactérias infecciosas incluem, porém não são limitadas a, bacté- rias gram negativas e gram positivas. Bactérias gram positivas incluem, po- rém não são limitadas a espécies Pasteurella, espécies Staphylococci, e es- pécies Streptococcus. Bactérias gram negativas incluem, porém não são limitadas a, Eseherichia coli, espécies Pseudomonas, e espécies Salmonel- la. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem porém não são limitados a: Helicobaeter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophi- Ha, Myeobaeteria sps (por exemplo, M. tubereulosis, M. avium, M. intracellu- lare, M. kansasii, M. gordonae), Staphyloeoeeus aureus, Neisseria gonorrho- eae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyoge- nes (rGrupo A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B Strepto- coccus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococ- eus bovis, Streptococcus (espécies anaeróbiasj, Streptococcus pneumoniae, Campylobaeter sp patogênica, Enteroeoeeus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthraeis, Corynebaeterium diphtheriae, Corynebaeterium sp., Ery- sipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Entero- baeter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multoeida, Baeteroides sp., Fusobaeterium nueleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pal- lidum, Treponema pertenue, Leptospira, Riekettsia, e Aetinomyees israelli.

Outros micro-organismos medicalmente relevantes foram descri- tos extensivamente na literatura, por exemplo, vide C.G.A Thomas, Medicai Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, os teores totais dos quais estão aqui incorporados por referência. Cada uma das listas anteriores é ilustrativo e não é pretendido ser limitante.

Os métodos da invenção podem também incluir a administração de agentes antibacterianos. Os agentes antibacterianos matam ou inibem bactérias, e inclui antibióticos bem como outros compostos sintéticos ou na- turais tendo funções similares. Muitos antibióticos são moléculas de peso molecular baixo que são produzidos como metabólitos secundários por célu- las, tal como micro-organismos. Em geral, antibióticos interferem com uma ou mais funções ou estruturas que são específicas para o micro-organismo e que não estão presentes em células hospedeiras.

Antibióticos antibacterianos que são eficaz para matar ou inibir uma ampla faixa de bactérias são referidos como antibióticos de amplo es- pectro. Outros tipos de antibióticos antibacterianos são predominantemente eficazes contra as bactérias da classe gram-positivas ou gram-negativas. Estes tipos de antibióticos são referidos como antibióticos de espectro estrei- to. Outros antibióticos que são eficazes contra um único organismo ou doen- ça e não contra outros tipos de bactérias, são referidos como antibióticos de espectro limitado.

Agentes antibacterianos às vezes são classificados com base em seu modo primário de ação. Em geral, agentes antibacterianos são inibi- dores de síntesede parede celular, inibidores de membrana celular, inibido- res de síntese de proteína, síntese de ácido nucleico ou inibidores funcio- nais, e inibidores competitivos. Inibidores de síntese de parede celular ini- bem uma etapa no processo de síntese de parede celular, e em geral na síntese de peptidoglicano bacteriano. Inibidores de síntese de parede celular incluem antibióticos de p-lactam, penicilinas naturais, penicilinas semi- sintéticas, ampicilina, ácido clavulânico, cefalolsporinas, e bacitracina.

Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhos (por exemplo em solução salina ou tampão) ou utilizando-se quaisquer veto- res de liberação conhecidos na técnica. Os Iigantes de TLR e agentes antivi- rais podem ser combinados com outros agentes terapêuticos tais como ad- juvantes para realçar respostas imunes além disso. O Iigante de TLR e/ou o agente antiviral e/ou outro agente terapêutico pode ser administrado simul- taneamente ou sequêncialmente. Quando os outros agentes terapêuticos são administrados simultaneamente eles podem ser administrados nas mesmas ou separadas formulações, porém são administrados ao mesmo tempo. Os outros agentes terapêuticos são administrados sequêncialmente um ao outro e com o Iigante de TLR e agente antiviral, quando a administra- ção dos outros agentes terapêuticos e do Iigante de TLR e agente antiviral é temporariamente separado. A separação do tempo entre a administração destes compostos pode ser uma questão de minutos ou pode ser mais lon- go. Outros agentes terapêuticos incluem porém não são limitados a adjuvan- tes de ácido não-nucleico, citocinas, anticorpos, antígenos, etc.

Um adjuvante de ácido não-nucleico é qualquer molécula ou composto exceto para os ácidos nucleicos imunoestimuladores descritos aqui que pode estimular a resposta imune celular e/ou humoral. Adjuvantes de ácido não-nucleico incluem, por exemplo, adjuvantes que cria um efeito de depo, adjuvantes de estimulação imune, adjuvantes que criam um efeito de depo e estimulam o sistema imune e adjuvantes mucosos.

Um adjuvante como o que cria um efeito de depo quando aqui utilizado é um adjuvante que causa um antígeno a ser liberado lentamente no corpo, desse modo prolongando a exposição de células imunes ao antí- geno. Um adjuvante de estimulação imune é um adjuvante que causa ativa- ção de uma célula do sistema imune. "Adjuvantes que criam um efeito de depo e estimulam o sistema imune" são aqueles compostos dos quais tem ambas as funções identificadas acima. Um " adjuvante mucoso de ácido nu- cleico" quando utilizado aqui é um adjuvante diferente de um ácido nucleico imunoestimulador que é capaz de induzir uma resposta imune mucosal em um indivíduo quando administrado a uma superfície mucosal juntamente com um antígeno. Tais moléculas são descritas por exemplo, em Pedido de Patente norte-americana N0 10/888,886 publicado como US 2004/0266719 e Patente norte-americana N0 6.406.705 cada dos quais estão incorporados por referência.

Respostas imunes podem da mesma forma ser induzidas ou aumentadas pela coadministração ou expressão colinear de citocinas (Bue- Ier & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al„ 1997; Kim et al„ 1997) ou moléculas co-estimuladoras B-7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) com os ácidos nucleicos imunoestimuladores e a- gentes antivirais. As citocinas podem ser administrados diretamente com ácidos nucleicos imunoestimuladores ou podem ser administradas na forma de um vetor de ácido nucleico que codifica a citocina, tal que a citocina pode ser expressada in vivo. Em uma modalidade, a citocina é administrada na forma de um vetor de expressão de plasmídeo. Nesta modalidade, o ácido nucleico imunoestimulador não está contido dentro do mesmo plasmídeo. O termo "citocina" é utilizado como um nome genérico para um grupo diverso de proteínas solúveis e peptídeos que agem como reguladores humorais em concentrações nano- a picomolar e que, sob condições normais ou patológi- cas, modulam as atividades funcionais de células individuais e tecidos. Estas proteínas da mesma forma mediam interações entre células diretamente e regulam processos no lugar no ambiente extracelular. Exemplos de citocinas incluem, porém não são limitados a IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL- 12, IL-15, IL-18 fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (GCSF), interfe- ron-γ (γ-IFN), IFN-a, fator de necrose de tumor (TNF), TGF-β, Iigante FLT-3, e Iigante CD40. Citocinas desempenham um papel dirigindo-se a resposta de célula T. Células T auxiliares (CD4+) orquestram a resposta imune de mamíferos através da produção de fatores solúveis que agem em outras cé- lulas do sistema imune, incluindo outras células Τ. A maioria das células T auxiliares CD4+ maduras expressam um de dois perfis de citocina: Th1 ou Th2. Em algumas modalidades é preferido que a citocina é uma citocina Th1.

