BR112020011815A2

BR112020011815A2 - oligonucleotídeos imunoestimulatórios

Info

Publication number: BR112020011815A2
Application number: BR112020011815-0A
Authority: BR
Inventors: Thomas Ilg
Original assignee: Bayer Animal Health Gmbh
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-11-17
Also published as: EP3701032A1; IL274975A; CL2020001562A1; EP3700564A1; CN111801419A; US20230174990A1; CA3085661A1; CO2020007102A2; PH12020550906A1; CO2020007100A2; DOP2020000106A; TW201940192A; US20210062192A1; US20210170020A1; PE20210635A1; US11542507B2; TW201936923A; CR20200260A; US11932857B2; CA3085575A1

Abstract

São revelados no presente documento composições e oligonucleotídeos imunoestimulatórios e métodos de uso dos mesmos. Mais especificamente, são revelados oligonucleotídeos imunoestimulatórios, métodos de otimização das propriedades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos, e métodos de uso dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios para elicitar uma resposta imune mediada por receptor semelhante a toll 21 (TLR21).

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEOS IMUNOESTIMULATÓRIOS” REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente nos EP17207740.6, EP17207746.3 e EP17207750.5, cada uma depositada em 15 de dezembro de 2017, cujas revelações são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Este pedido contém uma listagem de sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e que é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 30 de novembro de 2018, é denominada BHC_168028_SL.txt e tem 78.795 bites de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] São revelados no presente documento composições e oligonucleotídeos imunoestimulatórios e métodos de uso dos mesmos. Mais especificamente, são revelados oligonucleotídeos imunoestimulatórios, métodos de otimização das propriedades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos, e métodos de uso dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios para elicitar uma resposta imune mediada por receptor semelhante a toll 21 (TLR21).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Alguns atributos moleculares de microrganismos que incluem proteínas e outros antígenos em uma superfície do micróbio, assim como composições internas como determinados motivos contidos dentro de um genoma do micróbio (por exemplo, motivos de CpG não metilados), podem ser reconhecidos por um sistema imune do organismo hospedeiro e elicitar respostas imunes. A interação entre esses atributos moleculares, ou padrões moleculares associados a patógeno (PAMPs), e receptores de reconhecimento de patógeno cognato de um hospedeiro podem iniciar cascatas de sinalização de célula envolvidas em respostas imunes. O receptor semelhante a toll 21 (TLR21) é o homólogo funcional da galinha de receptor semelhante a toll 9 (TLR9) de mamífero e um receptor PAMP capaz de reconhecer motivos de CpG não metilados. A ativação de TLR21 por ácidos nucleicos que têm esses motivos de CpG foi mostrada para ativar sinais celulares envolvidos em respostas imunes para a infecção microbiana.

[0005] A compreensão do papel de TLR21 na resposta imune em galinhas não levo a um desvio na prevenção ou no tratamento de doenças na indústria de aves. Grandes populações de aves alojadas em instalações de incubadora têm risco aumentado de infecções microbianas em todos os estágios da vida devido aos ambientes inerentemente lotados e não estéreis, mas, as composições profiláticas e os tratamento pós-infecção atualmente disponíveis geralmente não elicitam respostas imunes mediadas por PAMP. Ao invés disso, as instalações de produção em grande escala contam com vacinas e antibióticos comercialmente disponíveis para prevenir ou reduzir surtos infecciosos. Embora os antibióticos estejam se tornando desfavorecidos devido às preocupações quanto resistência e consequências não pretendidas de consumo de carne tratada, a administração de antibiótico permanece um procedimento de operação padrão em muitas configurações agrícolas, incluindo alojamentos de incubadora de grande escala, e a adoção de novos métodos pode ser proibitivamente cara e onerosa. Um obstáculo para adotar agonistas de TLR21 como uma medida profilática ou como um tratamento para infecção inclui as ineficiências associadas a grandes números de triagem de compostos candidatos, que efetivamente desincentiva a pesquisa para identificar tais agonistas.

[0006] Então, há uma necessidade por composições estimulatórias de TLR21, métodos para identificar as mesmas e para otimizar as propriedades imunoestimulatórias das composições. Os métodos e as composições revelados são direcionados a essas e outras necessidades importantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] São revelados no presente documento oligonucleotídeos imunoestimulatórios que compreendem pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina (“enriquecida por guanina”) que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0008] Também são revelados no presente documento oligonucleotídeos que compreendem uma modificação de 5'- colesterila com pelo menos um motivo de CpG e com ou sem uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0009] Também são fornecidos métodos de estimulação de receptor semelhante a toll 21 (TLR21) que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo um oligonucleotídeo imunoestimulatório que tem pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0010] Métodos para aumentar a atividade estimulatória de

TLR21 de um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de CpG que compreende fusionar a extremidade 5’ do oligonucleotídeo a uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina também são revelados.

[0011] São fornecidos no presente documento métodos para elicitar uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de dinucleotídeo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo ao indivíduo.

BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOS

[0012] O sumário, bem como a descrição detalhada seguinte, é mais bem compreendido quando lido em conjunto com os desenhos anexos. Para fins de ilustração das composições e dos métodos revelados, são mostradas nos desenhos modalidades exemplificativas das composições e dos métodos; no entanto, as composições e os métodos não se limitam às modalidades específicas reveladas. Nos desenhos:

[0013] A FIG. 1 é um mapa de plasmídeo de pcDNATM3.1(+).

[0014] A FIG. 2 compara as curvas de resposta de dose de células HEK293-NFκB estimuladas por TNF-α e HEK293-NFκB-bsd- cTLR21.

[0015] A FIG. 3A e a FIG. 3B representam graficamente os efeitos estimulatórios de 2006-PTO e 2006-PDE em células HEK293-bsd e HEK293-bsd-cTLR21.

[0016] A FIG. 4A e a FIG. 4B representam graficamente os efeitos estimulatórios de números crescentes de resíduos de guanina na terminação 3’ do oligonucleotídeo 2006-PDE.

[0017] A FIG. 5A e a FIG. 5B representam graficamente os efeitos estimulatórios de números crescentes de resíduos de guanina na terminação 5’ do oligonucleotídeo 2006-PDE.

[0018] A FIG. 6 ilustra o logaritmo negativo (log10) da meia concentração efetiva máxima (pEC50) de oligonucleotídeos 2006-PDE que tem números crescentes de resíduos de guanina em seus terminais 3’ ou 5’.

[0019] A FIG. 7A e a FIG. 7B ilustram a agregação dos oligonucleotídeos 2006-PDE que têm números crescentes de guaninas em seus terminais 5’ e 3’, respectivamente.

[0020] A FIG. 8A e a FIG. 8B representam graficamente os efeitos estimulatórios de oligonucleotídeo 2006-PDE com seis resíduos consecutivos de guanina (5dG6), adenina (5dA6), citosina (5dC6), ou timina (5dT6) em seu terminal 5’.

[0021] A FIG. 9A e a FIG. 9B representam graficamente o efeito de ruptura do motivo de CpG(s) na estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos.

[0022] A FIG. 10A e a FIG. 10B representam graficamente os efeitos estimulatórios de corridas de guanina nas extremidades 3’ e 5’, respectivamente, de oligonucleotídeos que têm cadeias principais de fosfodiéster ou fosforotioato.

[0023] A FIG. 11A e a FIG. 11B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de única adenina dentro da corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG, enquanto a FIG. 11C e a FIG. 11D ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de duas adeninas na corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0024] A FIG. 12A e a FIG. 12B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma única substituição de adenina dentro da corrida de seis citosinas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG, enquanto a FIG. 12C e a FIG. 12D ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de duas adeninas na corrida de seis citosinas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0025] A FIG. 13A e a FIG. 13B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de única timina dentro da corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG, enquanto a FIG. 13C e a FIG. 13D ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de duas timinas na corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0026] A FIG. 14 demonstra o efeito posicional na estimulação de TLR21 de substituições de único nucleotídeo em uma corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG (SEQ ID NO: 272).

[0027] A FIG. 15 demonstra o efeito posicional na estimulação de TLR21 de substituições de nucleotídeo duplo em uma corrida de seis guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG (SEQ ID NO: 272).

[0028] A FIG. 16A e a FIG. 16B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de única adenina dentro de uma corrida de quatro guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0029] A FIG. 17A e a FIG. 17B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de única citosina dentro de uma corrida de quatro guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0030] A FIG. 18A e a FIG. 18B ilustram os efeitos na estimulação de TLR21 de uma substituição de única timina em uma corrida de quatro guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG.

[0031] A FIG. 19 demonstra o efeito posicional na estimulação de TLR21 de substituições de único nucleotídeo em uma corrida de quatro guaninas na terminação 5’ de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG (SEQ ID NO: 273).

[0032] As FIGs. 20A – 20K ilustram os efeitos de fusionar a corrida de cinco guaninas na terminação 3’, uma corrida de quatro guaninas nos cinco terminais principais, e uma corrida de seis guaninas na terminação 5’ de sequências de oligodesoxinucleotídeos que contêm CpG implicadas na literatura. A FIG. 20A ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs 1668, 1668-3dG5, 1668-5dG4 e 1668-5dG6. A FIG. 20B ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODN 1826-3dG5, 1826-5dG4 e 1826- 5dG6. A FIG. 20C ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs BW006, BW006-3dG5, BW00-65dG4 e BW006-5dG6. A FIG. 20D ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs D-SLO1, D-SLO1-3dG5, D-SLO1- 5dG4 e D-SLO1-5dG6. A FIG. 20E ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs M362, M362-3dG5, M362-5dG4 e M362-5dG6. A FIG. 20F ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs 2395, 2395-5dG4 e 2395-5dG6. A FIG. 20G ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs 2007-PDE, 2007-PDE-3dG5,

2007-PDE-5dG4 e 2007-PDE-5dG6. A FIG. 20H ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs CPG- 685 e CPG-685-5dG6. A FIG. 20I ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs CPG-202 e CPG-202- 5dG6. A FIG. 20J ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs CPG-2000 e CPG-2000-5dG6. A FIG. 20K ilustra graficamente a atividade estimulatória de TLR21 de ODNs CPG-2002 e CPG-2002-5dG6.

[0033] A FIG. 21A representa graficamente o impacto de fusionar sequências teloméricas conhecidas a 2006-PDE e 2006-PDE-T4; a FIG. 21B e a FIG. 21C representam graficamente o impacto de fusionar sequências teloméricas ou promotoras a 2006-PDE-T4.

[0034] A FIG. 22A e a FIG. 22B ilustram o impacto de fusionar sequências teloméricas conhecidas a 2006-PDE.

[0035] A FIG. 23A e a FIG. 23B mostram a disposição de pareamento de base de um tetrâmero de oligonucleotídeos que têm sequências de G-quarteto e a orientação dos oligonucleotídeos que compreendem o tetrâmero, respectivamente ("TGGGGT" revelado como SEQ ID NO: 265); a FIG. 23C ilustra a interação de oligonucleotídeos quando formam uma conformação de G-quarteto ou um G-wire (SEQ ID NO: 257); a FIG. 23D é uma imagem de uma conformação de G- wire (SEQ ID NO: 257).

[0036] A FIG. 24A e a FIG. 24B representam o efeito na estimulação de TLR21 adicionando-se sequências enriquecidas por nucleotídeo de guanina à extremidade 5’ de um oligonucleotídeo que tem motivos de CpG.

[0037] A FIG. 25 representa a presença de oligodesoxinucleotídeos agregados que têm uma sequência G-

wire.

[0038] A FIG. 26A, a FIG. 26B e a FIG. 26C representam graficamente o impacto estimulatório dos nucleotídeos imediatamente adjacente a um motivo de CpGp. A FIG. 26A representa a atividade estimulatória de TLR21 dos oligonucleotídeos basais. A FIG. 26B representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ dG6 adicional. A FIG. 26C representa os oligonucleotídeos basais com uma sequência 5’ Gwire2 adicional.

[0039] A FIG. 27A, a FIG. 27B e a FIG. 27C representam graficamente o impacto estimulatório dos nucleotídeos imediatamente adjacente a um motivo de CpGpG. A FIG. 27A representa a atividade estimulatória de TLR21 dos oligonucleotídeos basais. A FIG. 27B representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ dG6 adicional. A FIG. 27C representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ Gwire2 adicional.

[0040] A FIG. 28A, a FIG. 28B e a FIG. 28C representam graficamente o impacto estimulatório dos nucleotídeos imediatamente adjacente a um motivo de CpGpC. A FIG. 28A representa a atividade estimulatória de TLR21 dos oligonucleotídeos basais. A FIG. 28B representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ dG6 adicional. A FIG. 28C representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ Gwire2 adicional.

[0041] A FIG. 29A, a FIG. 29B, a FIG. 29C e a FIG. 29D representam graficamente o impacto estimulatório dos nucleotídeos imediatamente adjacente a um motivo de CpGpT. A FIG. 29A representa a atividade estimulatória de TLR21 dos oligonucleotídeos basais. A FIG. 29B representa os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5’ dG6 adicional. A FIG. 29C e a FIG. 29D representam os mesmos oligonucleotídeos com uma sequência 5' Gwire2 adicional.

[0042] A FIG. 30 ilustra o impacto estimulatório de romper o único motivo de CpG em um oligonucleotídeo que tem uma sequência 5' Gwire.

[0043] A FIG. 31 ilustra o impacto estimulatório da distância entre uma sequência 5' Gwire e um motivo de CpG.

[0044] A FIG. 32 ilustra o impacto estimulatório de modificar o número de nucleotídeos de 5'-monofosfato de timidina na extremidade 3’ de um oligonucleotídeo que tem uma sequência 5’ Gwire2 e um motivo de CpG.

[0045] A FIG. 33A e a FIG. 33B comparam as propriedades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm diferentes sequências 5’ G-wire.

[0046] A FIG. 34 representa a atividade estrutural de um oligonucleotídeo que tem uma sequência 5’ Gwire2. A Figura revela SEQ ID NOS 189, 269, e 270, respectivamente, em ordem de aparecimento.

[0047] A FIG. 35A e a FIG. 35B comparam as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de GCGT único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência 5’ Gwire2 e motivos de CpG.

[0048] A FIG. 36A e a FIG. 36B comparam as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de GCGA único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência 5’ Gwire2 e motivos de CpG.

[0049] A FIG. 37A e a FIG. 37B comparam as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de ACGC único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência 5’ Gwire2 e motivos de CpG.

[0050] A FIG. 38A e a FIG. 38B comparam as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de TCGC único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência 5’ Gwire2 e motivos de CpG.

[0051] A FIG. 39A e a FIG. 39B comparam as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de CCGC único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência 5’ Gwire2 e motivos de CpG.

[0052] A FIG. 40 compara as capacidades imunoestimulatórias de oligonucleotídeos que têm um elemento de sequência de GCGG único, duplo ou triplo próximo da 3’ de um oligonucleotídeo com uma sequência de Gwire2 e motivos de CpG.

[0053] A FIG. 41A e a FIG. 41B comparam os efeitos imunoestimulatórios de inserir um a quatro nucleotídeos de timina entre dois motivos de CpG em um oligonucleotídeo.

[0054] A FIG. 42A e a FIG. 42B ilustram o efeito estimulatório de uma separação de único nucleotídeo entre dois motivos de CpG ou um espaçador abásico entre os dois motivos de CpG.

[0055] A FIG. 43A a 43E representa diferentes pontes estruturais entre elementos de CpG em um oligonucleotídeo. A FIG. 43A representa a estrutura de um espaçador de T1. A FIG. 43B representa a estrutura do espaçador de T3. A FIG.

43C representa a estrutura de um espaçador abásico. A FIG. 43D representa a estrutura de espaçador de 1,3-propanodiol. A FIG. 43E representa a estrutura de um espaçador de hexaetilenoglicol.

[0056] A FIG. 44A e a FIG. 44B mostram o impacto estimulatório de inserir um espaçador de C3 e um de C18 entre motivos de CpG.

[0057] A FIG. 45A e a FIG. 45B representam o impacto imunoestimulatório de números crescentes de motivos de CpG em um oligonucleotídeo que compreende um motivo de 5’-Gwire2, sendo que os motivos de CpG são separados por um espaçador de C3.

[0058] A FIG. 46A e a FIG. 46B ilustram graficamente a imunoestimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com uma sequência de TGGGGT (SEQ ID NO: 265) na extremidade 5’ e entre um e cinco motivos de CpG, cada um separado por espaçadores de C3.

[0059] A FIG. 47 representa espaçadores à base de diol abásico.

[0060] A FIG. 48A e a FIG. 48B exibem graficamente a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos que têm sequências 5’ terminal GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) e motivos de CpG, e em que os motivos de CpG são separados por propanodiol ou uma ponte de desoxirribose abásica.

[0061] A FIG. 49 representa um espaçador de C8, um espaçador basal e um espaçador de ponte de desoxirribose abásica.

[0062] A FIG. 50A e a FIG. 50B ilustram as capacidades de estimulação de TLR21 de oligonucleotídeos que têm motivos de CpG e uma sequência G-wire, em que os motivos de CpG são separados por etanodiol, propanodiol, butanodiol, pentanodiol e hexanodiol.

[0063] A FIG. 51 ilustra o impacto de diferentes espaçadores à base de diol entre elementos de CpG na estimulação de TLR21.

[0064] A FIG. 52A e a FIG. 52B representam a estimulação de TLR21 após a exposição a oligonucleotídeos que têm elementos de sequência de CpG ACGC ou CCGC separados por propanodiol ou hexaetileno glicol e uma sequência 5' terminal de G-wire.

[0065] A FIG. 53A e a FIG. 53B representam a estimulação de TLR21 após exposição a oligonucleotídeos que têm quaisquer elementos de sequência de CpG ACGC ou CCGC separados por propanodiol e uma sequência 5' terminal de TGGGGT (SEQ ID NO: 265).

[0066] A FIG. 54A e a FIG. 54B representam a estimulação de TLR21 após exposição a oligonucleotídeos que têm uma sequência 5' terminal de G-wire e motivos de CpG separados por qualquer um dentre propanodiol ou hexaetilenoglicol.

[0067] A FIG. 55 ilustra a estrutura química de uma fração de colesterol conectada à fração de 3' desoxirribose por um ligante de hexanodiol.

[0068] A FIG. 56A e a FIG. 56B comparam a estimulação de TLR21 de um oligonucleotídeo que tem múltiplos motivos de CpG, e uma sequência 5’ Gwire2 àquela do mesmo oligonucleotídeo que tem um grupo 3’ colesterila.

[0069] A FIG. 57A e a FIG. 57B comparam dois oligonucleotídeos que têm uma sequência de extremidade 5’ terminal de TGGGGT (SEQ ID NO: 265), múltiplos motivos de CpG e um grupo 3’ colesterila.

[0070] A FIG. 58A e a FIG. 58B representam modificações de 5’ colesterol para dois desoxinucleotídeos diferentes.

[0071] A FIG. 59A e a FIG. 59B ilustram a estimulação de TLR21 causada por oligonucleotídeos que têm uma sequência 5’ terminal de TGGGGT (SEQ ID NO: 265), múltiplos motivos de CpG, e com ou sem uma modificação de 5’ colesterol.

[0072] A FIG. 60A e a FIG. 60B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol, em que o derivado de colesterol é obtido a partir de um fornecedor diferente (Sigma Aldrich).

[0073] A FIG. 61A e a FIG. 61B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0074] A FIG. 62A e a FIG. 62B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0075] A FIG. 63A e a FIG. 63B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0076] A FIG. 64A e a FIG. 64B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0077] A FIG. 65 ilustra a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0078] A FIG. 66A e a FIG. 66B ilustram a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0079] A FIG. 67 ilustra a estimulação de TLR21 por oligonucleotídeos com ou sem modificações de 5’ colesterol.

[0080] A FIG. 68A e a FIG. 68B representam graficamente os efeitos imunoestimulatórios de oligonucleotídeos modificados com números crescentes de nucleotídeos de guanina na terminação 5’ do oligonucleotídeo em células de camundongo e humanas, respectivamente.

[0081] A FIG. 69A e a FIG. 69B representam graficamente os efeitos imunoestimulatórios de oligonucleotídeos modificados com números crescentes de nucleotídeos de guanina na terminação 3’ do oligonucleotídeo em células de camundongo e humanas, respectivamente.

[0082] A FIG. 70 representa títulos de inibição de Hemoglutinação média (Log2) (com desvio padrão) resulta para ODN1 (GCGT3-TG4T-5Chol) nos dias 14 (painel superior) e 21 (painel inferior) pós-vacinação (pv). Os asteriscos indicam o nível de significância (*=significante a ****=altamente significante).

[0083] A FIG. 71 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para ODN1 (GCGT3-TG4T- 5Chol) durante todo o estudo.

[0084] A FIG. 72 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para ODN2 (GCGT3-TG4T) nos dias 14 (painel superior) e 21 (painel inferior) pós- vacinação. Os asteriscos indicam o nível de significância (*=significante a ****=altamente significante).

[0085] A FIG. 73 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para ODN2 (GCGT3-TG4T) durante todo o estudo.

[0086] A FIG. 74 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para ODN3 (2006-PTO) nos dias 14 (painel superior) e 21 (painel inferior) pós- vacinação. Os asteriscos indicam o nível de significância

(*=significante a ****=altamente significante).

[0087] A FIG. 75 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para ODN3 (2006-PTO) durante todo o estudo.

[0088] A FIG. 76 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para Artigos de Teste de controle positivo e negativo nos dias 14 (painel superior) e 21 (painel inferior) pós-vacinação. Os asteriscos indicam o nível de significância (*=significante a ****=altamente significante).

[0089] A FIG. 77 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) para Artigos de Teste de controle positivo e negativo durante todo o estudo.

[0090] A FIG. 78 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) nas concentrações mais ótimas de ODNs durante todo o estudo comparado com a vacina NDV sozinha.

[0091] A FIG. 79 representa resultados de títulos de HI média (Log2) (com desvio padrão) nas concentrações mais ótimas de ODNs no dia 14 (painel superior) e 21 (painel inferior) pv em comparação com a vacina NDV sozinha.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0092] As composições e os métodos revelados podem ser entendidos mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada tomada em conjunto com as figuras anexas, que formam uma parte desta revelação. Deve ficar entendido que as composições e os métodos revelados não são limitados às composições e aos métodos específicos descritos e/ou mostrados no presente documento, e que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever modalidades particulares por meio de exemplo apenas e não pretende ser limitante das composições e dos métodos reivindicados.

[0093] Salvo se declarado especificamente de outro modo, qualquer descrição de um mecanismo ou modo de ação possível ou razão para aprimoramento pretende ser apenas ilustrativa, e as composições e os métodos revelados não devem ser restritos pela exatidão ou não exatidão de qualquer mecanismo ou modo de ação ou razão para aprimoramento sugeridos.

[0094] Ao longo deste texto, as descrições se referem a composições e métodos de uso das ditas composições. Onde a revelação descrever ou reivindicar um recurso ou modalidade associado a uma composição, tal recurso ou modalidade é igualmente aplicável aos métodos de uso da dita composição. De modo semelhante, onde a revelação descrever ou reivindicar um recurso ou modalidade associado a um método de uso de uma composição, tal recurso ou modalidade é igualmente aplicável à composição.

[0095] Quando uma faixa de valores é expressa, uma outra modalidade inclui desde o valor em particular e/ou até o outro valor em particular. Ademais, a referência a valores definidos em faixas inclui cada e todo valor dentro dessa faixa. Todas as faixas são inclusivas e combináveis. Quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente “cerca de”, ficará entendido que o valor em particular forma uma outra modalidade. A referência a um valor numérico específico inclui pelo menos que esse valor específico, a menos que o contexto claramente dite o contrário.

[0096] Deve ser apreciado que certos recursos das composições e métodos revelados que são, a título de clareza, descritos no presente documento no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidos em combinação em uma única modalidade. Adversamente, vários recursos das composições e dos métodos revelados que são, a título de brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação.

[0097] Como usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o” ou “a” incluem o plural.

