JP7458977B2 - 免疫刺激性組成物 - Google Patents

Description

関連出願の参照
本出願は、欧州特許出願番号ＥＰ１７２０７７４０．６、ＥＰ１７２０７７４６．３、およびＥＰ１７２０７７５０．５（それぞれ、２０１７年１２月１５日に出願された）の優先権及びその利益を主張する。それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列リスト
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１１月３０日に作成され、ＢＨＣ＿１６８０２７＿ＳＬ．ＴＸＴと名付けられ、サイズが９２，１６７バイトである。

発明の分野
トル様受容体タンパク質２１（ＴＬＲ２１）を刺激するための組成物および方法が提供される。より具体的には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび組成物、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび組成物の作製方法、ならびにＴＬＲ２１を刺激する方法が本明細書に開示される。

発明の背景
脊椎動物の免疫系は侵入する病原体を認識し、細胞のシグナル伝達経路を開始して感染に積極的に抵抗するための分子機構を進化させてきた。分子メカニズムのいくつかは、特定の微生物に特異的であり、単一種の病原体の表面抗原を認識する抗体などの生体分子を含む。残念ながら、病原体特異的防御機構は感染が成立するまで獲得された耐性を発達させない動物もいるため、完全には効果的ではなく、場合によっては、病原体は脊椎動物の獲得防御を回避するためのステルス手段を進化させている。

脊椎動物はまた、感染症をより一般的に認識し、この認識はサイトカイン発現の上昇のような非特異的免疫応答につながる。この防御は、細胞受容体が病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に結合すると誘発されうる。ＰＡＭＰと宿主のＰＡＭＰの同族受容体との間のこの相互作用は、免疫応答を開始させることができる。例えば、トル様受容体タンパク質２１（ＴＬＲ２１）は哺乳動物ＴＬＲ９のニワトリの機能的相同体であり、非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することができ、それは脊椎動物よりも微生物においてより高いＣＰＧ含量を有する。公知の方法論は非メチル化ＣｐＧモチーフを有するプラスミドまたはオリゴヌクレオチドを投与することによってこの非特異的免疫応答経路を活用し、ＣｐＧモチーフ含有核酸によるＴＬＲ２１の活性化は、微生物感染に対する免疫応答に関与する細胞シグナルを活性化することが示されている。しかし、投与された免疫刺激性プラスミドまたはオリゴヌクレオチド単独では、感染と闘うのに十分な応答を誘発することができないことがある。

大規模な動物生産者は、感染症の抗生物質治療に代わる選択肢が厳しく必要とされている。消費者は抗生物質を含まない動物製品をこれらの生産者に求めており、同時に、抗生物質耐性病原体による感染の発生率の増加は、大きな集団に予防的に抗生物質を投与する危険性を照らし出している。同様に、抗生物質耐性は、ヒトの医療における国家的な緊急事態となりつつある。多剤耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）などの薬剤耐性菌の出現について、病院や医局はゼロ地点になりつつある。

したがって、病原体に対する非特異的免疫応答を誘発するための免疫刺激性組成物および方法が必要とされている。開示される方法および組成物は、これらおよび他の重要な必要性に向けられている。

核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルを含む免疫調節組成物；ならびに免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を本明細書に開示する。

また、核酸プラスミドを含む免疫調節組成物と免疫刺激性オリゴヌクレオチドを組み合わせて免疫刺激性組成物を形成すること、前記免疫刺激性組成物を遠心分離して上清およびペレットを生成すること；および前記ペレットを単離することを含む、免疫刺激性組成物を調製するための方法が本明細書に開示される。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫モジュレーター組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含むＴＬＲ２１を刺激する方法であって、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその付近にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み、前記免疫調節組成物が、非コード核酸プラスミドおよびカチオン性脂質送達ビヒクルを含む方法がさらに提供される。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節組成物、または免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節組成物を含む免疫刺激性組成物を対象に投与することによって、対象において免疫応答を誘発するための方法も開示され、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその付近にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有し、そして免疫調節組成物は非コード核酸プラスミドおよびカチオン性脂質送達ビヒクルを含む。

前記概要ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読まれる場合、さらに理解される。開示された組成物および方法を例示する目的で、図面には組成物および方法の例示的な実施形態が示されているが、組成物および方法は開示された特定の実施形態に限定されない。図面において：
図１は、テトラエチレングリコールリンカーに結合したコレステリル部分の化学構造を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、免疫刺激性プラスミドＤＮＡ、カチオン性リポソームと複合化したプラスミドＤＮＡ、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫原性を比較する。図２Ａは免疫刺激性プラスミドＤＮＡ（「ｐＤＮＡ」）およびカチオン性リポソームと複合化したｐＤＮＡ（「ｐＤＮＡ－Ｆ」）の免疫原性を比較する。図２Ｂは、ｐＤＮＡ、ｐＤＮＡ－Ｆおよび５’－コレステリル修飾を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの免疫原性を比較する（「５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）。 図３Ａおよび３Ｂは、免疫刺激性プラスミドＤＮＡ、カチオン性リポソームと複合化した免疫刺激性プラスミドＤＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびそれらの組み合わせの免疫原性を比較する。図３ＡはｐＤＮＡ、ｐＤＮＡ－Ｆ、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ、５’Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ（［ｐＤＮＡ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）、および５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の免疫原性を比較し、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドはｎＭ濃度であり、ｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ－Ｆはμｇ／ｍｌ濃度である。図３Ｂは、ｐＤＮＡ、ｐＤＮＡ－Ｆ、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ、５’Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ（「ｐＤＮＡ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）、および５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の間の免疫原性の差を示す。ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドはｐＭ濃度であり、ｐＤＮＡおよびｐＤＮＡ－Ｆはｎｇ／ｍｌ濃度である； 図４は、ＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞において、ｐＤＮＡ－Ｆ画分がＴＬＲ２１媒介免疫応答を刺激する能力を示す。具体的には、４℃で保存したｐＤＮＡ－Ｆの免疫原性を、遠心分離した試料のペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆペレット」）および上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ上清」）で得られたｐＤＮＡ－Ｆの免疫原性と比較した。 図５Ａおよび５Ｂは、ｐＤＮＡ－Ｆ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔおよび５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力をグラフで示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ｐＤＮＡ－Ｆ－５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、遠心分離したｐＤＮＡ－Ｆ試料のペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆ ５Ｃｈｏｌペレット」）および上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ ５Ｃｈｏｌ Ｕｂｅｒｓｔａｎｄ」）で得られた５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのものと比較する。 図７Ａおよび７Ｂは、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞においてＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、遠心分離されたｐＤＮＡ－Ｆ試料のペレット（「５Ｃｈｏｌペレット」）および上清（「５Ｃｈｏｌ Ｕｂｅｒｓｔａｎｄ」）で得られた５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのものと比較する。 図８Ａおよび８Ｂは、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（「５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ ４℃」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）のものと比較する。 図９Ａおよび９Ｂは、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、遠心分離されたｐＤＮＡ－Ｆ試料のペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔペレット」）および上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ上清」）で得られた５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆのものと比較する。 図１０Ａおよび１０Ｂは、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、ｐＤＮＡ－Ｆおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのものとを比較する。 図１１Ａおよび１１Ｂは、５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、遠心分離したｐＤＮＡ－Ｆ試料のペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔペレット」）および上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ－５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）で得られた５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆのものとを比較する。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ｐＤＮＡ－Ｆ、免疫刺激性オリゴヌクレオチドＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ、およびのＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと複合化したｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答生成の能力を比較する。 図１３Ａおよび１３Ｂは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆ（「ｐＤＮＡ－Ｆ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の高濃度および低濃度のそれぞれのＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞におけるＴＬＲ２１媒介免疫応答を生成する能力を、遠心分離したｐＤＮＡ－Ｆ試料のペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔペレット」）および上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ上清」）で得られた免疫刺激性オリゴヌクレオチドＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと組み合わされたｐＤＮＡ－Ｆのものとを比較する。 図１４は、ワクチン接種後（ｐｖ）１４日目（上のパネル）および２１日目（下のパネル）におけるＯＤＮ１（ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ－５Ｃｈｏｌ）についての平均血球凝集阻害（ＨＩ）力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意～＊＊＊＊＝非常に有意）。 図１５は、研究全体の間のＯＤＮ１（ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ－５Ｃｈｏｌ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。 図１６は、ワクチン接種後１４日目（上のパネル）および２１日目（下のパネル）におけるＯＤＮ２（ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意～＊＊＊＊＝非常に有意）。 図１７は、研究全体の間のＯＤＮ２（ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。 図１８は、ワクチン接種後１４日目（上のパネル）および２１日目（下のパネル）におけるＯＤＮ３（２００６－ＰＴＯ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意～＊＊＊＊＝非常に有意）。 図１９は、研究全体の間のＯＤＮ３（２００６－ＰＴＯ）についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。 図２０は、ワクチン接種後１４日目（上部パネル）および２１日目（下部パネル）の陽性および陰性対照試験物品についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。アスタリスクは、有意水準を示す（＊＝有意～＊＊＊＊＝非常に有意）。 図２１は、研究全体の間の陽性および陰性対照試験物品についての平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。 図２２は、ＮＤＶワクチン単独と比較した、研究全体の間のＯＤＮの最適な濃度での平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。 図２３は、ＮＤＶワクチン単独と比較した、ｐｖ１４日目（上部パネル）および２１日目（下部パネル)におけるＯＤＮの最適な濃度での平均ＨＩ力価（Ｌｏｇ２）（標準偏差を伴う）の結果を示す。

例示的な実施形態の詳細な説明
開示される組成物および方法は、本開示の一部を形成する添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。開示される組成物および方法は、本明細書に記載および／または示される特定の組成物および方法に限定されず、本明細書で使用される用語は例としてのみ特定の実施形態を記載する目的のためであり、特許請求される組成物および方法を限定することを意図しないことを理解されたい。

特に断らない限り、可能なメカニズムまたは作用様式または改善の理由に関するいかなる説明も、単に例示的であることを意味し、開示された組成物および方法は、そのような示唆されたメカニズムまたは作用様式または改善の理由の正確さまたは不正確さによって制約されるべきではない。

本文中では、前記記載は組成物及び当該組成を用いた方法に言及している。本開示が組成物に関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、そのような特徴または実施形態は、前記組成物を使用する方法に等しく適用可能である。同様に、本開示が組成物を使用する方法に関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、そのような特徴または実施形態は、組成物に等しく適用可能である。

ある範囲の値が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。さらに、範囲で記載される値への言及は、当該範囲内のあらゆる値を含む。全ての範囲は包括的であり、組み合わせ可能である。先行する「約」を使用することによって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値への言及は文脈が特に明確に指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。

明確にするために、別個の実施形態の文脈で本明細書に記載されている開示された組成物および方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される開示された組成物および方法の様々な特徴は別々に、または任意のサブコンビネーションで提供されてもよい。

本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形を含む。

本明細書中で使用される「共投与（Ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」は所望の免疫刺激効果を達成するために、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わせて免疫調節組成物を投与することを指す。免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、別々の組成物として、または単一の組成物として一緒に同時投与することができる。免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドが別々の組成物である場合、それらは、いずれかの順序で同時にまたは連続的に共投与され得る。連続共投与の場合、免疫調節組成物と免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの投与の間に、１分、１時間、またはさらには１日以上の遅延があってもよい。

本明細書で使用される場合、「融合（ｆｕｓｉｎｇ）」は、２つの化学的に反応性の種の間に化学結合を生成することを指す。本開示の文脈において、融合とは、ほとんどの場合、オリゴヌクレオチドに特定のエレメントを組み込むことをいう。例えば、チミンヌクレオチドのラン（ａ ｒｕｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｎｅ ｎｕｃｌｒｅｏｔｉｄｅｓ）をオリゴヌクレオチドの３’末端に融合させることができる。

本明細書中で使用される場合、「Ｇ－カルテット配列（Ｇ－ｑｕａｒｔｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、オリゴヌクレオチドが他のＧ－カルテット配列と相互作用してＧ－カルテットを形成することを可能にする、オリゴヌクレオチドの５’末端付近の連続したグアニン残基のストレッチをいう。Ｇ－カルテットは、核酸の免疫刺激特性を増強する。例えば、Ｇ－カルテット配列を含むオリゴヌクレオチドは、相互作用して、Ｇ－カルテットを生じ得る。遺伝子のプロモーター領域に生じるＧ－カルテット配列は、遺伝子の発現の調節に関与する四次構造を形成し得る。Ｇカルテット配列は任意の特定の配列に限定されないが、Ｇ－カルテット配列の例はＴＧＧＧＧＴである。

