ES2486298T3 - Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados - Google Patents

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Abstract

Un oligonucleótido inmunomodulador de 8-200 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un motivo GNCC inmunomodulador, en el que N es T, A, o un U sustituido en 5, y en el que al menos un G comprende una modificación 2'desoxi-2'-fluoro--D-arabino (FANA) y en el que la C del dinucleótido CG no está metilado

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
5 La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología. Más específicamente la invención se refiere a los oligonucleótidos terapéuticos con aumento de la capacidad inmunoestimuladora.
2. Explicación de los antecedentes de la técnica
El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimuladores para activar las células B y las células citolíticas naturales, pero el ADN de vertebrados no ((Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 10 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J. P., et al., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, En: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein y A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley y Sons, Inc., New York, NY, pp. 431448). Ahora se entiende que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son el resultado de la presencia de dinucleótidos CpG no metilados en contextos de bases particulares (motivos CpG), que son comunes en el ADN bacteriano, pero están metilados y subrepresentados en el ADN de vertebrados (Krieg et al, 1995 Nature 374:54615 549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden ser imitados con oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) que contienen estos motivos CpG. Tal CpG ODN tiene efectos altamente estimulantes sobre los leucocitos humanos y murinos, lo que induce la proliferación de células B; secreción de citoquinas e inmunoglobulinas; actividad lítica de las células citolíticas naturales (NK) y la secreción de IFN-γ; y la activación de las células dendríticas (DC) y otros células presentadoras de antígenos para expresar
20 moléculas coestimuladoras y secretar citoquinas, especialmente de las citoquinas tipo Th1 que son importantes en la promoción del desarrollo de las respuestas de las células T tipo Th1. Estos efectos inmunoestimuladores del esqueleto de fosfodiéster nativo ODN CpG son altamente específicos de CpG ya que los efectos se reducen drásticamente si el motivo CpG está metilado, cambiado a un GpC, o de otra manera eliminado o alterado (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10).
25 En estudios preliminares, se consideró que el motivo CpG inmunoestimulatorio seguido de la fórmula purina-purinaCpGpirimidina-pirimidina (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Sin embargo, actualmente es claro que los linfocitos de ratón responden relativamente bien a los motivos CpG fosfodiéster que no siguen esta "fórmula" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) y lo mismo es válido de las células B humanas y células
30 dendríticas (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Los oligonucleótidos de ADN y ARN se someten a la digestión mediante exonucleasas y endonucleasas, que degradan los enlaces fosfato internucleotídicos en los extremos de moléculas de ácido nucleico y en sitios internos, respectivamente. La tasa de degradación puede variar de acuerdo con la localización del ácido nucleico, por ejemplo, fuera de la célula (rápida) frente al interior de la célula (generalmente más lento), así como en el último
35 caso, el compartimiento intracelular que contiene el ácido nucleico, por ejemplo, dentro del lisosoma (rápido) versus en el citoplasma (más lento). Por lo tanto, el aumento de la estabilidad de un oligonucleótido frente a las nucleasas tiene el potencial de mejorar su eficacia por la prolongación de su vida funcional en la célula.
Se han informado numerosos abordajes para generar formas estabilizadas de ARN y ADN. Ver, por ejemplo, Uhlmann E et al. (1990) Chem. Rev 90:543-84. Desafortunadamente, muchos de estos abordajes no han producido
40 alternativas satisfactorias, ya sea debido a la estabilidad obtenida es insuficiente o porque el aumento de la estabilidad se asocia con la pérdida de la función.
El documento WO 2007/048244 A2 divulga un ARN interferente pequeño (siRNA) para modular la expresión de un gen blanco de una manera específica de secuencia que comprende un dúplex de cadena doble en el que al menos un nucleótido de ácido ribonucleico de la ARNsi está sustituido con 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótido (FANA).
45 El documento WO 2007/038869 A1 divulga ligandos de ácido nucleico (o aptámeros) capaces de formar una tétrada G y que comprende al menos un nucleótido modificado de arabinosa. Con preferencia, el nucleótido modificado de arabinosa es 2'-desoxi-2'-fluoroarabinonucleótidos (FANA).
Kalota A. et al. (2006, Nucleic Acid Research, 34, 2: 451-461) demostraron que las quimeras de ADN de ácido 2’desoxi-2’-fluoro-o-D-arabinonucleico plenamente fosforotioado son moléculas de silenciamiento de genes eficiente y
50 sugieren que podrían tener un potencial terapéutico significativo.
Peng C. G. y col. (2007, Nucleic Acid Research, 35, 15: 4.977-4.988) informan que la incorporación de 2'-desoxi-2'fluoroarabinoguanina (2'F-Arag) o residuos T en un cuádruples G de ADN de unión a trombina estabiliza el complejo (LTm hasta ~ 3 ° C/modificación 2'F-Aran); las unidades 2'F-araN también aumentan la vida media en el 10% de suero bovino fetal, hasta 48 veces.
imagen2
El documento WO 01/62207 A2 divulga un procedimiento para mejorar la inflamación gastrointestinal, en particular inflamación gastrointestinal crónica, tales como enfermedad inflamatoria intestinal en un sujeto. En una forma de realización, el procedimiento comprende la administración de un ácido nucleico inmunomodulador a un sujeto que padece o es susceptible a la inflamación gastrointestinal.
5 Ferrari N. y col. (2006, Ann NY Acad Sci 1082: 91-102) informan que se hallaron dos configuraciones diferentes de quimeras FANA/ADN (altímeros y gápmeros) para tener actividad antisentido potente. Estos resultados indican que los oligonucleótidos antisentido FANA/ADN quiméricos son nuevas herramientas prometesoras para el silenciamiento génico terapéutico cuando se requiere una mayor potencia y duración de acción.
Resumen de la invención
10 La presente invención proporciona oligonucleótidos modificados químicamente caracterizadas por su mejora de la estabilidad a las nucleasas y ácido en comparación con las correspondientes moléculas de ADN naturales. La invención se refiere en general a los oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen motivos inmunomoduladores que incluyen al menos un nucleósido de purina modificado FANA. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención son útiles en cualquier entorno o aplicación solicita la composición o
15 procedimiento para modular una respuesta inmunitaria. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención son de uso particular en la preparación de composiciones farmacéuticas, que incluyen adyuvantes, vacunas, y otros medicamentos para usar en el tratamiento de una variedad de afecciones, que incluyen infección, cáncer, alergia, enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios, y asma.
Un aspecto de la presente descripción es un oligonucleótido inmunomodulador de 8-200 nucleótidos de longitud, que
20 comprende al menos un motivo ZNYZ inmunomodulador, donde Z es un nucleósido de purina o un nucleósido de purina modificado con 2’-desoxi-2’-fluoro-ß-Darabinosa (FANA), N es T, A, o un U sustituido en 5, Y es un nucleósido de pirimidina, y donde al menos un Z comprende un nucleósido de purina modificado con FANA. En una forma de realización de la descripción el motivo inmunomodulador es ZNYZ N1 N2N3N4. En otra forma de realización de la descripción el motivo inmunomodulador es un motivo ZNYG, donde YG es un dinucleótido pirimidina-guanina
25 interno. De acuerdo con la presente invención Z es G y al menos un G comprende una modificación FANA. En una forma de realización, N es T. En otra forma de realización, N es 5-cloro-uracilo, 5-yodo-uracilo, 5-etiluracilo, 5-propiluracilo, 5-propinil-uracilo, o (E)-5-(2-bromovinil)-uracilo. En una forma de realización el oligonucleótido incluye al menos 4 nucleótidos 5’ al motivo inmunomodulador. En otra forma de realización al menos un nucleótido fuera del motivo inmunomodulador tiene una modificación FANA. En una forma de realización, el oligonucleótido no es un
30 oligonucleótido antisentido. En otra forma de realización, el oligonucleótido comprende una pluralidad de dinucleótidos YZ internos. En aún otra forma de realización, el Z de cada dinucleótido YZ interno comprende una modificación FANA. En algunas formas de realización de la descripción, Z es guanosina, 2’-desoxiguanosina, 2’desoxi-7-deazaguanosina, 2’-desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, 2’-desoxiinosina, 2’-desoxi arabinoguanosina sustituida 2’, arabinoguanosina sustituida 2’-O u otro nucleósido de purina no natural. De acuerdo
35 con la presente invención Z es G. De acuerdo con la presente invención la Y es C y Z es G, y donde la C del dinucleótido CG está no metilado. En otra forma de realización de la descripción, Y es citosina, 2’-desoxicitosina, 2’desoxitimidina, arabinocitidina, 1-(2’-desoxi-B-D-ribofuranosil)-2-oxo-7-deaza-8-metil purina, arabinocitidina sustituida con 2’-desoxi-2’, arabinocitidina sustituida con 2’-O, 2’-desoxi-5-hidroxicitidina, 2’-desoxi-N4-alquil citidina, 2’-desoxitiouridina u otro nucleósido de pirimidina no natural.
40 En una forma de realización el oligonucleótido inmunomodulador es un oligonucleótido inmunoestimulador. En otra forma de realización el oligonucleótido inmunomodulador es un oligonucleótido inmunosupresor. En varias formas de realización, el oligonucleótido inmunomodulador es un oligonucleótido de clase A, B, C, P, T, E, o S.
En una forma de realización el oligonucleótido es menor de 15 de nucleótidos de largo. En otra forma de realización, el oligonucleótido tiene al menos una unión internucleotídica estabilizada. En una forma de realización la al menos 45 una unión internucleotídica estabilizada se selecciona del grupo que consiste en: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfonoacetato, Rp-fosforotioato, Sp-fosforotioato, boranofosfato, o 3’-tioformacetal. En una forma de realización, el oligonucleótido tiene un segundo tipo de modificación de azúcar. En una forma de realización, el segundo tipo de modificación de azúcar se elige del grupo que consiste en 2’-O-metilribosa, 2’-Opropanilribosa, 2’-O-butilribosa, 2’-O-(2-metoxietil), 2’-O, ribosa unida a 4’-C-alquileno (alquileno es metileno (LNA) o
50 etileno), 2’-desoxi-2’-fluororibosa, 3’-O-metilribosa, 1’,2’-didesoxirribosa; arabinosa, 1’-metilarabinosa, 3’hidroximetilarabinosa, 4’-hidroximetil-arabinosa, o 1,5-anhidrohexitol.
En una forma de realización el oligonucleótido tiene al menos una unión internucleotídicas 3’-3’. En otra forma de realización el oligonucleótido tiene al menos una unión internucleotídicas 5’-5’. En aún otra forma de realización, el oligonucleótido tiene al menos una unión internucleotídicas 2’-5’. En una forma de realización, el oligonucleótido es 55 un oligonucleótido ramificado. En otra forma de realización, el oligonucleótido tiene al menos una secuencia palindrómica. En otra forma de realización, el oligonucleótido tiene al menos una secuencia (G)n (n es 4 a 10). En otra forma de realización, el oligonucleótido comprende al menos un análogo T hidrofóbico. En otra forma de realización el oligonucleótido comprende al menos un análogo de U sustituido en 5. En aún otra forma de realización el oligonucleótido tiene una modificación lipofílica. En una forma de realización, el oligonucleótido incluye un ligador.
60 En otra forma de realización, el ligador es d-espaciador, ligador 1,3-propanodiol, glicerol u homólogo de glicerol.
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Otro aspecto de la descripción es un procedimiento de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la descripción en una cantidad efectiva para estimular la respuesta inmunitaria. En una forma de realización de la descripción, el procedimiento es un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que 5 tiene cáncer de cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la descripción en una cantidad efectiva para tratar el cáncer. En otra forma de realización de la descripción el procedimiento comprende además administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer. En una forma de realización de la descripción el tratamiento contra el cáncer es la terapia de radicación, quimioterapia, inmunoterapia, una vacuna contra el cáncer, terapia hormonal, o un modificador de la respuesta biológica. En una forma de realización de la descripción, el procedimiento es un procedimiento para el tratamiento de la enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener la enfermedad infecciosa cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad infecciosa. En una forma de realización de la descripción el oligonucleótido inmunomodulador se administra por vía intravenosa. En otra forma de realización de la descripción el oligonucleótido inmunomodulador se administra por vía subcutánea. En una forma de realización de la 15 descripción, la enfermedad infecciosa es una enfermedad viral. En otra forma de realización de la descripción, la enfermedad viral es la hepatitis B, hepatitis C, citomegalovirus, (CMV), virus del papiloma virus, VIH o virus herpes simplex (HSV). En aún otra forma de realización de la descripción, la enfermedad infecciosa es de Leishmania, Listeria, o Ántrax. En aún otra forma de realización de la descripción, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un agente anti-viral, un agente antibacteriano, un agente anti-parasitario, o un agente antifúngico. En una forma de realización de la descripción, el procedimiento es un procedimiento para el tratamiento de la alergia en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que tiene alergia cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención en una cantidad efectiva para tratar la alergia. En una forma de realización de la descripción, la alergia es rinitis alérgica. En otra realización de la descripción, el procedimiento comprende además administrar al sujeto un medicamento antialergia. En una forma de realización de la descripción, el sujeto es un 25 sujeto que tiene o está en riesgo de tener dermatitis atópica (eczema), rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (erupción), o una alergia a los alimentos. En otra forma de realización de la descripción, el medicamento anti-alergia es un anticuerpo anti-IgE, un antihistamínico, un corticosteroide, o un inductor de la prostaglandina. En una forma de realización de la descripción, el procedimiento es un procedimiento para tratar el asma en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que tiene asma cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención en una cantidad efectiva para tratar el asma. En una forma de realización de la descripción el procedimiento comprende además administrar al sujeto un medicamento para el asma. En una forma de realización de la descripción, el medicamento del asma es un inhibidor de PDE-4, un agonista de broncodilatador/beta-2, un agente de apertura del canal de K+, un antagonista de VLA-4, un antagonista de neuroquina, un inhibidor de la síntesis de tromboxano A2 (TXA2), una xantina, un antagonista de ácido
35 araquidónico, un inhibidor de la 5 lipoxigenasa, un antagonista del receptor de TXA2, un antagonista de TXA2, un inhibidor de las proteínas de activación 5-lipox, o un inhibidor de la proteasa. En otra forma de realización de la descripción, el procedimiento es un procedimiento de suprimir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto cualquiera de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención en una cantidad efectiva para suprimir la respuesta inmunitaria. En otra forma de realización de la descripción el sujeto tiene un trastorno inflamatorio o una enfermedad autoinmune. En otra forma de realización de la descripción el sujeto es un sujeto que tiene la enfermedad autoinmune. En otra forma de realización de la descripción el sujeto es un sujeto que tiene o está riesgo de tener un trastorno inflamatorio. En aún otra forma de realización de la descripción el trastorno inflamatorio es la sepsis.
El uso de "que incluye", "que comprende" o "que tiene", "que contiene", "que implica", y sus variaciones en la
45 presente, significa abarcar los elementos listados a partir de este momento y sus equivalentes así como artículos adicionales.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos no se consideran dibujados en escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras está representado por un número similar. Para mayor claridad, no todos los componentes se pueden marcar en cada dibujo. En los dibujos:
La Figura 1 es un dibujo que muestra las estructuras químicas para los ácidos 2’-fluoro-arabino-nucleicos (FANA) y 2’O-metil (2’OMe). El dibujo también ilustra diferentes formas de FANA y 2’OMe, lo que demuestra que los ácidos 2’fluoro-arabino-nucleicos están en la conformación preferida 8-ADN (2’-endo).
La Figura 2 es un gráfico que muestra que los ácidos nucleicos con la modificación de FANA de un residuo de
55 guanosina son estables frente a los ácidos. La cinética de la despurinación de ácidos nucleicos FANA la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 se compararon con la cinética de la SEQ ID NO:8 progenitora no FANA. Los ácidos nucleicos se incubaron en HCl 0,1 M y se midió la despurinación por cuantificación de RP-HPLC de la base de purina libre. El eje x es el tiempo en minutos y el eje y es la concentración de guanina en nanogramos (ng).
La Figura 3 es un gráfico que muestra que la activación de NF-KB mediada por TLR9 por los ácidos nucleicos FANA de clase B. Las actividades de los ácidos nucleicos FANA SEQ ID NO:1-7 se compararon con la actividad del ácido nucleico progenitor no FANA SEQ ID NO:8. Las células hTLR9-LUC-293 se incubaron con cantidades indicadas de ácidos nucleicos y la activación NF-KB se determinó 16 horas después mediante la medición de la actividad de luciferasa. Los índices de estimulación se calcularon en referencia de la actividad de luciferasa del umbral medio. El eje x es el log de la concentración OD en µM y el eje y es IFN-α en pg/ml.
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La Figura 4 es un gráfico que muestra que la incorporación de FANA-G en el motivo CpG lleva a un aumento de la
5 producción de IFN-α mediada por hTLR9. Las actividades de los ácidos nucleicos FANA clase C SEQ ID NO:9-14 se compararon con la actividad del progenitor no FANA SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16 (progenitor con 3’-Ometilguanosina en el extremo 3’). Los PBMC humanos se incubaron durante 24 horas con cantidades crecientes de ácidos nucleicos de clase C y niveles de IFN-α se determinaron ±SEM de 3 donantes. El eje x es log de la concentración de ODN en µM y el eje y es la concentración de IFN-α en pg/ml.
10 Descripción detallada
La invención se basa en parte en los oligonucleótidos inmunomoduladores que presentan aumento de estabilidad sin una reducción concomitante en la capacidad inmunomodulatoria. Los oligonucleótidos (ODN) con ciertos motivos inmunomoduladores son conocidos por estimular el sistema inmunológico, por ejemplo a través de la interacción con los receptores Toll-like 9 (TLR9). Sin embargo, los oligonucleótidos se someten a la degradación mediante endo y 15 exonucleasas in vivo. Ciertas modificaciones químicas de CpG ODN, tales como variaciones de las uniones internucleotídicas o la alteración del residuo de azúcar, se utilizan para modular su estabilidad frente a las nucleasas, así como sus características de captación celular y su perfil inmunoestimulador. Desafortunadamente, estas modificaciones en algunos casos pueden producir una cierta pérdida de la capacidad de estos oligonucleótidos para estimular el sistema inmunitario, presumiblemente mediante la interferencia en el reconocimiento de estos
20 oligonucleótidos por sus receptores.