O termo "quantidade eficaz" de um Iigante de TLR e um agente antiviral se refere à quantidade necessária ou suficiente para realizar um efeito biológico desejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico imunoestimulador e um agente antiviral para tratar ou prevenir do- ença infecciosa é aquela quantidade necessária para prevenir a infecção com o micro-organismo se o indivíduo ainda não é infectado ou é aquela quantidade necessária para prevenir um aumento em células infectadas ou micro-organismos presentes no indivíduo ou aquela quantidade necessária para diminuir a quantidade da infecção que ocorreria de outra maneira na ausência do ácido nucleico imunoestimulador ou agente antiviral quando qualquer um for utilizado sozinho. Combinado com os ensinos fornecidos aqui, escolhendo-se entre os vários compostos ativos e pesando fatores tal como potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, seve- ridade dos efeitos colaterais adversos e modo de administração preferido, um regime de tratamento profiláctico ou terapêutico eficaz pode ser planeja- do não causar toxicidade substancial e ainda é completamente eficaz para tratar o indivíduo particular. A quantidade eficaz para qualquer aplicação par- ticular pode variar, dependendo de tais fatores como a doença ou condição a ser tratada, o ácido nucleico imunoestimulador particular ou agente antiviral sendo administrado (por exemplo, o tipo de ácido nucleico, isto é um ácido nucleico de CpG, o número de motivos imunoestimuladores ou seu local no ácido nucleico, o grau de modificação de cadeia principal ao oligonucleotí- deo o tipo de medicamento), o tamanho do indivíduo, ou a severidade da doença ou condição. Um versado na técnica pode empiricamente determinar a quantidade eficaz de um ácido nucleico imunoestimulador particular e/ou agente antiviral e/ou outro agente terapêutico sem necessitar experimenta- ção indevida. Em algumas modalidades da invenção, o Iigante de TLR e o a- gente antiviral são administrados em uma quantidade sinergística eficaz para tratar ou previnir doença infecciosa. Uma quantidade sinergística é aquela quantidade que produz uma resposta fisiológica que maior do que a soma dos efeitos individuais do ácido nucleico imunoestimulador ou do agente an- tiviral apenas. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, o efeito fisiológico é uma redução no número de células infectadas com o vírus. Uma quantidade sinergística é aquela quantidade que produz uma redução em células infectadas que é maior do que a soma das células infectadas reduzi- da pelo ácido nucleico imunoestimulador ou pelo agente antiviral apenas. Em outras modalidades, o resultado fisiológico é uma redução no número de micro-organismos no corpo. A quantidade sinergística neste caso é aquela quantidade que produz a redução que é maior do que a soma da redução produzida pelo ácido nucleico imunoestimulador ou pelo agente antiviral a- penas. Em outras modalidades o resultado fisiológico é uma diminuição em parâmetros fisiológicos associados com a infecção, por exemplo, lesões fún- gicas ou outros sintomas. Por exemplo, um diagnóstico de infecção do trato urinário é com base na presença e quantificação de bactérias na urina quan- do maior que 105 colônias por mililitro de micro-organismos são detectados em uma espécime de urina eliminada limpa, de corrente média. Uma redu- ção neste número para 103 e preferivelmente para menos do que 102 colô- nias bacterianas por mililitro indica que a infecção foi erradicada.

Doses de indivíduo dos compostos descritos aqui tipicamente faixa a partir de cerca de 0,1 μg a 10.000 mg, mais tipicamente a partir de cerca de 1 μg/dia a 8000 mg, e mais tipicamente a partir de cerca de 10 μg a 100 μg. Declarado em termos de peso corporal do indivíduo, dosagens típi- cas variam de cerca de 0,1 μς a 20 mg/kg/dia, mais tipicamente a partir de cerca de 1 a 10 mg/kg/dia, e mais tipicamente a partir de cerca de 1 a 5 mg/kg/dia.

Em alguns exemplos, uma dosagem subterapêutica do Iigante de TLR e o agente antiviral são utilizados. Quando as duas classes de fár- maco forem utilizadas juntas, elas podem ser administrados em doses subte- rapêuticas e ainda produziram um resultado terapêutico desejável, uma "do- se subterapêutica" quando aqui utilizada se referem a uma dosagem que é menor do que aquela dosagem que produziria um resultado terapêutico no indivíduo. Desse modo, a dose subterapêutica de um agente antiviral é uma que não produziria o resultado terapêutico desejado no indivíduo na ausên- cia do ácido nucleico imunoestimulador. Doses terapêuticas de agente antivi- ral são bem conhecidas no campo de medicina para o tratamento de doença infecciosa. Estas dosagens foram extensivamente descritas em referências tal como as Reminqton1S Pharmaceuticals Sciences. 18a ed., 1990; bem co- mo muitas outras referências médicas confiadas pela profissão médica como orientação para o tratamento de doença infecciosa. Dosagens terapêuticas de oligonucleotídeos imunoestimuladores foram da mesma forma descritas na técnica e métodos para identificar dosagens terapêuticas em indivíduos são descritos em mais detalhes acima. Em outras modalidades da invenção, o Iigante de TLR e o agen-

te antiviral são administrados em um horário rotineiro. Um "horário rotineiro" quando aqui utilizado, se refere a um período designado pré-determinado de tempo. O horário rotineiro pode abranger períodos de tempo que são idênti- cos ou que diferem em comprimento, contanto que o horário seja pré- determinado. Por exemplo, o horário rotineiro pode envolver administração da composição diariamente, a cada dois dias, a cada três dias, a cada qua- tro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, uma base semanal, uma base mensal ou qualquer número fixo de dias ou semanas entre, a cada dois me- ses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, etc. Alternativa- mente, o horário rotineiro pré-determinado pode envolver administração da composição diariamente durante a primeira semana, seguido por uma base mensal durante vários meses, e em seguida a cada três meses depois disso. Qualquer combinação particular seria abrangida pelo horário rotineiro con- tanto que seja determinado de antemão que o horário apropriado envolva a administração em um certo dia.

Para qualquer composto descrito aqui, a quantidade terapeuti- camente eficaz pode ser inicialmente determinada a partir de modelos ani- mais. Uma dose terapeuticamente eficaz pode da mesma forma ser determi- nada a partir de dados humanos para oligonucleotídeos de CpG que foram testados em humanos (tentativas clínicas humanas foram iniciadas) e para compostos que são conhecidos por exibir atividades farmacológicas simila- res, tais como outros adjuvantes, por exemplo, LT et al. antígenos para pro- pósitos de vacinação. Doses mais altas podem ser requeridas para adminis- tração parenteral. A dose aplicada pode ser ajustada com base na biodispo- nibilidade relativa e potência do composto administrado. Ajustamento da do- se para obter eficácia máxima com base nos métodos descritos acima et al. métodos como são bem conhecidos na técnica está bem incluído nas capa- cidades do técnico normalmente versado.

As formulações da invenção são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis, as quais podem rotineiramente conter con- centrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes de tamponamento, preservativos, veículos compatíveis, adjuvantes, e opcionalmente outros in- gredientes terapêuticos.

Para uso em terapia, uma quantidade eficaz do Iigante de TLR e composição anti viral pode ser administrada a um indivíduo por qualquer modo que libera a composição à superfície desejada, por exemplo, mucosal, sistêmica. Administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser realizada por quaisquer meios conhecidos pelo técnico versado. Rotinas preferidas de administração incluem, porém, não são limitadas a oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inalação, ocular, vaginal, e retal.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados facilmente combinando-se o(s) composto(s) ativo(s) com veículos farmaceu- ticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais portadores permitem os compostos da invenção ser formulados como comprimidos, pílulas, drá- geas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Preparações farmacêuticas pa- ra uso oral podem ser obtidas como excipiente sólido, opcionalmente moen- do uma mistura resultante, θ processando a mistura de grânulos, depois de adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou nú- cleos de drágea. Excipientes adequados são, em particular, cargas tais co- mo açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxi- propilmetil celulose, carboximetilcelulose sódica, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tal co- mo a polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal destes tal como alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais podem da mesma forma ser formuladas em solução salina ou tampões, isto é EDTA para neutralizar condições de ácido internas ou podem ser administradas sem quaisquer veículos.