[0098] Conforme usado no presente documento, “fusionar” ou “fusionando” se refere a criar uma ligação química entre as espécies reativas químicas. No contexto desta revelação, fusionar mais frequentemente se refere a incorporar elementos específicos em um oligonucleotídeo. Por exemplo, uma corrida de nucleotídeos de timina pode ser fusionada à extremidade 3’ de um oligonucleotídeo.

[0099] Conforme usado no presente documento, “sequência de G-quarteto” se refere a um alongamento de resíduos de guanina consecutivos perto da extremidade 5’ de um oligonucleotídeo que possibilita que o oligonucleotídeo interaja com outras sequências de G-quarteto para formar um G-quarteto. O G-quarteto intensifica as propriedades imunoestimulatórias do ácido nucleico. Por exemplo, os oligonucleotídeos que compreendem as sequências de G- quarteto podem interagir, resultando em G-quartetos. As sequências de G-quarteto que ocorrem na região de promotor de um gene podem formar estruturas quaternárias envolvidas na expressão de regulação do gene. Embora uma sequência de G-quarteto não seja limitada a qualquer sequência específica, um exemplo de uma sequência de G-quarteto é TGGGGT (SEQ ID NO: 265).

[0100] Conforme usado no presente documento, “sequência G-wire”, “sequência de G wire”, “sequência de Gwire”, e termos relacionados, se referem a uma pluralidade, mais frequentemente dois, de pelo menos quatro nucleotídeos de guanina consecutivos. As pluralidades de nucleotídeos de guanina, localizadas em ou perto da terminação 5’ de um oligonucleotídeo, são separadas por dois ou mais nucleotídeos de não guanina (isto é, nucleotídeos de timina). As sequências G-wire são capazes de interagir com outras sequências G-wire para formar uma estrutura de G-wire. Uma estrutura de G-wire pode intensificar as propriedades imunoestimulatórias de um ácido nucleico. Uma sequência G- wire exemplificativa é GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) ou GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO: 258).

[0101] Conforme usado no presente documento, os termos “sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina”, “sequência enriquecida por guanina”, e semelhantes, se referem a sequências de ácidos nucleicos que compreendem uma corrida de nucleotídeos de guanina consecutivos, normalmente entre quatro a seis nucleotídeos de guanina, ou uma região de um ácido nucleico, tipicamente em ou perto da extremidade 5’ de um oligonucleotídeo que tem mais nucleotídeos de guanina que os nucleotídeos de adenina, citosina ou timina. Uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina conforme revelado no presente documento pode intensificar as propriedades imunoestimulatórias de um oligonucleotídeo. As sequências de G-quarteto e G-wire são ambos os tipos de sequências enriquecidas por nucleotídeo de guanina.

[0102] Conforme usado no presente documento, “inserir” se refere a adicionar nucleotídeo (ou nucleotídeos) específico em posições específicas durante a síntese de um oligonucleotídeo.

[0103] Conforme usado no presente documento, “orientação paralela” se refere à interação direcional entre diferentes oligonucleotídeos. Por exemplo, a ilustração circulada na FIG. 23B demonstra quatro oligonucleotídeos que têm orientação paralela, como o tetrâmero de oligonucleotídeos são posicionados paralelos entre si. Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos individuais podem ser orientados na mesma direção de 5’ a 3’.

[0104] O termo “indivíduo” conforme usado no presente documento é destinado a significar qualquer animal, incluindo qualquer tipo de ave, mamífero ou espécie aquática e, em particular, galinhas. Os indivíduos podem ser tratados com o uso dos métodos revelados e com as composições reveladas.

[0105] O termo “teste de TLR21”, ou variações do mesmo, se refere a administrar oligonucleotídeos à linhagem celular HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 descrita no Exemplo 2 para determinar se o oligonucleotídeo estimula TLR21.

[0106] Vários termos relacionados aos aspectos da descrição são usados por todo o relatório descritivo e as reivindicações. Tais termos devem receber seu significado comum na técnica a menos que seja indicado o contrário. Outros termos especificamente definidos devem ser interpretados de uma maneira consistente com as definições fornecidas no presente documento.

[0107] São reveladas no presente documento linhagens celulares HEK293 recombinantes que compreendem um gene resistente à blasticidina e um construto de gene repórter de SEAP sintético (“NFκB-SEAP”) assim como uma linhagem celular estável cotransfectada com o construto de NFκB-SEAP e um construto de TLR21 de galinha (HEK293-NFκB-bsd-cTLR21). Essa última linhagem celular pode ser empregada para testar as propriedades imunoestimulatórias mediadas por TLR21 de compostos candidatos. Conforme demonstrado nos exemplos, a linhagem celular de HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 pode ser usada para identificar os oligonucleotídeos capazes de elicitar uma resposta imune mediada por TLR21.

[0108] Os oligonucleotídeos e métodos para seu uso na ativação ou, de outro modo, estimulação de TLR21 também são fornecidos no presente documento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem pelo menos um marcador molecular associado a patógeno (PAMP), especificamente um motivo de CpG de dinucleotídeo não metilado, que interage com receptores de reconhecimento de patógeno expresso no organismo hospedeiro. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos também têm uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina. Essas sequências podem facilitar o dobramento de uma fita de DNA em uma estrutura quaternária ou, no caso de oligonucleotídeos, promover a agregação de um ou mais oligonucleotídeos que compreendem a sequência. Demonstra-se no presente documento que a imunogenicidade de oligonucleotídeos que têm motivos de dinucleotídeo de CpG pode ser intensificada se o oligonucleotídeo compreende adicionalmente uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina. A sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina não precisa ser compreendida somente de nucleotídeos de guanina, mas deve ser enriquecida. Uma sequência enriquecida por guanina, conforme descrito acima e conforme exemplificado ao longo dessas revelações, é um segmento de um oligonucleotídeo que compreende mais nucleotídeos de guanina do que qualquer outro resíduo (isto é, nucleotídeos de adenina, citosina, timina). Em algumas modalidades, a manipulação adicional da sequência de oligonucleotídeos e da estrutura pode intensificar adicionalmente a habilidade do oligonucleotídeo de estimular TLR21. Portanto, uma modalidade da presente revelação compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0109] Foi anteriormente mostrado que a adição de nucleotídeos de desoxiguanina (dG) à extremidade 3’ de um CpG que contém ativação de TLR9 intensificada por oligonucleotídeo in vitro. Devido ao fato de que TLR9 e o equivalente funcional de mamífero de TLR21 de galinha, esperava-se que corridas de 3’ dG também aprimorassem a imunogenicidade de oligonucleotídeos designados para ativar TLR21. Surpreendentemente, não é verdade para sequências enriquecidas por nucleotídeo de guanina 3’ na ativação de TLR21. Os oligonucleotídeos que têm corridas 3’ de dois ou mais dGs falharam em ativar TLR21 (FIGs. 4A e 4B), enquanto a adição de corridas de dG à extremidade 5’ do CpG que contém imunogenicidade significativamente aprimorada por oligonucleotídeo do oligonucleotídeo.

[0110] Não apenas a posição da sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina no oligonucleotídeo afeta a intensificação da ativação de TLR21, como o teor da sequência tem um efeito também. Por essa razão, em algumas modalidades da presente revelação, a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina consecutivos. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende dois a oito nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende dois nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende três nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende quatro nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende cinco nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende seis nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende sete nucleotídeos de guanina. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende oito nucleotídeos de guanina. Em ainda outros aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende mais de oito nucleotídeos de guanina.

[0111] Em algumas modalidades da presente invenção, um oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 92, 93, 96, 97, 100, 102, 104, 106, 108 ou 143. Em algumas modalidades, a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, ou TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264). Em ainda outras modalidades, o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 ou 138.

[0112] Uma única corrida de dG não é apenas a modificação de 5’ que pode intensificar a estimulação de TLR21. Por exemplo, as sequências enriquecidas por nucleotídeos de adenina, citosina e timina também podem ser adicionadas à extremidade 5’ de um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de CpG e resultam na estimulação intensificada de TLR21, embora menos que isso seja elicitado pelas sequências enriquecidas por guanina na extremidade 5’ do oligonucleotídeo (vide FIGs. 8A e 8B). Embora uma única pluralidade de resíduos de guanina na extremidade 5’ do oligonucleotídeo possa elicitar a estimulação de TLR21, pluralidades adicionais de nucleotídeos de guanina na sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina podem intensificar adicionalmente as propriedades estimulatórias do oligonucleotídeo. Então, em alguns aspectos, o oligonucleotídeo da presente revelação compreende uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0113] Em alguns aspectos, a pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende uma sequência de G-quarteto. Em algumas modalidades, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina, a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina, ou ambas compreendem uma sequência de G-quarteto. As sequências de G-quarteto, conforme definido acima, permitem a interação entre oligonucleotídeos. Sem se ater à teoria, a interação dos oligonucleotídeos por meio de sequências de G-quarteto permite a concentração de motivos de dinucleotídeo de CpG e uma probabilidade intensificada correspondente de reconhecimento por TRL21. As sequências de G-quarteto também fornecem a oportunidade de múltiplas interações de receptor de TLR21 (intensificação avidez) e para a reticulação de receptor. Em algumas modalidades, a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente pelo menos um oligonucleotídeo adicional que tem uma sequência de G-quarteto, em que o oligonucleotídeo e o pelo menos um oligonucleotídeo adicional têm uma orientação paralela em uma estrutura quaternária. Em alguns aspectos, a sequência de G-quarteto compreende TGGGGT (SEQ ID NO: 265).

[0114] Uma sequência G-wire é uma outra sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que pode ser adicionada à 5’ de um oligonucleotídeo que tem motivos de CpG. Em alguns aspectos da presente revelação, a primeira e a segunda pluralidades de nucleotídeos de guanina compreendem uma sequência G-wire. Em alguns aspectos, a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258. Em ainda outros aspectos, a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203 ou GCGT-Gwire3. As duas pluralidades de nucleotídeos de guanina podem ser separadas por nucleotídeos de não guanina, análogos de nucleotídeo ou qualquer outro espaçador ou ligante. Por exemplo, em alguns aspectos da presente revelação, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina são separadas por pelo menos um nucleotídeo. Conforme usado no presente documento, o termo “espaçador” se refere a uma ligação química entre motivos de nucleotídeo semelhantes, isto é, entre dois motivos de CpG ou entre dois motivos de sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina, enquanto o termo “ligante” se refere a uma ligação química entre diferentes motivos de nucleotídeo, isto é, entre uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina e um outro motivo de nucleotídeo, por exemplo, um motivo de CpG. Os termos “espaçador” e “ligante” são usados por questão de clareza na descrição cujo aspecto de um oligonucleotídeo está sendo discutido. No entanto, será compreendido por aqueles versados na técnica que as estruturas reveladas no presente documento para espaçadores podem ser intercambiáveis com as estruturas reveladas no presente documento para ligantes, e vice-versa.

[0115] Sem se ater a qualquer teoria específica, é possível que uma sequência G-wire possibilite que um oligonucleotídeo interaja, e agregue, com outros oligonucleotídeos que têm sequências G-wire. Esse acúmulo de oligonucleotídeos e seus motivos de CpG pode levar à estimulação intensificada de TLR21.

[0116] As sequências enriquecidas por nucleotídeo de guanina em um oligonucleotídeo podem ser separadas dos motivos de nucleotídeo de CpG por nucleotídeos, análogos de nucleotídeo, ou outros ligantes. Portanto, em algumas modalidades da presente revelação, o oligonucleotídeo compreende adicionalmente um ligante entre a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina e a jusante pelo menos um motivo de CpG. O ligante não precisa ser diretamente adjacente a qualquer sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina ou ao motivo de CpG, mas o ligante deve residir entre os dois motivos de sequência independentemente de intervir nas sequências entre a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina e o ligante, assim como entre o motivo de CpG e o ligante. Em algumas modalidades das presentes revelações, o ligante compreende pelo menos três nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ligante pode não compreender bases nitrogenosas. Por exemplo, em alguns aspectos, o ligante é um hexaetilenoglicol, um propanodiol, um trietilenoglicol ou derivados dos mesmos. Em outros exemplos, o oligonucleotídeo que tem um ligante compreende 2006-PDE5dG4-X1 ou 2006-PDE5dG4-X3.

[0117] Acredita-se que os motivos de dinucleotídeo de CpG presentes nos oligonucleotídeos da presente revelação sejam PAMPs reconhecidos por TLR21 em galinhas. Embora mesmo um único motivo de CpG possa estimular TLR21, múltiplos CpGs presentes em um oligonucleotídeo podem aumentar a intensidade de sinal de TLR21 estimulado. Por essa razão, em alguns aspectos da presente invenção, o pelo menos um motivo de CpG compreende dois, três, quatro ou cinco motivos de CpG. Em alguns aspectos, o pelo menos um motivo de CpG compreende seis ou mais motivos de CpG. Em alguns aspectos, o pelo menos um motivo de CpG compreende dois motivos de CpG. Em alguns aspectos, o pelo menos um motivo de CpG compreende três motivos de CpG. Em alguns aspectos, o pelo menos um motivo de CpG compreende quatro motivos de CpG. Em algumas modalidades, o pelo menos um motivo de CpG compreende quatro motivos de CpG.

[0118] Em algumas modalidades dos oligonucleotídeos presentemente revelados, cada motivo de CpG pode ser separado dos outros motivos de CpG por pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo. Em alguns aspectos, o pelo menos um nucleotídeo é dois ou três nucleotídeos de timina. Em outros aspectos, o pelo menos um nucleotídeo é entre um e quatro nucleotídeos, embora o número de nucleotídeos intervenientes pode diferir dependendo da sequência dos nucleotídeos intervenientes. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 217, 218, 219 ou 220. Os nucleotídeos adjacentes a um motivo de CpG–juntamente com o próprio motivo de CpG constituem um elemento de sequência de CpG (por exemplo, XCGX, em que X = qualquer nucleotídeo). Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da presente revelação, compreendem elementos de sequência de CpG que são GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT, TCGC, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0119] Em algumas modalidades das presentes revelações, o motivo de CpG compreende um elemento de sequência de CpG que tem quatro nucleotídeos. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois elementos de sequência de CpG. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende pelo menos três elementos de sequência de CpG. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende pelo menos quatro elementos de sequência de CpG. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende pelo menos cinco elementos de sequência de CpG. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende pelo menos seis elementos de sequência de CpG. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende mais de oito,

dez, quinze ou até mesmo vinte elementos de sequência de CpG.

[0120] Em outras modalidades dos oligonucleotídeos presentemente revelados, cada um dos motivos de CpG são separados entre outro motivo de CpG por um espaçador ou uma combinação de um espaçador e pelo menos um nucleotídeo. Em alguns aspectos, pelo menos um motivo de CpG é separado do outro motivo de CpG mais próximo por um espaçador ou uma combinação de um espaçador e pelo menos um nucleotídeo, enquanto pelo menos dois outros motivos de CpG são adjacentes entre si. Embora os motivos de CpG separados possam intensificar as capacidades imunoestimulatórias dos oligonucleotídeos designados, é reconhecido que os motivos de CpG adjacentes entre si podem ainda estimular TLR21.

[0121] O espaçador empregado para separar linearmente os motivos de CpG pode ser qualquer ligação que faça ponte com pelo menos uma porção do oligonucleotídeo entre os motivos de CpG. O espaçador pode ser compreendido de, mas não necessariamente limitado a, uma ponte de desoxirribosefosfato, uma cadeia de múltiplos carbonos ou uma unidade química repetida. Uma propriedade essencial de um espaçador é a habilidade formar uma ligação química com a cadeia principal de nucleotídeo do oligonucleotídeo. Portanto, em algumas modalidades, o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato. A ponte de desoxirribosefosfato pode compreender bases nitrogenosas, em alguns aspectos, enquanto em outros, a ponte de desoxirribosefosfato é abásica. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:221, que compreende uma ponte de desoxirribosefosfato abásica.

[0122] Em outras modalidades da presente revelação, o espaçador compreende uma cadeia de carbono. A cadeia de carbono pode compreender dois a doze átomos de carbono. Os dióis que compreendem uma cadeia de carbono podem ser usados à medida que os grupos álcool terminal podem reagir com grupos álcool terminal e/ou fosfato de um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono, e em alguns aspectos, a cadeia de carbono é derivada de etanodiol. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende ODN-X2, em que X2 é etanodiol.

[0123] Outras modalidades da presente revelação fornecem a cadeia de carbono que compreende três átomos de carbono. Em alguns aspectos dessas modalidades, a cadeia de carbono é derivada de 1,3-propanodiol. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende CG-Gw2X2, CG-Gw2X2-2, ou ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG-G4T16X2- 1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4, ou CG-G4T16X2- 5, em que X2 é uma cadeia de três carbonos;2006-PDE5dG4-X2, em que X2 é uma cadeia de três carbonos derivados de 1,3- propanodiol; ou 2006-PDE5dG4-X4, em que X4 é uma cadeia de três carbonos derivada de 1,3-propanodiol.

[0124] Em ainda outras modalidades da presente revelação, o oligonucleotídeo compreende uma cadeia de carbono espaçador, em que a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono. Em alguns aspectos dessas modalidades, a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende ODN-X4, em que X4 é uma cadeia de quatro carbonos derivada de 1,4-butanodiol.

[0125] Em ainda outras modalidades das presentes revelações, o oligonucleotídeo compreende um espaçador que tem uma unidade química repetida. Por exemplo, em algumas modalidades, a unidade química repetida é um etileno glicol. A unidade química repetida pode ser repetida duas a doze vezes. Em algumas modalidades, etileno glicol é repetido seis vezes. Então, em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende CCGC-Gw2X1, em que X1 é um espaçador derivado de hexaetilenoglicol.

[0126] Embora as corridas de dG na terminação 3’ de um oligonucleotídeo resultem em pouca, caso haja, estimulação de TLR21, outras corridas de nucleotídeo podem conferir imunogenicidade intensificada ao oligonucleotídeo. Especialmente, em alguns aspectos das presentes revelações, o oligonucleotídeo pode compreender adicionalmente um terminal 3’ de nucleotídeo de tri-timina. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215.

[0127] Para cada oligonucleotídeo revelado no presente documento, um versado na técnica saberia que um nucleotídeo pode ser substituído por um análogo de nucleotídeo. Os oligonucleotídeos, em algumas modalidades, compreendem uma cadeia principal de fosfodiéster, embora outras modalidades dos oligonucleotídeos reveladas no presente documento compreendam uma cadeia principal de fosforotioato.

[0128] Em algumas modalidades da presente revelação, o oligonucleotídeo pode compreender uma fração de lipídio, que pode levar a um aumento na imunogenicidade do oligonucleotídeo. Uma explicação possível para a imunogenicidade aumentada é que a fração de lipídio pode funcionar para intensificar a biodisponibilidade do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a fração de lipídio está no ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo. Essa “capa” de lipídio pode impedir a degradação, aumentar a solubilidade, aprimorar a estabilidade do oligonucleotídeo em uma composição farmacêutica, pode levar a ligandos de polidentato via micela ou outra formação de agregado, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a fração de lipídio é um colesterol.

[0129] Devido ao fato de que os oligonucleotídeos revelados estimulam uma resposta imune intensificada por meio de TLR21, outras modalidades da presente revelação incluem métodos de prevenir ou tratar doença administrando- se a um indivíduo com necessidade do mesmo a um oligonucleotídeo imunoestimulatório presentemente revelado.

[0130] Também são fornecidas composições imunoestimulatórias que compreendem um oligonucleotídeo imunoestimulatório presentemente revelado. Embora essas composições imunoestimulatórias compreendam um oligonucleotídeo conforme descrito no presente documento, as composições também podem incluir outros componentes que afetam a imunogenicidade, eficácia e eficiência da composição. Por exemplo, em alguns aspectos, a composição imunoestimulatória compreende um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável adapta a composição para a administração por uma via selecionada dentre intravenosa, intramuscular, intramamária, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, por meio de aspersão, por meio de aerossol, em ovo, mucosal, transdérmica, por meio de imersão, oral, intraocular, intratracal, intranasal, pulmonar, retal, ou outro meio conhecido por aqueles que são versados na técnica.

O carreador (ou carreadores) farmaceuticamente aceitável pode ser um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a composição imunoestimulatória é administrada.

Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem petroleira, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares.

Por exemplo, 0,4 % de solução salina e 0,3 % de glicina podem ser usados.

Essas soluções são estéreis e geralmente livres de material particulado.

As mesmas podem ser esterilizadas por meio de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas como agentes de ajuste de pH e agentes tampão, agentes de estabilização, espessamento, lubrificação e colorantes, etc.

A concentração das moléculas da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,5 %, normalmente a pelo menos cerca de 1 % a tanto quanto 15 ou 20 % em peso e será selecionado principalmente com base na dose necessária, volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo de administração específico selecionado.

Os veículos e as formulações adequados, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing páginas 691-1092, vide especificamente páginas 958-989.

[0131] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo e o carreador estão ligados. Conforme usado para descrever a relação entre o oligonucleotídeo e o carreador, “ligado” se refere a associação física do oligonucleotídeo e do carreador. Quando o oligonucleotídeo e o carreador forem ligados entre si, interagem entre si ou são combinados, acoplados ou unidos de outro modo, os mesmos podem ser considerados ligados.

[0132] As composições imunoestimulatórias descritas no presente documento compreendem adicionalmente um hapteno em algumas modalidades. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo imunoestimulatório está ligado ao hapteno. O hapteno pode elicitar uma imunorresposta contra um microrganismo específico, como, mas sem limitação, E. coli ou Salmonella, enquanto o oligonucleotídeo imunoestimulatório elicita uma imunorresposta não específica mediada por interação de TLR21 com o oligonucleotídeo. Esses e outros microrganismos infecciosos são de preocupação específica em alojamentos de incubadora de grande escala em que os habitantes estão em risco aumentado de infecção.

[0133] Algumas modalidades das composições imunoestimulatórias fornecem uma vacina para prevenir ou tratar doença infecciosa que compreende pelo menos um dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios descritos no presente documento. Para um oligonucleotídeo elicitar qualquer resposta imune, o mesmo deve ser efetivamente liberado para seu alvo, enquanto o alvo é uma cultura celular, uma galinha ou um outro vertebrado. Portanto, um aspecto da presente revelação fornece um vetor que compreende um oligonucleotídeo imunoestimulatório descrito no presente documento.

[0134] A potência do oligonucleotídeo imunoestimulatório e, portanto, a composição imunoestimulatória que compreende apenas o oligonucleotídeo como um ingrediente ativo, pode ser medida por sua meia concentração eficaz máxima (EC50). EC50 é uma medição da concentração da composição imunoestimulatória que induz uma resposta que é metade da resposta máxima que pode ser obtida administrando-se a composição. Quanto menor a concentração, mais potente o oligonucleotídeo. Em alguns aspectos da presente revelação, a composição imunoestimulatória pode ter uma EC50 na faixa de pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 0,1 e 100 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 100 e 200 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 200 e 300 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 300 e 400 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 400 e 500 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 500 e 600 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 600 e 700 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 700 e 800 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 800 e 900 pM. Em alguns aspectos, a EC50 está entre cerca de 900 e 1 nM. Em ainda outros aspectos, a EC50 é menor que cerca de 100 pM.

[0135] Em relação à concentração do oligonucleotídeo na composição imunoestimulatória, em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 0,1 e 10 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 10 e 20 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 20 e 30 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 30 e 40 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 40 e 50 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 50 e 60 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 60 e 70 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 70 e 80 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 80 e 90 nM. Em alguns aspectos, a concentração do oligonucleotídeo está entre cerca de 90 e 1 µM. Em ainda outros aspectos, a concentração do oligonucleotídeo é menor que cerca de 20 nM.

[0136] A composição imunoestimulatória pode compreender adicionalmente pelo menos um oligonucleotídeo adicional que tem uma sequência G-wire em algumas modalidades da presente revelação. Devido ao fato de que a sequência G-wire facilita a agregação de outros oligonucleotídeos que têm a mesma, ou semelhante, sequência G-wire, um aspecto da composição imunoestimulatória compreende adicionalmente pelo menos um oligonucleotídeo adicional que tem uma sequência G-wire. Em alguns aspectos em que a composição imunoestimulatória compreende múltiplos oligonucleotídeos que têm sequências G- wire, o oligonucleotídeo e o pelo menos um oligonucleotídeo adicional têm uma conformação de G-wire.