La invención se refiere en algunos aspectos al descubrimiento de que el reemplazo de 2'-desoxi-ß-D-ribonucleósidos en los oligonucleótidos inmunomoduladores por la inclusión de 2'-desoxi-2'-fluoro-ß-D-arabino nucleósidos modificados (FANA) confiere la estabilidad deseada en el ODN, pero deja la actividad biológica intacta. Además, se descubrió de modo sorprendente que estos ODN también eran más estables a pH ácido, lo que indica el potencial
25 para el ODN modificado con FANA en aplicaciones orales. Tal aumento de la actividad se observó incluso cuando el FANA se ubica en un nucleósido interno dentro del motivo estimulatorio.
En algunos aspectos de la descripción el oligonucleótido tiene una secuencia ZNYZ del motivo inmunomodulador, donde Z es cada uno de modo independiente un nucleósido de purina o un nucleósido de purina modificado con FANA, N es T, A, o a U sustituido en 5. Y es un nucleósido de pirimidina. En los motivos inmunomoduladores de la
30 presente invención al menos un Z es un nucleósido de purina modificado con FANA. El oligonucleótido puede incluir uno o más de estos motivos. En algunos casos, el oligonucleótido tiene una pluralidad de dinucleótidos YZ internos. Uno o más de estos dinucleótidos pueden tener una purina modificada con FANA. En algunos casos, todos los dinucleótidos YZ tienen una purina modificada con FANA.
En algunos casos de la descripción el motivo inmunomodulador también se define como un motivo ZNYG, donde YG
35 es un dinucleótido pirimidina-guanina interno. En algunas formas de realización N es T. El motivo inmunomodulador puede estar corriente abajo de cuatro o más nucleótidos. El dinucleótido pirimidina-guanina interno está normalmente no metilado.
En algunos casos de la descripción el motivo inmunomodulador también se define como ZNYZ N1N2N3N4, donde N es To A.
40 En algunos casos Z es guanosina, 2’-desoxiguanosina, 2’ desoxi-7 deazaguanosina, 2’desoxi-6-tioguanosina, arabinoguanosina, 2-desoxiinosina, 2’-desoxi arabinoguanosina-sustituida-2’, arabinoguanosina 2’-O-sustituida u otro nucleósido de purina no natural.
En algunos casos hay más de un nucleósido de purina modificado con FANA en los motivos inmunomoduladores descritos anteriormente. En algunos casos existen uno o más nucleósidos de purina modificado FANA fuera el
45 motivo.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente invención pueden ser los oligonucleótidos inmunoestimuladores. Los motivos inmunomoduladores descritos anteriormente se pueden usar en el contexto de clases previamente descritas de oligonucleótidos inmunoestimuladores que incluyen las clases ODN tales como clase A, clase B, clase C, clase E, clase T y clase P. En algunas formas de realización de la invención de los 50 oligonucleótidos inmunomoduladores incluyen motivos inmunoestimuladores que son "dinucleótidos CpG". Un dinucleótido CpG está no metilado. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es una molécula de oligonucleótido que contiene una secuencia de dinucleótido de citosinaguanina no metilada (es decir, una 5’ citidina no metilada seguido por 3’ guanosina y ligada por un enlace fosfato) y que activa el sistema inmunológico; tal oligonucleótido inmunoestimulador es un oligonucleótido CpG. Los oligo55 nucleótidos CpG se han descrito en una serie de patentes emitidas, solicitudes de patentes publicadas, y otras publicaciones, que incluyen Patentes U.S Nros 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contienen al menos un dinucleótido CpG metilado es un oligonucleótido
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que contiene una metilated secuencia del dinucleótido citosina-guanina (es decir, una citidina metilada 5’ seguida por una guanosina 3’ y unida por un enlace fosfato) y que activa el sistema inmunitario. En otras formas de realización de la descripción los oligonucleótidos inmunoestimuladores están libres de dinucleótidos CpG. Estos oligonucleótidos que están libres de dinucleótidos CpG se denominan como oligonucleótidos no CpG, y tienen
5 motivos inmunoestimuladores no CpG. Con preferencia, estos son ODN ricos en T, tal como ODN que tiene al menos 80% T.
ODN de "clase B" son potentes en la activación de las células B, pero son relativamente débiles en la inducción de IFN-α y activación de las células NK. Los oligonucleótidos CpG de clase B normalmente están totalmente estabilizados e incluyen un dinucleótido CpG no metilado dentro de ciertos contextos de base preferidos. Ver, por 10 ejemplo, la Patente U.S Nros. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068. Otra clase es potente para la inducción de IFN-α y activación de las células NK, pero es relativamente débil en la estimulación de las células B; esta clase se ha denominado la "clase A". Los oligonucleótidos CpG de clase A normalmente tienen secuencias poli-G estabilizadas en los extremos 5’ y 3' y una secuencia que contiene dinucleótido CpG un fosfodiéster palindrómico de al menos 6 nucleótidos. Ver, por ejemplo, PCT/US00/26527 solicitud de patente
15 publicada (WO 01/22990). Sin embargo, otra clase de oligonucleótidos CpG activa las células B y células NK e induce IFN-α; esta clase se ha denominado la clase C.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de "clase C" que contienen al menos dos motivos distintos tienen efectos estimulantes únicas y deseables en las células del sistema inmunitario. Algunos de estos ODN tienen una secuencia CpG "estimulada" tradicional y un motivo "rico en GC" "neutralizante de las células B". Estos oligonucleótidos del 20 motivo de combinación tienen efectos estimulantes del sistema inmune que se hallan entre los efectos asociados con los ODN CpG de "clase B" tradicionales, que son fuertes inductores de la activación de las células B y las células dendríticas de activación (DC), y los efectos asociados con una clase más recientemente descrita de oligonucleótidos inmunoestimuladores (ODN CpG de "clase A") que son fuertes inductores de IFN-α y activación de las células citolíticas naturales (NK), pero relativamente pobres inductores de células B y la activación de DC. Krieg
25 AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6. Mientras que los ODN CpG de clase B preferidos a menudo tienen esqueleto de fosforotioato y los ODN CpG de clase A preferidos tienen esqueletos mixtos o quiméricos, la clase C de oligonucleótidos inmunoestimuladores del motivo de combinación pueden tener por ejemplo, esqueletos de fosforotioato, quimérico, o fosfodiéster estabilizados, y en algunos formas de realización preferidas, tienen esqueletos semi-blandos.
30 Los oligonucleótidos de “clase E” tienen una mejor capacidad de inducir la secreción de IFN-alfa. Estos ODN tienen un análogo de nucleótido lipofílico sustituido 5’ y/o 3’ de un motivo YGZ. El compuesto de la fórmula de la clase E puede ser, por ejemplo, alguno de los análogos de nucleótidos lipofílicos sustituidos: una pirimidina sustituida, un uracilo sustituido, un análogo T hidrofóbico, un tolueno sustituido, un imidazol o pirazol sustituido, un triazol sustituido, 5-cloro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-yodo-uracilo, 5-etil-uracilo, 5-propil-uracilo, 5-propinil-uracilo, (E)-5-(2
35 bromovinil)-uracilo, o 2.4-difluorotolueno.
Los oligonucleótidos de "clase T” inducen la secreción de niveles más bajos de IFN-alfa cuando no están modificados como en los ODN de la invención y de las citoquinas y quimioquinas relacionadas con el IFN que los oligonucleótidos de clase B o clase C, mientras que conservan la capacidad de inducir niveles de IL-10 similares a los oligonucleótidos de clase B.
40 Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de "clase P" tienen varios dominios, que incluyen un dominio de activación 5'TLR, 2 regiones de formación de dúplex y un espaciador opcional y cola 3'. Esta clase de oligonucleótidos tiene la capacidad en algunos casos para inducir niveles mucho más altos de secreción de IFN-α que los de clase C. Los oligonucleótidos de clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en concatámeros, ya sea in vitro y/o in vivo. Sin estar ligado por ninguna teoría en particular para el procedimiento de
45 acción de estas moléculas, una hipótesis potencial es que esta propiedad confiere a los oligonucleótidos de clase P la capacidad de reticulación del TLR9 más alta dentro de ciertas células inmunitarias, los que induce un patrón distinto de la activación inmunológica en comparación para las clases descritas anteriormente de los oligonucleótidos CpG. La reticulación de los receptores de TLR9 puede inducir la activación de una secreción más fuerte de IFN-α a través del ciclo de retroalimentación de IFNR tipo I en las células dendríticas plasmacitoides.
50 Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente invención pueden ser oligonucleótidos inmunosupresores. Los motivos inmunomoduladores descritos anteriormente se pueden utilizar en el contexto de las clases descritas anteriormente de oligonucleótidos inmunosupresores que incluyen las clases de ODN tales como la "clase S". Los ODN inhibitorios o de clase S son útiles siempre que sea deseable inhibir la inmunoestimulación. Los ODN inhibitorios se pueden utilizar para prevenir y tratar el choque séptico, inflamación, alergia, asma, rechazo de injertos,
55 enfermedad de injerto versus huésped (GvHD), enfermedades autoinmunes, enfermedades mediadas por Th1 o Th2, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, abortos espontáneos, y tumores. El ODN inhibitorio se puede utilizar generalmente para inhibir la activación de todas las células que expresan los TLR relevantes, y más específicamente para inhibir la activación de las células presentadoras de antígeno, células B, células dendríticas plasmacitoides (pDC), monocitos, células derivadas de monocitos, eosinófilos, y neutrófilos.
60 Los oligonucleótidos inmunomoduladores pueden tener un esqueleto de uniones internucleotídicas estabilizadas además de estabilizar los nucleótidos de purina FANA o tener un esqueleto de uniones de nucleótidos y fosfodiéster estabilizados. Una "unión internucleotídica estabilizada" significará una unión internucleotídica que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, a través de una exo o endo-nucleasas), en comparación con una unión internucleotídica fosfodiéster. Las uniones internucleotídicas estabilizadas preferidas incluyen, sin limitación,
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5 fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfonoacetato, Rp-fosforotioato, Sp-fosforotioato, boranofosfato, o 3'-tioformacetal, o combinaciones de estos. Otros oligonucleótidos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, tales como alquil y aril-fosfatos (en los que el oxígeno del fosfonato cargado se sustituye con un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en la que el resto de oxígeno cargado está alquilado. Los oligonucleótidos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos terminales también se ha demostrado que son sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasas.
Para los fines de la presente invención, un esqueleto quimérico se refiere a un esqueleto parcialmente estabilizado, en el que al menos una unión internucleotídica es fosfodiéster o tipo fosfodiéster y en el que al menos otra unión internucleotídica es es una uníón internucleotídica estabilizada, en el que el al menos una unión fosfodiéster o tipo y el al menos un enlace estabilizado son diferentes. Debido a que se ha informado que las uniones boranofosfonato 15 están estabilizadas con respecto al fosfodiéster, para los propósitos de la naturaleza quimérica del esqueleto, las uniones boranofosfonato se pueden clasificar como tipo fosfodiéster o como estabilizado, de acuerdo con el contexto. Por ejemplo, un esqueleto quimérico de acuerdo con la presente invención en una realización podría incluir al menos una unión fosfodiéster (fosfodiéster o tipo fosfodiéster) y la menos una unión boranofosfonato (estabilizada). En otra forma de realización un esqueleto quimérico de acuerdo con la presente invención puede incluir uniones boranofosofonato (fosfodiéster o tipo fosfodiéster) y fosforotioato (estabilizado). Los esqueletos modificados tales como fosforotioatos se pueden sintetizar usando técnicas automatizadas que emplean reacciones de química de fosforamidato o H-fosfonato. Los aril y alquil-fosfonatos se pueden obtener, por ejemplo, como se describe en la patente U.S. N º 4.469.863; y alquilfosfotriésteres (en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado como se describe en la patente U.S. N º 5.023.243 y la Patente Europea N º 092574) se pueden preparar
25 por síntesis en fase sólida automatizada usando reactivos disponibles en el comercio. Se han descrito procedimientos para realizar otras modificaciones y sustituciones del esqueleto del ADN. Uhlmann E et al. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem. 1: 165. Los procedimientos para preparar oligonucleótidos quiméricos también son conocidos. Para las patentes presentes emitidas en Uhlmann et al se han descrito tales técnicas.
El ODN con esqueleto mixto modificado se puede sintetizar utilizando un sintetizador de ADN disponible en el comercio y química de fosforamidita estándar. (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues -A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, and M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)) Después del acoplamiento, las uniones PS se introducen por sulfuración usando el reactivo de Beaucage (Iyer RP,
W. Egan, JB Regan y SL Beaucage, J. Am. Chem. SOC. 112, 1253 (1990)) (0,075 M en acetonitrilo) o disulfuro de
35 fenilo acetilo (PADS) seguido por la terminación con anhídrido acético, 2,6-lutidina en tetrahidrofurano (1:1:8; v:v:v) y N-metilimidazol (16% en tetrahidrofurano). Esta etapa de terminación se realiza después de la reacción de sulfuración para minimizar la formación de uniones fosfodiéster no deseadas (PO) en las posiciones donde se debe ubicar un enlace fosforotioato. En el caso de la introducción de un enlace fosfodiéster, por ejemplo, en un dinucleótido CpG, el intermedio de fósforo-III se oxida por tratamiento con una solución de yodo en agua/piridina. Después de la escisión del soporte sólido y la desprotección final mediante el tratamiento con amoníaco concentrado (15 horas a 50 ° C), el ODN se analiza por HPLC en una columna de Fax Gen-Pak (Millipore-Waters) usando un gradiente de NaCl (por ejemplo, buffer A: 10 mM de NaH2PO4 en acetonitrilo/agua = 1:4/v:v; pH 6,8; buffer B: 10 mM de NaH2PO4, 1,5 de NaCl 20 M en acetonitrilo/agua = 01:04/v: v; 5 a 60% de B en 30 minutos a 1 ml/min) o por electroforesis en gel capilar. El ODN se puede purificar por HPLC o mediante FPLC en una columna de alto
45 rendimiento Fuente (Amersham Pharmacia). Las fracciones homogéneas HPLC se combinan y se desalinizaron por medio de una columna C18 o por ultrafiltración. El ODN se analizó por espectrometría de masas MALDI-TOF para confirmar la masa calculada.
Los oligonucleótidos de la invención también pueden incluir otras modificaciones. Estos incluyen análogos de ADN no iónicos, tales como alquil-y aril-fosfatos (en los que el oxígeno fosfonato cargado se sustituye con un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en la que el resto de oxígeno cargado está alquilado. Los oligonucleótidos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos terminales también se ha demostrado que son sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasas.
Un oligonucleótido semi-blando es un oligonucleótido inmunoestimulatorio que tiene un esqueleto parcialmente estabilizado, en el que las uniones internucleosídicas fosfodiéster o tipo fosfodiéster se producen solo dentro de al
55 menos un dinucleótido de nucleósido de pirimidina-guanosina (YG). Los oligonucleótidos semiblandos pueden tener numerosas ventajas respecto de los oligonucleótidos inmunoestimuladores con esqueletos completamente estabilizados. Por ejemplo, los oligonucleótidos semi-blandos pueden poseer aumento de potencia inmunoestimuladora en relación con los correspondientes oligonucleótidos inmunoestimuladores completamente estabilizados.
En algunas formas de realización de la descripción, el dinucleótido YZ es un dinucleótido YG, en que G es guanosina o una guanosina modificada. En algunas formas de realización, la guanosina es una guanosina
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modificada con FANA.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores incluirán generalmente, además de la unión internucleotídica fosfodiéster o tipo fosfodiéster en las posiciones internas preferidas, extremos 5’ y 3' que son resistentes a la degradación. Tales extremos resistentes a la degradación pueden involucrar cualquier modificación adecuada que produce un aumento 5 de la resistencia contra la digestión con nucleasa respecto de los extremos correspondientes no modificados. Por ejemplo, los extremos 5’y 3' pueden estabilizarse mediante la inclusión de al menos una modificación de fosfato del esqueleto. En una forma de realización preferida, la al menos una modificación de fosfato del esqueleto en cada extremo es independientemente una unión internucleotídica de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, o metilfosforotioato. En otra forma de realización, el extremo resistente a la degradación incluye una o más unidades
10 de nucleótidos conectadas por las uniones de péptido o amida en el extremo 3’.
Una unión internucleotídica de fosfodiéster es el tipo de unión característica de oligonucleótidos que se encuentran en la naturaleza. La unión internucleotıdica fosfodiéster incluye un átomo de fósforo, flanqueada por dos átomos de oxígeno de puente y unidos también por dos átomos de oxígeno adicionales, uno cargado y otro sin carga. La unión internucleotídica fosfodiéster se prefiere particularmente cuando es importante para reducir la vida media de tejido
15 del oligonucleótido.
Una unión internucleotídica fosfodiéster como es un grupo puente que contiene fósforo que es similar desde el punto de vista químico y/o diastereomérico al fosfodiéster. Las mediciones de semejanza con fosfodiéster incluyen susceptibilidad a la digestión con nucleasa y la capacidad de activar la ARNasa H. Por lo tanto, por ejemplo, fosfodiéster, pero no nucleótidos de fosforotioato, los oligonucleótidos son susceptibles a la digestión con nucleasa, 20 mientras que los oligonucleótidos de fosfodiéster y fosforotioato activan la ARNasa H. En una forma de realización preferida, la unión internucleotídica tipo fosfodiéster es boranofosfato (o equivalentemente, boranofosofonato). Patente U.S. N.º 5.177.198; patente U.S. N.º 5.859.231; patente U.S. N.º 6.160.109; patente U.S. N.º 6.207.819; Sergueev et al., (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:9417-27. En otra forma de realización preferida, la unión internucleotídica fosfodiéster como es Rp fosforotioato diastoméricamente puro. Se considera que el Rp fosforotioato
25 diastoméricamente puro es más susceptible a la digestión de nucleasa y es mejor en la activación de la ARNasa H del fosforotioato Sp mixto o diastereoméricamente puro. Los éstereoisómeros de los oligonucleótidos CpG son el sujeto de la solicitud PCT publicada PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Cabe señalar que para los fines de la presente invención, el término unión internucleotídica tipo fosfodiéster -fosfodiéster excluye específicamente las uniones internucleotídicas fosforoditioato y metil fosfonato.