Da mesma forma especificamente consideradas são formas de dosagem oral do componente ou componentes acima. O componente ou componentes podem ser quimicamente modificados de forma que a libera- ção oral do derivado seja eficaz. Geralmente, a modificação química consi- derada é a ligação de pelo menos uma porção à própria molécula de com- ponente, em que a referida porção permite (a) inibição de proteólise; e (b) captação na corrente sangüínea do estômago ou intestino. Da mesma forma desejado é o aumento na estabilidade total do componente ou componentes e aumento no tempo de circulação no corpo. Exemplos de tais porções in- cluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, car- boximetil celulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e polipro- lina. Abuchowski e Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg e Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, pp. 367 a 383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185- 189. Outros polímeros que poderiam ser utilizados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano. Preferido para uso farmacêutico, como indicado acima, são porções de polietileno glicol.

Para o componente (ou derivado) o iocal de liberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno, ou o íleo), ou o intestino grosso. Alguém versado na técnica tem formulações disponíveis que não dissolverão no estômago, contudo libertará o material no duodeno ou em outro lugar no intestino. Preferivelmente, a liberação evitará os efeitos dano- sos do ambiente do estômago, por proteção do oligonucleotídeo (ou deriva- do) ou por liberação do material biologicamente ativo além do ambiente do estômago, tal como no intestino.

Para garantir resistência gástrica total um revestimento imper- meável em pelo menos pH 5.0 é essencial. Exemplos dos ingredientes iner- tes mais comuns que são utilizados como revestimentos entéricos são trime- Iitato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit L, Eudragit S, e Shellac. Estes revestimentos podem ser utilizados como pelí- culas misturadas.

Um revestimento ou mistura de revestimentos pode da mesma forma ser utilizado em comprimidos que não são destinados para proteção contra o estômago. Isto pode incluir revestimentos de açúcar, ou revestimen- tos que tornam o comprimido mais fácil de engolir. Cápsulas podem consistir em uma casca dura (tal como gelatina) para liberação de terapêutico seco, isto é pó; para formas líquidas, uma casca de gelatina macia pode ser utili- zada. O material de casca de selos poderia ser amido fino ou outro papel comestível. Para pílulas, pastilhas, comprimidos moldados ou comprimidos triturados, técnicas de aglomeração úmidas podem ser utilizadas.

O terapêutico pode ser incluído na formulação como múltiplos particulados finos na forma de grânulos ou péletes de tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para administração de cápsula pode da mesma forma ser como um pó, tampões facilmente comprimidos ou ainda como comprimidos. O terapêutico pode ser preparado por compres- são.

Corantes e agentes flavorizantes podem todos ser incluídos. Por exemplo, o oligonucleotídeo (ou derivado) pode ser formulado (tal como por Iipossoma ou encapsulação de microsfera) e em seguida também contido dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada contendo corantes e agentes flavorizantes.

Alguém pode diluir ou aumentar o volume do terapêutico com um material inerte. Estes diluentes podem incluir carboidratos, especialmen- te manitol, a-lactose, Iactose anidrosa, celulose, sacarose, dextranas modifi- cadas e amido. Certos sais inorgânicos podem ser da mesma forma ser utili- zados como cargas incluindo trifosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell. Desintegrantes podem ser incluídos na formulação do terapêuti-

co em uma forma de dosagem sólida. Materiais utilizados como desintegran- tes incluem porém não são limitados a amido, incluindo o desintegrante co- mercial com base em amido, Explotab. Glicolato de amido de sódio, Amberli- te, carboximetilcellulose sódica, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca laranja, carboximetil celulose de ácido, esponja natural e bentonita podem todos ser utilizados. Outra forma dos desintegrantes é as resinas de troca catiônica insolúveis. Gomas pulverizadas podem ser utilizadas como desintegrantes e como aglutinantes e estes podem incluir gomas pulveriza- das tal como ágar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínico e seu sal de sódio são da mesma forma úteis como desintegrantes.

Aglutinantes podem ser utilizados para segurar o agente tera- pêutico para formar um comprimido duro e incluir materiais a partir de produ- tos naturais tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC), etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC). Polivinil pirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetil celulose (HPMC) pode igualmente ser utilizados em soluções alcoólicas para granular o terapêutico.

Um agente antifriccional pode ser incluído na formulação do te- rapêutico para prevenir a aderência durante o processo de formulação. Lu- brificantes podem ser utilizados como uma camada entre o terapêutico e a parede matriz, e estes podem incluir porém não são limitados a; ácido esteá- rico incluindo seus sais de magnésio e cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos vegetais e ceras. Lubrificantes solúveis podem da mesma forma ser utilizados tal como Iauril sulfato de sódio, Iauril sulfato de magnésio, polietileno glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.

Deslizantes que podem melhorar as propriedades de fluxo do fármaco durante formulação e ajudar a redisposição durante a compressão podem ser adicionados. Os deslizantes podem incluir amido, talco, sílica pi- rogênica e silicoaluminato hidratado.

Para ajudar dissolução do terapêutico no ambiente aquoso um tensoativo poderia ser adicionado como um agente umectante. Tensoativos podem incluir detergentes aniônicos tal como Iauril sulfato de sódio, dioctil sulfossucinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos poderiam ser utilizados e poderiam incluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetômio. A lista de detergentes não-iônicos potenciais que poderiam ser incluídos na formulação como tensoativos são Iauromacrogol 400, estea- rato polioxil 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, mo- noestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Estes tensoativos podem estar presentes na formulação do oligonucleotídeo ou derivado sozinho ou como uma mistura em relações diferentes. Preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente

incluem cápsulas de liberação controlada feitas a partir de gelatina, bem co- mo cápsulas macias, seladas feitas a partir de gelatina e um plasticizador, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de liberação controlada podem conter os ingredientes ativos em mistura com carga tal como lactose, aglutinantes tal como amidos, e/ou lubrificantes tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tal como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabili- zadores podem ser adicionados. Microsferas formuladas para administração oral podem da mesma forma ser utilizadas. Tais microsferas foram bem de- finidas na técnica. Todas as formulações para administração oral deveriam estar em dosagens adequadas para tal administração. Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de maneira convencional.

Para administração por inalação, os compostos para uso de a- cordo com a presente invenção podem ser convenientemente liberados na forma de uma apresentação de spray em aerossol a partir de pacotes pres- surizados ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressu- rizado a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo-se uma vál- vula para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por e- xemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formula- dos contendo uma mistura em pó do composto e um base em pó adequada tal como Iactose ou amido.

Da mesma forma considerado aqui é a liberação pulmonar dos oligonucleotídeos (ou derivados destes). O oligonucleotídeo (ou derivado) é liberado aos pulmões de um mamífero enquanto inalando e atravessando através de revestimentos epiteliais pulmonares à corrente sangüínea. Outros relatórios de moléculas inaladas incluem Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565 569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceu- tics, 63:135 144 (acetato de leuprolida); Braquet et al., 1989, Journal of Car- diovascular Pharmacology, 13(suppl., 5): 143-146 (endothelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internai Medicine, Vol. , IN, pp. 206 212 (a1-antitripsina); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a1-proteinase); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respi- ratory Drug Delivery II, Keystone1 Colorado, March, (hormônio de crescimen- to humano recombinante); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482 3488 (in- terferon-g e fator alfa de necrose de tumor) e Platz et al., Patente norte- americana N0 5.284.656 (fator estimulante de colônia de granulócito). Um método e composição para liberação pulmonar de fármacos para efeito sis- têmico é descrito na Patente norte-americana N0 5.451.569, emitida em 19 de setembro de 1995 por Wong et al.,

Considerado para uso na prática desta invenção é uma ampla faixa de dispositivos mecânicos designados para liberação pulmonar de pro- dutos terapêuticos, incluindo porém não-limitados a nebulizadores, inalado- res com dosímetro, e inaladores de pó, todos dos quais são familiarizados por aqueles versados na técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis adequados para a prática desta invenção são o nebulizador Ul- travent, fabricado por Mallinckrodt1 Inc., St. Louis, Missouri; o nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medicai Products, Englewood1 Colorado; o inalador com dosímetro Ventolin1 fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park1 North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford1 Massachusetts.