[0137] Também são fornecidos no presente documento métodos de estimulação de receptor semelhante a toll 21 (TLR21) que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo. Os métodos também são fornecidos para elicitar uma resposta imune em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo um oligonucleotídeo imunoestimulatório que tem pelo menos um motivo de dinucleotídeo de CpG e pelo menos uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa no ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0138] O oligonucleotídeo pode ser administrado na forma de uma composição imunoestimulatória conforme descrito acima. A composição imunoestimulatória pode compreender adicionalmente um hapteno, um carreador farmaceuticamente aceitável, ou ambos, conforme descrito acima. A administração da composição imunoestimulatória, em alguns aspectos, pode ser realizada ide modo intravenoso, intramuscular, intramamário, intradérmico, intraperitoneal, subcutâneo, por meio de aspersão, por meio de aerossol, em ovo, de modo mucosal, transdérmico, por meio de imersão, de modo oral, intraocular, intratraqueal ou intranasal. O indivíduo com necessidade da administração é um animal. Em alguns aspectos, o indivíduo é um membro de uma espécie de ave. Por exemplo, a composição imunoestimulatória revelada no presente documento pode ser administrara em ovo a um ovo de galinha embrionado ou de modo intramuscular a pintos chocados ou até mesmos aves adultas.

[0139] Também são fornecidos no presente documento métodos para aumentar a atividade estimulatória de TLR21 de um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de CpG que compreende fusionar a extremidade 5’ do oligonucleotídeo a uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina. Em alguns aspectos, a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina é uma sequência de G-quarteto. Em alguns aspectos, a sequência de G-quarteto compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina. Essa primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina pode compreender parte de uma sequência de TGGGGT (SEQ ID NO: 265). Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende três a oito nucleotídeos de guanina. Em ainda outros aspectos, a sequência de G-quarteto compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, ou TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264).

[0140] Outras modalidades das presentes revelações fornecem a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina para compreender uma primeira e uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina. Em outros aspectos, a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma sequência G-wire. Em alguns aspectos, a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258. Em ainda outros aspectos do método, a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina são separadas por pelo menos um nucleotídeo.

[0141] O método conforme revelado no presente documento pode compreender adicionalmente, em algumas modalidades, inserir um ligante entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG. O ligante foi descrito acima e pode compreender, mas sem limitação, pelo menos três nucleotídeos ou um hexaetileno glicol.

[0142] A habilidade de um oligonucleotídeo de estimular

TLR21 pode ser adicionalmente intensificada de acordo com alguns aspectos da invenção aumentando-se o número de motivos de CpG no oligonucleotídeo. Em alguns aspectos, o pelo menos um motivo de CpG é uma pluralidade de motivos de CpG, e a pluralidade de motivos de CpG compreende dois, três, quatro, ou cinco motivos de CpG. A distância entre os motivos de CpG pode influenciar as propriedades estimulatórias de TLR21 do oligonucleotídeo. Por essa razão, alguns aspectos do método revelado fornecem inserir pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo entre os motivos de CpG. O pelo menos um nucleotídeo pode ser dois ou três nucleotídeos de timina.

[0143] Outras modalidades do método fornecem inserir um espaçador entre cada um dos motivos de CpG. O espaçador deve ser capaz de se ligar ao terminal 3’ de uma fita de nucleotídeo adjacente e à extremidade 5’ da outra fita de nucleotídeo. Em alguns aspectos, o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato, que pode ser abásica em alguns aspectos.

[0144] O espaçador, em alguns aspectos, pode compreender uma cadeia de carbono. Em algumas modalidades, a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono. Em alguns aspectos, a cadeia de carbono é derivada de etanodiol. Outras modalidades fornecem uma cadeia de carbono que compreende três átomos de carbono. Em alguns aspectos, a cadeia de carbono é derivada de 1,3-propanodiol. Em algumas modalidades, a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono, e em alguns aspectos, a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol. Em ainda outras modalidades, o espaçador compreende uma unidade química repetida. Em alguns aspectos, a unidade química repetida é um etileno glicol, e em alguns aspectos, o espaçador é derivado de hexaetilenoglicol.

[0145] Também é planejado no método para intensificar as propriedades estimulatórias de TLR21 de um oligonucleotídeo é a incorporação de pelo menos um análogo de nucleotídeo ou fração de lipídio no oligonucleotídeo. Em alguns aspectos, a fração de lipídio está no ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo. Ainda outras modalidades do método incluem modificar os nucleotídeos adjacentes ao motivo de CpG.

EXEMPLOS

[0146] Os seguintes exemplos são fornecidos para descrever adicionalmente algumas das modalidades reveladas no presente documento. Os exemplos pretendem ilustrar, não limitar, as modalidades reveladas. Exemplo 1: Geração de uma linhagem celular HEK293 de gene repórter de trajetória de NFκB

[0147] pNifTy2-SEAP (Invivogen) e outros vetores de plasmídeo comercialmente disponíveis são rotineiramente usados para gerar linhagens celulares de gene repórter de trajetória de NFκB. A forma comercialmente disponível de pNifTy2-SEAP compreende um gene resistente a zeocina para seleção bacteriana e de mamífero, que requer grandes quantidades dessa citostática (até 400 µg/ml), e a seleção, às vezes, não é confiável. Portanto, a geração de um plasmídeo repórter com melhores marcadores de seleção, de preferência, uma resistência à blasticidina, foi iniciada.

[0148] O quadro de leitura aberta que codifica o gene SEAP (fosfatase alcalina embriônica secretada) codificado por pNifty2-SEAP-encoded foi sintetizado em uma forma otimizada por códon humano. A região de 284 bp em pNifty2-SEAP a montante do códon de partida de ATG, que abrange cinco sítios de reconhecimento de NFκB e um sítio de promotor de molécula de adesão de leucócito endotelial (ELAM), também foi sintetizada com a seguinte modificação: um sítio de KpnI foi construído imediatamente a montante do códon de partida de ATG (inserção da sequência “GGTA”), e adicionalmente a montante, uma sequência foi introduzida consistindo em 5’a 3’ um sítio de EcoRV, um de MluI e um de NdeI. Ademais, a jusante do códon de parada, um sítio de NheI e um segundo sítio de EcoRV foram introduzidos. Tomou-se cuidado para evitar a presença desses sítios no quadro de leitura aberta de SEAP. NFκB-SEAP (códon humano otimizado) (SEQ ID NO:1) (O sublinhado mostra os sítios de enzima de restrição usados para subclonagem (MluI e NdeI ). Os códons ATG de partida e TAA de parada são enfatizados em negrito.)

GATATCACGCGTCAATTGGGATCTGCGATCGCTGAATTCTGGGGACTTTCCACTGGGGA CTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTGGGGACTTTCCACTCCTGCAGC AGTGGATATTCCCAGAAAACTTTTTGGATGCAGTTGGGGATTTCCTCTTTACTGGATGT GGACAATATCCTCCTATTATTCACAGGAAGCAATCCCTCCTATAAAAGGGCCTCAGCAG AAGTAGTGTTCAGCTGTTCTTGGCTGACTTCACATCAAAGCTTCTATACTGACCTGAGA CAGAGGGTACCATGGTGCTGGGTCCATGCATGCTGCTGCTCCTTCTGCTGCTGGGACTT CGATTGCAGCTGTCTCTGGGCATTATACCCGTTGAGGAAGAGAATCCAGACTTTTGGAA CAGAGAAGCAGCCGAGGCGCTTGGAGCAGCTAAGAAACTTCAACCAGCTCAGACTGCAG CCAAGAACCTGATCATCTTCCTGGGCGATGGCATGGGTGTGTCAACGGTTACTGCCGCT AGGATCCTGAAAGGCCAGAAGAAAGACAAACTGGGTCCCGAAATTCCTCTCGCCATGGA CAGGTTCCCCTACGTTGCTCTGAGCAAGACCTATAATGTGGACAAGCACGTCCCAGATA GCGGAGCCACAGCTACCGCCTATCTGTGTGGTGTGAAGGGCAATTTTCAGACAATCGGA CTCTCCGCTGCCGCTCGGTTCAACCAGTGCAACACGACTAGGGGCAATGAGGTGATTTC CGTGATGAATCGCGCCAAGAAGGCGGGGAAAAGCGTAGGGGTGGTCACTACTACTCGGG TTCAGCACGCTTCTCCCGCCGGCACCTACGCTCACACCGTGAATCGAAACTGGTACTCC GACGCTGACGTGCCGGCATCAGCACGGCAGGAAGGATGCCAAGACATCGCCACACAGCT GATCAGTAACATGGACATAGACGTAATTCTGGGCGGTGGGCGGAAGTACATGTTTCGGA TGGGGACTCCTGATCCCGAGTATCCCGACGACTACTCTCAGGGTGGTACACGACTCGAC GGCAAGAACCTGGTCCAGGAATGGCTTGCCAAGCGGCAAGGGGCGAGATACGTCTGGAA TCGCACAGAACTGATGCAAGCCTCCTTGGATCCTTCCGTGACCCACTTGATGGGCTTGT TTGAGCCTGGGGATATGAAGTATGAGATCCACCGCGATTCTACCCTGGATCCTTCTCTG ATGGAGATGACCGAAGCAGCCCTCAGGCTGCTGAGTCGGAATCCAAGGGGCTTCTTCTT GTTCGTTGAGGGAGGCCGTATTGACCATGGGCACCATGAGTCAAGAGCGTATAGAGCCC TCACCGAAACCATCATGTTTGACGATGCCATAGAGAGGGCAGGACAGCTGACGAGTGAG GAGGATACACTCAGCCTGGTGACCGCAGATCACAGCCACGTCTTTAGCTTCGGCGGTTA TCCGCTTCGTGGAAGCTCCATTTTCGGACTGGCACCAGGGAAAGCCAGAGATCGCAAAG CTTACACAGTCCTCCTCTATGGAAACGGACCCGGGTATGTACTGAAAGATGGCGCTCGT CCGGACGTGACCGAGAGCGAATCAGGAAGTCCCGAATACAGGCAACAGTCCGCGGTTCC CCTTGATGAAGAGACTCACGCCGGGGAGGACGTGGCCGTGTTTGCGAGAGGGCCTCAGG CCCATCTCGTGCATGGGGTACAGGAGCAGACATTCATTGCCCATGTCATGGCTTTTGCC GCCTGTCTGGAACCATACACGGCATGTGATCTGGCTCCTCCTGCTGGCACAACCGATGC AGCACATCCAGGCAGATCTCGCAGCAAACGCTTGGACTGACTTAAGGCTAGCGATATC

[0149] Esse construto de gente de SEAP sintético (“NFκB- SEAP”) foi excisado de um vetor de clonagem pela digestão dupla de MluI/NheI e introduzido por meio da ligação a um vetor de pcDNA3.1(+) (FIG. 1), pré-cortar com MluI/NheI e purificado com gel para remover a região de promotor de CMV. As versões domésticas de pcDNA3.1(+), em que o gene resistente à neomicina (NeoR/KanR) foram substituídas por um gene resistente à blasticidina (bsd  pcDNA3.1(+)-bsd) ou um gene resistente à puromicina (puro  pcDNA3.1(+)-puro) foram processados do mesmo modo e ligado com o construto de NFκB-SEAP.

[0150] Desse conjunto de construtos, o plasmídeo que contém bsd pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP foi escolhido para transfecção de HEK293. Para esse fim, a forma linearizada por PvuI foi introduzida nas células por meio de métodos de transfecção padrão e as células com um construto integrado em genoma foram selecionados com 10 µg/ml de blasticidina. Os agrupamentos celulares resistentes foram testados para produção de SEAP induzida por fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e por meio de clonagem de célula única, uma linhagem clonal (HEK293-NFκB-SEAP-bsd ou HEK293-NFκB-bsd) com uma razão de sinal para ruído particularmente vantajosa foi escolhida para estudos adicionais. A EC50 para TNF-α humano para essa linhagem celular é 3,2 ng/ml (FIG. 2). Exemplo 2: Geração de uma linhagem celular transgênica de TLR21 de galinha

[0151] O receptor semelhante a toll 21 (TLR21) de galinha é um receptor de DNA de CpG não metilado que é funcionalmente homólogo, mas não ortólogo, a TLR9 de mamífero (Brownlie et al. 2009, Keestra et al. 2010). O gene que codifica TLR21 de galinha foi sintetizado com base na sequência de proteínas deduzidas de número de acesso Genbank NM_001030558 e otimizando-se no sentido do uso de códon humano. A montante do códon de partida ATG, um sítio de KpnI que inclui uma sequência de Kozak foi introduzida, enquanto a jusante do códon de parada um sítio de NotI e um sítio de EcoRV foram adicionados. O gene TLR21 foi excisado do vetor de clonagem por meio de digestão dupla de KpnI/NotI, purificado por gel e ligado ao vetor de expressão de mamífero de KpnI/NotI-cut pcDNA3.1(+). Esse pcDNA3.1(+)-cTLR21 foi linearizado com PvuI e transfectado juntamente com pcDNA3.1(+)-bsd-NFκB-SEAP linearizado por PvuI em HEK293 que resulta em HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 ou HEK293–bsd-cTLR21.

[0152] Um agrupamento celular foi selecionado por meio de aplicação simultânea de blasticidina e G418, testada quanto à trajetória de NFκB funcional por TNF-α e para cTLR21 ativo por meio de oligonucleotídeo de fosforotioato 2006-PTO (SEQ ID NO:3). A clonagem de única célula levou a uma linhagem celular clonal com excelente razão de sinal para ruído em resposta a 2006-PTO. A linhagem celular de HEK293-NFκB-bsd- cTLR21 clonal mostrou excelente sensibilidade a TNF-α (EC50 = 1,4 ng/ml), semelhante àquela observada para HEK293-NFκB- bsd (FIG. 2). Gallus gallus TLR21-Gen (com base em NM_001030558) (SEQ ID NO:2) (Os códons ATG de partida e TAG de parada são enfatizados pelo sublinhado.):

CCCGGTACCATGATGGAAACAGCTGAGAAAGCCTGGCCATCTACCAGGATGTGTCCTAG TCACTGCTGTCCCCTCTGGCTGCTGCTGCTTGTTACCGTGACGCTGATGCCAATGGTAC ACCCTTATGGTTTCCGCAACTGCATCGAGGATGTCAAGGCTCCCTTGTACTTTAGGTGT ATCCAGAGATTCCTGCAGAGCCCAGCCCTCGCGGTGAGTGATCTTCCTCCCCATGCCAT TGCCTTGAACTTGAGTTACAACAAGATGCGGTGTCTCCAGCCATCAGCCTTCGCCCACC TGACGCAGTTGCATACGCTGGACCTGACTTACAATCTGCTCGAAACCCTGAGCCCTGGG GCCTTCAATGGCTTGGGCGTCCTCGTGGTGCTCGACCTGTCTCACAATAAGCTGACTAC TCTTGCAGAAGGGGTGTTTAACAGTCTGGGTAATCTGTCCTCCCTGCAAGTGCAGCATA ACCCTCTGAGCACAGTCTCACCATCAGCACTTTTGCCACTGGTCAATCTCCGCAGGCTG AGCCTGCGGGGAGGACGGCTGAATGGACTGGGCGCTGTTGCCGTGGCGGTTCAGGGACT TGCACAGCTTGAGCTGCTGGATCTGTGTGAAAATAATTTGACAACACTGGGACCCGGTC CGCCTCTGCCCGCTAGCCTGCTCACCCTGCAGCTGTGCAACAACTCACTGAGGGAGCTG GCCGGAGGAAGCCCTGAAATGCTGTGGCATGTGAAGATCCTGGATTTGTCATACAACAG CATCTCTCAGGCTGAAGTGTTTACTCAGCTCCACCTCCGCAATATCTCCCTTCTGCACT TGATTGGAAATCCCCTGGATGTGTTCCATTTGCTGGACATATCCGATATACAACCTAGG TCACTGGACTTCTCAGGTCTGGTTCTTGGTGCCCAAGGGCTGGACAAGGTGTGTCTGCG TCTGCAAGGGCCCCAGGCTCTTCGCCGTCTGCAACTTCAGAGAAACGGGCTCAAAGTCC TGCACTGCAACGCCCTGCAGCTTTGCCCCGTGCTGCGAGAGCTGGATCTGTCTTGGAAC CGCCTGCAGCACGTCGGCTGTGCAGGCCGACTCCTCGGGAAGAAACAGCGGGAGAAACT GGAAGTTCTGACCGTGGAACACAATCTTCTGAAGAAACTCCCCAGTTGCTTGGGTGCCC AAGTGCTCCCTAGACTGTATAACGTCAGCTTCCGGTTCAATCGAATCCTGACTGTGGGT CCACAGGCCTTCGCCTATGCACCCGCGCTCCAGGTCCTTTGGCTGAACATTAACTCCCT TGTCTGGTTGGATCGTCAGGCTCTTTGGCGCCTCCATAATCTGACCGAGCTGAGACTTG ATAACAATCTGTTGACAGATCTGTACCACAACTCTTTCATTGACCTTCACAGACTGCGG ACCCTGAATCTCCGGAACAACCGCGTGAGCGTTCTGTTTTCCGGGGTTTTCCAGGGCTT GGCCGAGCTGCAGACCCTGGACCTGGGCGGCAACAATCTGCGACACCTCACAGCTCAGA GTCTGCAGGGCCTCCCAAAGCTGAGGAGGCTGTACCTCGACCGGAATAGACTTCTGGAG GTGTCCTCAACTGTATTTGCTCCCGTTCAAGCCACCCTCGGGGTGCTGGACCTGAGAGC CAACAATCTGCAGTATATCTCCCAGTGGCTTAGGAAACCGCCGCCATTTAGAAACTTGA GCAGCCTGTATGACCTGAAACTGCAGGCCCAGCAGCCGTATGGGCTGAAGATGCTGCCT CACTACTTCTTTCAGGGCCTGGTTAGACTGCAACAGCTCTCCCTTAGCCAAAACATGCT GAGGTCTATCCCACCGGACGTGTTTGAAGATCTCGGACAGCTCCGTAGCCTGGCTCTGG CTGACAGTAGCAATGGGCTGCATGATTTGCCCGACGGCATTTTCCGGAACCTCGGGAAC CTGAGGTTTCTCGATCTTGAGAATGCGGGGTTGCACTCTCTCACCCTGGAGGTCTTTGG AAACCTCTCCCGCCTGCAAGTCCTGCATCTGGCAAGGAACGAACTCAAAACCTTCAATG ACTCTGTGGCAAGCCGGCTGAGCAGCCTTCGCTATCTGGACCTCCGGAAGTGTCCTCTG TCTTGCACTTGCGATAATATGTGGCTGCAGGGGTGGTTGAATAATTCTCGGGTACAGGT AGTGTACCCCTACAACTACACATGCGGATCTCAACACAACGCATACATACACAGCTTTG ACACACATGTCTGCTTTCTGGATCTGGGCTTGTACTTGTTCGCAGGCACCGCTCCTGCT GTACTGCTCCTCCTCGTCGTACCCGTAGTATATCATCGCGCATACTGGCGGTTGAAGTA CCACTGGTATCTTCTGAGATGTTGGGTGAATCAGCGCTGGAGAAGGGAGGAAAAGTGCT ATCTGTATGACTCATTTGTCTCTTACAACAGTGCGGATGAGTCCTGGGTTTTGCAAAAG CTCGTCCCAGAGCTCGAGCATGGGGCCTTCAGATTGTGTCTCCATCACAGGGACTTCCA GCCAGGAAGGAGTATTATCGACAATATCGTGGATGCGGTTTATAACAGTCGTAAAACGG TGTGCGTTGTGTCAAGATCCTACCTTAGATCCGAGTGGTGCAGCCTCGAGGTGCAGCTG GCATCCTATCGACTTCTGGATGAGCGCCGAGACATTTTGGTGCTGGTGCTGCTGGAGGA TGTGGGTGACGCCGAGCTGAGCGCATATCATCGCATGAGGAGAGTGCTGCTGAGGCGCA CATACCTCCGGTGGCCTCTGGATCCAGCCGCTCAACCCCTGTTTTGGGCTAGATTGAAA CGAGCCCTTCGATGGGGCGAGGGCGGAGAAGAGGAGGAAGAAGAAGGTCTGGGAGGCGG CACTGGCCGGCCTCGTGAAGGCGACAAGCAGATGTAGCGGCCGCGATATC

[0153] O oligodesoxinucleotídeo (ODN) de fosforotioato (PTO) 2006-PTO (ODN 2006) é conhecido para ativar TLR21. Keestra, A.M., de Zoete, M.R., Bouwman, L.I., van Putten, J.P., 2010. O TLR21 de galinha é um receptor de DNA de CpG inato distinto do TLR9 de mamífero. J. Immunol. 185, 460-

467. Na linhagem celular de TLR21 clonal desse estudo (HEK293-NFκB-bsd-cTLR21), 2006-PTO também estava ativa, com uma EC50 de ativação de ~ 8,5 nM. Em contrapartida, o HEK293- NFκB-bsd não mostrou qualquer secreção de SEAP (FIG. 3A). Isso demonstra que a interação específica desse ODN é especialmente em TLR21. 2006-PDE, a versão ligada a fosfodiéster de 2006-PTO, era muito mais fraca em sua atividade estimulatória em TLR21. Uma estimativa para sua EC50 é > 250 nM, com estimulação máxima muito menor em comparação com 2006-PTO (FIG. 3B). Exemplo 3: ODN que compreende sequências 5’ de formação de G-quarteto intensifica a atividade de TLR21 Impacto de adições de 3’desoxiguanina (dG) no reconhecimento de TLR21 de 2006-PDE (ODN2006, forma de fosfodiéster)

[0154] A versão ligada a fosfodiéster de 2006-PTO, 2006- PDE, foi usada como uma base para investigar o efeito de modificação de 3’-dG na atividade estimulatória de TLR21 na linhagem celular de HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 descrito no Exemplo 2. Para esse fim, os experimentos de titulação foram realizados começando a 20 nM com 15 etapas de diluição (1:2) que chegam aproximadamente 1 pM com uma diluição final. Especificamente, as células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 foram inoculadas em placas de 384 poços a 10.000 células/poço em 45 µl de meio de crescimento. Essas células foram expostas ao oligonucleotídeo dissolvido em meio de crescimento e incubadas a 37° por 3-4 dias. 10 µl de sobrenadante de cultura por poço foram transfectados para uma placa de 384 poços e 90 µl de 50 mM de NaHCO3/Na2CO3, 2 mM de MgCl2, 5 mM de para-nitrofenilfosfato (pNP) pH 9,6 foram adicionados e as taxas de reação foram determinadas por meio de medição cinética das alterações temporais da densidade óptica a 405 nM (mOD405nm/min). Tabela 1: Sequências de ODN (letra minúscula: Ligações de PTO, ligações de PDE em letra maiúscula) 2006-PTO SEQ ID NO:3 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE3dG1 SEQ ID NO:5 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTG 2006-PDE3dG2 SEQ ID NO:6 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGG 2006-PDE3dG3 SEQ ID NO:7 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGG 2006-PDE3dG4 SEQ ID NO:8 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGG 2006-PDE3dG5 SEQ ID NO:9 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGG

SEQ ID 2006-PDE3dG6 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGG NO:10

SEQ ID 2006-PDE3dG7 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGG NO:11

SEQ ID 2006-PDE3dG8 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGGG NO:12

[0155] Enquanto conforme esperado, TLR21 estimulado por 2006-PTO na faixa nanomolar, 2006-PDE não mostraram atividade estimulatória de TLR21 significativa. A adição de um dG na extremidade 3’ levou a alguma atividade estimulatória de TLR21 marcada na faixa de nM, que ainda estava presente com uma adição de uma segunda dG (dG2) e de uma terceira dG (dG3), embora muito mais fraca. Adição de uma 4ª, 5ª, 6ª, 7ª e 8ª dG (dG4-dG8) resultou em ODNs inativo por TLR21 (FIG. 4A). Na faixa de concentração de até 0,33 nM (330 pM), nenhum dos ODNs mostrou atividade de TLR21 (FIG. 4B). Impacto de adições de 5’dG no reconhecimento de TLR21 de 2006-PDE (ODN2006, forma de fosfodiéster)

[0156] A versão ligada a fosfodiéster de 2006-PTO, 2006- PDE, foi usada como uma base para investigar o efeito de modificação de 5’-dG na atividade estimulatória de TLR21. Para esse fim, os experimentos de titulação foram realizados começando a 20 nM com 15 etapas de diluição (1:2) que chegam aproximadamente 1 pM com uma diluição final. Tabela 2: Sequências de ODN (letra minúscula: Ligações de PTO, ligações de PDE em letra maiúscula) 2006-PTO SEQ ID NO:3 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2006-PDEV3 SEQ ID NO:13 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG1 SEQ ID NO:14 GTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG2 SEQ ID NO:15 GGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG3 SEQ ID NO:16 GGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG5 SEQ ID NO:18 GGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG7 SEQ ID NO:20 GGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG8 SEQ ID NO:21 GGGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

[0157] TLR21 estimulado por 2006-PTO na faixa nanomolar e 2006-PDE não mostraram atividade estimulatória de TLR21 significativa. Adição de um dG e dois Gs na extremidade 5’ de 2006-PDE levou a alguma atividade estimulatória de TLR21 menor na faixa de nM de dois dígitos. Uma terceira dG (dG3)

levou a um aumento drástico de atividade de TLR21, com uma EC50 calculada de 513 picoMolar (pM) (Tabela 3). Adição de uma 4a dG mais atividade aumentada em 14 vezes (EC50 calculada de 36 pM, Tabela 3), enquanto uma 5a, 6a, 7a e 8a dG (dG4- dG8) resultaram em um aumento adicional de EC50 e um platô estimulatório de TLR21 com EC50’s entre 17,1 e 22,2 pM.