30 Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la presente invención pueden abarcar varias modificaciones y sustituciones químicas, en comparación con el ARN y ADN naturales, que involucra un puente internucleotídico fosfodiéster, una unidad de β-D-ribosa y/o una base nucleotídica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Los ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por los expertos y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis
35 and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; and Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Un oligonucleótido de acuerdo con la invención puede tener una o más modificaciones, donde cada modificación se ubica en un puente internucleotídico fosfodiéster particular y/o en una unidad de β-D-ribosa particular y/o en una posición de base del nucleotídico natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que se compone de
40 ADN o ARn natural.
Por ejemplo, la invención se refiere a un oligonucleótido que puede comprender una o más modificaciones y donde cada modificación se selecciona de modo independiente de:
a) el reemplazo de un puente internucleotídico fosfodiéster ubicado en el extremo 3’ y/o 5’ de un nucleótido por un puente internucleotídico modificado,
45 b) el reemplazo del puente fosfodiéster ubicado en el extremo 3’ y/o 5’ de un nucleótido por un puente defosfo,
c) el reemplazo de una unidad de azúcar del esqueleto de fosfato de azúcar por otra unidad,
d) el reemplazo de una unidad de β-D-ribosa por una unidad de azúcar modificada, y
e) el reemplazo de una base nucleotídica natural con una base nucleotídica modificada.
50 Los ejemplos más detallados para la modificación química de un oligonucleótido son los siguientes.
Un puente internucleotídico fosfodiéster ubicado en el extremo 3’ y/o 5’ de un nucleótido se puede reemplazar con un puente internucleotídico modificado, donde el puente internucleotídico modificado por ejemplo, se selecciona de puentes fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, fosfonato de α-hidroxibencilo, fosfato-(C1C21)-O-alquil éster, fosfato-[aril (C6-C12)aril-O-alquil (C1-C21)]éster, alquil (C1-C8)fosfonato y/o aril(C6-C12)fosfonato, α55 hidroximetil-arilo (C7-C12) (por ejemplo, descrito en WO 95/01363), donde arilo (C6-C12), arilo (C6-C20) y arilo (C6-C14) están opcionalmente sustituidos con halógeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano, y donde R1 y R2 son, de modo
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independiente entre sí, hidrógeno, alquilo (C1-C18), arilo (C6-C20), aril-(C6-C14)-alquilo (C1-C8), con preferencia hidrógeno, alquilo (C1-C8), con preferencia alquilo (C1-C4) y/o metoxietilo, o R1 y R2 forman, junto con el átomo de nitrógeno que los porta, un anillo heterocíciclico de 5-6 miembros que puede contener adicionalmente un heteroátomo adicional del grupo O, S y N.
5 El reemplazo de un puente fosfodiéster ubicado en el extremo 3’ y/o 5’ de un nucleótido por un puente defosfo (los puentes defosfo se describen, por ejemplo, en Uhlmann E and Peyman A en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff), donde un puente defosfo por ejemplo se selecciona de los puentes de fosfo formacetal, 3’-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o grupos sililo.
10 Una unidad de fosfato de azúcar (es decir, una β-D-ribosa y puente internucleotídico fosfodiéster juntos que forman una unidad de fosfato de azúcar del esqueleto de fosfato de azúcar (es decir, un esqueleto de fosfato de azúcar compuesto de unidades de fosfato de azúcar) se puede reemplazar con otra unidad, donde la otra unidad es por ejemplo adecuada para formar un oligómero de "derivado de morfolino" (como se describe, por ejemplo, en Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), es decir, por ejemplo, el reemplazo de una unidad derivada de
15 morfolino; o para formar un ácido nucleico poliamida ("PNA"; como se describe por ejemplo, en Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo con una unidad del esqueleto de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina.
Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" también abarcan ácidos nucleicos u oligonucleótidos con sustituciones o modificaciones, tales como en las bases y/o azúcares. Por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que 20 tienen esqueletos de azúcares que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de peso molecular bajo distintos de un grupo hidroxilo en la posición 2’ y diferente de un grupo fosfato o grupo hidroxi en la posición 5’. Por lo tanto los ácidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa alquilada 2'-O. Además, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa o 2'-fluoroarabinosa en lugar de ribosa. Así, los oligonucleótidos pueden ser heterogéneos en la composición del esqueleto, de este modo contienen cualquier
25 posible combinación de unidades de polímero unidas entre sí, tales como ácidos nucleicos peptídicos (que tienen un esqueleto de aminoácidos con bases de ácidos nucleicos).
Los oligonucleótidos también incluyen purinas y pirimidinas sustituidas tales como C-5 propino pirimidina y bases modificadas de purina 7-deaza-7-sustituida, Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Las purinas y pirimidinas incluyen pero sin limitación adenina, citosina, guanina, timina, 5-metilcitosina, 5-hidroxicitosina, 5
30 fluorocitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hiopoxantina, y otras nucleobases naturales y no naturales, restos aromáticos sustituidos y no sustituidos. Otras de estas modificaciones son bien conocidas en la técnica.
Una base modificada es cualquier base que es químicamente diferente de las bases naturales normalmente halladas en ADN y ARN tales como T, C, G, A, y U, pero que comparten estructuras químicas básicas con estas bases 35 naturales. La base nucleotídica modificada se puede seleccionar, por ejemplo, de hipoxantina, uracilo, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil (C1-C6)-uracilo, 5-alquenil (C2-C6)-uracilo, 5-alquinil (C2-C6)-uracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil (C1C6)-citosina, 5-alquenil (C2-C6)-citosina, 5-alquinil (C2-C6)-citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-deazapurina sustituida, con preferencia purina 7-deaza-7
40 sustituida y/o 7-deaza-8-sustituida, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por ejemplo, N4-etilcitosina, 5hidroximetilcitosina, 6-tioguanina, nitropirrol, C5-propinilpirimidina, y diaminopurina por ejemplo, 2,6-diaminopurina, 5metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina u otras modificaciones de las bases de nucleótidos naturales. Esta lista se considera ilustrativa y no se interpreta como limitante.
Además de las modificaciones con FANA descritas anteriormente, los oligonucleótidos inmunomoduladores de la
45 presente invención pueden tener otros tipos de modificaciones de azúcar. Como en la modificación FANA, una unidad de β-ribosa o una unidad de β-D-2’-desoxirribosa se puede reemplazar con una unidad de azúcar modificada, donde la unidad de azúcar modificada por ejemplo se selecciona de β-D-ribosa, α-D-2’-desoxirribosa, L-2’desoxirribosa, 2’-F-2’-desoxirribosa, 2’-O-alquil(C1-C6)-ribosa, con preferencia 2’-O-alquil(C1-C6)-ribosa es 2’-Ometilribosa, 2’-O-alquenil (C2-C6)-ribosa, 2’-[O-alquil(C1-C6)-O-alquil(C1-C6)]-ribosa, 2’-NH2-2’-desoxirribosa, β-D-xilo
50 furanosa, α-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-β-D-eritro-hexo-piranosa, y análogos carbocíclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) y/o de azúcar de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) y/o análogos azúcar bicíclicos (descritos, por ejemplo, en Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481). En algunas formas de realización, la modificación es’-Ometoxietilribosa, 2’-O-propanilribosa, 2’-O-butilribosa, 2’-O-(2-metoxietil), ribosa unida a 2’-O,4’-C-alquileno (alquileno
55 es metileno (LNA) o etileno), 2’-desoxi-2’-fluororibosa, 3’-O-metilribosa, 1’,2’-didesoxirribosa; arabinosa, 1’metilarabinosa, 3’-hidroximetilarabinosa, 4’-hidroximetil-arabinosa, o 1,5-anhidrohexitol.
En fórmulas particulares descritas en la presente se define un conjunto de bases modificadas. Por ejemplo, en la presente descripción la letra Y se usa para referirse a la pirimidina y en algunas formas de realización un nucleósido que contiene una citosina o una citosina modificada. Una citosina modificada como se usa en la presente es un 60 análogo de la base pirimidina natural o no natural de citosina que puede reemplazar esta base sin alterar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las citosinas modificadas incluyen pero sin limitación citosinas 5-sustituidas (por ejemplo 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-clorocitosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina, y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas 6-sustituidas, citosinas N4-sustituidas (por ejemplo N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo5 isocitosina, análogos de citosina con sistemas anulares condensados (por ejemplo N,N’-propilen citosina o fenoxazina), y uracilo, análogos de uracilo 5’-sustituido tales como 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromoviniluracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo. Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, y N4-etil-citosina. En otra forma de realización de la invención, la base de citosina está sustituida con una base universal (por ejemplo 3-nitropirrol, base P), un sistema
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10 anular aromático (por ejemplo, fluorobenceno o difluorobenceno) o un átomo de hidrógeno (dSpacer).
En la presente divulgación, la letra Z se usa para referirse a un residuo de purina o abásico, en algunas formas de realización una guanina o una base de guanina modificada. Una guanina modificada como se usa en la presente es un análogo de la base de purina natural o no natural de guanina que reemplazar esta base sin alterar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las guaninas modificadas incluyen pero sin limitación 7-deazaguanina, 715 guanina deaza-7-sustituida (tales como 7-deaza-7-alquinil-(C2-C6)guanina), guanina 7-deaza-8-sustituida, hipoxantina, guaninas N2-sustituidas (por ejemplo N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, sustituida adeninas (por ejemplo N6-metiladenina, 8-oxo-adenina) guanina 8-sustituida (por ejemplo 8-hidroxiguanina y 8-bromoguanina), y 6-tioguanina. Estas bases de guanina modificada pueden ser residuos modificados con FANA. En otra forma de realización de la
20 descripción, una de las bases de guanina del motivo inmunomodulador está sustituida por una base universal (por ejemplo 4-metil-indol, 5-nitro-indol, y base K), un sistema anular aromático (por ejemplo, bencimidazol o diclorobencimidazol, amida del ácido 1-metil-1 H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) o un átomo de hidrógeno (dSpacer). En esta forma de realización, la otra base de guanina es un residuo modificado con FANA.
En algunas formas de realización el oligonucleótido comprende una o más secuencias palindrómicas. Como se usa
25 en la presente, "palíndromo" y, de modo equivalente, "secuencia palindrómica" se referirá a una repetición invertida, es decir, una secuencia tal como ABCDEE’D’C’B’A’ en que A y A’, B y B’, etc., son bases capaces de formar los pares de bases de Watson-Crick usuales. En algunos casos el palíndromo es rico en GC. Un palíndromo rico en GC es un palíndromo que tiene una composición de bases de al menos dos tercios de G y C. En algunas formas de realización el dominio rico en GC con preferencia es 3’ al "dominio estimulatorio de las células B". En el caso de un
30 palíndromo rico en GC de 10 bases de largo, el palíndromo contiene, en consecuencia, al menos 8 de G y C. En el caso de un palíndromo rico en GC de 12 bases de largo, el palíndromo también contiene al menos 8 de G y C. En el caso de un palíndromo rico en GC de 14 mer, al menos diez bases del palíndromo son de G y C. En algunas formas de realización el palíndromo rico en GC se compone exclusivamente de G y C. En algunas formas de realización el oligonucleótido contiene más de una secuencia palindrómica.
35 ADN es un polímero de desoxirribonucleótidos unidos a trav´s de uniones 3’-5’ fosfodiéster. Las unidades del polímero de la invención también se pueden unir a través de uniones 3’-5’ fosfodiéster. Sin embargo, la invención también abarca polímeros que tienen uniones internucleotídicas inusuales, que incluyen específicamente 5’-5’, 3’-3’, 2’-2’, 2’-3’, y uniones internucleotídicas 2’-5’. En una forma de realización, tales uniones inusuales se excluyen del motivo de ADN inmunomodulador, aun cuando una o más de estas uniones se puede producir en otra parte del
40 polímero. Para los polímeros que tienen extremos libres, la inclusión de una unión internucleotídicas 3’-3’ puede producir un polímero que tiene dos extremos 5’ libres. A la inversa, para los polímeros que tienen extremos libres, la inclusión de una unión internucleotídicas 5’-5’ puede producir un polímero que tiene dos extremos 3’ libres.
Una composición inmunoestimuladora de esta invención puede contener dos o más motivos de ADN inmunoestimuladores que se pueden unir a través de una unidad de ramificación. La uniones internucleotídicas 45 pueden ser uniones 3’-5’, 5’-5’, 3’-3’, 2’-2’, 2’-3’, o 2’-5’. De este modo, se elige la nomenclatura 2’-5’ de acuerdo con el átomo de carbono de la desoxirribosa. Sin embargo, si se emplean restos de azúcar no naturales, tales como análogos de azúcar de anillo expandiod (por ejemplo, hexanosa, cilohexeno o piranosa) o análogos de azúcar bi-o tricíclicos, entonces esta nomenclatura cambia de acuerdo con la nomenclatura del monómero. La unión internucleotídicas puede ser una unión fosfodiéster, pero alternativamente se puede modificar como fosforotioato o 50 cualquier otra unión modificada como se describe en la presente. La Fórmula I muestra una estructura general para los oligómeros de ADN ramificados y análogos de oligorribonucleótidos modificados de la invención por medio de una unidad de ramificación nucleotídica. De este modo, Nu1, Nu2, y Nu3 se pueden unir a través de uniones 3’-5’, 5’5’, 3’-3’, 2’-2’, 2’-3’, o 2’-5’. La ramificación de los oligómeros de ADN también puede involucrar el uso de ligadores no nucleotídicos y espaciadores abásicos. En una forma de realización, Nu1, Nu2, y Nu3 representan motivos de ADN
55 inmunoestimuladores idénticos o diferentes.
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Fórmula I
El análogo de oligorribonucleótido modificado puede contener una unidad duplicadora o triplicadora (Glen Research, Sterling, VA), en particular los análogos de oligodesoxirribonucleótidos modificados con una unión 3'-3’. Una unidad 5 duplicadora de en una forma de realización se puede basar en dimetoxitritiloxi)pentilamido]propil-2-[(2-cianoetil)(N,N-diisopropil)]-fosforamidita. Una unidad triplciadora en una forma de realización se puede basar en la incorporación de Tris-2,2,2-[3-(4,4’-dimetoxitritiloxi)propiloximetil]etil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita. La ramificación de los análogos de la oligorribonucleótido modificado por duplicador múltiple, triplicador u otras unidades de multiplicadores lleva a dendrímeros que son una forma de realización adicional de esta invención. Los 10 análogos oligorribonucleotídicos modificados ramificados pueden conducir a la reticulación de los receptores particularmente para combinaciones de ARN y ADN inmunoestimulador como TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 con efectos inmunológicos diferentes en comparación con las formas no ramificadas de los análogos. Además, la síntesis de análogos multiméricos ramificados o de otro modo puede estabilizar el ADN contra la degradación y puede permitir que secuencias de ADN débiles o parcialmente efectivas ejerzan un nivel terapéuticamente útil de la
15 actividad inmunológica. Los análogos de oligodesoxirribonucleótidos modificados también pueden contener unidades de ligadoras de péptidos provenientes de los reactivos modificadores del péptido o los reactivos modificadores de oligonucleótidos (Glen Research). Además, los análogos de oligodesoxirribonucleótidos modificados pueden contener uno o más residuos de aminoácidos naturales o no naturales que están conectados al polímero mediantes uniones peptídicas (amida).
20 El oligonucleótido inmunomodulador puede contener al menos una unión indirecta. Una unión directa se refiere a una unión de fosfato o fosfato modificado como se describe en la presente, sin un resto ligador interviniente. Un resto ligador interviniente es un resto orgánico distinto de una unión fosfato o fosfato modificado como se describe en la presente, que puede incluir, por ejemplo, polietilenglicol, 1,2-propanodiol, glicerol o homólogo de glicerol, trietilenglicol, hexaetilenglicol, dSpacer (es decir, un desoxinucleótido abásico), unidad duplicadora, o unidad
25 triplicadora.
Las uniones con preferencia están compuestas de C, H, N, O, S, B, P, y halógeno, que contiene 3 a 300 átomos. Un ejemplo con 3 átomos es una unión acetal (ODN 1-3'-O-CH2-O-3'-ODN2) que conecta, por ejemplo, el grupo 3'hidroxi de un nucleótido al grupo 3'-hidroxi de un segundo oligonucleótido. Un ejemplo con aproximadamente de 300 átomos es PEG-40 (tetraconta polietilenglicol). Las uniones preferidas son fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato,
30 fosforamidato, boranofosfonato, amida, éter, tioéter, acetal, tioacetal, urea, tiourea, sulfonamida, base de Schiff y uniones disulfuro. También es posible utilizar el Solulink BioConjugation System es decir, (www.trilinkbiotech.com).
Si el oligonucleótido se compone de dos o más partes de la secuencia, estas partes pueden ser idénticas o diferentes. Por lo tanto, en un oligonucleótido con una unión 3'3', las secuencias pueden ser 5'-ODN 1-3'3'-ODN 1 -5’ idénticas o 5'-ODN 1-3'3'-ODN2-5' diferentes. Además, la modificación química de las diversas partes de
35 oligonucleótidos, así como el ligador que los conecta pueden ser diferentes. Debido que la captación de oligonucleótidos cortos parece ser menos eficiente que la de los oligonucleótidos largos, la unión de dos o más secuencias cortas produce la mejora de la estimulación inmunológica. La longitud de los oligonucleótidos cortos es con preferencia 2-20 nucleótidos, con más preferencia 3-16 nucleótidos, pero con máxima preferencia 5-10 nucleótidos.
40 Las secuencias parciales de oligonucleótidos también pueden estar unidas por ligadores no nucleotídicos. Un ligador no nucleotídico se refiere a cualquier elemento ligador que no es un nucleótido o polímero del mismo (es decir, un polinucleótido), en el que un nucleótido incluye una nucleobase purina o pirimidina y un fosfato de azúcar, en particular, los ligadores abásicos (dSpacers), unidades de trieltilenglicol o unidades de hexaetilenglicol. Los ligadores preferidos son los ligadores alquilamino, tales como amino-ligadores C3, C6, C12 y también ligadores alquiltiol, tales
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5 como ligadores C3 o C6 tiol. Los oligonucleótidos también pueden estar unidos por residuos aromáticos que pueden estar sustituidos con grupos alquilo o grupos alquilo sustituidos.