Todos os tais dispositivos requerem o uso de formulações ade- quadas para a distribuição de oligonucleotídeo (ou derivado). Tipicamente, cada formulação é específica ao tipo de dispositivo empregado e pode en- volver o uso de um material propelente apropriado, além dos diluente habi- tuais, adjuvantes e/ou veículos úteis na terapia. Da mesma forma, o uso de lipossomas, microcápsulas ou microsferas, complexos de inclusão, ou outros tipos de veículos são considerados. Oligonucleotídeo quimicamente modifi- cados pode da mesma forma ser preparados em formulações diferentes de- pendendo do tipo de modificação química ou do tipo de dispositivo empre- gado.

Formulações adequadas para uso com um nebulizador, jato ou ultrassônico, tipicamente compreenderá oligonucleotídeo (ou derivado) dis- solvido em água em uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de oligonu- cleotídeo biologicamente ativo por mL de solução. A formulação pode da mesma forma incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo, para estabilização de oligonucleotídeo e regulação da pressão osmótica). A for- mulação de nebulizador pode da mesma forma conter um tensoativo, para reduzir ou prevenir agregação induzida por superfície do oligonucleotídeo causada por atomização da solução formando-se o aerossol.

Formulações para uso com um dispositivo de inalador com do- símetro geralmente compreenderão um pó finamente dividido contendo o oligonucleotídeo (ou derivado) suspenso em um propelente com a ajuda de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional em- pregado para este propósito, tal como um clorofluorocarbono, um hidrocloro- fluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarboneto, incluindo triclo- rofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, e 1,1,1,2- tetrafluoroetano, ou combinações destes. Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano e Iecitina de soja. Ácido oleico pode da mesma forma ser útil como um tensoativo.

Formulações para distribuição de um dispositivo inalador de pó compreenderão um pó seco finamente dividido contendo oligonucleotídeo (ou derivado) e pode da mesma forma incluir um agente de volume, tal como lactose, sorbitol, sacarose, ou manitol em quantidades que facilitam a dis- persão do pó a partir do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da for- mulação. O oligonucleotídeo (ou derivado) deveria mais vantajosamente ser preparado na forma particulada com um tamanho de partícula médio menor do que 10 mm (ou mícrons), preferivelmente 0,5 a 5 mm, para mais eficaz- mente liberar ao pulmão distai.

Liberação nasal de uma composição farmacêutica da presente invenção é da mesma forma considerada. Liberação nasal permite a passa- gem de uma composição farmacêutica da presente invenção à corrente san- güínea diretamente depois de administrar o produto terapêutico ao nariz, sem a necessidade de deposição do produto no pulmão. Formulações para liberação nasal incluem aquelas com dextrana ou ciclodextrana.

Para administração nasal, um dispositivo útil é um frasco peque- no, duro ao qual um pulverizador com dosímetro é ligado. Em uma modali- dade, o dosímetro é liberado extraindo-se a composição farmacêutica da solução da presente invenção em uma câmara de volume definido, cuja câ- mara tem uma abertura dimensionada para aerossolizar e a formulação de aerossol formando-se um spray quando um líquido na câmara é comprimido. A câmara é comprimida para administrar a composição farmacêutica da pre- sente invenção. Em uma modalidade específica, a câmara é uma disposição de pistão. Tais dispositivos são comercialmente disponíveis. Alternativamente, um frasco de pressão de plástico com um ori- fício ou abertura dimensionada para aerossolizar uma formulação de aeros- sol formando-se um spray quando aperto é utilizado. A abertura é normal- mente encontrada no topo do frasco, e o topo é geralmente diminuído para parcialmente ajustar-se nas passagens nasais para administração eficiente da formulação de aerossol. Preferivelmente1 o inalador nasal fornecerá uma quantidade medida da formulação de aerossol, para administração de uma dose medida do fármaco.

Os compostos, quando for desejável liberá-los sistemicamente, podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exem- plo, por injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção po- dem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em am- polas ou em recipientes de múltiplas doses, com um preservativo adiciona- do. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes for- muladores tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

Formulações farmacêuticas para administração parenteral inclu- em soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água. Adi- cionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos tal como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou Iiposso- mas. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que au- mentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetil celulose sódica, sorbitol, ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão pode da mesma forma conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concen- tradas.

Alternativamente, os compostos ativos podem ser em forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, depois de usado.

Os compostos podem da mesma forma ser formulados em com- posições retais ou vaginais tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais tal como mantei- ga de cacau ou outros glicerídeos.

Além das formulações previamente descritas, os compostos po- dem da mesma forma ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de ação longa podem ser formuladas com materiais poli- méricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados modera- damente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

As composições farmacêuticas podem da mesma forma com- preender excipientes ou veículos de fase de gel ou sólida adequados. Exem- plos de tais veículos ou excipientes incluem, porém, não são limitados a car- bonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina, e polímeros tais como polietileno glicóis.

Formas de preparação farmacêutica sólidas ou líquidas adequa- das são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microen- capsuladas, encochleated, revestidas em partículas de ouro microscópicas, contidas em lipossomas, nebulizadas, aerossóis, péletes para implantação na pele, ou secadas em um objeto afiado a ser arranhado na pele. As com- posições farmacêuticas da mesma forma incluem grânulos, pós, comprimi- dos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emul- sões, suspensões, cremes, gotas ou preparações com liberação demorada de compostos ativos, em cuja preparação excipientes e aditivos e/ou auxiliares tais como desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes de dilatação, lubrificantes, flavorizantes, adoçantes ou solubilizantes são habitu- almente utilizados como descrito acima. As composições farmacêuticas são adequadas para uso em uma variedade de sistemas de liberação de fármaco. Para uma breve revisão de métodos para liberação de fármaco, vide Langer, Science 249:1527-1533, 1990, que está aqui incorporado por referência.

As composições podem ser administradas de per se (líquido) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando utilizados em me- dicamentos, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, porém sais não farmaceuticamente aceitáveis podem convenientemente ser utilizados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Tais sais incluem, porém não são limitado àqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, salicílico, p-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metano sulfônico, fórmico, malônico, sucínico, naftaleno-2-sulfônico, e benzeno sulfônico. Da mesma forma, tais sais podem ser preparados como sais alcalinos terrosos ou de metal de ál- cali, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico.

Agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1 a 2% em p/v); ácido cítrico e um sal (1 a 3% em p/v); ácido bórico e um sal (0,5 a 2,5% em p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8 a 2% em p/v). Preservativos adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003 a 0,03% em p/v); clorobutanol (0,3 a 0,9% em p/v); parabenos (0,01 a 0,25% em p/v) e timerosal (0,004 a 0,02% em p/v). As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quanti-

dade eficaz de uma composição opcionalmente incluída em um veículo far- maceuticamente aceitável. O termo veículo farmaceuticamente aceitável significa uma ou mais cargas líquidas ou sólidas compatíveis, diluentes ou substâncias de encapsulação que são adequadas para administração a um ser humano ou outro vertebrado. O termo veículo denota um ingrediente or- gânico ou inorgânico, natural ou sintético, com que o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas da mesma forma são capazes de ser misturados com os com- postos da presente invenção, e entre si, de uma tal maneira que não há inte- ração que prejudicaria substancialmente a eficiência farmacêutica desejada.

