ES2634328T3 - Ácidos nucleicos inmunoestimuladores - Google Patents

Ácidos nucleicos inmunoestimuladores Download PDF

Info

Publication number
ES2634328T3
ES2634328T3 ES10185869.4T ES10185869T ES2634328T3 ES 2634328 T3 ES2634328 T3 ES 2634328T3 ES 10185869 T ES10185869 T ES 10185869T ES 2634328 T3 ES2634328 T3 ES 2634328T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sec
oligonucleotide
ident
oligonucleotides
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10185869.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Jörg VOLLMER
Robert Rankin
Eugen Uhlmann
Grayson B. Lipford
Ulrike Samulowitz
Marion Jurk
Arthur M. Krieg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coley Pharmaceutical GmbH
Coley Pharmaceutical Group Inc
Original Assignee
Coley Pharmaceutical GmbH
Coley Pharmaceutical Group Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharmaceutical GmbH, Coley Pharmaceutical Group Inc filed Critical Coley Pharmaceutical GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2634328T3 publication Critical patent/ES2634328T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido que comprende N1-C_G-N2-C_G-N3 donde N1 y N3 son cada uno independientemente una secuencia de ácidos nucleicos de 1-20 nucleótidos de longitud, _ indica un enlace internucleótidos fosfodiéster interno, N2 es independientemente una secuencia de ácidos nucleicos de 0-20 nucleótidos de longitud, y G-N2-C incluye 1 o 2 enlaces estabilizados.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Acidos nucleicos inmunoestimuladores Campo de la invencion
La presente invencion se refiere generalmente a acidos nucleicos inmunoestimuladores, como tambien a oligonucleotidos inmunoestimuladores con efectos inflamatorios renales reducidos, composiciones de estos y metodos para usar los acidos nucleicos inmunoestimuladores.
Antecedentes de la invencion
El ADN bacteriano posee efectos inmunoestimuladores para activar las celulas B y las celulas asesinas naturales, pero el ADN de los vertebrados no los tiene (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, en: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448). Ahora se comprende que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son el resultado de la presencia de dinucleotidos CpG no metilados en contextos de bases particulares (motivos CpG), los cuales son comunes en el ADN bacteriano, pero estan metilados y mal representados en el ADN de los vertebrados (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden imitarse con oligodesoxinucleotidos (ODN) sinteticos que contienen estos motivos CpG. Dichos ODN CpG poseen efectos altamente estimuladores en los leucocitos humanos y murinos, con lo que inducen la proliferacion de las celulas B; la secrecion de citocina e inmunoglobulina; la actividad lttica de las celulas asesinas naturales (NK) y secrecion de IFN-y; y la activacion de las celulas dendnticas (DC) y de otras celulas presentadoras de antfgenos para expresar moleculas coestimuladoras y secretar citocinas, especialmente las citocinas de tipo Th1 que son importantes en la promocion del desarrollo de las respuestas de las celulas T de tipo Th1. Estos efectos inmunoestimuladores de los ODN CpG de esqueleto de fosfodiester nativos son altamente espedficos a CpG en cuanto los efectos se reducen drasticamente si el motivo CpG se metila, se modifica a GpC, o se elimina o altera de alguna otra manera (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:930510).
En los primeros estudios, se pensaba que el motivo CpG inmunoestimulador segrna la formula purina-purina-CpG- pirimidina-pirimidina (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Sin embargo, ahora queda claro que los linfocitos de raton responden bastante bien a los motivos CpG fosfodiester que no siguen esta “formula” (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) y lo mismo se aplica a las celulas B y a las celulas dendnticas de humanos (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Recientemente se han descrito varias clases diferentes de acidos nucleicos CpG. Una clase es potente para activar celulas B pero es relativamente debil en la induccion de IFN-a y en la activacion de celulas NK; esta clase se ha denominado la clase B. Tfpicamente, los acidos nucleicos CpG de clase B estan completamente estabilizados e incluyen un dinucleotido CpG no metilado dentro de ciertos contextos de bases preferidos. Vease, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N° 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; y 6,339,068. Otra clase de acidos nucleicos CpG activa celulas B y celulas NK e induce IFN-a; esta clase se ha denominado la clase C. Los acidos nucleicos CpG de clase C, en una primera caracterizacion, tfpicamente estan completamente estabilizados, incluyen una secuencia de tipo clase B y un palmdromo o cuasi-palmdromo rico en GC. Esta clase se ha descrito en la solicitud de patente provisional de los EE.UU. en tramitacion 60/313,273, presentada el 17 de agosto de 2001 y US10/224.523 presentada el 19 de agosto de 2002 y en la solicitud de patente PCT relacionada PCT/US02/26468 publicada bajo el numero de publicacion internacional WO 03/015711.
Sumario de la invencion
Se ha descubierto con sorpresa que las propiedades inmunoestimuladoras de los acidos nucleicos CpG de clase B y de clase C y de otros acidos nucleicos inmunoestimuladores estabilizados se pueden conservar o incluso mejorar mediante la inclusion selectiva de uno o mas enlaces no estabilizados entre ciertos nucleotidos. Los enlaces no estabilizados preferiblemente son enlaces naturales, como ser, enlaces fosfodiester o enlaces de tipo fosfodiester. Un enlace no estabilizado tfpica, pero no necesariamente, sera relativamente susceptible a la digestion de nucleasa.
Al igual que los acidos nucleicos inmunoestimuladores totalmente estabilizados, los acidos nucleicos inmunoestimuladores de la presente invencion son utiles para inducir una respuesta inmune de tipo Th1. Por consiguiente, los acidos nucleicos inmunoestimuladores de la presente invencion son utiles como adyuvantes para vacunacion y son utiles para tratar enfermedades entre las que se incluye el cancer, las enfermedades infecciosas, las alergias y el asma. Se cree que son particularmente utiles en cualquier afeccion que requiera la administracion prolongada o reiterada de acidos nucleicos inmunoestimuladores para cualquier proposito.
Ademas de ser utiles para cualquier proposito para el cual los acidos nucleicos inmunoestimuladores estabilizados son utiles, los acidos nucleicos inmunoestimuladores de la presente invencion, en algunas realizaciones, pueden
5
10
15
20
25
30
35
presentar ventajas sobre los acidos nucleicos inmunoestimuladores completamente estabilizados, como ser, mayor potencia y menor toxicidad.
En un aspecto la invencion proporciona un oligonucleotido que comprende
Ni-C_G-N2-C_G-Na
donde N1 y N3 son cada uno independientemente una secuencia de acidos nucleicos de 1-20 nucleotidos de longitud, donde _ indica un enlace internucleotidos fosfodiester interno, N2 es independientemente una secuencia de acidos nucleicos de 0-20 nucleotidos de longitud, y G-N2-C incluye 1 o 2 enlaces estabilizados.
En algunas realizaciones, los oligonucleotidos tienen la estructura:
5' T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (N° ident. de sec.:313) o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (N° ident. de sec.:314).
En algunas relizaciones, el oligonucleotido tiene la estructura:
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (N° ident. de sec.: 316).
En una realizacion, el oligonucleotido se selecciona del grupo que *A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:1),
G*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*A*C_G*C (N° ident. de sec.:2),
G*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*C (N° ident. de sec.:3),
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:6),
T*c*g*t*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:7),
T*c*g*t*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:8),
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:14),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T (N° ident. de sec.:29),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:30),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G (N° ident. de sec.:31),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T (N° ident. de sec.:32),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T*T (N° ident. de sec.:33),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:34),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:35),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:36, T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:37), T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:38), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:39), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:40),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:41),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*C_G*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:42), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:43), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:44),
consiste
en:
5
10
15
20
25
30
35
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:45), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (N° ident. de sec.:46), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (N° ident. de sec.:47), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (N° ident. de sec.:48), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:49), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (N° ident. de sec.:50), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:51), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T (N° ident. de sec.:52), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (N° ident. de sec.:53), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:54), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:55), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:56), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:241), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T (N° ident. de sec.:58), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:59), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T (N° ident. de sec.:60), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:61),
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:62), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:63), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:64), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:65), T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:66), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:70), T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (N° ident. de sec.:74), T*g*t*c_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:77), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:80), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T (N° ident. de sec.:81), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:82), T*t*t*c_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T (N° ident. de sec.:84), T*t*t*t*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:85), T*t*t*t*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (N° ident. de sec.:86), T*t*t*t*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:87),
G*T*C
G*T*C
(N° ident. de sec.:88),
G*T*C
G*T*C G*T*C
(N° ident. de sec.:89),
y,
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:96),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
en donde * representa fosforotioato, _ representa fosfodiester, U representa 2'-desoxiuracilo y 7 representa 7- deazaguanina.
En una realizacion el oligonucleotido se selecciona del grupo que consiste en: T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:100),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:101),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:102),
y T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:104), en donde * representa fosforotioato y _ representa fosfodiester.
En una realizacion el oligonucleotido se selecciona del grupo que consiste en:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:105) T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (N° ident. de sec.:106), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (N° ident. de sec.:107), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:108), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (N° ident. de sec.:109), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (N° ident. de sec.:110), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (N° ident. de sec.:111), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:112), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (N° ident. de sec.:113), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (N° ident. de sec.:114), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (N° ident. de sec.:115), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:116), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (N° ident. de sec.:117), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (N° ident. de sec.:118), y T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (N° ident. de sec.:119), en donde * representa fosforotioato, y representa fosfodiester
En una realizacion, el oligonucleotido tiene un esqueleto que comprende desoxirribosa o ribosa.
En una realizacion el oligonucleotido esta en una composicion farmaceutica que opcionalmente comprende un vehnculo farmaceuticamente aceptable.
En una realizacion el oligonucleotido ademas comprende un adyuvante o una citocina.
En una realizacion el oligonucleotido ademas comprende un antigeno, opcionalmente en donde el oligonucleotido es un adyuvante de vacuna.
En una realizacion el antigeno es seleccionado del grupo que consiste en: un antfgeno viral, un antfgeno bacteriano, un antfgeno fungico, un antfgeno parasitario y un antfgeno tumoral. En una realizacion el antfgeno esta codificado por un vector de acido nucleico. En una realizacion el antfgeno es un antfgeno peptfdico. En una realizacion el antfgeno esta enlazado covalentemente al oligonucleotido o a la molecula de acido nucleico inmunoestimulador. En otra realizacion el antfgeno no esta enlazado covalentemente al oligonucleotido o a la molecula de acido nucleico inmunoestimulador.
En una realizacion, los enlaces internucleotidos estabilizados se seleccionan del grupo que consiste en: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato y cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion, los enlaces internucleotidos estabilizados son fosforotioato.
La invencion se refiere a un metodo para tratar o prevenir alergias o asma. El metodo se ejecuta administrando a un individuo un oligonucleotido CpG inmunoestimulador descrito en la presente en una cantidad efectiva para tratar o prevenir alergias o asma. En una realizacion el oligonucleotido se administra en una superficie mucosa. En otras realizaciones el oligonucleotido se administra en una formulacion en aerosol. Opcionalmente el oligonucleotido se administra en forma intranasal.
De acuerdo con otro aspecto de la descripcion, se proporciona un metodo para inducir la produccion de citocina. El metodo se ejecuta administrando a un individuo un oligonucleotido CpG inmunoestimulador descrito en la presente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en una cantidad efectiva para inducir una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-a, quimiocinas, e IFN-y.
La invencion abarca composicion de los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG descritos en la presente en combinacion con un antigeno u otro compuesto terapeutico, tal como un agente antimicrobiano. El agente antimicrobiano puede ser, a modo de ejemplo, un agente antiviral, un agente antiparasitario, un agente antibacteriano o un agente antifungico.
De acuerdo con otro aspecto de la descripcion, se proporciona una composicion de un dispositivo de liberacion sostenida que incluye los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG descritos en la presente.
La composicion opcionalmente puede incluir un vehfculo farmaceutico y/o estar formulada en un dispositivo de suministro. En algunas realizaciones el dispositivo de suministro se selecciona del grupo que consiste en lfpidos cationicos, protemas permeables en celulas y dispositivos de liberacion sostenida. En una realizacion el dispositivo de liberacion sostenida es un polfmero biodegradable o una micropartfcula.
En una realizacion, una composicion de un oligonucleotido es para usar un metodo para estimular una respuesta inmune en un individuo. El metodo implica administrar un oligonucleotido inmunoestimulador CpG a un individuo en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en el individuo. Preferiblemente, el oligonucleotido inmunoestimulador CpG es administrado via oral, en forma local, en un dispositivo de liberacion sostenida, por via de las mucosas, por via sistemica, parenteral o intramuscular. Cuando el oligonucleotido inmunoestimulador CpG se administra en la superficie mucosa, este puede suministrarse en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune de las mucosas o una respuesta inmune sistemica. En las realizaciones preferidas, la superficie mucosa se selecciona del grupo que consiste en una superficie oral, nasal, rectal, vaginal y ocular.
En algunas realizaciones, el metodo incluye exponer al individuo a un antfgeno en donde la respuesta inmune es una respuesta inmune espedfica al antfgeno. En algunas realizaciones, el antfgeno se selecciona del grupo que consiste en un antfgeno tumoral, un antfgeno viral, un antfgeno bacteriano, un antfgeno parasitario y un antfgeno peptfdico.
En algunas realizaciones el individuo tiene asma, alergia, cancer y enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o remodelacion de las vfas aereas. La composicion puede incluir un antfgeno. La composicion puede ser para administracion con un protocolo terapeutico, opcionalmente cirugfa, radiacion o un medicamento. El oligonucleotido se puede formular, por ejemplo, asociado con una molecula diana.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG son capaces de provocar un amplio espectro de respuestas inmunes. Por ejemplo, estos oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG pueden utilizarse para redirigir una respuesta inmune Th2 a una Th1. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien pueden utilizarse para activar una celula inmune, tal como un linfocito (por ejemplo, celulas B y T), una celula dendntica y una celula NK. La activacion puede realizarse in vivo, in vitro, o ex vivo, por ej., aislando una celula inmune del individuo, poniendo en contacto la celula inmune con una cantidad efectiva para activar la celula inmune del oligonucleotido inmunoestimulador CpG y volviendo a administrar la celula inmune activada al individuo. En algunas realizaciones la celula dendntica presenta un antfgeno canceroso. La celula dendntica puede exponerse al antfgeno canceroso ex vivo.
La respuesta inmune producida por oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien puede tener como resultado la induccion de la produccion de citocina, por ejemplo, la produccion de IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-a, quimiocinas e IFN-y.
Incluso en otra realizacion, los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG son utiles para tratar el cancer. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien son utiles de acuerdo con otros aspectos de la invencion para prevenir el cancer (por ejemplo, al reducir el riesgo de desarrollar cancer) en un individuo en riesgo de desarrollar un cancer. El cancer puede seleccionarse del grupo que consiste en cancer del tracto biliar, cancer de mama, cancer cervical, coriocarcinoma, cancer de colon, cancer del endometrio, cancer gastrico, neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cancer de Idgado, cancer de pulmon (por ejemplo, celulas pequenas y celulas no pequenas), melanoma, neuroblastomas, cancer oral, cancer ovarico, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer rectal, sarcomas, cancer de tiroides y cancer renal, asf como otros carcinomas y sarcomas. En algunas realizaciones importantes, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de huesos, cancer cerebral y del SNC, cancer del tejido conectivo, cancer de esofago, cancer de ojo, linfoma de Hodgkin, cancer de laringe, cancer de la cavidad oral, cancer de piel y cancer testicular.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien pueden usarse para aumentar la capacidad de respuesta de una celula cancerosa a una terapia para tratar el cancer (por ejemplo, una terapia contra el cancer), opcionalmente cuando el oligonucleotido inmunoestimulador CpG es administrado junto con una terapia contra el cancer. La terapia contra el cancer puede ser quimioterapia, una vacuna (por ejemplo, una vacuna con celulas dendnticas primadas in vitro o una vacuna con antfgenos cancerosos) o una terapia basada en anticuerpos. Esta ultima terapia tambien puede implicar administrar un anticuerpo espedfico para un antfgeno de superficie celular de,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
por ejemplo, una celula cancerosa, en donde la respuesta immune da como resultado una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). En una realizacion, el anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en Ributaxin, Herceptina, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEc2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD- 72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior C5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA.
Por lo tanto, de acuerdo con algunos aspectos de la descripcion, a un individuo enfermo de cancer o en riesgo de contraer cancer se le administra un oligonucleotido inmunoestimulador CpG y una terapia contra el cancer. En algunas realizaciones, la terapia contra el cancer se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapeutico, un agente inmunoterapeutico y una vacuna contra el cancer.
Incluso en otra realizacion de los metodos dirigidos a prevenir o tratar el cancer, tambien se puede administrar interferon-a al individuo.
La invencion en otros aspectos se refiere a metodos para prevenir enfermedades en un individuo. El metodo implica administrar al individuo un oligonucleotido inmunoestimulador CpG regularmente para promover la capacidad de respuesta del sistema inmune a fin de prevenir enfermedades en el individuo. Los ejemplos de enfermedades o afecciones que se busca prevenir utilizando los metodos profilacticos de la invencion incluyen infecciones microbianas (por ejemplo, enfermedades de transmision sexual) y shock anafilactico por alergias a ciertos alimentos.
En otros aspectos, la invencion se refiere a un metodo para inducir una respuesta inmune innata administrando al individuo un oligonucleotido inmunoestimulador CpG en una cantidad efectiva para activar una respuesta inmune innata.
De acuerdo con otro aspecto de la descripcion se proporciona un metodo para tratar o prevenir una infeccion viral o retroviral. El metodo implica administrar a un individuo que padece o en riesgo de padecer una infeccion viral o retroviral una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones de la invencion para tratar o prevenir la infeccion viral o retroviral. En algunas realizaciones la infeccion viral es provocada por un virus de la hepatitis, por ejemplo hepatitis B, hepatitis C, VIH, virus del herpes, o papilomavirus.
Se proporciona un metodo para tratar o prevenir una infeccion bacteriana de acuerdo con otro aspecto de la descripcion. El metodo implica administrar a un individuo que padece o en riesgo de padecer una infeccion bacteriana una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones de la invencion para tratar o prevenir la infeccion bacteriana. En una realizacion la infeccion bacteriana se debe a una bacteria intracelular.
En otro aspecto la invencion se refiere a un metodo para tratar o prevenir una infeccion parasitaria administrando a un individuo que padece o en riesgo de padecer una infeccion parasitaria una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones de la invencion para tratar o prevenir la infeccion parasitaria. En una realizacion la infeccion parasitaria se debe a un parasito intracelular. En otra realizacion la infeccion parasitaria se debe a un parasito no helmmtico.
En algunas realizaciones el individuo es un ser humano y en otras realizaciones el individuo es un vertebrado no humano seleccionado del grupo que consiste en un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, pavo, cabra, pez, mono, pollo, rata, raton y oveja.
En otro aspecto la invencion hace referencia a un metodo para inducir una respuesta inmune TH1 administrando a un individuo cualquiera de las composiciones de la invencion en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune TH1.
En otro aspecto, la invencion hace referencia a un metodo para tratar una enfermedad autoinmune administrando a un individuo que padece o en riesgo de padecer una enfermedad autoinmune una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones de la invencion para tratar o prevenir la enfermedad autoinmune.
En otras realizaciones, el oligonucleotido se suministra al individuo en una cantidad efectiva para inducir la expresion de citocina. Opcionalmente, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-6, TNFa, IFNa, IFNy e IP-10. En otras realizaciones el oligonucleotido es suministrado al individuo en una cantidad efectiva para cambiar la respuesta inmune de una respuesta polarizada Th2 a una respuesta polarizada Th1.
La invencion en algunos aspectos se refiere a un metodo para tratar la remodelacion de las vfas areas, que comprende: administrar a un individuo un oligonucleotido que comprende un dinucleotido CG en una cantidad efectiva para tratar la remodelacion de las vfas aereas en el individuo. En una realizacion el individuo padece de asma, de enfermedad pulmonar obstructiva cronica o es fumador. En otras realizaciones el individuo no presenta smtomas de asma.
Tambien se proporciona como un aspecto de la descripcion el uso de un oligonucleotido de la invencion para estimular una respuesta inmune.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tambien se describe un metodo para fabricar un medicamento de un oligonucleotido de la invencion para estimular una respuesta inmune.
Cada una de las limitaciones de la invencion puede abarcar diversas realizaciones de la invencion. Por lo tanto, se anticipa que cada una de las limitaciones de la invencion que implica cualquier elemento o combinaciones de elementos pueden estar incluidas en cada aspecto de la invencion.
Breve descripcion de los graficos
La Figura 1 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de interferon-alfa (pg/ml) secretados por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 1A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 242. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 1B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo es 5' TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3' (N° ident. de sec.: 329). La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de seis donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de Interferon-alfa (pg/ml) secretado por celulas tratadas con un control negativo (medio) para cada experimento.
La Figura 2 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de IL-10 (pg/ml) secretados por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 2A incluyen (N° ident. de sec.: 322), N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 242. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 2B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de seis donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de IL-10 (pg/ml) secretado por celulas tratadas con un control negativo (medio) para cada experimento.
La Figura 3 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de TNF-alfa (pg/ml) secretados por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 3A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 3B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de tres donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de TNF-alfa (pg/ml) secretado por celulas tratadas con un control negativo (medio) y con LPS para cada experimento.
La Figura 4 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de IL-6 (pg/ml) secretados por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 4A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329 (con un esqueleto completo fosforotioato modificado). Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 4B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de tres donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de IL-6 (pg/ml) secretado por celulas tratadas con un control negativo (medio) y con LPS para cada experimento.
La Figura 5 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de interferon-gamma (pg/ml) secretados por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 5A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 5B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de tres donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de interferon-gamma (pg/ml) secretado por celulas tratadas con un control negativo (medio) y con LPS para cada experimento.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La Figura 6 es un conjunto de graficos que ilustran niveles de expresion de CD69 (MFI) en celulas NK como un indicador de la activacion de las celulas Nk luego de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos listados por numero a lo largo del eje X superior del grafico e indicados mediante ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo ilustrado por ■. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 6A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. Los oligonucleotidos de prueba mostrados en la Figura 6B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328 y el oligonucleotido de control positivo tiene el N° ident. de sec.: 329. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM). La informacion que se muestra representa la media de tres donantes. Debajo de los graficos se lista el nivel de expresion de CD69 en celulas NK tratadas con un control negativo (medio) y con LPS para cada experimento.

La Figura 7 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (7A) y de IL-10 (7B)

producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
313 e indicado por ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado mediante •. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (H-M).

La Figura 8 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (8A) y de IL-10 (8B)

producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
314 e indicado por ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado mediante •. El ODN de control negativo tiene el N° ident. de sec. 330: TCCAGGACTTCTCTCAGGTT. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).

La Figura 9 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (9A) y de IL-10 (9B)

producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
319 e indicado por ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado mediante •. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 10 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (10A) y de IL-10 (10B) producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
316 e indicado por mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por
• . La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 11 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (11A) y de IL-10 (11B) producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
317 e indicado mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por •. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 12 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (12A) y de IL-10 (12B) producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.:
320 e indicado mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por •. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 13 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en celulas B (13A) y de expresion de CD80 en monocitos (13B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 313 e indicado mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por
• . La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 14 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en celulas B (14A) y de expresion de CD80 en monocitos (14B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 314 e indicado mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por
• . La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 15 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en celulas B (15A) y de expresion de CD80 en monocitos (15B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 319 e indicado mediante ■ frente a un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 indicado por
• . La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (HM).
La Figura 16 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en las celulas B (16A) y de expresion de CD80 en monocitos (16B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
sec.: 316 y comparado con un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 y con el oligonucleotido 5' TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT 3') con N° ident. de sec.: 330. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).
La Figura 17 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de interferon-alfa (IFN-a) (17A) y de IL-10 (17B) producidos por PBMC de humanos luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 321 en comparacion con el oligonucleotido de control con N° ident. de sec.: 242 y con el oligonucleotido con N° ident. de sec.: 330. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).
La Figura 18 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en las celulas B (18A) y de expresion de CD80 en monocitos (18B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 321 y comparado con un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 y con el oligonucleotido con N° ident. de sec.: 330. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).
La Figura 19 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en las celulas B (19A) y de expresion de CD80 en monocitos (19B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 317 y comparado con un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 y con el oligonucleotido con N° ident. de sec.: 330. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).
La Figura 20 es un conjunto de graficos que ilustran los niveles de expresion de CD86 en las celulas B (20A) y de expresion de CD80 en monocitos (20B) luego de la exposicion de estas celulas al oligonucleotido con N° ident. de sec.: 320 y comparado con un oligonucleotido de control positivo con N° ident. de sec.: 242 y con el oligonucleotido con N° ident. de sec.: 330. La concentracion de oligonucleotido usada para producir un punto de dato particular se ilustra a lo largo del eje X (|iM).
La Figura 21 es una representacion grafica de una porcion de una molecula de acido nucleico, que ilustra las caractensticas estructurales incluidas las bases (B), los azucares y el esqueleto con un enlace fosfodiester (que se muestra dentro del cfrculo) entre citidina 5' y guanosina 3' y los enlaces fosforotioato adyacentes.
La Figura 22 es un grafico de barras que ilustra las cantidades tisulares relativas de fosforotioato (N° ident. de sec.: 242), oligonucleotidos blandos (N° ident. de sec.: 294) y semiblandos (N° ident. de sec.: 241) en rinon, bazo e tngado 48 horas despues de una inyeccion subcutanea en ratones. Los oligonucleotidos con N° ident. de sec.: 242 y N° ident. de sec.: 241 poseen secuencias de bases identicas y difieren en la composicion de su esqueleto.
La Figura 23 muestra la estimulacion de las celulas inmunes de seres humanos in vitro por induccion de citocinas IL- 6, IL-10, IFNae IP-10.
La Figura 24 muestra la estimulacion de esplenocitos murinos in vitro por un aumento en la eficacia y/o potencia como inductor de citocinas asociadas con tLR9 IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa e IP-10, sin secrecion detectable de IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 o GM-CSF.
La Figura 25 muestra la expresion inducida de genes asociados con TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy e IP-10) en el pulmon por un ODN de la invencion (N° ident. de sec.: 313).
La Figura 26 muestra los efectos de los ODN CpG en el desarrollo de nodos linfaticos inducidos por antfgenos en ratones in vivo.
La Figura 27 demuestra que los ODN CpG suprimen una respuesta Th2 a la sensibilizacion por antfgenos.
La Figura 28 muestra los efectos en la produccion de IgE inducida por antfgenos en ratones in vivo.
La Figura 29 demuestra que el estfmulo de los antfgenos provoco un aumento en el numero total de leucocitos, predominantemente eosinofilos, en el lumen de las vfas aereas.
Las Figuras 30 y 32 muestran que el estfmulo de los antfgenos provoco un aumento en el numero total de leucocitos, predominantemente eosinofilos, en el lumen de las vfas aereas y que esto fue suprimido por un ODN de la invencion (N° ident. de sec.: 313) de un modo relacionado con las dosis.
Las Figuras 31 y 32 muestran que el estfmulo de los antfgenos provoco una hiperreactividad de las vfas aereas y que esto fue suprimido por un ODN de la invencion (N° ident. de sec.: 313) de un modo relacionado con las dosis.
La Figura 33 muestra concentraciones de ODN en el plasma de ratas luego de la administracion IV e IT de 5 mg/kg. La informacion del plasma muestra que el N° ident. de sec. 313 se elimina mas rapidamente del plasma en comparacion con el N° ident. de sec. 329 luego de la administracion tanto IV como IT.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La Figura 34 muestra concentraciones de ODN en los pulmones de ratas luego de la administracion IV e IT de 5 mg/kg. Luego de la administracion IV en el mismo nivel de dosis, las concentraciones de N° ident. de sec. 313 en los pulmones fueron menores que las concentraciones de N° ident. de sec. 329. Despues de la administracion IT la diferencia es menos pronunciada. La informacion pulmonar para N° ident. de sec. 329 solo esta disponible durante las 48 horas posteriores a la dosis.
La Figura 35 muestra concentraciones de ODN en los rinones de ratas luego de la administracion IV e IT de 5 mg/kg. La informacion renal indica que los niveles absolutos de N° ident. de sec. 313 en los rinones son menores que los correspondientes a las concentraciones de N° ident. de sec. 329 despues de la administracion IV e IT.
La exposicion renal a N° ident. de sec. 313 despues de la administracion IT en particular, se reduce considerablemente en comparacion con la exposicion a N° ident. de sec. 329 con el mismo nivel de dosis.
La Figura 36 muestra concentraciones de ODN en los rinones de ratas luego de la administracion IV de 5 mg/kg.
La Figura 37 muestra concentraciones de ODN en los rinones de ratas luego de la administracion IT de 5 mg/kg.
La Figura 38 muestra concentraciones de N° ident. de sec. 313 y sus metabolitos de 8 bases en los rinones de ratas luego de la administracion IV de 5 mg/kg de N° ident. de sec. 313.
La Figura 39 muestra concentraciones de N° ident. de sec. 313 y sus metabolitos de 8 bases en los rinones de ratas luego de la administracion IT de 5 mg/kg de N° ident. de sec. 313.
La Figura 40 es un grafico que ilustra el mdice de estimulacion de grupos de ODN semiblandos comparados con ODN con todos sus enlaces fosforotioatos con la misma secuencia.
La Figura 41 es un conjunto de graficos de barras que ilustran la induccion de citocinas A y B (IP-10), C (IFN) y D y E (TNF) en respuesta a la administracion de ODN blando (N° ident. de sec. 294), semiblando (N° ident. de sec. 241) y con todos sus enlaces fosforotioatos (N° ident. de sec. 242).
La Figura 42 es un conjunto de graficos que ilustran la actividad de anticuerpos y de linfocitos T citotoxicos en respuesta a la administracion de ODN blando (N° ident. de sec. 294), semiblando (N° ident. de sec. 241) y con todos sus enlaces fosforotioatos (N° ident. de sec. 242).
La Figura 43 es un conjunto de graficos que ilustran la terapia antitumoral en ratones utilizando ODN semiblando (N° ident. de sec. 241) o con todos sus enlaces fosforotioatos (N° ident. de sec. 242). Las Figuras 43 A y B ilustran los resultados en un modelo de carcinoma de celulas renales. Las Figuras 43 C y D ilustran los resultados en un modelo de neuroblastoma murino. Las Figuras 43 E y F ilustran los resultados en un modelo de cancer pulmonar de celulas no pequenas murino.
Descripcion detallada
Se proporcionan los acidos nucleicos inmunoestimuladores semiblandos de acuerdo con la invencion. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invencion descritos en la presente, en algunas realizaciones poseen propiedades mejoradas que incluyen potencia similar o mejorada, reducida exposicion sistemica para los rinones, el tngado y el bazo y pueden tener menor reactogenicidad en los sitios de inyeccion. Si bien el solicitante no se encuentra restringido por un mecanismo, se cree que estas propiedades mejoradas estan asociadas con la colocacion estrategica dentro de los oligonucleotidos inmunoestimuladores de los “enlaces internucleotidos” fosfodiester o de tipo fosfodiester. El termino “enlace internucleotidos” tal como se usa en la presente hace referencia al enlace covalente del esqueleto que une dos nucleotidos adyacentes en una molecula de acido nucleico. El enlace covalente del esqueleto tfpicamente sera un enlace fosfato modificado o no modificado, pero son posibles otras modificaciones. Por tanto, un oligonucleotido lineal que tiene n nucleotidos de longitud tiene un total de n-1 enlaces internucleotidos. Estos enlaces covalentes del esqueleto pueden estar modificados o no modificados en los oligonucleotidos inmunoestimuladores de acuerdo con las ensenanzas de la invencion.
En particular, los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester implican “dinucleotidos internos”. Un dinucleotido interno en general significa cualquier par de nucleotidos adyacentes conectados por un enlace internucleotidos, en el que ningun nucleotido en el par de nucleotidos es un nucleotido terminal, es decir, ningun nucleotido en el par de nucleotidos es un nucleotido que define el extremo 5' o 3' del oligonucleotido. Por tanto, un oligonucleotido lineal que tiene n nucleotidos de longitud tiene un total de n-1 dinucleotidos y solo n-3 dinucleotidos internos. Cada enlace internucleotidos en un dinucleotido interno es un enlace internucleotidos interno. Por tanto, un oligonucleotido lineal que tiene n nucleotidos de longitud tiene un total de n-1 enlaces internucleotidos y solo n-3 enlaces internucleotidos internos. Los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester ubicados estrategicamente, por lo tanto, se refieren a los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester posicionados entre cualquier par de nucleotidos en la secuencia de acido nucleico. En algunas realizaciones los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester no estan posicionados entre cualquiera de los pares de nucleotidos mas cercanos al extremo 5' o 3'.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La invencion esta basada al menos en algunos aspectos en el sorprendente descubrimiento de que los acidos nucleicos blandos y semiblandos descritos en la presente poseen al menos la misma actividad inmunoestimuladora o en muchos casos una actividad inmunoestimuladora mayor, en muchas instancias, que los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados correspondientes que poseen la misma secuencia de nucleotidos. Esto no se esperaba debido a que comunmente se cree que los oligonucleotidos fosforotioato son generalmente mas inmunoestimuladores que los oligonucleotidos no estabilizados. Los resultados fueron sorprendentes porque se esperaba que si el enlace “ablandante” se colocaba entre el motivo inmunoestimulador, por ej., CG el acido nucleico podna tener actividad reducida debido a que el acido nucleico se descomprondna facilmente en fragmentos que no contendnan CG in vivo. Contrario a las expectativas, muchos de estos acidos nucleicos en realidad tuvieron una actividad in vitro e in vivo equivalente o mejor. Parece ser que los oligonucleotidos blandos y semiblandos son al menos tan potentes, si no mas potentes, que sus contrapartes completamente estabilizados; el efecto inmunoestimulador neto de los oligonucleotidos blandos y semiblandos representa un equilibrio entre actividad y estabilidad. En concentraciones altas, el equilibrio parece favorecer la actividad, es decir, domina la potencia. En concentraciones bajas, este equilibrio parece favorecer la estabilidad, es decir, domina la inestabilidad relativa asociada con la susceptibilidad a la nucleasa.
Un oligonucleotido blando es un oligonucleotido inmunoestimulador que tiene un esqueleto parcialmente estabilizado, en el cual los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester ocurren solo dentro de al menos un dinucleotido pirimidina-purina (YZ) interno o inmediatamente adyacentes a el. Preferiblemente YZ es YG, un dinucleotido pirimidina-guanosina (YG). Al menos dicho dinucleotido YZ interno tiene un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester. Un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester que ocurre inmediatamente adyacente a al menos unico dinucleotido YZ interno puede ser 5', 3' o tanto 5' como 3' para dicho dinucleotido YZ interno. Preferiblemente, un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester que ocurre inmediatamente adyacente a dicho dinucleotido YZ interno es en sf mismo un enlace internucleotidos interno. Por tanto, para una secuencia Ni YZ N2, en donde N1 y N2 son cada uno, independientemente entre sf, cualquier nucleotido individual, el dinucleotido YZ tiene un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester y ademas (a) Ni e Y estan enlazados por un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester cuando Ni es un nucleotido interno, (b) Z y N2 estan enlazados por un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester cuando N2 es un nucleotido interno, o (c) Ni e Y estan enlazados por un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester cuando Ni es un nucleotido interno y Z y N2 estan enlazados por un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester cuando N2 es un nucleotido interno.
Los ejemplos no taxativos de oligonucleotidos blandos incluyen los descritos por los N° ident. de sec. i05-23i, N° ident. de sec. 232-234, N° ident. de sec. 235-237 y N° ident. de sec. 238-240.
Se cree que los oligonucleotidos blandos son relativamente susceptibles al clivado por nucleasas en comparacion con los oligonucleotidos completamente estabilizados. Sin la intencion de restringirse a una teona o mecanismo en particular, se cree que los oligonucleotidos blandos son clivables en fragmentos con actividad inmunoestimuladora reducida o sin ella respecto de los oligonucleotidos blandos de longitud completa. Se cree que la incorporacion de al menos un enlace internucleotidos sensible a las nucleasas, particularmente cerca del medio del oligonucleotido, proporciona una “desconexion” que altera la farmacocinetica del oligonucleotido a fin de reducir la duracion de la actividad inmunoestimuladora maxima del oligonucleotido. Esto puede tener un valor particular en aplicaciones tisulares y clmicas en las cuales se desea evitar los danos relacionados con la inflamacion o inmunoestimulacion local cronica, por ej., del rinon.
La invencion se refiere a los oligonucleotidos semiblandos. Un oligonucleotido semiblando es un oligonucleotido inmunoestimulador que tiene una estructura parcialmente estabilizada, en la cual los enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester ocurren solo dentro de al menos un dinucleotido pirimidina-purina (YZ) interno. Los oligonucleotidos semiblandos generalmente poseen un aumento de la potencia inmunoestimuladora respecto de los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados correspondientes. Por ejemplo, la potencia inmunoestimuladora del semiblando con N° ident. de sec.: 24i es 2-5 veces la de aquel con todos sus enlaces fosforotioato con N° ident. de sec.: 242, donde los dos oligonucleotidos comparten la misma secuencia de nucleotidos y difieren solo en cuanto a los enlaces internucleotidos YZ internos como se expresa a continuacion, donde * indica fosforotioato y _ indica fosfodiester:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:24i)
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:242)
N° ident. de sec.: 24i incorpora enlaces internucleotidos fosfodiester internos que implican tanto dinucleotidos CG como TG (ambos YZ). Debido a la mayor potencia de los oligonucleotidos semiblandos, los oligonucleotidos semiblandos pueden usarse en concentraciones efectivas menores y tener dosis efectivas menores que los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados convencionales a fin de lograr un efecto biologico deseado.
Mientras que los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados pueden exhibir maximos para la relacion dosis-respuesta, los oligonucleotidos semiblandos de la presente invencion parecen tener curvas dosis-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
respuesta en aumento monotono (como se ensayo por estimulacion con TLR9) que se extienden a concentraciones mas elevadas mas alia de la concentracion optima para los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados correspondientes. Por tanto, se cree que los oligonucleotidos semiblandos de la presente invencion pueden inducir mayor inmunoestimulacion que los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados.
Se ha descubierto de acuerdo con la presente invencion que se puede aumentar la actividad inmunoestimuladora de los oligonucleotidos completamente estabilizados debilmente inmunoestimuladores mediante la incorporacion de al menos un dinucleotido YZ interno con un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester. Por tanto, es posible comenzar con un oligonucleotido debilmente inmunoestimulador, que tenga un esqueleto completamente estabilizado y mejorar su actividad inmunoestimuladora mediante la sustitucion de un enlace internucleotidos estabilizado de al menos un dinucleotido YG interno en lugar de un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester. Por ejemplo, N° ident. de sec.: 243 resulto tener mas actividad inmunoestimuladora que su contraparte completamente estabilizada N° ident. de sec.: 244, donde N° ident. de sec.: 244 es un oligonucleotido inmunoestimulador relativamente debil comparado con N° ident. de sec.: 242:
T*g*t*c_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:243)
T*g*t*c*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:244)
A pesar de que los acidos nucleicos inmunoestimuladores completamente estabilizados de menos de 20 nucleotidos de longitud pueden tener una actividad inmunoestimuladora modesta en comparacion con oligonucleotidos completamente estabilizados mas largos (por ejemplo, de 24 nucleotidos de longitud), se ha descubierto que los oligonucleotidos semiblandos de tan solo 16 nucleotidos de longitud tienen una actividad inmunoestimuladora al menos igual a la actividad inmunoestimuladora de los oligonucleotidos completamente estabilizados de mas de 20 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, N° ident. de sec.: 245 y 5602 (ambos de 16 bases con secuencia parcialmente similar a N° ident. de sec.: 242) exhiben una actividad inmunoestimuladora comparable a la de N° ident. de sec.: 242 (24 bases).
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.: 245)
5602 T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.: 56)
T*c*g*t*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.: 242)
En algunos casos donde un oligonucleotido fosforotioato de 6 bases parecfa carecer de actividad inmunoestimuladora, la sustitucion de incluso un enlace fosforotioato en lugar de un enlace internucleotidos YZ interno fosfodiester resulto generar uno de 6 bases correspondiente con actividad inmunoestimuladora.
Tambien se cree que las propiedades precedentes de los oligonucleotidos semiblandos generalmente aumentan con una “dosis” mayor de enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester que impliquen dinucleotidos YZ internos. Por tanto, se cree, por ejemplo, que generalmente para una secuencia de oligonucleotidos dada con cinco dinucleotidos YZ internos, un oligonucleotido con cinco enlaces internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester internos es mas inmunoestimulador que un oligonucleotido con cuatro enlaces internucleotidos YG fosfodiester o de tipo fosfodiester internos, el cual, a su vez, es mas inmunoestimulador que un oligonucleotido con tres enlaces internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester internos, el cual, a su vez, es mas inmunoestimulador que un oligonucleotido con dos enlaces internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester internos, el cual, a su vez, es mas inmunoestimulador que un oligonucleotido con un enlace internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester interno. Lo que es importante, se cree que la inclusion de aun un enlace internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester interno resulta ventajosa respecto de la falta de enlaces internucleotidos YZ fosfodiester o de tipo fosfodiester internos. Ademas del numero de enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester, la posicion a lo largo del acido nucleico tambien puede afectar la potencia.
Ejemplos no taxativos de oligonucleotidos semiblandos incluyen los descritos por N° ident. de sec. 1-99 y 241 y N° ident. de sec. 100-104.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la presente invencion generalmente estan protegidos de la degradacion rapida en el suero. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la presente invencion tambien estan generalmente protegidos de la degradacion rapida en la mayona de los tejidos, con la excepcion de tejidos particulares con actividad de nucleasa espedfica o excesiva que son capaces de degradar los oligonucleotidos inmunoestimuladores. Esto provoca la reduccion de los oligonucleotidos inmunoestimuladores en aquellos tejidos en particular, cuya acumulacion podna, de otro modo, generar efectos indeseables de una terapia a largo plazo que utilizara oligonucleotidos resistentes a la degradacion. Los oligonucleotidos de la presente invencion generalmente incluiran, ademas de los enlaces internucleotidos fosfodiester en posiciones internas preferidas, extremos 5' y 3' que son resistentes a la degradacion. Dichos extremos resistentes a la degradacion pueden implicar cualquier modificacion adecuada que produzca una mayor resistencia contra la digestion por exonucleasas respecto de los extremos no modificados correspondientes. A modo de ejemplo, los extremos 5' y 3' pueden estabilizarse mediante la inclusion en dichas posiciones de al menos una modificacion en el fosfato del esqueleto. En una realizacion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
preferida, al menos dicha modificacion en el fosfato del esqueleto en cada extremo es independientemente un enlace internucleotidos fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, o metilfosforotioato. En otra realizacion, el extremo resistente a la degradacion incluye una o mas unidades de nucleotidos conectadas por enlaces peptidicos o amida en el extremo 3'. Incluso otros extremos estabilizados, que incluyen no taxativamente los descritos mas adelante, tienen por objeto estar comprendidos en la invencion.
Tal como se describe en lo precedente, los oligonucleotidos de la presente invencion incluyen fosfodiester dentro de dinucleotidos CG internos. Dichos dinucleotidos CG frecuentemente son parte de motivos inmunoestimuladores. Sin embargo, no es necesario que un oligonucleotido contenga fosfodiester dentro de cada motivo inmunoestimulador. A modo de ejemplo, un oligonucleotido como ser t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:242) con cuatro dinucleotidos CpG podna tener enlaces fosfodiester entre la C y la G del segundo, tercer, o cuarto dinucleotido CpG y cualquier combinacion de estos. Tambien pueden mantenerse enlaces fosfodiester o de tipo fosfodiester adicionales para una digestion renal aun mas rapida de estos “oligonucleotidos estabilizados” de otro modo. Por ejemplo, N° ident. de sec.: 242 ademas contiene dos dinucleotidos TG internos, uno de los cuales o ambos, solos o en combinacion con cualquier dinucleotido CG interno, o con o una combinacion de ellos, pueden tener enlaces internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester.
Un enlace internucleotidos fosfodiester es el tipo de enlace caractenstico de los acidos nucleicos que se encuentran en la naturaleza. Como se muestra en la Figura 20, el enlace internucleotidos fosfodiester incluye un atomo de fosforo flanqueado por dos atomos de oxfgeno en puente y unidos tambien por dos atomos de oxfgeno adicionales, uno con carga y el otro sin carga. Se prefiere particularmente un enlace internucleotidos fosfodiester cuando es importante reducir la vida media en el tejido del oligonucleotido.
Un enlace internucleotidos de tipo fosfodiester es un grupo puente que incluye fosforo y que es qrnmica y/o diastereomericamente similar al fosfodiester. Las medidas de similitud al fosfodiester incluyen susceptibilidad a la digestion por nucleasas y capacidad para activar el ARNse H. Asf, por ejemplo, los oligonucleotidos fosfodiester, pero no los fosforotioato, son susceptibles a la digestion por nucleasas, mientras que tanto los oligonucleotidos fosfodiester como los fosforotioato activan el ARNse H. En una realizacion preferida el enlace internucleotidos de tipo fosfodiester es un enlace boranofosfato (o equivalentemente, boranofosfonato). Patente de EE.UU. N° 5,177,198; patente de EE.UU. N° 5,859,231; patente de EE.UU. N° 6,160,109; patente de EE.UU. N° 6,207,819; Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. En otra realizacion preferida el enlace internucleotidos de tipo fosfodiester es fosforotioato Rp diastereomericamente puro. Se cree que el fosforotioato Rp diastereomericamente puro es mas susceptible a la digestion por nucleasas y es mejor para activar el ARNse H que el fosforotioato Sp mixto o diastereomericamente puro. Los estereoisomeros de oligonucleotidos CpG son el objeto de la solicitud de patente de los EE.UU. en tramitacion con la presente 09/361,575 presentada el 27 de julio de 1999 y publicada como solicitud PCT PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Se debe observar que para los propositos de la presente invencion, el termino “enlace internucleotidos de tipo fosfodiester” excluye espedficamente los enlaces internucleotidos fosforoditioato y metilfosfonato.
Las moleculas de acido nucleico inmunoestimuladoras de la presente invencion poseen un esqueleto quimerico. Para los propositos de la presente invencion, un esqueleto quimerico se refiere a un esqueleto parcialmente estabilizado, en donde al menos un enlace internucleotidos es fosfodiester o de tipo fosfodiester y en donde al menos otro enlace internucleotidos es un enlace internucleotidos estabilizado, en donde al menos un enlace fosfodiester o de tipo fosfodiester y dicho enlace estabilizado son diferentes. Dado que se ha informado que los enlaces boranofosfonato son estables respecto de los enlaces fosfodiester, para los propositos de la naturaleza quimerica del esqueleto, los enlaces boranofosfonato pueden clasificarse como de tipo fosfodiester o como estabilizados, segun el contexto. Por ejemplo, un esqueleto quimerico de acuerdo con la presente invencion en una realizacion podna incluir al menos un enlace fosfodiester (fosfodiester o de tipo fosfodiester) y al menos un enlace boranofosfonato (estabilizado). En otra realizacion un esqueleto quimerico de acuerdo con la presente invencion podna incluir enlaces boranofosfonato (fosfodiester o de tipo fosfodiester) y fosforotioato (estabilizados). Un “enlace internucleotidos estabilizado” significa un enlace internucleotidos que es relativamente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo, mediante una exonucleasa o una endonucleasa), comparado con un enlace internucleotidos fosfodiester. Los enlaces internucleotidos estabilizados preferidos incluyen, no de forma taxativa, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato y metilfosforotioato. Otros enlaces internucleotidos estabilizados incluyen, de manera no taxativa: los enlaces peptfdicos, alquilo, defosfo y otros como se describe en lo precedente.
Los esqueletos modificados como ser los fosforotioatos pueden sintetizarse usando tecnicas automatizadas que emplean qmmicas de fosforamidato o bien de H-fosfonato. Los arilfosfonatos y los alquilfosfonatos pueden hacerse, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N° 4,469,863; y los alquilfosfotriesteres (en los cuales la parte o resto de oxfgeno cargada esta alquilada como se describe en la patente de EE.UU. N° 5,023,243 y en la patente europea N° 092,574) pueden prepararse mediante una smtesis de fase solida automatizada usando reactivos disponibles comercialmente. Se han descrito metodos para hacer otras modificaciones y sustituciones al esqueleto del ADN. Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Tambien se conocen metodos para preparar oligonucleotidos quimericos. A modo de ejemplo, las patentes otorgadas a Uhlmann et al han descrito tales tecnicas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
El ODN modificado de esqueleto mixto puede ser sintetizado usando un sintetizador de DNA comercialmente disponible y de qmmica de fosforamidita estandar. (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991 y M. D. Matteucci y M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)) Luego del acoplamiento, los enlaces PS son introducidos por sulfuracion empleando el reactivo Beaucage (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan y S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0,075 M en acetonitrilo) o fenil acetil disulfuro (PADS) y a continuacion obturado con anhfdrido acetico, 2,6-lutidina en tetrahidrofurano (1:1:8; v:v:v) y W-metilimidazol (16 % en tetrahidrofurano). Este paso de obturacion se ejecuta despues de la reaccion de sulfuracion para minimizar la formacion de enlaces fosfodiester (PO) indeseados en posiciones donde debena ubicarse un enlace fosforotioato. En el caso de la introduccion de un enlace fosfodiester, p.ej. en un dinucleotido CpG, el fosforo-III intermediario se oxida mediante un tratamiento con una solucion de yodo en agua/piridina. Despues del clivado del soporte solido y la desproteccion final por tratamiento con amomaco concentrado (15 h a 50 °C), el ODN es analizado por HPLC en una columna Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) usando un gradiente de NaCl (p.ej. solucion amortiguadora A: NaH2PO4 10 mM en acetonitrilo/agua = 1:4/v:v pH 6,8; solucion amortiguadora B:
NaH2PO4 10 mM , NaCl 1,5 M en acetonitrilo/agua = 1:4/v:v; 5 a 60 % B en 30 minutos a 1 ml/min) o por
electroforesis en gel capilar. El ODN puede purificarse por HPLC o por FPLC en una columna Source High Performance (Amersham Pharmacia). Las fracciones homogeneas obtenidas de HPLC se combinan y se les elimina la sal mediante una columna C18 o por ultrafiltracion. El ODN fue analizado por espectrometna de masas MALDI- TOF para confirmar la masa calculada.
Los acidos nucleicos de la invencion tambien pueden incluir otras modificaciones. Estas incluyen analogos de ADN no ionicos, como ser alquilfosfatos y arilfosfatos (en los cuales el oxfgeno fosfonato cargado es reemplazado por un grupo alquilo o arilo), fosfodiester y alquilfosfotriesteres, en los cuales la parte de oxfgeno cargada esta alquilada. Tambien se ha demostrado que los acidos nucleicos que contienen diol, como ser tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos son sustancialmente resistentes a la degradacion por nucleasas.
El tamano (es decir, el numero de residuos nucleotidicos a lo largo del acido nucleico) del oligonucleotido inmunoestimulador tambien puede contribuir a la actividad estimuladora del oligonucleotido. A fin de facilitar la absorcion en las celulas, los oligonucleotidos inmunoestimuladores preferiblemente tienen una longitud minima de 6 residuos nucleotfdicos. Los acidos nucleicos de cualquier tamano superior a 6 nucleotidos (incluso de muchos kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmune de acuerdo con la invencion si estan presentes suficientes motivos inmunoestimuladores ya que los acidos nucleicos mas largos se degradan dentro de las celulas. Los inventores de la presente creen que los oligonucleotidos semiblandos de tan solo 4 nucleotidos de longitud tambien pueden ser inmunoestimuladores si pueden ser suministrados al interior de la celula. En ciertas realizaciones preferidas de acuerdo con la presente invencion, los oligonucleotidos inmunoestimuladores tienen entre 4 y 100 nucleotidos de longitud. En las realizaciones tfpicas, los oligonucleotidos inmunoestimuladores tienen entre 6 y 40 nucleotidos de longitud. En ciertas realizaciones preferidas de acuerdo con la presente invencion, los oligonucleotidos inmunoestimuladores tienen entre 6 y 19 nucleotidos de longitud.
Los oligonucleotidos de la presente invencion son acidos nucleicos que contienen secuencias espedficas que, se ha descubierto, provocan una respuesta inmune. Estas secuencias espedficas que provocan una respuesta inmune se denominan “motivos inmunoestimuladores” y los oligonucleotidos que contienen motivos inmunoestimuladores se denominan “moleculas de acido nucleico inmunoestimulador” y, equivalentemente, “acidos nucleicos inmunoestimuladores” u “oligonucleotidos inmunoestimuladores”. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invencion, por lo tanto, incluyen al menos un motivo inmunoestimulador. En una realizacion preferida el motivo inmunoestimulador es un “motivo inmunoestimulador interno”. El termino “motivo inmunoestimulador interno” hace referencia a la posicion de la secuencia de motivos dentro de una secuencia de acidos nucleicos mas larga, que es mas larga en longitud que la secuencia de motivos al menos por un nucleotido enlazado a ambos extremos 5' y 3' de la secuencia de motivos inmunoestimuladores.
En la invencion, los oligonucleotidos inmunoestimuladores incluyen motivos inmunoestimuladores que son “dinucleotidos CpG”. Un dinucleotido CpG puede estar metilado o no metilado. Un acido nucleico inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleotido CpG no metilado es una molecula de acido nucleico que contiene una secuencia de dinucleotidos citosina-guanina no metilados (es decir, una citidina 5' no metilada seguida por guanosina 3' y enlazadas por una union de fosfato) y la cual activa el sistema inmune; dicho acido nucleico inmunoestimulador es un acido nucleico CpG. Los acidos nucleicos CpG se han descrito en numerosas patentes otorgadas, en solicitudes de patentes publicadas y en otras publicaciones, entre las que se incluyen las patentes de los EE.UU. N° 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; y 6,339,068. Un acido nucleico inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleotido CpG metilado es un acido nucleico que contiene una secuencia de dinucleotidos citosina-guanina metilada (es decir, una citidina 5' metilada seguida por una guanosina 3' y enlazadas por una union de fosfato) y el cual activa el sistema inmune. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores pueden, de otro modo, no contener dinucleotidos CpG. Estos oligonucleotidos sin dinucleotidos CpG se denominan oligonucleotidos no CpG y tienen motivos inmunoestimuladores no CpG. Los acidos nucleicos con otros tipos de motivos inmunoestimuladores pueden ser metilados o no metilados. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la invencion, ademas, pueden incluir cualquier combinacion de motivos inmunoestimuladores CpG y no CpG metilados y no metilados.
5
10
15
20
25
30
35
En cuanto a los acidos nucleicos CpG, recientemente se ha descrito que existen diferentes clases de acidos nucleicos CpG. Una clase es potente para activar celulas B pero es relativamente debil en la induccion de IFN-a y en la activacion de celulas NK; esta clase se ha denominado la clase B. Tfpicamente, los acidos nucleicos CpG clase B estan completamente estabilizados e incluyen un dinucleotido CpG no metilado dentro de ciertos contextos de bases preferidos. Vease, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N° 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; y 6,339,068. Otra clase es potente para inducir IFN-a y para activar las celulas NK pero es relativamente debil para estimular las celulas B; esta clase se ha denominado la clase A. Los acidos nucleicos CpG clase A tipicamente tienen secuencias poli-G estabilizadas en los extremos 5' y 3' y una secuencia palindromica que contiene dinucleotidos CpG fosfodiester de al menos 6 nucleotidos. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente publicada PCT/US00/26527 (WO 01/22990). Incluso otra clase de acidos nucleicos CpG activa celulas B y celulas NK e induce IFN-a; esta clase se ha denominado la clase C. Los acidos nucleicos CpG clase C, en una primera caracterizacion, tipicamente estan completamente estabilizados, incluyen una secuencia tipo clase B y un palmdromo o cuasi-palmdromo rico en GC. Esta clase se ha descrito en la solicitud de patente provisional de los EE.UU. en tramitacion con la presente 60/313,273, presentada el 17 de agosto de 2001 y US10/224,523 presentada el 19 de agosto de 2002. Algunos ejemplos no taxativos de acidos nucleicos de clase C incluyen:
N° ident. de sec.
Secuencia
275
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
369
T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
370
T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
371
T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
372
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
373
T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
374
T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
375
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G
316
T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
Por lo tanto, en un aspecto la invencion implica el hallazgo de que subclases espedficas de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG que poseen esqueletos quimericos son altamente efectivas para mediar efectos inmunoestimuladores. Estos acidos nucleicos CpG poseen utilidad terapeutica y profilactica para estimular el sistema inmune para tratar el cancer, enfermedades infecciosas, alergias, asma, enfermedades autoinmunes y otros trastornos y como proteccion frente a infecciones oportunistas luego de la quimioterapia para el cancer. Las respuestas inmunes celulares y humorales fuertes aunque equilibradas provocadas por la estimulacion con CpG reflejan el sistema de defensas natural propio del organismo contra patogenos invasores y celulas cancerosas.
La invencion implica, en un aspecto, el descubrimiento de que un subgrupo de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG poseen propiedades inmunoestimuladoras mejoradas y un efecto inflamatorio renal reducido. En algunos casos, la inflamacion renal se ha observado en individuos que recibieron un oligonucleotido con todos sus enlaces fosforotioato. Se cree que los acidos nucleicos quimericos descritos en la presente producen menos inflamacion renal que los oligonucleotidos con todos sus enlaces fosforotioato. Adicionalmente, estos oligonucleotidos son altamente efectivos en la estimulacion de una respuesta inmune. Por tanto, la region fosfodiester de la molecula no redujo su efectividad.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG se pueden ubicar dentro de una de las 6 formulas generales siguientes:
5' t*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2*T*T 3' (N° ident. de sec.:296),
5' t*C*G*(T7A*)TN3CGTTTTN4CGN5*T*T 3' (N° ident. de sec.:301),
5' t*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.:307),
5' T*C_G(N6C_G N7)2-3T*C_G*T*T 3' (N° ident. de sec.:311-312),
5' T*T*GX1X2TGXaX4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T 3' (N° ident. de sec.:331) y 5' T*CGCGNbCGCGC*GN9 3' (N° ident. de sec.:332).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
En estas formulas N es cualquier nucleotido, N1 tiene 0-6 nucleotidos, N2 tiene 0-7 nucleotidos, N3 tiene 0-4 nucleotidos, N4 tiene 1-5 nucleotidos, N5 tiene 0-7 nucleotidos, N6 y N7 tienen independientemente entre 1 y 5 nucleotidos de longitud, N8 tiene entre 4 y 10 nucleotidos de longitud, Ng tiene entre 0 y 3 nucleotidos de longitud y en donde N10 tiene entre 4 y 8 nucleotidos de longitud. X1, X2, X3 y X4 son independientemente C o G. Las formulas definen subgrupos de la clase de oligonucleotidos CpG que demostraron excelentes propiedades inmunoestimuladoras e incluso fueron mas sensibles a la degradacion dentro del cuerpo que los oligonucleotidos que contienen todos sus enlaces fosforotioato. En la formula 5' se refiere al extremo 5' libre del oligonucleotido y 3' se refiere al extremo 3' libre del oligonucleotido.
El sfmbolo * utilizado en las formulas hace referencia a la presencia de un enlace internucleotidos estabilizado. Los enlaces internucleotidos no marcados con * pueden ser estabilizados o no estabilizados, siempre que el oligonucleotido incluya al menos 2-3 enlaces internucleotidos fosfodiester. En algunas realizaciones se prefiere que los oligonucleotidos incluyan 3-6 enlaces fosfodiester. En algunos casos los enlaces entre los motivos CG son fosfodiester y en otros casos son fosforotioato u otros enlaces estabilizados.
Otras formulas incluyen 5' TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT 3' (N° ident. de sec.: 368), en donde al menos un dinucleotido CG tiene un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester y el oligonucleotido incluye al menos un enlace internucleotidos estabilizado y 5'GNC 3', en donde N es una secuencia de acido nucleico de 4-10 nucleotidos de longitud y tiene al menos un 50% de T y no incluye un dinucleotido CG y el oligonucleotido incluye al menos un enlace internucleotidos estabilizado.
El oligonucleotido puede tener una de las siguientes estructuras:
5' t*C*G*T*C*G*TTTTGAN1C*G*N2*T*T 3' (N° ident. de sec.:296),
5' t*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2*T*T 3' (N° ident. de sec.:296),
5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N1C*G*N2*T*T 3' (N° ident. de sec.:296),
5' t*C*G*(T*/A*)TNsCGTTTTN4C*G*N5*T*T 3' (N° ident. de sec.:301),
5' t*C*G*A*T*NsC*G*TTTTN4C_G_*N5*T*T 3' (N° ident. de sec.:302),
5' t*C*G*T*T*NsC_G_TTTTN4CGN5*T*T 3' (N° ident. de sec.:303),
5' t*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.:307),
5' t*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.:308), o
5' t*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.:309).
El sfmbolo _ en estas estructuras hace referencia a la presencia de un enlace internucleotidos fosfodiester.
Algunos ejemplos preferidos de las estructuras incluyen los siguientes:
5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 327),
5' t*c*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 328),
5' t*c*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T 3' (N° ident. de sec.: 324), 5' T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 325),
5' t*c*g*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T 3' (N° ident. de sec.: 323),
5' t*c*g*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 326),
5' t*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 322), 5' t*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 313), 5' t*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (N° ident. de sec.: 314), 5' t*t*g*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3' (N° ident. de sec.: 319),
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (N° ident. de sec.: 316), 5' t*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G 3' (N° ident. de sec.: 317),
5' t*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3' (N° ident. de sec.: 320), 5'
T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (N° ident. de sec.: 321), T*C-G*T*C-G*T*T, C-G*T*C- q*j*j*j g*T*G q*y*y*y*y t*C 0*"r*"r*"r*"r*0 q q*y*y*y*y*q*^ y*y*y*y*q*^*q q X*T*T*G*A*G G*T
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
T*T*G*A*C G*T*T T*G*A*C G*T*T*T G*A*G 0*t*t*t*t A*G 0*t*t*t*t*0 q q*y*y*y*y*q*y y*y*y*y*q*y*q q
j*j*j*q*j*q Q*y 0*y*y*y*y*0*y*q q y*y*q*y*q 0*y*y
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores generalmente tienen una longitud que oscila entre 4 y 100 y en algunas realizaciones entre 10 y 40. La longitud puede estar en el rango de entre 16 y 24 nucleotidos.
Los terminos “acido nucleico” y “oligonucleotido” tambien comprenden acidos nucleicos u oligonucleotidos con sustituciones o modificaciones, tal tomo en las bases y/o azucares. Por ejemplo, ellos incluyen acidos nucleicos que tienen azucares de esqueleto que estan unidos covalentemente a grupos organicos de peso molecular bajo distintos de un grupo hidroxilo en la posicion 2' y distintos de un grupo fosfato o de un grupo hidroxi en la posicion 5'. Por tanto, los acidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Ademas, los acidos nucleicos modificados pueden incluir azucares como arabinosa o 2'-fluoroarabinosa en lugar de ribosa. Por tanto, los acidos nucleicos pueden ser heterogeneos en la composicion de su esqueleto por lo que contienen cualquier combinacion posible de unidades de polfmero enlazadas entre sf como ser acidos nucleicos peptidicos (los cuales tienen un esqueleto de aminoacido con bases de acido nucleico).
Los acidos nucleicos tambien incluyen purinas y pirimidinas sustituidas tales como bases C-5 propina pirimidina y 7- deaza-7-purina sustituida modificadas. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Las purinas y pirimidinas incluyen en forma no taxativa adenina, citosina, guanina, timina, 5-metilcitosina, 5-hidroxicitosina, 5-fluorocitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina y otras nucleobases que ocurren naturalmente y no naturalmente, partes o restos aromaticos sustituidos y no sustituidos. Otras modificaciones de este tipo son muy conocidas por los expertos en la tecnica.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores de la presente invencion pueden abarcar diversas modificaciones y sustituciones qmmicas, en comparacion con el aRn y ADN naturales, que involucran un puente internucleotidos fosfodiester, una unidad de p-D-ribosa y/o una base de nucleotidos natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Los ejemplos de modificaciones qmmicas son conocidos por los expertos y estan descritos, por ejemplo, en Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; y Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Un oligonucleotido de acuerdo con la invencion puede tener una o mas modificaciones, en donde cada modificacion esta ubicada en un puente internucleotidos fosfodiester particular y/o en una unidad p-D-ribosa particular y/o en una posicion de base nucleotidica natural particular en comparacion con un oligonucleotido de la misma secuencia la cual esta compuesta de ADN o ARN naturales.
Por ejemplo, la invencion se refiere a un oligonucleotido que puede comprender una o mas modificaciones y en donde cada modificacion se selecciona independientemente de:
a) el reemplazo de un puente internucleotidos fosfodiester ubicado en el extremo 3' y/o en el extremo 5' de un nucleotido por un puente internucleotidos modificado.
b) el reemplazo de un puente fosfodiester ubicado en el extremo 3' y/o en el extremo 5' de un nucleotido por un puente defosfo.
c) el reemplazo de una unidad de fosfato de azucar del esqueleto de fosfato de azucar por otra unidad,
d) el reemplazo de una unidad de p-D-ribosa por una unidad de azucar modificada y
el reemplazo de una base nucleotfdica natural por una base nucleotidica modificada.
Otros ejemplos detallados de la modificacion qmmica de un oligonucleotido son los que se expresan a continuacion.
Un puente internucleotidos fosfodiester ubicado en el extremo 3' y/o en el extremo 5' de un nucleotido puede ser reemplazado por un puente internucleotidos modificado, en donde el puente internucleotidos modificado, por ejemplo, se selecciona de puentes fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, a-hidroxibencil fosfonato, fosfato-(C1-C21)-O-alquil ester, fosfato-[(C6-C12)aril-(C1-C21)-O-alquil]ester, (C1-Cs)alquilfosfonato y/o (C6- C12)arilfosfonato, (C7-C12)-a-hidroximetil-arilo (por ejemplo, descrito en WO 95/01363), en donde (C6-C12)arilo, (C6- C20)arilo y (C6-C14)arilo son opcionalmente sustituidos por halogeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano y en donde R1 y R2 son, independientemente entre sf, hidrogeno, (C1-C1s)-alquilo, (C6-C20)-arilo, (C6-C14)-aril-(C1-Cs)-alquilo, preferiblemente hidrogeno, (C1-Cs)-alquilo, preferiblemente (C1-C4)-alquilo y/o metoxietilo, o R1 y R2 forman, junto con el atomo de nitrogeno que los porta, un anillo heterodclico de 5-6 miembros que, adicionalmente, puede contener un heteroatomo adicional del grupo O, S y N.
El reemplazo de un puente fosfodiester ubicado en el extremo 3' y/o en el extremo 5' de un nucleotido por un puente defosfo (los puentes defosfo estan descritos, por ejemplo, en Uhlmann E y Peyman A en “Methods in Molecular Biology”, Vol. 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capttulo 16, pp. 355 ss.), en donde un puente defosfo se selecciona, por ejemplo, de puentes defosfo formacetal, 3'- tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o grupos sililo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Una unidad de fosfato de azucar (por ejemplo, un puente internucleotidos fosfodiester y p-D-ribosa que forman juntos una unidad de fosfato de azucar) del esqueleto del fosfato de azucar (es decir, un esqueleto de fosfato de azucar esta compuesto de unidades de fosfato de azucar) puede ser reemplazada por otra unidad, en donde la otra unidad, por ejemplo, es adecuada para construir un oligomero “morfolino derivado” (como se describe, a modo de ejemplo, en Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad morfolino derivada; o para construir un acido nucleico poliamida (“PNA”; como se describe, por ejemplo, en Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad de esqueleto PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina.
Una unidad de p-ribosa o una unidad de p-D-2'-desoxirribosa puede ser reemplazada por una unidad de azucar modificada, en donde la unidad de azucar modificada se selecciona, a modo de ejemplo, de p-D-ribosa, a-D-2'- desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-F-arabinosa, 2'-O-(C1-C6)alquil-ribosa, preferiblemente 2'- O-(C1-C6)alquil-ribosa es 2'-O-metilrribosa, 2'-O-(C2-C6)alquenil-ribosa, 2'-[O-(C1-C6)alquil-O-(C1-C6)alquil]-ribosa, 2'- NH2-2'-desoxirribosa, p-D-xilo-furanosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-p-D-eritro-hexo-piranosa y analogos de azucar carbodclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) y/o de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) y/o analogos de bicicloazucar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481).
En algunas realizaciones preferidas el azucar es 2'-O-metilrribosa, particularmente para uno o ambos nucleotidos enlazados por un enlace internucleotidos fosfodiester o de tipo fosfodiester.
Los acidos nucleicos tambien incluyen purinas y pirimidinas sustituidas tales como bases C-5 propina pirimidina y 7- deaza-7-purina sustituida modificadas. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Las purinas y las pirimidinas incluyen, no de forma taxativa, adenina, citosina, guanina y timina y otras nucleobases que ocurren naturalmente y no naturalmente, partes o restos aromaticos sustituidos y no sustituidos.
Una base modificada es cualquier base que sea qmmicamente distinta de las bases que se presentan naturalmente, tipicamente encontradas en el ADN y en el ARN como T, C, G, A y U, pero que comparten las estructuras qmmicas basicas con estas bases que se presentan naturalmente. La base nucleotidica modificada, por ejemplo, puede seleccionarse de hipoxantina, uracilo, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-(C-i- C6)-alquiluracilo, 5-(C2-C6)-alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo,
5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(C-i-C6)-alquilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)- alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-deazapurina sustituida, preferiblemente purina 7-deaza-7-sustituida y/o 7-deaza-8-sustituida, 5- hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por ejemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxidesoxicitidina, 5- hidroximetildesoxicitidina, N4-alquildesoxicitidina, por ejemplo, N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina y desoxirribonucleotidos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina y diaminopurina por ejemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina u otras modificaciones de una base nucleotfdica natural. Esta lista se ofrece a modo de ejemplo y no debe interpretarse como limitativa.
En formulas particulares descritas en la presente se define un conjunto de bases modificadas. Por ejemplo, la letra Y se utiliza para referirse a un nucleotido que contiene una citosina o una citosina modificada. Una citosina modificada como se usa en la presente es un analogo de citosina de una base piriirndica que se presenta naturalmente o que no se presenta naturalmente que puede reemplazar esta base sin perjudicar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleotido. Las citosinas modificadas incluyen, de forma no taxativa, citosinas 5-sustituidas (por ejemplo 5-metil- citosina, 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil- citosina, 5-difluorometil-citosina y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas 6-sustituidas, citosinas N4- sustituidas (por ejemplo N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, analogos de citosina con sistemas de anillo condensado (por ejemplo N,N'-propilen citosina o fenoxazina) y uracilo y sus derivados (por ejemplo 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinil-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5- propinil-uracilo). Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5- hidroximetil-citosina y N4-etil-citosina. En otra realizacion de la invencion, la base de citosina esta sustituida por una base universal (por ejemplo 3-nitropirrol, base P), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo fluorobenceno o difluorobenceno) o un atomo de hidrogeno (dSpacer).
La letra Z se utiliza para referirse a la guanina o a una base de guanina modificada. Una guanina modificada como se usa en la presente es un analogo de guanina de base purica que se presenta naturalmente o que no se presenta naturalmente que puede reemplazar esta base sin perjudicar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleotido. Las guaninas modificadas incluyen, no en forma taxativa, 7-deazaguanina, 7-deaza-7-guanina sustituida (como ser 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina), 7-deaza-8-guanina sustituida, hipoxantina, guaninas N2-sustituidas (por ejemplo N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina) guanina 8-sustituida (por ejemplo 8-hidroxiguanina y 8-bromoguanina) y 6-tioguanina. En otra realizacion de la invencion, la base de guanina esta sustituida por una base universal (por ejemplo 4-metil-indol, 5-nitro-indol y base K), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo bencimidazol o dicloro-bencimidazol, 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-amida de acido carboxflico) o un atomo de hidrogeno (dSpacer).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Los oligonucleotidos pueden tener uno mas extremos 5' accesibles. Es posible crear oligonucleotidos modificados que tengan dos extremos 5' como los mencionados. Esto puede lograrse, por ejemplo, uniendo dos oligonucleotidos a traves de un enlace 3'-3' para generar un oligonucleotido que tenga uno o dos extremos 5' accesibles. El enlace 3'3' puede ser un fosfodiester, un fosforotioato o cualquier otro puente internucleotidos modificado. Los metodos para realizar dichos enlaces son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, dichos enlaces han sido descritos en Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 y Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