Tomados juntos, parece que após a adição de 3dGs, mas ainda não dois dGs, na extremidade 5’, ocorre alguma alteração fundamental na estrutura de ODN, que leva a um grande aumento de atividade de TLR21, de quase inatividade a atividade picomolar forte, que é adicionalmente mostrada pelas 5’ dGs adicionais.

As adições equivalentes de dGs na extremidade 3’ não levam à alta atividade, os derivados de ODN correspondentes são amplamente inativos (comparar FIGs. 4A- B, 5A-B e 6, assim como a Tabela 3). Tabela 3: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PTO 22463 1223 2006-PDE3dG1 35072 1121 2006-PDE3dG2 Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PDE3dG3 Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PDE3dG4 Inativo Inativo 2006-PDE3dG5 Inativo Inativo 2006-PDE3dG6 Inativo Inativo 2006-PDE3dG7 Inativo Inativo 2006-PDE3dG8 Inativo Inativo 2006-PDE5dG1 fraco fraco 2006-PDE5dG2 Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PDE5dG3 513 589

Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE5dG4 36,0 559 2006-PDE5dG5 22,2 553 2006-PDE5dG6 17,1 549 2006-PDE5dG7 22,2 555 2006-PDE5dG8 21,9 559

[0158] Para investigar o comportamento de migração eletroforético dos ODNs testados em TLR21, a eletroforese de gel de poliacrilamida de 16 % de TBE foi realizada, seguido pela coloração com azul de metileno. No caso de 2006-PDE- 5dG0-8, há uma correlação clara entre a aparência de estruturas de ordens superiores (FIGs. 7A, 7B) e alta atividade estimulatória de TLR21. Parece que as estruturas de ordem superior são formadas pela geração de estruturas de G-quarteto conhecidas por serem formadas frequentemente pelas Gs consecutivas, e que envolvem potencialmente a mesma fita (“G-quartetos intramoleculares”) ou fitas diferentes (“G-quartetos intermoleculares”) de DNA. Williamson JR, G- Quartet Structures in Telomeric DNA, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23: 703-730 (1994); Simonsson T, G- Quadruplex DNA Structures – Variations on a Theme, Biol. Chem. 382: 621-628 (2001). No entanto, a mesma agregação é observada nos oligonucleotídeos 2006-PDE-3dG0-8, que são ativos ou inativos de modo ruim em TLR21. Isso sugere que a agregação sozinha não é suficiente para atividade estimulatória de TLR21 forte. O posicionamento das guaninas consecutivas em relação à extremidade 5’ parece impactar na atividade estimulatória de TLR21. Examinação adicional da dependência de corridas de 5’ guanina da estimulação de TLR21 potente com o uso do 2006-PDE-5dG6 exemplificativo.

[0159] 2006-PDE-5dG6 foi escolhido como um exemplo, devido ao fato de que pareceu formar o platô de atividade estimulatória de TLR21 na varredura de 5’dGn de 2006-PDE (vide FIGs. 5A, 5B, 6 e Tabela 3). A corrida de 5’-dG6 foi substituída por dA6, dT6 ou dC6 (Tabela 4). Tabela 4: 2006-PDE SEQ ID NO: 4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dA6 SEQ ID NO:22 AAAAAATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dC6 SEQ ID NO:23 CCCCCCTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dT6 SEQ ID NO:24 TTTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

[0160] Quando 2006-PDE for modificado com dN6 na extremidade 5’, todo homômero de base produz algum aumento de atividade de TLR21 na ordem de aprimoramento: dA6 < dC6 < dT6 <<<<<<<< dG6 (FIG. 8A). O aprimoramento de 5’-dG6 é claramente de ordens de grandeza maior que aquelas das outras bases (visíveis, em particular, em baixas concentrações, FIG. 8B), sugerindo uma qualidade especial conferida por essa modificação com potencial de formação de G-quarteto. Examinação da dependência na presença de elementos de CpG da estimulação de TLR21 potente por 2006-PDE modificado por 5’- dG com o uso do 2006-PDE-5dG6 exemplificativo.

[0161] 2006-PDE-5dG6 foi escolhido como um exemplo, devido ao fato de que pareceu formar o platô de atividade estimulatória de TLR21 na varredura de 5’dGn de 2006-PDE (vide FIGs. 5A, 5B, 6 e Tabela 3). O impacto dos motivos de CpG na atividade estimulatória de TLR21 foi investigado 1)

sintetizando-se esse ODN com 5-metil-citidina substituindo cada citidina nos quatro motivos de CpG, 2) invertendo-se cada motivo de CpG por GpC, e 3) substituindo-se cada guanina nos motivos de CpG por adenina, substituindo-se cada citosina por timina, e através da substituição simultânea de citosina e guanina com timina e adenina, respectivamente. Os oligonucleotídeos resultantes foram testados quanto sua habilidade de estimular TLR21 com o uso de células HEK293- NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3. Tabela 5: 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-Me SEQ ID NO:25 GGGGGGTXGTXGTTTTGTXGTTTTGTXGTT 2006-PDE5dG6-GC SEQ ID NO:26 GGGGGGTGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT 2006-PDE5dG6-CA SEQ ID NO:27 GGGGGGTCATCATTTTGTCATTTTGTCATT 2006-PDE5dG6-TG SEQ ID NO:266 GGGGGGTTGTTGTTTTGTTGTTTTGTTGTT 2006-PDE5dG6-TA SEQ ID NO:267 GGGGGGTTATTATTTTGTTATTTTGTTATT X = 5 metil citidina

[0162] Cada modificação investigada no presente documento que interfere com a integridade dos motivos de CpG em 2006- PDE-5dG6 leva a uma grande perda de atividade (FIG. 9A), que se torna particularmente visível em baixas concentrações de ODN (FIG. 9B). Examinação do impacto de modificações de 3’- e 5’-dG6 de 2006-PTO na atividade estimulatória de TLR21 e comparação com as alterações equivalentes em 2006-PDE.

[0163] Para investigar se o aprimoramento de atividade estimulatória de TLR21 pela adição de corrida de dG também se aplica a oligodesoxinucleotídeos com cadeia principal de fosforotioato (PTO-ODNs), os congêneres de PTO de 2006-PDE,

2006-PDE-3dG5 e 2006-PDE-5dG6 foram sintetizados (Tabela 6), e sua habilidade de estimular TLR21 com o uso de células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi comparada entre si e suas versões de PDE (Tabela 7, FIGs. 10A e 10B). Tabela 6: As sequências de ODN PTO em função de PDE (PTO em letra minúscula) 2006-PTO SEQ ID NO:3 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2006-PTO3dG5 SEQ ID NO:28 tcgtcgttttgtcgttttgtcgttggggg 2006-PTO5dG6 SEQ ID NO:29 ggggggtcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE3dG5 SEQ ID NO:9 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGG 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 7: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Amplamente inativo - 2006-PDE3dG5 Amplamente inativo - 2006-PDE5dG6 17,1 556 2006-PTO 22463 2006-PTO3dG5 106775 2162 2006-PTO5dG6 42,7 655

[0164] Na ausência de resíduos de 5’dG, a modificação de PTO confere atividade muito maior para ODNs em comparação com as versões de PDE (Tabela 7, FIGs. 10A e 10B). Isso é diferente para 2006-PDE modificado por 5’dG6 em comparação com sua versão de PTO. No presente documento, PDE confere atividade ainda ligeiramente maior (EC50), que é inesperada

(Tabela 7, FIGs. 10A e 10B). Examinação do impacto de substituições de dA na corrida de 5dG6 de 2006-PDE-5dG6 na atividade estimulatória de TLR21.

[0165] Com base na hipótese de que as sequências 5’ dG consecutivas de 2006-PDE formam G-quartetos que conferem atividade estimulatória de TLR21, prediz-se que as substituições de dA em uma corrida de dG6 que se espera que rompam a formação de G-quarteto devam ter, dependendo da posição, um impacto negativo na atividade estimulatória de TLR21. Para esse fim, os ODNs de 2006-PDE-5dG6 de substituição de dA única ou dupla foram sintetizados com o uso de métodos familiares àqueles versados na técnica e testados em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 quanto sua habilidade para estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabelas 8 e 9, FIGs. 11A-D). Tabela 8: Sequências de ODN, substituições de A 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A1 SEQ ID NO:30 AGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A2 SEQ ID NO:31 GAGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A3 SEQ ID NO:32 GGAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A4 SEQ ID NO:33 GGGAGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A5 SEQ ID NO:34 GGGGAGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A6 SEQ ID NO:35 GGGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A12 SEQ ID NO:36 AAGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A23 SEQ ID NO:37 GAAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A34 SEQ ID NO:38 GGAAGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A45 SEQ ID NO:39 GGGAAGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-A56 SEQ ID NO:40 GGGGAATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 9: Concentração efetiva de 50 % (EC50) e o sinal máximo (Vmáx)

Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PDE5dG6 17,1 556 2006-PDE5dG6-A1 29,0 593 2006-PDE5dG6-A2 97,1 570 2006-PDE5dG6-A3 206 584 2006-PDE5dG6-A4 318 568 2006-PDE5dG6-A5 47,0 559 2006-PDE5dG6-A6 22,6 549 2006-PDE5dG6-A12 69,1 551 2006-PDE5dG6-A23 11705 460 2006-PDE5dG6-A34 7849 760 2006-PDE5dG6-A45 113 539 2006-PDE5dG6-A56 35,0 500

[0166] Em geral, todas as substituições de dA dentro da corrida de dG6 levam a poucas alterações em Vmáx (isto é, a leitura de gene repórter máxima obtida em experimentos comparativos), enquanto a EC50 variou consideravelmente até mais de duas ordens de grandeza (Tabela 9 e FIGs. 11A e 11B). As substituições únicas na 1a e 6a posições foram muito suaves na EC50, enquanto a 2a e 5a posição levou a um aumento mais acentuado. As alterações mais fortes foram observadas para a 3a e 4a posições, que levaram a um aumento de mais de 10 vezes em EC50. No caso de substituições de dA duplas (Tabela 9, FIGs. 11C e 11D), a 1a e 2a consecutivas assim como a 5a e 6a levaram a aumentos de EC50 relativamente suaves, enquanto a 4a e a 5a levaram a um aumento mais forte. A substituição de dA dupla da 2a e da 3a, assim como da 3a e da 4a posições levou a aumentos de EC50 de 685 vezes e 459 vezes, respectivamente. Dado o fato de que 3 dGs consecutivas foram identificadas antes nesse estudo como o número mínimo para a atividade de TLR21 potente e os aumentos de EC50 foram notados na ordem de dG3, dG4 a dG5, após a qual um platô de EC50 foi visto de dG5-dG8 (comparar FIGs 5A, 5B, 6 e Tabela 3), esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21. Examinação do impacto de substituições de dC na corrida de 5dG6 de 2006-PDE-5dG6 na atividade estimulatória de TLR21.

[0167] Com base na hipótese de que as sequências 5’ dC consecutivas de 2006-PDE formam G-quartetos que conferem atividade estimulatória de TLR21, prediz-se que as substituições de dA em uma corrida de dG6 que se espera que rompam a formação de G-quarteto devam ter, dependendo da posição, um impacto negativo na atividade estimulatória de TLR21. Para esse fim, os ODNs de 2006-PDE-5dG6 de substituição de dC única e dupla foram sintetizados e testados quanto a sua habilidade de estimular TLR21 conforme explicado no Exemplo 3. (Tabela 10, Tabela 11, FIGs. 12A-D). Tabela 10: Sequências de ODN, substituições de C 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C1 SEQ ID NO:41 CGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C2 SEQ ID NO:42 GCGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C3 SEQ ID NO:43 GGCGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C4 SEQ ID NO:44 GGGCGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C5 SEQ ID NO:45 GGGGCGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C6 SEQ ID NO:46 GGGGGCTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C12 SEQ ID NO:47 CCGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C23 SEQ ID NO:48 GCCGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C34 SEQ ID NO:49 GGCCGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

2006-PDE5dG6-C45 SEQ ID NO:50 GGGCCGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-C56 SEQ ID NO:51 GGGGCCTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 11: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e o sinal máximo (Vmáx) Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Amplamente inativo Amplamente inativo 2006-PDE5dG6 17,1 556 2006-PDE5dG6-C1 35,7 498 2006-PDE5dG6-C2 43,5 494 2006-PDE5dG6-C3 295 546 2006-PDE5dG6-C4 301 531 2006-PDE5dG6-C5 44,0 480 2006-PDE5dG6-C6 35,9 480 2006-PDE5dG6-C12 83,5 486 2006-PDE5dG6-C23 2738 473 2006-PDE5dG6-C34 5176 578 2006-PDE5dG6-C45 813 552 2006-PDE5dG6-C56 62,6 544

[0168] Em geral, todas as substituições de dC dentro da corrida de dG6 levam a poucas alterações em Vmáx (isto é, a leitura de gene repórter máxima obtida em experimentos comparativos), enquanto a EC50 variou consideravelmente até mais de duas ordens de grandeza (Tabela 11 e FIGs. 12A e 12B). As únicas substituições na 1a e 6a posições do oligonucleotídeo foram muito suaves na EC50, assim como eram a 2a e 5a posições do oligonucleotídeo. As alterações mais fortes foram observadas para a 3a e 4a posições do oligonucleotídeo, que levaram a um aumento de mais de 10 vezes em EC50. No caso de substituições de dC duplas (Tabela 11 e FIGs. 12C e 12D), a 1a e 2a consecutivas assim como a 5a e 6a posições do oligonucleotídeo levaram a aumentos de

EC50 relativamente suaves, enquanto a 4a e a 5a posições levaram a um aumento mais forte. A substituição de dC dupla de da 2a e da 3a posições, assim como da 3a e da 4a posições do oligonucleotídeo levou a grandes aumentos de EC50 de 160 vezes e 303 vezes, respectivamente. Dado que as 3 dGs consecutivas foram identificadas nesse estudo como o número mínimo para a atividade de TLR21 potente e os aumentos de EC50 foram notados na ordem dG3, dG4 a dG5, após o que um platô de EC50 foi visto a partir de dG5-dG8 (comparar FIGs. 5A-B, 6 e Tabela 3), esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21. Examinação do impacto de substituições de dT na corrida de 5dG6 de 2006-PDE-5dG6 na atividade estimulatória de TLR21.

[0169] Com base na hipótese de que as sequências dC consecutivas na terminação 5’ de 2006-PDE formam G-quartetos que conferem atividade estimulatória de TLR21, prediz-se que as substituições de dT em uma corrida de dG6 que se espera que rompam a formação de G-quarteto devam ter, dependendo da posição, um impacto negativo na atividade estimulatória de TLR21. Para esse fim, os ODNs de 2006-PDE-5dG6 de substituição de dT única ou dupla foram sintetizados e testados em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 quanto sua habilidade para estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabelas 12, Tabela 13, FIG. 13A-D). Tabela 12: Sequências de ODN, substituições de T

2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T1 SEQ ID NO:52 TGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T2 SEQ ID NO:53 GTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T3 SEQ ID NO:54 GGTGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T4 SEQ ID NO:55 GGGTGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T5 SEQ ID NO:56 GGGGTGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T6 SEQ ID NO:57 GGGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T12 SEQ ID NO:58 TTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T23 SEQ ID NO:59 GTTGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T34 SEQ ID NO:60 GGTTGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T45 SEQ ID NO:61 GGGTTGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6-T56 SEQ ID NO:62 GGGGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 13: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e o sinal máximo (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (mOD405/min)

ODN (pM) 2006-PDE Amplamente Amplamente inativo inativo 2006-PDE5dG6 17,1 556 2006-PDE5dG6-T1 17,6 495 2006-PDE5dG6-T2 36,9 500 2006-PDE5dG6-T3 128 521 2006-PDE5dG6-T4 138 539 2006-PDE5dG6-T5 16,4 511 2006-PDE5dG6-T6 26,7 562 2006-PDE5dG6-T12 37,1 536 2006-PDE5dG6-T23 30459 629 2006-PDE5dG6-T34 10639 636 2006-PDE5dG6-T45 572 565 2006-PDE5dG6-T56 31,2 514

[0170] Em geral, todas as substituições de dT dentro da corrida de dG6 levam a poucas alterações em Vmáx, enquanto a EC50 variou consideravelmente até mais de três ordens de grandeza (Tabela 13 e FIGs. 13A e 13B). As únicas substituições na 1a e 6a posições do oligonucleotídeo foram muito suaves na EC50, assim como eram a 2a e 5a posições do oligonucleotídeo. As alterações mais fortes foram observadas para a 3a e 4a posições do oligonucleotídeo, que levaram a um aumento de mais de 6 vezes em EC50. No caso de substituições de dT duplas (Tabela 13 e FIGs. 13C e 13D), a 1a e 2a consecutivas assim como a 5a e 6a posições do oligonucleotídeo levaram a aumentos de EC50 relativamente suaves, enquanto a 4a e a 5a posições levaram a um aumento mais forte. A substituição de dT dupla de da 2a e da 3a posições do oligonucleotídeo, assim como da 3a e da 4a posições levou a grandes aumentos de EC50 de 1781 vezes e 622 vezes, respectivamente. Dado que as três dGs consecutivas foram identificadas nesse estudo como o número mínimo para a atividade de TLR21 potente e que os aumentos de EC50 foram notados na ordem dG3, dG4 a dG5, após o que um platô de EC50 foi visto a partir de dG5-dG8 (comparar FIGs. 5A, 5B, 6 e Tabela 3), esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21.

[0171] A FIG. 14 ilustra que as substituições de dG nas posições 1 e 6 do oligonucleotídeo são um tanto benignas. Em contrapartida, qualquer substituição nas posições 3 e 4 do oligonucleotídeo não têm efeitos negativos marcados de potencial estimulatório de TLR21. Também parece que as substituições duplas de dGdG adjacentes nas posições 1 e 2, assim como 5 e 6, do oligonucleotídeo são benignas. Em contrapartida, a FIG. 15 ilustra que nas posições 2 e 3 assim como 3 e 4 do oligonucleotídeo, a substituição de dGdG adjacente por qualquer homodinucleotídeo (dCdC, dAdA, e particularmente, dTdT) leva a uma perda drástica de atividade estimulatória de TLR21. As substituições duplas de dGdG adjacente nas posições 4 e 5 do oligonucleotídeo são mais moderadas, mas também levam à perda de atividade.

[0172] Esses dados indicam que uma corrida consecutiva de quatro dGs é essencial para a alta atividade estimulatória de TLR21 e ruptura da corrida de quatro dG por quaisquer outros resultados de nucleotídeo em uma perda drástica de atividade. Examinação do impacto de substituições de dA na corrida de 5dG4 do 2006-PDE-5dG4 na atividade estimulatória de TLR21.

[0173] Para testar mais rigorosamente a hipótese de que 5’-dG4 é necessário e suficiente para conferir atividade estimulatória de alto nível para 2006-PDE, as frações de dG em 2006-PDE-5dG4 foram sistematicamente substituídas por dA e os vários derivados foram testados em células HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 quanto a sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 14, Tabela 15, FIGs. 16A e 16B). Tabela 14: Sequências de ODN, substituições de A 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-A1 SEQ ID NO:63 AGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-A2 SEQ ID NO:64 GAGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-A3 SEQ ID NO:65 GGAGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-A4 SEQ ID NO:66 GGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 15: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e o sinal máximo (Vmáx)

Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE5dG4 35,3 519 2006-PDE5dG4-A1 Ativamente fraco - 2006-PDE5dG4-A2 12066 1017 2006-PDE5dG4-A3 16640 1149 2006-PDE5dG4-A4 548 684

[0174] Todas as substituições de dA na corrida de dG4 levam a perdas de atividade estimulatória de TLR21. De modo um tanto surpreendente, uma alteração drástica na atividade estimulatória de TLR21 foi notada na posição 1, até o ponto em que uma EC50 não poderia ser calculada (Tabela 15 e FIGs. 16A e 16B). As substituições de dA única na 2a e na 3a posições de 2006-PDE5dG4 levam também a grandes aumentos de EC50, com fatores de 342 e 471, respectivamente. A perda de atividade mais suave foi observada na substituição de dA da posição 4 na corrida de dG4, com um aumento de EC50 de fator 16 (Tabela 15 e FIGs. 16A e 16B). Esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21. Examinação do impacto de substituições de dC na corrida de 5dG4 de 2006-PDE-5dG4 na atividade estimulatória de TLR21.

[0175] Para testar mais rigorosamente a hipótese de que 5’-dG4 é necessário e suficiente para conferir atividade estimulatória de alto nível para 2006-PDE, as frações de dG em 2006-PDE-5dG4 foram sistematicamente substituídas por dC e os vários derivados foram testados em células HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 quanto a sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 16, Tabela 17, FIGs.

17A e 17B). Tabela 16: Sequências de ODN, substituições de C 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-C1 SEQ ID NO:67 CGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-C2 SEQ ID NO:68 GCGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-C3 SEQ ID NO:69 GGCGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-C4 SEQ ID NO:70 GGGCTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 17: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e o sinal máximo (Vmáx) Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE5dG4-N2 35,3 519 2006-PDE5dG4-C1 3153 764 2006-PDE5dG4-C2 29357 1361 2006-PDE5dG4-C3 19228 1229 2006-PDE5dG4-C4 515 669

[0176] Todas as substituições de dC na corrida de dG4 levam a perdas de atividade estimulatória de TLR21. Uma perda marcada em atividade estimulatória de TLR21 foi notada na posição 1, com um aumento de EC50 de fator 89 (Tabela 17 e FIGs. 17A e 17B). As substituições de dC única na 2a e na 3a posições levam também a grandes aumentos de EC50, com fatores de 831 e 545, respectivamente. A perda de atividade mais suave foi constatada na substituição de dC da posição 4 na corrida de dG4, com um aumento de EC50 de fator 15 (Tabela 17 e FIGs. 17A e 17B). Esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos na terminação 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21.

Examinação do impacto de substituições de dT na corrida de 5dG4 de 2006-PDE-5dG4 na atividade estimulatória de TLR21.