Em outros aspectos, a invenção se refere a kits que são úteis no tratamento de doença infecciosa. Um kit da invenção inclui um recipiente que aloja um ácido nucleico imunoestimulador e um recipiente que aloja um agente antiviral e instruções para cronometragem da administração do ácido nucleico imunoestimulador e do agente antiviral. Preferivelmente, o ácido nucleico imunoestimulador é fornecido para administração sistêmica, e as instruções portanto fornecem isto. Em uma modalidade importante, o recipi- ente que aloja o ácido nucleico imunoestimulador é um veículo de liberação prolongada utilizado aqui de acordo com seu significado da técnica arterior de qualquer dispositivo que lentamente libera o ácido nucleico imunoestimulador.

Além do uso dos Iigantes de TLR e agentes antivirais para pre- venir infecção em humanos, as composições são da mesma forma adequa- das para o tratamento de vertebrados não-humanos. Vertebrados não- humanos que existem em alojamentos próximos e que são permitidos mistu- rar-se como no caso de animais de jardim zoológico, fazenda e de pesquisa são da mesma forma abrangidos como objetos para os métodos da inven- ção. Animais de jardim zoológico tais como as espécies de felídeos incluin- do, por exemplo, leões, tigres, leopardos, chitas, e pumas por exemplo; ele- fantes, girafas, ursos, cervos, lobos, iaques, primatas não-humanos, focas, golfinhos e baleias; e animais de pesquisa tais como camundongos, ratos, hamsters e gerbils são todos indivíduos potenciais para os métodos da in- venção.

Pássaros tais como galinhas, frangos, perus, patos, gansos, codorna, e fai- são são alvos principais para muitos tipos de infecções. Pássaros que cho- cam são expostos aos micro-organismos patogênicos logo após o nascimen- to. Embora estes pássaros sejam protegidos inicialmente contra patógenos por anticorpos derivados maternais, esta proteção é apenas temporária, e o próprio sistema imune imaturo do pássaro deve começar a proteger o pássa- ro contra os patógenos. É freqüentemente desejável prevenir infecção em pássaros jovens quando eles forem mais suscetíveis. É da mesma forma desejável prevenir contra a infecção em pássaros mais velhos, especialmen- te quando os pássaros são alojados em alojamentos fechados, levando à expansão rápida da doença. Desse modo, é desejável administrar os oligo- nucleotídeos imunoestimuladores e os agentes antivirais óticos aos pássaros para prevenir doença infecciosa.

Um exemplo de uma infecção comum em frangos é o vírus de anemia infecciosa de frango (CIAV). CIAV foi primeiro isolado no Japão em 1979 durante uma investigação de um intervalo de vacinação da doença de Marek (Yuasa et al„ 1979, Avian Dis. 23:366-385). Desde este tempo, CIAV foi detectado em aves domésticas comerciais em todos os principais países produtores avículas (van Bulow et al., 1991, pp. 690 a 699) em Diseases of Poultry, 9a edição, Iowa State University Press).

A infecção por CIAV resulta em uma doença clínica, caracteriza- da por anemia, hemorragia e imunossupressão, em galinhas suscetíveis jo- vens. Atrofia do timo e da medula óssea e lesões consistentes de galinhas infetadas por CIAV também são características de infecção por CIAV. De- pleção de linfócito no timo, e ocasionalmente na bursa de Fabricius1 resulta em imunossupressão e suscetibilidade aumentada à infecções virais, bacte- rianas ou fúngicas secundárias, que em seguida complicam o curso da do- ença. A imunossupressão pode causar doença agravada depois da infecção com um ou mais do vírus de doença de Marek (MDV), vírus da doença bur- sal infecciosa, vírus da reticuloendoteliose, adenovírus ou reovírus. Foi rela- tado que patogênese de MDV é realçado por CIAV (DeBoer et al., 1989, p. 28 In Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz). Além disso, foi relatado que CIAV agrava os sinais de doença bursal infecciosa (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707 a 713). As galinhas desenvolvem uma resistência com a idade à doença experimentalmente in- duzida devido a CAA. Isto é essencialmente completo pela idade de 2 se- manas, porém pássaros mais velhos ainda estão suscetíveis à infecção (Yu- asa, N. et al., 1979 supra; Yuasa1 N. et al., Arian Diseases 24, 202 209, 1980). Entretanto, se galinhas são dualmente infetados com CAA e um a- gente imunossupressor (IBDV, MDV etc.), a resistência com a idade contra a doença é retardada (Yuasa, N. et al., 1979 e 1980 supra; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93 116, 1986). As características de CIAV que podem potencializar a transmissão de doença incluem, alta resistência à ina- tivação ambiental e alguns desinfetantes comuns. O impacto econômico de infecção por CIAV na indústria avícula está claro a partir do fato que 10% a 30% de pássaros infetados no afloramento da doença morrem. Gado e animais de fazenda também são suscetíveis à infecção.

Doenças que afetam estes animais podem resultar em perdas econômicas severas, especialmente entre gado. Os métodos da invenção podem ser uti- iizados para proteger contra infecção em animais de fazenda, tais como va- cas, cavalos, porcos, ovelhas e cabras.

Vacas podem ser infetadas através de vírus bovino. O vírus da diarréia viral bovina (BVDV) é um vírus de RNA de filamento positivo revesti- do pequeno e é classificado, junto com o vírus da cólera de porco (HOCV) e vírus da doença da ovelha de fronteira (BDV), no gênero de pestivírus. Em- bora, os Pestivírus tenham sido previamente classificados na família Togavi- ridae, alguns estudos sugestionaram sua reclassificação dentro da família Flaviviridae junto com os grupos flavivírus e vírus da hepatite C (HCV) (Francki, etal., 1991).

BVDV1 que é um importante patógeno de gado pode ser distin- guido, com base na análise de cultura celular, em biotipos citopatogênicos (CP) e não-citopatogênicos (NCP). O biotipo NCP é mais difundido embora ambos os biotipos possam ser encontrados no gado. Se uma vaca grávida é infetada com uma cepa de NCP, a vaca pode dar à luz um bezerro persis- tentemente infetado e especificamente imunotolerante, que propagará o ví- rus durante sua vida. O gado persistentemente infetado pode sucumbir à doença da mucosa, e ambos os biotipos podem ser em seguida isolados do animal. Manifestações clínicas podem incluir aborto, teratogênese, e pro- blemas respiratórios, doença da mucosa e diarréia moderada. Além disso, trombocitopenia severa, associada com epidemias de rebanho, que podem resultar na morte do animal foi descrita, e as cepas associadas com esta doença parecem mais virulentas que os BVDVs clássicos.

Herpesvírus eqüinos (EHV) compreendem um grupo de agentes biológicos antigenicamente distintos que causam uma variedade de infec- ções em cavalos, que variam de doença subclínica à fatal. Estes incluem herpesvírus 1 Eqüino (EHV 1), um patógeno ubíquo em cavalos. EHV-1 está associado a epidemias de aborto, doença do trato respiratório e transtornos do sistema nervoso central. A infecção primária do trato respiratório superior de cavalos jovens resulta em uma doença febril que dura durante 8 a 10 di- as. Éguas imunologicamente experimentadas podem ser reinfectadas pelo trato respiratório sem formação de doença aparente, de forma que aborto normalmente ocorre sem aviso. A síndrome neurológica está associada à doença respiratória ou aborto, e pode afetar animais de qualquer sexo em qualquer idade, levando à incoordenação, fraqueza e paralisia posterior (Tel- ford, E. A. R. et al„ Virology 189, 304 316, 1992). Outros EHVs incluem EHV-2 ou citomegalovírus eqüino, EHV-3, exantema vírus coital eqüino e EHV-4, previamente classificados como EHV-1 subtipo 2.

Ovelhas e cabras podem ser infetadas por uma variedade de micro-organismos perigosos, incluindo visna-maedi.