El ODN inmunomodulador de la invención también puede tomar la forma de moléculas de forma de pesa covalentemente cerrados, con estructura primaria y secundaria. En una forma de realización tales oligorribonucleótidos cíclicos incluyen dos bucles de cadena simple conectados por un segmento de cadena doble 10 interviniente. En una forma de realización al menos un bucle de cadena simple incluye un motivo de ADN inmunomodulador de la invención. Otras moléculas de forma de pesa, covalentemente cerradas de la invención incluyen moléculas de ADN:ARN quiméricas en la que, por ejemplo, el segmento de cadena doble es al menos parcialmente de ADN (por ejemplo, ADNsd homodimérico o ADN:ARN heterodimérico) y al menos un bucle de cadena simple incluye un motivo de ADN inmunomodulador de la invención. Alternativamente, el segmento de
15 cadena doble de la molécula quimérica es ADN.
El ODN inmunomodulador puede ser aislado. Una molécula aislada es una molécula que está sustancialmente pura y está libre de otras sustancias con las que se encuentra normalmente en la naturaleza o en sistemas in vivo en un grado práctico y apropiado para el uso deseado. En particular, los ODN inmunomoduladores son suficientemente puros y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de las células con el fin de que sean útiles en,
20 por ejemplo, la producción de preparaciones farmacéuticas. Debido a que un ODN inmunomodulador aislado de la invención se puede mezclar con un portador farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el ODN inmunomodulador puede comprender solo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. El ODN inmunomodulador, sin embargo, está sustancialmente puro ya que se ha separado sustancialmente de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos.
25 Para facilitar la absorción en las células, los oligonucleótidos inmunoestimuladores en algunas formas de realización se hallan en el rango de 8 a 100 bases de longitud. Típicamente, los oligonucleótidos de cualquier tamaño mayor que 6 nucleótidos (incluso de muchas kb de largo) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria de acuerdo con la invención si están presentes suficientes motivos inmunoestimuladores. En algunas formas de realización, los oligonucleótidos tienen al menos de 15 nucleótidos de longitud.
30 En una forma de realización, la composición de la invención incluye además una secuencia de poliG unida de modo covalente a al menos un extremo del polímero, en donde cada secuencia de poliG incluye independientemente 4-10 nucleósidos de guanosina consecutivos seleccionados del grupo que consiste en ribonucleósido de guanosina, desoxirribonucleósido de guanosina, y cualquier combinación de estos. La secuencia de poliG en una forma de realización incluye uniones internucleotídicas de fosfato estabilizadas, por ejemplo, uniones de fosforotioato. Las
35 secuencias poliG pueden conferir numerosas propiedades biológicas y fisicoquímicas, que incluyen la estabilización frente a las nucleasas, aumento de la absorción por las células, inhibición de ciertas citoquinas, y la formación de la estructura secundaria o intermolecular que involucra las llamadas tétradas G. En una forma de realización, el polímero tiene un extremo 3’ y la secuencia de poliG se une de modo covalente al extremo 3'. La secuencia de poliG se puede unir de modo covalente al polímero a través de cualquier unión directa o indirecta adecuada, usualmente
40 través de una unión del esqueleto.
En un aspecto, la invención proporciona un conjugado de un oligonucleótido inmunomodulador de la invención y una modificación lipofílica. El grupo lipofílico, en general, puede ser un colesterilo, un colesterilo modificado, un derivado de colesterilo, un colesterol reducido, un colesterol sustituido, colestano, una cadena de alquilo de C16, un ácido biliar, ácido cólico, ácido taurocólico, desoxicolato, ácido oleil litocólico, ácido oleoil colérico, un glicolípido, un 45 fosfolípido, un esfingolípido, un isoprenoide, tales como esteroides, vitaminas, tales como vitamina E, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, ésteres de ácidos grasos, tales como triglicéridos, pirenos, porfirinas, Texafirina, adamantano, acridinas, biotina, cumarina, fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, digoxigenina, dimetoxitritilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, colorantes de cianina (por ejemplo, Cy3 o Cy5), colorante Hoechst 33258, psoraleno, o ibuprofeno. En ciertas formas de realización, el resto lipofílico se elige de colesterilo, palmitilo, y
50 acilo graso. En una forma de realización, el resto lipofílico es colesterilo. Se considera que la inclusión de uno o más de tales restos lipofílicos en el oligonucleótido inmunomodulador de la invención les confiere más estabilidad adicional contra la degradación por nucleasas. Cuando hay dos o más restos lipofílicos en un oligonucleótido inmunomodulador único de la invención, cada resto lipofílico se puede seleccionado de modo independiente de cualquier otro.
55 En una forma de realización, el grupo lipofílico está unido a una posición 2’ de un nucleótido del oligonucleótido inmunomodulador. Un grupo lipofílico, en forma alterantiva o adicional se puede unir a la nucleobase heterocíclica de un nucleótido del oligonucleótido inmunomodulador. El resto lipofílico se puede unir de modo covalente al oligonucleótido inmunomodulador a través de cualquier unión directa o indirecta adecuado. En una forma de realización, la unión es directa y es un éster o una amida. En una forma de realización, la unión es indirecto e incluye
60 un resto espaciador, por ejemplo, uno o más residuos de nucleótidos abásicos, oligoetilenglicol, tales como trietilenglicol (espaciador 9) o hexaetilenglicol (espaciador 18), o un alcanodiol, tal como butanodiol. 12
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La invención abarca el uso de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente invención para el tratamiento de un sujeto que tiene una afección que se puede tratar por estimulación o supresión de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la invención son útiles para el tratamiento de la infección, cáncer, alergia, asma, una afección inflamatoria, o una enfermedad autoinmune.
5 Los oligonucleótidos inmunomoduladores también son útiles en algunos aspectos de la invención para el tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar alergia o asma, una infección con un organismo infeccioso, o cáncer. Un sujeto en riesgo, como se usa en la presente es un sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a una infección causada por un patógeno o un cáncer o un alergeno o un riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un tema que está planeando viajar a un área donde se halla un determinado tipo de agente infeccioso o
10 puede ser un sujeto que debido a su estilo de vida o los procedimientos médicos está expuesto a fluidos corporales que pueden contener organismos infecciosos o directamente al organismo o incluso cualquier sujeto que vive en un área donde se ha identificado un organismo infeccioso o un alérgeno. Los sujetos con riesgo de desarrollar infección incluyen también poblaciones generales en que una organización médica recomienda la vacunación con un antígeno de microorganismo infeccioso particular. Si el antígeno es un alergeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a
15 ese antígeno particular y el sujeto puede estar expuesto al antígeno, es decir, durante la temporada de polen, entonces este sujeto está en riesgo de exposición al antígeno. Un sujeto en riesgo de desarrollar alergia o asma incluye los sujetos que han sido identificados como portadores de alergia o asma, pero que no tienen la enfermedad activa durante el tratamiento con oligonucleótidos inmunomoduladores, así como los sujetos que se consideran en riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a factores genéticos o ambientales.
20 Un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer es uno que tiene una alta probabilidad de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anormalidad genética, cuya presencia se ha demostrado que tiene una relación correlativa con una probabilidad más alta de desarrollar un cáncer y sujetos expuestos a agentes causantes de cáncer tales como tabaco, amianto u otras toxinas químicas, o un sujeto que ya ha sido tratado por cáncer y está en remisión aparente. Cuando un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer se trata con un antígeno
25 específico para el tipo de cáncer a la que el sujeto está en riesgo de desarrollar y un oligonucleótido inmunoestimulador CpG, el sujeto puede ser capaz de matar a las células cancerosas a medida que desarrollan. Si un tumor comienza a formarse en el sujeto, el sujeto desarrollará una respuesta inmunitaria específica contra el antígeno tumoral.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en
30 respuesta a un alergeno. Una alergia se refiere a la hipersensibilidad adquirida frente a una sustancia (alergeno). Las afeccioness alérgicas incluyen, pero sin limitación eccema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (erupción) y alergias alimentarias y otras enfermedades atópicas.
Las alergias son causadas generalmente por la generación de anticuerpos IgE contra alergenos inofensivos. Las citoquinas que son inducidas por la administración sistémica o en la mucosa de oligonucleótidos 35 inmunomoduladores son predominantemente de una clase llamada Th1 (los ejemplos son IL-12, IP-10, IFN-α e IFNγ) y estas inducen respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares. El otro tipo principal de respuesta inmunitaria, que está asociada con la producción de citoquinas IL-4 e IL-5, se denomina respuesta inmune Th2. En general, parece que las enfermedades alérgicas están mediadas por respuestas inmunes de tipo Th2. Sobre la base de la capacidad del oligonucleótido inmunomodulador para cambiar la respuesta inmune en un sujeto de una
40 respuesta predominantemente T h2 (que está asociada con la producción de anticuerpos IgE y alergia) a una respuesta Th2/Th1 equilibrada (que es protectora contra reacciones alérgicas), se puede administrar una dosis efectiva para inducir una respuesta inmune de un oligonucleótido inmunomodulador a un sujeto para tratar o prevenir el asma y la alergia.
Por lo tanto, los oligonucleótidos inmunomoduladores tienen utilidad terapéutica significativa en el tratamiento de las
45 afecciones alérgicas y no alérgicas tales como el asma. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5 están elevadas en las vías respiratorias de los sujetos asmáticos. Estas citoquinas promueven aspectos importantes de la respuesta inflamatoria asmática, que incluye el cambio de isótopos de IgE, quimiotaxis y activación de eosinófilos y el crecimiento de los mastocitos. Las citoquinas Th1, especialmente IFN-γ e IL-12 pueden suprimir la formación de clones Th2 y la producción de citoquinas Th2. El asma se refiere a un trastorno del sistema respiratorio
50 caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y el aumento de la reactividad de las vías respiratorias a los agentes inhalados. El asma con frecuencia, aunque no exclusivamente se asocia con síntomas atópicos o alérgicos.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención también se pueden administrar en conjunto con una terapia antialérgica. Los procedimientos convencionales para tratar o prevenir la alergia han implicado el uso de 55 medicamentos o terapias de desensibilización de la alergia. Algunas terapias en desarrollo para el tratamiento o la prevención de la alergia incluyen el uso de anticuerpos neutralizantes anti-IgE. Los antihistamínicos y otros fármacos que bloquean los efectos de los mediadores químicos de la reacción alérgica ayuda a regular la gravedad de los síntomas alérgicos, pero no previenen la reacción alérgica y no tienen efecto en las respuestas alérgicas posteriores. Las terapias de desensibilización se realizan mediante la administración de pequeñas dosis de un alergeno, 60 generalmente por inyección debajo de la piel, con el fin de inducir una respuesta de tipo IgG contra el alergeno. Se considera que la presencia de anticuerpos IgG ayuda a neutralizar la producción de mediadores resultantes de la
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inducción de anticuerpos IgE. Inicialmente, el sujeto se trata con una dosis muy baja de alergeno para evitar la inducción de una reacción grave y la dosis se aumenta lentamente. Este tipo de terapia es peligrosa porque al sujeto se le administra en efecto los compuestos que causan la respuesta alérgica y se pueden producir reacciones alérgicas graves.
5 Los medicamentos antialérgicos incluyen, pero sin limitación, antihistamínicos, corticosteroides, e inductores de prostaglandina. Los antihistamínicos son compuestos que contrarrestan la histamina liberada por los mastocitos o basófilos. Estos compuestos son bien conocidos en la técnica y se usan comúnmente para el tratamiento de la alergia. Los antihistamínicos incluyen, pero sin limitación, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina,
10 desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratadina, metscopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina, y tranilast.
Los corticosteroides incluyen, pero sin limitación, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, beclometasona, budesonida, dexametasona, flunisolida, propionato de fluticasona y triamcinolona. Aunque la dexametasona es un corticosteroide que tiene acción antiinflamatoria, no se utiliza regularmente para el tratamiento de alergia o asma en 15 una forma inhalada porque es altamente absorbida y tiene efectos secundarios supresores a largo plazo a una dosis efectiva. La dexametasona, sin embargo, se puede utilizar de acuerdo con la invención para el tratamiento de la alergia o el asma porque cuando se administra en combinación con una composición de la invención se puede administrar a una dosis baja para reducir los efectos secundarios. Algunos de los efectos secundarios asociados con el uso de corticosteroides incluyen tos, disfonía, muguet oral (candidiasis), y en dosis más altas, los efectos
20 sistémicos, tales como la supresión suprarrenal, intolerancia a la glucosa, osteoporosis, necrosis aséptica de hueso, formación de cataratas, supresión del crecimiento, hipertensión, debilidad muscular, adelgazamiento de la piel y propensión a los hematomas. Bames y Peterson (1993) Am Rev Respir Dis 148: S1-S26; y Kamada AK et al. (1996) Am. J. Respir Crit Care Med 153:1739-48.
Los oligonucleótidos y los procedimientos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otros agentes
25 y procedimientos útiles para el tratamiento del asma. En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene asma. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene asma una cantidad efectiva de una composición de la invención para tratar el sujeto.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene asma. El
30 procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene asma una cantidad efectiva de la composición de la invención y una terapia anti-asma para tratar el sujeto.
"Asma" tal como se utiliza en la presente se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por la inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias, y aumento de la reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma con frecuencia, aunque no exclusivamente, se asocia con una afección alérgica o 35 atópica. Los síntomas del asma incluyen episodios recurrentes de sibilancias, disnea, opresión torácica y tos, como resultado de la obstrucción al flujo aéreo. La inflamación de las vías respiratorias asociada con el asma se puede detectar mediante la observación de una serie de cambios fisiológicos, tales como, la denudación de epitelio de las vías respiratorias, depósito de colágeno por debajo de la membrana basal, edema, activación de mastocitos, infiltración de células inflamatorias, que incluyen neutrófilos, eosinófilos y linfocitos. Como resultado de la inflamación
40 de las vías respiratorias, los pacientes con asma a menudo experimentan hiperreactividad, limitación del flujo de aire, síntomas respiratorios y cronicidad de la enfermedad. Las limitaciones de flujo de aire incluyen broncoconstricción aguda, edema de las vías respiratorias, formación de tapón mucoso, y remodelación de las vías respiratorias, características que a menudo llevan a la obstrucción bronquial. En algunos casos de asma, se puede producir fibrosis de la membrana sub-basal, lo que lleva a anormalidades persistentes de la función pulmonar.
45 Las investigaciones realizadas durante los últimos años han revelado que el asma probablemente resulta de las interacciones complejas entre las células inflamatorias, mediadores y otras células y tejidos residente en las vías respiratorias. Los mastocitos, eosinófilos, células epiteliales, macrófagos, y células T activadas cumplen un papel importante en el proceso inflamatorio asociado con el asma. Djukanovic R et al. (1990) Am Rev Respir Dis 142:434
457. Se considera que estas células pueden influir en la función de las vías respiratorias a través de la secreción de
50 mediadores preformados y recién sintetizados que pueden actuar directa o indirectamente en el tejido local. También se ha reconocido que las subpoblaciones de linfocitos T (Th2) cumplen un papel importante en la regulación de la inflamación alérgica en las vías respiratorias mediante la liberación de citoquinas selectivas y el establecimiento de cronicidad de la enfermedad. Robinson DS et al. (1992) N Engl J Mod 326:298-304.
El asma es una enfermedad compleja que surge en diferentes etapas de desarrollo y se pueden clasificar en función
55 del grado de los síntomas como aguda, subaguda o crónica. Una respuesta inflamatoria aguda se asocia con un reclutamiento temprano de las células en las vías respiratorias. La respuesta inflamatoria subaguda implica el reclutamiento de células, así como la activación de células residentes, lo que causa un patrón más persistente de la inflamación. La respuesta inflamatoria crónica se caracteriza particularmente por un nivel persistente de daño celular y un proceso de reparación en curso, que puede producir alteraciones permanentes en las vías respiratorias.
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Un "sujeto que tiene asma" es un sujeto que tiene un trastorno del sistema respiratorio que se caracteriza por la inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias y aumento de la reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. Los factores asociados con la iniciación de asma incluyen, pero sin limitación, alergenos, temperatura fría, ejercicio, infecciones virales, y SO2.
5 Como se mencionó anteriormente, el asma se puede asociar con un tipo Th2 de la respuesta inmune, que se caracteriza, al menos en parte por las citoquinas Th2 IL-4 y IL-5, así como el cambio de isotipos del anticuerpo a IgE. Las respuestas inmunes Th1 y Th2 son mutuamente contra-regulatorias, de modo que el sesgo de la respuesta inmune hacia un tipo Th1 de la respuesta inmune puede prevenir o mejorar una de tipo Th2 de la respuesta inmune, que incluyen alergia. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención por lo tanto son útiles por sí mismos
10 para tratar a un sujeto que tiene el asma debido a que los análogos pueden sesgar la respuesta inmune hacia un tipo de respuesta inmunitaria Th1. En forma alternativa o adicional, los análogos de oligorribonucleótidos modificados de la invención se pueden utilizar en combinación con un alergeno para tratar un sujeto que tiene asma.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención también se pueden administrar en combinación con una terapia del asma. Los procedimientos convencionales para tratar o prevenir el asma han implicado el uso de las
15 terapias antialérgicas (descritas anteriormente) y otros diversos agentes, que incluyen agentes inhalados.
Los medicamentos para el tratamiento del asma se separan generalmente en dos categorías, los medicamentos de alivio rápido y medicamentos de control a largo plazo. Los pacientes con asma toman los medicamentos de control a largo plazo en forma diaria para lograr y mantener el control del asma persistente. Los medicamentos de control a largo plazo incluyen agentes antiinflamatorios como los corticosteroides, cromolina de sodio y nedocromilo;
20 broncodilatadores de acción prolongada, tales como agonistas β y metilxantinas de acción prolongada; y modificadores de leucotrienos. Los medicamentos de alivio rápido son de agonistas β2 de acción corta, anticolinérgicos y corticosteroides sistémicos. Existen muchos efectos secundarios asociados con cada uno de estos medicamentos y ninguno de los fármacos solos o en combinación es capaz de prevenir o tratar el asma completamente.