[0177] Para testar mais rigorosamente a hipótese de que 5’-dG4 é necessário e suficiente para conferir atividade estimulatória de alto nível para 2006-PDE, as frações de dG em 2006-PDE-5dG4 foram sistematicamente substituídas por dT e os vários derivados foram testados em células HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 quanto a sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 18, Tabela 19, FIGs. 18A e 18B). Tabela 18: Sequências de ODN, substituições de A 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-T1 SEQ ID NO:71 TGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-T2 SEQ ID NO:72 GTGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-T3 SEQ ID NO:73 GGTGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-T4 SEQ ID NO:74 GGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 19: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e o sinal máximo (Vmáx) Vmáx milliOD 405nm/min ODN EC50 picomolar (pM) (mOD405/min) 2006-PDE5dG4 35,3 519 2006-PDE5dG4-T1 Ativamente fraco - 2006-PDE5dG4-T2 3232 733 2006-PDE5dG4-T3 9337 961 2006-PDE5dG4-T4 191 605

[0178] Todas as substituições de dT na corrida de dG4 levam a perdas de atividade estimulatória de TLR21. Uma alteração um tanto surpreendente e drástica na atividade estimulatória de TLR21 foi observada para a posição 1, até o ponto em que uma EC50 não poderia ser calculada (Tabela 19 e FIGs. 18A e 18B). As substituições de dA única na 2a e na 3a posições levam também a grandes aumentos de EC50, com fatores de 92 e 265, respectivamente. A perda de atividade mais suave foi constatada na substituição de dT da posição 4 na corrida de dG4, com um aumento de EC50 de fator 5 (Tabela 19 e FIGs. 18A e 18B). Esses dados suportam adicionalmente a noção de que a formação não distribuída de G-quartetos 5’ de 2006-PDE é um pré-requisito para a forte estimulação de TLR21.

[0179] Como a FIG. 19 ilustra, quaisquer substituições de dG na corrida de dG4 são prejudiciais para a atividade estimulatória de TLR21, que está em linha com a vista de que quatro dGs consecutivas são necessárias para a alta atividade. De modo interessante, qualquer substituição na posição 1 eliminou a atividade de TLR21 apesar de preservar três dGs consecutivas, enquanto a substituição da posição 4 dG, que também preserva três dGs consecutivas, era comparativamente benigna. A substituição de dG2 ou dG3 foi uniformemente prejudicial para a atividade de TLR21. Impacto da adição de 5’-dG4 e 5’-dG6 a ODNs de PDE que contém CpG ao conferir atividade estimulatória de TLR21.

[0180] Onze sequências de oligodesoxinucleotídeos que contêm CpG implicadas na literatura como estimulatórias para TLR9 de mamífero (mas principalmente descritas como versões de PTO) foram escolhidas para a síntese como derivados de PDE (Tabela 20). A interação de TLR21 era desconhecida para todos os ODNs de PDE. Para cinco desses ODNs de PDE, suas versões de 3’-dG5-, 5’-dG4- e 5’-dG6 também foram sintetizadas. Para um ODN, suas versões de 5’-dG4- e 5’-dG6 foram sintetizadas; para uma outra, suas versões de 3’-dG5- e 5’-dG6 foram sintetizadas; enquanto para 4 outras, apenas as versões de 5’-dG6 correspondentes foram sintetizadas (Tabela 20). Esses ODNs foram submetidos ao teste de estimulação de TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 21, FIGs. 20A-I). Tabela 20: ODNs usados para fixação de dGn ODN SEQ ID NO Sequência 1668 SEQ ID NO:75 TCCATGACGTTCCTGATGCT 1668-3dG5 SEQ ID NO:76 TCCATGACGTTCCTGATGCTGGGGG 1668-5dG4 SEQ ID NO:77 GGGGTCCATGACGTTCCTGATGCT 1668-5dG6 SEQ ID NO:78 GGGGGGTCCATGACGTTCCTGATGCT 1826 SEQ ID NO:79 TCCATGACGTTCCTGACGTT 1826-3dG5 SEQ ID NO:80 TCCATGACGTTCCTGACGTTGGGGG 1826-5dG4 SEQ ID NO:81 GGGGTCCATGACGTTCCTGACGTT 1826-5dG6 SEQ ID NO:82 GGGGGGTCCATGACGTTCCTGACGTT BW006 SEQ ID NO:83 TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC BW006-3dG5 SEQ ID NO:84 TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTCGGGGG BW006-5dG4 SEQ ID NO:85 GGGGTCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC BW006-5dG6 SEQ ID NO:86 GGGGGGTCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC D-SLO1 SEQ ID NO:87 TCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA D-SLO1-3dG5 SEQ ID NO:88 TCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTAGGGGG D-SLO1-5dG4 SEQ ID NO:89 GGGGTCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA D-SLO1-5dG6 SEQ ID NO:90 GGGGGGTCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA 2395 SEQ ID NO:91 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 2395-5dG4 SEQ ID NO:92 GGGGTCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 2395-5dG6 SEQ ID NO:93 GGGGGGTCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG M362 SEQ ID NO:94 TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT M362-3dG5 SEQ ID NO:95 TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGATGGGGG M362-5dG4 SEQ ID NO:96 GGGGTCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT M362-5dG6 SEQ ID NO:97 GGGGGGTCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT 2007-PDE SEQ ID NO:98 TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT 2007-PDE3dG5 SEQ ID NO:99 TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGG

ODN SEQ ID NO Sequência 2007-PDE5dG6 SEQ ID GGGGGGTCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT NO:100 CPG-202 SEQ ID GATCTCGCTCGCTCGCTAT NO:101 CPG-202-5dG6 SEQ ID GGGGGGGATCTCGCTCGCTCGCTAT NO:102 CPG-685 SEQ ID TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC NO:103 CPG-685-5dG6 SEQ ID GGGGGGTCGTCGACGTCGTTCGTTCTC NO:104 CPG-2000 SEQ ID TCCATGACGTTCCTGCAGTTCCTGACGTT NO:105 CPG-2000- SEQ ID

GGGGGGTCCATGACGTTCCTGCAGTTCCTGACGTT 5dG6 NO:106 CPG-2002 SEQ ID TCCACGACGTTTTCGACGTT NO:107 CPG-2002- SEQ ID GGGGGGTCCACGACGTTTTCGACGTT 5dG6 NO:108 Tabela 21: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) Vmáx milliOD ODN EC50 picomolar (pM) 405nm/min (mOD405/min) 1668 Inativo - 1668-3dG5 Inativo - 1668-5dG4 15140 71 1668-5dG6 6328 45 1826 pequena atividade - 1826-3dG5 Inativo - 1826-5dG4 866 309 1826-5dG6 478 373

Vmáx milliOD ODN EC50 picomolar (pM) 405nm/min (mOD405/min) BW006 pequena atividade - BW006-3dG5 Inativo - BW006-5dG4 20,3 378 BW006-5dG6 76 311 D-SLO1 alguma atividade - D-SLO1-3dG5 Inativo - D-SLO1-5dG4 174 372 D-SLO1-5dG6 129 372 M362 Inativo - M362-3dG5 Inativo - M362-5dG4 6832 609 M362-5dG6 38480 1214 2395 Inativo - 2395-5dG4 121 410 2395-5dG6 1092 475 2007 pequena atividade - 2007-3dG5 Inativo - 2007-5dG6 20,3 637 202 Inativo - 202-5dG6 92,2 446 685 Inativo - 685-5dG6 97,4 451 2000 Inativo - 2000-5dG6 530 727 2002 Inativo - 2002-5dG6 61,6 833

[0181] Nos testes de ativação de TLR21 dos ODNs de PDE não modificados (Tabela 20), apenas 1826, BW006, D-SLO1 e

2007 mostraram alguma pequena atividade (Tabela 21, FIGs. 20B, 20C, 20D, 20G). Todos os outros ODNs de PDE não exibiram atividade estimulatória de TLR21 na concentração testada (Tabela 21, FIGs. 20A, 20E, 20F, 20H, 20I, 20J e 20K). Os seis derivados de ODN que têm adição de 3’dG5 não exibiram atividade de TLR21 (Tabela 21). Esses estão em linha com as observações anteriores de 2006-PDE. Para os quatro ODNs com menor sinal de estimulação de TLR21 (1826, BW006, D-SLO1 e 2007), a adição de 3’dG5 exterminou sua atividade (FIGs. 20B, 20C, 20D, 20G).

[0182] Em contrapartida, a adição de 5’dG4 (seis ODNs) ou 5’dG6 (onze ODNs) levou à atividade estimulatória de TLR21 aumentada em cada caso incluindo EC50’s nanomolar em cinco casos EC50 picomolar (pM) em treze outros casos (Tabela 21). Seis ainda tiveram EC50 de pM de dois dígitos (tão baixo quanto 20 pM), que é altamente notável, dado que o ponto de partida foi quase zero. Tomados juntos, os dados sugerem que a atividade de TLR21 potente pode ser obtida fixando-se corridas de dG à extremidade 5’ (mas NÃO a extremidade 3’) de ODNs de PDE que contém CpG anteriormente ativamente ruins ou inativos.

[0183] Os dados apresentados no presente documento também sugerem que o ganho de atividade é conectado à formação intermolecular pelos ODNs modificados por 5’dGn de uma superestrutura de DNA de G-quarteto. Impacto de adições de 5’dG no reconhecimento de TLR9 de camundongo de 2006-PDE

[0184] A versão de ligação de fosfodiéster de 2006-PTO, 2006-PDE, foi usada como uma base para investigar o efeito de modificação de 5’-dG na atividade estimulatória de TLR9 de murino e TLR9 humano. Os experimentos de titulação foram realizados começando em 2000 nM ou 5000 nM de concentração de ODN com 15 etapas de diluição (1:2) chegando aproximadamente a 100 pM ou 500 pM como diluições finais. Os ODNs derivados de 2006-PTE são descritos na Tabela 21-2. Tabela 21-2: Os ODNs derivados de 2006-PDE (ligações de PTO em letra minúscula) 2006-PTO SEQ ID NO: 3 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 2006-PDEV3 SEQ ID NO: 13 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG1 SEQ ID NO: 14 GTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG2 SEQ ID NO: 15 GGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG3 SEQ ID NO: 16 GGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO: 17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG5 SEQ ID NO: 18 GGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG6 SEQ ID NO: 19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG7 SEQ ID NO: 20 GGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG8 SEQ ID NO: 21 GGGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

[0185] TLR9 de camundongo e humano estimulado por 2006- PTO na faixa nanomolar. 2006-PDE mostrou apenas atividade estimulatória de TLR9 de camundongo ou humano menor (FIGs. 68A e 68B). A adição de um a oito dGs na extremidade 5’ de 2006-PDE levou a nenhum aumento ou a apenas pequenos aumentos de atividade de TLR9 de camundongo (FIG. 68A). Em células humanas HEKBlue, a adição de um a seis dG na extremidade 5’ de 2006-PDE levou a nenhum aumento ou até mesmo a uma diminuição na atividade estimulatória. A adição de dG7 e dG8 na extremidade 5’ do oligonucleotídeo que tem motivos de CpG levou a algum aumento pequeno na atividade de TLR9 humano (FIG. 68B). Coletivamente, essa figura está em contraste gritante com a observação de que a atividade estimulatória de TLR21 de galinha de 2006-PDE é fortemente reforçada pela adição de três a oito dGs na extremidade 5’ do oligonucleotídeo. Impacto de adições de 3’dG no reconhecimento de TLR9 de camundongo e humano de 2006-PDE

[0186] A adição de um a três dGs na extremidade 3’ de 2006-PDE levou a pequenos aumentos progressivos de atividade em TLR9 de camundongo (FIG. 69A). A adição de uma quarta dG na extremidade 3’ do oligonucleotídeo levou a um forte aumento na atividade estimulatória de TLR9 de camundongo, que foi ligeiramente aprimorada ou preservada mediante a adição de uma 5ª, 6ª, 7ª ou 8ª 3’ dG à extremidade 3’ do oligonucleotídeo (FIG. 69A).

[0187] Para a estimulação de TLR9 humano, a adição de um a três dG na extremidade 3’ de 2006-PDE levou ao aumento progressivo marcado na atividade estimulatória em relação ao 2006-PDE parental. A adição de uma quarta dG na extremidade 3’ do oligonucleotídeo levou a um aumento forte na atividade estimulatória de TLR9 humano. Esse efeito estimulatório foi ligeiramente aprimorado ou preservado na adição de uma 5ª, 6ª, 7ª ou 8ª 3’ dG (FIG. 69B).

[0188] Coletivamente, essa figura está em contraste gritante com a observação de que a atividade estimulatória de TLR21 de galinha de 2006-PDE não é reforçada ou até mesmo diminuída pela adição de 3-8 dGs na extremidade 3’. Tomados juntos, a relação de estrutura-atividade para as adições de 5’-dG e 3’-dG em 2006-PDE em relação à atividade estimulatória de TLR é fundamentalmente diferente para TLR9 de camundongo e humano (e, presumidamente, de mamífero) em comparação com o TLR21 de galinha (e, presumidamente, de ave). Isso pode refletir o fato de que TLR21 é apenas um ortólogo funcional, mas não uma genética verdadeira, de TLR9 em aves. Exemplo 4: Sequências conhecidas ou suspeitas para formar estruturas de G-quarteto conferem atividade estimulatória de TLR21 quando ligadas à extremidade 5’ de 2006-PDE amplamente inativo.

[0189] Fase de teste I. Vários elementos de sequência de telômero e promotores com potencial de formação de G-quarteto proposto foram adicionados à extremidade 5’ de 2006-PDE. Adicionalmente, 2006-PDE modificado por 5’ T4 (2006-PDE-T4) foi usado para determinar a habilidade de células HEK293- NFκB-bsd-cTLR21 de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 22). Tabela 22: Sequências de ODN (O sublinhado indica as sequências consideradas como envolvidas na formação de G- quarteto) ODNs que formam bases SEQ ID NO Sequência e padrões 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE-5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-T4-PDE SEQ ID NO:109 TTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Fusões de ODN derivadas de telômeros: 2006-HuTel-1 SEQ ID TTAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:110 2006-HuTel-2 SEQ ID TTAGGGTTAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:111 2006-PDE-Oxy1 SEQ ID TTTTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:112

ODNs que formam bases SEQ ID NO Sequência e padrões 2006-PDE-Oxy2 SEQ ID GGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:113 2006-PDE-Oxy3 SEQ ID GGGGTTTTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:114 2006-T4- SEQ ID TTAGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT HuTel-1 NO:115 2006-T4- SEQ ID TTAGGGTTAGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTC HuTel-2 NO:116 GTT 2006-T4- SEQ ID TGTGGGTGTGTGTGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTT ScerTel NO:117 TGTCGTT Derivado de um promotor: 2006-T4-cMyc SEQ ID GGAGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:118 2006-T4-cMyc2 SEQ ID TGGAGGCTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:119 2006-T4-cMyc3 SEQ ID TGGAGGCTGGAGGCTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTG NO:120 TCGTT Tabela 23: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Inativo - 2006-HuTel-1 12611 269 2006-HuTel-2 1374 271 2006-T4-PDE ativamente fraco - 2006-T4- 4563 284 HuTel-1 2006-T4- 769 270 HuTel-2

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-T4- 152 341 ScerTel 2006-T4-cMyc 28,8 318 2006-T4-cMyc2 1190 366 2006-T4-cMyc3 436 359

[0190] A fusão de sequências de telômeros humana a 2006- PDE e 2006-PDE-T4 resultou em ODNs capazes de ativar TLR21 com EC50 nanomolar (nM) ou ainda atividade picomolar (pM) (Tabela 23, FIG. 21A). A sequência de telômeros de levedura conferiu alta atividade de TLR21, com uma EC50 tão baixa quanto 152 pM. As sequências derivadas de promotor de testadas também foram capazes de ativar 2006-PDE-T4 em relação à estimulação de TLR21, um derivado produzindo uma atividade de pM de dois dígitos (Tabela 23, FIG. 21B e 21C).

[0191] As fusões de 2006-PDE com elementos de sequência de telômeros de Oxytricha spp. (Uma espécie modelo anteriormente preferencial para busca de telômero, e para busca de estrutura de G-quarteto) foram sintetizadas (Tabela 22) e testadas quanto seu potencial estimulatório de TLR21 (Tabela 24, FIGs. 22A e 22B). Nesse estudo, as sequências fusionadas compreendem o seguinte: TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, ou TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264). Tabela 24: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Inativo - 2006-PDE-5dG4 54,7 668 2006-PDE-Oxy1 40,2 650 2006-PDE-Oxy2 19,3 638 2006-PDE-Oxy3 48,5 609

[0192] Os elementos de sequência de telômeros de Oxytricha spp. Conferiram atividade de TLR21 altamente potente para inativar 2006-PDE. Os derivados resultantes estavam dentre os derivados mais potentes identificados nesse ponto.

[0193] Fase de teste II. 20 elementos promotores diferentes mostrados ou preditos por envolver formação de G- quarteto foram selecionados, e os construtos de fusão 5' que compreendem 2006-PDE e os elementos promotores foram sintetizados (Tabela 25) para testar em células HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 para determinar sua habilidade de estimular TLR21. Tabela 25: Sequências de ODN (O sublinhado indica as sequências consideradas como envolvidas na formação de G- quarteto) 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE-5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT EA2-2006 SEQ ID NO:121 GCTGCGAGGCGGGTGGGTGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT EA2D-2006 SEQ ID NO:122 GCTGCGGGCGGGTGGGTGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT EA2a-2006 SEQ ID NO:123 CGAGGCGGGTGGGTGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

EA2aD-2006 SEQ ID NO:124 CGGGCGGGTGGGTGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT HCV-2006 SEQ ID NO:125 GGGCGTGGTGGGTGGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT HIV-93del- SEQ ID NO:126 GGGGTGGGAGGAGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006 Hema-2006 SEQ ID NO:127 GGGGTCGGGCGGGCCGGGTGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

GGTGGTGGGGGGGGTTGGTAGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCG Insu-2006 SEQ ID NO:128

TT IonK-2006 SEQ ID NO:129 GGGTTAGGGTTAGGGTAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Scle-2006 SEQ ID NO:130 TGGGGGGGTGGGTGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT STAT-2006 SEQ ID NO:131 GGGCGGGCGGGCGGGCTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT TBA-2006 SEQ ID NO:132 GGTTGGTGTGGTTGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT TNF-2006 SEQ ID NO:133 GGTGGATGGCGCAGTCGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT apVEGF-D-2006 SEQ ID NO:134 TGGGGGTGGACGGGCCGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT apVEGF-2006 SEQ ID NO:135 TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT HTR-2006 SEQ ID NO:136 GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT bcl-2-2006 SEQ ID NO:137

T c-myc-2006 SEQ ID NO:138 AGGGTGGGGAGGGTGGGGATCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT c-kit87-2006 SEQ ID NO:139 AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT vegf-2006 SEQ ID NO:140 GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Tabela 26: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Inativo 0 2006-PDE-5dG6 29,4 452 EA2-2006 22,2 306 EA2D-2006 53,7 316 EA2a-2006 21,7 315 EA2aD-2006 55,1 313 HCV-2006 18,5 329 HIV-93del-2006 21,9 364 Hema-2006 22,4 402 Insu-2006 20,7 371 IonK-2006 377,0 386 Scle-2006 15,6 353 STAT-2006 30,6 355 TBA-2006 1172,0 434 TNF-2006 226,0 394 apVEGF-D-2006 19,4 373 apVEGF-2006 23,4 460 HTR-2006 421,0 438 bcl-2-2006 40,0 387 c-myc-2006 23,6 406 c-kit87-2006 23,3 403 vegf-2006 48,2 413

[0194] O ensaio de TLR21 revelou que todos os elementos testados conferiram atividade ao 2006-PDE inativo. Onze dos vinte elementos testados mostraram potências que excedem aquelas do agonista de TLR21, 2006-5dG6, com valores de EC50 abaixo de 30 pM, e tão baixos quanto 15,6 pM (Tabela 26).

Exemplo 5: Identificação, aplicação e otimização de novos elementos de sequência e princípios biofísicos que conferem atividade estimulatória de TLR21 a CpG-ODNs.

[0195] G-quartetos (FIG. 23A) podem ser formados de modo intramolecular ou intermolecular e em paralelo ou em orientação antiparalela (FIGs. 23B, 23C). Com base na hipótese de que a agregação mediada por G-quarteto de ODNs leva à atividade estimulatória de TLR21 aumentada gerando- se uma variante de ligando com múltiplos sítios de ligação para TLR21 (levando à ganhos de avidez de interação e à agregação de receptor), hipotetizou-se adicionalmente que a orientação de otimização e multiplicidade de sítio de ligação devem intensificar ainda mais a atividade.

[0196] Fase de teste I. Vários elementos de sequência de telômero e promotor com potencial de formação de G-quarteto proposto foram fusionados à extremidade 5’ de 2006-PDE e 2006-PDE-T4 para teste em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 para determinar sua habilidade de estimular TLR21 (Tabela 27).

[0197] É particularmente interessante nesse sentido a formação de uma estrutura de G-quarteto polimérica de monômeros de ODN, chamados de um G-wire (FIGs. 23C e 23D), à medida que têm o potencial para gerar um ligando de TLR21 polimérico. Marsh TC, Vesenka J, Henderson E, A New DNA Nanostructure, the G-wire, Imaged by Scanning Probe Microscopy, Nucl. Acid Res., 23: 696-700 (1995). Especificamente, 2006-PDE que tem a sequência GGGGTTGGGG (SEQ ID NO:257) fusionada a sua extremidade 5’ parece ter a propensão de formar tais estruturas (Tabela 27). Devido ao fato de que a disposição de CpG-ODN se “ativa” muito perto de tal polímero formado por 5’ GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) é provável que leva a problemas estéricos como interação de receptor, derivados com um espaçador de dT4 também foram sintetizados (Tabela 27).

[0198] Foi anteriormente relatado, que o hexanucleotídeo rico em G TGGGGT (SEQ ID NO: 265) forma, de preferência, estruturas de G-quarteto tetraméricas orientadas em paralelo (Phillips K, Dauter Z, Murchie AI, Lilley DM, Luisi BJ, The Crystal Structure of a Parallel-Stranded Guanine Tetraplex at 0.95 Å Resolution, J. Mol Biol. 273: 171-182 (1997)), (FIG. 23B). Espera-se que tal disposição tetramérica de ODNs que contém CpG ligados por um G-quarteto paralelo a 5’ forneça uma disposição de ligando vantajosa para TLR21. Tal derivado de 2006-PDE foi sintetizado (Tabela 27), e testado, juntamente com os derivados acima em comparação com 2006- PDE-5dG4 e 2006-PDE-5dG6 (Tabela 28, FIGs. 24A e 24B). Tabela 27: Sequências de ODN (O sublinhado indica as sequências consideradas como envolvidas na formação de G- quarteto) 2006-PDE SEQ ID NO:4 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE-5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE-5dG6 SEQ ID NO:19 GGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE- SEQ ID NO:141 GGGGTTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Gwire1 2006-PDE- SEQ ID NO:142 GGGGTTGGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Gwire2 2006PDE5dG4- SEQ ID NO:143 TGGGGTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT T1-6 Tabela 28: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-PDE Inativo - 2006-PDE-5dG4 58,0 692 2006-PDE-5dG6 29,4 603 2006-PDE-Gwire1 108 662 2006-PDE-Gwire2 19,2 593 2006PDE5dG4-T1-6 12,1 583

[0199] A adição de GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) à extremidade 5’ de 2006-PDE inativo a TLR21 (2006-PDE-Gwire1) levou a um ODN com EC50 de pM, mas sua atividade caiu em relação às EC50’s de 2006-PDE-5dG4 e 2006-PDE-5dG6, que foram usadas como testes de desempenho nesse estudo (Tabela 28, FIGs. 24A e 24B). No entanto, a introdução de 4 nucleotídeos de dT entre a sequência G-wire e 2006-PDE (2006-PDE-Gwire2) aprimorou a EC50 por um fator de 5 e produziu uma atividade superior aos testes de desempenho (Tabela 28, FIGs. 24A e 24B). A adição de TGGGGT (SEQ ID NO: 265) à extremidade 5’ de 2006-PDE resultou em um ODN com a mais baixa EC50 para TLR21 nesse ponto (Tabela 28, FIGs. 24A e 24B). A formação de estruturas de ordem superior por meio da modificação de 5’G-wire foi demonstrada por meio de eletroforese de gel de poliacrilamida (FIG. 25).