Primatas tais como macacos, bugios e símios podem ser infeta- dos por vírus da imunodeficiência símio. Vacinas contra imunodeficiência símia total livre de célula e de vírus de célula inativada foram relatadas pro- porcionar proteção em símios (Stott et al., (1990) Lancet 36:1538 1541; Des- rosiers et al„ PNAS USA (1989) 86:6353 6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246:1293 a 1297; e Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retrovi- ruses 6:1239 a 1246). Uma vacina de HIV gp120 recombinante foi relatada proporcionar proteção em chimpanzés (Berman et al., (1990) Nature 345:622 625).

Gatos, ambos domésticos e selvagens, são suscetíveis à infec- ção com uma variedade de micro-organismos. Por exemplo, peritonite infec- ciosa felina é uma doença que ocorre tanto em gatos domésticos quanto selvagens, tais como leões, leopardos, chitas, e jaguares. Quando for dese- jável impedir a infecção com estes et al. tipos de organismos patogênicos em gatos, os métodos da invenção podem ser utilizados para prevenir ou tratar infecção em gatos.

Gatos domésticos podem ser infectados com vários retrovírus, incluindo porém não-limitados ao vírus da leucemia felina (FeLV), vírus de sarcoma felino (FeSV), oncornavírus tipo C endógeno (RD 114), e vírus for- mador de sincício felino (FeSFV). Destes, FeLV é o patógeno mais signifi- cante, causando sintomas diversos, incluindo neoplasmas Iinforreticulares e mielóides, anemias, distúrbios mediados imunes, e uma síndrome da imuno- deficiência que é similar à síndrome da imuno deficiência adquirida humana (AIDS). Recentemente, um mutante de FeLV defeituoso de replicação parti- cular, designado FeLV-AIDS1 foi mais particularmente associado a proprie- dades imunossupressoras.

A descoberta de lentivírus linfotrópico T de felino (da mesma forma referido como imunodeficiência felina) foi relatada em Pedersen et al. (1987) Science 235:790-793. Características de FIV foram relatadas em Yamamoto et al., (1988) Leukemia1 Dezembro Suplemento 2:204S a 215S; Yamamoto et al., (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; e Ackley et al., (1990) J. Virol. 64:5652 a 5655. A clonagem e análise de seqüência de FIV foram relatadas em Olmsted et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2448 2452 e 86:4355 a 4360.

Peritonite infecciosa felina (FIP) é uma doença esporádica que ocorre não previsivelmente em Felidae doméstico e selvagem. Embora FIP seja principalmente uma doença de gatos domésticos, foi diagnosticada em leões, leões monteses, leopardos, chitas, e o jaguar. Gatos selvagens meno- res que foram afligidos com FIP incluem o Iince e caracal, gato de areia, e gato de palas. Em gatos domésticos, a doença ocorre predominantemente em animais jovens, gatos de todas as idades sejam suscetíveis. Uma inci- dência de pico ocorre entre 6 e 12 meses de idade. Um declínio na incidên- cia é notado a partir de 5 a 13 anos de idade, seguido por uma incidência aumentada em gatos com 14 a 15 anos de idade.

A invenção também abrange um método de avaliação quanto as moléculas que contêm um agente antiviral e um oligonucleotídeo imunoesti- mulador para atividade imunoestimuladora e, simultaneamente, quanto a atividade antiviral. Isto pode ser alcançado utilizando células imunes isoladas de pacientes infectados por vírus, por exemplo, medindo-se a produção de citocina e título de vírus, ou uma combinação de um sistema de teste antivi- ral in vitro, por exemplo, o réplicon de HCV e um sistema de teste imunoes- timulador in vivo, por exemplo, uma linhagem celular que transporta a série de reação de TLR9/IFN-alfa, ou um sistema de teste viral in vitro que imita uma infecção virótica (por exemplo, PBMC infectada por vírus da diarréia viral bovina para HCV). Além disso, visto que muitas viroses alvejam com seus efeitos antivirais de proteínas, tal como sinalização mediada por TLR, sistemas de célula que contêm naturalmente ou transfectados a série de re- ação de sinalização de TLR de interesse e o agente antiviral podem ser utili- zados para avaliar o efeito combinado de um oligonucleotídeo imunoestimu- Iador e um antiviral.

Os métodos de avaliação da invenção são úteis para identifica-

ção de composições antivirais eficazes de oligonucleotídeos imunoestimula- dores e terapia antiviral. Um método de avaliação emprega o isolamento de células imunes de pacientes infectados por vírus seguido por tratamento das células com as composições da invenção. A eficácia das composições pode ser avaliada medindo-se a produção de citocina e título de vírus. Tais medi- das podem ser feitas utilizando sistema de teste antiviral, por exemplo, o ré- plicon de HCV (referência necessária) e um sistema teste imunoestimulador in vivo, por exemplo, uma linhagem celular que transporta a série de reação de TLR9/IFN-alfa. Outro sistema de teste viral in vitro que pode ser utilizado é aquele que imita uma infecção viral, tal como PBMC infetadas com vírus de diarréia viral bovino como um modelo para HCV. Além disso, visto que muitos vírus alvejam os processos antivirais no corpo, tal como sinalização mediada por TLR, sistemas de célula contendo naturalmente ou transfecta- dos com a série de reação de sinalização de TLR de interesse e a composi- ção antiviral podem ser utilizados para avaliar o efeito combinado de um oli- gonucleotídeo imunoestimulador e um antiviral. Por exemplo, em uma tal combinação o agente antiviral é a NS3/4 protease, e o oligonucleotídeo imu- noestimulador é um oligonucleotídeo de CpG.

Exemplos

Métodos

Oligonucleotídeos e reagentes Todos ODN e ORN foram adqui- ridos de Biospring (Frankfurt, Alemanha) ou fornecidos por Coley Pharma- ceutical GmbH (Langenfeld, Alemanha), controlados quanto a identidade e pureza por Coley Pharmaceutical GmbH e tiveram níveis de endotoxina não- detectáveis (< 0,1EU/ml) medidos pelo ensaio de Limulus (BioWhittaker, Verviers, Bélgica). ODN foram suspensos em Tris-EDTA livre de endotoxina, estéril (Sigma, Deisenhofen, Alemanha), ORN foram suspensos em dH20 livre de DNAse e RNAse1 estéril (Life Technologies, Eggenstein, Alemanha) e armazenados e controlados sob condições assépticas para prevenir tanto a contaminação microbiana e quanto por endotoxina. Todas as diluições fo- ram realizadas utilizando Tris-EDTA livre de endotoxina ou dH20 livre de RNAse e DNAse. Nucleosídeos que incluem 8-Oxo-rG e cloroquina foram obtidos de Sigma ou ChemGenes (Wilmington, MA1 USA), e foram dissolvi- dos em DMSO1 NaOH ou H2O.

Purificação de célula Preparações de camada leucocitária de sangue periférico de doadores humanos saudáveis foram obtidas a partir do Blood Bank of the University of Dusseldorf (Alemanha) e PBMC foram purifi- cadas por centrifugação em Ficoll-Hypaque (Sigma). As células foram culti- vadas em uma incubadora umedecida a 37°C em meio RPMI 1640 suple- mentado com 5% (v/v) de soro AB humano inativado por calor (BioWhittaker) ou 10% (v/v) de FCS inativado por de calor, 2mM de L-glutamina, 100U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina (todos de Sigma).

Detecção de citocina PBMC foram ressuspensas em uma con- centração de 5x106 de células/ml e adicionadas às placas de base arredon- dada de 96 cavidades (250pl/cavidade). PBMC foram incubadas com vários ODN1 ORN ou concentrações de nucleosídeo e sobrenadantes de cultura (SN) foram coletados depois dos pontos de tempo indicados. Se não utiliza- dos imediatamente, SN foram armazenados a -20°C até que requeridos. Pa- ra experiências inibidoras, células foram estimuladas com a concentração de Iigante de TLR indicada e nucleosídeo ou ORN adicionado. Em algumas ex- periências, o segundo ORN modificado foi adicionado 1h depois do começo da cultura celular.