本明細書中で使用される場合、「Ｇ－ワイヤー配列（Ｇ－ｗｉｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「Ｇ ワイヤー 配列（Ｇ ｗｉｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「Ｇワイヤー配列（Ｇｗｉｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、および関連する用語は、複数の、最も頻繁には２つの、少なくとも４つの連続するグアニンヌクレオチドをいう。前記複数のグアニンヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に位置し、２つ以上の非グアニンヌクレオチド（すなわち、チミン）によって分離される。Ｇ－ワイヤー配列は、他のＧ－ワイヤー配列と相互作用してＧ－ワイヤー構造を形成することができる。Ｇーワイヤー構造は、核酸の免疫刺激特性を増強することができる。例示的なＧーワイヤー配列は、ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧ（配列番号２５７）またはＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２５８）である。

本明細書中で使用される場合、用語「グアニンヌクレオチド富化配列（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「グアニン富化配列（ｇｕａｎｉｎｅ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」などは、連続グアニンヌクレオチドのラン（ａ ｒｕｎ ｏｆ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）（通常、４～６個の間のグアニンヌクレオチド）か、または核酸の領域であって、典型的にはオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍において、アデニン、シトシン、またはチミンヌクレオチドよりも多いグアニンヌクレオチドを有するもののいずれかを含む配列をいう。本明細書中に開示されるグアニン富化配列は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を増強し得る。Ｇ－カルテットおよびＧ－ワイヤー配列は、両方ともグアニンヌクレオチド富化配列の型である。

本明細書で使用される「免疫調節組成物（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、少なくとも免疫原性核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルを含む組成物を指す。本開示の組成物および方法のいくつかの態様において、核酸プラスミドは、特定の免疫原をコードし得ず、そして核酸プラスミドの固有の特性に基づいて免疫原性であり得る。いくつかの態様では、リポソーム送達ビヒクルはカチオン性である。

「免疫原性核酸プラスミド（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ）」は、脊椎動物の免疫系によって検出された場合、免疫応答を誘発する核酸プラスミドである。いくつかの免疫原性核酸プラスミドは、いくつかの脊椎動物生物において天然に存在する核酸プラスミド配列と比較して、増加したパーセンテージのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含む。理論に束縛されるものではないが、増加したＣｐＧジヌクレオチドモチーフは細菌由来核酸中に存在し、従って、このようなＣｐＧ富化核酸は宿主免疫防御に対して外来性であると考えられる。免疫原性核酸プラスミドは、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチドの誘導体を含み得る。

本明細書で使用される「免疫刺激性組成物（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む組成物を指す。いくつかの態様では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節性組成物は、免疫刺激性組成物である単一の処方物を含む。いくつかの態様では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫調節組成物のリポソーム送達ビヒクルと物理的に関連し得る。

本明細書中で使用される場合、「挿入する（ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ）」とは、オリゴヌクレオチドの合成の間に特定の位置に特定のヌクレオチド（単数または複数の）を付加することをいう。

本明細書中で使用される場合、「平行配向（ｐａｒａｌｌｅｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、異なるオリゴヌクレオチド間の方向性相互作用をいう。例えば、同じ５’から３’方向に配向された個々のオリゴヌクレオチドは、平行な配向である。

本明細書中で使用される場合、「同一性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」および同様の用語は、２つ以上の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドの間の配列関係を記載するために使用され、そして（ａ）参照配列、（ｂ）比較ウィンドウ、（ｃ）配列同一性、および（ｄ）配列同一性のパーセンテージを含む用語の文脈において、およびそれらと関連して理解される。

（ａ） 「参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は特定の配列のサブセットまたは全体；例えば、完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列であり得る。

（ｂ） 「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」はポリヌクレオチド配列の連続した特定のセグメントへの参照を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列は参照配列と比較され得、そして、２つの配列の最適なアラインメントのために、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（これは、付加、置換、または欠失を含まない）と比較して、付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。当業者はポリヌクレオチド配列におけるギャップの包含に起因する参照配列に対する誤った高い類似性を回避するために、ギャップペナルティーが典型的に導入され、そして一致の数から差し引かれることを理解する。

（ｃ） 比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のためのシークエンスの最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｙ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって行うことができ；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０の相同性アライメントアルゴリズムによって行うことができ；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：２４４４，１９８８の類似性検索法によって行うことができる；これらのアルゴリズムのコンピューター化された実施（以下を含むがこれらに限定されない）によって行われる：ＣＬＵＳＴＡＬ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣ／Ｇｅｎｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｂｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムはＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３： ２３７－２４４、１９８８； Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１－６，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：７－３３１，１９９４により知られている。データベース類似性検索のために使用され得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーは、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＸ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＸを含む。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，ＡｕｓｕｂｅｌらＥｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照されたい。上記のプログラムの新しいバージョンまたは新しいプログラムは疑いなく、将来入手可能になり、本開示とともに使用され得る。

（ｄ） 「同一性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される数値を意味し、ここで、２つの配列の最適な整列のため、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、基準配列（付加、置換、または欠失を含まない）と比較して、付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列において生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数で割り、そして結果に１００を掛けることによって配列同一性のパーセンテージを得る。

「治療的に有効な量」は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）を処置する免疫調節組成物および／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは免疫刺激性組成物の量を指す。

「相乗的に有効な量」とは、対象を処置する際に相乗的または相加的以上の効果を提供する免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量をいう。本明細書で使用する「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、任意の動物、特に鳥類を意味することを意図する。「鳥類（Ａｖｉａｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）」にはニワトリ、家畜シチメンチョウ、水鳥および任意の他の食物源の家禽が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および同様の用語は、感染の症状の重症度および／または頻度を減少させること、症状および／または前記症状を基礎にある原因を排除すること、症状および／またはその基礎にある原因の頻度または可能性を減少させること、および／または感染性因子によって直接的または間接的に引き起こされる損傷を改善または修復することをいう。

記述の態様に関連する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲を通して用いられる。このような用語は特に断らない限り、当該技術分野において通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。

核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルを含む免疫調節組成物と、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物が本明細書において提供される。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、ＴＬＲ２１と相互作用して、免疫応答を誘発し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、宿主生物において発現される病原体認識受容体と相互作用する少なくとも１つの非メチル化ジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含む。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、グアニンヌクレオチド富化配列を有する。これらの配列は、ＤＮＡ鎖の四次構造への折り畳みを容易にするか、またはグアニン富化の配列を有する１つ以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの凝集を促進し得る。グアニン富化配列はグアニンヌクレオチドのみから構成される必要はないが、富化されなければならない。グアニン富化配列は、上記に記載され、これらの開示を通して例示されるように、典型的には、オリゴヌクレオチド末端またはその近傍（４ヌクレオチド内）に位置する。オリゴヌクレオチド配列および構造のさらなる操作は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの能力をさらに増強し、ＴＬＲ２１を刺激し得る。したがって、本開示の１つの実施形態は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端または４つ以内のヌクレオチドで始まるグアニン富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する少なくとも１つの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を含む。

本開示のいくつかの態様において、グアニンヌクレオチドラン（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｕｎｓ）のＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端への付加は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫原性を有意に改善し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチド中のグアニン富化配列の位置がＴＬＲ２１活性化の増強に影響を及ぼすだけでなく、配列の内容も同様に影響を及ぼす。この理由のために、本開示のいくつかの態様において、グアニン富化配列は、複数の連続するグアニンヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、グアニン富化配列が第１の複数の連続したグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、２～８個のグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、２つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、３つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、４つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、５つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、６つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、７つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつか態様では、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、８つのグアニンヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドは、８を超えるグアニンヌクレオチドを含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、以下の配列番号を含む：配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、または１４３。他の実施形態では、グアニン富化配列は、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６１）、ＴＴＴＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴＴＴＴ、ＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号２６２）、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴ（配列番号２６３）、ＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧ（配列番号２６９）、ＧＧＡＧＧ、ＴＧＧＡＧＧＣ、またはＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号２６４）を含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドが配列番号１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２４、１２５、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３４、１３６、１３７、または１３８を含む。

グアニンヌクレオチドの単一のラン（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｕｎ ｏｆ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）は、ＴＬＲ２１刺激を増強し得る唯一の５’修飾ではない。例えば、アデニン、シトシン、およびチミン富化配列はまた、ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端に付加され得、そしてオリゴヌクレオチドの５’末端でのグアニン富化配列によって誘発されるものより少ないにもかかわらず、増強されたＴＬＲ２１刺激を生じる。オリゴヌクレオチドの５’末端の単一の複数のグアニン残基がＴＬＲ２１刺激を誘発し得るが、グアニン富化配列における追加の複数のグアニンヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの刺激特性をさらに増強し得る。したがって、いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間に第２の複数のグアニンヌクレオチドを含む。

いくつかの態様では、複数のグアニンヌクレオチドは、Ｇ－カルテット配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数のグアニンヌクレオチド、第２の複数のグアニンヌクレオチド、またはその両方は、Ｇ－カルテット配列を含む。Ｇ－カルテット配列はまた、上記で定義したように、オリゴヌクレオチド間の相互作用を可能にする。理論に束縛されるものではないが、オリゴヌクレオチドの５’末端での相互作用はＣｐＧジヌクレオチドモチーフの濃縮およびＴＲＬ２１による認識のための対応する増強された機会を可能にする。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物はＧ－カルテット配列を有する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、前記オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチドは、４次構造において平行配向を有する。いくつかの態様では、Ｇ－カルテット配列は、ＴＧＧＧＧＴを含む。

ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に付加され得る別のグアニン富化配列は、Ｇ－ワイヤー配列である。本開示のいくつかの態様では、第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドは、Ｇ－ワイヤー配列を含む。いくつかの態様では、Ｇ－ワイヤー配列は、配列番号２５７または２５８を含む。さらに他の態様において、Ｇ－ワイヤー配列は、配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、またはＧＣＧＴ－Ｇｗｉｒｅ３を含む。２つの複数のグアニンヌクレオチドは、非グアニンヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または任意の他のスペーサーもしくはリンカーによって分離され得る。例えば、本開示のいくつかの態様において、第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび第２の複数のグアニンヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。本明細書中で使用される場合、用語「スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）」は類似のヌクレオチドモチーフ間、すなわち２つのＣｐＧモチーフ間、または２つのグアニンヌクレオチド富化配列モチーフ間の化学結合をいい、一方、用語「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は異なるヌクレオチドモチーフ間、すなわちグアニンヌクレオチド富化配列と別のヌクレオチドモチーフ、例えばＣｐＧモチーフとの間の化学結合をいう。用語「スペーサー」および「リンカー」はオリゴヌクレオチドのどの態様が議論されているかを明確に記載するために使用される。しかしながら、スペーサーについて本明細書中に開示された構造はリンカーについて本明細書中に開示された構造と交換可能であり得、逆もまた同様であり得ることが、当業者によって理解される。

いかなる特定の理論にも束縛されることなく、Ｇ－ワイヤー配列は、オリゴヌクレオチドをＧ－ワイヤー配列を有する他のオリゴヌクレオチドと相互作用させ、そして凝集させることを可能にすることが可能である。Ｇ－ワイヤー配列を有するオリゴヌクレオチドの凝集によって想定されるコンホメーションは、Ｇ－ワイヤーコンホメーションと呼ばれ、そしてこのオリゴヌクレオチドおよびそれらのＣｐＧモチーフの蓄積はＴＬＲ２１の増強された刺激を導き得る。

グアニン富化配列は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または他のリンカーによってＣｐＧヌクレオチドモチーフから分離され得る。したがって、本開示のいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、グアニン富化配列と下流の少なくとも１つのＣｐＧモチーフとの間にリンカーをさらに含む。本明細書中で使用される場合、「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」は、５’→３’方向を意味する；すなわち、「下流」ヌクレオチドまたはモチーフは比較配列エレメントの３’であるヌクレオチドまたはモチーフである。「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、３’→５’方向を意味する；すなわち、「上流」ヌクレオチドまたはモチーフは、比較配列エレメントの５’であるヌクレオチドまたはモチーフである。リンカーはグアニン富化配列またはＣｐＧモチーフのいずれかに直接隣接する必要はなく、むしろ、リンカーはグアニン富化配列とリンカーとの間、ならびにＣｐＧモチーフとリンカーとの間の介在配列にかかわらず、２つの配列モチーフの間に存在しなければならない。本開示のいくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも３つのヌクレオチドを含む。リンカーはまた、窒素塩基を含まなくてもよい。例えば、いくつかの態様において、リンカーは、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、トリエチレングリコール、またはそれらの誘導体である。他の例において、リンカーを有するオリゴヌクレオチドは、２００６－ＰＤＥ５ｄＧ４－Ｘ１または２００６－ＰＤＥ５ｄＧ４－Ｘ３を含む。