25 Los medicamentos anti-asma incluyen, pero sin limitación, inhibidores de PDE-4, broncodilatadores/ agonistas beta2, agentes de apertura de canal de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neuroquina, inhibidores de la síntesis de tromboxano A2 (TXA2), xantinas, antagonistas del ácido araquidónico, inhibidores de 5 lipoxigenasa, antagonistas de los receptores de TXA2, antagonistas de TXA2, inhibidor de proteínas de activación 5-lipox, e inhibidores de proteasa.
30 Los broncodilatadores/agonistas β2 son una clase de compuestos que causan broncodilatación o relajación del músculo liso. Bronchodilator/β2 agonistas incluyen, pero sin limitación, salmeterol, salbutamnol, albuterol, terbutalina, D2522/formoterol, fenoterol, bitolterol, metilxantinas pirbuerol y orciprenalina. Los broncodilatadores y agonistas β2 de acción prolongadas son compuestos que se utilizan para la prevención a largo plazo de los síntomas además de las terapias antiinflamatorias. Los agonistas de acción prolongada incluyen, pero sin limitación,
35 salmeterol y albuterol. Estos compuestos se utilizan generalmente en combinación con corticosteroides y en general no se utilizan sin ninguna terapia inflamatoria. Ellos se han asociado con efectos secundarios tales como taquicardia, temblor muscular esquelético, hipopotasemia, y prolongación del intervalo QTc en la sobredosis.
Las metilxantinas, que incluyen, por ejemplo, teofilina, se han utilizados para el control a largo plazo y la prevención de los síntomas. Estos compuestos causan broncodilatación resultante de la inhibición de la fosfodiesterasa y 40 probablemente antagonismo de adenosina. Las toxicidades agudas relacionadas con la dosis son un problema particular con este tipo de compuestos. Como resultado, la concentración de suero de rutina se debe controlar con el fin de tener en cuenta la toxicidad y el estrecho rango terapéutico que surge de las diferencias individuales en la depuración metabólica. Los efectos secundarios incluyen taquicardia, taquiarritmias, náuseas y vómitos, estimulación del sistema nervioso central, cefalea, convulsiones, hematemesis, hiperglucemia e hipopotasemia. Los
45 agonistas β2 de acción corta incluyen, pero sin limitación, albuterol, bitolterol, pirbuterol, y terbutalina. Algunos de los efectos adversos asociados con la administración de agonistas β2 de acción corta incluyen taquicardia, temblor muscular, hipopotasemia, aumento del ácido láctico, cefalea, e hiperglucemia.
La cromolina de sodio y el nedocromilo se utilizan como medicamentos de control a largo plazo para principalmente la prevención de los síntomas del asma procedentes del ejercicio o síntomas alérgicos derivados de alergenos. Se
50 considera que estos compuestos bloquean reacciones tempranas y tardías a los alergenos al interferir en la función del canal de cloruro. Ellos también estabilizan las membranas de los mastocitos e inhiben la activación y la liberación de mediadores en eosinófilos y células epiteliales. Se requiere por lo general un período de administración de cuatro a seis semanas para lograr un beneficio máximo.
Los anticolinérgicos se utilizan generalmente para el alivio del broncoespasmo agudo. Se considera que estos
55 compuestos funcionan por inhibición competitiva de los receptores colinérgicos muscarínicos. Los anticolinérgicos incluyen, pero sin limitación, bromuro de ipratropio. Estos compuestos invierten solo el broncoespasmo mediado colnérgicamente y no modifican ninguna reacción al antígeno. Los efectos secundarios incluyen sequedad de la boca y secreciones respiratorias, aumento de las sibilancias en algunas personas, y visión borrosa si se rocían en los ojos.
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Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias. La remodelación de las vías respiratorias proviene de la proliferación de células del músculo liso y/o engrosamiento de la submucosa en las vías respiratorias, y finalmente, causa el estrechamiento de las vías respiratorias que conducen al flujo de aire restringido. Los oligonucleótidos
5 inmunomoduladores de la invención puede prevenir la remodelación posterior y, posiblemente, incluso reducir la acumulación de tejido resultante del proceso de remodelación.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención también pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer. Un sujeto que tiene un cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen pero sin limitación cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; 10 cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular, cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una forma de realización, el cáncer es la leucemia de células
15 pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia de células T cutánea, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de vejiga, o carcinoma de colon.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden administrar solos o en combinación con una terapia anticáncer. Las terapias anticáncer incluyen, pero no sin limitación terapia de radiación, quimioterapia, inmunoterapia, una 20 vacuna contra el cáncer, terapia hormonal, un modificador de la respuesta biológica, y procedimientos quirúrgicos. Un medicamento de cáncer se refiere a un agente que se administra a un sujeto para el propósito de tratar un cáncer. Como se usa en la presente, "tratamiento del cáncer" incluye la prevención del desarrollo de un cáncer, reducción de los síntomas de cáncer, y/o inhibición del crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento del cáncer se administra a un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer con el fin de reducir el riesgo
25 de desarrollar el cáncer. Varios tipos de medicamentos para el tratamiento de cáncer se describen en la presente. Para el propósito de esta memoria descriptiva, los medicamentos de cáncer se clasifican como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas contra el cáncer, terapia hormonal, y modificadores de la respuesta biológica.
Además, los procedimientos de la invención están destinados a abarcar el uso de más de un medicamento del
30 cáncer junto con los oligonucleótidos inmunomoduladores. Como un ejemplo, cuando sea apropiado, los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden administrar tanto con un agente quimioterapéutico como un agente inmunoterapéutico. Alternativamente, el medicamento de cáncer puede abarcar un agente inmunoterapéutico y un vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico y una vacuna contra el cáncer, o un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico y un vacuna contra el cáncer, todos administrados a un sujeto con
35 el propósito de tratar a un sujeto que tiene un cáncer o en riesgo de desarrollar un cáncer.
El agente quimioterapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, cloroetilnitrosoureas que no contiene azúcar, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, meglamina GLA, valrubicina, carmustina y poliferposan, MMI270 BAY 12-9566, inhibidor de RAS farnesil transferasa, inhibidor de farnesil transferasa, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, 40 Glamolec, CI-994, TNP-470, ycamtin/topotecano, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxantrona, Metaret/Suramin, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, me ncel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/temozolomida, Evacet/doxorrubicina liposómica, Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeload/capecitabina, Furtulon/doxifluridina, 45 Cyclopax/paclitaxel oral, taxoide oral, SPU-077/Cisplatino, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor de oncogén RAS, BMS-182751/ platino oral, UFT (tegafur/uracilo), Ergamisol/Levamisol, potenciador Eniluracil/776C85/5FU, Campto/Levamisol, amptosar/irinotecano, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/cladribina, Paxex/paclitaxel, Doxil/doxorrubicina liposómica, Caelyx/doxorrubicina liposómica, Fludara/fludarabina, Pharmarubicina/epirrubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastatina, 50 Caetyx/doxorrubicina liposómica, Gemzar/gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, IFES/Mesnex/ifosamida, Vumon/Tenipósido, Paraplatino/carboplatino, plantinol/ cisplatino, Vepeside/etopósido, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, profármaco de arabinósido de guanina, análogo de taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes tales como melfelan y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfano, carboplatino, Clorambucilo, citarabina HCl, dactinomicina, HCl 55 daunorrubicina, estramustina fosfato de sodio, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5 -FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón alfa-2a, Alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo del factor liberador de LHRH), lomustina (CCNU), mecloretamina HCl (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, Mesna, mitotano (o.p’-DDD), mitoxantrona HCl, octreotida, plicamicina, Procarbazina HCl, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidina, eritropoyetina,
60 Hexametilmelamina (HMM ), interleuquina 2, mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guan-ilhidrazona; MGBG), pentostatina (2'deoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU), tenipósido (VM-26) y sulfato de vindesina, pero sin limitación.
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El agente inmunoterapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en Ributaxin, Herceptina, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELlMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C,
5 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab y ImmuRAIT-CEA, pero sin limitación a estos.
La vacuna contra el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en EGF, vacunas contra el cáncer antiidiotípicos, antígeno gp75, vacuna contra el melanoma GMK, vacuna de conjugado de gangliósido MGV, Her2/neu, OvaRex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn KHL Theratope, BLP25 (MUC-1), vacuna idiotípica liposómica, Melacina,
10 vacunas de antígenos peptídicos, vacunas contra toxina/antígeno, vacuna basada en MVA, PACIS, vacuna BCG, TA-HPV, TA-ClN, DISC-virus y ImmuCyst/TheraCys, pero sin limitación a estos.
Como se usan en la presente, los términos "antígeno de cáncer" y "antígeno tumoral" se utilizan indistintamente para referirse a antígenos que se expresan en forma diferencial en las células cancerosas y por lo tanto, se pueden aprovechar con el fin de dirigirse a las células cancerosas. Los antígenos de cáncer son antígenos que 15 potencialmente pueden estimular aparentemente respuestas inmunes específicas de los tumores. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente se expresan en las células normales. Estos antígenos se pueden caracterizar como los que son normalmente silentes (es decir, no expresado) en las células normales, los que se expresan solo en ciertas etapas de la diferenciación y los que se expresan en forma temporaria tales como antígenos embrionarias y fetales. Otros antígenos del cáncer son codificados por genes celulares mutantes, tales
20 como oncogenes (por ejemplo, oncogen ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de supresiones internas o translocaciones cromosómicas. Sin embargo, otros antígenos del cáncer pueden ser codificados por los genes virales, como los portados en los virus ARN y ADN tumorales.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención en algunos aspectos también se pueden usar para tratar o prevenir infecciones con virus, bacterias, hongos o parásitos. Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que ha 25 sido expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden usar con o sin un antígeno para montar una respuesta inmune sistémica o mucosa específica del antígeno que es capaz de reducir el nivel de o la erradicación del patógeno infeccioso. Una enfermedad infecciosa, como se usa en la presente, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo. Es particularmente importante desarrollar estrategias de vacunas
30 efectivas y tratamientos para proteger las superficies mucosas del cuerpo, que son el sitio principal de entrada de patógenos.
Los virus son agentes infecciosos pequeños que contienen generalmente un núcleo de ácido nucleico y una capa de proteína, pero no son organismos que viven de forma independiente. Los virus también pueden adoptar la forma de ácidos nucleicos infecciosos que carecen de una proteína. Un virus no puede sobrevivir en ausencia de una célula 35 viva dentro de la cual se puede replicar. Los virus entran en las células vivas específicas, ya sea por endocitosis o inyección directa de ADN (fagos) y se multiplican, lo que causa la enfermedad. El virus multiplicado luego se puede liberar e infectar células adicionales. Algunos virus son los virus que contienen ADN y otros son los virus que contienen ARN. Los virus de ADN incluyen Pox, Herpes, Adeno, Papova, Parvo, y HepaADN. Los virus de ARN incluyen Picorna, Calici, Astro,Toga, Flavi, Corona, Paramyxo, Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, Filo, Boma, Reo,
40 y Retro. En algunos aspectos, la invención también intenta tratar enfermedades en las que los priones están implicados en la progresión de la enfermedad, tales como por ejemplo la encefalopatía espongiforme bovina (es decir, la enfermedad de las vacas locas, BSE) o la infección de tembladera en los animales, o la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en los seres humanos.
Los virus incluyen, pero sin limitación, los enterovirus (que incluyen, pero sin limitación, virus de la familia picor
45 naviridae, tales como el virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, virus ECHO), rotavirus, adenovirus, y virus de la hepatitis, tales como la hepatitis A, B, C, D y E. Los ejemplos específicos de los virus que se han encontrado en seres humanos incluyen pero sin limitación: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tal como el VIH-1 (también conocido como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III, y otras cepas, como el VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, los virus de la poliomielitis, virus de hepatitis A, enterovirus, virus de Coxsackie humano,
50 rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus
55 de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunya, flebovirus y virus Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus): Bimaviridae; HepaADNviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus variola, virus vaccinia, virus de la viruela); Iridoviridae (por ejemplo, virus
60 de la peste porcina africana); y otros virus, virus de laringotraqueobronquitis aguda, Alphavirus, herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de Nipah, el virus de Norwalk, virus del
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papiloma, virus parainfluenza, virus de gripe aviar, virus del SARS, Virus del Nilo Occidental.
La hepatitis viral es una inflamación del hígado que puede producir inflamación, sensibilidad a la palpación y algunas veces daño permanente en el hígado. Si la inflamación del hígado continúa al menos seis meses o más, se denomina como hepatitis crónica. Existen al menos cinco virus diferentes conocidos por causar hepatitis viral, que 5 incluyen hepatitis A, B, C, D y E. La hepatitis A se transmite generalmente a través de alimentos o agua de bebida contaminados con heces humanas. La hepatitis B generalmente se transmite a través de fluidos corporales tales como la sangre. Por ejemplo, puede transmitirse de madre a hijo en el nacimiento, a través del contacto sexual, transfusiones de sangre y agujas contaminadas. La hepatitis C es bastante común y como la hepatitis B a menudo se transmite a través de transfusiones de sangre y agujas contaminadas. La hepatitis D se encuentra más a menudo
10 en los usuarios de drogas intravenosas que son portadores del virus de la hepatitis B con el que se coasocia. La hepatitis E es similar a la hepatitis viral A y por lo general se asocia con instalaciones sanitarias deficientes.
Las bacterias grampositivas y gramnegativas sirven como antígenos en animales vertebrados. Tales bacterias grampositivas incluyen, pero sin limitación, especies de Pasteurella, especies de Staphylococci, y especies de Streptococcus. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero sin limitación a, Escherichia coli, especies de 15 Pseudomonas, y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero sin limitación, Helicobacter piloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus coccus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis,
20 Streptococcus bovis, Streptococcus (sps anaeróbicas.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campilobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia,y Actinomyces israelli.
25 Los ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale,y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos transmitidos por sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania
30 spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), y Toxoplasma gondii.
Otros microorganismos médicamente relevantes se ha descrito exhaustivamente en la bibliografía, por ejemplo, see
C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden administrar a un sujeto con un agente anti-microbiano. Un agente
35 antimicrobiano, como se usa en la presente, se refiere a un compuesto natural o sintético que es capaz de matar o inhibir los microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil de acuerdo con la invención dependerá del tipo de microorganismo con el que el sujeto está infectado o en riesgo de contraer la infección. Los agentes antimicrobianos incluyen pero sin limitación agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos y agentes antiparasitarios. Frases como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente
40 antifúngico", "agente antiparasitaria" y "parasiticida" tienen significados bien establecidos para los expertos en la técnica y se definen en los textos médicos estándares. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos, así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios en células, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren en una o más funciones o estructuras
45 bacterianas que son específicas para el microorganismo y que no están presentes en las células huésped. Los agentes antivirales se pueden aislar de fuentes naturales o sintetizarse y son útiles para matar o inhibir los virus. Los agentes antifúngico se utilizan para tratar las infecciones fúngicas superficiales, así como las infecciones fúngicas sistémicas oportunistas y primarias. Los agentes antiparasitarios matan o inhiben parásitos.
Ejemplos de agentes antiparasitarios, también se hace referencia como parasiticidas útiles para la administración
50 humana incluyen pero sin limitación albendazol, anfotericina B, benznidazol, bitionol, cloroquina HCl, fosfato de cloroquina, clindamicina, dehidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflomitina, furazolidaona, glucocorticoides, halofantrina, yodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanilo, pirantel, pirimetanmina-sulfonamidas,
55 pirimetanmina-sulfadoxina, quinacrina NCI, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato de sodio (gluconato de antimonio y sodio), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprimasulfametoxazol, y triparsamida algunos de los cuales se usan solos o en combinación con otros.
Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o la función de las bacterias. Una clase grande de agentes antibacterianos son los antibióticos. Los antibióticos, que son efectivos para matar o inhibir un amplio rango de bacterias, se denominan como antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos son predominantemente efectivos contra las bacterias de la clase grampositivas o gramnegativas. Estos tipos de antibióticos se conocen como antibióticos de espectro estrecho. Otros antibióticos que son efectivos contra un solo organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias, se denominan como antibióticos de espectro limitado.
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5 Los agentes antibacterianos a veces se clasifican sobre la base de su modo de acción primario. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteínas, inhibidores de síntesis de ácidos nucleicos o funcionales, y los inhibidores competitivos.
Los agentes antivirales son compuestos que previenen la infección de células por virus o la replicación del virus
10 dentro de la célula. Existen muchos menos fármacos antivirales que los fármacos antibacterianos porque el proceso de la replicación viral es tan estrechamente relacionado con la replicación del ADN dentro de la célula huésped, que los agentes antivirales no específicos a menudo puede ser tóxico para el huésped. Hay varias etapas dentro del proceso de infección viral que puede ser bloqueado o inhibido por agentes antivirales. Estas etapas incluyen, la fijación del virus a la célula huésped (inmunoglobulina o péptidos de unión), separación de la capa del virus (por
15 ejemplo amantadina), síntesis o traducción del ARNm viral (por ejemplo, interferón), replicación de ARN o ADN viral (por ejemplo, análogos de nucleótidos), maduración de las proteínas nuevas del virus (por ejemplo, inhibidores de la proteasa), y brotación y liberación del virus.
Los análogos de nucleótidos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen un grupo de desoxirribosa o ribosa incompleto o anormal. Una vez que los análogos de nucleótidos están en la célula, 20 se fosforilan, lo que produce el trifosfato formado que compite con los nucleótidos normales para su incorporación en el ADN o ARN viral. Una vez que la forma de trifosfato del análogo de nucleótido se incorpora en la cadena de ácido nucleico creciente, que causa asociación irreversible con la polimerasa viral y por lo tanto terminación de la cadena. Los análogos de nucleótidos incluyen, pero sin limitación, aciclovir (utilizado para el tratamiento del virus del herpes simple y el virus de la varicela-zoster), ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina
25 (útil para el tratamiento del virus sincitial respiratorio), dideoxiinosina, didesoxicitidina, zidovudina (azidotimidina), imiquimod, y resimiquimod.