Asimismo, los acidos nucleicos enlazados 3'-3' donde el enlace entre los nucleotidos 3' terminales no es un fosfodiester, fosforotioato u otro puente modificado, pueden prepararse usando un espaciador adicional, como ser una parte tri- o tetra-etilenglicol fosfato (Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197204, patente de los EE.UU. N° 5658738 y en la patente de los EE.Uu. N° 5668265). Alternativamente, el enlazador no nucleotidico puede derivarse de etanodiol, propanodiol, o de una unidad de desoxirribosa no basica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'- attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) empleando la qmmica de fosforamidita estandar. Los enlazadores no nucleotfdicos pueden incorporarse una vez o multiples veces, o combinarse entre sf y asf permitir cualquier distancia deseable entre los extremos 3' de los dos ODN que se van a enlazar.
Recientemente se ha informado que los oligonucleotidos CpG parecen ejercer su efecto inmunoestimulador a traves de la interaccion con el receptor de tipo Toll 9 (TLR9). Hemmi H et al. (2000) Nature□ 408:740-5. La actividad de senalizacion del TLR9, por lo tanto, puede medirse en respuesta al oligonucleotido CpG o a otro acido nucleico inmunoestimulador midiendo las senales NF-kB, NF-KB-relacionadas y los sucesos e intermediarios adecuados por encima de NF-kB.
Para usarse en la presente invencion, los oligonucleotidos de la invencion pueden sintetizarse de novo empleando cualquier numero de procedimientos muy conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el metodo de b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.L. y Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); el metodo de nucleotidos H-fosfonato (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986, ; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Estas qrnmicas pueden ser ejecutadas por una variedad de sintetizadores de acidos nucleicos automatizados disponibles en el mercado. Estos oligonucleotidos se denominan oligonucleotidos sinteticos. Un oligonucleotido aislado generalmente hace referencia a un oligonucleotido que esta separado de los componentes con los cuales normalmente esta asociado en la naturaleza. A modo de ejemplo, un oligonucleotido aislado puede ser uno que esta separado de una celula, de un nucleo, de la mitocondria o de la cromatina.
Los oligonucleotidos son parcialmente resistentes a la degradacion (por ejemplo estan estabilizados). Una “molecula de oligonucleotido estabilizado” refiere a un oligonucleotido que es relativamente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo mediante una exo-nucleasa o una endo-nucleasa). La estabilizacion del acido nucleico puede lograrse por medio de modificaciones del esqueleto. Los oligonucleotidos que tienen enlaces fosforotioato proporcionan una actividad maxima y protegen al oligonucleotido de la degradacion por medio de exo-nucleasas y endo-nucleasas intracelulares. Otros oligonucleotidos modificados incluyen acidos nucleicos fosfodiester modificados, combinaciones de acido nucleico fosfodiester y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de estos.
Los esqueletos modificados como ser los fosforotioatos pueden sintetizarse usando tecnicas automatizadas que emplean qrnmicas de fosforamidato o bien de H-fosfonato. Los arilfosfonatos y los alquilfosfonatos pueden hacerse, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N° 4,469,863; y los alquilfosfotriesteres (en los cuales la parte o resto de oxfgeno cargado esta alquilado como se describe en la patente de EE.UU. N° 5,023,243 y en la patente europea N° 092,574) pueden prepararse mediante una smtesis de fase solida automatizada usando reactivos disponibles comercialmente. Se han descrito metodos para hacer otras modificaciones y sustituciones al esqueleto del ADN (por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990).
Otros oligonucleotidos estabilizados incluyen: analogos de ADN no ionicos, como ser alquilfosfatos y arilfosfatos (en los cuales el oxfgeno fosfonato cargado es reemplazado por un grupo alquilo o arilo), fosfodiester y alquilfosfotriesteres, en los cuales la parte de oxfgeno cargada esta alquilada. Tambien se ha demostrado que los acidos nucleicos que contienen diol, como ser tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o ambos extremos son sustancialmente resistentes a la degradacion por nucleasas.
Si bien los efectos de la CpG en ratones estan bien caracterizados, la informacion respecto del sistema humano es limitada. Los oligonucleotidos fosforotioato CpG con fuerte actividad estimuladora en el sistema de ratones muestran menor actividad en las celulas inmunes de los seres humanos y de otros no roedores. En los ejemplos, se describe el desarrollo de un motivo CpG humano potente y la caracterizacion de sus efectos y mecanismos de accion en PBMC de humanos, por ejemplo celulas B y celulas NK. El ADN que contiene estos motivos CpG y esqueletos parcialmente modificados estimularon fuertemente las celulas de la sangre periferica humana para producir IL-6, IL-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
10, IP-10, TNF-a, IFN -a , e IFN-y. El IFN-y aumento por encima de los niveles de control. Las celulas NK y las celulas T tambien fueron inducidas para expresar niveles aumentados de CD69.
De acuerdo con la invencion se ha descubierto que los subgrupos de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tienen efectos inmunoestimuladores sorprendentes en las celulas humanas como ser las celulas NK, lo que sugiere que estos oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG son agentes terapeuticos efectivos para la vacunacion de los seres humanos, la inmunoterapia contra el cancer, la inmunoterapia contra el asma, el mejoramiento general de la funcion inmune, el mejoramiento de la recuperacion hematopoyetica luego de radiacion o de quimioterapia, las enfermedades autoinmunes y otras aplicaciones inmuno modulatorias.
Por tanto, los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG resultan utiles en algunos aspectos de la invencion como vacuna para el tratamiento de un individuo en situacion de riesgo de desarrollar alergias o asma, una infeccion con un organismo infeccioso o un cancer en el cual se ha identificado un antfgeno espedfico del cancer. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien pueden darse sin el antfgeno o el alergeno para proteccion contra infecciones, alergia o cancer y en este caso las dosis repetidas pueden permitir una proteccion a mas largo plazo. El termino “individuo en riesgo”, tal como se emplea en la presente, es un individuo que sufre cualquier riesgo de exposicion a un patogeno causante de infeccion o a un cancer o a un alergeno o que esta en riesgo de desarrollar cancer. Por ejemplo, un individuo en riesgo puede ser un individuo que planea viajar a una region donde se halla un tipo particular de agente infeccioso o puede ser un individuo que, por su estilo de vida o por procedimientos medicos, esta expuesto a fluidos corporales que pudieran contener organismos infecciosos o directamente al organismo mismo o incluso cualquier individuo que vive en una region donde se ha identificado un organismo infeccioso o un alergeno. Los individuos en riesgo de desarrollar infeccion tambien incluyen poblaciones en general a las que un organismo de salud recomienda la vacunacion con un antfgeno de un organismo infeccioso en particular. Si el antfgeno es un alergeno y el individuo desarrolla respuestas alergicas a dicho antfgeno en particular y el individuo puede estar expuesto al antfgeno, como ser, durante la estacion del polen, entonces el individuo esta en riesgo de exposicion al antfgeno. Un individuo en riesgo de desarrollar una alergia o asma incluye aquellos individuos en quienes se ha identificado una alergia o asma pero que no tienen la enfermedad activa durante el tratamiento con oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG asf como los individuos considerados en riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a factores geneticos o ambientales.
Un individuo en riesgo de desarrollar un cancer es un individuo que tiene una alta probabilidad de desarrollar cancer. Estos individuos incluyen, a modo de ejemplo, individuos que tienen una anormalidad genetica, cuya presencia ha sido correlacionada, segun se demuestra, con una probabilidad mayor de desarrollar cancer y los individuos expuestos a agentes causantes de cancer como el tabaco, los asbestos u otras toxinas qrnmicas, o un individuo que ha sido previamente tratado por cancer y que se encuentra en aparente remision. Cuando un individuo en riesgo de desarrollar un cancer recibe tratamiento con un antfgeno espedfico para el tipo de cancer que el individuo esta en riesgo de desarrollar y un oligonucleotido inmunoestimulador CpG, el individuo puede estar en condiciones de matar las celulas cancerosas a medida que estas se desarrollan. Si comienza a formarse un tumor en el individuo, el individuo desarrollara una respuesta inmune espedfica contra el antfgeno tumoral.
Ademas de usar los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG para el tratamiento profilactico, la invencion tambien se refiere al uso de los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG para el tratamiento de un individuo que tiene una infeccion, una alergia, asma o un cancer.
Un individuo que tiene una infeccion es una persona que se ha expuesto a un patogeno infeccioso y que tiene niveles detectables agudos o cronicos del patogeno en el cuerpo. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG pueden usarse con o sin un antfgeno con el fin de preparar una respuesta inmune mucosa o sistemica espedfica al antfgeno que sea capaz de reducir el nivel del patogeno infeccioso o de erradicarlo. Una enfermedad infecciosa, como se usa en la presente, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo externo en el cuerpo. Resulta particularmente importante desarrollar estrategias y tratamientos efectivos con vacunas para proteger las superficies mucosas del cuerpo, que constituyen el sitio principal para el ingreso de patogenos.
Un individuo que tiene una alergia es una persona que tiene o esta en riesgo de desarrollar una reaccion alergica en respuesta a un alergeno. Una alergia se refiere a una hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alergeno). Las afecciones alergicas incluyen, de forma no taxativa, eczemas, rinitis alergica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (erupcion cutanea) y alergias a los alimentos y otras afecciones atopicas.
Las alergias generalmente son provocadas por la generacion de anticuerpos IgE contra alergenos inofensivos. Las citocinas que son inducidas por la administracion sistemica o por via de las mucosas de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG son predominantemente de una clase llamada Th1 (cuyos ejemplos son IL-12, IP-10, IFN -a e IFN-y) y estas inducen tanto respuestas inmunes humorales como celulares. El otro de tipo principal de respuesta inmune, el cual esta asociado con la produccion de citocinas IL-4 e IL-5, se denomina respuesta inmune Th2. En general, parece que las enfermedades alergicas son mediadas por respuestas inmunes de tipo Th2. Sobre la base de la capacidad de los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG para cambiar la respuesta inmune en un individuo de una respuesta Th2 predominante (que esta asociada con la produccion de anticuerpos IgE y alergias) a una respuesta equilibrada Th2/Th1 (que protege contra reacciones alergicas), se puede administrar a un individuo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
una dosis efectiva para la induccion de una respuesta immune de un oligonucleotido inmunoestimulador CpG para tratar o prevenir el asma y las alergias.
Por lo tanto, los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG poseen una utilidad terapeutica significativa en el tratamiento de afecciones alergicas y no alergicas como ser asma. Las citocinas Th2, especialmente las IL-4 e IL-5, se elevan en las vfas aereas de los individuos asmaticos. Estas citocinas promueven aspectos importantes de la respuesta inflamatoria asmatica, que incluyen el cambio de isotopo de la IgE, quimiotaxis y activacion de eosinofilos y crecimiento de mastocitos. Las citocinas Th1, especialmente IFN-y e IL-12, pueden inhibir la formacion de clones de Th2 y la produccion de citocinas Th2. Asma se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamacion, estrechamiento de las vfas aereas y aumento de la reactividad de las vfas aereas a los agentes inhalados. El asma, aunque no exclusivamente, suele asociarse con smtomas atopicos o alergicos.
Un individuo que tiene cancer es un individuo que tiene celulas cancerosas detectables. El cancer puede ser un cancer maligno o no maligno. Los canceres o tumores incluyen, en forma no taxativa, cancer del tracto biliar; cancer cerebral; cancer de mama; cancer cervical; coriocarcinoma; cancer de colon; cancer del endometrio; cancer de esofago; cancer gastrico; neoplasmas intraepiteliales; linfomas; cancer de Imgado; cancer de pulmon (por ejemplo celulas pequenas y celulas no pequenas); melanoma; neuroblastomas; cancer oral; cancer ovarico; cancer de pancreas; cancer de prostata; cancer rectal; sarcomas; cancer de piel; cancer testicular; cancer de tiroides; y cancer renal, asf como otros carcinomas y sarcomas. En una realizacion el cancer es leucemia de bulbo capilar, leucemia mielogena cronica, leucemia de las celulas T cutaneas, mieloma multiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de las celulas renales, carcinoma de prostata, carcinoma de las celulas de la vejiga, o carcinoma de colon.
Por individuo se entiende un ser humano o un animal vertebrado entre los que se incluye, de forma no taxativa, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pavo, pollo, primate, por ejemplo un mono y un pez (especies ictfcolas), por ejemplo salmon. Por lo tanto, la invencion tambien puede usarse para tratar cancer y tumores, infecciones y alergia / asma en individuos no humanos. El cancer es una de las causas de muerte principales en animales de compafua (como ser, perros y gatos).
Como se usa en la presente, el termino tratar, tratado o que trata, cuando se usa con respecto a un trastorno como ser una enfermedad infecciosa, cancer, alergia, o asma, se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un individuo al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo, a la infeccion con un patogeno) o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el individuo desarrolle la enfermedad (por ejemplo, que se infecte con el patogeno) asf como un tratamiento despues de que el individuo ha desarrollado la enfermedad a fin de combatir la enfermedad (por ejemplo, reducir o eliminar la infeccion) o impedir que la enfermedad empeore.
En los casos en que el oligonucleotido CpG es administrado con un antfgeno, el individuo puede estar expuesto al antfgeno. Como se usa en la presente, el termino expuesto se refiere al paso activo de poner en contacto al individuo con un antfgeno o bien a la exposicion pasiva del individuo al antfgeno in vivo. Los metodos para la exposicion activa de un individuo a un antfgeno son muy conocidos en la tecnica. En general, un antfgeno es administrado directamente al individuo por medio de la administracion intravenosa, intramuscular, oral, transdermica, por via de las mucosas, por via intranasal, intratraqueal o subcutanea. El antfgeno puede ser administrado sistemica o localmente. Los metodos para administrar el antfgeno y el oligonucleotido inmunoestimulador CpG se describen en mayor detalle a continuacion. Un individuo se expone pasivamente a un antfgeno si un antfgeno esta disponible para su exposicion a las celulas inmunes en el cuerpo. Un individuo puede estar expuesto pasivamente a un antfgeno, por ejemplo, mediante el ingreso de un patogeno externo en el cuerpo o mediante el desarrollo de una celula tumoral que expresa un antfgeno extrano sobre su superficie.
Los metodos en los cuales un individuo se expone pasivamente a un antfgeno pueden depender particularmente de la frecuencia de administracion del oligonucleotido inmunoestimulador CpG. A modo de ejemplo, en un individuo en riesgo de desarrollar un cancer o una enfermedad infecciosa o una respuesta alergica o asmatica, se puede administrar al individuo el oligonucleotido inmunoestimulador CpG regularmente cuando dicho riesgo es mayor, por ej., durante la estacion de las alergias o despues de la exposicion a un agente causante de cancer. Asimismo, el oligonucleotido inmunoestimulador CpG puede ser administrado a los viajeros antes de que viajen a tierras extranjeras donde puedan estar en riesgo de exposicion a agentes infecciosos. De la misma manera, el oligonucleotido inmunoestimulador CpG puede ser administrado a soldados o civiles en riesgo de exposicion a una guerra biologica para inducir una respuesta inmune sistemica o por via de las mucosas al antfgeno cuando el individuo se exponga a dicho antfgeno, siempre y cuando el individuo estuviera expuesto a este.
Un antfgeno, como se emplea en la presente, es una molecula capaz de provocar una respuesta inmune. Los antfgenos incluyen, de forma no taxativa, celulas, extractos de celulas, protemas, polipeptidos, peptidos, polisacaridos, conjugados polisacaridos, imitaciones peptfdicas y no peptfdicas de polisacaridos y de otras moleculas, moleculas pequenas, lfpidos, glicolfpidos, carbohidratos, virus y extractos virales y organismos multicelulares como ser parasitos y alergenos. El termino antfgeno incluye ampliamente cualquier tipo de molecula que sea reconocida por un sistema inmune huesped como extrana. Los antfgenos incluyen, no de forma taxativa, antfgenos cancerosos, antfgenos microbianos y alergenos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Un antigeno canceroso como se usa en la presente es un compuesto, como ser un peptido o una protema, asociado con la superficie de una celula tumoral o cancerosa y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se expresa sobre la superficie de una celula presentadora de antigeno en el contexto de una molecula MHC. Los antigenos cancerosos pueden prepararse de celulas cancerosas ya sea preparando extractos crudos de celulas cancerosas, por ejemplo, como se describe en Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, purificando parcialmente los antigenos, mediante tecnolog^a recombinante, o por la smtesis de novo de antigenos conocidos. Los antigenos cancerosos incluyen, de forma no taxativa, antfgenos que se expresan de manera recombinante, una porcion inmunogenica de un tumor o la totalidad de un tumor o cancer. Dichos antigenos pueden aislarse o prepararse de manera recombinante o por cualquier otro medio conocido en la tecnica.
Un antigeno microbiano como se usa en la presente es un antigeno de un microorganismo e incluye, no de forma taxativa, virus, bacterias, parasitos y hongos. Dichos antigenos incluyen el microorganismo intacto asf como aislados y fragmentos naturales o derivados de ellos y tambien compuestos sinteticos que son identicos o similares a los antigenos de microorganismos naturales y que inducen una respuesta inmune espedfica para dicho microorganismo. Un compuesto es similar a un antigeno de un microorganismo natural si induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) a un antfgeno de un microorganismo natural. Dichos antfgenos se usan rutinariamente en la tecnica y son muy conocidos por los expertos.
Los ejemplos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, de forma no taxativa: Retroviridae (por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana, como ser VIH-1 (tambien denominado HDTV-III, LAVE o HTLV- III/LAV, o VIH-III; y otras cepas aisladas, como ser VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviridae (por ejemplo virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo coronavirus); Rhabdoviradae (por ejemplo virus de estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo virus del ebola); Paramyxoviridae (por ejemplo virus de la parainfluenza, virus de la parotiditis, virus del sarampion, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo virus de la influenza); Bungaviridae (por ejemplo virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorragica); Reoviridae (por ejemplo reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayona de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simplex (HSV) tipo 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes; Poxviridae (virus de la viruela, virus de la vaccinia, virus pox); e Iridoviridae (por ejemplo virus de la fiebre porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo el agente de la hepatitis delta (se cree que es un satelite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no-A, no-B (clase 1 = transmitidos internamente; clase 2 = transmitidos parenteralmente (por ejemplo, Hepatitis C); virus de Norwalk y relacionados y astrovirus).
Tanto las bacterias gram negativas como las gram positivas sirven como antfgenos en animales vertebrados. Dichas bacterias gram positivas incluyen, no de forma taxativa, especies Pasteurella, especies Staphylococci y especies Streptococcus. Las bacterias gram negativas incluyen, no de forma taxativa, Escherichia coli, especies Pseudomonas y especies Salmonella. Los ejemplos espedficos de bacterias infecciosas incluyen, no de forma taxativa, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patogenicas, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces israelli.
Los ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Otros organismos infecciosos (por ej., protistas) incluyen Plasmodium spp. como ser Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parasitos portados en la sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueno africana), Trypanosoma cruzi (mal de Chagas) y Toxoplasma gondii.
Otros microorganismos medicamente pertinentes han sido descritos extensivamente en la literatura, por ejemplo, vease C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983.
Un alergeno se refiere a una sustancia (antfgeno) que puede inducir una respuesta alergica o asmatica en un individuo susceptible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir polenes, venenos de insectos, caspa de animales, esporas fungicas y farmacos (por ejemplo penicilina). Los ejemplos de alergenos naturales, de animales y de plantas incluyen, no de forma taxativa, protemas espedficas a los siguientes generos: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (por ejemplo Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
artemiisfolia); Lolium (por ejemplo Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ejemplo Plantago lanceolata); Parietaria (por ejemplo Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blattella (por ejemplo Blattella germanica); Apis (por ejemplo Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo Periplaneta americana); Agropyron (por ejemplo Agropyron repens); Secale (por ejemplo Secale cereale); Triticum (por ejemplo Triticum aestivum); Dactylis (por ejemplo Dactylis glomerata); Festuca (por ejemplo Festuca elatior); Poa (por ejemplo Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo Avena sativa); Holcus (por ejemplo Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo Agrostis alba); Phleum (por ejemplo Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo Sorghum halepensis); y Bromus (por ejemplo Bromus inermis).
El termino sustancialmente purificado como se usa en la presente se refiere a un polipeptido que esta sustancialmente libre de otras protemas, lfpidos, carbohidratos u otros materiales con los que esta naturalmente asociado. Un experto en la tecnica puede purificar polipeptidos virales o bacterianos usando tecnicas estandar para la purificacion de protemas. El polipeptido sustancialmente puro a menudo generara una banda unica principal sobre un gel de poliacrilamida no reductor. En el caso de los polipeptidos parcialmente glicosilados o de los que tienen varios codones de inicio, puede haber varias bandas sobre un gel de poliacrilamida no reductor, pero estas formaran un patron distintivo para dicho polipeptido. La pureza del polipeptido viral o bacteriano tambien puede determinarse por el analisis de secuencia de los aminoacidos amino-terminales. Otros tipos de antfgenos no codificados por un vector de acido nucleico tal como los polisacaridos, las moleculas pequenas, las imitaciones, etc. estan incluidos dentro de la invencion.
Los oligonucleotidos de la invencion pueden ser administrados a un individuo con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se emplea en la presente, se refiere a un compuesto sintetico o que se presenta naturalmente, capaz de matar o de inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano util de acuerdo con la invencion dependera del tipo de microorganismo con el cual el individuo esta infectado o esta en riesgo de infectarse. Los agentes antimicrobianos incluyen, no de forma taxativa, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifungicos y agentes antiparasitarios. Frases tales como “agente antiinfeccioso”, “agente antibacteriano”, “agente antiviral”, “agente antifungico”, “agente antiparasitario” y “parasiticida” poseen significados bien establecidos para los no expertos y se encuentran definidos en textos medicos estandar. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o inhiben bacterias, e incluyen antibioticos asf como otros compuestos sinteticos o naturales que poseen funciones similares. Los antibioticos son moleculas de peso molecular bajo que son producidas como metabolitos secundarios por celulas, tales como microorganismos. En general, los antibioticos interfieren con una o mas funciones o estructuras bacterianas que son espedficas para el microorganismo y que no estan presentes en las celulas huesped. Los agentes antivirales pueden aislarse de fuentes naturales o pueden sintetizarse y son utiles para matar o inhibir virus. Los agentes antifungicos se utilizan para tratar infecciones fungicas superficiales asf como infecciones fungicas sistemicas oportunistas y primarias. Los agentes antiparasitarios matan o inhiben parasitos.
Los ejemplos de agentes antiparasitarios, tambien denominados parasiticidas, utiles para la administracion en humanos incluyen pero no de forma taxativa albendazol, anfotericina B, benzidazol, bitionol, cloroquina HCl, fosfato de cloroquina, clindamicina, dehidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflornitina, furazolidaona, glucocorticoides, halofantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina , melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanilo, pamoato de pirantel, pirimetanmina- sulfonamidas, pirimetanmina-sulfadoxina, quinacrina HCl, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato sodico (gluconato sodico antimonico), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprimo-sulfametoxazol y triparsamida, algunos de los cuales se utilizan solos o en combinacion con otros.
Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o la funcion de las bacterias. Una vasta clase de agentes antibacterianos son los antibioticos. Los antibioticos, que son efectivos para matar o inhibir una amplia gama de bacterias, se denominan antibioticos de amplio espectro. Otros tipos de antibioticos son predominantemente efectivos contra las bacterias de clase gram positiva o gram negativa. Estos tipos de antibioticos se denominan antibioticos de espectro reducido. Otros antibioticos que son efectivos contra un solo organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias, se denominan antibioticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos a veces se clasifican respecto de su modo de accion principal. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la smtesis de la pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la smtesis de protemas, inhibidores funcionales o de la smtesis de acido nucleico, e inhibidores competitivos.
Los agentes antivirales son compuestos que previenen infecciones de celulas por virus o la replicacion de los virus dentro de la celula. Existen muchas menos drogas antivirales que drogas antibacterianas debido a que el proceso de replicacion viral esta tan relacionado con la replicacion del ADN dentro de la celula huesped, que los agentes antivirales no espedficos a menudo resultanan toxicos para la celula huesped. Hay varias etapas dentro del proceso
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de infeccion viral que pueden ser bloqueadas o inhibidas por los agentes antivirales. Estas etapas incluyen la union del virus a la celula huesped (inmunoglobulina o peptidos de enlace), perdida de la cubierta del virus (por ejemplo amantadina), la smtesis o traduccion del mARN viral (por ejemplo interferon), la replicacion del ARN o aDn viral (por ejemplo analogos de nucleotidos), la maduracion de nuevas protemas de virus (por ejemplo inhibidores de proteasa) y la gemacion y liberacion del virus.
Los analogos de nucleotidos son compuestos sinteticos que son similares a los nucleotidos pero tienen un grupo ribosa o desoxirribosa anormal o incompleto. Una vez que los analogos de nucleotidos estan en la celula, se fosforilan, produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleotidos para incorporarse en el ADN o ARN viral. Una vez que la forma trifosfato del analogo de nucleotido se incorpora a la cadena de acido nucleico en crecimiento, ocasiona una asociacion irreversible con la polimerasa viral y asf produce la terminacion de la cadena. Los analogos de nucleotidos incluyen, en forma no taxativa, el aciclovir (utilizado para el tratamiento del virus del herpes simple y del virus de varicela-zoster), el ganciclovir (util para el tratamiento del citomegalovirus), la idoxuridina, la ribavirina (util para el tratamiento del virus sincitial respiratorio), la didesoxinosina, la didesoxicitidina, la zidovudina (azidotimidina), el imiquimod y el resimiquimod.
Los interferones son citocinas que son secretadas por celulas infectadas por virus asf como por celulas inmunes. Los interferones funcionan enlazandose a receptores espedficos en las celulas adyacentes a las celulas infectadas, ocasionando el cambio en la celula que lo protege de la infeccion del virus. Los interferones a y p tambien inducen la expresion de las moleculas MHC de Clase I y Clase II en la superficie de las celulas infectadas, lo que da como resultado una presentacion incrementada del antfgeno para el reconocimiento por parte de la celula inmune huesped. Los interferones a y p estan disponibles como formas recombinantes y han sido utilizados para el tratamiento de la infeccion cronica de hepatitis B y C. A las dosis que son efectivos para la terapia antiviral, los interferones poseen graves efectos colaterales tales como fiebre, malestar y perdida de peso.
Los agentes antivirales utiles en la invencion incluyen en forma no taxativa las inmunoglobulinas, la amantadina, los interferones, los analogos de nucleotidos y los inhibidores de proteasas. Los ejemplos espedficos de antivirales incluyen en forma no taxativa Acemanan; Aciclovir; Aciclovir Sodico; Adefovir; Alovudina; Alvircept Sudotox; Clorhidrato de Amantadina; Aranotina; Arildona; Mesilato de Atevirdina; Avridina; Cidofovir; Cipamfylline; Clorhidrato de Citarabina; Mesilato de Delavirdinea; Desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Edoxudina; Enviradeno; Enviroxima; Famciclovir; Clorhidrato de Famotina; Fiacitabina; Fialuridina; Fosarilato; Foscarnet Sodico; Fosfonet Sodico; Ganciclovir; Ganciclovir Sodico; Idoxuridina; Ketoxal; Lamivudina; Lobucavir; Clorhidrato de Memotina; Metisazona; Nevirapina; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirina; Clorhidrato de Rimantadina; Mesilato de Saquinavir; Clorhidrato de Somantadina; Sorivudina; Estatolon; Estavudina; Clorhidrato de Tilorona; Trifluridina; Clorhidrato de Valaciclovir; Vidarabina; Fosfato de Vidarabina; Fosfato Sodico de Vidarabina; Viroxime; Zalcitabina; Zidovudina; y Zinviroxime.
Los agentes antifungicos son utiles para el tratamiento y prevencion de los hongos infecciosos. Los agentes antifungicos algunas veces se clasifican conforme a su mecanismo de accion. Algunos agentes antifungicos funcionan como inhibidores de pared celular al inhibir la glucosa-sintasa. Estos incluyen, en forma no taxativa, basiungin/ECB. Otros agentes antifungicos funcionan al desestabilizar la integridad de la membrana. Estos incluyen, en forma no taxativa, los imidazoles, tal como clotrimazol, sertaconzole, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol y voriconacole, asf como FK 463, amfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes antifungicos funcionan rompiendo la quitina (es decir, la quitinasa) o la inmunosupresion (501 cream).
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG se pueden combinar con otros agentes terapeuticos tales como adyuvantes para mejorar las respuestas inmunes. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG y otros agentes terapeuticos se pueden administrar en forma simultanea o secuencial. Cuando los otros agentes terapeuticos se administran en forma simultanea, se pueden administrar en la misma formulacion o en formulaciones separadas, pero se administran al mismo tiempo. Los otros agentes terapeuticos se administran secuencialmente entre sf y con respecto al oligonucleotido inmunoestimulador CpG, cuando la administracion de los otros agentes terapeuticos y el oligonucleotido inmunoestimulador CpG esta separada en el tiempo. La separacion temporal entre la administracion de estos compuestos puede tratarse de minutos o puede ser mayor. Otros agentes terapeuticos incluyen en forma no taxativa adyuvantes, citocinas, anticuerpos, antfgenos, etc.
Los compuestos de la invencion tambien pueden administrarse con adyuvantes no acido nucleico. Un adyuvante no acido nucleico es cualquier molecula o compuesto con excepcion de los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG descritos en la presente que pueden estimular la respuesta inmune celular y/o humoral. Los adyuvantes no acido nucleico incluyen, por ejemplo, adyuvantes que crean un efecto deposito, los adyuvantes inmunoestimuladores y los adyuvantes que crean un efecto deposito y estimulan el sistema inmunologico.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien son utiles como adyuvantes de mucosa. Se ha descubierto previamente que tanto la inmunidad sistemica como la de las mucosas estan inducidas por el suministro de acidos nucleicos CpG a la mucosa. Asp los oligonucleotidos se pueden administrar en combinacion con otros adyuvantes de mucosa.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Las respuestas inmunes tambien pueden estar inducidas o aumentadas por la coadministracion o la expresion colineal de citocinas (Bueler y Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) o moleculas coestimuladoras B-7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) con los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG. El termino citocina se utiliza como un nombre generico para un grupo variado de peptidos y protemas solubles que actuan como reguladores humorales a concentraciones desde nano hasta picomolares y que ya sea bajo condiciones normales o patologicas, modulan las actividades funcionales de tejidos y celulas individuales. Estas protemas tambien median en las interacciones entre celulas en forma directa y regulan los procesos que tienen lugar en el entorno extracelular. Los ejemplos de citocinas incluyen, en forma no taxativa, IL- 1, lL-2, IL-4, iL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, factor estimulante de colonia de macrofagos-granulocitos (GM- CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF), interferon-Y (y-IFN), IFN-a, factor de necrosis tumoral (TNF), TGF-p, ligando FLT-3 y ligando CD40.
Los oligonucleotidos tambien son utiles para redirigir una respuesta inmune de una respuesta inmune Th2 a una respuesta inmune Th1. Esto da como resultado un entorno Th1/Th2 relativamente equilibrado. La redireccion de una respuesta inmune de Th2 a Th1 se puede evaluar midiendo el nivel de las citocinas producidas en respuesta al acido nucleico (por ejemplo, induciendo celulas monodticas y otras celulas para producir citocinas Th1, incluyendo IL-12, IFN-y y GM-CSF). La redireccion o reequilibrio de la respuesta inmune de respuesta Th2 a Th1 es particularmente util para el tratamiento o la prevencion del asma. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar el asma puede ser esa cantidad util para redirigir una respuesta inmune de tipo Th2, que esta asociada con el asma, a una respuesta de tipo Th1 o a un entorno Th1/Th2 equilibrado. Las citocinas Th2, especialmente las IL-4 e IL-5 se elevan en las vfas aereas de los individuos asmaticos. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG de la invencion ocasionan un incremento en las citocinas Th1 que ayuda a reequilibrar el sistema inmunologico y evitan o reducen los efectos adversos asociados con una respuesta inmune predominantemente Th2.
Los oligonucleotidos de la invencion pueden tambien ser utiles en el tratamiento de la remodelacion de las vfas aereas. La remodelacion de las vfas aereas se produce por la proliferacion de celulas de musculo liso y/o engrosamiento submucoso de las vfas aereas y en ultima instancia produce un estrechamiento de las vfas aereas que conduce a la restriccion del flujo de aire. Los oligonucleotidos de la invencion pueden prevenir remodelaciones posteriores e incluso posiblemente reducir la formacion de tejido que resulta del proceso de remodelacion.
Los oligonucleotidos tambien son utiles para mejorar la supervivencia, diferenciacion, activacion y maduracion de las celulas dendnticas. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tienen la capacidad unica de promover la supervivencia, diferenciacion, activacion y maduracion celular de las celulas dendnticas.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien incrementan la actividad lttica de las celulas asesinas naturales y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se puede realizar la ADCC utilizando un oligonucleotido inmunoestimulador CpG en combinacion con un anticuerpo espedfico para un objetivo celular, tal como una celula cancerosa. Cuando se administra el oligonucleotido inmunoestimulador CpG a un individuo junto con el anticuerpo, se induce al sistema inmunologico del individuo a matar la celula tumoral. Los anticuerpos utiles en el procedimiento ADCC incluyen anticuerpos que interactuan con una celula en el cuerpo. Se han descrito en la tecnica muchos de tales anticuerpos espedficos para objetivos celulares y muchos estan disponibles comercialmente.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien se pueden administrar junto con una terapia anticancerosa. Las terapias anticancerosas incluyen los medicamentos, la radiacion y los procedimientos quirurgicos para el cancer. Tal y como se lo utiliza en la presente, el termino “medicamento para el cancer” se refiere a un agente que se administra a un individuo con el proposito de tratar el cancer. Tal y como se lo utiliza en la presente, el termino “tratar el cancer” incluye la prevencion del desarrollo de un cancer, la reduccion de los smtomas del cancer y/o la inhibicion del crecimiento de un cancer establecido. En otros aspectos, el medicamento para el cancer se administra a un individuo que esta en riesgo de desarrollar un cancer con el proposito de reducir el riesgo de desarrollar el cancer. Se describen en la presente distintos tipos de medicamentos para el tratamiento del cancer. Para los propositos de la presente especificacion, los medicamentos para el cancer se clasifican como agentes quimioterapeuticos, agentes inmunoterapeuticos, vacunas contra el cancer, terapia hormonal y modificadores de respuesta biologica.
Adicionalmente, los metodos relacionados con la invencion estan pensados para abarcar el uso de mas de un medicamento para el cancer junto con los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG. A modo de ejemplo, cuando es adecuado, los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG se pueden administrar con un agente quimioterapeutico y un agente inmunoterapeutico. Alternativamente, el medicamento para el cancer puede abarcar un agente inmunoterapeutico y una vacuna contra el cancer, o un agente quimioterapeutico y una vacuna contra el cancer, o un agente quimioterapeutico, un agente inmunoterapeutico y una vacuna contra el cancer, todos ellos administrados a un solo individuo con el proposito de tratar a un individuo con cancer o en riesgo de desarrollar cancer.
El agente quimioterapeutico se puede seleccionar de entre el grupo compuesto por metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, cloroetilnitrosourea que no contiene azucar, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamine GLA, valrubicina, carmustina y poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de la transferasa “famesyl” RAS, inhibidor de la transferasa “famesyl”, MMP, MTA/LY231514,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833,
Novantrone/Mitroxantrona, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/Temozolomida, Evacet/doxorrubicina liposomal yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon/Doxifluridina, Cyclopax/paclitaxel oral, Taxoid Oral, SPU-077/Cisplatino, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor oncogenetico de RAS, BMS-182751/platino oral, UFT(Tegafur/Uracilo), Ergamisol/Levamisol, Eniluracilo/776C85/intensificador 5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/doxorrubicina liposomal, Caelyx/doxorrubicina liposomal, Fludara/Fludarabina, Farmorubicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis- Naftalimida, LU 103793/Dolastain, Caetyx/doxorrubicina liposomal, Gemzar/Gencitabina, ZD 0473/Anormed yM 116, semillas con yodo, inhibidores CDK4 y CDK2, inhibidores PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Teniposido, Paraplatino/Carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/Etoposido, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, profarmacos de guanina arabinosida, Analogo de Taxane, nitrosoureas, agentes de alquilacion tal como melfelan y ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginasa, Busulfano, Carboplatino, Clorombucil, Cytarabine HCl, Dactinomicina, Daunorubicina HCl, Fosfato sodico de estramustina, Etoposido (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracilo (5-FU), Flutamida, Hidroxiurea (hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Acetato de leuprolida (LHRH-analogo de factor de liberacion), Lomustina (CCNU), mecloretamina HCl (mostaza de nitrogeno), Mercaptopurina, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrona HCl, Octreotido, Plicamicina, Procarbazina HCl, Estreptozocina, Citrato de tamoxifen, Tioguanina, Tiotepa, Sulfato de vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoyetina, Hexametilmelamina (HMM), Interleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis- guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2'desoxicoformicina), Semustina (metil-CCNU), Teniposido (VM-26) y Sulfato de vindesina, pero en forma no taxativa.
El agente inmunoterapeutico puede seleccionarse de entre el grupo compuesto por Ributaxin, Herceptina, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATrAgEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior T6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA, pero en forma no taxativa.
La vacuna contra el cancer puede seleccionarse de entre el grupo compuesto por EGF, vacunas contra el cancer anti-idiotipicas, antfgeno Gp75, vacuna contra melanoma GMK, vacuna conjugada contra gangliosido MGV, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, teratopo STn-KHL, BLP25 (MUC-1), vacuna idiotfpica liposomal, Melacina, vacunas de antfgeno peptfdico, vacunas toxina / antfgeno, vacunas basadas en MVA, PACIS, vacuna contra BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus e ImmuCyst/TheraCys, pero en forma no taxativa.
El uso de oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG junto con agentes inmunoterapeuticos tal como anticuerpos monoclonales es capaz de incrementar la supervivencia a largo plazo a traves de distintos mecanismos que incluyen la intensificacion significativa de ADCC (tal como se senalo anteriormente), la activacion de celulas asesinas naturales (NK) y un incremento en los niveles de IFNa. Los acidos nucleicos cuando se utilizan en combinacion con los anticuerpos monoclonales sirven para reducir la dosis de anticuerpo necesaria para lograr un resultado biologico.
Tal y como se los utiliza en la presente, los terminos “antigeno canceroso” y “antfgeno tumoral” se utilizan en forma intercambiable para referirse a antfgenos que se expresan diferencialmente por celulas cancerosas y que por lo tanto pueden ser aprovechados para identificar como objetivo celulas cancerosas. Los antfgenos cancerosos son antfgenos que potencialmente pueden estimular aparentemente respuestas inmunes espedficas a tumores. Algunos de estos antfgenos estan codificados por celulas normales, aunque no necesariamente estan expresados por estas. Estos antfgenos se pueden caracterizar como los que normalmente son silenciosos (es decir, no estan expresados) en celulas normales, los que se expresan solo en ciertas etapas de diferenciacion y los que estan expresados temporalmente, tal como antfgenos embrionicos y fetales. Otros antfgenos cancerosos estan codificados por genes celulares mutantes, tal como los oncogenes (por ejemplo, el oncogen ras activado), los genes supresores (por ejemplo, el mutante p53), las protemas de fusion resultantes de deleciones internas o de traslocaciones cromosomicas. Aun asf, otros antfgenos cancerosos pueden ser codificados por genes virales tales como los transportados por los virus tumorales de ARN y ADN.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG tambien son utiles para tratar y prevenir las enfermedades autoinmunes. Una enfermedad autoinmune es una clase de enfermedad en la que los propios anticuerpos de un individuo reaccionan con el tejido huesped o en la que las celulas T efectoras inmunes son autorreactivas a los propios peptidos endogenos y ocasionan la destruccion del tejido. Asf, se arma una respuesta inmune contra los propios antfgenos del individuo, a los que nos referimos como antfgenos propios. Las enfermedades autoinmunes incluyen en forma no taxativa la artritis reumatoidea, la enfermedad de Crohn, la esclerosis multiple, el lupus eritematoso sistemico (SLE), la encefalomielitis autoinmune, la miastenia gravis (MG), la tiroiditis de Hashimoto, el smdrome de Goodpasture, el penfigo (por ejemplo, el penfigo vulgaris), la enfermedad de Grave, la anemia hemolftica autoinmune, la purpura trombocitopenica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anti-colageno, la enfermedad del tejido conectivo mixto, la polimiositis, la anemia perniciosa, la enfermedad de Addison idiopatica, la infertilidad asociada a la enfermedad autoinmune, la glomerulonefritis (por ejemplo, la glomerulonefritis rapidamente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
progresiva, la glomerulonefritis proliferativa), el penfigoide bulloso, el smdrome de Sjogren, la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus autoinmune.
Tal como se lo utiliza en la presente, el termino “antigeno propio” se refiere a un antigeno de un tejido huesped normal. El tejido huesped normal no incluye celulas cancerosas. Asf, una respuesta inmune armada contra un antfgeno propio, en el contexto de una enfermedad autoinmune, es una respuesta inmune no deseable y contribuye a la destruccion y al dano del tejido normal, mientras que una respuesta inmune armada contra un antigeno canceroso es una respuesta inmune deseable y contribuye a la destruccion del tumor o cancer. Asf, en algunos aspectos de la invencion que apunta a tratar los trastornos autoinmunes, no se recomienda que los acidos nucleicos inmunoestimuladores CpG sean administrados con antigenos propios, particularmente los que son objetivo del trastorno autoinmune.
En otras instancias, los acidos nucleicos inmunoestimuladores CpG se pueden suministrar con dosis bajas de antigenos propios. Distintos estudios en animales han demostrado que la administracion por mucosa de dosis bajas de antfgenos pueden dar como resultado un estado de hiporresponsividad inmune o “tolerancia”. El mecanismo activo parece ser un desvfo inmune mediado por citocina de una respuesta Th1 a una respuesta predominantemente Th2 y Th3 (es decir, dominada por TGF-p). La supresion activa con suministro de bajas dosis de antfgenos tambien puede suprimir una respuesta inmune no relacionada (supresion en espera) que es de considerable interes en la terapia de enfermedades autoinmunes, por ejemplo, la artritis reumatoidea y la SLE. La supresion en espera involucra la secrecion de citocinas supresoras contra-regulatorias a Th1 en el entorno local donde se liberan citocinas Th1 y pro inflamatorias en forma espedfica para antigeno o no espedfica para antigeno. El termino “tolerancia” tal como se lo utiliza en la presente hace referencia a este fenomeno. Asimismo, la tolerancia oral ha sido efectiva para tratar distintas enfermedades autoinmunes en animales, entre las que se incluyen: la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), la miastenia gravis autoinmune experimental, la artritis inducida por colageno (CIA) y la diabetes mellitus dependiente de insulina. En estos modelos, la prevencion y supresion de la enfermedad autoinmune esta asociada con un cambio en las respuestas celulares y humorales espedficas a un antfgeno de respuesta Th1 a Th2/Th3.
La invencion se refiere a metodo para inducir una activacion inmune innata no espedfica a antfgeno y resistencia de amplio espectro al desaffo infeccioso utilizando los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG. Tal y como se lo utiliza en la presente, el termino “activacion inmune innata no espedfica a antfgeno” hace referencia a la activacion de celulas inmunes distintas de las celulas B y por ejemplo, puede incluir la activacion de celulas NK, celulas T u otras celulas inmunes que pueden responder en forma independiente del antfgeno o alguna combinacion de estas celulas. Se induce una resistencia de amplio espectro al desaffo infeccioso porque las celulas inmunes estan en forma activa y cebadas para responder a cualquier compuesto o microorganismo invasor. Las celulas no tienen que estar espedficamente cebadas contra un antfgeno determinado. Esto es particularmente util en caso de guerra biologica y las otras circunstancias descritas anteriormente, como ser los viajeros.
La invencion tambien hace referencia a oligonucleotidos que tienen enlaces internucleotidos quirales. Segun se describe anteriormente, los oligonucleotidos blandos y semiblandos pueden tener enlaces de tipo fosfodiester entre C y G. Un ejemplo de un enlace de tipo fosfodiester es un enlace fosforotioato en una conformacion Rp.
Al menos un estudio ha examinado el efecto de la quiralidad p sobre los efectos inmunoestimuladores de los oligonucleotidos CpG. Yu et al., compararon (PS)-oligonucleotidos con enlaces fosforotioato estereoenriquecidos (no estereo puros) en cuanto a su capacidad para inducir la proliferacion de celulas esplenicas (Yu et al., 2000). En ese estudio, se encontro que una secuencia de19 bases que contema un motivo CpG simple induda niveles altos de proliferacion de celulas esplenicas en raton si el oligonucleotido se sintetizaba con quiralidad p aleatoria o era rico en enlaces internucleotidos Sp, pero la proliferacion sufna un reduccion importante si el oligonucleotido era rico en enlaces internucleotidos Rp. (Yu et al., 2000). Sin embargo, el estudio no examino el papel espedfico de la quiralidad p en el dinucleotido CpG, como tampoco determino si los oligonucleotidos CpG Rp tendnan actividad en ensayos de estimulacion a corto plazo.
Se ha descubierto, de acuerdo con la invencion, que la quiralidad p en oligonucleotidos puede tener, aparentemente, efectos opuestos sobre la actividad inmune de un oligonucleotido CpG, segun el momento en el que se mida la actividad. En un momento inicial de 40 minutos, es el estereoisomero Rp del oligonucleotido CpG fosforotioato y no el Sp el que induce la fosforilacion JNK en celulas esplenicas de raton (se analiza en los ejemplos). En contraste, cuando se evalua en un tiempo posterior de 44 horas, el estereoisomero Sp y no el Rp resulta activo en la estimulacion de la proliferacion de celulas esplenicas. Hemos demostrado que esta diferencia en la cinetica y la bioactividad de los estereoisomeros Rp y Sp no proviene de ninguna diferencia en la captacion celular, sino mas probablemente se debe a dos papeles biologicos opuestos de la quiralidad p. Primero, la actividad mejorada del estereoisomero Rp comparado con el Sp en cuanto a la estimulacion de las celulas inmunes en momentos iniciales indica que el Rp puede ser mas efectivo en la interaccion con el receptor TLR9 del CpG o en la induccion de las rutas de senalizacion en cascada. Por otro lado, la degradacion mas rapida de los PS-oligonucleotidos Rp comparados con los Sp da como resultado una duracion mucho menor de la senalizacion, de modo que los PS- oligonucleotidos Sp parecen ser biologicamente mas activos cuando se evaluan en momentos posteriores.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En algunos aspectos la invencion se basa en el novedoso hallazgo de que la carencia relativa previamente informada de inmunoestimulacion por parte de los PS-oligo Rp se debe solo a su labilidad ante las nucleasas, no a una incapacidad inherente de estimular el receptor de CpG y las rutas en cascada. Cuando se evaluo en cuanto a su capacidad de estimular la fosforilacion JNK, la cual indica la activacion de la ruta de la proteinquinasa activada por mitogeno, el oligonucleotido Rp parecio ser el mas activo, seguido por un oligo estereo aleatorio y sin actividad detectable del oligonucleotido Sp. Sin embargo, cuando estos oligonucleotidos se compararon en cuanto a su capacidad de activar las rutas NF-kB, medida por la degradacion de la protema inhibitoria kB-a, todos los oligonucleotidos CpG resultaron activos, aunque el control no CpG no logro inducir la degradacion de kB-a. Asf, el oligonucleotido Sp resulta aun biologicamente activo. Su falla en la induccion de la ruta JNK podna estar relacionada con diferencias en la cinetica de activacion de las rutas de JNK y NF-kB, pero, debido a las cantidades limitadas de oligonucleotido estereoespedfico disponibles para la prueba, no pudimos confirmar esta hipotesis.
Los experimentos descritos en los ejemplos revelaron un efecto sorprendentemente fuerte de la quiralidad p en el propio dinucleotido CpG. En comparacion con un oligonucleotido CpG estereo aleatorio, su par en el que el unico dinucleotido CpG tema enlaces Rp resulto levemente mas activo, mientras que su par con enlaces Sp fue casi inactivo en la induccion de la proliferacion de celulas esplenicas. La perdida de actividad del oligonucleotido Sp apoya nuestra hipotesis de que el receptor TLR9 puede no ser indiferente a la quiralidad del dinucleotido CpG en el ADN con el que interactua, pero en realidad puede ser mejor estimulado por el estereoisomero Rp. Por ello, el efecto estimulador del oligo estereo aleatorio probablemente no se deba solo a la presencia del 50 % de enlaces Sp que retardan la degradacion, sino tambien al hecho de que las moleculas oligo tendran quiralidad Rp en el dinucleotido CpG, lo que parece mejorar los efectos inmunoestimuladores.
La sensibilidad de los enlaces PS Rp a las nucleasas tiene importantes repercusiones en la interpretacion de estudios farmacocineticos (PK) y metabolicos de PS-oligos en seres humanos o animales. Se sabe que la actividad nucleasa que predomina en el suero es la 3' exonucleasa. En soluciones tfpicas de PS-oligo estereo aleatorio, se espera que el ultimo enlace internucleotidos 3' posea quiralidad Rp en la mitad de las moleculas. Por lo tanto, en este 50% de moleculas PS-oligo, la base terminal 3' sera clivada con bastante rapidez despues de la infusion IV. El segundo enlace internucleotidos desde el extremo 3' debena tener quiralidad Rp en la mitad de dichas moleculas y por lo tanto en un 25% de la moleculas PS-oligo iniciales puede esperarse que el extremo 3' se acorte en 2 bases con relativa rapidez. Puede esperarse que este proceso de recorte de bases in vivo que involucra los enlaces internucleotidos Rp 3' continue hasta que el enlace internucleotidos 3' tenga la configuracion Sp. Por lo tanto, si los PS-oligos se sintetizaran con un enlace 3' terminal Sp, debenan degradarse con mucha mas lentitud y tendnan un perfil PK diferente comparados con PS-oligos estereo aleatorios. Esto debena posibilitar el uso de oligonucleotidos algo mas cortos para aplicaciones in vivo. Al disenar oligos optimizados para aplicaciones antisentido, la union mejorada de ARN del estereoisomero Rp apunta al deseo de que, tanto como sea posible, la parte interna central del oligonucleotido tenga configuracion Rp. Por otro lado, un oligonucleotido CpG optimizado para aplicaciones inmunoestimulatorias puede ser aquel en el que todos los enlaces internucleotidos, excepto el CpG, tuviesen quiralidad Sp.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG se pueden administrar directamente al individuo o se pueden administrar junto con un complejo de suministro de acido nucleico. Un complejo de suministro de acido nucleico hace referencia a una molecula de acido nucleico asociada con (por ejemplo, enlazada en forma ionica o covalente, o encapsulada dentro de) un medio para identificar como objetivo (por ejemplo, una molecula que da como resultado un enlace de mayor afinidad a una celula objetivo). Los ejemplos de complejos de suministro de acido nucleico incluyen acidos nucleicos asociados con un esterol (por ejemplo colesterol), un lfpido (por ejemplo un lfpido cationico, un virosoma o liposoma) o un agente de enlace espedfico de una celula objetivo (por ejemplo un ligando reconocido por un receptor espedfico de la celula objetivo). Los complejos preferidos pueden ser lo suficientemente estables in vivo para evitar un desacoplamiento significativo antes de la internalizacion por parte de la celula objetivo. Sin embargo, los complejos pueden ser clivables bajo condiciones adecuadas en la celula de forma que el oligonucleotido se libera en forma funcional.