本開示のオリゴヌクレオチド中に存在するジヌクレオチドＣｐＧモチーフは、ニワトリにおいてＴＬＲ２１によって認識されるＰＡＭＰであると考えられる。単一のＣｐＧモチーフであってもＴＬＲ２１を刺激することができるが、オリゴヌクレオチド上に存在する複数のＣｐＧは刺激されたＴＬＲ２１シグナル強度を増加させることができる。この理由のために、本発明のいくつかの態様において、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、６つ以上のＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、２つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、３つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの態様において、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、４つのＣｐＧモチーフを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣｐＧモチーフが４つのＣｐＧモチーフを含む。

本開示のオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態において、各ＣｐＧモチーフは、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログによって他のＣｐＧモチーフから分離され得る。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのヌクレオチドは、２つまたは３つのチミンヌクレオチドである。他の態様において、介在ヌクレオチドの数は介在ヌクレオチドの配列に依存して異なり得るが、前記少なくとも１つのヌクレオチドは１～４ヌクレオチドである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２１７、２１８、２１９、または２２０を含む。ＣｐＧに隣接するヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ自体と共に、ＣｐＧ配列エレメント（例えば、ＸＣＧＸ、ここで、Ｘ＝任意のヌクレオチド）を構成する。本開示のオリゴヌクレオチドは、いくつかの態様において、ＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、ＴＣＧＣ、またはそれらの任意の組み合わせであるＣｐＧ配列エレメントを含む。

本開示のいくつかの実施形態において、ＣｐＧモチーフは、４つのヌクレオチドを有するＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６つのＣｐＧ配列エレメントを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、８、１０、１５、またはさらには２０を超えるＣｐＧ配列エレメントを含む。

本開示のオリゴヌクレオチドの他の実施形態において、ＣｐＧモチーフの各々は、スペーサーまたはスペーサーと少なくとも１つのヌクレオチドとの組み合わせによって、他の全てのＣｐＧモチーフから分離される。いくつかの態様では、少なくとも１つのＣｐＧモチーフはスペーサーまたはスペーサーと少なくとも１つのヌクレオチドとの組み合わせによって、最も近い他のＣｐＧモチーフから分離され、一方、少なくとも２つの他のＣｐＧモチーフは互いに隣接する。分離されたＣｐＧモチーフは設計されたオリゴヌクレオチドの免疫刺激能力を増強し得るが、互いに隣接するＣｐＧモチーフは依然としてＴＬＲ２１を刺激し得ることが認められる。

ＣｐＧモチーフを直線的に分離するために使用されるスペーサーは、ＣｐＧモチーフ間のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を架橋する任意の連結であり得る。スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋、多重炭素鎖、または反復化学単位から構成され得るが、必ずしもこれらに限定されない。スペーサーの１つの必須の特性は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド骨格と化学結合を形成する能力である。したがって、いくつかの実施形態では、スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋である。デオキシリボースリン酸架橋はいくつかの態様において窒素塩基を含み得るが、他の態様において、デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基（ａｂａｓｉｃ）である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは配列番号２２１を含み、これは、脱塩基デオキシリボースリン酸架橋を含む。

本開示の他の実施形態では、スペーサーは炭素鎖を含む。炭素鎖は、２～１２個の炭素原子を含むことができる。末端アルコール基は、オリゴヌクレオチドの末端アルコールおよび／またはリン酸基と反応することができるので、炭素鎖を含むジオールを使用することができる。いくつかの態様では、炭素鎖は２個の炭素原子を含み、いくつかの態様において、炭素鎖はエタンジオールから誘導される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＯＤＮ－Ｘ２を含み、ここで、Ｘ２はエタンジオールである。

本開示の他の実施形態は、３個の炭素原子を含む炭素鎖を提供する。これらの実施形態のいくつかの態様において、炭素鎖は、１，３－プロパンジオールから誘導される。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２－２またはＯＤＮ－Ｘ３、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２－１、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２－３、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２－４、ＣＧ－Ｇｗ２Ｘ２－５、ＣＧ－Ｇ４Ｔ１６Ｘ２－１、ＣＧ－Ｇ４Ｔ１６Ｘ２－２、ＣＧ－Ｇ４Ｔ１６Ｘ２－３、ＣＧ－Ｇ４Ｔ１６Ｘ２－４、またはＣＧ－Ｇ４Ｔ１６Ｘ２－５、ここで、Ｘ２は３つの炭素鎖である；２００６－ＰＤＥ５ｄＧ４－Ｘ２、ここで、Ｘ２はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である；または配列番号２５０、ここで、Ｘ４はプロパンジオールから誘導される３炭素鎖である、を含む。

本開示のさらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは炭素鎖スペーサーを含み、ここで、炭素鎖は４個の炭素原子を含む。これらの実施形態のいくつかの態様において、炭素鎖は、１，４－ブタンジオールから誘導される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはＯＤＮ－Ｘ４を含み、ここで、Ｘ４は、１，４－ブタンジオールに由来する４炭素鎖である。

本開示のさらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、反復化学単位を有するスペーサーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、反復化学単位はエチレングリコールである。反復化学単位は、２～１２回繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、エチレングリコールは６回繰り返される。したがって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはＣＣＧＣ－Ｇｗ２Ｘ１を含み、Ｘ１は、ヘキサエチレングリコールに由来するスペーサーである。

オリゴヌクレオチドの３’末端上のグアニンヌクレオチドラン（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｕｎｓ）は、ＴＬＲ２１刺激はあったとしても、ほとんど生じないが、他のヌクレオチドランはオリゴヌクレオチドに増強された免疫原性を付与し得る。具体的には本開示のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはトリチミンヌクレオチド３’末端をさらに含み得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドが配列番号２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、または２１５を含む。

本明細書中に開示される各オリゴヌクレオチドについて、当業者は、ヌクレオチドがヌクレオチドアナログで置換され得ることを知る。いくつかの実施形態におけるオリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格を含むが、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの他の実施形態はホスホロチオエート骨格を含む。ホスホロチオエート骨格はいくつかの状況において、製造するのがより容易であり、より費用効果的であり得る。

本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの免疫原性の増加をもたらすことができる脂質部分を含むことができる。増加した免疫原性についての１つの可能な説明は、脂質部分がオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティーを増強するように機能し得ることである。いくつかの実施形態では、脂質部分がオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある。この脂質「キャップ（ｃａｐ）」は分解を防止し、溶解性を増加させ、医薬組成物中のオリゴヌクレオチドの安定性を改善し、またはそれらの任意の組み合わせをなし得る。いくつかの態様では、脂質部分はコレステリルである。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫刺激性組成物の効力は、組成物を投与することによって達成することができる最大応答の半分である応答を誘導するのに要する濃度の尺度である、それらの半数効果濃度（ＥＣ_５０）によって特徴付けることができる。濃度が低ければ低いほど、オリゴヌクレオチドはより強力である。本開示のいくつかの態様では、免疫刺激性組成物がｐＭ範囲のＥＣ_５０を有することができる。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約０．１～１００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約１００～２００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約２００～３００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約３００～４００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約４００～５００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は約５００～６００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０が約６００～７００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約７００～８００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約８００～９００ｐＭの間である。いくつかの態様では、ＥＣ_５０は、約９００～１ｎＭの間である。さらに他の対応では、ＥＣ_５０は約１００ｐＭ未満である。

免疫刺激性組成物中のオリゴヌクレオチドの濃度に関して、いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約０．１～１０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度が約１０～２０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約２０～３０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は約３０～４０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約４０～５０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約５０～６０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約６０～７０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約７０～８０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約８０～９０ｎＭの間である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの濃度は、約９０～１００ｎＭの間である。さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドの濃度は、約２０ｎＭ未満である。

免疫刺激性組成物は、本開示のいくつかの実施形態において、Ｇ－ワイヤー配列を有する少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。Ｇ－ワイヤー配列は、同じまたは類似のＧ－ワイヤー配列を有する他のオリゴヌクレオチドの凝集を容易にするので、免疫刺激性組成物の１つの態様は、Ｇ－ワイヤー配列を有する少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドをさらに含む。免疫刺激性組成物がＧ－ワイヤー配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含むいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドは、Ｇ－ワイヤーコンホメーションを有する。

ＴＬＲ２１を刺激するオリゴヌクレオチドの能力は、さらなるＣｐＧモチーフを挿入することによって、本発明のいくつかの態様に従ってさらに増強され得る。いくつかの態様において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフは複数のＣｐＧモチーフであり、複数のＣｐＧモチーフは、２つ、３つ、４つ、または５つのＣｐＧモチーフを含む。ＣｐＧモチーフ間の距離は、オリゴヌクレオチドのＴＬＲ２１刺激特性に影響を及ぼすことができる。この理由のために、開示されるオリゴヌクレオチドのいくつかの態様は、ＣｐＧモチーフ間への少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の挿入を提供する。前記少なくとも１つのヌクレオチドは、２つまたは３つのチミンヌクレオチドであり得る。

他の実施形態は、ＣｐＧモチーフの各々の間にスペーサーを含むことを提供する。前記スペーサーは、１つの隣接するヌクレオチド鎖の３’末端および他のヌクレオチド鎖の５’末端に結合できなければならない。いくつかの態様では、スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋であり、これは、いくつかの態様では脱塩基であり得る。

スペーサーは、いくつかの態様において、炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、炭素鎖は２個の炭素原子を含む。いくつかの態様では、炭素鎖はエタンジオールから誘導される。他の実施形態は、３個の炭素原子を含む炭素鎖を提供する。いくつかの態様では、炭素鎖が１，３－プロパンジオールから誘導される。いくつかの実施態様では炭素鎖は４個の炭素原子を含み、およびある態様では炭素鎖は１，４－ブタンジオールから誘導される。さらに他の実施形態では、スペーサーが反復化学単位を含む。いくつかの態様では反復化学単位はエチレングリコールであり、およびいくつかの態様ではスペーサーはヘキサエチレングリコールから誘導される。

本開示の代表的なオリゴヌクレオチドを表１に同定する。

本明細書に記載の免疫原性核酸プラスミドは、ＣｐＧモチーフに富む。いくつかの態様では、免疫原性核酸プラスミドは、脊椎動物核酸配列において見出されるＣｐＧモチーフの頻度と比較して、２０％を超えるＣｐＧモチーフを含む。

いくつかの態様では、本開示は、抗生物質耐性遺伝子を含まない免疫原性核酸プラスミドに関する。いくつかの態様では、プラスミドは、全長または機能的な選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコードする核酸配列を含まない。例えば、本明細書中に記載されるｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、全長または機能的な選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を全く含まない。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列は、配列番号２６５（表１Ａ）に提供される。いくつかの態様では、本明細書中に記載されるプラスミドは、免疫原をコードしない。

いくつかの態様では、免疫原性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列を含み得る。例えば、本明細書中に記載されるｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドは、スクリーニング可能なマーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を含む。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列は、配列番号２６８に提供される。さらに他の態様では、プラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含むであろう。例えば、ｐＭＢ７５．６は、抗生物質カナマイシンに対する耐性をコードする核酸配列を含む。ｐＭＢ７５．６の配列は、配列番号２６６に提供される。

ｐＭＢ７５．６、ｐＧＣＭＢ７５．６、またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドのヌクレオチド配列は、その免疫刺激特性に有意に悪影響を及ぼすことなく、ある程度まで変化し得ることが理解される。いくつかの態様では、ｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号２６５）の配列と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなる免疫原性核酸プラスミドが提供される。いくつかの態様では、免疫原性プラスミドがｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号２６５）の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、免疫原性核酸プラスミドは、ｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号２６５）の配列を含む。

いくつかの態様では、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号２６８）の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫原性核酸プラスミドが提供される。いくつかの態様では、免疫原性プラスミドは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号２６８）の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、免疫原性核酸は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６（配列番号２６８）の配列を有するプラスミドを含む。

いくつかの態様では、配列番号２６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫原性核酸プラスミドが提供される。いくつかの態様では、免疫原性プラスミドは、配列番号２６６の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、免疫原性核酸プラスミドは、配列番号２６６の配列を含む。