Los interferones son citoquinas que son secretadas por las células infectadas por virus, así como las células inmunológicas. La función de los interferones mediante la unión a receptores específicos en las células adyacentes a las células infectadas, lo que causa el cambio en la célula que lo protege de la infección por el virus. El interferón α y
30 β también inducen la expresión de moléculas MHC de clase I y clase II en la superficie de las células infectadas, lo que produce el aumento de la presentación de antígenos para el reconocimiento de las células inmunitarias del huésped. Los interferones α y β están disponibles como formas recombinantes y se han utilizado para el tratamiento de la infección de hepatitis B y C crónica. En las dosis que son efectivas para la terapia antiviral, los interferones tienen efectos secundarios graves, como fiebre, malestar general y pérdida de peso.
35 Los agentes anti-virales útiles en la invención incluyen pero sin limitación inmunoglobulinas, amantadina, interferones, análogos de nucleótidos, y los inhibidores de proteasa. Los ejemplos específicos de antivirales incluyen pero sin limitación Acemannano; Aciclovir; Aciclovir sódico; Adefovir; Alovudina; Alvircept Sudotox; clorhidrato de amantadina; Aranotin; Arildona; mesilato de atevirdina; Avridina; Cidofovir; Cipamfilina; clorhidrato de citarabina; Mesilato de delavirdina; Desciclovir; Didanosina; Disoxarilo; Edoxudina; Enviradeno; Enviroxime; Famciclovir;
40 clorhidrato de Famotina; Fiacitabina; Fialuridina; Fosarilato; Foscarnet sódico; Fosfonet Sódico; Ganciclovir, Ganciclovir sódico; Idoxuridina; Ketoxal; Lamivudina; Lobucavir; Clorhidrato de Memotina; Metisazona; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirina; Clorhidrato de Rimantadina; Mesilato de Saquinavir; Clorhidrato de Somantadina; Sorivudina; Estatolon; Estavudina; Clorhidrato de Tilorona; Trifluridina; Clorhidrato de Valaciclovir; Vidarabina; fosfato de Vidarabina; Fosfato de Vidarabina sódico; Viroxime; Zalcitabina; Zidovudina; y Zinviroxime.
45 Los agentes antifúngicos son útiles para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifúngicos a veces se clasifican según su mecanismo de acción. Algunos agentes antifúngicos funcionan como inhibidores de la pared celular mediante la inhibición de la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero sin limitación, basiungin /ECB. Otros agentes antifúngicos actúan mediante la desestabilzación de la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero sin limitación, immidazoles, tales como clotrimazol, sertaconzol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol,
50 y voriconacol, así como FK 463, anfotericina B, Bay 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes antifúngicos actúan mediante la ruptura de la quitina (por ejemplo, quitinasa) o inmunosupresión (501 crema).
Los oligonucleótidos inmunomoduladores también pueden ser útiles para el tratamiento y prevención de la enfermedad autoinmune. La enfermedad autoinmune es una clase de enfermedades en las que los propios 55 anticuerpos de un sujeto reaccionan con tejido del huésped o en el que las células T efectoras inmunes son autorreactivas para péptidos propios endógenos y causan la destrucción del tejido. En consecuencia, una respuesta inmune se monta contra los antígenos propios del antígeno, denominados como autoantígenos. Las enfermedades autoinmunes incluyen, pero sin limitación alopecia areata, hemofilia adquirida, espondilitis anquilosante, síndromeantifosfolípido, infertilidad asociada autoinmune, encefalomielitis autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia 60 hemolítica autoinmune, diabetes mellitus autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, síndrome de Behçet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, fatiga crónica, síndrome de disfunción inmune (CFIDS), polineuropatía
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desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de churo-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad por crioaglutininas, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiosistis, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis semilunar, glomerulonefritis proliferativa), enfermedad de Grave, enfermedad del injerto versus huésped, síndrome
5 de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgar), fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, resistencia a la insulina, enfermedad idiopática de Addison, nefropatía por IgA, enfermedad inflamatoria del intestino (que incluye enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), artritis juvenil, liquen plano, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad mixta del tejido conectivo, polimiositis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide juvenil y adulta, síndrome de Sjorgen, esclerodermia con anticuerpos anti-colágeno, sarcoidosis, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico (LES), artritis de Takayasu, rechazo del órgano trasplantado, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, uveítis, colitis ulcerativa, vasculitis, y vitíligo.
Un "auto-antígeno" como se usa en la presente se refiere a un antígeno de un tejido huésped normal. El tejido
15 huésped normal no incluye células de cáncer. Por lo tanto una respuesta inmune montada contra un autoantígeno, en el contexto de una enfermedad autoinmune, es una respuesta inmune indeseable y contribuye a la destrucción y daño de tejido normal, mientras que una respuesta inmune montada contra un antígeno de cáncer es una respuesta inmune deseable y contribuye a la destrucción del tumor o cáncer. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invención destinados a tratar los trastornos autoinmunes, no se recomienda que los oligonucleótidos inmunomoduladores sean administrados con autoantígenos, particularmente aquellos que son el blanco de la enfermedad autoinmune.
En otros casos, los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden administrar con dosis bajas de autoantígenos. Diversos estudios de animales han demostrado que la administración en mucosa de dosis bajas de antígeno puede producir un estado de hiporreactividad inmune o "tolerancia". El mecanismo activo parece ser una desviación inmunomediada por citoquinas lejos de una respuesta Th1 a predominantemente Th2 y Th3 (es decir, dominada por 25 TGF-β). La supresión activa con la administración de una dosis baja de antígeno también puede suprimir una respuesta inmunitaria no relacionada (supresión del espectador) que es de considerable interés en la terapia de enfermedades autoinmunes, por ejemplo, la artritis reumatoide y SLE. La supresión del espectador implica la secreción de citoquinas supresores contra-regulatoria de Th1 en el ambiente local donde las citoquinas proinflamatorias y se liberan de manera específica de antígeno o no específica de antígeno. "Tolerancia" como se usa en la presente se utiliza para referirse a este fenómeno. En efecto, la tolerancia oral ha sido efectiva en el tratamiento de numerosas enfermedades autoinmunes en animales, que incluyen: encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), miastenia gravis autoinmune experimental, artritis inducida por colágeno (CIA), y diabetes mellitus dependiente de insulina. En estos modelos, la prevención y la supresión de la enfermedad autoinmune se asocia con un cambio en las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno de una respuesta Th1 a
35 Th2/Th3.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención son útiles en algunos aspectos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. Como se usa en la presente, el término "trastorno inflamatorio" se refiere a una afección asociada con una reacción no específica de antígeno del sistema inmune innato que implica la acumulación y activación de los leucocitos y las proteínas plasmáticas en un sitio de la infección, exposición a toxinas, o lesión celular. Las citoquinas que son característicos de la inflamación incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina 1 (IL-1), IL-6, IL-12, interferón alfa (IFN-α), interferón beta (IFN-β), y quimioquinas. Por lo tanto, ciertos tipos de asma, alergia, y trastornos autoinmunes pueden tener las características de un trastorno inflamatorio. Los trastornos inflamatorios incluyen también, por ejemplo, enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquiectasias, colecistitis crónica, tuberculosis, tiroiditis de Hashimoto, sepsis,
45 sarcoidosis, silicosis y otras neumoconiosis, y un cuerpo extraño implantado en una herida, pero sin limitaciones a estas. Como se usa en la presente, el término "sepsis" se refiere a un síndrome clínico bien reconocido asociado con una respuesta inflamatoria sistémica del huésped a la invasión microbiana. El término "sepsis" Como se usa en la presente, se refiere a una afección que normalmente se caracteriza por fiebre o hipotermia, taquicardia y taquipnea, y en casos graves puede progresar a la hipotensión, disfunción de órganos, e incluso la muerte.
Un "sujeto" se refiere a un ser humano o animal vertebrado, que incluye pero sin limitación un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pavo, pollo, primate, por ejemplo, el mono, y peces (especies acuícolas), por ejemplo, salmón. Por lo tanto, la invención también se puede utilizar para tratar cáncer y tumores, infecciones y alergia/ asma en sujetos no humanos. Por ejemplo, el cáncer es una de las principales causas de muerte en animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros).
55 Como se usa en la presente, el término tratar, tratado, o tratamiento cuando se utiliza con respecto a un trastorno tal como una enfermedad infecciosa, cáncer, alergia o asma se refiere a un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo, a la infección con un patógeno) o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle la enfermedad (por ejemplo, se infecte con el patógeno), así como un tratamiento después de que el sujeto ha desarrollado la enfermedad con el fin de combatir la enfermedad (por ejemplo, reducir o eliminar la infección) o impedir que la enfermedad empeore.
En los casos en los que el oligonucleótido inmunomodulador se administra con un antígeno, el sujeto puede ser
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expuesto al antígeno. Como se usa en la presente, el término expuesto a se refiere a la etapa activa de puesta en contacto del sujeto con un antígeno o a la exposición pasiva del sujeto al antígeno in vivo. Los procedimientos para la exposición activa de un sujeto a un antígeno son bien conocidos en la técnica. En general, un antígeno se administra directamente al sujeto por cualquier medio tal como administración intravenosa, intramuscular, oral, 5 transdérmica, mucosa, intranasal, intratraqueal, o subcutánea. El antígeno se puede administrar en forma sistémica
o local. Los procedimientos para administrar el antígeno y el oligonucleótido inmunomodulador se describen con más detalle a continuación. Un sujeto está expuesto pasivamente a un antígeno si un antígeno se halla disponible para la exposición a las células inmunes en el cuerpo. Un sujeto se puede exponer pasivamente a un antígeno, por ejemplo, por entrada de un patógeno extraño en el cuerpo o por el desarrollo de una célula tumoral que expresa un antígeno extraño en su superficie. El antígeno o alergeno en algunas formas de realización se conjuga con el oligonucleótido.
Los procedimientos en los que un sujeto se expone pasivamente a un antígeno pueden ser particularmente dependientes del tiempo de administración del oligonucleótido inmunomodulador. Por ejemplo, en un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer o una enfermedad infecciosa o una respuesta alérgica o asmática, al sujeto se puede administrar el oligonucleótido inmunomodulador de manera regular cuando ese riesgo es más grande, es decir,
15 durante la temporada de alergias o después exposición a un agente causante de cáncer. Además, el oligonucleótido inmunomodulador se puede administrar a los viajeros antes de viajar a tierras extranjeras donde están en riesgo de exposición a agentes infecciosos. Asimismo, los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden administrar a soldados o civiles con riesgo de exposición a guerra biológica para inducir una respuesta inmunitaria sistémica o de mucosa al antígeno cuando y si el sujeto está expuesto a ella.
Un antígeno como se usa en la presente es una molécula capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Los antígenos incluyen, pero sin limitación células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, miméticos de péptidos y no péptidos de polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glicolípidos, carbohidratos, virus y extractos virales y organismos muticelulares, tales como los parásitos y alergenos. El término antígeno en general incluye cualquier tipo de molécula que es reconocida por un
25 sistema inmunitario del huésped como extraña. Los antígenos incluyen pero sin limitación antígenos de cáncer, antígenos microbianos y alergenos.
Un antígeno de cáncer como se usa en la presente es un compuesto, tal como un péptido o proteína, asociado con la superficie de las células del tumor o cáncer y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se expresa en la superficie de una célula presentadora de antígeno en el contexto de una molécula de MHC. Los antígenos de cáncer se pueden preparar a partir de las células cancerosas, ya sea mediante la preparación de extractos crudos de células de cáncer, por ejemplo, como se describe en Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, mediante la purificación parcial de los antígenos, por tecnología recombinante, o por la síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos de cáncer incluyen, pero sin limitación, antígenos que se expresan de forma recombinante, una porción inmunogénica, o un tumor o cáncer total. Tales antígenos se pueden aislar o preparar de modo
35 recombinante o por cualquier otro medio conocido en la técnica.
Un antígeno microbiano como se usa en la presente es un antígeno de un microorganismo e incluye, pero sin limitación, virus, bacterias, parásitos y hongos. Tales antígenos incluyen el microorganismo intacto así como cepas naturales y fragmentos o derivados de los mismos y también compuestos sintéticos que son idénticos o similares a antígenos de microorganismos naturales e inducen una respuesta inmune específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a un antígeno de microorganismo natural si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) a un antígeno de microorganismo natural. Tales antígenos se usan de rutina en la técnica y son bien conocidos por los expertos normales en la técnica.
Un alérgeno se refiere a una sustancia (antígeno) que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insectos, polvo de caspa de 45 animales, esporas de hongos y fármacos (por ejemplo, penicilina). Ejemplos de alergenos, animales y vegetales naturales incluyen, pero sin limitación proteínas específicas para los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (por ejemplo Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por ejemplo Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder, Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Arternisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ejemplo Plantago lanceolata); Parietaria (por ejemplo Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blanella (por ejemplo Blattella germanica); Apis (por ejemplo Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo
55 Periplaneta americana); Agropiron (por ejemplo Agropiron repens); Secale (por ejemplo Secale cereale); Triticum (por ejemplo Triticum aestivum); Dactilis (por ejemplo Dactilis glomerata); Festuca (por ejemplo Festuca elatior); Poa (por ejemplo Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo Avena sativa); Holcus (por ejemplo Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo Agrostis alba); Phleum (por ejemplo Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo Sorghum halepensis); y Bromus (por ejemplo Bromus inermis).
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El término sustancialmente purificado como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está naturalmente asociado. Los expertos en la técnica pueden purificar polipéptidos virales o bacterianos usando técnicas estándares para la purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro a menudo producirá una única banda principal
5 en un gel de poliacrilamida no reductor. En el caso de polipéptidos parcialmente glicosilados o los que tienen varios codones de inicio, puede haber varias bandas en un gel de poliacrilamida no reductor, pero estos formarán un patrón distintivo para ese polipéptido. La pureza del polipéptido viral o bacteriano también se puede determinar por análisis de la secuencia de aminoácidos amino-terminal. Otros tipos de antígenos no codificados por un vector de ácido nucleico tales como polisacáridos, molécula pequeña, miméticos, etc se incluyen dentro de la invención.
10 Los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden combinar con otros agentes terapéuticos tales como adyuvantes para mejorar la respuesta inmune. El oligonucleótido inmunomodulador y otro agente terapéutico se pueden administrar en forma simultánea o secuencial. Cuando los otros agentes terapéuticos se administran simultáneamente, se pueden administrar en las mismas formulaciones o separadas, pero se administran al mismo tiempo. Los otros agentes terapéuticos se administran de forma secuencial entre sí y con un oligonucleótido
15 inmunomodulador, cuando se separa temporalmente la administración de los otros agentes terapéuticos y el oligonucleótido inmunomodulador. La separación en el tiempo entre las administraciones de estos compuestos puede ser una cuestión de minutos o puede ser más largo. Otros agentes terapéuticos incluyen pero sin limitación adyuvantes, citoquinas, anticuerpos, antígenos, etc.
Las composiciones de la invención también se pueden administrar con adyuvantes que no son ácidos nucleicos. Un
20 adyuvante no ácido nucleico es cualquier molécula o compuesto a excepción de los oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en la presente que pueden estimular la respuesta inmune humoral y/o celular. Los adyuvantes no ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, adyuvantes que crean un efecto depo, adyuvantes inmunoestimuladores y adyuvantes que crean un efecto depo y estimulan el sistema inmune.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores algunas formas de realización también son útiles como adyuvantes de la
25 mucosa. Previamente se ha descubierto que la la inmunidad sistémica y de la mucosa son inducidas por la administración de oligonucleótidos CpG. Por lo tanto, los oligonucleótidos se pueden administrar en combinación con otros aditivos de la mucosa.
Las respuestas inmunes también puede ser inducidas o aumentadas por la co-administración o la expresión de colineal de citoquinas (Bueler y Mulligan, 1996;. Chow et al, 1997; Geissler et al, 1997; Iwasaki et al, 1997. ; Kim et 30 al, 1997) o moléculas co-estimuladoras B-7 (Iwasaki et al, 1997;... Tsuji et al, 1997) con los oligonucleótidos inmunomoduladores. El término citoquina se usa como un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales en concentraciones de nano a picomolares y que, ya sea en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de las células y tejidos individuales. Estas proteínas también median las interacciones entre las células en forma directa y regulan los procesos que
35 tienen lugar en el ambiente extracelular. Los ejemplos de citoquinas incluyen, pero sin limitación IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferón-γ (IFN-γ), IFN-α, factor de necrosis tumoral (TNF), TGF-R, ligando FLT-3 y ligando de CD40.
Los oligonucleótidos también son útiles para redirigir una respuesta inmune a una respuesta inmune Th2 a una
40 respuesta inmune Th1. Esto da como resultado la producción de un ambiente Th1/Th2 relativamente equilibrado. La redirección de una respuesta inmune Th2 a una Th1 se puede evaluar mediante la medición de los niveles de citoquinas producidas en respuesta al oligonucleótido (por ejemplo, mediante la inducción de las células monocíticas y otras células para producir las citoquinas Th1, que incluyen IL-12, IFN-γ y GM-CSF). La redirección o reequilibrio de la respuesta inmune de una respuesta Th2 a una Th1 es particularmente útil para el tratamiento o prevención del
45 asma. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar el asma puede ser esa cantidad; útil para redirigir un respuesta inmune tipo Th2 que está asociada con el asma a un tipo de respuesta Th1 o un ambiente Th1/Th2 equilibrada. Las citoquinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5 son elevados en las vías respiratorias de los sujetos asmáticos. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la invención causan un aumento en las citoquinas Th1 que ayuda a reequilibrar el sistema inmune, lo que previene o reduce los efectos adversos asociados con una respuesta
50 inmunitaria predominantemente Th2.
Los oligonucleótidos de la invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias. La remodelación de las vías respiratorias resulta de la proliferación de células de músculo liso y/o engrosamiento de la submucosa de las vías respiratorias, y finalmente provoca el estrechamiento de las vías respiratorias que conducen al flujo de aire restringido. Los oligonucleótidos de la invención también pueden prevenir
55 la remodelación y posiblemente incluso reducir la acumulación de tejido resultante del proceso de remodelación.