Quantidades de citocinas no SN foram avaliadas utilizando um Kit de ELISA comercialmente disponível para IL-12p40 (a partir de BD Bio- sciences, Heidelberg, Alemanha), IFN-γ e TNF-α (de Diaclone, Besançon, France) ou um ELISA in-house para IFN-α desenvolvida utilizando anticor- pos comercialmente disponíveis (PBL, New Brunswick, NJ, USA). Para aná- lise de um amplo conjunto de citocinas e quimiocinas, análise de multiplex com um sistema Iuminex de Bio-Rad (Munich, Alemanha) e kits Multiplex de Biosource (Solingen, Alemanha) foi realizado.

Exemplos

Exemplo 1 Efeito sinerqístico de ligar uma auanosina 8-modificada para um ácido nucleico estimulador imune foi observado

PBMC humano (n=3) foi estimulado com ORN modificado por 8- Oxo-rG (uma guanosina C-8 substituída) (SEQ ID N0:1-4) e um ORN inalte- rado (SEQ ID N0:8). Sobrenadantes foram coletados e IFN-alfa de citocinas (Figura 1a), IL-12p40 (Figura 1b) e TNF-alfa (Figura 1c) foram medidos. Os dados demonstram que a adição de 8-Oxo-rG na seqüência realça a ativida- de de indução de IFN-alfa e IL-12 quando comparada ao SEQ ID N0:10 de ORN inalterado.

Exemplo 2 A posição de G 8-modificado na seqüência de RNA pode realçar a atividade

PBMC humano (n=3) foi estimulado com o ORN indicado com um único 8-Oxo-rG em posições diferentes do ORN (SEQ ID ΝΟ.Ί-4) e o controle negativo modificado por 8-Bromo-dA (SEQ ID NO:8). Os sobrena- dantes foram coletados e IFN-alfa medida. Os dados mostram que a inclu- são de um 8-Oxo-rG na posição 5' (SEQ ID N0:1 e 3), porém não nas posi- ções 3' adicionais (SEQ ID N0:2 e 4), resulta na indução de citocina aumen- tada (Figura 2).

Exemplo 3 Desóxi- e ribonucleotídeos 8-modificados diferentes na extremi- dade 5' de ORN aumenta a atividade imunoestimuladora

PBMC humana (n=3) foi estimulada com o ORN indicado com um único 8-Oxo-rG/Dg (SEQ ID N0:1, 5), 8-Bromo-dG (SEQ ID N0:7) ou Immunosine (Isatoribina) (SEQ ID N0:6) (com uma ligação 5'-5') na extremi- dade 5' de ORN e IFN-alfa medidos. Os dados mostram que a adição de Gs 8-modificado (desóxi- ou ribonucleotídeos) na posição 5' resultou na indução de citocina aumentada comparada ao ORN inalterado (SEQ ID N0:8 e 11) (Figura 3). Dados similares foram obtidos para 8-Bromo-rG (dados não- mostrados). Além disso, mesmo a ligação de um dA ou rA 8-modificado (da- dos não-mostrados) resulta em um, embora apenas leve, aumento da indu- ção de citocina. Exemplo 4 A combinação de Ribavirina com um ODN de CpG imunoestimu- Iador resulta em uma diminuição da 1L-10 relativo à atividade de indução de IFN-alfa

Na estimulação de PBMC humano com um ODN de CpG (SEQ ID N0:15) e cocultura com doses crescentes de Ribavirina, um efeito su- pressor da Ribavirina na indução de IL10 induzida por CpG pode ser obser- vado. Importantemente, o efeito supressor de Ribavirina não foi observado com respeito a IFN-alfa. As observações foram particularmente notadas em doses perdidas de Ribavirina.

Tabela 1: IC50 calculada na adição de Ribavirina em culturas que contêm IpMde SEQID N0:13

IC50 IFN-alfa IC50 IL-10 IC50 IL-6 Ribavirina ΙΟΟΟμΜ 58μΜ 320μΜ

A observação tem implicações importantes para o uso de Ribavi- rina em indicações terapêuticas. IL-10 é uma citocina regulador que freqüen- temente contraria as intervenções terapêuticas (por exemplo, para Iigantes de TLR, ou terapia de IFN-alfa). A capacidade de suprimir IL10 é útil em combinações de fármaco porque permite IFN e outras citocinas produzirem uma resposta realçada, desse modo aumentando a eficácia da combinação de agentes terapêuticos. Portanto, este efeito de Ribavirina pode resultar em uma alteração do ambiente de citocina no paciente tratado com uma combi- nação do anterior e Ribavirina, resultando em um efeito mais forte, efeito desinibido da citocina ou Iigand de TLR.

Tabela 2: Seqüências de ácido nucleico

Seq ID N0 Seqüência 1 rO*rU*rU*rO*rU*rO*rU 2 rG*rU*rU*rO*rU*rG*rU 3 rO*rU*rU*rG*rU*rG*rU 4 rG*rU*rU*rG*rU*rO*rU 0*rU*rU*rG*rU*rG*rU 6 ilM*rU*rU*rG*rU*rG*rU 7 BG*rU*rU*rG*rU*rG*rU 8 rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU Seq ID N0 Seqüência 9 rG*rC*rC*rA*rC*rC*rG*rA*rG*rC*rC*rG*rA*rA*rG*rG*rC*rA*rC*rC BA*rU*rll*rG*rU*rG*rU 11 rC*rC*rG*rU*rC*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU*rG*rA*rC*rU*rC 12 rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU*rG*rU*rU 13 14 TCCATGACGTTCCTGATGC

Exemplo 5 Efeito de Ribavirina in vitro e in vivo em uma produção de citocina

de célula T mediada por ODN de CpG imunoestimulador

Experiência inicial com 10 mg/kg de ribivirina (RBV) intraperito- neal (IP) não mostrou nenhum efeito in vivo de RBV e possivelmente até mesmo uma diminuição leve na produção induzida por IFN-γ CD3 ex vivo. Entretanto, estimulação anti-CD3 ex vivo na presença de RBV mostrou au- mentar a produção de IFN-γ, porém apenas em concentrações baixas o sufi- ciente de RBV (1-5 μΜ). Repetimos a experiência com uma dose mais baixa de RBV in vivo (0,5 mg/kg IP).

Os ratos foram injetados com SEQ ID NO: 14 (100 microgramas

SC), RBV (0,5 mg/kg IP) ou SEQ ID NO: 14 e RBV. RBV foi administrada in vivo no dia 0 ou dia 5 e CpG foi administrada no dia 0. Amostras foram iso- ladas no dia 6 a partir do Iinfonodo inguinal e mantidas em médio em anti- CD3 revestido semeado na presença de 1 a 16 μΜ de RBV. No dia 8, um ensaio ELISA foi realizado para detectar IFN-gama.

Como esperado, ODN de CpG in vivo aumentou a produção de IFN-γ de célula T ex-vivo (Figura 4B). Um efeito pequeno de RBV sobre a produção de IFN-γ na ausência de ODN de CpG foi observado (Figura 4A). Entretanto, o efeito de RBV sobre a produção de IFN-γ foi grandemente au- mentado quando ODN de CpG também foi injetado.