いくつかの態様では、ｐＭＢ７５．６_ＡｓｃＩ(配列番号２６７）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫原性核酸プラスミドが提供される。いくつかの態様では、免疫原性プラスミドは、配列番号２６７の配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、免疫原性核酸プラスミドは、配列番号２６７の配列を含む。

高ストリンジェンシー条件下で配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、または配列番号２６８にハイブリダイズする核酸配列を含む、免疫応答を刺激することができる免疫原性核酸または免疫原性プラスミドが、本明細書中にさらに提供される。適切な核酸配列には、本明細書に記載の核酸と相同、実質的に類似、または同一であるものが含まれる。いくつかの態様において、相同核酸配列は、配列番号２６５またはそれぞれの相補的配列に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のパーセント同一性を有する。他の態様において、相同核酸配列は、配列番号２６８またはそれぞれの相補的配列に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する。他の態様において、相同核酸配列は、配列番号２６６またはそれぞれの相補的配列に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する。他の態様において、相同核酸配列は、配列番号２６７またはそれぞれの相補的配列に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する。配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０に記載されているＢＬＡＳＴのような、当技術分野で公知の多数のアルゴリズムを用いて計算することができる。核酸は遺伝コードの縮重のために、上記の核酸と配列が異なっていてもよい。一般に、参照配列は１８ヌクレオチド、より通常には３０以上のヌクレオチドであり、比較目的のために組成物の核酸配列全体を含み得る。

本明細書中では、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、または配列番号２６８にハイブリダイズし得る核酸が企図されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションなどの条件が含まれる。別の例は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡの溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、続いて約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄する。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記の特定の条件と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％のストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当該分野で公知であり、本開示の核酸の相同体を同定するために使用することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ ６，ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。

免疫原性核酸プラスミドのヌクレオチド配列は、それらの免疫原性に有意に悪影響を及ぼすことなく、ある程度まで変化し得ることが理解される。このような改変体核酸プラスミド分子の核酸配列は、通常、１つ以上のヌクレオチドによって異なる。配列変化は、置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせであり得る。クローニングされた遺伝子の突然変異誘発のための技術は、当技術分野で公知である。部位特異的突然変異誘発の方法は、Ｇｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２、１９９３；Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ ３７：１１１－２３、１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７－９，１９８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９、ｐｐ．１５．３－１５．１０８に見出すことができ、およびすべて参照により本明細書に組み込まれる。要約すると、本発明は、対象における自然免疫応答を刺激することができる核酸プラスミド分子、およびその変異体または突然変異体に関する。また、本発明は、記載された核酸によってコードされる中間体ＲＮＡ、ならびに本明細書に記載された核酸プラスミドによってコードされる任意の結果として得られるアミノ酸配列を包含する。

いくつかの態様において、免疫原性核酸プラスミドのヌクレオチド配列が配列番号２６５、２６６、２６７、または２６８に提供される配列とは異なる場合、免疫原性核酸プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドは、好ましくは無傷のままである。あるいは、免疫原性プラスミドのヌクレオチド配列が、ＣｐＧジヌクレオチドが排除されるように改変される場合、免疫原性核酸プラスミドの配列は核酸プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドの総数が同じままであるように、別の位置で改変され得る。免疫原性核酸プラスミド中に既に存在するものに加えて、さらなるＣｐＧジヌクレオチドを導入することもできる。したがって、例えば、本明細書に記載される免疫原性核酸プラスミドは、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８３、少なくとも約２８５、または少なくとも約２８８個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性核酸プラスミドが２８３個のＣｐＧジヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列に既に存在するものに加えて、ＣｐＧジヌクレオチドがプラスミドに導入される。

いくつかの態様において、免疫原性核酸プラスミドのヌクレオチド配列が、本明細書中に提供される配列とは異なる場合、免疫原性核酸中のＣｐＧモチーフ型は、サイトゾル核酸サーベイランス分子（すなわち、ＴＬＲ２１および／またはＴＬＲ９）の結果として生じる活性化を調節するように変化される。例えば、免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増加させて、免疫原性核酸プラスミドに応答する少なくとも１つのサイトゾル核酸サーベイランス分子の活性化を増強することができる。あるいは、非免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増加させて、少なくとも１つのサイトゾル核酸サーベイランス分子の活性化を減少させてもよい。いくつかの態様において、刺激性および非刺激性ＣｐＧモチーフの数を改変して、少なくとも１つのサイトゾル核酸サーベイランス分子の活性化を増強し、少なくとも１つのサイトゾル核酸サーベイランス分子の活性化を低下させることができる。

適切な免疫原性核酸プラスミド分子には、本明細書に記載の免疫原性コード核酸および免疫原性非コード核酸のいずれかが含まれる。コード核酸配列はタンパク質またはペプチドの少なくとも一部をコードするが、非コード配列はタンパク質またはペプチドの任意の部分をコードしない。本発明によれば、「非コード（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ）」核酸はプロモーター領域などの転写ユニットの調節領域を含むことができる。用語「空ベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）」が「非コード」という用語と互換的に使用することができ、特に、遺伝子挿入物を含まないプラスミドベクターなどのタンパク質コード部分が存在しない場合の核酸配列を指す。本明細書中に記載される核酸プラスミドによってコードされるタンパク質の発現は免疫応答を誘導するために必要とされない；したがって、プラスミドは転写制御配列に作動可能に連結される任意のコード配列を含む必要はない。しかし、免疫原および／またはサイトカインをコードする少なくとも１つの核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を免疫調節組成物中に含めることによって、さらなる利点が得られ得る（すなわち、抗原特異的および増強された免疫）。免疫原および／またはサイトカインをコードするこのような核酸配列は本明細書中に記載される免疫原性核酸プラスミドに含まれ得るか、または組成物中の別個の核酸（例えば、別個のプラスミド）に含まれ得る。

本明細書中に記載される免疫調節組成物のいくつかの実施形態において、免疫調節組成物は、リポソーム送達ビヒクルおよび本明細書中に記載される免疫原性核酸プラスミドの少なくとも１つを含む。適切な免疫調節組成物は米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１ Ａ１号および第２０１３／０２９５１６７ Ａ１号に記載されており、両方の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

適切なリポソーム送達ビヒクルは、処置された対象の組織に核酸分子を送達することができる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態において、リポソーム送達ビヒクルは、核酸分子および／または生物学的因子を送達するために十分な量の時間、対象において安定なままであり得る。例えば、リポソーム送達ビヒクルは、少なくとも約５分間、少なくとも約１時間、または少なくとも約２４時間、レシピエント対象において安定である。

本明細書中に記載されるリポソーム送達ビヒクルは、核酸分子を細胞中に送達するために細胞の原形質膜と融合することができる脂質組成物を含む。核酸分子が１つ以上のタンパク質をコードする場合、核酸：リポソーム複合体は、いくつかの態様において、送達される核酸のマイクログラム（μｇ）あたりの総組織タンパク質のミリグラム（ｍｇ）あたりに発現されるタンパク質の少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）のトランスフェクション効率を有する。例えば、核酸：リポソーム複合体のトランスフェクション効率は、送達される核酸μｇ当たりの総組織タンパク質ｍｇ当たり発現されるタンパク質の少なくとも約１０ｐｇ；または送達される核酸μｇ当たりの総組織タンパク質ｍｇ当たり発現されるタンパク質の少なくとも約５０ｐｇであり得る。複合体のトランスフェクション効率は、送達される核酸μｇ当たりの総組織タンパク質ｍｇ当たりに発現されるタンパク質の１フェムトグラム（ｆｇ）程度に低くてもよく、上記の量がより好ましい。

いくつかの実施形態では、本発明のリポソーム送達ビヒクルが直径約１００～５００ナノメートル（ｎｍ）である。例えば、リポソーム送達ビヒクルは、直径約１５０～４５０ｎｍまたは約２００～４００ｎｍであり得る。

適切なリポソームとしては、例えば、当業者に公知の遺伝子送達方法において一般的に使用されるものなどの任意のリポソームが挙げられる。いくつかの実施形態では、リポソーム送達ビヒクルが多層小胞（ＭＬＶ）脂質、押出脂質、またはその両方を含む。いくつかの態様では、リポソーム送達ビヒクルはカチオン性である。ＭＬＶの調製方法は、当技術分野で周知である。いくつかの態様において、リポソーム送達ビヒクルはポリカチオン性脂質組成物を有するリポソーム（すなわち、カチオン性リポソーム）および／またはポリエチレングリコールに結合されたコレステロール骨格を有するリポソームを含む。例示的なカチオン性リポソーム組成物として、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）－イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロール、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群より選択される脂質の対を含む。いくつかの態様において、送達ビヒクルとして使用するためのリポソーム組成物は、ＤＯＴＩＭおよびコレステロールを含む。

リポソームと本明細書に記載の免疫原性核酸プラスミドとの複合体化は、当該分野で標準的な方法を使用して、または米国特許第６，６９３，０８６号（その内容はその全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、達成され得る。リポソームに添加するための核酸プラスミドの適切な濃度は全身性免疫応答が誘発されるように、十分な量の免疫原性核酸プラスミドを対象に送達するために有効な濃度を含む。例えば、約０．１μｇ～約１０μｇの免疫原性核酸プラスミドを約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができ、約０．５μｇ～約５μｇの免疫原性核酸プラスミドを約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができ、または約１．０μｇの免疫原性核酸プラスミドを約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができる。組成物中の免疫原性核酸プラスミド対脂質の比（μｇ免疫原性核酸プラスミド：ｎｍｏｌ脂質）は少なくとも約１：１の免疫原性核酸プラスミド：脂質（重量で）（例えば、１μｇ免疫原性核酸プラスミド：１ｎｍｏｌ脂質）であり得る。例えば、免疫原性核酸プラスミド対脂質の比は、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、または少なくとも約１：２０であり得る。本明細書で表される比率は組成物中の脂質の量に基づくものであり、組成物中の脂質の総量に基づくものではない。本発明の組成物中の免疫原性核酸プラスミド対脂質の比は、適切には重量で約１：１～約１：８０の免疫原性核酸プラスミド：脂質（重量で）：約１：２～約１：４０の免疫原性核酸プラスミド：脂質（重量で）；約１：３～約１：３０の免疫原性核酸：脂質（重量で）；または約１：６～約１：１５の免疫原性核酸プラスミド：脂質（重量で）である。

免疫調節組成物の濃度は、閾値を超えて上昇した場合、細胞毒性であり得る。この理由のために、本開示において意図されるような免疫調節組成物の濃度は非細胞毒性であり、すなわち、この閾値未満のレベルである。「細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」は本明細書中で使用される場合、異常な細胞状態（例えば、増殖不全、増殖遅延、不規則な顕微鏡的外観、および／または免疫応答性の低下）をいう。いくつかの態様では、免疫調節組成物の濃度は約０．１～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様では、前記濃度は約０．１～約２００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様では、免疫調節組成物の濃度は約０．１～約１５０ｎｇ／ｍｌである。他の態様では、免疫調節組成物の濃度が約０．１～約１００ｎｇ／ｍｌである。さらに他の態様では、免疫調節複合体の濃度は約０．１～約５０ｎｇ／ｍｌである。他の態様では、免疫調節組成物は濃度は約１～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様において、免疫調節組成物の濃度は、約１０～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様において、免疫調節組成物の濃度は、約５０ｎｇ～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様において、免疫調節組成物の濃度は、約１００～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様において、免疫調節組成物の濃度は、約１５０～約２５０ｎｇ／ｍｌである。さらに他の態様において、免疫調節組成物の濃度は、約２００～約２５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、免疫調節組成物の濃度が約１２０ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの態様において、免疫調節組成物の濃度は、非細胞毒性である。

本明細書では、上記の免疫刺激性組成物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。免疫調節組成物は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの前、それと同時に、またはその後に投与することができる。個々の免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのための医薬担体は同じ担体であってもよいが、同じ担体である必要はない。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧、エアゾール、卵内、粘膜、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、鼻腔内、肺、直腸、または当業者に公知の他の手段から選択される経路による投与に組成物を適合させる。薬学的に受容可能な担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルであり得、これらを用いて、免疫刺激性組成物、または免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドが投与される。このようなビヒクルは水および油（石油、動物、植物、または合成起源のもの（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような液体であり得る。例えば、０．４％の生理食塩水および０．３％のグリシンを使用することができる。これらの溶液は、無菌で一般に粒状物質を含まない。それらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有する可能性がある。このような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く、すなわち、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで変動し得、選択される特定の投与様式に従って、主に必要な用量、流体容量、粘度などに基づいて選択される。他のヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む適切なビヒクルおよび処方物は例えば、以下に記載される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２（とりわけｐｐ．９５８－９８９を参照）。