[0200] Tomados juntos, dois elementos de sequência de G- quarteto presumidamente superiores que levam a atividade estimulatória de TLR21 potente de 2006-PDE foram identificados nesse estudo. Sem se ater à teoria, é provável que a capacidade de ativação de TLR21 potente de GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) está relacionada a seu potencial conhecido para formar as denominadas estruturas de G-wire (FIGs. 23C e 23D), fornecendo um ligando de polidentato com uma orientação vantajosa. É provável que a capacidade de ativação de TLR21 potente de TGGGGT (SEQ ID NO: 265) esteja relacionada a seu potencial conhecido para formar G- quartetos intermoleculares tetraméricos paralelos, que fornecem um ligando de tetradentato com orientação vantajosa (FIG. 23B).

[0201] Fase de teste II. O potencial para estimulação de atividade de intensificação de TLR21 na sequência GGGGGG de teste de desempenho foi testado e comparado com a sequência G-wire GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258), que provou ser superior no estudo anterior. Para essa finalidade, 16 oligonucleotídeos foram projetados, os quais eram da sequência geral TTTTTTTXCGXTTT (SEQ ID NO:259), em que X representou qualquer base (Tabela 29). Os dTs foram usados para gerar um oligonucleotídeo de comprimento aceitável (14 bases), para encerrar o tetranucleotídeo CpG “warhead” em um contexto de ODN, devido ao fato de que não gera problemas na síntese, e devido à sua baixa propensão a formar estruturas secundárias indesejadas. Espera-se que tais ODNs curtos com apenas um elemento de CpG e com ligações de PDE sejam de baixa atividade estimulatória de TLR21. Por isso, a concentração de partida para teste em TLR21 foi elevada 50 vezes de 20 nM a 1000 nM. Esses 16 ODNs também foram sintetizados tendo terminais 5’-GGGGGG e terminais 5’- GGGGTTGGGGTTTT (Gwire2; SEQ ID NO: 258) (Tabela 29) e testados em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 quanto sua habilidade de estimular TLR21. Tabela 29: Sequências de ODN (O sublinhado indica as sequências consideradas como envolvidas na formação de G-

quarteto e/ou formação de G-wire) ODNs basais (Todos os tetranucleotídeos que contêm CpG) 1-ACGA TTTTTTTACGATTT SEQ ID NO:144 2-GCGA TTTTTTTGCGATTT SEQ ID NO:145 3-CCGA TTTTTTTCCGATTT SEQ ID NO:146 4-TCGA TTTTTTTTCGATTT SEQ ID NO:147 5-ACGG TTTTTTTACGGTTT SEQ ID NO:148 6-GCGG TTTTTTTGCGGTTT SEQ ID NO:149 7-CCGG TTTTTTTCCGGTTT SEQ ID NO:150 8-TCGG TTTTTTTTCGGTTT SEQ ID NO:151 9-ACGC TTTTTTTACGCTTT SEQ ID NO:152 10-GCGC TTTTTTTGCGCTTT SEQ ID NO:153 11-CCGC TTTTTTTCCGCTTT SEQ ID NO:154 12-TCGC TTTTTTTTCGCTTT SEQ ID NO:155 13-ACGT TTTTTTTACGTTTT SEQ ID NO:156 14-GCGT TTTTTTTGCGTTTT SEQ ID NO:157 15-CCGT TTTTTTTCCGTTTT SEQ ID NO:158 16-TCGT TTTTTTTTCGTTTT SEQ ID NO:159 ODNs basais (Todos os tetranucleotídeos que contêm CpG) 17-ACGA-5dG6 GGGGGGTTTTTTTACGATTT SEQ ID NO:160 18-GCGA-5dG6 GGGGGGTTTTTTTGCGATTT SEQ ID NO:161 19-CCGA-5dG6 GGGGGGTTTTTTTCCGATTT SEQ ID NO:162 20-TCGA-5dG6 GGGGGGTTTTTTTTCGATTT SEQ ID NO:163 21-ACGG-5dG6 GGGGGGTTTTTTTACGGTTT SEQ ID NO:164 22-GCGG-5dG6 GGGGGGTTTTTTTGCGGTTT SEQ ID NO:165 23-CCGG-5dG6 GGGGGGTTTTTTTCCGGTTT SEQ ID NO:166 24-TCGG-5dG6 GGGGGGTTTTTTTTCGGTTT SEQ ID NO:167 25-ACGC-5dG6 GGGGGGTTTTTTTACGCTTT SEQ ID NO:168 26-GCGC-5dG6 GGGGGGTTTTTTTGCGCTTT SEQ ID NO:169 27-CCGC-5dG6 GGGGGGTTTTTTTCCGCTTT SEQ ID NO:170 28-TCGC-5dG6 GGGGGGTTTTTTTTCGCTTT SEQ ID NO:171 29-ACGT-5dG6 GGGGGGTTTTTTTACGTTTT SEQ ID NO:172 30-GCGT-5dG6 GGGGGGTTTTTTTGCGTTTT SEQ ID NO:173 31-CCGT-5dG6 GGGGGGTTTTTTTCCGTTTT SEQ ID NO:174 32-TCGT-5dG6 GGGGGGTTTTTTTTCGTTTT SEQ ID NO:175

ODNs basais modificados por 5’-Gwire2 33-ACGA-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGATTT SEQ ID NO:176 34-GCGA-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGATTT SEQ ID NO:177 35-CCGA-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGATTT SEQ ID NO:178 36-TCGA-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGATTT SEQ ID NO:179 37-ACGG-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGGTTT SEQ ID NO:180 38-GCGG-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGGTTT SEQ ID NO:181 39-CCGG-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGGTTT SEQ ID NO:182 40-TCGG-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGGTTT SEQ ID NO:183 41-ACGC-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGCTTT SEQ ID NO:184 42-GCGC-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGCTTT SEQ ID NO:185 43-CCGC-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGCTTT SEQ ID NO:186 44-TCGC-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGCTTT SEQ ID NO:187 45-ACGT-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGTTTT SEQ ID NO:188 46-GCGT-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT SEQ ID NO:189 47-CCGT-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGTTTT SEQ ID NO:190 48-TCGT-Gwire2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGTTTT SEQ ID NO:191 Gwire2 GGGGTTGGGGTTTT SEQ ID NO:258

[0202] Os dezesseis 14-mer ODNs que compreendem todas as permutações potenciais de tetranucleotídeos com um CpG central estavam amplamente inativas em TLR21 até 1000 nM de concentração, com a exceção das espécies que contêm ACGC e que contêm CCGC (ODNs 9 e 11, respectivamente), que mostraram um sinal detectável na mais alta concentração.

[0203] A adição de dG6 (GGGGGG) à extremidade 5’ de ODNs basais (SEQ ID NOs:144-159) levou a alguma atividade estimulatória de TLR21 na maioria dos casos, com a exceção de CCGA (ODN 19), CCGG (ODN 23), GCGC (ODN 26) e CCGT (ODN 31) (FIGs. 26B, 27B, 28B e 29B). Isso confirma o potencial de 5’-GGGGGG para conferir atividade de TLR21 a ODNs de CpG, embora com a exceção de GCGG (ODN 22), ACGA (ODN 25) e TCGC (ODN 28), a intensidade de sinal para cada um era fraca (FIGs. 27B e 28B).

[0204] A adição de Gwire2 (GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258)) à extremidade 5’ de ODNs basais (SEQ ID NOs:144- 159) levou à atividade estimulatória de TLR21 em todos os casos, em que 5dG6 foi bem-sucedido, e em adição para CCGA (ODN 35), CCGG (ODN 39) e GCGC (ODN 42), enquanto CCGT (ODN 47) permaneceu refratário (FIGs. 26C, 27C, 28C e 29C e 29D). No entanto, a intensidade de sinal obtida com fixação de Gwire2 foi muito mais alta do que visto com 5dG6. Isso foi particularmente evidente para GCGA (ODN 18 em função de ODN 34 (FIGs. 26B e 26C, respectivamente), GCGG (ODN 22 em função de ODN 38 (FIGs. 27B e 27C, respectivamente)), ACGC (ODN 25 em função de ODN 41 (FIGs. 28B e 28C, respectivamente)), CCGC (ODN 27 em função de ODN 43 (FIGs. 28B e 28C, respectivamente)), TCGC (ODN 28 em função de ODN 44 (FIGs. 28B e 28C, respectivamente)), e GCGT (ODN 30 em função de ODN 46 (FIGs. 29B e 29C, respectivamente)). O último ODN, 46, GCGT-Gwire2 era a espécie mais notável: o mesmo exibiu atividade estimulatória de TLR21 surpreendente já em concentrações picomolares, e a EC50 poderia ser determinada como próxima de 2 nM (FIG. 29D).

[0205] Os elementos de sequência que contêm CpG GCGA, GCGG, ACGC, CCGC GCGT e, talvez, também TCGC, não foram anteriormente descritos no contexto de ativação de TLR21.

[0206] Série XCGA. Nenhum dos 14-mers da série XCGA mostrou qualquer atividade de TLR21 até 1000 nM. A adição de 5’-dG6 leva a alguma atividade de GCGA>ACGA>TCGA, enquanto CCGA permanece inativo. Mais notavelmente, a adição de 5’- Gwire2 leva à atividade de TLR21 para todos os quatro derivados. Um aumento drástico na atividade de TLR21 é notado para GCGA, enquanto os outros têm atividade aumentada na ordem relativa TCGA>ACGA>CCGA (FIGs. 26A-C).

[0207] Série XCGG. Dois dos 14-mers da série XCGG mostram quão pequena, caso haja, é a atividade de TLR21 a 1000 nM (GCGG, TCGG), enquanto os outros dois oligonucleotídeos estão inativos. A adição de 5’-dG6 leva à alguma atividade de GCGG>ACGG>=TCGG, enquanto CCGG permanece inativo. Mais notavelmente, a adição de 5’-Gwire2 leva à atividade de TLR21 para todos os quatro derivados. Um aumento drástico na atividade de TLR21 é notado para GCGG, enquanto os outros têm atividade aumentada na ordem relativa TCGG>ACGG>CCGG (FIGs. 27A-C).

[0208] Série XCGC. Dois dos 14-mers da série XCGC mostram quão pequena, caso haja, é a atividade de TLR21 a 1000 nM e 500 nM (ACGC, CCGC), enquanto os outros dois estão inativos. A adição de 5’-dG6 leva à atividade forte de TCGC>ACGC>CCGC, enquanto GCGC permanece inativo. Mais notavelmente, a adição de 5’-Gwire2 leva, mais uma vez, à atividade de TLR21 para todos os quatro derivados. Um grande aumento na atividade de TLR21 é notada para TCGC>ACGC>CCGC, nessa ordem de atividade, enquanto GCGC permanece fraco (FIGs. 28A-C).

[0209] Série XCGT. Nenhum dos 14-mers da série XCGT mostrou qualquer atividade de TLR21 até 1000 nM (FIG. 29A). A adição de 5’-dG6 leva a alguma atividade de todos os quatro, na ordem de atividade TCGT>GCGT>ACGT> CCGT (FIG. 29B). Mais notavelmente, a adição de 5’-Gwire2 leva a um aumento drástico na atividade de TLR21 para GCGT e a atividade de TCGT também é maior do que notado para TCGT- 5dG6 (FIG. 29C). A atividade de ACGT e CCGT modificados por Gwire2 não é maior que os derivados de 5dG6 (FIGs. 29C e 29D). O Gwire2 14mer ODN sozinho (GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID

NO:258)), que é fixado aos ODNs basais, é inativo em TLR21 (vide Tabela 49, FIG. 29). Exemplo 6: A cadeia principal da sequência mais potente é GCGT-Gwire2: Relação de estrutura-atividade (SAR)

[0210] As investigações de SAR de GCGT-Gwire2 incluíram modificar o elemento de CpG central pela inversão (GC), e pirimidina-pirimidina (TG) assim como troca de purina-purina (CA) (Tabela 30). O teste desses derivados em células HEK293- NFκB-bsd-cTLR21 quanto sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 revelou uma perda completa de atividade após essas manipulações (Tabela 31, FIG. 30), confirmando que a atividade estimulatória de TLR21 potente de GCGT-Gwire2 é crucialmente dependente da presença desse único elemento de CpG. Tabela 30: Sequências de ODN GCGT-Gwire2 SEQ ID NO:189 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-GC SEQ ID NO:192 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGGCTTTT GCGT-Gwire2-TG SEQ ID NO:193 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGTGTTTT GCGT-Gwire2-CA SEQ ID NO:194 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCATTTT GCGT-Gwire2 SEQ ID NO:189 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T1 SEQ ID NO:195 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T2 SEQ ID NO:196 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T3 SEQ ID NO:197 GGGGTTGGGGTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T4 SEQ ID NO:198 GGGGTTGGGGTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T5 SEQ ID NO:199 GGGGTTGGGGTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-T6 SEQ ID NO:200 GGGGTTGGGGTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2 SEQ ID NO:189 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-eT1 SEQ ID NO:201 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTT GCGT-Gwire2-eT2 SEQ ID NO:202 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTT GCGT-Gwire2-eT3 SEQ ID NO:203 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGT

GCGT-Gwire2 SEQ ID NO:189 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire3 SEQ ID NO:224 GGGGTTGGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT

[0211] O número de dTs entre o elemento Gwire2 e o elemento GCGT também foi diminuído (Tabela 30), e os ODNs correspondentes foram testados: Tabela 31: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) GCGT-Gwire2 2886 272 GCGT-Gwire2-GC Inativo - GCGT-Gwire2-TG Inativo - GCGT-Gwire2-CA Inativo - GCGT-Gwire2 2886 272 GCGT-Gwire2-T1 1710 283 GCGT-Gwire2-T2 4194 286 GCGT-Gwire2-T3 7874 226 GCGT-Gwire2-T4 2477 278 GCGT-Gwire2-T5 8881 195 GCGT-Gwire2-T6 6527 136 GCGT-Gwire2 2886 272 GCGT-Gwire2-eT1 2459 168 GCGT-Gwire2-eT2 9422 27 GCGT-Gwire2-eT3 Inativo - GCGT-Gwire2 2886 272 GCGT-Gwire3 373 344

[0212] Os resultados de deleções T1-T4 em GCGT-Gwire2 levaram à poucas alterações em Vmáx, e, exceto por T3,

valores EC50 amplamente semelhantes. No entanto, as deleções de T5 e T6 levaram a EC50 aumentada, e, particularmente, uma diminuição em Vmáx, sugerindo uma perda de atividade intrínseca (Tabela 31, FIG. 31).

[0213] Para um terceiro estudo de SAR, o número de Ts que flanqueiam o elemento de GCGT na extremidade 3’ do ODN foi diminuído (Tabela 30), e os ODNs correspondentes foram testados. Os efeitos foram imediatamente óbvios. Enquanto a perda de um T (eT1) levou a uma Vmáx diminuída sob preservação da EC50, a perda de dois Ts (eT2) aumentou EC50 e reduziu drasticamente Vmáx, perda de três dTs eliminou a atividade juntos (Tabela 31, FIG. 32).

[0214] Em um quarto experimento, o efeito de incorporar um motivo de GGGGTT adicional (GCGT-Gwire3, Tabela 30) na atividade estimulatória de TLR21 intrínseca de GCGT-Gwire2 foi investigado. A atividade de GCGT-Gwire3 foi superior àquela do GCGT-Gwire2 parental (Tabela 31, FIGs. 33A e 33B). A EC50 era 8 vezes menor e a Vmáx também aumentou (Tabela 31). Os resultados de SAR preliminares de oligonucleotídeos de GCGT-Gwire2 imunoestimulatórios são ilustrados na FIG.

34. Exemplo 7: A influência de número de cópia de elemento de CpG na atividade estimulatória de TLR21 de espécies de XCGX- Gwire2 selecionadas Tabela 32: Sequências de ODN (O sublinhado indica elementos de XCGX.) GCGT-Gwire2 SEQ ID NO:189 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-do SEQ ID NO:204 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTTGCGTTTT GCGT-Gwire2-tri SEQ ID NO:205 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGTTTTGCGTTTTTGCGTTTT GCGA-Gwire2 SEQ ID NO:177 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGATTT GCGA-Gwire2-do SEQ ID NO:206 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGATTTGCGATTT

GCGA-Gwire2-tri SEQ ID NO:207 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGATTTGCGATTTGCGATTT ACGC-Gwire2 SEQ ID NO:184 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGCTTT ACGC-Gwire2-do SEQ ID NO:208 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGCTTTACGCTTT ACGC-Gwire2-tri SEQ ID NO:209 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTACGCTTTACGCTTTACGCTTT TCGC-Gwire2 SEQ ID NO:187 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGCTTT TCGC-Gwire2-do SEQ ID NO:210 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGCTTTTCGCTTT TCGC-Gwire2-tri SEQ ID NO:211 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTTCGCTTTTCGCTTTTCGCTTT CCGC-Gwire2 SEQ ID NO:186 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGCTTT CCGC-Gwire2-do SEQ ID NO:212 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGCTTTCCGCTTT CCGC-Gwire2-tri SEQ ID NO:213 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTCCGCTTTCCGCTTTCCGCTTT GCGG-Gwire2-mo SEQ ID NO:181 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGGTTT GCGG-Gwire2-do SEQ ID NO:214 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGGTTTGCGGTTT GCGG-Gwire2-tri SEQ ID NO:215 GGGGTTGGGGTTTTTTTTTTTGCGGTTTGCGGTTTGCGGTTT

Tabela 33: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) GCGT-Gwire2 2886 272 GCGT-Gwire2-do 44,5 426 GCGT-Gwire2-tri 13,7 457

GCGA-Gwire2 1996 220 GCGA-Gwire2-do 48,8 441 GCGA-Gwire2-tri 22,7 421

ACGC-Gwire2 3020 288 ACGC-Gwire2-do 379 267 ACGC-Gwire2-tri 46,0 441

TCGC-Gwire2 2232 341 TCGC-Gwire2-do 180 421 TCGC-Gwire2-tri 26,2 488

ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) CCGC-Gwire2 3758 240 CCGC-Gwire2-do 74,2 401 CCGC-Gwire2-tri 4,4 428 GCGG-Gwire2 19903 22 GCGG-Gwire2-do 391 333 GCGG-Gwire2-tri 89,5 470

[0215] GCGT-Gwire2 mostrou a EC50 nanomolar esperada. A adição de um segundo elemento GCGTTTT (GCGT-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um grande aprimoramento de EC50 (por um fator de ~65) e um aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 35A e 35B). A adição adicional de um elemento GCGTTTT (GCGT-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 3 (compósito 135) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 35A e 35B).

[0216] GCGA-Gwire2 mostrou a EC50 nanomolar esperada. A adição de um segundo elemento GCGATTT (GCGA-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um forte aprimoramento de EC50 (por um fator de ~24) e um aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 36A e 36B). A adição adicional de um elemento GCGATTT (GCGT-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 2 (compósito 48) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 36A e 36B).

[0217] ACGC-Gwire2 mostrou a EC50 nanomolar esperada. A adição de um segundo elemento ACGCTTT (ACGC-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um aprimoramento brando de EC50 (por um fator de ~8) e um aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 37A e 37B). A adição adicional de um elemento ACGCTTT

(ACGC-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 8 (compósito 64) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 37A e 37B).

[0218] TCGC-Gwire2 mostrou a EC50 nanomolar esperada. A adição de um segundo elemento TCGCTTT (TCGC-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um forte aprimoramento de EC50 (por um fator de ~12) e um aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 38A e 38B). A adição adicional de um elemento TCGCTTT (TCGC-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 7 (compósito 84) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 38A e 38B).

[0219] CCGC-Gwire2 mostrou a EC50 nanomolar esperada. A adição de um segundo elemento CCGCTTT (CCGC-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um grande aprimoramento de EC50 (por um fator de ~50) assim como Vmáx (Tabela 33, FIGs. 39A e 39B). A adição adicional de um elemento CCGCTTT (CCGC-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 17 (compósito 850) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIGs. 39A e 39B)

[0220] GCGG-Gwire2 mostrou apenas sinais fracos na faixa de concentração baixa considerada. A adição de um segundo elemento GCGGTTT (GCGG-Gwire2-do, Tabela 32) na extremidade 3’ levou a um grande aprimoramento de EC50 assim como Vmáx (por um fator de ~51) (Tabela 33, FIG. 40). A adição adicional de um elemento GCGGTTT (GCGG-Gwire2-tri, Tabela 32) levou a uma outra diminuição em EC50 por um fator de 4 (compósito 204) e um ligeiro aumento em Vmáx (Tabela 33, FIG. 40).

[0221] Em suma, é mostrado que a adição de mais elementos de sequência estimulatórios de TLR21 que contém CpG a oligonucleotídeos que têm uma sequência de Gwire2 e um único elemento de CpG leva a aprimoramentos de EC50 de um fator de 8 a um fator de 55, enquanto a Vmáx é tipicamente dobrada. A adição de um terceiro elemento também aprimorou uniformemente a atividade estimulatória de TLR21 adicional. Parece que esse é um método genérico para gerar altas atividades de acertos de atividade baixa iniciais simples. Exemplo 8: Obter ODNs estimulatórios de TLR21 de alta atividade com uma vantagem de síntese/custo de produtos: adição de ou substituição de nucleotídeo por espaçadores de alquila e etileno glicol a) entre elementos de sequência que contêm CpG, e b) dentro da fração de formação de G-quarteto e em sua borda para o elemento de sequência que contém CpG

[0222] A tecnologia de 5’-Gwire2 (GGGGTTGGGGTTTT (SEQ ID NO:258)) foi usada para investigar a potência estimulatória de TLR21 de uma sequência estimulatória conceitualmente simples: três CpGs consecutivos encerrados por quatro dTs na extremidade 5’ e três dTs na extremidade 3’ (Tabela 34 CG- Gw2-T0). A influência de espaçamento dos elementos de CpG na atividade estimulatória de TLR21 foi investigada pela inserção gradual de um, dois, três e quatro dTs entre os três elementos de CpG (resultando em CG-Gw2-T1 - CG-Gw2-T4, Tabela 34). Um ensaio de estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 para determinar a habilidade dos ODNs na Tabela 34 para estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado, e os valores de EC50 e Vmáx foram calculados (Tabela 35, FIGs. 41A e 41B). Tabela 34: Sequências de ODN CG-Gw2-T0 SEQ ID NO:216 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGCGCGTTT CG-Gw2-T1 SEQ ID NO:217 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTCGTCGTTT

CG-Gw2-T2 SEQ ID NO:218 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTTCGTTCGTTT CG-Gw2-T3 SEQ ID NO:219 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTTTCGTTTCGTTT CG-Gw2-T4 SEQ ID NO:220 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTT Tabela 35: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) CG-Gw2-T0 Inativo - CG-Gw2-T1 133 378 CG-Gw2-T2 617 350 CG-Gw2-T3 16,6 335 CG-Gw2-T4 11,3 333

[0223] Notavelmente, CG-Gw2-T0 estava completamente inativo em TLR21 na faixa de concentração considerada (até 20 nM), enquanto um dT de espaçamento entre o CpGs já levou a um ODN fortemente estimulatório com uma EC50 na faixa picomolar. Um segundo dT entre os CpGs não aprimoraram a atividade, mas dT3 e dT4 levaram à EC50 de 16,6 e 11,3 pM, respectivamente (Tabela 35, FIGs. 41A e 41B). Isso sugere que a presença completa de elementos de CpG não é suficiente para a atividade; os mesmos precisam estar no contexto certo. A atividade estimulatória de TLR21 requer uma base no grupo espaçador?