O efeito ex vivo de RBV sobre a produção de IFN-γ mediada por CD3 independentemente do tratamento com ODN/RBV anterior foi examina- do. Os resultados são mostrados na Figura 5. Similares aos dados descritos acima, baixas concentrações de RBV in vitro aumentou níveis de IFN-γ inde- pendentemente de tratamentos in vivo anteriores (Figura 5A). O efeito de uma combinação com ODN de CpG é mostrado na Figura 5B. Experiências similares foram realizadas utilizando células den- dríticas (DCs) derivadas da medula óssea (BM). DC derivada de BM manti- das em GM-CSF foi tratada com SEQ ID NO: 14, RBV (1μΜ, 5 μΜ, 10μΜ, 100μΜ, ou 120μΜ) ou com SEQ ID NO: 14 e RBV. No 4, amostras com 24 e 72 horas foram testadas quanto a citocina, IL-10 (Figura 6), IL-12p40 (Figura 7A), IL-12p70 (Figura 7B) e TNF (dados não-mostrados). Nenhum efeito de RBV sozinho em 120 μΜ foi observado. SEQ ID NO: 14 induziu IL-12, IL-10 e TNF. RBV diminuiu IL-10 e TNF porém aumentou IL-12 (apenas em 72h). RBV diminuiu IL-10 induzida por SEQ ID NO: 14 como mostrado na Figura 6. RBV diminuiu IL-12p40 induzido por SEQ ID NO: 14 e aumentou IL-12p70 (ligeiramente).

Exemplo 6 Efeito de Ribavirina e ODN de CpG in vivo em um modelo de câncer sobre camundongo

Modelo de camundongo C26 SC foi tratado com SEQ ID NO: 14 e RBV (100 microgramas de ODN intra/peri tumor nos dias 7,14,21 e 0,5 mg/kg de RBV IP nos mesmos dias). O dados são mostrados na Figura 8. A partir do dias 30 a 40, o ODN de CpG sozinho e a terapia combinada produ- ziu sobrevivência prolongada no camundongo. Embora o ODN de CpG mais RBV não tenha alcançado significação estatística por análise das classifica- ções de Iog sobre a terapia de ODN de CpG sozinha, houve uma tendência clara de sobrevivência melhorada, como mostrado na Figura 8. EQUIVALENTES

A especificação escrita antecedente é considerada ser suficiente para permitir alguém versado na técnica praticar a invenção. A presente in- venção não deve ser limitada no escopo por exemplos fornecidos, visto que os exemplos são destinados como uma única ilustração de um aspecto da invenção e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção além daquelas mos- tradas e descritas aqui ficarão evidentes para aqueles versados na técnica da descrição precedente e incluem-se no escopo das reivindicações anexas. As vantagens e objetivos da invenção não são necessariamente abrangidos por cada modalidade da invenção. Listagem de Seqüência

<110> Coley Pharmaceutical Group, Inc. Coley Pharmaceutical GmbH Coley Pharmaceutieal Canada

<120> COMPOSIÇÕES DE LIGANTES DE TLR E ANTIVIRAIS

<13Q> C1037.7Q066WOOQ

<140> Ainda não-determinado <141> 2007-09-27

<150> US 60/847,408 <1S1> 2006-09-27

<16Q> 14

<170> PatentIn version 3.4

<210> l

<2ll> 7

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(!}

<223> em que η é 8-Oxo-rG

<220>

<221> raisc_£eature

<222> (4).. (4)

<223> em que η é 8-Oxo-rG

<220>

<22í> rnisc feature

<222> {6).7(6)

<223> em que η é 8-Oxo-rG

<400> 1 nuununu

<210> 2

<211> 7

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<2 20>

<221> misc_feature

<222> (41..Í4)

<223> em que η é 8-Oxo-rG <400> 2 guunugu

<210> 3 <211> 7 <212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<220>

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<223> Oligonucleotídeo Sintético

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<223> em que η é 8-Oxo-rG

<400> 4 guugunu

<210> 5 <211> 7

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

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<210> 6

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<223> em que η é 5 a 5 iminosina ligada

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<210> 7

<211> 8

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<220>

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<222> (1}..(1)

<223> em que η é 8-Bromo-dG

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<210> e <21 L> 8 <212> RNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Oligonucleotídeo Sintético <400> 8 gauugugu

<210> 9

<211> 20

<212> RMA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<4 00> 9

gccaccgagc cgaaggcacc

<210> 10

<211> ?

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Oligonucleotídeo Sintético

<220>

<221> misc feature

<222> (l).T(l)

<2.23> em que η é 8-Bromo-dA

<400> 10 nuugugu

<210> Il

<211> 18

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<400> 11

ccgucuguua ugugacuc

<210> 12

<2U> 20

<212> RNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<400> 12

uuguuguugu uguuguuguu

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<4Q0> 13

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg

<210> 14

<211> 19

<222> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo Sintético

<4 00> 14

tccatgacgt tcctgatgc

Claims (29)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo imunoestimulador e um agente antiviral, em que o agente antiviral não é uma guanosina substituída por C-8 ou uma imidazoquinolina, e, em que o agente antiviral é ligado ao oligonucleotídeo imunoestimulador.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador: a) é ligado diretamente ao agente antiviral; b) é ligado indiretamente ao agente antiviral; c) compreende uma cadeia principal quimérico; d) é um oligonucleotídeo de RNA; e) é um oligonucleotídeo de DNA.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2 a), caracteriza- da pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador e o agente antiviral fazem parte da mesma molécula.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente antiviral é um ou mais análogos de nucleotídeo.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2 a), caracteriza- da pelo fato de que compreende ainda um sítio suscetível à nuclease entre o oligonucleotídeo imunoestimulador e o agente antiviral.

6. Composição de acordo com a reivindicação 2 a), caracteriza- da pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador contém pelo menos uma ligação 3-3' ou pelo menos uma ligação 5'-5'.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador é SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 12.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador e um agente antiviral, em que o agente antiviral é associado com o oligonucleotídeo de RNA imunoestimula- dor.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador é: a) ligado ao agente antiviral; b) ligado diretamente ao agente antiviral; ou c) ligado indiretamente ao agente antiviral.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10 a), caracteri- zada pelo fato de que o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador e o a- gente antiviral fazem parte da mesma molécula.

12. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador não é ligado ao agente antiviral.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- da pelo fato de que inclui: a) uma micropartícula que aloja o oligonucleotídeo de RNA imu- noestimulador e o agente antiviral; ou b) um Iipossoma que aloja o oligonucleotídeo de RNA imunoes- timulador e o agente antiviral.

14. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador é SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 12.

15. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente antiviral é: a) um ou mais análogos de nucleotídeo; ou b) uma guanosina substituída por C-8.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15 b), caracteri- zada pelo fato de que a guanosina substituída por C-8 é incorporada no oli- gonucleotídeo de RNA.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- da pelo fato de que a guanosina substituída por C-8 é posicionada na extre- midade 5" do oligonucleotídeo de RNA.

18. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- da pelo fato de que a guanosina substituída por C-8 é posicionada um, dois ou três nucleotídeos 3' da extremidade 5' do oligonucleotídeo dc RNA.

19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um Iigante TLR7/8/9 ligado a um agente antiviral.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- da pelo fato de que o Iigante TLR7/8/9 é um oligonucleotídeo imunoestimu- lador.

21. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- da pelo fato de que o Iigante TLR7/8/9 é: a) ligado diretamente ao agente antiviral; ou b) ligado indiretamente ao agente antiviral.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21 a), caracteri- zada pelo fato de que o Iigante TLR7/8/9 e o agente antiviral fazem parte da mesma molécula.

23. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracteri- zada pelo fato de que o agente antiviral é um ou mais análogos de nucleo- tídeo.

24. Composição de acordo com a reivindicação 21 a), caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda um sítio suscetível à nuclease en- tre o Iigante TLR7/8/9 e o agente antiviral.

25. Uso de uma quantidade eficaz de uma composição, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição para tratar uma infecção bacteriana em um indivíduo com necessidade do mesmo.

26. Uso de uma quantidade eficaz de uma composição, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição para tratar uma doença viral em um indivíduo com ne- cessidade do mesmo.

27. Uso de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o agente antiviral é ligado ao oligonucleotídeo imunoestimu- lador.

28. Uso de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo imunoestimulador é: a) é um oligonucleotídeo de RNA; b) é um oligonucleotídeo de DNA.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28 a), caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo de RNA imunoestimulador é SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 12.