免疫調節組成物と免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを組み合わせて、免疫刺激性組成物を形成すること；免疫刺激性組成物を遠心分離して上清およびペレットを生成すること；およびペレットを単離することを含む、上記の免疫刺激性組成物を調製するための方法も本明細書に提供される。

免疫刺激性組成物を遠心分離すると、免疫刺激性組成物の沈降を引き起こす。ペレットの単離は、ペレットの一部が残っている限り、上清を注ぎ出すこと、上清をピペットで取り除くこと、または他の手段によって上清を除去することによって達成することができる。上清の除去中にいくらかのペレットが失われることが予想される。また、いくらかの免疫刺激性組成物は、遠心分離後でさえも上清中に残存し得る。このようなシナリオにおいて、上清は免疫刺激特性を保持し得る。免疫刺激性組成物の存在による免疫刺激活性が上清中に残るが、ペレット中にほとんど全ての免疫刺激性組成物を有することが所望される場合、より高い遠心分離速度が使用されるべきである。例えば、上清が８，０００ｒｐｍでの遠心分離後に免疫刺激性組成物を含有する場合、１４，０００ｒｐｍまで遠心分離を増加させると、残りの免疫刺激性組成物が低下し得る。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節組成物を投与することを含む、トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激するための方法もまた本明細書に提供され、ここで、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその付近にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み、免疫調節組成物は、非コード核酸プラスミドおよびカチオン性脂質送達ビヒクルを含む。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節組成物は、静脈内、筋肉内、乳房内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧、エアゾール、卵内、粘膜、経皮、浸漬、経口、眼内、気管内、鼻腔内、肺、直腸、または当業者に公知の他の手段から選択される経路によって投与され得る。いくつかの態様において、免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、相乗的に有効な量で存在する。免疫刺激性組成物および免疫調節組成物の投与は、連続的であっても同時であってもよい。

免疫調節組成物の濃度は２５０μｇ／ｍｌを超える場合に細胞毒性であり得、この細胞毒性は免疫調節剤の任意の免疫刺激効果を相殺することを超え得るものです。本開示のいくつかの態様において、免疫調節剤の濃度は、約２００μｇ／ｍｌである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与では、細胞毒性レベルが１０μＭ範囲以下では観察されない。免疫刺激性オリゴヌクレオチドのさらに高い濃度は、レシピエントによって許容され得る。本開示のいくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は、約１０μＭと０．５μＭとの間である。いくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は約２μＭであり、そしてある態様において、免疫調節組成物の濃度は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度よりも高い。細胞毒性は免疫調節組成物の投与に伴う制限因子であるため、いくつかの態様において、免疫調節組成物は非細胞毒性量で存在する。

本明細書に提示される方法の各態様において、免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、上記のような任意の実施形態または態様であり得る。

また、本明細書に記載の免疫刺激性組成物の任意の実施形態を投与することを含む、対象において免疫応答を誘発するための方法も提供される。本開示に含まれる他の実施形態は、本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘発するための方法を含む。

以下の実施例は、本明細書中に開示される実施形態のいくつかをさらに記載するために提供される。実施例は開示された実施形態を説明することを意図したものであり、限定することを意図したものではない。

以下の実施例で使用した免疫調節組成物は、カチオン性脂質（ＤＯＴＩＭおよびコレステロール）および非コードＤＮＡ(ｐＭＢ７５．６）（配列番号２６６）を含む組成物であった。カチオン性脂質成分は［１－［２－［９－（Ｚ）－オクタデセノ－イルオキシ］］－２－［８］（Ｚ）－ヘプタデセニル］－３－［ヒドロキシエチル］イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）および合成中性脂質コレステロールであり、直径約２００ｎｍのリポソームを生成するように処方された（米国特許第６，６９３，０８６号を参照のこと）。非コードＤＮＡ成分は大腸菌で産生された４２９２塩基対の非コードＤＮＡプラスミド（ｐＭＢ７５．６）（配列番号２６６）であり、これは、負に荷電しており、正に荷電した（カチオン性）リポソームと会合する（米国特許第６，６９３，０８６号を参照のこと）。実施例において、「免疫刺激性核酸プラスミド（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ）」という用語は、ｐＭＢ７５．６を指す。

実施例１：ＴＬＲ２１活性オリゴデオキシヌクレオチドと免疫調節組成物との組み合わせ
ＴＬＲ２１に対する免疫調節組成物の活性を調べた。具体的には、ＨＥＫ２９３－ＮＦκＢ－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞を、４５μｌの増殖培地中、１０，０００細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに播種した。これらの細胞を、増殖培地に溶解したオリゴヌクレオチドに暴露し、３７℃で３～４日間インキュベートした。ウェル当たりの培養上清１０μｌを３８４ウェルプレートに移し、９０μｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭパラ－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰ）（ｐＨ ９．６）を添加し、４０５ｎＭでの光学濃度の時間的変化の動力学的計測によって反応速度を決定した（ｍＯＤ４０５ｎｍ／分）。

免疫刺激性核酸プラスミド単独は、考察される濃度範囲（２μｇ／ｍｌ以下）において不活性であることが証明され、一方、リポソーム処方された免疫刺激性核酸プラスミド（ｐＤＮＡ－Ｆ）はベル型曲線を有する弱いが明確なシグナルを示し、ＴＬＲ２１とのその相互作用を示した（図２Ａ）。しかし、ＴＬＲ２１刺激活性は、この受容体と相互作用するように最適化されたオリゴヌクレオチドリガンドである５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（配列番号１）（図２Ａおよび２Ｂ）と比較して、数桁低かった。

ＴＬＲ２１に対する免疫調節組成物ｐＤＮＡ－Ｆの活性は、このレセプターが実際に免疫調節組成物のインビボ作用の成分であり得ることを示唆するが、免疫調節組成物はＴＬＲ２１に対するかなり弱いリガンドであるため、このレセプターは唯一のそして優性の同族レセプターではないかもしれない。
実施例２：５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫刺激性核酸プラスミドおよび免疫調節組成物との組合せ
免疫刺激性核酸プラスミド単独の２００μｇ／ｍｌ溶液および免疫調節剤組成物ならびに５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの２μＭ溶液を調製し、４℃で２時間インキュベートした。続いて、この溶液から、連続１：２希釈液を調製し、実施例１のプロトコールに従って、２０ｎＭプラスミド濃度（および２μｇ／ｍｌプラスミド濃度）で開始するＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞に投与し、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのみを含有する試料と比較した。全ての試料は強いＴＬＲ２１刺激活性を示し、唯一の試料はわずかに高いピーク値および２．４４ｐＭのＥＣ_５０を示した（図３Ａ、表３）。わずかに低いＶ_ｍａｘを示すことを除いて、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫刺激性核酸プラスミド（それ自身は完全に不活性であった）との組合せは、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独（２．１１ｐＭ）と比較して、ＥＣ_５０においてほとんど変化をもたらさなかった（図３Ａ、表３）。対照的に、リポソーム含有試料（免疫刺激性オリゴヌクレオチド５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔおよび免疫調節組成物）は、より高い濃度で活性最大および強いシグナルの減少を示した（図３Ａ）。しかしながら、低濃度（ｐＭ）のより綿密な検査は、計算された１．０４ｐＭのＥＣ_５０を有する規定された活性プラトーを明らかにした（図３Ｂ、表３）。この濃度領域において、免疫調節組成物はまた、完全に不活性であり（図３Ｂ）、それ自身、より低いＥＣ_５０に関与しない。

結果は、ＴＬＲ２１刺激性ＯＤＮ ５‐Ｃｈｏｌ‐ＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔと非細胞毒性濃度の免疫刺激性核酸プラスミドまたは免疫調節組成物のいずれかの組み合わせが活性混合物をもたらすことを示唆する。さらに、ＴＬＲ２１刺激性ＯＤＮ ５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫調節組成物との組み合わせは、ＴＬＲ２１活性化のＥＣ_５０に関して相乗的である。

実施例３：免疫調節組成物の遠心分離およびＴＬＲ２１活性
２００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度の免疫調節組成物溶液を、４℃、１４，０００ｒｐｍ、エッペンドルフ卓上遠心分離機において４℃で２時間遠心分離した。比較のために、非遠心分離アリコートを４℃で２時間保存した。上清を除去しおよび保存し、ペレットは等量に再懸濁した。免疫調節組成物がいくらかの弱いＴＬＲ２１刺激活性を有することが先に確立されたので（実施例１を参照のこと）、実施例１に記載されるように、２ｍｇ／ｍｌのプラスミド含量で開始するタイトレーションを、ＴＬＲ２１アッセイにおける使用のために調製した。

免疫調節組成物の遠心分離は、ピペットで再懸濁するのが困難なペレットを生じた。免疫調節組成物の全てのＴＬＲ２１刺激活性は、遠心分離後にペレット中に見出され、上清はＴＬＲ２１活性を欠いていた（図４）。再懸濁されたリポソームは、４℃で保存されたリポソームと比較して、ＴＬＲ２１刺激についてより高いＥＣ_５０を示した。この効果は遠心分離後のリポソームの変化（例えば、不完全な再懸濁／分散）に起因し得る。

実施例４：５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫調節組成物との組み合わせ
２００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度および２μＭの５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔを有する免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ溶液を調製した。５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの２μＭ溶液も調製した。両試料を４℃で２時間インキュベートした。これらの溶液の１００μｌアリコートをエッペンドルフ卓上遠心機中で１４，０００ｒｐｍ、４℃で２時間、実施例５で使用するために遠心分離し、残りのインキュベーションを、この実施例４に従って分析するために４℃で保存した。両方のサンプルは強力なＴＬＲ２１刺激活性を示したが、おそらく免疫調節組成物の細胞毒性の結果からか、免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組み合わせはより高い濃度で強く減少するシグナルを示した（図５Ａ）、。それぞれのＶ_ｍａｘ値は、試料の免疫調節組成物成分を低毒性濃度で考察した場合に類似していた（図５Ｂ、表４）。しかしながら、組合せ免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの計算されたＥＣ_５０は、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独のそれよりも４倍低かった（図５Ｂ、表４）。

実施例５：免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔおよび５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの遠心分離
２００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度および２μＭの５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔを有する免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ溶液を調製した。５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの２μＭ溶液も調製した。両試料を４℃で２時間インキュベートした。これらの溶液の１００μｌアリコートを４℃で１４，０００ｒｐｍのエッペンドルフ卓上遠心機で２時間遠心した。上清を除去しおよび保存した、一方で、ペレットを１００μｌに再懸濁した。続いて、これらの溶液から、連続１：２希釈液を調製し、２０ｎＭプラスミド濃度（および２μｇ／ｍｌプラスミド濃度）で開始するＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞に投与し、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのみを含有する試料と比較した。

免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組み合わせの遠心分離は明確に目に見えるペレットをもたらしたが、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔについては目に見えるペレットは観察されなかった。免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ組み合わせペレット（「ｐＤＮＡ－ｆ ５Ｃｈｏｌ ｐｅｌｌｅｔ」）は再懸濁することが困難であったが、実施例１に記載されるようなＴＬＲ２１アッセイにおいて、それは実質的に全ての刺激活性（図６Ａおよび６Ｂ）を含み、上清に痕跡のみが検出され（「ｐＤＮＡ－Ｆ ５Ｃｈｏｌ Ｕｂｅｒｓｔａｎｄ」）（図６Ｂ、表４）、ただし、元の試料（「ｐＤＮＡ－ｆＦ－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）よりも高いＥＣ_５０を有する（表４）。この結果は、免疫調節組成物と混合した後、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔがリポソーム画分と定量的に物理的に関連していることを示唆する。５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独は遠心分離されると、可溶性化合物から予想されるように（図７Ａおよび７Ｂ）、上清中にほとんど専ら残る（推定９９％、表４）。

実施例６：５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫調節組成物との組み合わせ
２００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度および２μＭの５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔを有する免疫刺激性組成物を調製した。５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの２μＭ溶液も調製した。両試料を４℃で２時間インキュベートした。これらの溶液の１００μｌアリコートを、実施例７で使用するために４℃で１４，０００ｒｐｍで２時間、エッペンドルフ卓上遠心機で遠心分離した。一方、残りのインキュベートは、この実施例６に従って分析のために４℃で保存した。上清を除去しおよび保存し、一方でペレットを２００μｌに再懸濁した。続いて、これらの溶液から、連続１：２希釈を行い、実施例１のプロトコールに従ってＴＬＲ２１分析のためにＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞に投与した。出発プラスミド濃度は２０ｎＭ（および２μｇ／ｍｌプラスミド濃度）であり、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのみを含有する試料と比較した。