Los oligonucleótidos también son útiles para mejorar la supervivencia, diferenciación, activación y maduración de las células dendríticas. Los oligonucleótidos inmunomoduladores tienen la capacidad única de promover la supervivencia celular, diferenciación, activación y maduración de las células dendríticas.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores también aumentan la actividad lítica de las células citolíticas naturales y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). ADCC se puede realizar utilizando un oligonucleótido inmunomodulador en combinación con un anticuerpo específico para un blanco celular, tal como una célula de cáncer. Cuando el oligonucleótido inmunomodulador se administra a un sujeto en combinación con el anticuerpo, el sistema inmune del sujeto es inducido a matar la célula tumoral. Los anticuerpos útiles en el procedimiento de la
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5 ADCC incluyen anticuerpos que interaccionan con una célula en el cuerpo. Muchos de estos anticuerpos específicos para blancos celulares se han descrito en la técnica y muchos están disponibles en el comercio.
La invención también incluye un procedimiento para inducir la activación inmune innata no específica del antígeno y la resistencia de amplio espectro a la provocación infecciosa utilizando los oligonucleótidos inmunomoduladores. El término activación inmunológica innata no específica del antígeno como se usa en la presente, se refiere a la 10 activación de las células inmunes distintas de las células B y por ejemplo puede incluir la activación de las células NK, células T u otras células inmunes que pueden responder de una manera independiente de antígeno o alguna combinación de estas células. La resistencia de amplio espectro a la provocación infecciosa es inducida debido a que las células inmunes están en forma activa y están preparadas para responder a cualquier compuesto o microorganismo invasor. Las células no deben prepararse específicamente contra un antígeno particular. Esto es 15 particularmente útil en la guerra biológica, y las otras circunstancias descritas anteriormente, tales como los viajeros.
El ODN inmunoestimulador de la invención se puede combinar con un lípido catiónico. En una forma de realización, el lípido catiónico es DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi) propil-I]-N,N,N-trimetilamonio metil-sulfato). Se considera que DOTAP transporta los polímeros en las células y, específicamente, el tránsito hacia el compartimiento endosómico, donde puede liberar el polímero de una manera dependiente del pH. Una vez en el compartimiento endosómico, los 20 polímeros pueden interactuar con ciertos TLRs intracelulares, desencadenar las vías de transducción de señal mediada por TLR involucrados en la generación de una respuesta inmune. Otros agentes con propiedades similares, que incluyen el tránsito al compartimiento endosómico se pueden utilizar en lugar de o además de DOTAP. Otras formulaciones de lípidos incluyen, por ejemplo, EFFECTENE® (un lípido no liposómico con un potenciador de la condensación de ADN especial) y SUPERFECT® (una nueva tecnología de acción dendrimérica), SMARTICLES ® 25 (partículas de carga reversible que se convierten en carga positiva cuando cruzan las membranas celulares) y partícula de lípidos de ácidos nucleicos estables (SNALPs) que emplean una bicapa lipídica. Los liposomas están disponibles en el comercio de Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN® y LIPOFECTACETM que se forman de lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3 dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetil dioctadecilamonio (DDAB). Los procedimientos para preparar liposomas son bien conocidos en la técnica y
30 se han descrito en muchas publicaciones. Los liposomas también han sido revisados por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241. En otras formas de realización los polímeros inmunoestimuladores de la invención se combinan con micropartículas, ciclodextrinas, nanopartículas, niosomas, dendrímeros, péptidos policitiónicos, virosomas y partículas tipo virus, o ISCOMSC ®.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden administrar directamente al sujeto o se pueden administrar
35 conjuntamente con un complejo de liberación del oligonucleótido. Un complejo de liberación de oligonucleótido significará una molécula de oligonucleótido asociada con (por ejemplo, unida en forma iónica o covalente a; o encapsulada dentro de) un medio de direccionamiento (por ejemplo, una molécula que produce mayor afinidad de unión a la célula blanco. Los ejemplos de complejos de liberación de oligonucleótidos incluyen oligonucleótidos asociados con un esterol (por ejemplo, colesterol), un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico, virosoma o liposoma), o
40 un agente de unión específico de la célula blanco (por ejemplo, un ligando reconocido por un receptor específico de la célula blanco). Los complejos preferidos pueden ser suficientemente estables in vivo para prevenir un desacoplamiento significativo antes de la internalización en la célula blanco. Sin embargo, el complejo puede ser escindible en condiciones apropiadas dentro de la célula de modo que el oligonucleótido se libera en una forma funcional.
45 Se han descrito los vehículos de liberación o dispositivos de liberación para la liberación del antígeno y oligonucleótidos a las superficies. El oligonucleótido inmunomodulador y/o el antígeno y/u otros agentes terapéuticos se pueden administrar solos (por ejemplo, en solución salina o buffer) o empleando cualquier de vehículos de liberación conocido en la técnica. Por ejemplo, se han descrito los siguientes vehículos de liberación: cocleatos; Emulsomes ®; ciertos lípidos catiónicos tales como los mencionados anteriormente, por ejemplo ISCOM ®; vectores
50 bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guérin, Shigella, Lactobacillus); vectores de virus vivos (por ejemplo, vaccinia, adenovirus, herpes simple); microesferas; vacunas de ácidos nucleicos; polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosano); anillos de polímero; proteosomas; fluoruro de sodio; plantas transgénicas. En algunas formas de realización de la invención, el vehículo de liberación es un liposoma, un niosoma, una lipoplexo, un poliplexo, un lipopolipexo, una emulsión de agua-en-aceite (W/O), una
55 emulsión de aceite-en-agua (O/W), una emulsión múltiple agua-en-aceite-en agua (W/O/W), una microemulsión, una nanoemulsión, una micela, un dendrímero, un virosoma, una partícula tipo virus, una nanopartícula polimérica, como una nanoesferas o nanocápsula, una micropartícula polimérica, tal como una microesfera o una microcápsula. Otros vehículos de liberación se conocen en la técnica.
El término "cantidad efectiva" de un oligonucleótido inmunomodulador se refiere a la cantidad necesaria o suficiente
60 para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un oligonucleótido inmunomodulador administrada con un antígeno para inducir la inmunidad de la mucosa es la cantidad necesaria
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para provocar el desarrollo de IgA en respuesta a un antígeno después de la exposición al antígeno, mientras que la cantidad requerida para la inducción de inmunidad sistémica es la cantidad necesaria para provocar el desarrollo de IgG en respuesta a un antígeno después de la exposición al antígeno. En combinación con las enseñanzas proporcionadas en la presente, mediante la elección entre los diversos compuestos activos y factores de 5 ponderación tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, la gravedad de los efectos secundarios adversos y modo de administración preferido, se puede planificar un régimen de tratamiento profiláctico
o terapéutico efectivo que no causa toxicidad sustancial y aún es totalmente efectivo para tratar el sujeto particular. La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar de acuerdo con factores tales como la enfermedad o afección que se trata, el oligonucleótido inmunomodulador particular que se administra, el tamaño del sujeto, o la gravedad de la enfermedad o afección. Los expertos en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de un oligonucleótido inmunomodulador y/o antígeno y/u otro agente terapéutico particular sin necesidad de experimentación indebida.
Las dosis objeto de los compuestos descritos en la presente para la mucosa o la liberación local normalmente varían de aproximadamente 0,1 µg a 10 mg por administración, que de acuerdo con la aplicación se pueden administrar en 15 forma diaria, semanal, o mensual y cualquier otra cantidad de tiempo entre los mismos. Más típicamente, las dosis en mucosa o locales varían de aproximadamente 10 µg a 5 mg por administración, y más típicamente aún de aproximadamente 100 µg a 1 mg, con 2 -4 administraciones en días o semanas separadas. Más típicamente, las dosis de inmunoestimulador varían de 1 µg a 10 mg por administración, y más típicamente aún de 10 µg a 1 mg, con administraciones diarias o semanales. Las dosis presentes de los compuestos descritos en la presente para la administración parenteral con el fin de inducir una respuesta inmune específica de antígeno, en el que los compuestos se administran con un antígeno pero no con otro agente terapéutico son típicamente de 5 a 10.000 veces más altas que la dosis efectiva de mucosa para el adyuvante de vacuna o aplicaciones inmunoestimuladores, y más típicamente 10 a 1000 veces mayor, y más típicamente aún de 20 a 100 veces mayor. Las dosis de los compuestos descritos en la presente para la administración parenteral con el fin de inducir una respuesta inmune
25 innata o para aumentar la ADCC o para inducir una respuesta inmune específica de antígeno cuando los oligonucleótidos inmunomoduladores se administran en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de liberación especializados típicamente varían de aproximadamente 0,1 mg a 0,1 µg a 10 mg por administración, que de acuerdo con la aplicación se puede administrar en forma diaria, semanal, o mensual y cualquier otra cantidad de tiempo entre los mismos. Más típicamente las dosis parenterales para estos fines varían de aproximadamente 10 µg a 5 mg por administración, y más típicamente aún de aproximadamente 100 µg a 1 mg, con 2 -4 administraciones en días o semanas separadas. En algunas formas de realización, sin embargo, las dosis parenterales para estos fines se pueden usar en un rango de 5 a 10.000 veces alto que las dosis típicas descritas anteriormente.
Para cualquier compuesto descrito en la presente, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede determinar
35 inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente efectiva también se puede determinar a partir de datos humanos para los oligonucleótidos que se han probado en seres humanos (se han iniciado ensayos clínicos en seres humanos) y para los compuestos que se sabe que muestran actividades farmacológicas similares, tales como otros adyuvantes, por ejemplo, LT y otros antígenos para los propósitos de vacunación. Las dosis más altas pueden ser necesarias para la administración parenteral. La dosis aplicada se puede ajustar sobre la base de la biodisponibilidad relativa y potencia del compuesto administrado. El ajuste de la dosis para conseguir una eficacia máxima sobre la base de los procedimientos descritos anteriormente y otros procedimientos bien conocidos en la técnica están dentro de las capacidades de los profesionales expertos.
Las formulaciones de la invención se administran en soluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener de rutina concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes buffer, conservantes, portadores
45 compatibles, adyuvantes, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
Para uso en terapia, una cantidad efectiva del oligonucleótido inmunomodulador se puede administrar a un sujeto por cualquier modo que libera el oligonucleótido a la superficie deseada, por ejemplo, mucosa, sistémica. La administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Las vías preferidas de administración incluyen pero sin limitación oral, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intranasal, sublingual, intratraqueal, la inhalación, ocular, vaginal, y rectal.
Para la administración oral, los compuestos (es decir, oligonucleótidos inmunomoduladores, antígenos y otros agentes terapéuticos) se pueden formular fácilmente mediante la combinación del compuesto activo con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los compuestos de la 55 invención sean formulados como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un sujeto por tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener como excipiente sólido, opcionalmente por la molienda de la mezcla resultante, y procesamiento de la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxi propilmetil
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celulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal de estos tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular en solución salina o buffer, es decir EDTA para neutralizar las condiciones ácidas internas o se puede administrar sin ningún portador.
5 También se contemplan específicamente formas de dosis orales del componente o componentes anteriores. Como se demuestra en los Ejemplos a continuación, los oligonucleótidos modificados FANA han aumentado la estabilidad en ambientes ácidos, lo que los hace útiles para la aplicación oral. El componente o componentes pueden tener modificaciones químicas adicionales, de modo que la administración oral es aún más eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto a la molécula de componente mismo, en el que
10 dicho resto permite (a) inhibición de la proteólisis; y (b) absorción en la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino.
También se desea el aumento de la estabilidad general del componente o componentes y el aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de tales restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski and
15 Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Otros polímeros que se pueden utilizar son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Se prefieren para uso farmacéutico, como se indicó anteriormente, los restos de polietilenglicol.
Para el componente (o derivado) la ubicación de la liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el
20 duodeno, el yeyuno, el íleon o), o el intestino grueso. Los expertos en la técnica tienen formulaciones disponibles que no se disolverán en el estómago, pero liberarán el material en el duodeno o en otro lugar del intestino. Con preferencia, la liberación evitará los efectos perjudiciales del ambiente del estómago, por la protección del oligonucleótido (o derivado) o por liberación del material biológicamente activo más allá del ambiente del estómago, tal como en el intestino.
25 Para asegurar la resistencia gástrica completa es esencial un recubrimiento impermeable a por lo menos pH 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos son acetato trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, acetato ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac. Estos recubrimientos se pueden utilizar como películas mixtas.
30 Un recubrimiento o mezcla de recubrimientos también se pueden utilizar en comprimidos, que no estén destinados a la protección contra el estómago. Esto puede incluir recubrimientos de azúcar, o recubrimientos que hacen que el comprimido sea más fácil de tragar. Las cápsulas pueden consistir en una cáscara dura (tal como gelatina) para la liberación de producto terapéutico seco, es decir, polvo; para formas líquidas, se puede utilizar una cubierta de gelatina blanda. El material de la cáscara de los sellos puede ser almidón espeso u otro papel comestible. Para
35 píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de comprimidos, se pueden utilizar técnicas de amasado húmedas.
El agente terapéutico se puede incluir en la formulación como multiparticulados finos en forma de gránulos o pellets de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración en cápsulas también puede ser como un polvo, tapones ligeramente comprimidos o incluso como comprimidos. El agente
40 terapéutico se puede preparar por compresión.
Se pueden incluir colorantes y agentes saborizante. Por ejemplo, el oligonucleótido (o derivado) se puede formular (tal como, mediante encapsulación en liposomas o microesferas) y después introducir dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes y agentes saborizantes.
Se puede diluir o aumentar el volumen del agente terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes pueden incluir
45 carbohidratos, especialmente manitol, α-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales inorgánicas también se pueden usar como rellenos que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles en el comercio son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
Se pueden incluir desintegrantes en la formulación del producto terapéutico en una forma de dosis sólida. Los
50 materiales utilizados como desintegrantes incluyen, pero sin limitación almidón, incluyendo el desintegrante comercial basado en almidón, Explotab. Se pueden usar glicolato sódico de almidón, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma de los desintegrantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Las gomas en polvo se pueden usar como desintegrantes y como aglutinantes y estos pueden incluir gomas pulverizadas tales
55 como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio también son útiles como desintegrantes.
Los aglutinantes se pueden usar para mantener el agente terapéutico unido para formar un comprimido duro e incluyen materiales procedentes de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). También se pueden usar polivinilpirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.
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Un agente antifricción se puede incluir en la formulación del producto terapéutico para evitar que se pegue durante el
5 proceso de formulación. Los lubricantes se pueden usar como una capa entre el agente terapéutico y la pared de la matriz, y estos pueden incluir, pero sin limitación; ácido esteárico incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También se pueden usar lubricantes solubles tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
10 Se pueden añadir deslizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y para ayudar al reordenamiento durante la compresión. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado.
Para ayudar a la disolución del producto terapéutico en el ambiente acuoso se puede añadir un agente tensioactivo como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como lauril sulfato sódico, 15 dioctil sulfosuccinato de sodio y dioctilsulfonato de sodio. Se pueden usar detergentes catiónicos y pueden incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de posibles detergentes no iónicos que se pueden incluir en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos pueden estar presentes en la formulación del
20 oligonucleótido o derivado solos o como una mezcla en diferentes proporciones.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar en forma oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenos tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las
25 cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Las microesferas formuladas para la administración oral también se pueden utilizar. Tales microesferas han sido bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en las dosis adecuadas para tal administración.
30 Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se pueden administrar convenientemente en la forma de una presentación de aerosol de pulverización en envases presurizados
o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
35 diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosis se puede determinar mediante la provisión de una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular con una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
También se contempla en la presente la administración pulmonar de los oligonucleótidos (o sus derivados). El
40 oligonucleótido (o derivado) se administra a los pulmones de un mamífero mientras se inhala y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón a la corriente sanguínea. Otros informes de moléculas inhalatorias incluyen Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135144 (leuprolide acetate); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (endothelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212 (a1-antitrypsin); Smith et al.,
45 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (recombinant human growth hormone); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (interferón-g y factor de necrosis tumoral alfa) y Platz et al., Patente
U.S N.|º 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos). Un procedimiento y una composición para la
administración pulmonar de fármacos para efecto sistémico se describe en la patente U.S. N º 5.451.569, emitida el 50 19 de septiembre de 1995 a Wong et al.
Una amplia variedad de dispositivos mecánicos están contemplados para usar en la práctica de esta invención diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen pero sin limitación nebulizadores, inhaladores de dosis medidas, e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.
55 Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el comercio adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acom II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp.,
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Bedford, Massachusetts.
Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para el dispensado del oligonucleótido (o derivado). Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propulsor apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o portadores habituales útiles en
5 terapia. Asimismo, se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de portadores. El oligonucleótido químicamente modificado también se puede preparar en diferentes formulaciones de acuerdo con el tipo de modificación química o el tipo de dispositivo empleado.
Las formulaciones adecuadas para usar con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el oligonucleótido (o derivado) disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg
10 de oligonucleótido biológicamente activo por ml de solución. La formulación también puede incluir un buffer y un azúcar simple (por ejemplo, para la estabilización del oligonucleótido y regulación de la presión osmótica). La formulación de nebulizador también puede contener un tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie del oligonucleótido causada por la atomización de la solución en la formación del aerosol.
Las formulaciones para usar con un dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán generalmente un polvo
15 finamente dividido que contiene el oligonucleótido (o derivado) suspendido en un propulsor con la ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, que incluye triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de estos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soja. El ácido oleico también puede
20 ser útil como un agente tensioactivo.
Las formulaciones para dispensar desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el oligonucleótido (o derivado) y también pueden incluir un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, o manitol en cantidades que facilitan la dispersión de la polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la formulación. El oligonucleótido (o derivado) se debe preparar más ventajosamente en forma
25 particulada con un tamaño de partícula promedio menor de 10 mm (o micrones), con máxima preferencia de 0,5 a 5 mm, para la administración más efectiva en el pulmón distal.