Los vehfculos de suministro o dispositivos de suministro para suministrar antfgenos y oligonucleotidos a superficies ya han sido descritos. Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG y/o el antfgeno y/u otros agentes terapeuticos se pueden administrar solos (por ejemplo en solucion salina o amortiguadora) o utilizando cualquier vehfculo de suministro conocido en la tecnica. Por ejemplo, se han descrito los siguientes vehfculos de suministro: Cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomes (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Liposomas (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); Vectores bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); Vectores virales vivos (por ejemplo, Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); Microesferas (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Vacunas de acidos nucleicos (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); Polfmeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); Anillos de polfmero (Wyatt et al., 1998); Proteosomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); Fluoruro de Sodio (Hashi et al., 1998); Plantas transgenicas (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); Virosomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); Partfculas de tipo virus (Jiang et al., 1999,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Leibl et al., 1998). Se conocen en la tecnica otros vetuculos de suministro y a mas adelante se proporcionan ejemplos adicionales en la discusion sobre vectores.
El termino “cantidad efectiva de oligonucleotido inmunoestimulador CpG” se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biologico deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de oligonucleotido inmunoestimulador CpG que se administra con un antigeno para inducir la inmunidad por mucosa es la cantidad necesaria para ocasionar el desarrollo de IgA en respuesta a un antigeno despues de la exposicion al antigeno, mientras que la cantidad necesaria para inducir la inmunidad sistemica es la cantidad necesaria para ocasionar el desarrollo de IgG en respuesta a un antfgeno despues de la exposicion al antigeno. Combinado con las ensenanzas que se proporcionan en la presente, al elegir entre los distintos componentes activos y factores de peso tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos colaterales y el modo preferido de administracion, se puede planear un regimen de tratamiento terapeutico o profilactico efectivo que no cause toxicidad sustancial e incluso sea totalmente efectivo en el tratamiento de un individuo en particular. La cantidad efectiva para una aplicacion determinada puede variar segun ciertos factores tales como la enfermedad o afeccion que se este tratando, el oligonucleotido inmunoestimulador CpG determinado que se administre, la contextura ffsica del individuo o la gravedad de la enfermedad o afeccion. Una persona que posea una habilidad normal en la tecnica puede determinar empmcamente la cantidad efectiva de oligonucleotido inmunoestimulador CpG y/o antfgeno y/u otro agente terapeutico determinado, sin necesidad de experimentacion indebida.
Las dosis objeto de los compuestos descritos en la presente para el suministro local o por via de las mucosas vanan tipicamente desde aproximadamente 0,1 |jg a 10 mg por administracion, que segun la administracion pueden darse en forma diaria, semanal o mensual y en cualquier plazo de tiempo entre estos. Mas tfpicamente, las dosis por mucosa o locales vanan desde aproximadamente 10 jg a 5 mg por administracion y mas tfpicamente desde aproximadamente 100 jg a 1 mg, con 2-4 aplicaciones espaciadas entre sf dfas o semanas. Mas tfpicamente, las dosis de inmunoestimulacion vanan desde 1 jg a 10 mg por administracion y mas tfpicamente desde 10 jg a 1 mg, con aplicaciones diarias o semanales. Las dosis objeto de los compuestos descritos en la presente para suministro parenteral con el proposito de inducir una respuesta inmune espedfica a antfgeno, en donde los compuestos son suministrados con un antfgeno pero no con otro agente terapeutico, son tfpicamente de 5 a 10.000 veces mayores que la dosis efectiva por mucosa para aplicaciones de adyuvante de vacuna o inmunoestimulante y mas tfpicamente de 10 a 1.000 veces mayor y mas tfpicamente de 20 a 100 veces mayor. Las dosis de los compuestos descritos en la presente para suministro parenteral con el proposito de inducir una respuesta inmune innata o para incrementar el ADCC o para inducir una respuesta inmune espedfica a un antfgeno cuando se administran los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG en combinacion con otros agentes terapeuticos o en vedculos de suministro especializados vana desde aproximadamente 0,1 jg a 10 mg por administracion, que segun la aplicacion pueden darse en forma diaria, semanal o mensual o cada cualquier plazo de tiempo entre estos. Mas tfpicamente, las dosis parenterales para estos propositos vanan desde aproximadamente de 10 jg a 5 mg por aplicacion y mas tipicamente desde aproximadamente 100 jg a 1 mg con 2-4 aplicaciones espaciadas entre sf dfas o semanas. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis parenterales para estos propositos se pueden usar en un rango de 5 a 10.000 veces mas altas que las dosis tfpicas descritas anteriormente.
Para cualquier compuesto descrito en la presente, la cantidad terapeuticamente efectiva se puede determinar inicialmente a partir de modelos animales. Tambien se puede determinar la dosis terapeuticamente efectiva a partir de datos de humanos para oligonucleotidos CpG que hayan sido probados en humanos (se han iniciado ensayos clmicos en humanos) y para compuestos que se sepa que exhiben actividad farmacologica similar, tal como otros adyuvantes, por ejemplo LT y otros antfgenos para fines de vacunacion. Pueden ser necesarias dosis mas altas para la administracion parenteral. La dosis aplicada se puede ajustar en base a la biodisponibilidad relativa y a la potencia del compuesto administrado. Ajustar la dosis para lograr la eficacia maxima en base a los metodos descritos anteriormente y a otros metodos es algo bien conocido en la tecnica y esta comprendido dentro de las capacidades de los expertos que la manejan.
Las formulaciones de la invencion se administran en soluciones farmaceuticamente aceptables, que rutinariamente pueden contener concentraciones de sal, agentes amortiguadores, conservantes, veldculos compatibles, adyuvantes y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos farmaceuticamente aceptables.
Para su uso en terapias, se puede administrar una cantidad efectiva de oligonucleotido inmunoestimulador CpG a un individuo de cualquier manera que suministre el oligonucleotido a la superficie deseada, por ejemplo por via mucosa, sistemica. La administracion de la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede lograr por cualquier medio conocido para el experto en la tecnica. Las vfas de administracion preferidas incluyen en forma no taxativa la via oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inhalacion, ocular, vaginal y rectal.
Para la administracion oral, los compuestos (por ejemplo, los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG, los antfgenos y otros agentes terapeuticos) se pueden formular facilmente combinando el compuesto o compuestos activos con vedculos farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica. Tales vedculos permiten que los compuestos de la invencion sean formulados como tabletas, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares para la toma oral por parte del individuo que va a ser tratado. Las preparaciones farmaceuticas para uso oral se pueden obtener como excipientes solidos, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, despues de anadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
nucleos de tabletas o grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azucares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidon de ir^z, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sodica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea , se pueden anadir agentes desintegradores, tales como la polivinilpirrolidona de enlace cruzado, agar o acido algmico o una sal de los mismos, tal como el alginato sodico. Opcionalmente, las formulaciones orales tambien se pueden formular en soluciones salinas o amortiguadoras, por ejemplo EDTA, para neutralizar las condiciones acidas internas o se pueden administrar sin ningun vehmulo.
Tambien se contemplan espedficamente formas farmaceuticas orales del componente o componentes anteriormente mencionados. El componente o los componentes se pueden modificar qmmicamente de forma que el suministro oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificacion qmmica contemplada es la union de al menos una parte o resto a la propia molecula del componente, donde dicha parte o resto permite (a) la inhibicion de la proteolisis; y (b) la absorcion hacia el torrente sangumeo desde el estomago o intestino. Tambien se desea el incremento en la estabilidad general del componente o componentes y el incremento en el tiempo de circulacion en el cuerpo. Los ejemplos de tales partes o restos incluyen: polietilenglicol, copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinflico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" En: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Otros polnrieros que pueden utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Las preferidas para el uso farmaceutico, tal como se indica anteriormente, son las partes o restos de polietilenglicol.
Para el componente (o derivado), el lugar de liberacion puede ser el estomago, el intestino delgado (duodeno yeyuno o Aeon) o el intestino grueso. Un experto en la tecnica cuenta con formulaciones disponibles que no se disolveran en el estomago; aun asf liberaran el material en el duodeno o en otro lugar del intestino. Preferentemente, la liberacion evitara los efectos nocivos del ambito del estomago ya sea mediante la proteccion del oligonucleotido (o derivado) o mediante la liberacion del material biologicamente activo mas alla del ambito del estomago, tal como en el intestino.
Para asegurar la resistencia gastrica completa es esencial un recubrimiento impermeable que resiste al menos un pH 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes mas comunes que se utilizan como recubrimientos entericos son acetato trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de polivinilacetato (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac. Estos recubrimientos se pueden usar como pelmulas mixtas.
Tambien se puede usar en las tabletas un recubrimiento o mezcla de recubrimientos que no se pretende que otorguen proteccion contra el estomago. Estos pueden incluir recubrimientos de azucar o recubrimientos que hagan que la tableta sea mas facil de tragar. Las capsulas pueden consistir en una cubierta dura (tal como gelatina) para suministrar un agente terapeutico seco, es decir, polvo; para formas lfquidas se puede utilizar un cubierta de gelatina blanda. El material de la cubierta puede ser almidon grueso u otro papel comestible. Para pfldoras, pastillas deslefbles, tabletas moldeadas o triturados de tableta, se pueden utilizar tecnicas de amasado humedo.
El agente terapeutico se puede incluir en la formulacion como finos multiparticulados en forma de granulos o pelotitas de tamano de partmula de aproximadamente 1 mm. La formulacion del material para la administracion de la capsula tambien puede ser un polvo, tapones ligeramente comprimidos o incluso como tabletas. La parte terapeutica se puede preparar por compresion.
Todos los agentes colorantes y saborizantes pueden estar incluidos. Por ejemplo, el oligonucleotido (o derivado) puede estar formulado (tal como por encapsulacion de microesfera o liposoma) y luego contenido posteriormente en un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene agentes colorantes y saborizantes.
Se puede diluir o incrementar el volumen del agente terapeutico con un material inerte. Estos diluyentes podnan incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, almidon y dextranos modificados. Ciertas sales inorganicas tambien se pueden usar como rellenos, incluyendo el trifosfato de calcio, el carbonato de magnesio y el cloruro sodico. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son el Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
Los desintegrantes se pueden incluir en la formulacion del agente terapeutico en una forma farmaceutica solida. Los materiales que se utilizan como desintegrantes comprenden en forma no taxativa el almidon, incluido el desintegrante comercial basado en el almidon Explotab. El glicolato de almidon sodico, la Amberlite, la carboximetilcelulosa sodica, la ultramilopectina, el alginato de sodio, la gelatina, la cascara de naranja, la carboximetilcelulosa acida, la esponja natural y la bentonita, todos ellos se pueden utilizar. Otra forma de desintegrante son las resinas de intercambio cationico insolubles. Las gomas en polvo se pueden utilizar como desintegrantes y como aglutinantes y pueden incluir gomas tales como el agar, la Karaya o el tragacanto. El acido algmico y su sal sodica son tambien utiles como desintegrantes.
Los aglutinantes pueden utilizarse para mantener unido el agente terapeutico para formar una tableta dura e incluyen materiales realizados a partir de productos naturales tales como la acacia, el tragacanto, el almidon y la gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Tanto la polivinilpirrolidona (PVP) como la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) pueden utilizarse en soluciones alcoholicas para granular el agente terapeutico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Se puede incluir un agente antifriccion en la formulacion del agente terapeutico para evitar la adhesion durante el proceso de formulacion. Se pueden usar lubricantes a modo de capa entre el agente terapeutico y la pared de la matriz y pueden incluir en forma no taxativa los siguientes: acido estearico, incluidas sus sales de calcio y magnesio, politetrafluoruroetileno (PTFE), parafina lfquida, aceites vegetales y ceras. Tambien se pueden usar lubricantes solubles tales como el laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de distintos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
Se puede anadir deslizantes que pueden mejorar la fluidez del farmaco durante la formulacion y ayudar a la redisposicion durante la compresion. Los deslizantes pueden incluir almidon, talco, sflice pirogenica y silicio-aluminio hidratado.
Para ayudar a la disolucion del agente terapeutico en el entorno acuoso, se puede anadir un surfactante como agente humectante. Los surfactantes pueden incluir detergentes anionicos tales como el laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo y sodio y sulfonato de dioctilo y sodio. Pueden utilizarse detergentes cationicos y pueden incluir el cloruro de benzalconio o el cloruro de benzetomio. La lista de detergentes no ionicos potenciales que podnan ser incluidos en la formulacion como surfactantes son lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, ester de acido graso y sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos surfactantes pueden estar presentes en la formulacion del oligonucleotido o derivado ya sean solos o como una mezcla en distintas proporciones.
Las preparaciones farmaceuticas que se pueden utilizar por via oral incluyen capsulas de ajuste sin holgura hechas de gelatina, asf como capsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas de ajuste sin holgura pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un relleno tal como lactosa, con un aglutinante tal como los almidones y/o con lubricantes tales como el talco o el estearato de magnesio y, opcionalmente, con estabilizadores. En las capsulas blandas los componentes activos pueden estar disueltos o suspendidos en lfquidos adecuados tales como la acidos grasos, parafina lfquida o polietilenglicoles lfquidos. Asimismo, se pueden anadir estabilizadores. Tambien se pueden usar las microesferas formuladas para administracion oral. Tales microesferas estan bien definidas en la tecnica. Todas las formulaciones para administracion oral deben estar en dosis adecuadas para tal administracion.
Para la administracion por boca, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas deslefbles formuladas de manera convencional.
Para la administracion por inhalacion, los compuestos que se van a utilizar conforme a la presente invencion pueden suministrarse convenientemente en la forma de presentacion de un pulverizador en aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otros gases adecuados. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede estar determinada con la provision de una valvula que suministra una cantidad medida. Para su uso en inhalador o insuflador, las capsulas y los cartuchos de por ejemplo gelatina, deben estar formulados con contenido de una mezcla de polvo del compuesto y un polvo base adecuado tal como la lactosa o el almidon.
Tambien se contempla en la presente el suministro pulmonar de los oligonucleotidos (o sus derivados). El oligonucleotido (o su derivado) se suministra a los pulmones de un mairnfero mientras inhala y atraviesa el recubrimiento epitelial de los pulmones hasta el torrente sangumeo. Otros informes de moleculas inhaladas incluyen Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei etal., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (acetato de leuprolide); Braquet etal., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (endotelin-1); Hubbard etal., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. ]ii, pp. 206-212 (a1- antitripsina); Smith etal., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-1- proteinasa); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (hormona de crecimiento humana recombinante); Debs etal., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (interferon-g y factor alfa de necrosis tumoral) y Platz et al., patente de los EE.UU. N° 5,284,656 (factor estimulante de colonia de granulocitos). Un metodo y una composicion para el suministro pulmonar de farmacos para efecto sistemico se describe en la patente de los EE.Uu. N° 5,451,569, otorgada el 19 de septiembre de 1995 a Wong et al.
Se contemplan para su utilizacion en la practica de esta invencion una amplia gama de dispositivos mecanicos disenados para el suministro pulmonar de productos terapeuticos, incluidos en forma no taxativa nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de productos en polvo; los expertos en la tecnica estan familiarizados con todos ellos.
Algunos ejemplos espedficos de dispositivos disponibles comercialmente adecuados para la practica de esta invencion son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de productos en polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para dispensar el oligonucleotido (o derivado). Tfpicamente cada formulacion es espedfica para el tipo de dispositivo utilizado y puede involucrar el uso de un material propelente adecuado, ademas de los diluyentes, adyuvantes y/o vehfculos habituales utiles en la terapia. Tambien se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
contempla el uso de liposomas, microcapsulas o microesferas, complejos de inclusion u otros tipos de vehfculos. Tambien se pueden preparar oligonucleotidos qmmicamente modificados en diferentes formulaciones, segun el tipo de modificacion qmmica o del tipo de dispositivo utilizado.
Las formulaciones adecuadas para su uso con nebulizador ya sea a chorro o ultrasonico, comprenden tipicamente oligonucleotidos (o derivados) disueltos en agua a una concentracion de aproximadamente 0,1 a 25 mg de oligonucleotido biologicamente activo por ml de solucion. La formulacion tambien puede incluir una solucion amortiguadora o un azucar simple (por ejemplo, para la estabilizacion del nucleotido y la regulacion de la presion osmotica). La formulacion de nebulizador tambien puede contener un surfactante, para reducir o evitar la agregacion superficial inducida del oligonucleotido causada por la atomizacion de la solucion que forma el aerosol.
Las formulaciones que se van a utilizar con un inhalador de dosis medida por lo general comprenderan un polvo dividido finamente que contiene el oligonucleotido (o derivado) suspendido en un propelente con la ayuda de un surfactante. El propelente puede ser cualquier material convencional utilizado para este fin, tal como un clorofluorocarbono, hidroclorofluorocarbono, hidrofluorocarbono o hidrocarburo, incluidos triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o una combinacion de estos. Los surfactantes adecuados incluyen el trioleato de sorbitan y la lecitina de soja. Los acidos oleicos tambien pueden ser utiles como surfactantes.
Las formulaciones para ser dispensadas desde un dispositivo inhalador para productos en polvo comprenderan un polvo seco dividido finamente que contiene oligonucleotido ( o un derivado) y tambien pueden incluir agentes voluminizadores tal como la lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersion del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, entre un 50 a un 90% en peso de la formulacion. Mas ventajosamente, el oligonucleotido (o derivado) debera estar preparado en forma de partfcula con un tamano de partfcula promedio de menos de 10 mm (o micrones), mas preferentemente de 0,5 a 5 mm, para un suministro mas efectivo al pulmon distal.
Tambien se contempla el suministro nasal de una composicion farmaceutica de la presente invencion. El suministro nasal permite el pasaje de una composicion farmaceutica de la presente invencion al torrente sangumeo directamente despues de la administracion del producto terapeutico en la nariz, sin necesidad de depositar el producto en los pulmones. Las formulaciones para el suministro nasal incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano.
Un dispositivo util para la administracion nasal es una botella dura, pequena, a la que se le une un pulverizador de dosis medida. En una realizacion, la dosis medida se suministra al extraer la composicion farmaceutica de la solucion de la presente invencion hasta una camara de volumen definido, donde dicha camara tiene una abertura con dimensiones para pulverizar la formulacion en aerosol para formar una pulverizacion cuando se comprime un lfquido en la camara. La camara se comprime para administrar la composicion farmaceutica de la presente invencion. En una realizacion espedfica, la camara es una disposicion de piston. Tales dispositivos estan disponibles comercialmente.
En forma alternativa, se puede utilizar una botella de plastico que puede oprimirse con una abertura u orificio con dimensiones para pulverizar una formulacion en aerosol al formar una pulverizacion cuando se aprieta. El orificio generalmente se encuentra en la parte superior de la botella y por lo general, la parte superior esta ahusada para encajar en las narinas para una administracion eficiente de la formulacion en aerosol. Preferentemente, el inhalador nasal proporcionara una cantidad medida de la formulacion en aerosol, para administrar una dosis medida de del farmaco.
Los compuestos, cuando es deseable suministrarlos sistemicamente, pueden estar formulados para su administracion parenteral por inyeccion, por ejemplo mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion se pueden presentar en unidades de forma farmaceutica, por ejemplo en ampollas o envases multidosis, con la adicion de un conservante. Las composiciones pueden estar en forma de suspension, solucion o emulsion en vefuculos acuosos u oleosos y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizadores y/o dispersantes.
Las formulaciones farmaceuticas para la administracion parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyeccion oleosas adecuadas. Los vehfculos o solventes lipofflicos adecuados incluyen los aceites grasos tales como el aceite de sesamo o los esteres de acidos grasos sinteticos tales como el etiloleato o los trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones de inyeccion acuosa pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspension, tales como la carboximetilcelulosa sodica, el sorbitol o el dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para reconstitucion antes de su uso con un vefuculo adecuado, por ejemplo agua esteril libre de pirogenos.
Los compuestos tambien pueden estar formulados en composiciones rectales o vaginales, tal como supositorios o enemas de retencion, que por ejemplo contienen bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros gliceridos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En forma adicional a las formulaciones descritas previamente, los compuestos tambien pueden estar formulados como preparacion de deposito. Tales formulaciones de accion prolongada pueden estar formuladas con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo como sales escasamente solubles.
Las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender vehftculos de fase solida o en gel, o excipientes adecuados. Los ejemplos de tales vehftculos o excipientes incluyen en forma no taxativa carbonato de calcio, fosfato de calcio, distintos azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y poftmeros tales como los polietilenglicoles.
Las formas de preparaciones farmaceuticas adecuadas ftquidas o solidas son por ejemplo, soluciones salinas o acuosas para inhalacion, microencapsuladas, encocleadas, recubiertas en partfculas de oro microscopicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, pulverizadas en aerosol, como granulos para su implantacion en la piel o secas sobre un objeto afilado que se raspara en la piel. Las composiciones farmaceuticas tambien incluyen granulos, polvos, tabletas, tabletas recubiertas, (micro)capsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones de liberacion prolongada de los compuestos activos, en cuya preparacion se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como desintegrantes, aglutinadores, agentes de recubrimiento, agentes esponjantes, lubricantes, saborizantes, edulcorantes o solubilizadores, tal como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmaceuticas son adecuadas para su uso en distintos sistemas de suministro de farmacos. Para una breve revision de los metodos de suministro de farmacos vease Langer, Science 249:1527-1533, 1990.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores CpG y opcionalmente otros agentes terapeuticos y/o antfgenos se pueden administrar per se (puros) o en forma de una sal farmaceuticamente aceptable. Cuando se utilizan en el campo de la medicina, las sales deben ser farmaceuticamente aceptables, pero convenientemente se pueden utilizar sales no aceptables farmaceuticamente para preparar sales farmaceuticamente aceptables a partir de ellas. Tales sales incluyen, en forma no taxativa, las preparadas a partir de los siguientes acidos: clorhndrico, bromhftdrico, sulfurico, nftrico, fosforico, maleico, acetico, salidlico, p-toluensulfonico, tartarico, cftrico, metanosulfonico, formico, malonico, sucdnico, naftalen-2-sulfonico y bencensulfonico. Asimismo, tales sales se pueden preparar como sales de metales alcalinos o de alcalinoterreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo del acido carboxflico.
Los agentes amortiguadores adecuados incluyen: acido acetico y una sal (1-2% p/v); acido cftrico y una sal (1-3% p/v); acido borico y una sal (0,5-2,5% p/v); y acido fosforico y una sal (0,8-2% w/v). Los conservantes adecuados incluyen el cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v); clorobutanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) y timerosal (0,004-0,02% p/v).
Las composiciones farmaceuticas de la invencion contienen una cantidad efectiva de un oligonucleotido inmunoestimulador CpG y opcionalmente antfgenos y/u otros agentes terapeuticos opcionalmente incluidos en un vehftculo farmaceuticamente aceptable. El termino “vehftculo farmaceuticamente aceptable” se refiere a una o mas sustancias encapsuladoras, diluyentes o rellenos compatibles, solidos o ftquidos, que son adecuados para su administracion a un ser humano o a otro animal vertebrado. El termino vehftculo denota un ingrediente organico o inorganico, natural o sintetico con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicacion. Los componentes de las composiciones farmaceuticas tambien se pueden mezclar con los compuestos de la presente invencion y entre sf, de forma que no haya interaccion que perjudique sustancialmente la eficiencia farmaceutica deseada.
La presente invencion se ilustra ademas con los siguientes ejemplos, que de ninguna manera deben interpretarse como limitantes.
EJEMPLOS
Metodos y materiales:
Oligodesoxinucleotidos (ODN)
Todos los ODN se compraron a Biospring (Frankfurt, Alemania) o a Sigma-Ark (Darmstadt, Alemania) y su identidad y pureza fueron controladas por Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Alemania). Los ODN se diluyeron en solucion salina fosfato-amortiguada (Sigma, Alemania) y se almacenaron a -20 oC. Todas las diluciones se realizaron utilizando reactivos libres de pirogenos.
Purificacion celular
Se obtuvieron preparaciones de capas leucocitarias de sangre periferica de donantes masculinos y femeninos humanos sanos del Banco de Sangre de la Universidad de Dusseldorf (Alemania) y a partir de estos se purificaron PBMC por centrifugacion en una Ficoll-Hypaque (Sigma). Las PBMC purificadas se utilizaron frescas (para la mayona de los ensayos) o se suspendieron en un medio de congelamiento y se almacenaron a -70°C. Cuando fueron requeridas, se descongelaron aftcuotas de estas celulas, se lavaron y se resuspendieron en un medio de cultivo RPMI 1640 (BioWhittaker, Belgica) suplementadas con un 5% (v/v) de suero humano AB inactivado por calor
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(BioWhittaker, Belgica) o un 10% (v/v) de FCS inactivado por calor, L-glutamina 2mM (BioWhittaker), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml (Invitrogen (Karlsruhe, Alemania)).
Deteccion de citocina
Se sembraron PBMC descongeladas o frescas en placas de fondo plano de 48 pocillos, o en placas de fondo redondeado de 96 pocillos y se incubaron con ODN en las concentraciones que se indican, en un incubador humidificado a 37 °C. Se recolectaron los sobrenadantes de los cultivos y si no se usaron inmediatamente, se congelaron a -20 °C hasta que se necesitaron. Se determinaron las cantidades de citocinas en los sobrenadantes utilizando equipos de ELISA disponibles comercialmente (Diaclone, EE.UU.) o equipos de ELISA desarrollados internamente utilizando anticuerpos disponibles comercialmente (de Becton Dickinson/Pharmingen o PBL).
Cultivos para analisis por citometna de flujo de la activacion de celulas NK
Se compraron anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo para CD3 (marcador de celulas T), CD56 (marcadores de celulas NK) y CD69 (marcador de activacion temprana en celulas NK y celulas T) a Becton Dickinson. Se incubaron las PBMC durante 24 horas con o sin la adicion de distintas concentraciones de ODN en placas con fondo redondeado de 96 pocillos. Las celulas NK se identificaron como celulas CD56-positivas y CD3- negativas mediante citometna de flujo. Los datos de citometna de flujo fueron obtenidos en un FACSCalibur (Becton Dickinson). Los datos se analizaron utilizando el programa de computacion CellQuest (Becton Dickinson).
Analisis de citometna de flujo para marcadores de activacion de superficie celular
Para medir la expresion de la molecula coestimuladora CD86 como marcador de activacion en celulas B, se incubaron PBMC durante 48 horas con ODN en las concentraciones que se indican y se tineron las celulas con mAb para CD19 y CD86 (Pharmingen, Alemania). Se midio la expresion de CD86 en celulas B positivas a CD19 mediante citometna de flujo.
Para medir la expresion de la molecula coestimuladora CD80 como marcador de activacion en monocitos, se incubaron PBMC durante 48 horas con ODN en las concentraciones que se indican y se tineron las celulas con mAb para CD14, CD19 y CD80 (Pharmingen, Alemania). Se midio la expresion de CD80 en monocitos negativos CD19 y positivos CD14 mediante citometna de flujo. Los resultados de ambas mediciones se ofrecen como Intensidad de Fluorescencia Media (MFI).
Ejemplo 1: (Comparativo)
Los niveles de interferon-alfa (IFN-a), IFN-y, IL-10, IL-6 y TNF-a secretados de PBMC de humanos despues de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos CpG descritos en la presente se muestran en las Figuras 1-5 adjuntas. Los oligonucleotidos de prueba examinados se representan en las figuras mediante ▲ . Un oligonucleotido que se utilizo como oligonucleotido de control positivo se representa mediante ■. Los oligonucleotidos de prueba que se muestran en las Figuras 1A, 2A, 3A, 4A y 5A incluyen el numero de identificacion de secuencia (o N° ident. de sec.): 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324. Los oligonucleotidos de prueba que se muestran en las Figuras 1B, 2B, 3B, 4B y 5B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328. La concentracion de oligonucleotido utilizada para producir un punto de datos en particular se representa a lo largo del eje X (|iM). Debajo de los graficos se lista para cada experimento el nivel de citocina secretado por las celulas tratadas con un (medio de) control negativo y en algunos casos con LPS.
Tal como se muestra en las Figuras 1-5, los oligonucleotidos probados en los ensayos fueron capaces de producir secrecion de citocina a un nivel aproximadamente equivalente o mejor que los oligonucleotidos de control positivos que tienen un esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato. El control negativo ocasiono una produccion significativamente menor de citocinas.
Ejemplo 2: (Comparativo)
Se examinaron los niveles de expresion de CD69 (MFI) en celulas NK en respuesta al tratamiento con los oligonucleotidos de prueba frente a los oligonucleotidos de control. La expresion de CD69 es un indicador de activacion de celulas T y celulas NK. Las celulas se expusieron a los oligonucleotidos de prueba representados en la Figura 6 por un ▲ frente a un oligonucleotido de control positivo representado por ■. Los oligonucleotidos de prueba que se muestran en la Figura 6A incluyen N° ident. de sec.: 322, N° ident. de sec.: 323 y N° ident. de sec.: 324. Los oligonucleotidos de prueba que se muestran en la Figura 6B incluyen N° ident. de sec.: 325, N° ident. de sec.: 326, N° ident. de sec.: 327 y N° ident. de sec.: 328. El oligonucleotido de control positivo utilizado en estos estudios tiene el N° ident. de sec.: 329. Debajo de los graficos se lista para cada experimento el nivel de expresion de CD69 en celulas NK y T tratadas con un (medio de) control negativo y con LPS.
Tal como se muestra en la Figuras 6, los oligonucleotidos probados en los ensayos fueron capaces de inducir la expresion de CD69 a un nivel aproximadamente equivalente o mejor que los oligonucleotidos de control positivos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
que tienen un esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato. El control negativo ocasiono una produccion significativamente menor de CD69.
Ejemplo 3:
Los niveles de interferon-alfa (IFN-a) e IL-10 producidos por PBMC de humanos despues de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos CpG descritos en la presente se muestran en las Figuras 7-12 y 17 adjuntas. Los oligonucleotidos de prueba examinados se representan en las figuras mediante ■. Un oligonucleotido que se utilizo como oligonucleotido de control positivo de N° ident. de sec.: 242 se represento mediante •. Un oligonucleotido que se utilizo como oligonucleotido de control negativo se represento mediante ♦ N° ident. de sec.: 330. El oligonucleotido de prueba que se muestra en la Figura 7A y 7B tiene N° ident. de sec.: 313. El oligonucleotido de prueba que se muestra en la Figura 8A y 8B tiene N° ident. de sec.: 314. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 9A y 9B tiene N° ident. de sec.: 319. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 10A y 10B tiene N° ident. de sec.: 316. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 11A y 11B tiene N° ident. de sec.: 317. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 12A y 12B tiene N° ident. de sec.: 320. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 17A y 17B tiene N° ident. de sec.: 321. La concentracion de oligonucleotido utilizada para producir un punto de datos en particular se representa a lo largo del eje X (|iM).
Tal como se demuestra en las Figuras 7-12 y 17, cada uno de los oligonucleotidos probados en los ensayos fue capaz de producir distintos niveles y patrones de secrecion de citocina. Por ejemplo, a concentraciones aproximadamente equivalentes o menores, la mayona de los ODN probados dieron como resultado una induccion mejor de una o mas citocinas que el oligonucleotido de control positivo que tema un esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato. El control negativo ocasiono una produccion significativamente menor de citocinas.
Despues de la incubacion con N° ident. de sec.: 313 las PBMC secretan niveles similares de Interferon-alfa (IFNa) e Interleucina-10 (IL-10) que despues de la incubacion con N° ident. de sec.: 242. El N° ident. de sec.: 314 tiene efectos similares sobre la cantidad de IL-10 secretada por PBMC de humanos a los de N° ident. de sec.: 242, mientras que la secrecion de IFNa se incrementa fuertemente. En contraste con el N° ident. de sec.: 242, el N° ident. de sec.: 319 induce solamente niveles bajos de secrecion de IFNa de PBMC de humanos, mientras que la cantidad de IL-10 secretada es comparable entre los dos oligonucleotidos. El N° ident. de sec.: 316 fue capaz de inducir niveles de IFNa de PBMC de humanos varias veces superiores que N° ident. de sec.: 242. Tambien se observo un incremento en la cantidad total de IL-10 secretada. El N° ident. de sec.: 317 demostro propiedades similares a N° ident. de sec.: 316, con una secrecion de IFNa de PBMC de humanos fuertemente incrementada en comparacion con N° ident. de sec.: 242. Los niveles de secrecion de IL-10 fueron ligeramente elevados. Aunque el N° ident. de sec.: 320 diera como resultado la induccion de IFNa e IL-10 de PBMC de humanos, la induccion fue menor que las de N° ident. de sec.: 242. El N° ident. de sec.: 321 es capaz de inducir niveles de IFNa de PBMC de humanos mas de diez veces superiores que el N° ident. de sec.: 242 (Figura 17A). En comparacion con el N° ident. de sec.: 242, la secrecion de IL-10 de PBMC de humanos inducida por N° ident. de sec.: 321 esta ligeramente incrementada a concentraciones mayores de este oligonucleotido (Figura 17B).
Ejemplo 4:
Los niveles de activacion de monocitos y celulas B despues de la exposicion de estas celulas a los oligonucleotidos CpG descritos en la presente se muestran en las Figuras 13-15, 16 y 18-20 adjuntas. Los oligonucleotidos de prueba examinados se representan en las figuras mediante ■. Un oligonucleotido que se utilizo como oligonucleotido de control positivo de N° ident. de sec.: 242 se represento mediante •. Un oligonucleotido que se utilizo como oligonucleotido de control negativo se represento mediante ♦ N° ident. de sec.: 330. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 13A y 13B tiene N° ident. de sec.: 313. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 14A y 14B tiene N° ident. de sec.: 314. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 15A y 15B tiene N° ident. de sec.: 319. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 16A y 16B tiene N° ident. de sec.: 316. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 18A y 18B tiene N° ident. de sec.: 321. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 19A y 19B tiene N° ident. de sec.: 317. El oligonucleotido de prueba que se muestra en las Figuras 20A y 20B tiene N° ident. de sec.: 320. La concentracion de oligonucleotido utilizada para producir un punto de datos en particular se representa a lo largo del eje X (|iM).
Tal como se demuestra en las Figuras 13-15, 16 y 18-20, cada uno de los oligonucleotidos probados en los ensayos fue capaz de producir distintos niveles y patrones de expresion de marcador de superficie celular. Por ejemplo, a concentraciones aproximadamente equivalentes o menores, la mayona de los ODN probados dieron como resultado una induccion mejor de los marcadores de superficie celular que el oligonucleotido de control positivo que tema un esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato.
El nivel de expresion de CD86 en celulas B y de expresion de CD80 en monocitos inducido por el N° ident. de sec.: 313 es comparable al del N° ident. de sec.: 242. En contraste con el N° ident. de sec.: 242, el N° ident. de sec.: 313 estimula las celulas a concentraciones menores en comparacion con el N° ident. de sec.: 242, lo que sugiere una potencia incrementada. Los niveles de expresion de CD86 en celulas B y de expresion de CD80 en monocitos inducidos por el N° ident. de sec.: 314 son comparables. Los efectos de N° ident. de sec.: 314 se observan usando
5
10
15
20
25
30
35
concentraciones mas bajas de N° ident. de sec.: 314 en comparacion con N° ident. de sec.: 242, lo que demuestra una potencia incrementada de N° ident. de sec.: 314. En las celulas B, la expresion de superficie de CD86 esta fuertemente regulada ascendentemente con N° ident. de sec.: 319, con una fuerza de senal comparable a la de N° ident. de sec.: 242. En monocitos, solamente se pudieron detectar niveles debilmente elevados de expresion de CD80 con N° ident. de sec.: 319. La potencia de N° ident. de sec.: 319 para inducir la regulacion ascendente de CD86 en celulas B esta ligeramente reducida en contraste con N° ident. de sec.: 242. En comparacion con N° ident. de sec.: 242, N° ident. de sec.: 316 induce niveles mas altos de marcador de activacion CD86 en celulas B (Figura 16A) y de marcador de activacion CD80 en monocitos (Figura 16B). Las celulas B se activan fuertemente despues de la incubacion de PBMC de humanos con N° ident. de sec.: 321 como se muestra mediante la expresion de CD86 (Figura 18A). El nivel de CD86 es mayor que el inducido por N° ident. de sec.: 242. La activacion de monocitos, tal como lo determina la expresion de CD80, tambien es mayor con N° ident. de sec.: 321 que con N° ident. de sec.: 242 (Figura 18B). El N° ident. de sec.: 317 induce la expresion de CD86 en celulas B a niveles comparables con la de N° ident. de sec.: 242 (Figura 19A), mientras que la expresion del marcador de activacion cD80 en monocitos se incrementa en comparacion con la de N° ident. de sec.: 242 (Figura 19B). El N° ident. de sec.: 320 induce la expresion de CD86 en celulas B en una medida similar a la de N° ident. de sec.: 2426 (Figura 20A).
Ejemplo 5. Los oligonucleotidos semiblandos son inmunoestimuladores para las PBMC de humanos in vitro.
En este ejemplo se evaluaron oligonucleotidos semiblandos para determinar su capacidad para inducir citocinas y quimiocinas in vitro. Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se obtuvieron de tres donantes humanos sanos y se cultivaron en presencia de distintas concentraciones (0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 y 5,0 jM) de CpG completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 o de semiblandos de N° ident. de sec.:241. Despues de 6, 16 y 48 horas, se recolectaron los sobrenadantes de los cultivos y las distintas citocinas (IFN-a, TNF-a, IL-10) y la quimiocina IP-10 de los sobrenadantes se midieron mediante ELISA. A concentraciones bajas de oligonucleotido, los oligonucleotidos completamente estabilizados y semiblandos indujeron IFN-a en medidas similares despues de estar en cultivo 16 o 48 horas. Sin embargo, la induccion maxima de IFN-a con ODN 5476 se alcanzo a una concentracion de oligonucleotido de aproximadamente la mitad de la necesaria para N° ident. de sec.: 242. A concentraciones intermedias, N° ident. de sec.: 242 indujo mas IFN-a que N° ident. de sec.: 241 y a concentraciones altas ni N° ident. de sec.: 242 ni N° ident. de sec.: 241 indujeron mucho IFN-a. La quimiocina IP-10 fue estimulada en una medida similar y con una dependencia de concentracion similar por los oligonucleotidos completamente estabilizados y semiblandos. En ambos casos, ca. 700 pg/ml de IP-10 fueron observadas a concentraciones mas bajas de oligonucleotido y menos IP-10 fue inducida a concentraciones mas altas de oligonucleotido. Un patron similar al de IP-10 se observo para la citocina IL-10, con la excepcion de que el oligonucleotido semiblando a 0,05 jM indujo una cantidad de IL-10 significativa, mientras que el oligonucleotido completamente estabilizado a 0,05 jM indujo poco o nada de IL-10. Los oligonucleotidos completamente estabilizados y semiblandos fueron similares en cuanto a su capacidad para inducir TNF-a, es decir, ambos tipos de oligonucleotido indujeron fuertemente TNF-a, particularmente a concentraciones altas.
Tabla 1. Citocinas y quimiocinas (pg/ml)1 inducidas por oligonucleotidos (jM)
ODN 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0
IFN-a
N° ident. de sec.: 241 534,8 (3,5) 466,0 (7,5) 251,6 (22,9) 25,4 (21,4) 22,9 (26,3) 26,7 (22,1)
N° ident. de sec.: 242 444,0 (23,9) 573,6 (41,7) 892,4 (58,0) 583,6 (51,5) 115,6 (2,5) 51,5 (12,8)
IP-10
N° ident. de sec.: 241 5677,8 (18,9) 6221,5 (22,4) 4936,6 (11,8) 1493,6 (5,5) 121,9 (0,4) 0,0 (0,0)
N° ident. de sec.: 242 7287,4 (5,5) 6685,8 (12,8) 6967,4 (15,9) 4422,7 (11,0) 361,7 (2,6) 0,0 (0,0)
IL-10
N° ident. de sec.: 241 447,6 (3,7) 385,3, (4,9) 257,3 (3,1) 92,9 (1,6) 46,5 (0,2) 17,3 (1,5)
N° ident. de sec.: 242 73,4 (1,0) 399,8 (3,0) 367,7 (9,8) 237,8 (2,6) 52,3 (1,3) 10,5 (0,3)
TNF-a
N° ident. de sec.: 241 179,0 (18,3) 186,4 (15,9) 229,9 (23,4) 178,8 (9,0) 368,2 (22,3) 886,3 (31,7)
N° ident. de sec.: 242 196,8 (25,9) 211,5 (8,7) 242,7 (5,5) 262,1 (6,3) 479,8 (33,5) 939,6 (69,7)
Valores informados como medias (desviacion estandar).
Ejemplo 6. Estimulacion de macrofagos murinos in vitro por N° ident. de sec.: 241 semiblando frente a ODN completamente estabilizados.
Una lmea celular de macrofagos murinos (RAW264) se incubo durante 16 horas con el oligonucleotido semiblando de N° ident. de sec.: 241, el oligonucleotido completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242, ODN 5 completamente estabilizado 1826, lipopolisacarido (LPS) o PBS. Se examinaron el ODN semiblando y el completamente estabilizado a concentraciones de 0,02; 0,05 y 0,1 pM. Se recolectaron los sobrenadantes y se midio la subunidad p40 de IL-12 (IL-12p40, pg/ml) por ELISA. Los resultados se muestran en la Tabla 2. El oligonucleotido semiblando de N° ident. de sec.: 241 fue significativamente mas potente para inducir macrofagos para secretar IL- 12p40 que cualquiera de los ODN completamente estabilizados.
10 Tabla 2. Secrecion de IL-12p40 por parte de macrofagos murinos estimulados por el oligonucleotido semiblando de N° ident. de sec.: 241
ODN
Concentracion de ODN (pM) IL-12 p40, pg/ml media (D.S.)
N° ident. de sec.: 241
0,02 148,8 (37,5)
0,05 149,8 (28,7)
0,1 162,3 (8,4)
N° ident. de sec.: 242
0,02 41,4 (18,6)
0,05 42,0 (26,2)
0,1 23,0 (10,7)
N° ident. de sec.: 386
0,02 43,5 (23,0)
0,05 38,3 (19,2)
0,1 54,4 (4,1)
LPS
-- 346,5 (20,5)
PBS
-- 32,0 (12,1)
Ejemplo 7. Los oligonucleotidos semiblandos de clase B con secuencia optimizada para la estimulacion de celulas 15 inmunes humanas son potentes inmunoestimuladores de celulas inmunes murinas.
Se ha informado que las celulas inmunes humanas y murinas responden a diferentes ODN CpG. El CpG completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 ha sido considerado “optimo” para estimular celulas inmunes humanas, pero no ha sido considerado “optimo” para estimular celulas inmunes murinas. Por el contrario, el ODN CpG 5890 completamente estabilizado (5' T*C*A*A*C*G*T*T 3') ha sido considerado “optimo” para estimular celulas 20 inmunes murinas, pero no ha sido considerado “optimo” para estimular celulas inmunes humanas. Se ha informado que tanto las celulas B humanas como las murinas expresan TLR9. Se cultivaron esplenocitos murinos HEK293 que expresan TLR9 en presencia de diversas concentraciones de CpG completamente estabilizado N° ident. de sec.:242, ODN CpG completamente estabilizado 5890, o semiblando N° ident. de sec.:241 y se midio la activacion de TLR9 como se indica a continuacion. Las celulas utilizadas para este ensayo fueron TLR9 murinas expresadas y 25 conteman una construccion de gen reportero. Las celulas se incubaron con ODN durante 16 horas a 37 °C en una
incubadora humidificada. Cada punto de datos se realizo por triplicado. Las celulas se lisaron y se ensayaron para
detectar actividad del gen reportero. Se calcularon los indices de estimulacion en referencia a la actividad del gen reportero del medio sin la adicion de ODN. El oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241 y el oligonucleotido completamente estabilizado N° ident. de sec.: 242 tienen la misma secuencia de base. Los resultados se muestran
30 en la Tabla 3. A la concentracion mas baja, N° ident. de sec.: 241 y N° ident. de sec.: 242 tienen un efecto
inmunoestimulador mmimo. Sin embargo, a medida que la concentracion se incremento a 14 nM y por encima de esta, N° ident. de sec.: 241 fue claramente mas inmunoestimuladora que N° ident. de sec.: 242. A la mayor concentracion estudiada en este experimento, N° ident. de sec.: 241 fue como mmimo tan estimulador como el oligonucleotido ODN 5890 murino completamente estabilizado optimizado.
5
10
15
20
25
Tabla 3. Indice de estimulacion de celulas HEK293 murinas que expresan TLR9 mediante ODN semiblando con secuencia optimizada para celulas humanas
Conc.
ODN
5890 N° ident. de sec.: 241 N° ident. de sec.: 242
0,9 nM
1,4 0,7 0,9
3,5 nM
2,4 1,1 1,2
14 nM
12,5 1,9 1,1
58 nM
21,4 4,3 2,0
0,23 jM
25,2 12,0 6,2
0,94 jM
28,6 18,3 8,0
3,75 jM
29,3 32,1 10,3
Ejemplo 8-9. Oligonucleotidos semiblandos inducen la activacion de celulas NK.
Tambien se compararon los oligonucleotidos semiblandos y los completamente estabilizados en terminos de su capacidad para estimular la activacion de celulas NK. Utilizando un ensayo de liberacion de cromo estandar, 10 x 10° celulas esplenicas BALB/c se cultivaron en 2 ml de RPMI suplementado con FBS al 10% (inactivado por calor a 65 °C durante 30 min), 2-mercaptoetanol 50 jM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml y L-glutamato 2 mM, con o sin el semiblando de N° ident. de sec.: 241 o el completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 y cada ODN se anadio a una concentracion final de 1, 3, o 10 jg/ml, durante 48 horas. Las celulas se lavaron y luego se usaron como celulas efectoras en un ensayo de liberacion de 51Cr a corto plazo con YAC-1 y 2C11, dos lmeas de celulas objetivo sensibles a las NK (Ballas ZK et al. (1993) J Immunol 150:17-30). Las celulas efectoras se anadieron a distintas concentraciones a 104 celulas objetivo marcadas con 51Cr en placas para microtitulacion con fondo en V en 0,2 ml y se incubaron en CO2 al 5% durante 4 horas a 37 °C. Las relaciones estudiadas de celula efectora:celula objetivo (E:T) fueron de 6,25:1; 25:1; 50:1 y 100:1. Luego se centrifugaron las placas y se realizo un conteo de una alfcuota del sobrenadante para detectar radioactividad. El porcentaje espedfico de lisis se determino calculando la relacion del 51Cr liberado en presencia de las celulas efectoras menos el 51Cr liberado cuando las celulas se cultivaron solas, sobre el total de los conteos del liberado despues de la lisis celular en un acido acetico al 2% (100 por ciento de lisis) menos el 51Cr cpm liberado cuando las celulas se cultivaron solas. Los resultados se muestran en la Tabla 5 que sigue a continuacion. En resumen, el oligonucleotido semiblando de N° ident. de sec.: 241 y el completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 inducen esencialmente niveles comparables de activacion de celulas NK sobre todas las concentraciones de ODN y las relaciones E:T examinadas.
Tabla 5. Lisis espedfica mediada por celulas NK
ODN
jg/ml Relacion E:T
6,25:1 25:1 50:1 100:1
N° ident. de
1 8 17 17,5 27,5
sec.: 241
3 2,5 5 8 15
10 4 12,5 20 28
N° ident. de
1 7 8 12,5 22
sec.: 242
3 3,5 4 11 18
10 5 12,5 23 32,5
Ejemplo 10. Los oligonucleotidos semiblandos son generalmente mas inmunoestimuladores que los oligonucleotidos con todos sus enlaces fosforotioato de igual o similar secuencia.
Todas las versiones semiblandas probadas fueron mas activas en el ensayo de TLR9 humano que en la correspondiente molecula uniformemente de fosforotioato (Tabla 6). El mdice de estimulacion promedio se calculo a partir de puntos de datos de cuatro concentraciones (0,1 pM; 0,5 pM; 2 pM y 8 jM). En la Tabla, U representa 2'- desoxiuracilo.
5 Tabla 6. indices relativos promedio de estimulacion de oligonucleotidos semiblandos frente a oligonucleotidos con todos sus enlaces fosforotioato de igual o similar secuencia.
Secuencia
Indice Relativo Promedio de Estimulacion
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:247)
1,00
T*c*g*c*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:248)
0,74
T*c*g*c*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:249)
0,72
T*c*g*t*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:250)
1,37
T*c*g*t*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:251)
1,25
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:252)
2,99
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:253)
2,22
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:254)
3,46
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G N° ident. de sec.:255)
4,08
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:256)
5,69
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:257)
4,49
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:244)
1,00
T*g*t*c_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:258)
4,23
T*g*t*c_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:243)
4,74
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:259)
1,00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:260)
1,80
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:261)
1,00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:262)
2,71
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:263)
3,01
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:264)
3,06
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (N° ident. de sec.:265)
2,06
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T (N° ident. de sec.:266)
1,43
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T (N° ident. de sec.:267)
0,91
G*t*t*c*T*C*G*C*T*G*G*T*G*A*G*T*T*T*C*A (N° ident. de sec.:268)
1,00
G*t*t*c*T*C_G*C*T_G*G*T_G*A*G*T*T*T*C*A (N° ident. de sec.:269)
3,45
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:270)
1,00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:271)
2,49
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:272)
2,51
T*C*G*T*C*G*T*T*T*U*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:273)
1,00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:274)
2,62
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:242)
1,00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:276)
1,95
T*C*G*U*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*U*G*U*C*G*T*T (N° ident. de sec.:277)
1,00
T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (N° ident. de sec.:278)
1,39
T*C*G*T*C*G*U*U*U*T*G*T*C*G*U*U*U*U*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:279)
1,00
T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:280)
2,05
A*A*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:281)
1,00
A*A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:282)
1,58
Ejemplo 11. Potencia in vitro mejorada para versiones semiblandas de oligonucleotidos completamente estabilizados debilmente inmunoestimuladores
10
(T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T, N° ident. de sec.:244) es un oligonucleotido CpG con todos los enlaces fosforotioato completamente estabilizado, con potencia inmunoestimuladora baja comparado con N° ident. de sec.: 242. Los oligonucleotidos semiblandos relacionados
(T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T, N° ident. de sec.:258) y (T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T, N° ident. de sec.:243) fueron muchas veces mas potentes que N° ident. de sec.: 244 e incluso mas potentes que N° ident. de sec.: 242.
T*g*t*c_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:258)
T*g*t*c_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:243)
T*g*t*c*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:244)
5
Tabla 7. Estimulacion inmune mejorada por variantes semiblandas de un oligonucleotido completamente estabilizado pero debilmente inmunoestabilizador.
ODN
Concentracion de ODN (jM)
0,1 0,5 2 8
N° ident. de sec.: 244
16,0 47,5 71,4 68,5
N° ident. de sec.: 243
19,3 40,5 78,2 77,9
N° ident. de sec.: 241
2,6 9,5 12,9 14,0
N° ident. de sec.: 242