両試料（「５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」および「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）は強力なＴＬＲ２１刺激活性を示したが、免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）は、おそらく免疫調節組成物の細胞毒性の結果として、高濃度での強い減少シグナルを示した（図８Ａ）。免疫調節組成物含有試料の刺激活性を低毒性濃度で考察した場合、それぞれのＶ_ｍａｘ値は非常に類似していた（図８Ｂ、表５）。しかし、免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４ＴのＥＣ_５０計算値は５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（「５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）単独の２倍低かった（図８Ｂ、表５）。

実施例７：免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔおよび５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの遠心分離
免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組み合わせの遠心分離ははっきりと見えるペレットをもたらしたが、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔについては目に見えるペレットは観察されなかった。免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せのペレットは再懸濁が困難であったが、実施例１に記載したようにＴＬＲ２１アッセイにおいて、それ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ ペレット」）は、刺激活性の実質的にすべてを含んでおり（表９Ｂ）、ただし、元の試料よりも高いＥＣ_５０を伴っていた（表５）、上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ 上清」）では痕跡のみが検出された（図９Ｂ、表５）。この結果は免疫調節組成物と混合した後、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔがリポソーム画分と物理的に関連していることを示唆している。両画分を非遠心免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）と比較した。
実施例８：５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫調節組成物との組み合わせ
２００μｇ／ｍｌのプラスミド濃度および２μＭの５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの免疫調節組成物溶液を調製した。２μＭの５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ試料も調製した。両試料を４℃で２時間インキュベートした。これらの溶液の１００μｌアリコートを、実施例９で使用するために４℃で１４，０００ｒｐｍで２時間、エッペンドルフ卓上遠心機で遠心分離した。一方、残りのインキュベートは、この実施例８に従って分析するために４℃で保存した。上清を除去しおよび保存し、一方で、ペレットを１００μｌに再懸濁した。続いて、これらの溶液から、連続１：２希釈物を調製し、実施例１のプロトコールに従ってＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞に投与し、２０ｎＭプラスミド濃度（および２μｇ／ｍｌプラスミド濃度）で開始し、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのみを含有する試料と比較した。

両試料とも強力なＴＬＲ２１刺激活性を示したが、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ／免疫調節組成物の組合せ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）は、免疫調節組成物単独（「ｐＤＮＡ－Ｆ」）と同様に、高濃度で強く減少するシグナルを示し（図１０Ａ）、これは免疫調節組成物の細胞毒性の結果のようである。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（「５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）は免疫調節組成物を含むいずれのサンプルよりも高い濃度でより高い刺激活性を示した。それぞれのＶ_ｍａｘ値は、試料の免疫調節組成物成分の刺激活性を低毒性濃度で考察した場合、非常に類似していた（図１０Ｂ、表６）。しかし、組み合わせ免疫調節剤組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）のＥＣ_５０の計算値は、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独（「５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）の４倍低かった（図１０Ｂ、表６）。免疫調節組成物単独（「Ｂａｙ ９８－Ｆ」）では最小活性のみが示され、その相加効果は、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独に対する免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの増加した活性を説明できない。

実施例９：免疫調節組成物の遠心分離
免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せの遠心分離は明確に目に見えるペレットをもたらしたが、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔについては目に見えるペレットは観察されなかった。免疫調節組成物／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せのペレット（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔペレット」）は再懸濁することが困難であったが、実施例１に記載されるようなＴＬＲ２１アッセイにおいて、＞９５％の刺激活性を含み（図１１Ｂ）、ただし、それは元の試料よりも高いＥＣ_５０を伴っており、上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ上清」）（図１１Ｂ、表６）中ではわずかな画分（＜５％）しか検出されず、低免疫調節組成物濃度（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）では非遠心分離サンプルよりもわずかに少ない。この結果は、免疫調節組成物と混合した後、５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔがリポソーム画分と定量的に物理的に関連していることを示唆する。

実施例１０：ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔと免疫調節組成物との組み合わせ
２００μｇ／ｍｌプラスミド濃度および２μＭ ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（配列番号２５２；５－ＣｈｏｌＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（配列番号１）と同じオリゴヌクレオチド配列であるが、コレステリル修飾を含まない）の免疫調節組成物溶液を調製した。また、２μＭのＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ試料を調製し、両方の試料を４℃で２時間インキュベートした。これらの溶液の１００μｌアリコートを、１４，０００ｒｐｍ、４℃で２時間、実施例１１で使用するためにエッペンドルフ卓上遠心分離機で遠心分離し、インキュベーションの残りは、この実施例１０による分析のために４℃で保存した。上清を除去しおよび保存し、一方でペレットを１００μｌに再懸濁した。続いて、これらの溶液から、連続１：２希釈物を調製し、実施例１のプロトコールに従ってＨＥＫ２９３－ｂｓｄ－ｃＴＬＲ２１細胞に投与し、２０ｎＭプラスミド濃度（および２μｇ／ｍｌプラスミド濃度）で開始し、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔのみを含有する試料と比較した。

両試料は強力なＴＬＲ２１刺激活性を示したが、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ／免疫調節組成物の組合せ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／５－Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）は、おそらく免疫調節組成物の細胞毒性の結果として、高濃度で強く減少するシグナルを示した（図１２Ａ）。試料の免疫調節組成物成分の刺激活性を低毒性濃度で考察した場合（図１２Ｂ、表７）、それぞれのＶ_ｍａｘ値は非常に類似していた。しかし、免疫調節組成物／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せのＥＣ_５０の計算値は、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独の場合（表７）よりも４倍以上低かった。免疫調節組成物単独（「ｐＤＮＡ－Ｆ」）は最小活性のみを示し、その相加効果は、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ単独対する免疫調節組成物／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの増加した活性を説明することができない。

実施例１１：免疫調節組成物／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの遠心分離
免疫調節組成物／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔの組合せの遠心分離は、明らかに目に見えるペレットをもたらした。免疫調節組成物／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ組合せペレットは再懸濁することが困難であったが、実施例１に記載されるＴＬＲ２１アッセイにおいて、それ（「ｐＤＮＡ－Ｆ／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔペレット」）は元の試料（「ｐＤＮＡ－Ｆ／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」）よりも高いＥＣ_５０ではあるが、上清（「ｐＤＮＡ－Ｆ／ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ上清」）よりも３倍を超える刺激活性を含んでいた（図１３Ｂ、表７）。この結果は免疫調節組成物と混合した後、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔは、おそらくコレステリル誘導体化５－ＣｈｏｌＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔほど効率的ではないが、リポソーム画分と定量的に物理的に関連していることを示唆している。

当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変更および修正を行うことができ、本発明の精神から逸脱することなくそのような変更および修正を行うことができることを理解するのであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内に入るそのような均等な変形のすべてを包含することが意図される。

この文献に引用または記載された各特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１２：ニワトリにおけるニューカッスル病ワクチン接種モデルにおける免疫刺激剤の有効性のＩｎ ｖｉｖｏ研究
免疫刺激剤としてのＯＤＮ１、ＯＤＮ２、およびＯＤＮ３の適合性および有効性を決定するために、それぞれを３つの異なる濃度で試験した。

以下の免疫刺激剤について検討した：
ＯＤＮ１：［ＣｈｏｌＴＥＧ］－ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ （“５Ｃｈｏｌ－ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ”） （配列番号１） （［ＣｈｏｌＴＥＧ］＝５’－トリエチレングリコール－結合コレステリル修飾）、
ＯＤＮ２：ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ （“ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ”） （配列番号２５２）、
ＯＤＮ３：ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ （“２００６－ＰＴＯ”） （配列番号３）。

各免疫刺激剤を、表９に従って、最適以下の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）濃度の不活化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を含有する油エマルジョンに添加した。最適以下のＮＤＶワクチンの調製のために、ＮＤＶ抗原バッチをＮＤＶ陰性尿膜液（ＡＦ）中で５０倍希釈した。ＳＰＦ層ニワトリ（Ｌｅｇｈｏｒｎ）を用いて、ＯＤＮ１、ＯＤＮ２、およびＯＤＮ３とニューカッスル病ワクチンの最適以下の用量との併用の有効性を試験した。血清学的反応を測定し、免疫刺激剤を用いない同様の最適以下のＮＤＶワクチンと比較した。ワクチン接種後の異なる時点で抗体価を測定し、免疫刺激剤の添加がより早期の免疫応答につながるかどうかを検討した。３つのＯＤＮの最適な投与量を決定するために、各々が最適以下のＮＤＶワクチンに１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの３つの異なる投与量で補充され、９つの免疫刺激剤群がもたらされた。これら９つの免疫刺激剤群の他に、５つの対照群を本研究に組み入れ、それらは、免疫刺激剤無しの最適以下のＮＤＶワクチン群、非希釈ＮＤＶワクチン群、陰性対照群（アジュバントとの併用での免疫刺激剤）および２つの異なる濃度でのポリイノシン：ポリシチジル酸（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）による２つの陽性対照群から成る（表８）。

以下のパラメーターを試験した：ニワトリの健康（データは示していない）および血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによる血清学的検査。

処置群Ｔ０１～Ｔ１４に登録されたニワトリには、試験デザインに従って試験品または対照品目を投与した。Ｔ１３群およびＴ１４群では、試験開始前に２頭が消失したため、１群あたり１０羽のニワトリの代わりに９羽にワクチンを接種した。

処置群Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０８およびＴ０９に割り付けたニワトリに、３種類の異なる免疫刺激剤（ＯＤＮ）のうちの１種類を含む最適以下のＮＤＶ懸濁液（それぞれ、３種類の異なる濃度（１００、１０００、５０００ｎｇ／投与）をワクチン接種した。油中水型エマルジョンの調製のために、ＮＤＶ抗原懸濁液および免疫刺激剤（水相）を、アジュバントＳｔｉｍｕｎｅ（油相）と一緒に４：５の比で処方した（表９）。

Ｔ１０の対照群に割り当てたニワトリに、免疫刺激剤を含まない最適以下のＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比率でワクチン接種した。

Ｔ１１の対照群に割り付けたニワトリに、免疫刺激剤を含まない非希釈ＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比率でワクチン接種した。

Ｔ１２群に割り付けたニワトリに、免疫刺激剤１（３羽）、免疫刺激剤２（３羽）および免疫刺激剤３（３羽）（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比率でワクチン接種した。１匹のニワトリに、アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の希釈緩衝液（独自仕様）をワクチン接種した。

Ｔ１３（ｎ＝９）およびＴ１４（ｎ＝９）の対照群に割り当てたニワトリに、２つの濃度（１０，０００ｎｇおよび１００μｇ）のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃと組み合わせたＮＤＶの最適以下ＮＤＶ懸濁液（アジュバント（Ｓｔｉｍｕｎｅ）中の）を４：５の比でワクチン接種した。
試験品又は対照品の投与
－７０℃で保存した不活化ＮＤＶ株Ｕｌｓｔｅｒ懸濁液を解凍し、陰性尿膜液中で５０倍希釈して、最適以下のワクチン用量を作製した。免疫刺激剤を、試験デザインに従って添加した。得られた水相を、表９に示すワクチン接種調製スキームに従って、４：５の比でＳｔｉｍｕｎｅと混合した。調製中、Ｓｔｉｍｕｎｅアジュバントを除く全てのワクチン成分を融解氷中に置いた。調製したワクチンを、調製直後に注射した（０．５ｍｌ、筋肉内）。

全身の健康状態は、到着日から試験終了まで、経験豊富なバイオ技術者が毎日モニタリングした。
血清採血
試験０日目（ワクチン接種前）、７日目、１４日目および２１日目に、すべてのニワトリから血清学的検査用の血液サンプルを採取した。血液サンプルには、試験番号、固有のサンプル識別、および採取日をラベル付けした。採取した血液量に応じて、血清を約０．５ｍｌの２つのアリコートに分け、－２０±５℃で保存した。
赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ
簡単に述べると、希釈系列の血清を、８ＨＡＵ(赤血球凝集単位）のＮＤＶ株Ｕｌｓｔｅｒと共に室温で６０分間インキュベートした。各アッセイの前にＨＡＵをタイトレーションした。その後、ニワトリ赤血球を添加し、４℃で４５分間インキュベートした後、凝集を記録した。陰性対照血清および３つの陽性対照血清（低、中および高抗体価）を、それぞれのアッセイに含めた。