También se contempla la administración nasal de una composición farmacéutica de la presente invención. La administración nasal permite el pasaje de una composición farmacéutica de la presente invención a la corriente sanguínea directamente después de administración el producto terapéutico en la nariz, sin necesidad de deposición
30 del producto en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano.
Para la administración nasal, un dispositivo útil es un frasco duro pequeño al que está unido un pulverizador de dosis medida. En una forma de realización, la dosis medida se administra mediante la extracción de la composición farmacéutica en solución de la presente invención en una cámara de volumen definido, tal cámara tiene una
35 abertura dimensionada para aerosolizar y formular el aerosol mediante la formación de un spray cuando se comprime un líquido en la cámara. La cámara se comprime para administrar la composición farmacéutica de la presente invención. En una forma de realización específica, la cámara es una estructura de pistón. Tales dispositivos están disponibles en el comercio.
Alternativamente, se utiliza una botella de plástico comprimible con una abertura u orificio dimensionado para
40 aerosolizar una formulación de aerosol mediante la formación de un spray cuando se comprime. La abertura se encuentra generalmente en la parte superior del frasco, y la parte superior está generalmente estrechada para ajustarse parcialmente en los conductos nasales para una administración eficiente de la formulación de aerosol. Con preferencia, el inhalador nasal proporcionará una cantidad medida de la formulación de aerosol, para la administración de una dosis medida del fármaco.
45 Los compuestos, cuando es deseable administrarlos sistémicamente, se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión,
50 estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o
55 triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
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Alternativamente, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de usar.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de 5 cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
10 Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores o excipientes adecuados en fase sólida o gel. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen pero sin limitación carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las formas de preparación farmacéuticas líquidas o sólidas adecuadas son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para la inhalación, microencapsulado, encocleado, recubierto sobre partículas microscópicas de oro, 15 contenido en liposomas, nebulizados, aerosoles, pellets para el implante en la piel, o secado sobre un objeto agudo para ser rayado en la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se utilizan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como desintegrantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de
20 hinchamiento, lubricantes, saborizantes, edulcorantes o solubilizantes como se describe anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para usar en una variedad de sistemas de administración de fármacos. Para una breve revisión de los procedimientos para la administración de fármacos, ver Langer, Science 249:15271533, 1990.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores y opcionalmente otros agentes terapéuticos y/o antígenos se pueden
25 administrar per se (puros) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usa en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no farmacéuticamente aceptables se pueden usar convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de estos. Tales sales incluyen, pero sin limitación, los preparados a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluensulfónico, tartárico, cítrico, metansulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftalen
30 2-sulfónico, y bencensulfónico. También, dichas sales se pueden preparar como sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.
Los agentes buffer adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% p/v); ácido cítrico y una sal (1-3% p/v); ácido bórico y una sal (0,5-2,5% p/v); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v); clorobutanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01 -0,25% p/v) y timerosal
35 (0,004-0,02% p/v).
Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad efectiva de un oligonucleótido inmunomodulador y opcionalmente antígenos y/u otros agentes terapéuticos opcionalmente incluidos en un portador farmacéuticamente aceptable. El término portador farmacéuticamente aceptable significa una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración a un ser
40 humano u otro animal vertebrado. El término portador indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de mezclarse con los compuestos de la presente invención, y entre sí, de una manera tal que no hay interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos, que de ningún modo deben 45 interpretarse como limitando aún más.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Oligodesoxinucleótidos (ODN) y reactivos
Síntesis en fase sólida de oligonucleótidos modificados con FANA (ODN)
50 Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN AKTA OligoPilot 10 (GE-Healthcare) en una escala de 1 µmol usando la química estándar de fosforamidita R-cianoetilo. Primersupport PS200 se compraron de GE-Healthcare (carga: 40 µmol/g). Se utilizaron R-cianoetil fosforamiditas protegidas-5'-DMT para la síntesis de oligo 2'-desoxinucleótidos. El grupo DMT se eliminó en el extremo 5’de la síntesis.
Desprotección y purificación
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Los ODN (Tabla 1) se desprotegieron y escindieron del soporte sólido por tratamiento con solución acuosa concentrada de amoníaco (40 ° C, 4 h). La purificación se realizó en una columna de intercambio de aniones SOURCE 15Q (CV: 6 ml, GE Healthcare), con el siguiente sistema de gradiente: Buffer A: 10 mM de hidróxido de sodio, pH 12; tampón B:. 2,5 M de cloruro de sodio, 10 mM de hidróxido de sodio, pH 12. El gradiente utilizado
5 dependía de la secuencia del oligonucleótido. El sistema de cromatografía fue un purificador ÄKTA 10 con un colector de fracciones Frac950 (GE Healthcare). Las fracciones que contienen el producto se desalinizaron en una columna de Biogel P4 y se liofilizaron.
Análisis
Los ODN se analizaron en un sistema HPLC Agilent 1100 con los siguientes módulos: Micro-desgasificador de
10 vacío (G1379A), bomba binaria (G1312A), muestreador de placa de pocillos (G1367A), horno de columna (G1316A) y MWD (G1365B), que se acopló a un espectrómetro de masas con trampa de iones Bruker Esquire 3000 + (modo negativo): Columna: Waters x-Bridge C18 2,5 µm 2,1 x 50 mm; temperatura de la columna 60 ° C; Detección UV a 260 nm; flujo: 0,2 ml/min; solvente A: 385 mM de HFIP + 14,4 mM de TEA; solvente B: metanol; volumen de inyección: 10 µL; gradiente: 0 min: 5% B, 15 min: 17.5% B, 50 min 24% B, 65 min: 45% B.
15 Tabla 1: Secuencias de muestra de ODNs y caracterización por ESI-TOF
Seq. Id. No.
Secuencia [5’-3’] pm. a[Da] pm.b[Da]
1
T*faG*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6365,4
2
T*G*faT*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6365,8
3
T*G*T*faC-G*T*T*T*T’T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6365,6
4
T*G*T*C-faG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6365,9
5
T*faG*T*C-faG*T*T*T*T*T*T*T*T"T*T*T*T*T*T*T 6382,2 6383,8
6
T*G*T*C-G*faT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6366,0
7
T*G*T*C-G*T*faT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6364,2 6365,4
8
T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 6347,0 6346,2
9
T*C*faG*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 7065,7 7063,5
10
T*C*G*T*C*faG*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 7065,7 7063,6
11
T*C*faG*T*C*faG*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 7083,7 7081,6
12
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*faG*faG*C*faG*C*faG*C*faG*C*C*G 7137,7 7136,1
13
T*C*faG*T*C*faG*T*T*T*T*C*faG*faG*C*faG*C*faG*C*faG*C*C*G 7173,7 7172,3
14
T*C*faG*T*C*faG*T*T*T*T*C*faG*faG*C*faG*C*faG*C*faG*C*C*3mG 7203,7 7201,2
15
T*C*G*T*C*G*T*T*T’T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 7047,7 7048,0
16
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 7077,8 7076,4
a Calculado (ácido libre); b Determinado por LC-MS (ESI-TOF)
Ensayos de despurinación
Los ODN se disolvieron en agua a una concentración final de 250 µM. Para cada ODN, tres muestras (20 µl) se prepararon mediante la mezcla de la solución de ODN con agua y HCl 1 N, se obtuvieron soluciones de ODN con 20 una concentración final de 1 µg/µl en HCl 0,1 N. Para cada ODN se preparó una solución separada con una concentración final de ODN de 1 µg/µl sin HCl que se utilizaron como muestras de punto de tiempo cero en el experimento de la despurinación. Las muestras que contienen HCl se incubaron a RT durante 10, 240 y 1440 min. Después de la incubación, se añadieron aproximadamente 5,3 µl de NH4OH (1%) para disolver el ODN precipitado. Las muestras se analizaron por HPLC en una columna Waters Atlantis de 3 µm C18 2,1 x 150 mm con un gradiente 25 de separación (solvente A: 100 mM de TEAAc, solvente B: ACN; 0% de B (0 min), 9% de B (9 min), 40% de B (25 min ), 95% de B (30 min), 95% de B (35 min), 0% de B (36 min), 0% de B (50 min)) a 30 °C de temperatura de la
imagen29
columna. La guanina se controló a 274 nm UV. Se preparó una curva estándar mediante el análisis de muestras estándar de concentración conocida de guanina. La concentración real de guanina en las muestras de ODN se calculó de nuevo usando la curva de calibración obtenida a partir de las muestras de estándar.
Ensayos de TLR
5 Las células HEK293 se transfectaron por electroporación con vectores que expresan el respectivo TLR humano y un plásmido indicador de luciferasa 6xNF-KB. Los transfectantes estables (3x104 células/pocillo) se incubaron con cantidades indicadas de ODN durante 16 h a 37 ° C en un incubador humidificado. Cada punto de datos se realizó por triplicado. Las células se lisaron y analizaron para determinar la actividad del gen de la luciferasa (utilizando el kit de Britelite de Perkin-Elmer, Zaventem, Bélgica). Los índices de estimulación se calcularon en referencia a la
10 actividad del gen indicador de un medio sin adición de ODN.
Purificación de células
Las preparaciones de capa leucocitaria de sangre periférica de donantes humanos sanos se obtuvieron del Banco de Sangre de la Universidad de Dusseldorf (Alemania) ylos PBMC se purificaron por centrifugación sobre Ficoll-Hypaque (Sigma). Las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 °C en medio RPMI 1640
15 suplementado con 5% (v/v) de suero AB humano inactivado por calor (Bio Whittaker) o 10% (v/v) de FCS inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (todos de Sigma).
Detección de citoquinas y análisis de citometría de flujo
Los PBMC se resuspendieron a una concentración de 5x106 células/ml y se añadió a placas de fondo redondo de 96 pocillos (250 µl/pocillo). Los PBMC se incubaron con ODN y se recolectaron los sobrenadantes del cultivo (SN)
20 después de los puntos de tiempo indicados. Si no se utilizaron inmediatamente, los SN se almacenaron a-20 ° C hasta que sea necesario.
Las cantidades de citoquinas en los SN se evaluaron usando un ELISA interno para IFN-α desarrollado utilizando anticuerpos disponibles en el comercio (PBL, New Brunswick, NJ, USA).
Introducción
25 Los oligonucleótidos (ODN) que contienen motivos CpG no metilados son capaces de estimular la respuesta inmune a través de la vía del receptor 9 tipo Toll (TLR9) . Los ODN con residuos de azúcar no naturales son generalmente sustratos más pobres para las nucleasas en comparación con los nucleótidos naturales. Se ha informado de que ciertos tipos de sustitución de 2'-desoxi ribosa en el dinucleótido CpG o 5’ al motivo CpG produce una disminución de la estimulación de hTLR9 [Zhao et al. (1999) Biorg. Med. Chem. Lett. 9, 3453]; por ejemplo, la modificación de la
30 5'-G en GTCpGTT por 2'-O-metilo produjo una actividad fuertemente disminuida a través de la vía de hTLR9. Sorprendentemente, el ODN modificado con FANA no muestra la misma disminución de la actividad hTLR9. El impacto de los nucleósidos 2'-desoxi-2'-fluoro-ß-D-arabino (FANA) sobre la actividad biológica de los ODN CpG se describe en los siguientes Ejemplos. La Figura 1 muestra que las estructuras de azúcares modificados con FANA favorecen la conformación 2'-endo preferida, a diferencia de los azúcares modificados 2'-O-metilo que favorecen la
35 conformación 2'-exo.
Ejemplo 1: Oligonucleótidos con residuos G modificados con FANA son estables a pH bajo
A continuación se muestra el mecanismo de despurinación:
imagen30
Se investigó la estabilidad de la SEQ ID N º: 1 (un G se reemplaza con faG, ver Tabla 2) y SEQ ID NO: 5 (ambos
40 reemplazados con G). Los ODN se incubaron en HCl 0,1 M, que imita el pH en el estómago, y se midió la despurinación con el tiempo por RP-HPLC. La estabilidad ácida mejoró fuertemente mediante la sustitución de una G por G modificada con FANA (faG) (Figura 2). La SEQ ID N º: 5 con todos los residuos de G sustituidos con faG fue estable frente a ácido a un pH de 1 durante el marco de tiempo investigado de 24 horas. Incluso el ODN con una sola faG (SEQ ID N º: 1) mostró un aumento de la estabilidad de su secuencia original no modificada (SEQ ID NO: 8). Este resultado tiene importancia para la fabricación de ODN ricos en G, debido a que la formación de productos secundarios de despurinación es un problema durante la eliminación ácida del grupo dimetoxitritilo en el extremo 5’de los ODN. De mayor importancia, sin embargo, es que los ODN que son estables al pH deberían ser mejores candidatos para la administración oral.
imagen31
5 Ejemplo 2: Incorporación de faG en el motivo CpG inmunoestimulatorio produce un aumento en la activación de TLR9 humana in vitro.
Con el fin de probar la capacidad de los oligonucleótidos modificados con FANA para activar TLR9, se sintetizaron numerososo ODN CpG de clase B con modificaciones FANA y se analizaron para determinar la capacidad de activar TLR9. Los ODNs se incubaron con hPBMCs y se midió la secreción de IFN-α por ELISA. Se introdujeron numerosas 10 modificaciones en el motivo de hexámero GTCGTT. Como se muestra en la Figura 3, la sustitución de C por faC (derivado de citidina con FANA) en el motivo CpG (SEQ ID NO: 3) produjo una fuerte disminución de la actividad hTLR ya que se redujeron la potencia y la eficacia. Sorprendentemente, la sustitución de T por faG en el motivo dinucleótido CpG (SEQ ID NO: 4) produjo una mejora significativa de la potencia respecto del oligonucleótido modificado con faC. ODN con una sustitución de un nucleótido FANA para un T o G en el motivo hexanucleótido
15 fuera del dinucleótido CG tuvo una eficacia y una potencia similar que la SEQ ID N º: 8 original no modificada). Cuando se intercambiaron los dos nucleótidos G en el motivo hexanucleótido por faG (SEQ ID NO: 5), la eficacia en hTLR9 fue significativamente mejor que para el ODN original.
La actividad mejorada de los ODN con G reemplazado por faG es un ejemplo sorprendente en el que una modificación del resto de azúcar desoxirribosa produjo un aumento de actividad en el ensayo de hTLR9, más que la
20 disminución observada con otros tipos de modificaciones.
Tabla 2: ODN modificado con FANA
Seq ID No:
Secuencia
1
T*faG*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
2
T*G*faT*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
3
T*G*T*faC-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
4
T*G*T*C-faG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
5
T*faG*T*C-faG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
6
T*G*T*C-G*faT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
7
T*G*T*C-G*T*faT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
8
T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
faN = nucleótido modificado con FANA
Ejemplo 3: la incorporación de faG en el motivo CpG lleva a un ligero aumento de la secreción de IFN-α in vitro.
25 Con el fin de estudiar el impacto de la sustitución de FANA sobre la capacidad de inducir la secreción de IFN-α in vitro, los ODN derivados de Clase C se incubaron con hPBMCs y se midió la secreción de IFN-α por ELISA (ver Tabla 3 y Figura 4). De modo sorprendente, la SEQ ID NO:9 con la primera G en el extremo 5’ reemplazada por faG fue máas potente para inducir IFN-α que la SEQ ID NO:15 original no modificada. Además, la substitución de G por faG en ODN de clase C pareció ser generalmente bien tolerado incluso si se intercambiaron todos los residuos G.
30 Tabla 3: ODN de clase C modificado con FANA
Seq ID No:
Secuencia
9
T*C*faG*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
10
T*C*G*T*C*faG*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
11
T*C*faG*T*C*faG*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
12
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*faG*faG*C*faG*C*faG*C*faG*C*C*G

Claims (9)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleótido inmunomodulador de 8-200 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un motivo GNCC inmunomodulador, en el que N es T, A, o un U sustituido en 5, y en el que al menos un G comprende una modificación 2’desoxi-2’-fluoro-β-D-arabino (FANA) y en el que la C del dinucleótido CG no está metilado.
    5 2. El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, en el que el motivo inmunomodulador es GNCG N1N2N3N4 en el que cada uno de N1, N2, N3 y N4 es T.
  2. 3.
    El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, en el que el motivo inmunomodulador es un motivo GNCG, en el que CG es un dinucleótido pirimidina-guanina interno.
  3. 4.
    El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1:
    10 en el que el oligonucleótido incluye al menos 4 nucleótidos 5’ para el motivo inmunomodulador o,
    en el que al menos un nucleótido fuera del motivo inmunomodulador tiene una modificación FANA.
  4. 5.
    El oligonucleótido inmunoestimulador de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende una pluralidad de dinucleótidos CG internos y en el que G de cada dinucleótido CG interno comprende una modificación FANA.
  5. 6.
    El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, que además comprende al menos una unión
    15 internucleotídica estabilizada seleccionada del grupo que consiste en: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfonoacetato, Rp-fosforotioato, Sp-fosforotioato, boranofosfata, o 3’-tioformacetal.
  6. 7. El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, que además comprende un segundo tipo de modificación de azúcar, en el que el segundo tipo de modificación de azúcar se selecciona del grupo que consiste en 2’-O-metilribosa, 2’-O-propanilribosa, 2’-O-butilribosa, 2’-O-(2-metoxietil), 2’-O, ribosa unida a 4’-C-alquileno
    20 (alquileno es metileno (LNA) o etileno), 2’-desoxi-2’-fluororibosa, 3’-O-metilribosa, 1’,2’-didesoxirribosa; arabinosa, 1’-metilarabinosa, 3’hidroximetilarabinosa, 4’-hidroximetil-arabinosa, o 1,5-anhidrohexitol.
  7. 8. El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, que además comprende al menos una unión internucleotídicas 3’-3’ y/o al menos una unión internucleotídicas 5’-5’ y/o al menos una unión internucleotídicas 2’-5’.
    25 9. El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, que además comprende al menos una secuencia palindrómica o que además comprende al menos una secuencia (G)n en la que n es 4 a 10.
  8. 10. El oligonucleótido inmunomodulador de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende al menos un análogo T hidrofóbico y/o al menos un análogo de U sustituido en 5 y/o;
    una modificación lipofílica del oligonucleótido y/o;
    30 en el que el oligonucleótido incluye un ligador.
  9. 11. Una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del conjunto que comprende SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14.
    46
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