[0224] Um ODN com ponte de desoxirribosefosfato (“sítios abásicos”) entre os CpGs, ao invés de dTs (CG-Gw2-abase) foi sintetizado. Esse ODN e o CG-Gw2-T1 parental foram testados em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 por sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 36,

FIGs. 42A e 42B). Tabela 36: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência CG-Gw2-T1 SEQ ID NO:217 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTCGTCGTTT CG-Gw2-abase SEQ ID NO:221 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGXCGXCGTTT X = sítio abásico Tabela 37: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) CG-Gw2-T1 133 378 CG-Gw2-abase 34 299

[0225] Surpreendentemente, CG-Gw2-abase (FIG. 43) mostrou até mesmo potência um tanto mais alta em TLR21 (EC50 = 34 pM) do que CG-Gw2-T1 (EC50 = 133 pM), enquanto a Vmáx era um tanto menor (Tabela 37, FIGs. 42A e 42B). Esse resultado mostra que uma base no nucleotídeo de espaçamento no ODN de CG-Gw2- T1 não é apenas não requerido para estimulação de TLR21, mas tem um impacto negativo na EC50. Impacto de grupos espaçadores lineares na atividade de TLR21 de ODNs de CG-Gw2

[0226] Nesse estudo, o nucleotídeo de dT que espaça dois CpGs em CG-Gw2-T1 foi substituído por um ligante de hexaetilenoglicol “C18”, ou um ligante de propanodiol “C3” (Tabela 38). Esses ODNs foram testados em células HEK293- NFκB-bsd-cTLR21 por sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 Tabela 38: Sequências de ODN

ODN SEQ ID NO Sequência CG-Gw2-T1 SEQ ID NO:217 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTCGTCGTTT CG-Gwire2 = SEQ ID NO:219 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTTTCGTTTCGTTT CG-Gw2-T3 CG-Gw2X1 SEQ ID NO:222* GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX1CGX1CGTTT CG-Gw2X2 SEQ ID NO:223* GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGTTT X1=C18 X2=C3 *Conforme referido no presente documento, CG-Gw2X1 e CG-Gw2X2 se referem às sequências totais mostradas nessa tabela, incluindo os ligantes de não nucleotídeo X1 e X2.

Tabela 39: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) CG-Gw2-T1* 133* 378* CG-Gwire2 = 12,5 183 CG-Gw2-T3 CG-Gw2X1 Inativo - CG-Gw2X2 96,5 284 *Tomados juntos do estudo anterior

[0227] Enquanto um espaçador de C18, formado por hexaetilenoglicol quando inserido entre elementos de CpG de CG-Gw2 (Tabela 36, FIG. 43), leva a um ODN inativo para TLR21 (Tabela 39, FIG. 44A), a mesma modificação com um espaçador de C3 (1,3-propanodiol, CG-Gw2X2, Tabela 38, FIG. 43) não apenas retém, mas até mesmo aprimora ligeiramente a eficácia do CG-Gw2-T1 parental em relação a EC50 (Tabela 39, FIG. 44B). Dada a simplicidade da estrutura de espaçador de C3 comparada a um nucleotídeo (FIG. 43), esse é um resultado mais notável. Considerando que um sítio abásico, como o espaçador de C3, compreende três átomos de carbono conectados entre as duas ligações de fosfodiéster, é possível que C3 seja uma forma simplificada da estrutura de sítio abásico altamente ativo (vide FIG. 43), e também suporta eficientemente a ativação de TLR21. Investigações na atividade estimulatória de TLR21 de G-wire e TGGGGT (SEQ ID NO: 265)- estruturas de CpG conectadas a espaçador de C3 ativado

[0228] Nesse estudo, ou um elemento de GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) G-wire (CG-Gw2X2-1) ou um de TGGGGT (SEQ ID NO: 265) (CG-G4T16X2-1) foi conectado a TTTTTTTTCG-X2-CGTTT (SEQ ID NO. 271) (Tabela 40), e a potência estimulatória de TLR21 foi avaliada. Então, ambos os ODNs foram adicionalmente modificados pelas adições consecutivas de espaçadores de C3 conectados a um motivo de CpG, produzindo ODNs com três, quatro e cinco motivos de CpG, cada um separado por C3 (Tabela 40). Sua potência de ativação em TLR21 também foi avaliada em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme explicado no Exemplo 3 (Tabela 41, FIGs. 45 e 46). Tabela 40: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência CG-Gw2X2-1 SEQ ID NO:225* GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGTTT CG-Gw2X2-2 SEQ ID NO:223* GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGTTT CG-Gw2X2-3 SEQ ID NO:226* GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGTTT GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGX2CGT CG-Gw2X2-4 SEQ ID NO:227*

TT GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGX2CGX CG-Gw2X2-5 SEQ ID NO:228* 2CGTTT CG-G4T16X2- SEQ ID NO:229* 1 TGGGGTTTTTTTTCGX2CGTTT

ODN SEQ ID NO Sequência CG-G4T16X2- SEQ ID NO:230* 2 TGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGTTT CG-G4T16X2- SEQ ID NO:231* 3 TGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGTTT CG-G4T16X2- SEQ ID NO:232* 4 TGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGX2CGTTT CG-G4T16X2- TGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGX2CGX2CGX2CGTT SEQ ID NO:233* 5 T X2=C3 *Conforme referido no presente documento, CG-Gw2X2-1 a -5 e CG- G4T16X2-1 a -5 se referem às sequências totais mostradas nessa tabela, incluindo os ligantes de não nucleotídeo X2.

Tabela 41: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) ODN EC50 picomolar (pM) Vmáx milliOD 405nm/min (mOD405/min) CG-Gw2X2-1 312 283 CG-Gw2X2-2 78,5 267 CG-Gw2X2-3 7,4 254 CG-Gw2X2-4 4,9 250 CG-Gw2X2-5 6,5 253 CG-G4T16X2-1 1408 266 CG-G4T16X2-2 21,6 259 CG-G4T16X2-3 5,1 297 CG-G4T16X2-4 5,6 279 CG-G4T16X2-5 5,7 283

[0229] Na ativação de G-wire, o primeiro ODN com dois motivos de CpG separados por C3 mostrou atividade já picomolar (EC50 = 312 pM), embora na faixa de três dígitos.

Um terceiro CpG separado por C3 forneceu uma EC50 de 78,5 pM, que se compara bem com 96,5 pM determinada para uma segunda batelada sintetizada separadamente (vide Tabela 39). A adição de um quarto motivo de CpG separado por C3 forneceu um outro aumento de 10 vezes em potência (EC50 = 7,4 pM). As adições de quinto e sexto motivos de CpG separados por C3 retiveram a alta potência e ainda resultaram em pequeno aprimoramento. Essas potências picomolares de único dígito estão dentre as mais altas atividades vistas até então em TLR21, um feito notável e inesperado para elementos estruturais tão simples quanto os motivos de CpG separados por propanodiolfosfato (Tabela 41, FIGs. 44A e 44B). A substituição do elemento de G-wire nas séries X2-1 a X2-5 pelo elemento GTTTTG conhecido por promover estruturas de G- quarteto intermoleculares paralelas (Tabela 40) levou a ODNs de potência semelhante ainda mais semelhante em parte (Tabela 41, FIGs. 46A e 46B). Investigações do impacto do comprimento de espaçador e estrutura química detalhada na atividade estimulatória de TLR21 de motivos de CpG conectados a espaçador de C3 conectado por G-wire

[0230] Nesse estudo, um G-wire de GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) foi conectado a TTTTTTTTCG-X-CGXCGTTT (SEQ ID NO:260) (Tabela 42), e a potência estimulatória de TLR21 foi analisada. X é uma série de fosfatos de alquildiol usados para separar motivos de CpG (Tabela 42, FIG. 47), dos quais ODN-X3 era uma síntese repetida de CG-Gw2X2 (vide Tabela 38) e CG-Gw2X2-2 (vide Tabela 40). Ademais, um oligonucleotídeo que compreende um espaçador abásico (Tabela 42, FIG. 49; vide CG-Gw2-abase (SEQ ID NO:221 na Tabela 36)) assim como um espaçador de derivado de trietilenoglicol (um ligante de “C8”, FIG. 49) foram analisados para a estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3. Tabela 42: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência CG-Gw2-T1 SEQ ID NO:217 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGTCGTCGTTT GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX2CGX2CGTTT ODN-X2 SEQ ID NO:234* (X2 = Etanodiol) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX3CGX3CGTTT ODN-X3 SEQ ID NO:223* (X3 = Propanodiol) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX4CGX4CGTTT ODN-X4 SEQ ID NO:235* (X4 = Butanodiol) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX6CGX6CGTTT ODN-X6 SEQ ID NO:236* (X6 = Hexanodiol GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX9CGX9CGTTT ODN-X9 SEQ ID NO:237* (X9 = Nonanodiol) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGX12CGX12CGTTT ODN-X12 SEQ ID NO:238* (X12 = Dodecanodiol) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGXabCGXabCGTTT ODN-Xab SEQ ID NO:239 (Xab = dSpacer (abásico)) GGGGTTGGGGTTTTTTTTCGXtrCGXtrCGTTT ODN-XtrEG SEQ ID NO:240* (Xtr = Trietilenoglicol) *Conforme referido no presente documento, ODN-X2, -X3, -X4, -X6, - X9, -X12 e -XtrEG se referem a sequências totais mostradas nessa tabela, incluindo os ligantes de não nucleotídeo X2, X3, X4, X6, X9, X12 e Xtr.

Tabela 43: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

ODN EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min (pM) (mOD405/min) CG-Gw2-T1* 133* 378* ODN-X2 368 566 ODN-X3 149 554 ODN-X4 91,6 522 ODN-X6 8176 680 ODN-X9 12644 372 ODN-X12 Inativo - ODN-Xab 127 592 ODN-XtrEG 3095 427 *Tomados juntos do estudo anterior

[0231] Estruturalmente, o espaçamento entre o 3’-fosfato de um elemento de CpG para o 5’-fosfato do próximo elemento de CpG em CG-Gw2-T1 é por meio de três átomos de carbono ligados de 5’C a 4’C a 3’C (FIG. 49). A mesma distância é mantida, quando um sítio abásico é usado, à medida que a falta da base não muda a fração de desoxirribose. A mesmíssima disposição é mantida em ODN-X3, em que três grupos metileno (-CH2-) formam o espaçador entre os grupos 3’- e 5’-fosfato (FIG. 47). De modo interessante, sua potência em TLR21, conforme determinado pela EC50, é altamente semelhante (133 pM, 127 pM e 149 pM, respectivamente; Tabela 43), sugerindo que a distância física é mais importante do que a estrutura química detalhada (por exemplo, presença de base, integridade da fração de desoxirribose), uma vez que o ligante 1,3-propanodiol mais simples concebível que mantém parcialmente a geometria da desoxirribose não parece ser uma desvantagem (Tabela 43, FIGs. 49A e 49B).

[0232] Com base na constatação de que 1,3-propanodiol é equivalente como um espaçador à desoxitimina (dT) ou um sítio abásico (Tabela 43), que também já foi sugerido pelos experimentos anteriores (Tabelas 36-39), foi investigado o efeito do comprimento do espaçador na atividade de TLR21.

[0233] O etanodiol derivado mais curto (ODN-X2, Tabela 42, FIG. 47) era mais fraco na estimulação de atividade de TLR21 em comparação com o ODN-X3 derivado de 1,3-propanodiol (Tabela 42, FIG. 47), por um fator de mais de dois (Tabela 43, FIGs. 50A e 50B). Em contrapartida, o espaçador no ODN- X4 derivado de 1,4-butanodiol (Tabela 42, FIG. 47) conferiu atividade ligeiramente maior (Tabela 43, FIGs. 50A e 50B), enquanto o alongamento adicional por dois grupos metila adicionais (1,6-hexanodiol, ODN-X6) ou 5 grupos metileno adicionais (1,9-nonanodiol, ODN-X9) (Tabela 42, FIG. 47) diminuíram drasticamente a potência de estimulação de TLR21 por um fator de 89 e 138, respectivamente (Tabela 43, FIGs. 50A e 50B). Um espaçador com 12 grupos metileno (1,12, dodecanodiol, ODN-X12) (Tabela 42, FIG. 47) estava completamente inativo na faixa de concentração considerada na Tabela 43, FIGs. 50A e 50B). Um ligante de trietilenoglicol (TEG) também foi explorado (ODN-XtrEG, Tabela 42, FIG. 48). Esse derivado corresponde estericamente a um ligante de C8. Portanto, foi notável que sua EC50 de TLR21 era significativamente menor que aquela do ODN-X9 derivado de 1,9-nonanodiol, e ainda menor que a EC50 para o ODN-X6 derivado de 1,6-hexanodiol) (vide Tabela 43, FIG. 51) O princípio de espaçador de C3 também funciona para as estruturas de tetranucleotídeo que contêm CpG?

[0234] Os ODNs ativos em TLR21 que contém espaçador de

C3-(1,3-propanodiol) que têm estruturas de tetranucleotídeo que contêm CpG foram examinados. Para esse fim, em um primeiro experimento a sequência de 5’-G-wire que contém ACGC-Gw2X1, ACGC-Gw2X2, CCGC-Gw2X1 e CCGC-Gw2X2 foi sintetizada e testada em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 quanto sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 44). Isso se seguiu pela síntese e teste de TLR21 do ACGC-G4T16X2 e CCGC-G4T16X2 que contêm 5’-G4T16 (Tabela 44). Tabela 44: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência ACGC-Gw2X1 GGGGTTGGGGTTTTTTTTACGCX1ACGCX1ACGCTTT SEQ ID NO:241** X1 = C18 (HEG*) CCGC-Gw2X1 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCCGCX1CCGCX1CCGCTTT SEQ ID NO:242** X1 = C18 (HEG*) ACGC-Gw2X2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTACGCX2ACGCX2ACGCTTT SEQ ID NO:243** X2 = Propanodiol CCGC-Gw2X2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTCCGCX2CCGCX2CCGCTTT SEQ ID NO:244** X2 = Propanodiol ACGC-G4T16- TGGGGTTTTTTTTACGCX2ACGCX2ACGCTTT SEQ ID NO:245** X2 X2 = Propanodiol CCGC-G4T16- TGGGGTTTTTTTTCCGCX2CCGCX2CCGCTTT SEQ ID NO:246** X2 X2 = Propanodiol *Hexaetilenoglicol *Conforme referido no presente documento, ACGC-Gw2X1, CCGC-Gw2X1, ACGC-Gw2X2, CCGC-Gw2X2, ACGC-G4T16-X2 e CCGC-G4T16-X2 se referem a sequências totais mostradas nessa tabela, incluindo os ligantes de não nucleotídeo X1 e X2.

Tabela 45: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

ODN EC50 Vmáx milliOD 405nm/min picomolar (mOD405/min) (pM) ACGC-Gw2X1 Inativo - CCGC-Gw2X1 1238 64 ACGC-Gw2X2 112 307 CCGC-Gw2X2 91,3 323 ACGC-G4T16-X2 68,1 277 CCGC-G4T16-X2 20,3 230

[0235] O espaçamento de C3 de sequências de tetranucleotídeo de CpG é claramente capaz de estimular TLR21. ACGC-Gw2X2 e CCGC-Gw2X2 (Tabela 44) exibiram EC50s de TLR21 (Tabela 45, FIGs. 52A e 52B) em uma faixa observada anteriormente para CG-Gw2X2/ODN-X3 (compare Tabelas 39 e 43). Conforme observado anteriormente para CG-Gw2X1 (Tabela 39), e conforme predito pelas relações de estrutura- atividade, os derivados de hexaetilenoglicol (HEG, “C18”) ACGC-Gw2X1 e CCGC-Gw2X1 estavam inativos, ou muito fracos, respectivamente (Tabela 45, FIGs. 52A e 52B). A substituição da sequência de 5’-G-wire pela outra 5’-estrutura privilegiada identificada anteriormente (TGGGGT (SEQ ID NO: 265), G4T16) produziu dois derivados, ACGC-G4T16-X2 e CCGC- G4T16-X2, com EC50 adicionalmente aprimorada (Tabela 45, FIGs. 53A e 53B). Impacto de ligantes de C3 e C18 a/na sequência rica em 5’-G de ODNs de ativação de TLR21

[0236] Foi investigado se os espaçadores de C3 (1,3- propanodiol) ou espaçadores de C18 (hexaetilenoglicol, HEG) podem aprimorar a atividade de ODNs que contêm 5’-G-quarteto ativo em TLR21, quando colocado entre o motivo de CpG e a sequência de G-quarteto, ou quando posicionado na sequência de G-quarteto. Dois ODNs com base em 2006-PDE5dG4 foram sintetizados. Um com um ligante 3’ de C18 de a jusante da sequência de dG4 (2006-PDE5dG4-X1) e um com um ligante de C3 na mesma posição (2006-PDE5dG4-X2) (Tabela 46). Ademais 2006-G-wire1 foi modificado substituindo-se os T’s na sequência GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 257) por qualquer um dentre um ligante de C18 (2006-5dG4-X3) ou um ligante de C3 (2006- 5dG4-X4). Todos esses derivados foram testados em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 por sua habilidade de estimular TLR21 conforme descrito no Exemplo 3 (Tabela 47). Tabela 46: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência 2006-PDE5dG4 SEQ ID NO:17 GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 2006-PDE5dG4-X1 SEQ ID GGGGX1TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:247** X1 = C18 (HEG*) 2006-PDE5dG4-X2 SEQ ID GGGGX2TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:248** X2 = Propanodiol 2006-PDE5dG4-X3 SEQ ID GGGGX3GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:249** X3 = C18 (HEG*) 2006-PDE5dG4-X4 SEQ ID GGGGX4GGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT NO:250** X4 = Propanodiol 2006-PDE-G-Wire1 SEQ ID NO:141 GGGGTTGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT *Hexaetilenoglicol *Conforme referido no presente documento, 2006-PDE5dG4-X1 a -X4 se referem às sequências totais mostradas nessa tabela, incluindo os ligantes de não nucleotídeo X1, X2, X3 e X4.

Tabela 47: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) 2006-PDE5dG4-N3 109 180 2006-PDE5dG4-X1 15,1 154 2006-PDE5dG4-X2 55,1 154 2006-PDE-G- 380 194 Wire1 2006-PDE5dG4-X3 78,6 150 2006-PDE5dG4-X4 86,1 142

[0237] Em 2006-PDE5dG4, a adição do espaçador de C18 entre dG4 e 2006-PDE aprimorou a atividade de TLR21 conforme medido por EC50 mais do que 6 vezes (Tabela 47, FIG. 54A). O espaçador de C3 na mesma posição aprimorou a estimulação de TLR21 por um fator de 2 (Tabela 47, FIG. 54A). Em 2006-PDE- G-wire1, a substituição dos dois Ts na sequência G-wire pelo espaçador de C18 aprimorou a atividade de TLR21 conforme medido por EC50 cerca de 5 vezes (Tabela 47, FIG. 54B). O espaçador de C3 na mesma posição aprimorou a estimulação de TLR21 por um fator de 4 (Tabela 47, FIG. 54B). Tomados juntos, os dados sugerem que as propriedades de ativação de TLR21 são não compreendidos pela presença de ligantes de C18 ou C3 e que os mesmos levam a atividades ainda mais aprimoradas. Exemplo 9: Modificação de 5’-colesterol, mas não de 3’- colesterol, de ODNs resulta em atividade estimulatória de TLR21 fortemente aumentada

[0238] O impacto da modificação de 3’-colesterol clássica e a modificação de 5’-colesterol mais raramente usada em potencial estimulatório de TLR21 de espécie de ODN moderada e altamente ativo ODN foi examinado. Modificação de 3’-colesterol

[0239] Uma modificação de 3’-colesterol comumente aplicada (FIG. 55) foi aplicada a dois ODNs altamente ativos em TLR21, 2006-Gwire2 e 2006-T4-5dTG4T (Tabela 48). Mais especificamente, ODNs que compreendem uma fração de 3’ colesterol foram adquiridos junto à Eurofins. A estrutura da fração de colesterol se baseou em 3’ Cholesterol SynBaseTM mostrado em www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cho lesterol_palmitate_modification/969_3-cholesterol-synbase- cpg-1000-110. Um teste de estimulação de TLR21 conforme explicado no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 48: Sequências de ODN ODN SEQ ID NO Sequência 2006- GGGGTTGGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTT SEQ ID NO:142 Gwire2 TGTCGTT

GGGGTTGGGGTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTT 2006-Gw2- SEQ ID NO:142 TGTCGTTX 3C 3’-Colesterila 2006-T4- TGGGGTTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTC SEQ ID NO:251 5dTG4T GTT

TGGGGTTTTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTC 2006- SEQ ID NO:251 GTTX T4TG4T-3C 3’-Colesterila Tabela 49: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

ODN EC50 picomolar (pM) Vmáx milliOD 405nm/min (mOD405/min) Medição 1 2006-Gwire2 19,7 389 2006-Gw2-3C 26,5 325 2006-T4-5dTG4T 19,2 372 2006-T4TG4T-3C 33,5 330 Medição 2 2006-Gwire2 13,7 291 2006-Gw2-3C 67,4 301 2006-T4-5dTG4T 11,7 298 2006-T4TG4T-3C 68,8 261

[0240] Os resultados sugerem que a atividade estimulatória de TLR21 de ambos os ODNs não foi aprimorada mediante a modificação de 3’-colesterol (Tabela 49, FIGs. 56A, 56B, 57A, 57B). A EC50 dos ODNs modificados por 3’- colesterol ainda aumentou (Tabela 49), sugerindo pequena perda de atividade estimulatória de TLR21.

[0241] ODNs que compreendem uma fração de 3’ colesterol foram adquiridos junto à Eurofins. A estrutura da fração de colesterol se baseou em 3’ Cholesterol SynBaseTM mostrado em www_linktech_co_uk/products/modifiers/hydrophobic_group_cho lesterol_palmitate_modification/969_3-cholesterol-synbase- cpg-1000-110. Modificação de 5’-colesterol (I)

[0242] A modificação de 5’-colesterol muito menos comumente aplicada (FIGs. 58A e 58B) foi sintetizada em um ODN altamente ativo em TLR21 identificado no curso dos estudos da depositante, GCGT3-TG4T (Tabela 50). Mais especificamente, ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na Genelink, e a estrutura da fração de lipídio desses ODNs se baseou na estrutura mostrada em www_genelink_com/newsite/products/MODPDFFILES/26-6602.pdf. Outros ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na Sigma Aldrich. A estrutura da fração de lipídio desses ODNs se baseou nas estruturas mostradas em www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma- Aldrich/General_Information/1/custom-oligonucleotide- modifications-guide.pdf, páginas 85/86. Outros ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na IBA Lifesciences e tinham uma estrutura com base naquela mostrada em www_iba- lifesciences_com/Services_custom_oligos_custom_DNa_Non- fluorescent_5-modifications.html. Um teste de estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 50: Sequências de ODN (letra maiúscula: Ligações de PDE, ligações de PTO em letra minúscula) ODN SEQ ID NO Sequência 5Chol-GCGT3- SEQ ID NO:252 XTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT TG4T X = 5’-Colesterila GCGT3-TG4T SEQ ID NO:252 TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT 2006-PTO SEQ ID NO:3 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt Tabela 51: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 1 5Chol-GCGT3-TG4T 2,4 338 GCGT3-TG4T 352 356 2006-PTO 4479 427

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 2 5Chol-GCGT3-TG4T 4,1 338 GCGT3-TG4T 623 356 2006-PTO 8790 427

[0243] Os resultados de duas medições independentes sugerem que a atividade estimulatória de TLR21 de GCGT3-TG4T é grandemente aprimorada pela modificação de 5’-colesterol (Tabela 51, FIGs. 59A, 59B). Em comparação com sua versão não modificada, a EC50 diminuiu mais do que duas ordens de grandeza em ambos os ensaios (fatores de 147 e 152, respectivamente, Tabela 51). O GCGT3-TG4T modificado por 5’- colesterila está dentre os ODNs estimulatório de TLR21 mais ativos identificados até então.