ＨＩ力価の結果を、凝集を完全に阻害する最高血清希釈の逆数として表し、これを最終Ｌｏｇ２力価に対数変換した。

統計
対数的に変換されたＨＩ結果を、動物ごとに要約した（表６２～６５を参照のこと）。処置群ごとに、抗体価の平均値と標準偏差を算出した。統計解析は、ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ－ｔｅｓｔを用いて行った。
結果
ワクチン接種に関連した臨床症状及び有害事象は全群で認められず、全試験期間中、全てのニワトリが健康に見えた。

しかしながら、２羽のニワトリを、試験開始の６日前に開始したペッキング行動に起因する軽度の損傷でスコア化した。ワクチン接種の日に、これらのニワトリを、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ群Ｔ１３（＃１１６５８）およびＴ１４（＃１１６７６）に割り当てた。ワクチン接種後１週間以内に回復した。
ＯＤＮ１，ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ－５Ｃｈｏｌ
１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表１０に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図１４（ワクチン接種後（ｐｖ）１４日目および２１日目）および図１５（すべてのデータ）に示す。

ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ－５Ｃｈｏｌ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。ｐｖ１４日目では、これは、３つの用量のすべてのケースであった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．４（ｐ＝０．０２１４）、１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．９Ｌｏｇ２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．０００３）および５０００ｎｇ：平均ＨＩ５．９Ｌｏｇ２／ＳＤ０．７（ｐ＝０．０２４３）。

しかし、ｐｖ２１日目では、ＮＤＶワクチン；ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０と比較した場合、１０００ｎｇの濃度は非常に有意に近いが、全ての濃度で有意差は観察されなかった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．９Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．１９９５）；１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価７．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．９（ｐ＝０．０５２７）；および５０００ｎｇ：平均ＨＩ６．７Ｌｏｇ２／ＳＤ０．９（ｐ＝０．４５２３）（図１４）。

ＯＤＮ２，ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ
１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表１１に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図１６（ｐｖ１４日目および２１日目）および図１７（すべてのデータ）に示す。

ＯＤＮ２、ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ_２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。これは、３つの用量全てのワクチン接種後１４日目のケースだった；１００ｎｇ：平均ＨＩ力価７．１Ｌｏｇ_２／ＳＤ１．２（ｐ＝０．０００３）、１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．４Ｌｏｇ_２／ＳＤ０．７（ｐ＝０．００２７）、および５０００ｎｇ：平均ＨＩ力価６．１Ｌｏｇ_２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．０２３６）。２１日目に、ＮＤＶワクチン（ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ_２／ＳＤ１．０）と比較した場合、７．６Ｌｏｇ_２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．００８３）の平均ＨＩ力価を有する１００ｎｇ投与量でのみ有意差が観察された。１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの平均ＨＩ力価は、それぞれ７．１Ｌｏｇ_２／０．６（ｐ＝０．０６９６）および７．２Ｌｏｇ_２／ＳＤ１．０（ｐ＝０．０９５６）であった（図１６）。

ＯＤＮ３，２００６－ＰＴＯ
測定した１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇのＯＤＮ１用量群のＬｏｇ２力価として表した個々のＨＩ結果を表１２に示す。３連のＨＩアッセイ実施の間に、異常値の結果が２１日目に動物１１５７０について観察され、これはピペッティングエラー（十分なＡＦが添加されていない）によって引き起こされた可能性が最も高く、したがって、この結果は最終分析から省略された（表１２において強調されている）。従って、この動物および日付について、平均ＨＩ力価は、二重測定に基づいた。

これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図１８（ｐｖ１４日目および２１日目）および図１９（すべてのデータ）に示す。

ＯＤＮ３，２００６－ＰＴＯ群は、希釈ＮＤＶワクチン（平均ＨＩ力価：４．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意に高いＨＩ力価を示した。これは、ワクチン接種後１４日目の２つの用量に当てはまった；１０００ｎｇ：平均ＨＩ力価：６．３Ｌｏｇ２／ＳＤ１．２（ｐ＝０．００８１）および５０００ｎｇ：平均ＨＩ力価：６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．００５９）。１００ｎｇ用量の平均ＨＩ力価は、５．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．５（ｐ＝０．２０９０）であった。ｐｖ２１日目において、有意差は、５０００ｎｇ：平均ＨＩ力価７．３Ｌｏｇ２／ＳＤ０．６（ｐ＝０．０２９６）でのみ測定された。ＮＤＶワクチン；ＨＩ力価６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０と比較した場合、１００ｎｇおよび１０００ｎｇ容量では有意差は認められず、平均ＨＩ力価はそれぞれ６．６Ｌｏｇ２／ＳＤ０．５（ｐ＝０．７１８３）および６．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．１（ｐ＝０．１６８５）であった（図１８）。

対照群
１０μｇおよび１００μｇのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ用量群、希釈および非希釈ＮＤＶワクチン、ならびに陰性対照群のＬｏｇ２力価として表される個々のＨＩ結果を表１３に示す。これらの群の平均ＨＩ力価および標準偏差を、希釈ＮＤＶワクチン群の平均力価と比較して、図２０（ｐｖ１４日目および２１日目）および図２１（すべてのデータ）に示す。

陽性対照群であるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃについては、ＮＤＶワクチン（６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較した場合、１００μｇ用量：２１日目のＨＩ力価７．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．４（ｐ＝０．００５３）でのみ有意に高いＨＩ力価が観察された。１０μｇおよび１００μｇ用量群の１４日目の平均ＨＩ力価は、それぞれ５．８Ｌｏｇ２／ＳＤ１．３（ｐ＝０．１８５９）および５．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．８（ｐ＝０．１６０９）であった。ｐｖ２１日目における１０μｇ用量群の平均ＨＩ力価は、６．４Ｌｏｇ２／ＳＤ１．３（ｐ＝０．７２７３）であった。非希釈ＮＤＶワクチン（８．３／ＳＤ０．５および８．５Ｌｏｇ２／ＳＤ０．７）と陰性対照群との間で、ワクチン接種後１４日目および２１日目の希釈ＮＤＶ群（それぞれ４．８／ＳＤ１．０および６．２Ｌｏｇ２／ＳＤ１．０）と比較して有意差（ｐ＜０．０００１）が観察された（図２０）。

結論
目的は、３種類の異なる免疫刺激剤のアジュバント活性を試験することであった。これは、最適以下の濃度の不活化ＮＤＶおよび３つの異なる免疫刺激剤のうちの１つの異なる濃度を含有する油エマルジョンワクチンでのワクチン接種後の血清学的応答を測定することによって試験された。

以下の免疫刺激剤について検討した：
ＯＤＮ１：［ＣｈｏｌＴＥＧ］－ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ（「ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ－５Ｃｈｏｌ」） （配列番号１） （［ＣｈｏｌＴＥＧ］＝５’－トリエチレングリコール－結合コレステリル修飾）、
ＯＤＮ２：ＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴ（「ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ」） （配列番号２５２）、
ＯＤＮ３：ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ（「２００６－ＰＴＯ」） （配列番号３）。

ＯＤＮ１およびＯＤＮ２免疫の骨格はホスホジエステル結合していたが、ＯＤＮ３の骨格はホスホロチオエート結合していた。各ＯＤＮの有効性は、１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび５０００ｎｇの３種類の異なる用量で測定し、最適以下のＮＤＶワクチンに補完した。

血清学的反応はワクチン接種後０日目（ワクチン接種前）、７日目、１４日目および２１日目に測定し、これらの免疫刺激剤の添加がより早期の免疫反応にもつながる可能性があるかどうかを検討した。ワクチン接種後（ｐｖ）０日目および７日目におけるＮＤＶに対する抗体レベルは、７日目の非希釈ＮＤＶワクチン群の１匹（＃１１６１８）を除いては、検出されなかった。

Ｌｏｇ２ＨＩ力価として表した血清学的反応は、ｐｖ１４日目と２１日目で非希釈と最適以下ＮＤＶワクチンの間で有意差（ｐ＜０．０００１）を示し、５０倍の希釈係数が最適以下ワクチン用量を作り出すのに十分であることを示した。

陰性対照群は全試験期間中陰性のままであり、ＮＤＶワクチン非接種の免疫刺激剤は非特異的免疫応答をもたらさないことが示された。

陽性対照のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ １００μｇ用量群は２１日目にナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＮＤＶワクチンと比較して有意に高いＨＩ力価を示し（ｐ＝０．００５３）、この用量群が有効な陽性対照群となることを示した。

ＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔ‐５Ｃｈｏｌ（ＯＤＮ１）群は、３つの用量；１００ｎｇ（ｐ＝０．０２１４）、１０００ｎｇ（ｐ＝０．０００３）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．０２４３）全てについて、希釈ＮＤＶワクチンと比較した場合、ｐｖ１４日目で、有意に高いＨＩ力価を示した。しかし、ｐｖ２１日目では、有意差は観察されなかった。

ＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（ＯＤＮ２）群は、ｐｖ１４日目の希釈したＮＤＶワクチンと比較した場合、３つの用量；１００ｎｇ（ｐ＝０．０００３）、１０００ｎｇ（ｐ＝０．００２７）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．０２３６）すべてについて有意に高いＨＩ力価を示した。２１日目において、有意差（ｐ＝０．００８３）は、１００ｎｇ用量群でのみ測定された。

２００６－ＰＴＯ（ＯＤＮ３）群は、希釈ＮＤＶワクチンと比較して、２つの用量；１０００ｎｇ（ｐ＝０．００８１）および５０００ｎｇ（ｐ＝０．００５９）で、ｐｖ１４日目に有意に高いＨＩ力価を示した。ｐｖ２１日目においては、有意差（ｐ＝０．０２９６）は５０００ｎｇ用量群でのみ測定された。

結論として、最も高い平均ＨＩ力価は１００ｎｇのＧＣＧＴ３－ＴＧ４Ｔ（ＯＤＮ２）用量群、７．１Ｌｏｇ２（ｐｖ１４日目）および７．６Ｌｏｇ２（ｐｖ２１日目）で観察され、これはナイーブＮＤＶワクチンと比較した場合、ｐｖ１４日目および２１日目でそれぞれ２．３Ｌｏｇ２および１．４Ｌｏｇ２の力価の増加を示す。

１０００ｎｇのＧＣＧＴ３‐ＴＧ４Ｔ‐５Ｃｈｏｌ（ＯＤＮ１）用量群のｐｖ１４日目と２１日目での力価、それぞれ６．９Ｌｏｇ２と７．３Ｌｏｇ２は、ＯＤＮ２群とほぼ同様であった。ｐｖ１４日目では、ＯＤＮ１群とＯＤＮ２群の間に有意差（ｐ＝０．７５１３）は観察されなかった。

５０００ｎｇの２００６－ＰＴＯ（ＯＤＮ３）用量群の力価は、それぞれ、ｐｖ１４日目および２１日目で６．２Ｌｏｇ２および７．３Ｌｏｇ２であった。ｐｖ１４日目において、ＯＤＮ３群は、ＯＤＮ１群およびＯＤＮ２群の両方と有意に異なった（ｐ＝０．０３００）（図２２および図２３）。

ｐｖ２１日目では、全てのＯＤＮ群間に有意差は示されなかった。

従って、これらの結果は、全てのＯＤＮが、特にワクチン接種後１４日目に、血清学的反応を有意に増加させることができ、また、より早期の免疫の開始を示すことができることを示す。
［実施例］

実施形態
さらなる例示のために、本開示のさらなる非限定的な実施形態を以下に記載する。

例えば、実施形態１は、以下を含む免疫刺激性組成物である：
核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルを含む免疫調節組成物；および
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド。

実施形態２は、実施形態１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫調節組成物および免疫刺激性オリゴヌクレオチドは相乗的に有効な量で存在する。

実施形態３は、実施形態１または２に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはサイトゾル核酸サーベイランス分子のためのリガンドを含む。

実施形態４は、実施形態３に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫サイトゾル核酸サーベイランス分子はトル様受容体（ＴＬＲ）でる。

実施形態５は、実施形態３または４に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記サイトゾル核サーベイランス分子はＴＬＲ２１である。

実施形態６は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫調節組成物は約２００μｇ／ｍｌの核酸濃度を有する。

実施形態７は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は約１０μＭ～０．５μＭである。

実施形態８は、実施形態７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は約２μＭである。

実施形態９は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫調節組成物の核酸プラスミド濃度は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度よりも高い。