10,6 34,2 38,3 40,8
Ejemplo 12. Los oligonucleotidos semiblandos de longitud reducida son inmunoestimuladores in vitro.
Se compararon el oligo de 16 bases semiblando, N° ident. de sec.:283, el de 16 bases, N° ident. de sec.:245, el de 17 bases, N° ident. de sec.:284 y el de 24 bases, N° ident. de sec.:241 con los ODN completamente estabilizados de 5 24 bases, N° ident. de sec.:242 y de 18 bases, N° ident. de sec.:285 respecto de su capacidad para estimular la
senalizacion de TLR9. Cada oligonucleotido se anadio a celulas HEK293 transfectadas con TLR9 humanos y un gen reportero a una concentracion de 1, 6, 12, o 24 pg/ml y se midio la activacion de TLR9 tal como se describio anteriormente.
(16 bases) T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (N° ident. de sec.:283)
10 (16 bases) T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:245)
(17 bases) T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:284)
(18 bases) A*A*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:285)
(24 bases)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (N° ident. de sec.:241)
(24 bases)T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (N° ident. de sec.:242)
15 Mientras que el ODN oligonucleotido completamente estabilizado de 18 bases de N° ident. de sec.: 285 fue menos inmunoestimulador que el oligonucleotido totalmente estabilizado de 24 bases de N° ident. de sec.: 242 a todas las concentraciones examinadas, los oligonucleotidos semiblandos de 16 bases y 17 bases fueron como mmimo tan estimuladores como el de 24 bases N° ident. de sec.: 242 a concentraciones de 6 pg/ml y superiores. Asimismo, los oligonucleotidos semiblandos de 16 bases y 17 bases fueron casi tan inmunoestimuladores como el oligonucleotido 20 semiblando de 24 bases de N° ident. de sec.: 241.
Tabla 8. Actividad inmunoestimuladora de los oligonucleotidos semiblandos cortos comparados con los oligonucleotidos semiblandos y completamente estabilizados largos y cortos
ODN
Concentracion de ODN (pg/ml)
1 6 12 24
N° ident. de sec.: 283
1,2 17,1 29,0 39,5
N° ident. de sec.: 245
1,1 8,4 31,3 48,9
N° ident. de sec.: 284
3,4 23,9 35,9 45,6
N° ident. de sec.: 285
4,6 12,9 15,9 18,0
N° ident. de sec.: 241
6,4 33,0 50,8 58,6
N° ident. de sec.: 242
11,0 24,6 26,2 21,9
Ejemplo 13. Los oligonucleotidos semiblandos son inmunoestimuladores in vivo.
25 Se dividieron ratones BALB/c en grupos y se les administro subcutaneamente 400 pg de oligonucleotido semiblando de N° ident. de sec.: 241, de oligonucleotido completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242, de oligonucleotido de control negativo completamente estabilizado (TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT, N° ident. de sec.:286), o un volumen equivalente de solucion salina de fosfato amortiguadora (PBS). Se sangraron los animales 3 horas despues de la inyeccion y se determinaron los niveles en suero de IP-10, IFN-y y TNF-a usando un ensayo 30 apropiado de ELISA espedfico para citocinas. El IP-10 en suero fue aproximadamente dos veces superior en los animales que recibieron el semiblando de N° ident. de sec.: 241 (8.000-12.000 pg/ml) que el oligonucleotido inmunoestimulador completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 (3.500-8.000 pg/ml). El IP-10 en suero de los animales que recibieron el control de N° ident. de sec.: 286 tuvo el mismo nivel bajo de IP-10 que los animales que recibieron PBS. El oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241 y el oligonucleotido inmunoestimulador 35 completamente estabilizado N° ident. de sec.: 242 indujeron cantidades similares de IFN-y, ca. 150 pg/ml. El oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241 indujo un 30-45 por ciento mas de TNF-a que el oligonucleotido inmunoestimulador completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 (ca. 1.550 pg/ml frente a ca. 1.175 pg/ml en un experimento y ca. 710 pg/ml frente a 490 pg/ml en otro experimento).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otro conjunto de experimentos in vivo, los oligonucleotidos semiblandos y completamente estabilizados fueron examinados para determinar su capacidad de tratar tumores en ratones BALB/c. Tres grupos de ratones BALB/c fueron inyectados via i.p. con adenocarcinoma renal murino de celulas (Renca) de origen espontaneo, usando un modelo de tumor establecido. Salup RR et al. (1985) J Immunopharmacol 7:417-36. Cada grupo de ratones tambien recibio o bien 100 mg de oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241, o 100 mg de oligonucleotido inmunoestimulador completamente estabilizado N° ident. de sec.: 242, o un volumen equivalente de PBS. Se hizo un seguimiento de los ratones para determinar su supervivencia y el tamano del tumor al momento de su muerte. Los ratones que recibieron el tratamiento sustituto con PBS tuvieron una media de supervivencia de 44 dfas y un 20 por ciento de supervivencia a los 50 dfas. En contraste, los ratones que recibieron oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241 tuvieron un 80 por ciento de supervivencia a los 50 dfas y los ratones que recibieron el oligonucleotido inmunoestimulador completamente estabilizado N° ident. de sec.: 242 tuvieron un 70 por ciento de supervivencia a los 50 dfas. En terminos de tamano del tumor (milfmetros cubicos), despues de 52 dfas, los ratones que recibieron PBS tuvieron volumenes de tumor cercanos a los 1200 mm3, mientras que los ratones que recibieron oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241, u oligonucleotido inmunoestimulador completamente estabilizado de N° ident. de sec.: 242 tuvieron tumores de ca. 250 mm3 y 180 mm3, respectivamente. Asf, los oligonucleotidos semiblandos y los oligonucleotidos completamente estabilizados fueron ambos altamente efectivos para reducir la carga tumoral y extender la supervivencia en este experimento modelo.
Ejemplo 14. Los oligonucleotidos blandos o semiblandos tienen nefrotoxicidad reducida.
Se ha observado que la administracion de oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados a monos puede estar asociada con el desarrollo de glomerulonefritis, es decir, inflamacion del rinon. La glomerulonefritis se puede diagnosticar y controlar mediante la presencia de globulos rojos y protemas en la orina, a menudo acompanada de una velocidad de filtracion glomerular reducida (con azotemia), retencion de agua y sales, hipertension y edema. Normalmente la orina esta esencialmente libre de celulas sangumeas y protemas plasmaticas. Se puede realizar el diagnostico mediante un examen histologico del tejido renal. Se ha informado que el tejido renal es rico en nucleasas, que se espera sean mas activas sobre los oligonucleotidos blandos que sobre los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados.
Los monos se dividieron en dos grupos; a uno se le administro oligonucleotidos blandos y al otro se le administro oligonucleotidos inmunoestabilizadores completamente estabilizados. Los oligonucleotidos blandos y los oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados son identicos en cuanto a su secuencia y difieren tan solo en sus enlaces internucleotidos. Ambos grupos de monos recibieron la misma dosis de oligonucleotido inmunoestimulador. Se realizaron mediciones pretratamiento (lmea de base) y mediciones periodicas durante el tratamiento de al menos un parametro util para evaluar la presencia de glomerulonefritis, que incluyeron por ejemplo, analisis de orina con tiras reactivas para determinar la presencia de proteinuria y/o hematuria, analisis de orina microscopico para determinar la presencia de globulos rojos y/o cilindros de globulos rojos, concentracion de protema en orina, nitrogeno ureico en sangre (BUN), creatinina serica, tension sangumea, peso corporal y biopsia de rinon con analisis de tejido con microscopio electronico u optico. Los hallazgos clmicos se correlacionaron con el tipo de oligonucleotido inmunoestimulador administrado a cada mono y se compararon los resultados entre grupos para determinar su importancia estadfstica.
Opcionalmente, se incluyeron grupos de monos apareados adicionales a los que se les administraron oligonucleotidos blandos o semiblandos u oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados como se indico anteriormente, pero utilizando dosis de oligonucleotido mayores o menores que las anteriores para evaluar los resultados mas aun en funcion de la dosis de oligonucleotido.
Los monos que recibieron los oligonucleotidos blandos son significativamente menos proclives a desarrollar glomerulonefritis que los monos que recibieron oligonucleotidos inmunoestimuladores completamente estabilizados.
Ejemplo 15. Los oligonucleotidos blandos tienen una potencia inmunoestimuladora incrementada a concentracion alta.
Los oligonucleotidos blandos se compararon con N° ident. de sec.: 242 para determinar su capacidad para inducir actividad de TLR9. El ODN blando y el control de N° ident. de sec.: 242 se compararon a cada una de cuatro concentraciones, 1 pg/ml, 6 pg/ml, 12 pg/ml y 24 pg/ml. Las relaciones de cada concentracion de activacion por cada oligonucleotido blando comparada con la activacion por N° ident. de sec.: 242 se muestran a continuacion en la Tabla 9. Estos resultados indican que los oligonucleotidos blandos son mas inmunoestimuladores que N° ident. de sec.: 242 a las concentraciones mas altas que se examinaron.
T*g*t*c_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G_T*C_G*T*T N° ident. de sec.:287
T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_G_T*T*T N° ident. de sec.:288
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*C_G_G*T*C_G_T*T*T*T N° ident. de sec.:289
T*C G T*C G t*T*T*T*T*C G T*G*C G t*T*T*T*T N° ident. de sec.:290
5
10
15
20
25
30
35
40
T*C G T*C G t*T*T*T*C G t*T*T*T*T*T*T*C G*T*T*T
T*C G t*T*T*T*G*T*C G t*T*T*T*T*T*T*C G*A
T*C G T*C G T*T*T*T G T*C G T*T*T*T G*T C G*T*T
Tabla 9. Potencia relativa de los oligonucleotidos blandos comparados con N concentracion
N° ident. de sec.:291 N° ident. de sec.:292 N° ident. de sec.:293 ° ident. de sec.: 242 a cada
Ident.
Concentracion de ODN (jg/ml)
1
6 12 24
N° ident. de sec.: 287
0,11 0,12 1,00 1,68
N° ident. de sec.: 288
0,30 0,62 1,67 1,81
N° ident. de sec.: 289
0,13 0,52 1,67 1,97
N° ident. de sec.: 290
0,18 0,41 1,69 2,27
N° ident. de sec.: 291
0,16 0,35 1,56 1,81
N° ident. de sec.: 292
0,25 0,48 1,38 1,84
N° ident. de sec.: 293
0,10 0,11 1,20 2,05
Ejemplo 16. Estabilidad de oligonucleotidos en suero y en tejidos.
Se inyectaron subcutaneamente ratones con 25 mg/kg del oligonucleotido semiblando N° ident. de sec.: 241, del oligonucleotido blando (T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T; N° ident. de sec.:294), o del oligonucleotido completamente estabilizado N° ident. de sec.: 242. Se obtuvieron las muestras de tejido y suero despues del numero de horas seleccionado y se analizaron para determinar los oligonucleotidos intactos y los fragmentos de estos.
A las muestras de tejido o suero se les incorporo una cantidad conocida de ODN estandar interno (1,25 |jg poliT) y se aislo el ODN de las muestras de plasma y tejido mediante metodos de extraccion de fase solida (SPE) que se describen a continuacion. Las soluciones resultantes que contienen el analito, metabolitos y el estandar interno se analizaron mediante electroforesis de gel capilar (CGE) y los metodos MALDI-TOF que tambien se describen a continuacion. Se definieron las cantidades totales del ODN recuperado (es decir, analito mas metabolitos) de las muestras de suero, bazo, tngado y rinon analizadas por CGE. Se calculo la desviacion estandar. Se asigno la cantidad relativa porcentual del area total del pico a cada metabolito.
SPE. Para el aislamiento de ODN del suero, a 100 jg de la muestra se le agregaron 1,25 jg de ODN estandar interno, se mezclo y se disolvio en 5 ml de solucion amortiguadora SAX. Esta solucion se aplico a una columna de intercambio anionico (SAX, Agilent), la columna se lavo y se eluyo el ODN con una solucion amortiguadora de fuerza ionica incrementada. Al eluato resultante se le elimino la sal utilizando una columna de fase reversa (RP) (Glen Research) o una columna comparable (HBL, Waters). Los eluatos de la columna RP, que conteman tan solo agua y acetonitrilo, se secaron y solubilizaron en el mismo tubo en 60 jl de agua desionizada. Para eliminar mas sal de las muestras se realizo una dialisis de membrana. Las muestras se analizaron directamente mediante electroforesis de gel capilar. Para realizar los MS MALDI-TOF, se usaron las muestras sin diluir o concentradas, es decir, 50 jl de la muestra de ODN se secaron al vado y se disolvieron en agua desionizada y se ensayaron tal como se describe mas adelante.
Se aislaron ODN de los tejidos conforme a un protocolo de SPE similar. Se homogeneizaron 100 mg de tejido utilizando un dispositivo FastPrep. Se anadio proteinasa K y se hidrolizaron las protemas durante 2 horas. Se realizo una extraccion con fenol antes de proceder con la fraccion soluble en agua del metodo de SPE descrito anteriormente.
CGE. Las muestras sin sales que contienen el analito, sus metabolitos y una cantidad definida de ODN estandar interno se inyectaron electrocineticamente en un capilar relleno con gel (neutro, 30 cm, capilar de ADN eCAP, Beckman N° 477477 ) en el lado de la muestra con preinyeccion de agua. Se aplico una tension de 300 V/cm mientras se controlaba la deteccion a 260 nm. La separacion se llevo a cabo a 25 °C en solucion amortiguadora de Tris/acido borico/EDTA que contema urea 7 M. El analito se identifico mediante su tiempo de migracion relativo (TMOligo/TMEs.int.) comparado con el de un estandar que esta preparado en forma similar y que se ha analizado concomitantemente. Se registro el tiempo de migracion relativo y el porcentaje de area relativa de cualquier pico electroforetico que fuera >3x la relacion senal : ruido (S:N). Las alturas de picos de entre 3x y 10x senal: ruido se registraron como no cuantificables.
% Oligo = (area del pico / area pico total > 3 x S:N) x 100 %
MALDI-TOF. Se analizaron las muestras sin sales que conteman el analito y sus metabolites en un espectrometro de masas MALDI-TOF de Applied Biosystems con una fuente de extraccion retardada, un laser de nitrogeno a una longitud de onda de 337 nm y un tubo de vuelo de 1,2 metros. El instrumento se fijo en los siguientes valores: 5 tension 25 kV; tension de grilla 95,4%; alambre de grna 0,1%; tiempo de retardo 1200 ns. Se utilizo como matriz acido 3-hidroxipicolmico que contema citrato de diamonio. Los espectros de las muestras de ODN fueron calibrados externamente en la misma placa bajo identicas condiciones, utilizando un conjunto de ODN estandar de pesos moleculares conocidos.
Los resultados obtenidos a 48 horas se muestran en la Figura 20. La figura 20 muestra que en el semiblando de 10 rinon de N° ident. de sec.: 241 y en el ODN blando N° ident. de sec.: 294 se redujeron de manera sorprendente (en un 93 por ciento y en un 87 por ciento, respectivamente) en comparacion con el de todos los enlaces fosforotioato de N° ident. de sec.: 242.
Ejemplo 17. Los oligonucleotidos C son inmunoestimuladores in vitro.
Los oligonucleotidos de clase C semiblandos se prepararon con enlaces fosfodiester en la porcion no palindromica 5' 15 (ODN de N° ident. de sec.: 255), la porcion palindromica 3' (ODN de N° ident. de sec.: 251) y en la porcion no palindromica 5' y la porcion palindromica 3' (ODN de N° ident. de sec.: 295). Ademas, el ODN de N° ident. de sec.: 252 se preparo con enlaces como el ODN de N° ident. de sec.: 295 pero con azucares de ribosa 2'-O-Me en los nucleotidos que conforman la porcion 3' palindromica (que se muestra subrayada a continuacion). Luego estos oligonucleotidos fueron evaluados utilizando un ensayo de TLR9 descrito anteriormente.
20 T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (N° ident. de sec.:255)
T*c*g*t*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:251)
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (N° ident. de sec.:295)
T*C G*C*C g*T*T*T*T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (N° ident. de sec.:252)
Los oligonucleotidos de clase C con esqueletos completamente estabilizados, generalmente exhiben una actividad 25 de TLR9 relativamente baja en comparacion con los oligonucleotidos de clase B. Tal como se muestra en la Tabla 10 a continuacion, la incorporacion de una secuencia semiblanda en tan solo la porcion no palindromica 5' (ODN de N° ident. de sec.: 255) mejoro significativamente la actividad de TLR9 en comparacion con la incorporacion de una secuencia semiblanda en tan solo la porcion palindromica 3' (ODN de N° ident. de sec.: 251). La incorporacion de la secuencia semiblanda en la porcion 5' no-palindromica y la porcion 3' palindromica (ODN de N° ident. de sec.: 295) 30 dio como resultado una actividad mejorada de TLR9 en comparacion con la incorporacion de una secuencia semiblanda en tan solo la porcion palindromica 3' (ODN de N° ident. de sec.: 251).
Tabla 10. Estimulacion de TLR9 por los nucleotidos de clase C semiblandos
ODN
Concentracion de ODN (pg/ml)
0,1
0,5 2,0 8,0
N° ident. de sec.: 255
2,3 16,9 36,4 35,7
N° ident. de sec.: 251
1,2 2,5 8,4 16,8
N° ident. de sec.: 295
2,0 11,6 29,8 37,3
N° ident. de sec.: 252
1,1 3,9 22,1 47,0
Los oligonucleotidos semiblandos de clase C no solo conservan su capacidad de inducir IFN-a por PBMC humanas, sino tambien son significativamente mas potentes a bajas concentraciones. La potencia mejorada fue mas 35 pronunciada en los oligonucleotidos de clase C que inclrnan la secuencia semiblanda en la porcion no palindromica 5' (ODN N° ident. de sec.: 255 y ODN de N° ident. de sec.: 295). Los ODN de N° ident. de sec.: 255, N° ident. de sec.: 251 y N° ident. de sec.: 295 se evaluaron mediante ELISA y se compararon con N° ident. de sec.: 242, la forma completamente estabilizada de estos tres oligonucleotidos semiblandos y un oligonucleotido de clase C potente inductor de IFN-a. Los resultados se presentan en la Tabla 11.
40 Tabla 11. Induccion de IFN-a (pg/ml) por versiones semiblandas del oligonucleotido clase C
ODN
Concentracion de ODN (pM)
0,1
0,2 0,5 1,0 2,0
5
10
15
20
25
30
35
40
N° ident. de sec.: 255
3202 7429 937 64 3
N° ident. de sec.: 251
688 3033 3083
N° ident. de sec.: 295
2560 3363 3246 930 41
—
50 504 3247 2114 1789
Ejemplo 18: Caracteristicas fisicoqmmicas de N° ident. de sec. 313 Metodos:
El patron de difractometna de rayos X de polvo de N° ident. de sec. 313 mostro un halo caractenstico de una fase amorfa. El analisis de sorcion de vapor de agua ha mostrado que N° ident. de sec. 313 es altamente higroscopico La tendencia del farmaco a intercambiar humedad puede dar como resultado una cantidad variable de humedad dependiendo de la humedad del entorno. El compuesto muestra una alta solubilidad en agua (>100 mg/ml) y asf tiene una solubilidad adecuada a traves de todo el rango de pH utilizable. El analisis de las soluciones acuosas del farmaco a elevada temperatura muestra que se degrada rapidamente en entornos levemente acidos a acidos, pero las soluciones amortiguadoras de pH mayor de seis parecen tener una estabilidad de solucion adecuada.
Resultados:
Se descubrio que N° ident. de sec. 313 es amorfo por naturaleza y altamente higroscopico. El compuesto muestra una alta solubilidad en agua (>100 mg/ml) y asf tiene una solubilidad adecuada a traves de todo el rango de pH utilizable. El ODN se degrada rapidamente en entornos ligeramente acidos a acidos. Las soluciones amortiguadoras de pH mayor de seis parecen tener una estabilidad de solucion adecuada.
Ejemplo 19: Estimulacion de celulas transfectadas TLR-9 in vitro
Metodos:
Se incubaron celulas HEK 293 transfectadas con TLR9 humano con N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329 durante 16 horas. La senal se determino mediante una lectura de luciferasa.
Resultados:
Comparandolo con N° ident. de sec. 329, N° ident. de sec. 313 fue un estimulador mas potente del receptor objetivo TLR9.
Ejemplo 20: Estimulacion de celulas inmunes humanas in vitro Metodos:
Se incubaron las celulas mononucleares de sangre periferica humana de 6 donantes con N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329 durante 24 - 48 horas. Se midio la secrecion de citocinas.
Resultados:
Los resultados se muestran en la Figura 23. Comparandolo con N° ident. de sec. 329, N° ident. de sec. 313 mostro una eficacia y/o potencia incrementadas o al menos similares como inductor de las citocinas IL-6, IL-10, IFNa e IP- 10 asociadas con TLR9.
Ejemplo 21: Estimulacion de esplenocitos murinos in vitro Metodos:
Los esplenocitos murinos (BALB/c) se incubaron con N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329 durante 48 horas. Se midio la secrecion de citocinas y de IP-10.
Resultados:
Comparandolo con N° ident. de sec. 329, N° ident. de sec. 313 mostro una eficacia y/o potencia incrementadas o al menos similares como inductor de las citocinas IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa e IP-10. Los datos se muestran en la Figura 24. Estos datos demuestran que la actividad de N° ident. de sec. 313 sobre las celulas inmunes de murino es comparable a la que ejerce sobre las celulas humanas (ver arriba) y es similarmente consistente con la activacion v'ia TLR9.
Ejemplo 22: Induccion de genes de citocina en ratones in vivo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Metodos:
Este estudio evaluo la expresion de citocinas en los pulmones de raton despues de que se dosifico N° ident. de sec. 313 en vfas aereas. Para investigar la exposicion renal, tambien se evaluo la induccion de las mismas citocinas (tal como se describe en los Ejemplos 10 y 21) en este organo. Se administro a los ratones (machos, BALB/c) N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329 (cada uno 1 mg/kg) ya sea por instilacion intranasal o por inyeccion intravenosa en bolo. Se les extirparon los pulmones y rinones despues de transcurridas 8 o 15 horas desde la administracion. Se extrajo el ARN y se le aplico transcripcion inversa para obtener ADNc. Los fragmentos objetivo de ADNc se amplificaron y se detectaron mediante PCR de tiempo real (Roche LightCycler usando el metodo de deteccion SYBR Green). Los cebadores para GAPDH, IFN gamma, IL-6, IP-10 y TNF-alfa se disenaron usando el software LC PROBE DESIGN de Roche(Version 1.0 N° catalogo Roche 3 139 174). Los cebadores para IFN-alfa se disenaron usando el software PRIMER 3. La produccion de producto se normalizo como la relacion de la expresion (GAPDH) del gen control.
Resultados:
Cuando se administro en las vfas aereas, N° ident. de sec. 313 indujo la expresion de genes asociados con TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy e IP-10) en el pulmon. Los resultados se muestran en la Figura 25. Sin embargo, con la excepcion del IP-10, estos genes no se expresaron en los rinones de los ratones administrados por esta via. Dado que el IP-10 esta inducido tipicamente por los interferones, la expresion de esta quimiocina podria haber ocurrido indirectamente como resultado de los interferones secretados a la circulacion sistemica desde el pulmon. Cuando N° ident. de sec. 313 se administro por via intravenosa, cada uno de estos genes fue inducido en el rinon, con la excepcion de IFNy. Por lo tanto, la falta de impacto renal de N° ident. de sec. 313 despues de su administracion en las vfas aereas fue debida probablemente a la baja exposicion sistemica.
Los ODN CpG pueden ocasionar efectos renales mediante distintos mecanismos. Se ha observado una inflamacion granulomatosa renal aguda causada por un mecanismo dependiente de TLR9 despues de la exposicion sistemica a algunos ODN CpG. Nuestros resultados sugieren que la exposicion sistemica a N° ident. de sec. 313 administrado en las vfas aereas no es suficiente para inducir directamente genes asociados a TLR-9 en el rinon.
Ejemplo 23: Efectos sobre el desarrollo de nodulos linfaticos inducidos por antigeno en ratones in vivo
Metodos:
Este estudio investiga la capacidad de N° ident. de sec. 313 para inducir la desviacion inmune desde una respuesta de tipo Th2 en nodulos linfaticos de drenaje en ratones. Se sensibilizaron ratones (machos, BALB/c) por inyeccion en la planta de la pata derecha trasera con antigeno (ovoalbumina, 100 |jg) en adyuvante completo de Freund. Los ratones fueron inyectados en forma simultanea en la misma planta de la pata con N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329 (1,5 mg/kg) o con vetticulo (solucion salina). Seis dfas despues de la inyeccion en la planta de la pata, el nodulo linfatico popliteal de drenaje se extirpo. Las celulas T (CD3+) y B (B220+) se contaron mediante citometna de flujo. Un ensayo de recuperacion de antigeno ex vivo se realizo de la siguiente manera: 1x106 celulas (del nodulo linfatico popliteal de drenaje) se incubaron en 220 ul de medio RPMI 1640 + suero bovino fetal al 10% que contema ovoalbumina (100 ug/ml) o diluyente. Despues de 36 horas, se quito el medio de cultivo y se midieron las concentraciones de IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, GM-CSF, IFN gamma y TNF alfa utilizando un equipo de LINCO research, Inc. 14 Research Park Drive, St Charles, Missouri 63304 y se analizaron en el sistema Luminex multiplex (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Resultados:
Numero de celulas en los nodulos linfaticos popliteales. La sensibilizacion causo la acumulacion de celulas T y B en los nodulos linfaticos popliteales de drenaje. Esta acumulacion inducida por antigeno no se incremento significativamente en ratones que tambien recibieron un ODN CpG. Sin embargo, cada ODN CpG inyectado solo a ratones no sensibilizados sf ocasiono la acumulacion de celulas T y celulas B. Los datos se muestran en la Figura 26.
Ensayo de recuperacion de antigeno. Celulas del nodulo linfatico de drenaje tomadas de ratones sensibilizados a antigeno secretaron IL-4, IL-5, IL-10 e IFNy cuando se las reestimulo con antigeno ex vivo. En ratones sensibilizados que tambien recibieron ODN CpG, las secreciones de citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 tipo Th2 se redujeron, mientras que la secrecion de citocina IFNy tipo Th1 se incremento. Nuestros datos, que se muestran en la Figura 27, respaldan la hipotesis de que N° ident. de sec. 313, al igual que N° ident. de sec. 329, suprime una respuesta Th2 a la sensibilizacion de antigeno. Los resultados son media ± s.e.m. (n = 9-10). * P < 0.05 comparado con el grupo sensibilizado, tratado con vetticulo (prueba de comparacion multiple de Kruskal-Wallis).
Ejemplo 24: Efectos sobre la produccion de IgE inducida por antigeno en ratones in vivo
Metodos:
5
10
15
20
25
Se sensibilizaron ratones (machos, BALB/c) en los dfas 0 y 7 del estudio con antigeno (ovoalbumina, 100 pg, i.p.) con adyuvante de hidroxido de aluminio. Los ratones recibieron N° ident. de sec. 313 (0,15 o 1,5 mg/kg, i.p.) o N° ident. de sec. 17 (1,5 mg/kg, i.p.) dos dfas antes de cada sensibilizacion y el dfa de cada sensibilizacion. Se recolecto el suero en el dfa 18 del estudio. Se midieron los titulos de IgE y de IgG2a espedficas al antigeno (ovoalbumina) por ELISA. En la tabla 12 se muestra un resumen del protocolo.
Tabla 12 Resumen del protocolo del estudio
Sensibilizar Sensibilizar
* *
ODN ODN ODN ODN
Dia
-2 0 5 7 18
Punto Final
Resultados:
En los ratones tratados con N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329, la produccion de IgE espedfica al antigeno se evito totalmente. Por el contrario, se incremento la produccion de IgG2a. Dado que la produccion de IgE y de IgG2a son caracteristicas de las respuestas de tipo Th2 y de tipo Th1 respectivamente, este efecto hace mas evidente que N° ident. de sec. 313 puede suprimir las respuestas de tipo Th2 a la sensibilizacion por antigeno. Alternativamente los ODN CpG pueden inducir directamente la expresion de T-beta y el cambio de clase de IgE en celulas B. Los datos se muestran en la Figura 28. Los resultados son media ± s.e.m. (n = 10-12, excepto 5 para el grupo de N° ident. de sec.: 329). * P < 0,05 comparado con el grupo sensibilizado, tratado con vehticulo (prueba de comparacion multiple de Kruskal-Wallis).
Ejemplo 25: Efectos contra la inflamacion de las vias aereas inducida por antigeno en ratones in vivo Metodos:
Se sensibilizaron ratones (machos, BALB/c) en los dfas 0 y 7 del estudio con antigeno (ovoalbumina, 100 pg, i.p.) con adyuvante de hidroxido de aluminio. Los ratones fueron desafiados con antigeno mediante la exposicion a un aerosol de ovoalbumina inhalado, dos veces cada semana durante dos semanas consecutivas. El primer desatio fue el dfa 21 del estudio. Se administraron N° ident. de sec. 313 (0,1 - 1000 pg/kg), N° ident. de sec. 329 (1 - 1000 pg/kg) o vehticulo (solucion salina, 20 pl) en las vfas aereas mediante instilacion intranasal una vez cada semana, dos dfas antes del primer desatio con antigeno de la semana. Los puntos finales se evaluaron 48 horas despues del ultimo desatio con antigeno. Se recuperaron las celulas de las vfas aereas por lavaje broncoalveolar y se hizo un conteo diferencial de celulas. Las cifras de eosinofilos (densidad de volumen de eosinofilo) y la secrecion de mucosidad (tincion PAS) en tejido pulmonar se determinaron por evaluacion histopatologica. El protocolo se describe en la Tabla 13.
5
10
15
20
25
Tabla 13 Resumen del protocolo del estudio
Sensibilizar Desafio Desaffo
* * * * * * 33 *
ODN ODN
* *
Dia:
0 7 19 21 24 26 28 31
Puntos Finales
Resultados:
El desaffo con antigeno provoco un aumento en el numero total de leucocitos, predominantemente eosinofilos, en el lumen de las vfas aereas. Los datos se muestran en la Figura 29. Se suprimio significativamente la eosinofilia en forma relacionada con la dosis mediante N° ident. de sec. 313 o N° ident. de sec. 329. Los valores de ED50 contra la eosinofilia fueron: N° ident. de sec. 313: 23 pg/kg; N° ident. de sec. 329: 47 pg/kg. El desaffo tambien causo una acumulacion de celulas T CD4+ (celulas CD3+CD4+) que fue suprimida significativamente por N° ident. de sec. 313. El N° ident. de sec. 313 tambien suprimio significativamente la acumulacion de eosinofilos inducida por antigeno en el tejido pulmonar y la secrecion de mucosidad epitelial. Los resultados de la Figura 29 son media ± s.e.m. (n = 15). * P < 0,05 comparadas con el grupo desafiado con antigeno, tratado con velticulo (prueba de comparacion multiple de Kruskal-Wallis). Los resultados de la Figura 30 son media ± s.e.m. (n = 6). * P < 0,05; ** P < 0,001 comparadas con el grupo desafiado con antigeno, tratado con velticulo (ANOVA, prueba de comparacion multiple de Dunnett).
Ejemplo 26: Efectos contra la hiperreactividad de las vias aereas inducida por antigeno en ratones in vivo
Metodos:
Se sensibilizaron ratones (machos, BALB/c) en los dfas 0 y 7 del estudio con antigeno (ovoalbumina, 100 pg, i.p.) con adyuvante de hidroxido de aluminio. Los ratones fueron desafiados con antigeno mediante la exposition a un aerosol de ovoalbumina inhalado, dos veces cada semana durante dos semanas consecutivas. El primer desaffo fue el dfa 19 del estudio. Se administraron N° ident. de sec. 313 (10 - 1000 pg/kg), o velticulo (solution salina, 20 pl) de manera intranasal una vez cada semana, dos dfas antes del primer desaffo con antigeno de la semana. Se evaluo la hiperreactividad de las vfas aereas 24 horas despues del ultimo desaffo con antigeno midiendo la broncoconstriccion (incremento en la resistencia de las vfas aereas) generada por metacolina intravenosa. Se obtuvo una curva de respuesta a dosis de metacolina para cada animal y se cuantifico la reactividad de las vfas aereas como el area bajo la curva. El protocolo se muestra en la Tabla 14.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 14 Resumen del protocolo del estudio
Sensibilizar Desaffo Desaffo
* * * * * * 30 *
ODN ODN
* *
Dia:
0 7 17 21 24 26 29 31
Puntos Finales
Resultados:
El desaffo con anffgeno causo hiperreactividad de las vfas aereas. El N° ident. de sec. 313 suprimio el desarrollo de hiperreactividad de las vfas aereas inducida por anffgeno de manera relacionada con la dosis. Los datos se muestran en las Figuras 31 y 32 como curvas de respuesta a dosis de muestra para la metacolina para mostrar el efecto de N° ident. de sec. 313 (1000 pg/kg). Las curvas de respuesta a dosis para la metacolina se cuantifican como areas bajo la curva. Los resultados son media ± s.e.m. (n = 6-8). * P < 0,05 comparado con el grupo desafiado con anffgeno, tratado con velffculo (prueba de comparacion multiple de Kruskal-Wallis).
Se llevo a cabo un analisis de las curvas de respuesta a dosis (RL) completas entre los ratones que se desafiaron con anffgeno y se trataron con velffculo y cada raton respectivo que fue desafiado y tratado con N° ident. de sec. 313 utilizando mediciones repetidas de MANOVA. Si bien hubo una diferencia significativa (P<0,05) entre las curvas de respuesta a dosis con los grupos de tratamiento de 100 y 1000 ug/kg de N° ident. de sec. 313, no hubo una diferencia significativa entre los ratones que fueron desafiados con anffgeno, tratados con velffculo y los animales que fueron tratados similarmente con dosis de 10 ug/kg de N° ident. de sec. 313.
Ejemplo 27: Estudio de farmacocinetica (PK) in vivo en ratas
Se llevo a cabo un estudio de PK en ratas para determinar si el N° ident. de sec. 313, un ODN 'semiblando', se elimina del plasma y los tejidos, particularmente de los rinones, a una velocidad mayor que el N° ident. de sec. 329, un ODN con todos sus enlaces fosforotioato, que es identico a N° ident. de sec. 313 en cuanto a secuencia de base.
Metodos:
Se administro a 56 ratas por via intravenosa (IV) e intratraqueal (IT) 5 mg/kg (tanto para via IV como IT) de N° ident. de sec. 313 y de N° ident. de sec. 329. Se recolectaron plasma, pulmones y rinones. El estudio duro 5 dfas, con 14 puntos de tiempo por grupo de dosis. Se utilizaron 3 ratas/punto de tiempo para el grupo IV (Total = 42 ratas) y 4 ratas/punto de tiempo para el grupo IT.
Resultados:
La Figura 33 muestra concentraciones de ODN en el plasma de ratas luego de la administracion IV e IT a 5 mg/kg. La informacion del plasma muestra que el N° ident. de sec. 313 se elimina mas rapido del plasma en comparacion con el N° ident. de sec. 329 luego de la administracion tanto IV como IT.
La Figura 34 muestra concentraciones de ODN en los pulmones de ratas luego de la administracion IV e IT a 5 mg/kg. Luego de la administracion IV al mismo nivel de dosis, las concentraciones de N° ident. de sec. 313 en los pulmones fueron menores que las concentraciones de N° ident. de sec. 329. Despues de la administracion IT, la diferencia es menos pronunciada. La informacion pulmonar para el N° ident. de sec. 329 solo esta disponible durante 48 horas posteriores a la dosis.
La Figura 35 muestra concentraciones de ODN en los rinones de ratas luego de la administracion IV e IT a 5 mg/kg. La informacion renal indica que los niveles absolutos N° ident. de sec. 313 en los rinones son menores que los correspondientes a las concentraciones de N° ident. de sec. 329 despues de la administracion IV e IT. La exposicion
renal a N° ident. de sec. 313 despues de la administracion IT en particular, se reduce considerablemente en comparacion con la exposicion a N° ident. de sec. 329. Esto se puede ver con mayor claridad en las Figuras 36 y 37.
La Figura 36 muestra concentraciones de ODN en rinones de rata despues de la administracion IV a 5 mg/kg. La Figura 37 muestra las concentraciones de ODN en rinon de ratas despues de la administracion IT a 5 mg/kg.
5 Despues de la administracion IT tanto N° ident. de sec. 313 como N° ident. de sec. 329 estuvieron por debajo del lfmite inferior de cuantificacion (0,4-0,6 |ig/g) en los rinones hasta 1 hora con posterioridad a la dosis. Despues de 1 hora, N° ident. de sec. 329 se pudo detectar en todas las muestras de rinon recolectadas durante el periodo del estudio (48 horas). Por otro lado, N° ident. de sec. 313 solo esta presente en niveles detectables por el termino de 7 horas con posterioridad a la dosis.
10 Tabla 15: Resumen de parametros PK promedio para N° ident. de sec. 313 y N° ident. de sec. 329 despues de la administracion IV e IT a ratas a un nivel de dosis de 5 mg/kg.
Grupo Dosis
Tejido ODN Cm ax (ug/mJ) Tmax (h) t,q W AUQ-ikf (h ug/ml) AUQj_4ah. (h ug/ml)
IV (5 mg/kg)
Plasma 10 na na 0,20 9,5 9,3
17
na na 0,62 62,8 62,2
Pulm
10 1,4 0,25 0,17 0,47 0,35
17
14,4 0,0 S3 2,5 23,7 20,8
Rinon
10 6,6 0,083 24,9 184 123
17
11,4 0,0 S3 no nc 346
IT (5 mg/kg)
Plasma 10 1.9 0,75 1,20 2,68 2,35
17 2,1 2 2,3 9,01 7,46
Pulm
10 632 0,25 28,1 5540 5350
17
692 1 (31)** (7908)** 6505
Rinon
10 0,49 2 7,8 5,81 2,34
17
3,8 7 nc nc 134
na: No aplicable
nc: No calculable. No se pudo determinar con exactitud debido a que no se alcanzaron suficientes puntos de datos 15 en la fase terminal o en la fase de eliminacion terminal durante el periodo del estudio.
*: AUCo -48h (Area bajo la curva de cero a 48 horas) o AUCo-last (Area bajo la curva cuando la ultima conc. determinable fue antes de las 48 horas)
**: Estimacion muy aproximada (basada en 2 puntos de datos solamente en fase terminal).
10: N° ident. de sec. 313 20 17: N° ident. de sec. 329
Tablas 16(a)-(c) Exposicion sistemica y tisular a N° ident. de sec. 313 y N° ident. de sec. 329 despues de la administracion IV e IT a ratas a un nivel de dosis de 5 mg/kg.
(a) - Datos de plasma
ODN
Via de AUC 0-48hr Relacion N° ident. de
administracion (hr ug/ml) sec.: 313 : N° ident. sec.: 329 de
N°
ident. IT 2,35 0,32 (IT)
de 313:
sec. IV 9,30 0,15 (IV)
Relacion IT : IV 0,25
N°
ident. IT 7,46
de 329:
sec. IV 62,2
Relacion IT : IV 0,12
(b) - Datos de pulmon 5
ODN
Via de AUC 0-48hr Relacion N° ident. de
administracion (h ug/ml) sec.: 313 : N° ident. sec.: 329 de
N°
ident. IT 5350 0,82 (IT)
de 313:
sec. IV 0,35 0,017 (IV)
Relacion IT : IV 15286
N°
ident. IT 6505
de 329:
sec. IV 21
Relacion IT : IV 313
(c) - Datos de rinon
ODN
Via de AUC 0-48hr Relacion N° ident. de
administracion (hr ug/ml) sec.: 313 : N° ident. sec.: 329 de
N°
ident. IT 2,34 0,017 (IT)
de 313:
sec. IV 123 0,36 (IV)
Relacion IT : IV 0,019
N°
ident. IT 134
de 329:
sec. IV 346
Relacion IT : IV 0,39
5
10
15
20
25
30
35
40
45
La exposicion renal y sistemica a N° ident. de sec. 313 se vio que era marcadamente inferior a la exposicion a N° ident. de sec. 329 despues de las administraciones de 2 ODN por via intravenosa (IV) o intratraqueal (IT).
El area bajo la curva (AUC) del plasma para N° ident. de sec. 313 despues de la administracion IT a 5 mg/kg fue de 2,7 h |ig/ml. El valor correspondiente para N° ident. de sec. 329 fue de 9,0 h |ig/ml. As^ la exposicion sistemica a N° ident. de sec. 313 es un tercio de la que se determino para N° ident. de sec. 329.
El area bajo la curva (AUC) del rinon para N° ident. de sec. 313 despues de la administracion IT a 5 mg/kg fue de 2,35 h |ig/ml. El valor correspondiente para N° ident. de sec. 329 fue de 134 h |ig/ml. Asf, para el mismo nivel de dosis, la exposicion renal a N° ident. de sec. 313 es solo aproximadamente un 2% de la exposicion que se determino para N° ident. de sec. 329.
A diferencia del caso del plasma y del rinon, la exposicion pulmonar a N° ident. de sec. 313 despues de la administracion IT no se redujo tanto si se la compara con la exposicion a N° ident. de sec. 329. El AUC del pulmon para N° ident. de sec. 313 fue aproximadamente un 70-80% del AUC del pulmon para N° ident. de sec. 329 al mismo nivel de dosis. Dado que el pulmon es el tejido objetivo, es ventajoso que la eliminacion del ODN del pulmon no se incremente en la misma medida que la del plasma y rinon.
La Figura 38 muestra las concentraciones de N° ident. de sec. 313 y sus metabolitos de 8 bases en rinones de ratas luego de la administracion de IV de N° ident. de sec. 313 a 5 mg/kg.
La Figura 39 muestra las concentraciones de N° ident. de sec. 313 y sus metabolitos de 8 bases en rinones de ratas despues de la administracion IT de N° ident. de sec. 313 a 5 mg/kg. Debido a problemas metodologicos, los datos para el metabolito de 8 bases de N° ident. de sec. 313 en plasma y tejidos estan incompletos. Sin embargo, hay datos disponibles del de 8 bases para algunas de las muestras de rinon de administracion IV y todas las de administracion IT. Esta informacion muestra que en la mayona de aquellas muestras de rinon donde se determinaron exitosamente concentraciones de oligo de 8 bases, los niveles del metabolito excedieron los niveles de N° ident. de sec. 313, indicando que la actividad de endonucleasas es una ruta importante de metabolismo para N° ident. de sec. 313.
La introduccion de distintos enlaces fosfodiester (N° ident. de sec. 313) en un esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato (N° ident. de sec. 329) parece haber incrementado la velocidad de degradacion del ODN, dando como resultado una eliminacion mas rapida, particularmente de los rinones.
Ejemplo 28: Activacion del TLR9 mediante ODN semiblando comparado con ODN son todos sus enlaces fosforotioato
Metodos
Ya se han descrito celulas HEK293 transfectadas estables que expresan el TLR9 de humanos [Bauer et al., PNAS; 2001]. Brevemente, las celulas HEK293 fueron transfectadas por electroporacion con vectores que expresan el TLR9 de humanos y un plasmido reportero 6xNFKB-luciferasa. Se incubaron transfectantes estables (3 x 104 celulas/pocillo) con oDn durante 16 horas a 37 °C en una incubadora humidificada. Cada punto de datos se realizo por triplicado. Las celulas se lisaron y se ensayo la actividad del gen de la luciferasa (utilizando el equipo Brightlite de Perkin-Elmer, Ueberlingen, Alemania). Se calcularon los indices de estimulacion en referencia a la actividad del gen reportero del medio sin agregado de ODN.
Resultados
El TLR9 se activa facilmente mediante ODN que contengan secuencias CpG inmunoestimulatorias optimas. Incubamos una lmea celular estable que expresaba el TLR9 de humanos con un perfil de ODN semiblando y un perfil de ODN con todos sus enlaces fosforotioato con la misma secuencia de ODN que el ODN semiblando. Los resultados se muestran en la Figura 40.
Los resultados demuestran que cada uno de los ODN semiblandos mostrados en la tabla siguiente, N° ident. de sec. 376, 378, 380, 382, 384, 241, activaron niveles mayores de TLR9 que los ODN con la misma secuencia con el esqueleto con todos sus enlaces fosforotioato, N° ident. de sec. 377, 379, 381, 383, 385 y 242 respectivamente.
N° ident. de sec. 376
N° ident. de sec. 377
“p*0*“p*0*0*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p*“p
N° ident. de sec. 378
u*g*t*c_g*t*t*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u
N° ident. de sec. 379
u*g*t*c*g*t*t*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u
N° ident. de sec. 380
d*g*t*c_g*t*t*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*t
5
10
15
20
25
30
35
40
45
N° ident. de sec.381
Q*0*J*Q*0*J*J*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*Q*J
N° ident. de sec. 382
u*g*t*c g*t*t*u*u*u*u*u gggag g*g*g
N° ident. de sec. 383
u*g*t*c*g*t*t*u*u*u*u*u*g*g*g*a*g*g*g*g
N° ident. de sec. 384
u*g*t*c g*t*t*c*c*u*u*u gggag g*g*g
N° ident. de sec. 385
u*g*t*c*g*t*t*c*c*u*u*u*g*g*g*a*g*g*g*g
N° ident. de sec. 241
T*G G*T*C q*y*y*y*y G*X*G q*x*x*x*x*q*x*q G*y*y
N° ident. de sec. 242
“P*0*0*“P*0*0*“P*“P*“P*“P*0*“P*0*0*“P*“P*“P*“P*0*“P*0*0*“P*“P
Ejemplo 29: Enlaces internucleotidos Rp como enlaces de tipo fosfodiester en oligonucleotidos semiblandos (Comparativo)
Metodos
Condiciones y reactivos para cultivos celulares
Para ensayos de proliferacion de celulas B, se cultivaron celulas esplenicas de ratones BALB/c (de 4 a 18 semanas) a 2-5 x 10 - 106 celulas/ml en RPMI durante 44 horas, en placas de microtitulacion de 96 pocillos y luego se les aplicaron pulsos de 1 pCi de timidina 3H durante 4-6 horas, antes de ser recogidas y determinadas las cpm mediante un contador de centelleo segun se describio anteriormente (Krieg et al., 1995). Para los Western blots, se cultivaron celulas WEHI-231 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% y mantenidas en RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementadas con FCS (Life Technologies, Gaithersburg, MD) inactivado por calor, L-glutamina 1,5 mM, 2-ME 50 pM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml.
Oligonucleotidos
Los [Mix-PS]-oligos oligonucleotidos (PO-oligos) y oligos estereo aleatorios (desoxinucleosidos fosforotioatos) se compraron a Operon Technologies (Alameda, CA) o se prepararon por el metodo de fosforamidita estandar (Caruthers, 1985)(Stec et al., 1984). El oligonucleotido [Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT) ([Mix-PS]-N° ident. de sec.: 386) se utilizo como control positivo dado que previamente se habfa hallado que tema fuertes efectos inmunoestimuladores sobre celulas de raton (Yi et al., 1996). Para un PS-oligo CpG con un motivo estimulador mmimo, se eligio para el estudio la secuencia PS-d(TCAACGTT)-2066 como un motivo CpG tfpico con amplios efectos inmunoestimuladores, representativo de la amplia familia de ADN CpG. A esta secuencia se la llamo [Mix- PS]-2066 cuando se hizo con un esqueleto estereo aleatorio. Cuando esta secuencia octamerica se hizo con un esqueleto total o parcialmente definido en cuanto a su configuracion esterica, al oligo-PS se lo llamo [All-Rp-PS]- 2066 o [All-Sp-Ps]-2066 cuando la configuracion esterica de todo el esqueleto estaba definida, o [CG-Rp-PS]-2066 o [CG-Sp-PS]-2066 cuando solo la configuracion esterica del dinucleotido CpG estaba definida. Otros oligos-PS utilizados incluyen PS-d(TCAACGTTGA) CpG ([Mix-PS]-N° ident. de sec.: 387) y sus contrapartes con configuracion esterica definida All-Rp y All-Sp, asf como el control PS-d(TCAACGTTGA) no CpG [Mix-PS]-N° ident. de sec.: 388.
Los oligonucleotidos con enlaces fosforotioato de configuracion esterica definida se prepararon mediante el metodo oxatiafosfolano segun fue descrito (Stec et al., 1995)(Stec et al., 1998). Las smtesis se llevaron a cabo de forma manual. Las primeras unidades de nucleosidos del extremo 3' se sujetaron al soporte solido por un ligante sarcosinil resistente a DBU (Brown et al., 1989). Los monomeros desoxinucleosidil adecuadamente protegidos que posefan la parte 3'-O-(2-tio-"espiro"-4,4-pentametilen-1,3,2-oxatiafosfolano) se sintetizaron y separaron cromatograficamente en p-diasteromeros puros. Para la smtesis de [CG-Rp-PS]-2066 y [CG-Sp-PS]-2066, se utilizaron mezclas no resueltas de ambos p-diasteromeros (con relacion Rp:Sp ca.1:1) ( Stec et al., 1998) para el ensamblado de enlaces internucleotidos con configuracion aleatoria de atomos P. Todos los oligomeros sintetizados se purificaron mediante RP-HPLC de dos pasos: DMT-on (tiempos de retencion en el rango de 23-24 minutos) y DMT-off (tiempos de retencion de 14-16 minutos); sistema cromatografico: una columna ODS Hypersil, 5pm, 240 x 4,6 mm, ChbCN al 040% en bicarbonato de trietilamonio 0,1 M, pH 7,5, gradiente 1%/min. Su pureza se evaluo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Para estudios de incorporacion de PS-oligos, se prepararon PS-oligos estereorregulares conjugados con fluorescema mediante elongacion en fase solida de PS-oligomeros definidos en su configuracion esterica sintetizados manualmente. Despues del paso de destritilacion, se agregaron de manera rutinaria (tiempo de acoplamiento 120 s) fosforamidita de fluorescema (ChemGenes Corporation, Ashland, MA; concentracion de trabajo 125 mg/ml) y 1-H-tetrazol, seguido por la sulfuracion con reactivo S-Tetra (Stec et al., 1993). El clivaje del soporte y la desproteccion se realizaron con hidroxido de amonio concentrado durante 1 hora a temperatura ambiente y 4 horas a 55 °C, respectivamente. Los oligomeros resultantes se purificaron mediante RP-HPLC de un paso (vease
5
10
15
20
25
30
mas arriba). Debido a la notable hidrofobicidad del resto de fluorescema, el oligomero Rp y Sp eluyo en tiempos de retencion de 14,5; 14,8 y 15,0 minutes, respectivamente, es decir, al final de las secuencias fallidas. En ambos casos, eluyeron dos p-diasteromeros debido a la no estereoespecificidad del metodo de elongacion fosforamidita/sulfuracion con el monomero de fluorescema.
Analisis Western Blot
Se recogieron las celulas y se resuspendieron en medio fresco a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml. Se dejo reposar a las celulas durante cuatro horas antes de una estimulacion de 40 minutos. Se recogieron las celulas y se lavaron tres veces con PBS fna. Las celulas se lisaron en Tris 0,05 M (pH 7,4), NaCl 0,14 M, NP-40 al 1%, Na3VO4 0,001 M, NaF 0,01 M, 13-glicerofosfato 4,3 mg/ml, DTT 0,002 M, PMsF 50 pg/ml, antipama 12,5 pg/ml, aprotinina 12,5 pg/ml, leupeptina 12,5 pg/ml, pepstatina 1,25 pg/ml, bestatina 19 pg/ml, fosforamidona 10 pg/ml, inhibidor de tripsina 12,5 pg/ml, mediante congelacion y descongelacion, seguido por una incubacion en hielo de 30 minutos. Las muestras se centrifugaron a 10.000 G durante 10 minutos a 4 °C. Se conservaron los sobrenadantes como lisado completo de celulas para analisis posteriores. Se hirvieron cantidades iguales (20 pg) de lisados completos de celulas en una solucion amortiguadora de muestra con SDS durante 5 minutos antes de someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizada al 11%. Despues de la electroforesis, las protemas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa utilizando un blotter semiseco (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las manchas se bloquearon con leche desgrasada al 5% antes de la hibridacion con fosfo-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), kB-a y JNK1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Las manchas se visualizaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham International) segun el protocolo del fabricante.
Resultados
Induccion de la incorporacion de timidina 3H en celulas esplenicas mediante el estereoisomero Sp de PS-oligos CpG. Con el fin de determinar la estereoespecificidad de los efectos inmunoestimuladores de ADN CpG, se cultivaron celulas esplenicas de BALB/c con octanucleotidos definidos estericamente PS-d(TCAACGTT)-2066 en los que todos los enlaces internucleotidos teman configuracion Rp o Sp a las concentraciones indicadas en la Tabla 17. Las celulas se cultivaron durante 48 horas, tiempo suficiente para que los motivos CpG indujeran la proliferacion de las celulas B (Krieg et al., 1995). El [Mix-PS]-2066 estereo aleatorio, que posee un motivo CpG, indujo una fuerte proliferacion de celulas esplenicas dependiente de la dosis (Tabla 17). El isomero Sp tambien indujo la proliferacion y parece ser ligeramente mas potente que [Mix-PS]-2066. En contraste, el estereoisomero Rp no indujo proliferacion detectable, en coincidencia con los hallazgos de Yu et al., (Yu et al., 2000).
Tabla 17. Induccion de la proliferacion de celulas esplenicas por el estereoisomero Sp de octameros CpG.
Oligo
Concentracion cpm SI
Ninguno (medio)
2.170 1
2066 (CpG estereo aleatorio)
0,4 pM 3.154 1,5
2,4 pM 16.525 7,6
4,8 pM 30.811 14,2
Rp (2066)
0,4 pM 1.207 0,6
2,4 pM 985 0,5
4,8 pM 640 0,3
Sp (2066)
0,4 pM 9.567 4,4
2,4 pM 35.372 16,3
4,8 pM 43.591 20,1
Rp (2066) + 20661
0,4 pM 1.597 0,7
2,4 pM 10.255 4,7
4,8 pM 15.841 7,3
SI = mdice de estimulacion comparado con el control (medio)
1 cada uno de los dos PS-oligos se anadio en la concentracion indicada al comienzo del cultivo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Nuestros estudios previos habfan demostrado que los PS-oligos CpG decamericos teman efectos inmunoestimuladores mejorados en comparacion con los octameros utilizados en los primeros experimented. Por ello, se repitieron estos experimentos utilizando el PS-construido con N° ident. de sec.: 387, el que se sintetizo como [Mix-PS] estereo aleatorio N° ident. de sec.: 387, o en la forma All-Rp- o All-Sp-. Nuevamente, tanto [Mix-PS]-N° ident. de sec.: 387 como [All-Sp-PS]-N° ident. de sec.: 387 indujeron una fuerte incorporacion de timidina 3H en forma dependiente de la dosis. Sin embargo, en este caso, [All-Rp-PS]-N° ident. de sec.: 387 tambien fue capaz de inducir un incremento sustancial en la proliferacion celular a las concentraciones mas altas, indicando que conservaba al menos una actividad inmunoestimuladora parcial.
Preferencia por quiralidad Rp en el dinucleotido CpG en PS-oligos octamericos. No quedaba claro si la preferencia aparente por el estereoisomero Sp en los experimentos iniciales fue el resultado de un efecto dentro del propio dinucleotido CG, o si este efecto podna ser externo al CG. Con el fin de determinar esto, se sintetizaron dos octameros PS-2066 con esqueletos estereo aleatorios excepto en el enlace entre el CG central, que se definio como Sp o Rp. Sorprendentemente, este experimento parecio proporcionar el resultado opuesto a aquellos en los que se usaron PS-oligos en los cuales todo el esqueleto era estereorregular, dado que [CG-Rp-PS]-2066 produjo un incremento tan marcado en la incorporacion de timidina 3H en las celulas esplenicas como el PS-oligo de control estereo aleatorio. En contraste, PS-oligo [CG-Sp-PS] resulto esencialmente inactivo.
Inhibicion de la incorporacion de timidina 3H en celulas esplenicas mediante el estereoisomero R de PS-oligo CpG. El nivel de incorporacion de timidina 3H en los pocillos tratados con el estereoisomero Rp fue menor que en los pocillos de control, sugiriendo una posible actividad inhibitoria, aunque no se evidencio citotoxicidad en el examen microscopico de las celulas. De hecho, cuando las celulas se cultivaron con una mezcla equimolar de [Mix-PS]-2066 y del estereoisomero Rp, se produjo una reduccion aproximada del 50% en el nivel de incorporacion de timidina 3H en comparacion con celulas cultivadas solo con [Mix-PS]-2066 (Tanla 17).
Inmunoestimulacion preferencial por [Rp-PS]-oligos en puntos de tiempo iniciales. Los ensayos de incorporacion de timidina 3H realizados en los experimentos anteriores son vulnerables a un artefacto que resulta de la degradacion del PS-oligo, con la liberacion de timidina fna que compite con el material marcado, impidiendo de manera artificial su incorporacion (Matson et al., 1992). Estudios previos habfan demostrado que los [Rp-PS]-oligos eran mucho mas susceptibles a la degradacion por nucleasas que sus contrapartes Sp. De este modo, era posible que la carencia aparente de efecto estimulador del [Rp-PS]-oligo en nuestros ensayos de incorporacion de timidina 3H pueda haber sido un artefacto erroneo que no reflejaba los verdaderos efectos del [Rp-PS]-oligo. Con el objeto de detectar los efectos estimuladores del [Rp-PS]-oligo en un punto de tiempo inicial, antes de que el PS-oligo se pudiese degradar y a modo de ensayo biologico independiente para determinar la estimulacion inducida por CpG, probamos la capacidad de dichos PS-oligos para inducir la fosforilacion rapida de la proteinquinasa reguladora activada por mitogeno, JNK. Sorprendentemente, hallamos que despues del tratamiento con secuencias CpG PS-N° ident. de sec.: 386 y PS-N° ident. de sec.: 387, dentro de los cuarenta minutos, se indujo fuertemente la fosforilacion de JNK pero no por los isomeros [Sp-PS], sino solo por los isomeros [Mix-PS] estereo aleatorio y por [Rp-PS]. Un control [Mix-PS] no CpG con N° ident. de sec.: 388 no indujo fosforilacion detectable de JNK. Todas las muestras conteman cantidades comparables de protema JNK total.
Aunque no se pudo detectar ningun efecto del [Sp-PS]-oligo CpG en el ensayo de fosforilacion de JNK, el oligo fue biologicamente activo en este experimento ya que todos los PS-oligos CpG redujeron el nivel de la protema inhibitoria kB-a, independientemente del estereoisomero involucrado, excepto el control PS no CpG con N° ident. de sec.: 388.
Independencia esterica de la union del PS-oligo a la superficie celular e incorporacion. Una explicacion posible que podna contribuir a las diferencias observadas en la bioactividad de los estereoisomeros PS-oligo es que la union o incorporacion de los PS-oligos a la celula dependa de la configuracion esterica. Para probar esta posibilidad, se sintetizaron PS-oligos definidos estericamente como P con marcas fluorescentes y se incubaron con las celulas. De manera coincidente con estudios anteriores, los PS-oligos mostraron un patron de incorporacion celular dependiente de la concentracion y de la temperatura. Particularmente, no existio diferencia detectable en la union o incorporacion de los PS-oligos Rp o Sp.
Ejemplo 30: El oligonucleotido ODN 316 semiblando clase C y el oligonucleotido ODN 313 semiblando clase B reducen la inflamacion de las vias aereas inducida por antigeno in vivo
Este estudio evaluo el efecto in vivo del ODN 316 en un modelo murino inflamacion de las vfas aereas inducida por antigeno. El ODN 313 clase B se incluyo en el estudio a modo de comparacion.
Metodos. Se sensibilizaron ratones (machos BALB/c) en los dfas 0 y 7 del estudio con antigeno (ovoalbumina, 10 |jg, i.p.) con adyuvante de hidroxido de aluminio (Pierce Alum).
Los ratones fueron desafiados con antigeno mediante la exposicion a un aerosol de ovoalbumina inhalado, dos veces cada semana durante dos semanas consecutivas. El primer desatio se administro el dfa 21 del estudio. El aerosol se rocio durante 1 hora con una solucion al 1% de ovoalbumina en PBS usando un nebulizador DeVilbiss Ultraneb. Otros ratones actuaron como ratones controles no desafiados.
5
10
15
20
25
30
35
40
Se administro ODN 316 u ODN 313 (1 - 100 jg/kg) o vetffculo (solucion salina, 20 |jl) por v^a intranasal una vez cada semana, dos d^as antes del primer desaffo con anffgeno de la semana.