実施形態１０は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫調節組成物は非細胞毒性の量で存在する。

実施形態１１は、さらに医薬担体を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物である。

実施形態１２は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルは多重膜小胞脂質、押出脂質、またはその両方を含む。

実施形態１３は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルはカチオン性である。

実施形態１４は、実施形態１３の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記カチオン性リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；およびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群より選択される脂質の対を含む。

実施形態１５は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは非コードである。

実施形態１６は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは細菌由来である。

実施形態１７は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは免疫原性である。

実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６５と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態１９は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６６と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態２０は、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６８と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態２１は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む。

実施形態２２は、実施形態２１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドは３～８個のグアニンヌクレオチドを含む。

実施形態２３は、実施形態２１または２２に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１４３、または１を含む。

実施形態２４は、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドからの下流に第２の複数のグアニンヌクレオチドをさらに含む実施形態２１または２２に記載の免疫刺激性組成物である。

実施形態２５は、実施形態２４に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、またはＧＣＧＴ－Ｇｗｉｒｅ３を含む。

実施形態２６は、実施形態２４または２５に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび前記第２の複数のグアニンヌクレオチドは少なくとも２つのヌクレオチドによって分離されている。

実施形態２７は、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフは少なくとも３つのヌクレオチドによって分離されている。

実施形態２８は、実施形態２１～２７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドおよび少なくとも１つのＣｐＧモチーフはヘキサエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロパンジオール、またはそれらの誘導体によって分離される。

実施形態２９は、実施形態２８に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記ヘキサエチレングリコールの構造は下記式である：

実施形態３０は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは複数のＣｐＧモチーフをさらに含み、複数のＣｐＧモチーフの各ＣｐＧモチーフがスペーサーによって複数のＣｐＧモチーフの他のものから分離されている。

実施形態３１は、実施形態３０に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記スペーサーは少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。

実施形態３２は、実施形態３１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記スペーサーはデオキシリボースリン酸架橋を含む。

実施形態３３は、実施形態３２に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。

実施形態３４は、実施形態３１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。

実施形態３５は、実施形態３４に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記炭素鎖は１，３－プロパンジオールから誘導される。

実施形態３６は、実施形態３１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。

実施形態３７は、実施形態３６に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。

実施形態３８は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。

実施形態３９は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格をさらに含む。

実施形態４０は、実施形態１～３８のいずれかに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格をさらに含む。

実施形態４１は、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは脂質部分を含む。

実施形態４２は、実施形態４１の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記脂質部分はコレステリルである。

実施形態４３は、実施形態４１～４２のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記脂質部分は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある。

実施形態４４は、５’末端、３’末端、またはその両方にＣｐＧ配列エレメントを含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物である。

実施形態４５は、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを有する、実施形態４４の免疫刺激性組成物である。

実施形態４６は、実施形態４４または４５に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記ＣｐＧ配列要素はＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、またはＴＣＧＣである。

実施形態４７は、先行する請求項のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物を調製する方法であって：
前記免疫調節組成物と前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを組み合わせて免疫刺激性組成物を形成すること；
前記免疫刺激性組成物を遠心分離して、上清およびペレットを生成すること；および
ペレットを単離すること、
を含む。

実施形態４８は、トル様受容体２１（ＴＬＲ２１）を刺激するための方法であって：
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫調節剤組成物を投与することを含み、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有し、前記免疫調節剤組成物は、非コード核酸プラスミドおよび脂質送達ビヒクルを含む。

実施形態４９は、実施形態４８に記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物および前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは相乗的に有効な量で存在する。

実施形態５０は、実施形態４８または４９に記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはＴＬＲ２１に対するリガンドを含む。

実施形態５１は、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物の核酸プラスミド濃度は約２００μｇ／ｍｌである。

実施形態５２は、実施形態４８～５１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は約１０μＭ～０．５μＭである。

実施形態５３は、実施形態５２記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度は約２μＭである。

実施形態５４は、実施形態４８～５３のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物の核酸プラスミド濃度は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度よりも高い。

実施形態５５は、実施形態４８～５４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物は非細胞毒性の量で存在する。

実施形態５６は、実施形態４８～５５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物は医薬担体をさらに含む。

実施形態５７は、実施形態４８～５６のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルは多重膜小胞脂質、押出脂質、またはその両方を含む。

実施形態５８は、実施形態４８～５７のいずれか１つの方法であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルはカチオン性である。

実施形態５９は、実施形態５８に記載の方法であり、ここで、前記カチオン性リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群より選択される脂質の対を含む。

実施形態６０は、実施形態４８～５９のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは非コードである。

実施形態６１は、実施形態４８～６０のいずれかに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは細菌由来である。

実施形態６２は、実施形態４８～６１のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは免疫原性である。

実施形態６３は、実施形態４８～６２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６５と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態６４は、実施形態４８～６２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６６と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態６５は、実施形態４８～６２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６８と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態６６は、実施形態４８～６５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記グアニンヌクレオチド富化配列は第１の複数のグアニンヌクレオチドを含む。

実施形態６７は、実施形態６６に記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドは３～８個のグアニンヌクレオチドを含む。

実施形態６８は、実施形態６６または６７に記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは配列番号１、１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８または１４３を含む。

実施形態６９は、実施形態４８～６８のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、第１の複数のグアニンヌクレオチドから下流に第２の複数のグアニンヌクレオチドをさらに含む。

実施形態７０は、実施形態６９に記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは配列番号１４１、１４２、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、またはＧＣＧＴ－Ｇｗｉｒｅ３を含む。

実施形態７１は、実施形態６９または７０に記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチド、前記第２の複数のグアニンヌクレオチド、またはその両方は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、またはその両方での四次構造の形成を促進する。

実施形態７２は、実施形態７０または７１に記載の方法であり、ここで、前記第１および第２の複数のグアニンヌクレオチドは、Ｇ－ワイヤーコンホメーションを有する四次構造の形成を促進する。

実施形態７３は、実施形態７０～７２のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと第２の複数のグアニンヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチドによって分離される。

実施形態７４は、実施形態６７～７３のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、少なくとも３つのヌクレオチドによって分離される。

実施形態７５は、実施形態６７～７３のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記第１の複数のグアニンヌクレオチドと少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、ヘキサエチレングリコールによって分離される。

実施形態７６は、実施形態７５に記載の方法であり、ここで、前記ヘキサエチレングリコールの構造は下記式である：

実施形態７７は、実施形態４８～７６のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは複数のＣｐＧモチーフをさらに含み、前記複数のＣｐＧモチーフの各ＣｐＧモチーフは、スペーサーによって分離されている。

実施形態７８は、実施形態７７に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含む。

実施形態７９は、実施形態７８に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは、デオキシリボースリン酸架橋である。

実施形態８０は、実施形態７９に記載の方法であり、ここで、前記デオキシリボースリン酸架橋は脱塩基である。

実施形態８１は、実施形態７８に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは炭素鎖を含む。

実施形態８２は、、実施形態８１に記載の方法であり、ここで、前記炭素鎖は１，３－プロパンジオールから誘導される。

実施形態８３は、実施形態７８に記載の方法であり、ここで、前記スペーサーは反復化学単位を含む。

実施形態８４は、実施形態８３に記載の方法であり、ここで、前記反復化学単位はエチレングリコールである。

実施形態８５は、実施形態４８～８４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはその両方は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログをさらに含む。

実施形態８６は、実施形態４８～８５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格を含む。

実施形態８７は、実施形態４８～８５のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格を含む。

実施形態８８は、実施形態４８～８７のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは脂質部分をさらに含む。

実施形態８９は、実施形態８８に記載の方法であり、ここで、前記脂質部分は前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強する。

実施形態９０は、実施形態８８または８９の方法であり、ここで、前記脂質部分はコレステリルである。

実施形態９１は、実施形態８８～９０のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記脂質部分は免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある。

実施形態９２は、５’末端、３’末端、またはその両方にＣｐＧ配列エレメントを含む、実施形態４８～９１のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態９３は、少なくとも２つのＣｐＧ配列エレメントを有する、実施形態９２の方法である。

実施形態９４は、実施形態９２または９３に記載の方法であり、ここで、前記ＣｐＧ配列要素は、ＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、またはＴＣＧＣである。

実施形態９５は、実施形態４８～９４のいずれか１つに記載の方法であり、ここで、前記免疫調節組成物および前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは同時に投与される。

実施形態９６は、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘発する方法である。

実施形態９７は、以下を含む免疫刺激性組成物である：
核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクル；ならびに
配列番号１を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド。

実施形態９８は、実施形態９７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６５と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態９９は、実施形態９７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６６と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態１００は、、実施形態９７に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記核酸プラスミドは配列番号２６８と少なくとも７５％の配列同一性を有する。

実施形態１０１は、実施形態９７～１００のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルは、多層膜小胞脂質、押出脂質、またはその両方を含む。

実施形態１０２は、実施形態１０１に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記リポソーム送達ビヒクルはカチオン性である。

実施形態１０３は、実施形態１０２の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記カチオン性リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群より選択される脂質の対を含む。

実施形態１０４は、実施形態９７～１０３のいずれか１つに記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは５’コレステリル修飾をさらに含む。

実施形態１０５は、実施形態１０４に記載の免疫刺激性組成物であり、ここで、前記５’コレステリル修飾はトリエチレングリコールリンカーを含む。

本開示の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「Ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は１つまたは複数の要素が存在することを意味することを意図し、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。

上記に鑑みて、本開示のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かるであろう。

本開示の範囲から逸脱することなく、上記の者および方法に様々な変更を加えることができるので、上記の説明に含まれるすべての事項は例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。

Claims (21)

1. 免疫刺激性組成物であって：
   ａ)免疫原性核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルを含む免疫調節組成物であって、ここで、前記核酸プラスミドは、配列番号２６５、２６６又は２６８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し；および
   ｂ)免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にグアニンヌクレオチド富化配列および少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであって、
   ここで、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７８、８１、８２、８５、８６、８９、９０、９２、９３、９６、９７、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１４３、または１のヌクレオチド配列を含む、
   を含む、前記免疫刺激性組成物。
2. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、サイトゾル核酸サーベイランス分子のためのリガンドを含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
3. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、トル様受容体（ＴＬＲ）のためのリガンドである、請求項２に記載の免疫刺激性組成物。
4. 前記トル様受容体（ＴＬＲ）がＴＬＲ２１である、請求項３に記載の免疫刺激性組成物。
5. 前記免疫調節組成物の前記核酸プラスミド濃度が免疫刺激性オリゴヌクレオチドの濃度よりも高い、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
6. 医薬担体をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
7. 前記リポソーム送達ビヒクルが、多重膜小胞脂質、押出脂質、またはその両方を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
8. 前記リポソーム送達ビヒクルがカチオン性である、請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
9. 前記カチオン性リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイオルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群より選択される脂質の対を含む、請求項８に記載の免疫刺激性組成物。
10. 前記核酸プラスミドが非コードである、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
11. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
12. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが脂質部分を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
13. 前記脂質部分がコレステリルである、請求項１２に記載の免疫刺激性組成物。
14. 前記脂質部分が免疫刺激性オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍にある、請求項１２～１３のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物。
15. 少なくとも１つのＣｐＧモチーフを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、５’末端、３’末端、又は、５’末端及び３’末端の両方にＣｐＧモチーフを含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
16. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、５’末端及び３’末端の両方にＣｐＧモチーフを含む、請求項１５に記載の免疫刺激性組成物。
17. 前記ＣｐＧモチーフが、ＧＣＧＡ、ＧＣＧＧ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＧＣＧＴ、またはＴＣＧＣである、請求項１５または１６に記載の免疫刺激性組成物。
18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の免疫刺激性組成物を調製する方法であって：
    前記免疫調節組成物と前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを組み合わせて免疫刺激性組成物を形成すること；
    前記免疫刺激性組成物を遠心分離して、上清およびペレットを生成すること；及び
    ペレットを単離すること
    を含む、前記方法。
19. 免疫刺激性組成物であって：
    （ａ） 核酸プラスミドおよびリポソーム送達ビヒクルであって、
    ここで、核酸プラスミドは、配列番号２６５、２６６又は２６８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する；および
    （ｂ） 配列番号１を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド
    を含む、前記組成物。
20. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが５’コレステリル修飾をさらに含む、請求項１９に記載の免疫刺激性組成物。
21. ５’コレステリル修飾がトリエチレングリコールリンカーを含む、請求項２０に記載の免疫刺激性組成物。

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