Los puntos finales se evaluaron el dfa 33 del estudio (es decir, 48 horas despues del ultimo desaffo con anffgeno). Se recogieron celulas de las v^as aereas por lavaje broncoalveolar. Se realizaron conteos diferenciales de celulas mediante un contador celular automatico Advia con muestras aleatorias, controlado mediante conteos visuales celulares en preparaciones de citocentfffugas tenidas con tinte Wright-Giemsa. Las cantidades de celulas T CD4+ (celulas CD3+ cD4+) se contaron mediante citometffa de flujo. Los resultados se expresaron en terminos de media ± SEM para cada grupo. La importancia se midio usando la prueba de comparacion multiple de Kruskall-Wallis.
Resultados. El desaffo con anffgeno produjo un incremento en el numero total de leucocitos en el lumen de las vfas aereas. Este incremento se debio principalmente a una acumulacion de eosinofilos (por ejemplo, 3 x 105 eosinofilos/ml en ratones desafiados con anffgeno tratados con vetffculo frente a < 1 x 104 eosinofilos/ml en ratones no desafiados). La eosinofilia se suprimio significativamente mediante ODN 316 u ODN 313 (por ejemplo, ca. 5 x 104 eosinofilos/ml (P < 0,05) en ratones desafiados con anffgeno tratados con 100 jg/ml de uno u otro ODN).
El desaffo con anffgeno tambien produjo una acumulacion de celulas T CD4+ que se suprimio significativamente por uno u otro ODN (por ejemplo, ca. 2 x 104 celulas T CD4+/ml en ratones desafiados con anffgeno tratados con 100 jg/ml de uno u otro oDn, frente a ca. 1,3 x 105 celulas T CD4+/ml (P < 0,05) en ratones desafiados con anffgeno, tratados con vetffculo).
Conclusiones. Cada uno de los oligonucleotidos ODN 316 semiblando clase C y ODN 313 semiblando clase B suprimieron la eosinofilia de las vfas aereas inducida por anffgeno y la acumulacion de celulas T CD4+ in vivo.
Ejemplo 31: Comparacion de ODN semiblandos clase B, C y T: induccion de secrecion de citocinas a partir de esplenocitos murinos in vitro
En este estudio se investigo la capacidad de ODN semiblandos clase B, C y T para inducir la secrecion de citocinas a partir de esplenocitos murinos in vitro.
Metodos: Se recogieron y combinaron esplenocitos de ratones BALB/c. Los esplenocitos se cultivaron en placas de cultivo con 48 pocillos a 1 x 107 celulas/ml en RPMI 1640 + suero bovino fetal al 10% con ODN individuales (0; 0,001; 0,01; 0,1; 1 o 10 jg/ml). Se evaluaron los ODN incluidos ODN 20674 semiblando clase B, ODN 316 y 317 semiblandos clase C y ODN 319 y 320 semiblandos clase T.
Despues de 48 horas de incubacion (37 °C, CO2 al 5%), se retiro el medio de cultivo y se midieron las concentraciones de IL-113, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-y y TNF-a usando el sistema multiplex para citocinas Luminex. Se midieron las concentraciones de IL-12p40, IFN-a e IP-10 mediante ELISA. Los ffmites inferiores de detectabilidad con precision fueron 3,2 - 10 pg/ml. El estado de activacion de las celulas se evaluo midiendo la expresion de CD40, Cd69 y CD86 en celulas cD3+ y B220+ por citometffa de flujo.
Resultados. Cada uno de los ODN indujo la activacion de celulas B (celulas B220+) segun se midio por la expresion aumentada de CD40, CD69 y CD86 y la activacion de celulas T (celulas CD3+) segun se midio por la expresion aumentada de CD69.
Los ODN indujeron la secrecion de IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN-a, TNF-a e IP-10. Los fftulos de las demas citocinas medidas no se incrementaron. Por ejemplo, a una concentracion de ODN de 1 jg/ml, se hallo que los niveles de secrecion de citocinas resultaron los siguientes (todos expresados en pg/ml):
Tabla 18. Secrecion de citocinas in vitro en respuesta a ODN semiblandos clase B, C y T
ODN
IL-6 IL-10 IL-12p40 IFN-a TNF-a IP-10
313
4000 410 300 12 150 400
316
3600 820 820 90 400 780
317
2200 410 790 140 340 760
319
1200 200 300 nd 50 30
320
150 nd 160 nd 15 25
nd: no detectado
Cuando se los comparo con el ODN 313 semiblando clase B, los dos ODN semiblandos clase C indujeron fftulos mayores de IL-10, IL-12p40, IFN-a, TNF-a e IP-10, pero no causaron una activacion mas marcada de celulas B. Los dos ODN semiblandos clase T parecieron ser menos efectivos como inductores de citocinas que los ODN semiblandos clase B y C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Conclusiones. Cada ODN clase B y clase C produjo un perfil de induccion de citocinas coincidente con la activacion del TLR9 y cada uno produjo la activacion de celulas B. Los ODN clase T resultaron ser inductores de citocinas menos efectivos.
Cuando se los comparo con el ODN 313 semiblando clase B, los ODN 316 y 317 semiblandos clase C indujeron concentraciones mayores de citocinas modificadoras de la respuesta inmune, pero sin inducir mayor activacion de celulas B. Estos datos sugieren un beneficio terapeutico de los ODN clase C.
Ejemplo 32: Induccion de citocinas, anticuerpos y CTL in vivo en respuesta a ODN CpG
Mediciones de citocinas: Se les administro a ratones BALB/c 400 mg de ODN (N° ident. de sec. 294 (blando), 241 (semiblando), 242 y 286) mediante inyeccion SC. Los animales se sangraron a las 3 horas posteriores a la inyeccion y se midieron los niveles en plasma de IP-10, IFN-gamma y TNF-alfa mediante ELISA. Los resultados se muestran en las Figuras 41 A - B (IP-10), C (IFN) y D - E (TNF).
Respuesta de anticuerpos: Se inmunizaron ratones BALB/c con 1 mg de HBsAg solo o en combinacion con ODN CpG por inyeccion IM. Se aplico un refuerzo a los animales pasadas 4 semanas de la inmunizacion primaria. Se midieron los tftulos de anticuerpos mediante punto final en ELISA. Se midieron los tttulos de isotipos IgG pasadas 2 semanas del refuerzo mediante punto final en ELISA. Los resultados se muestran en las Figuras 42 A y B.
Respuesta de linfocitos T citotoxicos: Se inmunizaron ratones BALB/c con 1 mg de HBsAg solo o en combinacion con ODN CpG por inyeccion IM. Se aplico un refuerzo a los animales pasadas 4 semanas de la inmunizacion primaria. Se midio la actividad de CTL pasadas 4 semanas del refuerzo mediante el ensayo de liberacion de 51Cr. Los resultados se muestran en la Figura 42 C.
Asf, los ODN blandos y semiblandos son similares o mejores en la activacion del sistema inmune murino segun lo observado tanto en estudios in vitro como in vivo y pueden aumentar las respuestas inmunes espedficas de antfgenos.
Ejemplo 33: Uso de ODN CpG in vivo cono terapia contra el cancer
Los ODN de la invencion fueron evaluados en cuanto a la eficacia como monoterapia en tres modelos de cancer. Inicialmente, los ODN se administraron a ratones con carcinoma de celulas renales (renca). Los metodos se realizaron del siguiente modo: se indujeron tumores por inyeccion SC de celulas renca en el costado izquierdo de los ratones el dfa 0. El tratamiento continuo e involucro inyecciones SC de PBS, ODN CpG 241 o 242 semanalmente durante 5 semanas, comenzando el dfa 10 posterior a la inyeccion de celulas tumorales. Los resultados se muestran en las Figuras 43 A y B.
El segundo modelo evaluado fue el cancer pulmonar murino de celulas no pequenas (carcinoma pulmonar de Lewis). Se indujeron tumores por inyeccion SC de 2 x 106 celulas de carcinoma pulmonar de Lewis en el costado izquierdo de los ratones el dfa 0. El tratamiento continuo e involucro inyecciones SC de PBS, 100 mg de ODN CpG 241 o 242 los dfas 1, 3, 7 y semanalmente durante 2 meses. Los resultados se muestran en las figuras 43 E y F.
Un tercer modelo evaluado fue el neuroblastoma murino. Se inyectaron de manera SC 1 x 106 celulas Neuro2a en el costado izquierdo el dfa 0. Se aplicaron diariamente inyecciones SC de PBS, 100 mg de ODN CpG 241 o 242 desde el dfa 10 al dfa 15. Los resultados se muestran en las Figuras 43 C y D.
Asf, los ODN semiblandos pueden controlar el crecimiento del cancer (renca murino, LLC, neuroblastoma) y mejorar la supervivencia de ratones que padecen estos canceres.
Ejemplo 34: Inflamacion perirrenal causada por la administracion de ODN blandos, semiblandos y duros en ratones BALB/c en ratones con TLR-9 inactivos
Se evaluo la inflamacion perirrenal en ratones BALB/c en ratones con TLR-9 inactivos. Los resultados se muestran en las Tablas 19 y 20 respectivamente. Los ODN semiblandos (241) indujeron menos inflamacion en el sitio de la inyeccion, no indujeron (dosis de 100 mg) inflamacion perirrenal o fue muy poca (dosis de 250 mg) y fueron mejor tolerados siguiendo administraciones multiples de ODN.
Tabla 19
GRUPO
INFLAMACION PARENQUIMA RENAL DEL INFLAMACION GRANULOMATOSA DE LA cApsula RENAL INFLAMACION GRANULOMATOSA DEL TEJIDO ADIPOSO
PBS
Normal Normal Normal
5/5 5/5 5/5
GRUPO
INFLAMACION DEL PARENQUIMA RENAL INFLAMACION GRANULOMATOSA DE LA cApsula RENAL INFLAMACION GRANULOMATOSA DEL TEJIDO ADIPOSO
242
Leve Leve a moderada Leve a moderada
100 mg
2/5 5/5 4/5
242
Leve Leve a moderada Marcada
250 mg
1/4 4/4 4/4
241
Normal Normal Normal
100 mg
5/5 5/5 5/5
241
Leve Leve Leve a moderada
250 mg
2/5 2/5 3/5
Tabla 20
Grupo
Inflamacion del parenquima renal Inflamacion granulomatosa de la capsula renal Inflamacion granulomatosa del tejido adiposo
PBS
Normal Normal Normal
5/5 5/5 5/5
242
Normal Normal Normal
100 mg
5/5 5/5 5/5
242
Normal Normal Normal
250 mg
5/5 5/5 5/5
241
Normal Normal Normal
100 mg
5/5 5/5 5/5
241
Normal Normal Normal
250 mg
5/5 5/5 5/5
Se considera que la especificacion escrita antecedente es suficiente para permitir que un experto en la tecnica 5 ponga en practica la invencion. La presente invencion no esta limitada en cuanto a su alcance a los ejemplos proporcionados, dado que los ejemplos se ofrecen a modo de unica ilustracion de un aspecto de la invencion y otras realizaciones funcionalmente equivalentes estan comprendidas dentro del alcance de la invencion. Las distintas modificaciones de la invencion, ademas de las que se muestran y describen en la presente, seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion antecedente y estan comprendidas dentro del alcance de las 10 reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y los objetos de la invencion no estan comprendidos necesariamente en cada realizacion de la invencion.
Se reivindica lo siguiente:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> COLEY PHARMACEUTICAL GROUP, INC.
COLEY PHARMACEUTICAL GmbH
<120> Acidos nucleicos inmunoestimuladores
<130> TSJ/47776EP2
<140> 03788643.9 <141> cualquiera a todos <150> US 60/404,479 <151>
<150> US 60/404,820 <151>
<150> US 60/429,701 <151>
<150> US 60/447,377 <151>
<160> 388
<170> Patent In version 3.2
<210> 1 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 1
acgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 2 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 2
gcgtcgacgt cgacgc 16
<210> 3 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 3
gcgtcgtttt cgtcgc 16
<210> 4 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 4
tccatgacgt tcctgatgc 19
<210>5 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 5
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210>6 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 6
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210>7 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 7
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210>8 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 8
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210>9 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 9
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 10 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 10
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 11 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 11
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 12 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (3)..(3)
<223> deazaguanosina
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
<223> deazaguanosina
<400> 12
tcntcntttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 13 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (3)..(3)
<223> deazaguanosina
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (22)..(22)
<223> deazaguanosina
<400> 13
tcntcgtttt gtcgttttgt cntt 24
<210> 14 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 14
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 15 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 15
tcgtcgtttt acgacgtcgc g 21
<210> 16 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 16
tcgtcgtttt acgacgtcgt g 21
<210> 17 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 17
tcgtcgtttt acggcgccgc gccg 24
<210> 18 <211> 72 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(10)
<223> n es a, c, g, o t con un enlace fosforotioato, <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (43)..(62)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (63)..(72)
<223> n es a, c, g, o t con un enlace fosforotioato, <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<221> caracteristica miscelanea <222> (4)..(10)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (43)..(62)
<223> cualquiera o todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (63)..(69)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <400> 18
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtcgttgtcg ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nn 72
<210> 19 <211> 84 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (1)..(10)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (55)..(74)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (75)..(84)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (4)..(10)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (55)..(74)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (75)..(81)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <400> 19
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtcgttgtcg ttgtcgttgt cgttnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 84
<210> 20 <211> 90 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (1)..(10)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (61)..(80)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (81)..(90)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (4)..(10)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caracteristica miscelanea <222> (61)..(80)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes
<221> caracteristica miscelanea <222> (81)..(87)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <400> 20
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtcgttgtcg ttgtcgttgt cgttgtcgtt 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 90
<210> 21 <211> 22 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 21
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 22 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 22
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 23 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 23
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 24 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 24
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 25 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 25
tcgtcgtttt gcgacgtcgc g 21
<210> 26 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 26
tcgtcgtttt tcgacgtcga g 21
<210> 27 <211> 21 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 27
tcgtcgtttt tcgacgtcgc g 21
<210> 28 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
<223> deazaguanosina
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (19)..(19)
<223> deazaguanosina
<400> 28
tcgtcntttt gtcgttttnt cgtt 24
<210> 29 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 29
tcgtcgtttc gacgtt 16
<210> 30 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 30
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt 24
<210> 31 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 31
tcgtcgtttc gtcgacgtcg tttcgtcg
<210> 32 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
28
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 32
tcgtcgtttc gtcgat 16
<210> 33 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 33
tcgtcgtttc gtcgatt 17
<210> 34 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 34 tcgtcgtttc gtcgt 15
<210> 35 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 35 tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 36 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 36
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24
<210> 37 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 37
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 38 <211> 26 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 38
tcgtcgtttg tcgtcggcgg ccgccg
<210> 39 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 39
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 40 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 40
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 41 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 41
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 42 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 42
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 43 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 43
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 44 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 44 tcgtcgtttt cgtcgt 16
<210> 45 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 45
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 46 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 46 tcgtcgtttt cgttgtt 17
<210> 47 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 47
tcgtcgtttt gtcgtcgttt t 21
<210> 48 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 48
tcgtcgtttt ttttcgtcgt ttt 23
<210> 49 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 49 tcgtcgtttt tgtcgtt 17
<210> 50 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 50 tcgtcgtttt tgttgtt 17
<210> 51 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(11)
<223> deazaguanosina
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (14)..(14)
<223> deazaguanosina
<400> 51
tcgtcgtttt ntcnttttgt cgtt 24
<210> 52 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 52
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 53 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 53
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 54 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 54
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 55 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 55
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 56 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 56 tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210> 57 <211> 96 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(10)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (67)..(86)
<223> n es a, c, g, o t,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (87)..(96)
<223> n es a, c, g, o t, con un enlace fosforotioato,
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(10)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(30)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (67)..(86)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (87)..(93)
<223> cualquiera a todos pueden estar presentes o ausentes <400> 57
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtcgttgtcg ttgtcgttgt cgttgtcgtt 60 gtcgttnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 96
<210> 58 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (19)..(19)
<223> deazaguanosina
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (22)..(22)
<223> deazaguanosina
<400> 58
tcgtcgtttt gtcgttttnt cntt 24
<210> 59 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 59
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 60 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(10)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 60
tcgtcgtttn gtcgttt 17
<210> 61 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(10)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 61
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 62 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 62
tcgtcgtttg cgtcgt 16
<210> 63 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 63
tcgtcgtttg cgtcgtt 17
<210> 64 <211> 14 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 64 tcgtcgtttg tcgt 14
<210> 65 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 65 tcgtcgtttg tcgtt 15
<210> 66 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 66
tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt 24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 67 <211> 15 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 67 tcgttttgtc gtttt 15
<210> 68 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 68 tcgttttgtc gtttttttt 19
<210> 69 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 69
tcgttttttt tcgtttt 17
<210> 70 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 70
tcgttgtttt cgtcgtt 17
<210> 71 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 71
tcgttgtttt cgttgtt 17
<210> 72 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 72
tcgttgtttt tgtcgtt 17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 73 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 73 tcgttgtttt tgttgtt 17
<210> 74 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> misc feature <222> (4)..(4)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (18)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 74
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24
<210> 75 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 75
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 76 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 76
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 77 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 77 tgtcgtttcg tcgtt 15
<210> 78 <211> 15 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 78 tgtcgttttg tcgtt 15
<210> 79 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 79
ttagttcgta gttcttcgtt 20
<210> 80 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 80
ttcgtcgttt cgtcgtt 17
<210> 81 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 81
ttcgtcgttt cgtcgttt 18
<210> 82 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 82 ttcgtcgttt tgtcgtt 17
<210> 83 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 83
ttcgttctta gttcgtagtt 20
<210> 84 <211> 14 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 84
tttcgacgtc gttt 14
<210> 85 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 85
ttttcgtcgt tttgtcgtcg t 21
<210> 86 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 86
ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt 24
<210> 87 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 87
ttttcgtcgt tttttttcgt cgt 23
<210> 88 <211> 26 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 88
ttttcgtcgt tttttttcgt cgtttt 26
<210> 89 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 90 <211> 15 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 90 ttttcgtttt gtcgt 15
<210> 91 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 91 ttttcgtttt gtcgtttt 18
<210> 92 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 92 ttttcgtttt ttttcgt 17
<210> 93 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 93
ttttcgtttt ttttcgtttt 20
<210> 94 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 94
ttttcgtttt gtcgtttt 18
<210> 95 <211> 19 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 95
ttttttttcg ttttgtcgt 19
<210> 96 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 96 ttgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 97 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 97 ttgtcgtttt cgttgtt 17
<210> 98 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 98 ttgtcgtttt tgtcgtt 17
<210> 99 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 99 ttgtcgtttt tgttgtt 17
<210> 100 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 100
tcgtcgtttt gtcgtttgtc gtt 23
<210> 101 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 101 tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210> 102 <211 > 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 102 tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 103 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 103
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 104 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 104
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 105 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 105
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 106 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 106
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 107 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 108 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 108
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 109 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 109
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 110 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 110
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 111 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 111
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 112 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 112
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 113 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 113
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 114 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 114
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 115 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 115
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 116 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 116
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 117 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 117
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 118 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 118
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 119 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 120 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 120
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 121 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 121
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 122 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 122
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 123 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 123
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 124 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 124
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 125 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 126 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 126
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 127 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 127
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 128 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 128
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 129 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 129
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 130 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 130
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 131 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 132 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 132
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 133 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 133
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 134 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 134
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 135 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 135
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 136 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 136
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 137 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 137
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 138 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 138
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 139 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 139
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 140 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 140
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 141 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 141
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 142 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 142
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 143 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 143
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 144 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 144
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 145 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 145
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 146 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 146
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 147 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 147
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 148 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 148
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 149 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 150 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 150
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 151 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 151
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 152 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 152
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 153 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 153
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 154 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 154
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 155 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 156 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 156
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 157 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 157
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 158 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 158
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 159 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 159
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 160 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 160
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 161 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 162 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 162
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 163 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 163
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 164 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 164
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 165 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 165
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 166 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 166
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 167 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 168 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 168
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 169 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 169
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 170 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 170
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 171 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 171
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 172 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 172
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 173 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 174 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 174
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 175 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 175
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 176 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 176
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 177 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 177
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 178 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 178
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 179 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 180 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 180
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 181 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 181
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 182 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 182
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 183 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 183
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 184 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 184
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 185 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 186 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 186
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 187 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 187
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 188 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 188
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 189 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 189
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 190 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 190
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 191 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 192 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 192
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 193 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 193
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 194 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 194
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 195 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 195
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 196 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 196
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 197 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 198 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 198
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 199 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 199
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 200 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 200
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 201 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 201
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 202 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 202
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 203 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 204 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 204
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 205 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 205
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 206 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 206
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 207 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 207
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 208 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 208
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 209 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 210 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 210
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 211 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 211
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 212 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 212
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 213 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 213
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 214 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 214
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 215 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 216 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 216
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 217 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 217
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 218 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 218
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 219 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 219
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 220 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 220
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 221 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 222 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 222
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 223 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 223
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 224 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 224
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 225 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 225
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 226 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 226
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 227 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 228 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 228
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 229 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 229
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 230 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 230
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 231 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 231
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 232 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 232
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 233 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 234 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 234
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 235 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 235
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 236 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 236
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 237 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 237
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 238 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 238
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 239 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 239
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 240 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 240
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 241 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 241
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 242 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 242
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt 23
<210> 243 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 243
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 244 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 244
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 245 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 245
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 246 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 246
tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210> 247 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 247
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 248 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 248
tcgccgtttt cggcggccgc cg
<210> 249 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 249
tcgccgtttt cggcggccgc cg
<210> 250 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 250
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 251 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
22
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 251
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 252 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 252
tcgccgtttt cggcggccgc cg
<210> 253 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 253
tcgccgtttt cggcggccgc cg
<210> 254 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 254
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 255 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 255
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 256 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 256
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 257 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
22
22
22
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 257
tcgtcgtttt cggcggccgc cg
<210> 258 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 258
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt
<210> 259 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 259
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt
<210> 260 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 260
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt
<210> 261 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 261
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt
<210> 262 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 262
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt
<210> 263 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
22
25
24
24
24
24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 263
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 264 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 264
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 265 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 265
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 266 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 266
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 267 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 267
tcgtcgtttc gacgtt 16
<210> 268 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 268
gttctcgctg gtgagtttca 20
<210> 269 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 269
gttctcgctg gtgagtttca 20
<210> 270 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 270
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24
<210> 271 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 271
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24
<210> 272 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(10)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 272
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 273 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(10)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 273
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 274 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(10)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 274
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 275 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 275
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 276 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 276
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 277 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(4)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (18)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 277
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24
<210> 278 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(4)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (18)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 278
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24
<210> 279 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 279
tcgtcgnnnt gtcgnnnngt cgtt 24
<210> 280 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> 2'-desoxiuracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(18)
<223> 2'-desoxiuracilo
<400> 280
tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt 24
<210> 281 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 282 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 282
aacgtcgttt tcgtcgtt 18
<210> 283 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 283
tcgtcgtttt cgtcgt 16
<210> 284 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 284
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 285 <211> 18 .<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 285
aacgtcgttt tcgtcgtt 18
<210> 286 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 286
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24
<210> 287 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 288 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 288
tcgttttttt cgtttttttc gttt 24
<210> 289 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 289
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 290 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 290
tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22
<210> 291 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 291
tcgtcgtttt cgtttttttc gttt 24
<210> 292 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 292
tcgttttgtc gtttttttcg a 21
<210> 293 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 294 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 294
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 295 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 295
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 296 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (13)..(13)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (16)..(16)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 296
tcgtcgtttt gancgntt 18
<210> 297 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 297
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt 24
<210> 298 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 299 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 299
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 300 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 300
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 301 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(7)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (14)..(14)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (17)..(17)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 301
tcgtatncgt tttncgntt 19
<210> 302 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (16)..(16)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 302
tcgatncgtt ttncgntt 18
<210> 303 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (13)..(13)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (16)..(16)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 303
tcgttncgtt ttncgntt 18
<210> 304 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 304
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23
<210> 305 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 305
tcgttttgac gttttgtcgtt 21
<210> 306 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (12)..(12)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(17)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 306
tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt 24
<210> 307 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (12)..(12)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(17)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 307
tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt 24
<210> 308 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (12)..(12)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> n es a, c, g, o t <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (20)..(20)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 308
tcgtcgttac gncgttacgn cgtt 24
<210> 309 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(9)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(17)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 309
tcgtcgnnnc gtcgnnncgt cgtt 24
<210> 310 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400>, 310
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt 24
<210> 311 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(4)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(8)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(11)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 311
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 312 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(4)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (7)..(8)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (11)..(12)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (15)..(15)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 312
tcgncgnncg nncgntcgtt 20
<210> 313 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 313
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 314 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 314
tcgacgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 315 <211> 13 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (13)..(13)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 315
tcgcgncgcg cgn 13
<210> 316 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 316
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg
<210> 317 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 317
tcgcgacgtt cgcgcgcgcg 20
<210> 318 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(5)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(9)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (14)..(14)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 318
ttgnntgnnt tttntttttt t 21
<210> 319 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 320 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 320
ttggctggct tttgacgttt tttt 24
<210> 321 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 321
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 322 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 322
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt 24
<210> 323 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 323
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23
<210> 324 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 324
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 325 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 326 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 326
tcgttttgac gttttgtcgt t 21
<210> 327 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 327
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt 24
<210> 328 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 328
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 329 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 329
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 330 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 330
tccaggactt ctctcaggtt 20
<210> 331 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (4)..(5)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(9)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (14)..(14)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 331
ttgnntgnnt tttntttttt t 21
<210> 332 <211> 13 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (6)..(6)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (13)..(13)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 332
tcgcgncgcg cgn 13
<210> 333 <211> 23 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 333
cgtcgttttg acgttttgtc gtt 23
<210> 334 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 334
gtcgttttga cgttttgtcg tt 22
<210> 335 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 335
tcgttttgac gttttgtcgt t 21
<210> 336 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 336
cgttttgacg ttttgtcgtt 20
<210> 337 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 337
gttttgacgt tttgtcgtt 19
<210> 338 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 338
ttttgacgtt ttgtcgtt 18
<210> 339 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 339
tttgacgttt tgtcgtt 17
<210> 340 <211> 16 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 340
ttgacgtttt gtcgtt 16
<210> 341 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 341
tgacgttttg tcgtt 15
<210> 342 <211> 14 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 342
gacgttttgt cgtt 14
<210> 343 <211> 13 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 343
acgttttgtc gtt 13
<210> 344 <211> 11 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 344 gttttgtcgt t 11
<210> 345 <211> 11 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 345 gttttgtcgt t 11
<210> 346 <211> 10 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 346 ttttgtcgtt 10
<210> 347 <211> 23 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 347
tcgtcgtttt gacgttttgt cgt 23
<210> 348 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 348
tcgtcgtttt gacgttttgt cg 22
<210> 349 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 349
tcgtcgtttt gacgttttgt c 21
<210> 350 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 350
tcgtcgtttt gacgttttgt 20
<210> 351 <211> 19 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 351
tcgtcgtttt gacgttttg 19
<210> 352 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 352
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 353 <211> 17 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 353
tcgtcgtttt gacgttt 17
<210> 354 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 354
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 355 <211> 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 355
tcgtcgtttt gacgt 15
<210> 356 <211> 14 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 356
tcgtcgtttt gacg 14
<210> 357 <211> 13 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 357
tcgtcgtttt gac 13
<210> 358 <211> 12 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 358 tcgtcgtttt ga 12
<210> 359 <211> 11 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 359 tcgtcgtttt g 11
<210> 360 <211> 10 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 360 tcgtcgtttt 10
<210> 361 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 361
cgtcgttttg acgttttgtc gt 22
<210> 362 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 362
gtcgttttga cgttttgtcg 20
<210> 363 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 363
tcgttttgac gttttgtc 18
<210> 364 <211> 16 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 364
cgttttgacg ttttgt 16
<210> 365 <211> 14 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 365
gttttgacgt tttg 14
<210> 366 <211> 12 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 366 ttttgacgtt tt 12
<210> 367 <211> 10 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 367 tttgacgttt 10
<210> 368 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 368
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt
<210> 369 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 369
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg
<210> 370 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 370
tcggacgttc ggcgcgcgcc g
<210> 371 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
24
23
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 371
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 372 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 372
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 373 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 373
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 374 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 374
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 375 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 375
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 376 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 376
tgtcgttttt tttttttttt 20
<210> 377 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 377 tgtcgttttt tttttttttt 20
<210> 378 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n = uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(20)
<223> n = uracilo
<400> 378
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 379 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n = uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(20)
<223> n = uracilo
<400> 379
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 380 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n es 2'-desoxiuracilo <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(20)
<223> n es 2'-desoxiuracilo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 380
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt 20
<210> 381 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> N es 2'-desoxiuracilo <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(19)
<223> n es 2'-desoxiuracilo
<400> 381
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt 20
<210> 382 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n es uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(12)
<223> n es uracilo
<400> 382
ngtcgttnnn nngggagggg 20
<210> 383 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n es uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (8)..(12)
<223> n es uracilo
<400> 383
ngtcgttnnn nngggagggg 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 384 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n es uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(12)
<223> n es uracilo
<400> 384
ngtcgttccn nngggagggg 20
<210> 385 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (1)..(1)
<223> n es uracilo
<220>
<221> caractenstica miscelanea <222> (10)..(12)
<223> n es uracilo
<400> 385
ngtcgttccn nngggagggg 20
<210> 386 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido <400> 386
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 387 <211> 10 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligodesoxinucleotido
<400> 387 tcaacgttga 10
<210> 388 <211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5 <223> Oligodesoxinucleotido
<400> 388 tcaagcttga 10
10

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    1. Un oligonucleotido que comprende
    Ni-C_G-N2-C_G-N3
    donde N1 y N3 son cada uno independientemente una secuencia de acidos nucleicos de 1-20 nucleotidos de longitud, _ indica un enlace internucleotidos fosfodiester interno, N2 es independientemente una secuencia de acidos nucleicos de 0-20 nucleotidos de longitud, y G-N2-C incluye 1 o 2 enlaces estabilizados.
  2. 2. Un oligonucleotido segun la reivindicacion 1, donde:
    (a) el acido nucleico tiene un esqueleto que comprende desoxiribosa o ribosa;
    (b) los enlaces internucleotidos estabilizados se seleccionan del grupo que consiste en: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato y cualquier combinacion de los mismos; o
    (c) los enlaces internucleotidos estabilizados son fosforotioato.
  3. 3. Un oligonucleotido segun la reivindicacion 1, donde el oligonucleotido ademas comprende un adyuvante o una citocina, o un antigeno.
  4. 4. Una composicion de un oligonucleotido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo.
  5. 5. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 4, donde el individuo tiene asma, alergia, cancer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o remodelacion de las vfas aereas.
  6. 6. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 4, donde la composicion incluye un antfgeno.
  7. 7. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 4, donde la composicion es para ser administrada con un protocolo terapeutico.
  8. 8. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 7, donde el protocolo es cirugfa, radiacion o un medicamento.
  9. 9. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 4, donde se formula el oligonucleotido.
  10. 10. Una composicion de un oligonucleotido para usar en la estimulacion de una respuesta inmune en un individuo segun la reivindicacion 9, donde el oligonucleotido se asocia con una molecula diana.
    136
    MEDIA DE SEIS DONANTES. COMPARACION COM ODN 242. DATOS OBTENIDOS DE EXPERIMENTQS INDEPENDlENTES.
    imagen1
    CONTROL.
    52 i
    324
    imagen2
    - I
    g
    P
    i-o
    P
    Ln
    - I
    imagen3
    icwp.n/rr.:
    ^Control positivo ^Oligonucleotidos de ensayo
    ODN [uM|
    Fig. 1A
    30pg/ml
ES10185869.4T 2002-08-19 2003-08-19 Ácidos nucleicos inmunoestimuladores Expired - Lifetime ES2634328T3 (es)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40447902P 2002-08-19 2002-08-19
US40482002P 2002-08-19 2002-08-19
US404820P 2002-08-19
US404479P 2002-08-19
US42970102P 2002-11-27 2002-11-27
US429701P 2002-11-27
US44737703P 2003-02-14 2003-02-14
US447377P 2003-02-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2634328T3 true ES2634328T3 (es) 2017-09-27

Family

ID=31892263

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03788643.9T Expired - Lifetime ES2600553T3 (es) 2002-08-19 2003-08-19 Ácidos nucleicos inmunoestimuladores
ES10185869.4T Expired - Lifetime ES2634328T3 (es) 2002-08-19 2003-08-19 Ácidos nucleicos inmunoestimuladores

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03788643.9T Expired - Lifetime ES2600553T3 (es) 2002-08-19 2003-08-19 Ácidos nucleicos inmunoestimuladores

Country Status (27)

Country Link
US (2) US8283328B2 (es)
EP (2) EP1538904B1 (es)
JP (2) JP5414961B2 (es)
KR (2) KR20080011247A (es)
AR (1) AR040996A1 (es)
AU (2) AU2003259916B2 (es)
BR (1) BR0313414A (es)
CA (1) CA2493753C (es)
DK (2) DK1538904T3 (es)
EC (1) ECSP055687A (es)
ES (2) ES2600553T3 (es)
HU (2) HUE030347T2 (es)
IL (1) IL166376A (es)
MA (1) MA27468A1 (es)
MX (1) MXPA05002014A (es)
NO (1) NO20051469L (es)
NZ (2) NZ560722A (es)
OA (1) OA12906A (es)
PE (2) PE20081155A1 (es)
PL (2) PL232260B1 (es)
PT (2) PT1538904T (es)
RS (1) RS20050126A (es)
SI (1) SI2290078T1 (es)
SV (1) SV2008001602A (es)
TW (1) TW200412981A (es)
UY (1) UY27945A1 (es)
WO (1) WO2004016805A2 (es)

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
JP4656675B2 (ja) * 1997-05-14 2011-03-23 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入
CA2323929C (en) * 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
WO1999058118A2 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Cpg Immunopharmaceuticals Gmbh METHODS FOR REGULATING HEMATOPOIESIS USING CpG-OLIGONUCLEOTIDES
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
WO2000048630A1 (en) 1999-02-17 2000-08-24 Csl Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AP1775A (en) * 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
EP1366077B1 (en) * 2000-09-15 2011-05-25 Coley Pharmaceutical GmbH PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
DE60134421D1 (de) * 2000-12-08 2008-07-24 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
CN100334228C (zh) * 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
IL160157A0 (en) * 2001-08-17 2004-07-25 Coley Pharm Group Inc Combination motif immune stimulation oligonucleotides with improved activity
WO2003094836A2 (en) * 2001-10-12 2003-11-20 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
EP1441763A2 (en) * 2001-11-07 2004-08-04 Inex Pharmaceuticals Corp. Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
ES2734652T3 (es) * 2002-04-04 2019-12-11 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
CA2494508A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
ATE544466T1 (de) * 2002-10-29 2012-02-15 Coley Pharm Group Inc Verwendung von cpg oligonukleotide zur behandlung von hepatitis c virus infektion
WO2004053104A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
WO2004087203A2 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
MXPA05012421A (es) * 2003-05-16 2006-02-22 Hybridon Inc Tratamiento sinergistico de cancer usando inmunomeros junto con agentes quimioterapeuticos.
CA2528774A1 (en) * 2003-06-20 2005-01-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Small molecule toll-like receptor (tlr) antagonists
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
JP4989225B2 (ja) * 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
CA2542099A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
KR101107818B1 (ko) * 2003-10-30 2012-01-31 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 향상된 면역자극 효능을 가진 ｃ-부류 올리고뉴클레오티드유사체
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
WO2005097993A2 (en) * 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
CA2560108A1 (en) * 2004-04-02 2005-11-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
EP1753453A2 (en) * 2004-06-08 2007-02-21 Coley Pharmaceutical GmbH Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
WO2006091915A2 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
KR20080008350A (ko) * 2005-04-08 2008-01-23 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 감염성 질환에 의해 악화된 천식의 치료 방법
AU2006241149A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
AU2006269555A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
KR20080048067A (ko) * 2005-09-16 2008-05-30 콜리 파마슈티칼 게엠베하 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 면역자극성 단일가닥리보핵산
KR20080047463A (ko) * 2005-09-16 2008-05-28 콜리 파마슈티칼 게엠베하 뉴클레오티드 변형에 의한 짧은 간섭 리보핵산(ｓｉｒｎａ)의 면역자극 특성의 조절
PT1957647E (pt) 2005-11-25 2015-06-01 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos imunoestimulantes
EP1986664A4 (en) * 2006-02-01 2009-07-22 Eyegene Inc COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH OLIGONUCLEOTIDES AND NON-TOXIC LPS
ES2553284T5 (es) * 2006-02-15 2021-08-31 Rechtsanwalt Thomas Beck Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos
US20080026986A1 (en) * 2006-06-05 2008-01-31 Rong-Fu Wang Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
NZ575437A (en) 2006-09-27 2012-02-24 Coley Pharm Gmbh Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity
US8377898B2 (en) * 2006-10-12 2013-02-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
EP2185160B1 (en) 2007-08-31 2019-02-13 Neurimmune Holding AG Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
KR20100068422A (ko) * 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체
US10383887B2 (en) 2008-02-20 2019-08-20 New York University Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity
AU2009311753B2 (en) * 2008-11-04 2015-01-15 Index Pharmaceuticals Ab Compounds and methods for the treatment of inflammatory diseases of the CNS
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
EP2411521B1 (en) 2009-03-25 2015-01-14 The Board of Regents of The University of Texas System Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
AU2011219025A1 (en) 2010-02-25 2012-09-27 Duke University Method of inducing the production of protective anti-HIV-1 antibodies
DK2614082T3 (en) 2010-09-09 2018-11-26 Pfizer 4-1BB BINDING MOLECULES
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
WO2012084991A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Index Pharmaceuticals Ab Biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system ii
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
SG10201700554VA (en) 2011-07-19 2017-03-30 Wave Life Sciences Pte Ltd Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
SG11201407875UA (en) 2012-06-08 2014-12-30 Aduro Biotech Compostions and methods for cancer immunotherapy
AR091569A1 (es) 2012-06-28 2015-02-11 Intervet Int Bv Receptores de tipo toll
BR112015000723A2 (pt) 2012-07-13 2017-06-27 Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd adjuvante de ácido nucléico quiral
WO2014012081A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Ontorii, Inc. Chiral control
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
DK3521312T3 (da) 2013-02-20 2021-06-28 Innate Pharma Forbindelse, der binder specifikt til kir3dl2, til anvendelse til behandling af perifert t-cellelymfom
CN105358158A (zh) 2013-04-29 2016-02-24 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于改变第二信使信号传导的组合物和方法
JP2016518140A (ja) 2013-05-03 2016-06-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｉ型インターフェロンの環状ジヌクレオチド誘導法
RS59500B1 (sr) * 2013-05-18 2019-12-31 Aduro Biotech Inc Sastavi i metode za aktiviranje signaliziranja koje je zavisno od „stimulatora gena za interferon“
US9549944B2 (en) * 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
JP6865582B2 (ja) * 2013-05-29 2021-04-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｋｉｒ３ｄｌ２は皮膚及び非皮膚末梢ｔ細胞リンパ腫のサブセットをそれぞれ予防及び治療するために有用なバイオマーカー及び治療標的である
WO2015017652A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
US10076567B2 (en) 2013-09-27 2018-09-18 Duke University MPER-liposome conjugates and uses thereof
EP3095461A4 (en) * 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
US10149905B2 (en) 2014-01-15 2018-12-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
MX2016009290A (es) 2014-01-16 2017-02-28 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral.
EP3508198A1 (en) 2014-06-04 2019-07-10 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
WO2016109310A1 (en) 2014-12-31 2016-07-07 Checkmate Pharmaceuticals, Llc Combination tumor immunotherapy
US10449212B2 (en) 2015-07-09 2019-10-22 National Institute For Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
US11013757B2 (en) * 2016-06-03 2021-05-25 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotides, compositions and methods thereof
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
JP7458977B2 (ja) * 2017-12-15 2024-04-01 エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー 免疫刺激性組成物
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
JP7511478B2 (ja) 2018-04-09 2024-07-05 チェックメイト ファーマシューティカルズ ウイルス様粒子中へのオリゴヌクレオチドのパッケージ化
AU2019252680A1 (en) * 2018-04-12 2020-10-22 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
KR102584675B1 (ko) 2018-05-23 2023-10-05 화이자 인코포레이티드 GUCY2c에 특이적인 항체 및 이의 용도
SG11202010580TA (en) 2018-05-23 2020-12-30 Pfizer Antibodies specific for cd3 and uses thereof
US20220370606A1 (en) 2018-12-21 2022-11-24 Pfizer Inc. Combination Treatments Of Cancer Comprising A TLR Agonist
WO2021124073A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Pfizer Inc. Antibodies specific for cd47, pd-l1, and uses thereof
IL294621A (en) * 2020-01-10 2022-09-01 Sbi Biotech Co Ltd 9tlr agonistic oligonucleotides, preparations containing them and their uses
WO2022034555A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
DE3280400D1 (de) 1981-10-23 1992-06-04 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
AU643141B2 (en) 1991-03-15 1993-11-04 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
ATE162198T1 (de) 1992-07-27 1998-01-15 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) * 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
EP1167377B2 (en) 1994-07-15 2012-08-08 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ES2241042T3 (es) 1996-10-11 2005-10-16 The Regents Of The University Of California Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora.
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
CA2281838A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated cpg dinucleotide in the treatment of lps-associated disorders
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
DE69838294T2 (de) * 1997-05-20 2009-08-13 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
DE69840025D1 (de) 1997-07-03 2008-10-30 Donald E Macfarlane Assoziierter antworten
DK1009413T3 (da) 1997-09-05 2007-06-11 Univ California Anvendelse af immunstimulerende oligonukleotider til forebyggelse eller behandling af astma
JPH11209289A (ja) 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
CA2323929C (en) 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
AU3751299A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
JP2002513763A (ja) 1998-05-06 2002-05-14 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション Ｃｐｇオリゴヌクレオチドを使用して寄生生物感染および関連する疾患を予防および処置するための方法
WO1999058118A2 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Cpg Immunopharmaceuticals Gmbh METHODS FOR REGULATING HEMATOPOIESIS USING CpG-OLIGONUCLEOTIDES
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US6562798B1 (en) * 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
JP2002521489A (ja) 1998-07-27 2002-07-16 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体および関連する方法
EP1102786A4 (en) 1998-08-03 2002-03-06 Univ East Carolina AGENT COMPRISING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES WITH LOW ADENOSINE CONTENT, COMPOSITION, KIT AND TREATMENTS
EP1108017A2 (en) 1998-09-03 2001-06-20 Coley Pharmaceutical GmbH G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AU4978100A (en) 1999-04-29 2000-11-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening for immunostimulatory dna functional modifyers
WO2000076982A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
AU783745B2 (en) 1999-08-13 2005-12-01 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AP1775A (en) * 1999-09-25 2007-08-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
EP1220684B2 (en) * 1999-09-27 2010-07-14 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ATE378348T1 (de) * 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
CA2396871A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
US6815429B2 (en) 2000-01-26 2004-11-09 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
AU2001249609A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-08 Department Of Veterans Affairs Methods for increasing a cytotoxic T lymphocyte response in vivo
DE10016079A1 (de) * 2000-03-31 2001-10-04 Alstom Power Nv Verfahren zum Entfernen von Kohlendioxid aus dem Abgas einer Gasturbinenanlage sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
CN1309418C (zh) 2000-06-08 2007-04-11 英特塞尔生物医药研究发展股份公司 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
EP1366077B1 (en) 2000-09-15 2011-05-25 Coley Pharmaceutical GmbH PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
ES2298269T3 (es) 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
DE60134421D1 (de) 2000-12-08 2008-07-24 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
AU2002248185A1 (en) * 2000-12-14 2002-07-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7176296B2 (en) * 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
CN100334228C (zh) 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
US20030133988A1 (en) 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
US7354909B2 (en) 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
IL160157A0 (en) 2001-08-17 2004-07-25 Coley Pharm Group Inc Combination motif immune stimulation oligonucleotides with improved activity
WO2003027313A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SUPPRESSORS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE
IL160837A0 (en) 2001-10-05 2004-08-31 Coley Pharm Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
KR20050048539A (ko) 2001-10-06 2005-05-24 메리얼엘엘씨 ＣｐＧ 제제 및 관련된 방법
WO2003094836A2 (en) 2001-10-12 2003-11-20 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003054161A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
ES2734652T3 (es) 2002-04-04 2019-12-11 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U
AU2003219383B2 (en) * 2002-04-22 2010-08-26 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotide compositions and their use for the modulation of immune responses
US20040009949A1 (en) * 2002-06-05 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory CpG nucleic acids
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
ATE544466T1 (de) 2002-10-29 2012-02-15 Coley Pharm Group Inc Verwendung von cpg oligonukleotide zur behandlung von hepatitis c virus infektion
US20040248837A1 (en) 2002-11-01 2004-12-09 Eyal Raz Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
WO2004053104A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
EP1625140A4 (en) 2002-12-23 2008-06-18 Dynavax Tech Corp BRANCHED IMMUNOMODULAR COMPOUNDS AND METHOD OF USE THEREOF
WO2004064782A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
WO2004087203A2 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
MXPA05012421A (es) * 2003-05-16 2006-02-22 Hybridon Inc Tratamiento sinergistico de cancer usando inmunomeros junto con agentes quimioterapeuticos.
CA2528774A1 (en) 2003-06-20 2005-01-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Small molecule toll-like receptor (tlr) antagonists
WO2005009355A2 (en) 2003-07-15 2005-02-03 Hybridon, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
JP4989225B2 (ja) 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
KR101107818B1 (ko) 2003-10-30 2012-01-31 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 향상된 면역자극 효능을 가진 ｃ-부류 올리고뉴클레오티드유사체
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
CA2549173A1 (en) 2003-12-08 2005-07-07 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
WO2005097993A2 (en) 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
US20050266015A1 (en) 2004-03-12 2005-12-01 Hybridon, Inc. Enhanced activity of HIV vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
CA2560108A1 (en) * 2004-04-02 2005-11-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
EP1753453A2 (en) 2004-06-08 2007-02-21 Coley Pharmaceutical GmbH Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
HUE036894T2 (hu) * 2004-06-15 2018-08-28 Idera Pharmaceuticals Inc Immunstimuláló oligonukleotid multimerek
US7427405B2 (en) * 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US7283209B2 (en) * 2004-07-09 2007-10-16 Carl Zeiss Smt Ag Illumination system for microlithography
NZ553244A (en) 2004-07-18 2009-10-30 Csl Ltd Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
JP2008506683A (ja) * 2004-07-18 2008-03-06 コーリー ファーマシューティカル グループ， リミテッド 先天免疫応答を誘導するための方法および組成物
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
WO2006091915A2 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
KR20080008350A (ko) 2005-04-08 2008-01-23 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 감염성 질환에 의해 악화된 천식의 치료 방법
AU2006241149A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
AU2006269555A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
US7490795B2 (en) * 2005-08-31 2009-02-17 Goodrich Corporation Aircraft evacuation slide with primary gas relief valve
KR20080047463A (ko) 2005-09-16 2008-05-28 콜리 파마슈티칼 게엠베하 뉴클레오티드 변형에 의한 짧은 간섭 리보핵산(ｓｉｒｎａ)의 면역자극 특성의 조절
KR20080048067A (ko) 2005-09-16 2008-05-30 콜리 파마슈티칼 게엠베하 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 면역자극성 단일가닥리보핵산
EA200800943A1 (ru) 2005-09-27 2008-12-30 Коли Фармасьютикал Гмбх Модуляция tlr-опосредуемых иммунных ответов с использованием олигонуклеотидов-адаптеров
US7776834B2 (en) * 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
PT1957647E (pt) 2005-11-25 2015-06-01 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos imunoestimulantes
ES2553284T5 (es) 2006-02-15 2021-08-31 Rechtsanwalt Thomas Beck Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
NZ575437A (en) 2006-09-27 2012-02-24 Coley Pharm Gmbh Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity
AU2007300378A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Compositions of TLR ligands and antivirals
CN101558157A (zh) 2006-10-26 2009-10-14 科勒制药有限责任公司 寡核糖核苷酸及其应用
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
KR20100010509A (ko) 2007-05-17 2010-02-01 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 면역자극 효과를 갖는 ａ 클래스 올리고뉴클레오타이드
KR20100068422A (ko) * 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체

Also Published As

Publication number Publication date
NZ560722A (en) 2009-10-30
CA2493753A1 (en) 2004-02-26
AU2009251186A1 (en) 2010-01-28
DK1538904T3 (en) 2016-11-21
PT2290078T (pt) 2017-07-31
PE20040900A1 (es) 2004-12-29
KR20050034738A (ko) 2005-04-14
MA27468A1 (fr) 2005-08-01
WO2004016805A9 (en) 2004-08-19
PL227938B1 (pl) 2018-01-31
RS20050126A (en) 2007-06-04
IL166376A (en) 2012-10-31
HUE030347T2 (en) 2017-05-29
EP2290078A3 (en) 2013-02-13
ES2600553T3 (es) 2017-02-09
JP2011004746A (ja) 2011-01-13
NZ538001A (en) 2008-05-30
WO2004016805A2 (en) 2004-02-26
IL166376A0 (en) 2006-01-16
AR040996A1 (es) 2005-04-27
AU2003259916B2 (en) 2010-01-21
AU2009251186B2 (en) 2013-05-30
KR20080011247A (ko) 2008-01-31
PT1538904T (pt) 2016-11-08
PL375398A1 (en) 2005-11-28
AU2003259916A1 (en) 2004-03-03
PE20081155A1 (es) 2008-08-15
JP2006508693A (ja) 2006-03-16
US20050059619A1 (en) 2005-03-17
ECSP055687A (es) 2005-05-30
EP1538904A4 (en) 2008-03-05
CA2493753C (en) 2014-07-08
OA12906A (en) 2006-10-13
EP1538904B1 (en) 2016-07-27
US8283328B2 (en) 2012-10-09
EP2290078A2 (en) 2011-03-02
PL414814A1 (pl) 2016-03-14
UY27945A1 (es) 2004-03-31
US20070224210A1 (en) 2007-09-27
SV2008001602A (es) 2008-02-27
BR0313414A (pt) 2007-07-31
EP1538904A2 (en) 2005-06-15
SI2290078T1 (sl) 2017-08-31
WO2004016805A3 (en) 2005-02-17
DK2290078T3 (en) 2017-07-31
HUE035336T2 (en) 2018-05-02
PL232260B1 (pl) 2019-05-31
MXPA05002014A (es) 2005-10-19
US8304396B2 (en) 2012-11-06
TW200412981A (en) 2004-08-01
NO20051469L (no) 2005-05-19
KR100969727B1 (ko) 2010-07-13
EP2290078B1 (en) 2017-04-26
JP5414961B2 (ja) 2014-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2634328T3 (es) Ácidos nucleicos inmunoestimuladores
US7956043B2 (en) 5′ CpG nucleic acids and methods of use
US9382545B2 (en) CpG oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity
US8188254B2 (en) C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20060211644A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
ES2486298T3 (es) Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados
ZA200500963B (en) Immunostimulatory nucleic acids