[0244] ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na Genelink, e a estrutura da fração de lipídio desses ODNs se baseou na estrutura mostrada em www_genelink_com/newsite/products/MODPDFFILES/26-6602.pdf. Outros ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na Sigma Aldrich. A estrutura da fração de lipídio desses ODNs se baseou nas estruturas mostradas em www_sigmaaldrich_com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma- Aldrich/General_Information/1/custom-oligonucleotide- modifications-guide.pdf, páginas 85/86. Outros ODNs que compreendem uma fração de 5’ colesterol foram pedidos na IBA Lifesciences e tinham uma estrutura com base naquela mostrada em www_iba- lifesciences_com/Services_custom_oligos_custom_DNa_Non- fluorescent_5-modifications.html.

Modificação de 5’-colesterol (I)

[0245] Uma modificação de 5’-colesterol (FIGs. 58A e 58B) foi sintetizada em dois ODN altamente ativo em TLR21 identificado no curso dos estudos da depositante, GCGT-3- TG4T e GCGT-3-Gw2 (Tabela 52), e um teste de estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 52: Sequências de ODN (Sigma) ODN SEQ ID NO Sequência GCGT3-TG4T- SEQ ID XTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT 5Chol NO:252 5’-Colesterila

SEQ ID GCGT3-TG4T TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:252 GCGT3-Gw2- SEQ ID XGGGGTTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT 5Chol NO:253 5’-Colesterila

SEQ ID GCGT-3-Gw2 GGGGTTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:253 Tabela 53: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 1 Titulação de 20 nM GCGT3-TG4T-5Chol 0,47 140 GCGT3-TG4T 4,5 134 GCGT-3-Gw2-5Chol 0,68 147 GCGT-3-Gw2 20,6 142 Medição 2 Titulação de 1 nM GCGT3-TG4T-5Chol 0,59 164

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) GCGT3-TG4T 7,5 159 GCGT-3-Gw2-5Chol 1,23 161 GCGT-3-Gw2 29,0 171

[0246] Os resultados de duas medições independentes sugerem que a atividade estimulatória de TLR21 tanto de GCGT- 3-TG4T quanto GCGT-3-Gw2 é grandemente aprimorada pela modificação de 5’-colesterol (Tabela 53, FIGs. 60A, 60B, 61A, 61B). Em com suas versões não modificadas, a EC50 diminuída em cerca de 1 ordem de grandeza em ambos os ensaios (fatores de 10 e 13 para GCGT-3-TG4T-5Chol, e fatores 30 e 24 para GCGT-3-Gw2-5Chol, respectivamente (Tabela 51). Os ODNs modificados por 5'-colesterila GCGT-3-TG4T e GCGT-3-Gw2 são os ODNs estimulatórios de TLR21 mais ativos identificados até então, exibindo valores de EC50 femtomolares. Modificação de 5’-colesterol (II)

[0247] Uma modificação de 5’-colesterol (FIGs. 58A e 58B) foi sintetizada em dois ODN altamente ativo em TLR21 identificado no curso dos estudos da depositante, GCGT-3- TG4T e GCGT-3-Gw2 (Tabela 54), e um teste de estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 54: Sequências de ODN (Sigma) ODN SEQ ID NO Sequência GCGT3-TG4T- SEQ ID XTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT 5Chol NO:252 X = 5’-Colesterila GCGT3-TG4T SEQ ID TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:252 GCGT3-Gw2- SEQ ID XGGGGTTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT

ODN SEQ ID NO Sequência 5Chol NO:253 X = 5’-Colesterila GCGT3-Gw2 SEQ ID GGGGTTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:253 GCGT3-5Chol SEQ ID XTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:254 X = 5’-Colesterila GCGT3 SEQ ID TTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:254 2006-PTO SEQ ID tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt NO:3 Tabela 55: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 1 Titulação de 20 nM GCGT3-TG4T-5Chol 2,1 112 GCGT3-TG4T 11,5 94 GCGT3-Gw2-5Chol 2,3 94 GCGT3-Gw2 21,9 91 GCGT3-5Chol 463 104 GCGT3 7840 99 2006-PTO 3931 114 Medição 2 Titulação de 1 nM GCGT3-TG4T-5Chol 3,4 119 GCGT3-TG4T 19,9 113 GCGT-3-Gw2-5Chol 5,2 115 GCGT-3-Gw2 53,6 120 GCGT3-5Chol 665 145 GCGT3 fraco -

[0248] Os resultados de duas medições independentes sugerem que a atividade estimulatória de TLR21 tanto de GCGT- 3-TG4T quanto GCGT-3-Gw2 é aprimorada pela modificação de 5’-colesterol (Tabela 55, FIGs. 62A, 62B, 63A, 63B). Em comparação com suas versões não modificadas, a EC50 diminuiu cerca de 5 a 10 vezes em ambos os ensaios (fator de aproximadamente 5 para GCGT3-TG4T-5Chol e fator de aproximadamente 10 para GCGT3-Gw2-5Chol (Tabela 55)). Foi mostrado nesse estudo que as sequências de 5’-dG não são necessárias para o efeito de intensificação de atividade de 5’-colesterol à medida que GCGT3-5Chol é aproximadamente 17 vezes mais ativo em comparação com seu congênere não modificado (Tabela 55, FIG. 64). Modificação de 5’-colesterol (III)

[0249] Uma modificação de 5’-colesterol (FIGs. 58A e 58B) foi sintetizada em GCGT3-TG4T por um outro fornecedor (Tabela 56), e um teste de estimulação de TLR21 em células HEK293- NFκB-bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 56: Sequências de ODN (IBA GmbH) ODN SEQ ID NO Sequência GCGT3- SEQ ID XTGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT TG4T-5Chol NO:252 X = 5’-Colesterila GCGT3-TG4T SEQ ID TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT NO:252 Tabela 57: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx)

EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 1 Titulação de 20 nM GCGT3-TG4T-5Chol 2,04 343 GCGT3-TG4T 2991 303 Medição 2 Titulação de 1 nM GCGT3-TG4T-5Chol 3,86 282 GCGT3-TG4T fraco -

[0250] A forma modificada por 5’-colesterila de GCGT3- TG4T mostrou atividade estimulatória de TLR21 altamente potente, com valores de EC50 em pM de único dígito (Tabela 57, FIGs. 65A e 65B). Em contrapartida, a forma de GCGT3- TG4T desprovida de 5’-colesterila foi, em relação a EC50, quase 1500 vezes menos potente, demonstrando a importância da modificação de 5’ lipídio (Tabela 57, FIGs. 65A e 65B). Modificação de 5’-colesterol (IV)

[0251] Uma modificação de 5’-colesterol (FIGs. 58A e 58B) foi sintetizada em um outro ODN altamente ativo em TLR21 com um núcleo de tetranucleotídeo de CpG diferente identificado no curso dos estudos da depositante, CCGC3-Gw2 (Tabela 58), e um teste de estimulação de TLR21 em células HEK293-NFκB- bsd-cTLR21 conforme descrito no Exemplo 3 foi realizado. Tabela 58: Sequências de ODN (Sigma) ODN SEQ ID NO Sequência 5Chol- SEQ ID XGGGGTTGGGGTTTTTTTTCCGCTTTTCCGCTTTTCCGCTTT CCGC3-Gw2 NO:255 X = 5’-Colesterila CCGC3-Gw2 SEQ ID GGGGTTGGGGTTTTTTTTCCGCTTTTCCGCTTTTCCGCTTT

ODN SEQ ID NO Sequência NO:255

SEQ ID XTTTTTTTCCGCTTTTCCGCTTTTCCGCTTT 5Chol-CCGC3 NO:256 X = 5’-Colesterila

SEQ ID TTTTTTTCCGCTTTTCCGCTTTTCCGCTTT CCGC3 NO:256 Tabela 59: Meia concentração eficaz máxima (EC50) e velocidade de sinal máxima (Vmáx) EC50 picomolar Vmáx milliOD 405nm/min

ODN (pM) (mOD405/min) Medição 1 Titulação de 20 nM 5Chol-CCGC3-Gw2 3,4 87 CCGC3-Gw2 19,4 83 5Chol-CCGC3 1564 146 CCGC3 51436 52 Medição 2 Titulação de 1 nM 5Chol-CCGC3-Gw2 8,4 107 CCGC3-Gw2 24,6 98 5Chol-CCGC3 fraco - CCGC3 Inativo -

[0252] Os resultados de duas medições independentes sugerem que a atividade estimulatória de TLR21 de CCGC3-Gw2 é aprimorada pela modificação de 5’-colesterol (Tabela 59, FIGs. 66A, 66B). Em comparação com uma versão não modificada, a EC50 diminuiu cerca de 3 a 5 vezes em ambos os ensaios (Tabela 59). Também foi mostrado nesse estudo, que as sequências de 5’-dG não são necessárias para o efeito de intensificação de atividade de 5’-colesterol: CCGC3-5Chol é aproximadamente 33 vezes mais ativo em comparação com seu congênere não modificado (Tabela 59, FIG. 67).

[0253] Para resumir, acredita-se que o primeiro relatório na atividade intrínseca aumentada de ODNs em TLR21 devido a uma modificação de 5'-colesterila. Foi mostrado para GCGT3- TG4T (um ODN recentemente identificado nessa série de estudos) em três bateladas diferentes sintetizadas por três fornecedores diferentes. O efeito de aumento de atividade de TLR21 está em adição à ativação devido às sequências de formação de 5’-G-quarteto (como Gwire2 ou TG4T), mas não requer as mesmas (vide GCGT3). O efeito de aumento de atividade de TLR21 também foi demonstrado por um outro CpG- ODN identificado nessa série de estudos: CCGC3-Gwire2 e CCGC3. A modificação de 3’-colesterila não tem um efeito de aumento de atividade de TLR21. Parece que uma derivação de 5’colesterila também tem um efeito estabilizante contra a degradação de nuclease. Pode ser especulado que o conjunto de micela de colesterila contribui para a formação de ligandos de TLR21 de polidentato. A localização 5’, em oposição à localização 3’, é provável que seja necessário para a orientação correta dos motivos de CpG. Ademais, é possível que uma derivação de 5’colesterila tenha um efeito de modificação na biodisponibilidade in vivo.

[0254] Aqueles versados na técnica observarão que várias alterações e modificações podem ser feitas nas modalidades preferenciais da invenção e que tais alterações e modificações podem ser feitas sem que se afaste do espírito da invenção. Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas abranjam todas as variações equivalentes como incluídas nos verdadeiros espírito e escopo da invenção.

[0255] As revelações de cada patente, pedido de patente e publicação citadas ou descritas neste documento são incorporadas no presente documento a título de referência, em sua totalidade. Exemplo 10: Estudo in vivo da eficácia de imunoestimulantes em um modelo de vacinação de doença de Newcastle em galinhas

[0256] Para determinar a adequabilidade e a eficácia de ODN1, ODN2 e ODN3 como imunoestimulantes, cada um foi testado em três concentrações diferentes.

[0257] Os imunoestimulantes a seguir foram investigados: ODN1: [CholTEG]- TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3- TG4T-5Chol”) (SEQ ID NO:252) (modificação de colesterila ligada a [CholTEG]=5’- trietilenoglicol), ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T”) (SEQ ID NO:252), ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt (“2006-PTO”) (SEQ ID NO:3).

[0258] Cada imunoestimulante foi adicionada a uma emulsão de óleo que contém uma concentração sub-ótima de um vírus da doença de Newcastle (NDV) inativado de acordo com a Tabela

61. Para a preparação da vacina NDV sub-ótima, a batelada de antígeno de NDV foi diluída 50 vezes em fluido alantoico negativo a NDV (AF). As eficiências de ODN1, ODN2 e ODN3 em combinação com uma dosagem sub-ótima de uma vacina de doença de Newcastle foram testadas em galinhas poedeiras SPF (Leghorn). A resposta sorológica foi medida e comparada à vacina NDV sub-ótima semelhante sem o imunoestimulante. O título de anticorpo foi determinado em pontos no tempo diferentes após a vacinação para investigar a possibilidade de a adição dos imunoestimulantes resultar em uma resposta imunológica precoce. Para determinar a dosagem mais ótima dos três ODNs, cada um foi suplantado em três doses diferentes de 100 ng, 1000 ng e 5000 ng para a vacina NDV sub-ótima, resultando em nove grupos de imunoestimulante. Além desses nove grupos de imunoestimulante, cinco grupos de controle foram incorporados nesse estudo, que consiste em uma vacina NDV sub-ótima sem grupo de imunoestimulante, o grupo de vacina NDV não diluída, um grupo de controle negativo (imunoestimulantes em combinação com o adjuvante) e dois grupos de controle positivo com ácido poli- inosínico:policitidílico (poli I:C) em duas concentrações diferentes (Tabela 60).

[0259] Os seguintes parâmetros foram testados: saúde das galinhas (dados não mostrados) e sorologia pelo ensaio de inibição da Hemaglutinação (HI). Tabela 60: Projeto de Estudo Artigo de Teste /Item de Grupo de Número Controle Teste (n) NDV Sub-ótima+ ODN1 100 ng T01 10 NDV Sub-ótima+ ODN1 1000 ng T02 10 NDV Sub-ótima+ ODN1 5000 ng T03 10 NDV Sub-ótima+ ODN2 100 ng T04 10 NDV Sub-ótima+ ODN2 1000 ng T05 10 NDV Sub-ótima+ ODN2 5000 ng T06 10 NDV Sub-ótima+ ODN3 100 ng T07 10 NDV Sub-ótima+ ODN3 1000 ng T08 10

Artigo de Teste /Item de Grupo de Número Controle Teste (n) NDV Sub-ótima+ ODN3 5000 ng T09 10 NDV Sub-ótima T10 10 NDV Ideal (vacina não diluída) T11 10 ODN1 5000 ng + Adjuvante* T12a 3 ODN2 5000 ng + Adjuvante* T12b 3 ODN3 5000 ng + Adjuvante* T12c 3 Adjuvante sozinho (Stimune)* T12d 1 NDV Sub-ótima+ 10 µg Poli I:C T13 9 NDV Sub-ótima+ 100 µg Poli I:C T14 9 *3 animais foram alocados como controle para cada imunoestimulante em combinação com o adjuvante (Stimune). Um animal recebeu apenas o adjuvante. Todos os animais chegaram com 3 semanas de idade. Todos os animais foram vacinados com 5 semanas de idade. Todas as vacinações foram realizadas em no dia 0 por injeção intramuscular. A amostragem/sorologia sanguínea foi realizada nos dias 0 (antes da vacinação), 7, 14 e 21. A pontuação clínica de todos os animais foi realizada diariamente.

[0260] As galinhas registradas nos grupos de tratamento T01-T14 receberam o Artigo de Teste ou Item de Controle, de acordo com o projeto de estudo. Nos grupos T13 e T14, nove em vez de dez galinhas por grupo foram vacinadas devido à perda de dois animais antes do início do estudo.

[0261] As galinhas alocadas para os grupos de tratamento T01, T02, T03, T04, T05, T06, T07, T08 e T09 foram vacinadas com uma suspensão de NDV sub-ótima que contém 1 de 3 imunoestimulantes diferentes (ODNs), cada um em 3 concentrações diferentes (100, 1000, 5000 ng/dose). Para a preparação das emulsões de água em óleo, a suspensão de antígeno de NDV e o imunoestimulante (fase aquosa) foram formulados juntamente com o adjuvante Stimune (fase oleosa) em uma razão de 4:5 (Tabela 61). Tabela 61: Preparação de Artigos de Teste e Itens de Controle Fase Aquosa Fase Oleosa Fase Adicional Stimune aquosa fase Batelada AF 600 de aquosa em Stimune Total Grupo Nome de NDV Negativo ng/µl volume volume a (ml) (ml) (µl) (µl) (µl) total Stimune (ml) (ml) ODN1 100 T01 100 4896 4 5 4 5 9 ng ODN1 1000 T02 100 4862 38 5 4 5 9 ng ODN1 5000 T03 100 4712 188 5 4 5 9 ng ODN2 100 T04 100 4896 4 5 4 5 9 ng ODN2 1000 T05 100 4862 38 5 4 5 9 ng ODN2 5000 T06 100 4712 188 5 4 5 9 ng ODN3 100 T07 100 4896 4 5 4 5 9 ng ODN3 1000 T08 100 4862 38 5 4 5 9 ng ODN3 5000 T09 100 4712 188 5 4 5 9 ng Vacina T10 100 4900 0 5 4 5 9 sub-ótima Vacina não T11 5000 0 0 5 4 5 9 diluída ODN1 5000 T12a ng em - 2887 113 3 2 2,5 4,5 Stimune

Fase Aquosa Fase Oleosa Fase Adicional Stimune aquosa fase Batelada AF 600 de aquosa em Stimune Total Grupo Nome de NDV Negativo ng/µl volume volume a (ml) (ml) (µl) (µl) (µl) total Stimune (ml) (ml) ODN2 5000 T12b ng em - 2887 113 3 2 2,5 4,5 Stimune ODN3 5000 T12c ng em - 2887 113 3 2 2,5 4,5 Stimune Tampão de diluição T12d - 2887 113 3 0,8 1 1,8 (PBS) em Stimune Poli I:C T13 100 4877 23 5 4 5 9 10 µg Poli I:C T14 100 4675 225 5 4 5 9 100 µg Preparação de ODN para 600 ng/µl 100 µM de ODN Tampão de Estoque em (µl) Diluição (µl) Volume 600 ng/µl (µl) ODN1 GCGT3-TG4T-5Chol 204 196 400 (SEQ ID NO: 252, vide Tabela 50) ODN2 GCGT3-TG4T (SEQ ID 216 184 400 NO: 252, vide Tabela 50) ODN3 2006-PTO (SEQ ID 312 88 400 NO: 3, vide Tabela 1)

Poli I:C 10 µg/µl Pó Liofilizado Solução Salina Estoque em (mg) Fisiológica (ml) Volume 10 µg/µl (µl) Contro Poli I:C (P0913) 10 1 1000 le Lote 116M4118V nº 16TK5011 10 min 50 °C, os: n 60 min em TA (recozimento) armazenamento a -20 °C

[0262] As galinhas foram alocadas para o grupo de controle de T10 foram vacinadas com uma suspensão de NDV sub-ótima sem imunoestimulante em adjuvante (Stimune) em uma razão de 4:5.

[0263] As galinhas foram alocadas para o grupo de controle de T11 foram vacinadas com uma suspensão de NDV não diluída sem imunoestimulante em adjuvante (Stimune) em uma razão de 4:5.

[0264] As galinhas alocadas para o grupo T12 foram vacinadas com imunoestimulante 1 (3 galinhas), imunoestimulante 2 (3 galinhas) ou imunoestimulante 3 (3 galinhas) em adjuvante (Stimune) em uma razão de 4:5. Uma galinha foi vacinada com tampão de diluição em adjuvante (Stimune).

[0265] As galinhas alocadas para os grupos de controle de T13 (n=9) e T14 (n=9) foram vacinadas com uma suspensão de NDV sub-ótima em combinação com Poli I:C em duas concentrações (10.000 ng e 100 µg) em adjuvante (Stimune) em uma razão de 4:5. Administração de Artigo de Teste ou Item de Controle

[0266] A suspensão da cepa Ulster de NDV inativada armazenada a -70°C foi descongelada e diluída 50 vezes em fluido alantoico negativo para criar a dose de vacina sub- ótima. Os imunoestimulantes foram adicionados de acordo com o projeto do estudo. As fases aquosas resultantes foram misturadas com Stimune em uma razão de 4:5 de acordo com o esquema de preparação de vacinação mostrado na Tabela 61. Durante a preparação, todos os ingredientes da vacina, com exceção do adjuvante Stimune, foram colocados em gelo derretido. As vacinas formuladas foram injetadas (0,5 ml, intramuscular) diretamente após a preparação.

[0267] A saúde geral foi monitorada por um biotécnico experiente diariamente a partir do dia de chegada até o fim do estudo. Amostragem sanguínea sérica

[0268] As amostras sanguíneas para sorologia foram coletadas a partir de todas as galinhas nos dias de estudo 0 (antes da vacinação), 7, 14 e 21. As amostras sanguíneas foram etiquetadas com o número de estudo, uma identificação de amostra única e a data de coleta. Dependendo da quantidade do volume sanguíneo extraído, os soros foram submetidos alíquota em duas alíquotas de aproximadamente 0,5 ml e armazenadas a -20 ±5℃. Ensaio de inibição da Hemaglutinação (HI)

[0269] Em resumo, a série de diluições de soros foi incubada com 8 HAU (unidades de hemaglutinação) de cepas Ulster de NDV a temperatura ambiente por 60 minutos. As HAU foram tituladas antes de cada ensaio. Portanto, os eritrócitos de galinha foram adicionados e a aglutinação foi pontuada após a incubação a 4 °C por 45 minutos. Um soro de controle negativo e três soros de controle positivo, com títulos de anticorpo baixos, intermediários e altos foram incluídos em cada ensaio.

[0270] Os resultados de título de HI foram expressos como os recíprocos da maior diluição séria que inibe completamente a aglutinação, que foram transformados de modo logarítmico nos títulos de Log2 finais. Estatísticas

[0271] Os resultados de HI transformados de modo logarítmico foram resumidos por animal (consultar as Tabelas 62-65). Por grupo de tratamento, o desvio médio e padrão dos títulos de anticorpo foi calculado. A análise estatística foi realizada com o teste t de Mann-Whitney não paramétrico. Resultados

[0272] Nenhum sintoma clínico ou efeitos adversos relacionados foram observados em qualquer grupo. Todas as galinhas pareceram saudáveis durante todo o período de estudo.

[0273] Duas galinhas, no entanto, foram classificadas com lesões pequenas devido ao comportamento de bicar, que começou 6 dias antes do início do estudo. No dia da vacinação dessas, as galinhas foram alocadas aos grupos T13 (#11658) e T14 (#11676) de Poli I:C. A recuperação ocorreu em uma semana após a vacinação. ODN1, GCGT3-TG4T-5Chol

[0274] Os resultados de HI individuais expressos como títulos de Log2 dos grupos de dose de ODN1 de 100 ng, 1000 ng e 5000 ng são indicados na Tabela 62. Os títulos de HI média e desvio padrão desses grupos são indicados em FIG. 70 (dias 14 e 21 pós-vacinação (pv)) e na FIG. 71 (todos os dados) em comparação com os títulos médios do grupo de vacina

NDV diluída.

[0275] Os grupos GCGT3-TG4T-5Chol mostraram títulos de HI significativamente maiores em comparação com a vacina NDV diluída (título de HI média: 4,8 Log2/SD 1,0). No dia 14 pv esse era o caso para todas as três doses; 100 ng: título de HI média 6,2 Log2/SD 1,4 (p=0,0214), 1000 ng: título de HI média 6,9 Log2/SD 1,1 (p=0,0003) e 5000 ng: HI média 5,9 Log2/SD 0,7 (p=0,0243).

[0276] No dia 21 pv, no entanto, nenhuma diferença significativa foi observada para todas as concentrações; 100 ng: título de HI média 6,9 Log2 /SD 0,8 (p=0,1995); 1000 ng: título de HI média 7,3 Log2/SD 0,9 (p=0,0527); e 5000 ng: HI média 6,7 Log2/SD 0,9 (p=0,4523) quando em comparação com a vacina NDV; título de HI 6,2 Log2/ SD1,0. (FIG. 70), embora a concentração de 1000 ng seja muito próxima da significância. Tabela 62:

HI HI HI Resultados HI dupla HI2 HI 1 HI2 HI2 HI3 HI2 HI3 1 1 1 Grupo Tratamento animal d0 d0 média d7 d7 média d14 d14 d14 média d21 d21 d21 média 11402 0 0 0 1 1 1 7 7 7 7,0 7 7 7 7,0 11404 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 7 7,0 11406 0 0 0 0 0 0 3 4 4 3,7 6 6 6 6,0 11408 0 0 0 0 0 0 7 8 8 7,7 8 9 7 8,0 GCGT3- 11410 0 0 0 0 0 0 5 6 6 5,7 7 7 7 7,0 T01 TG4T-5Chol 100 ng 11412 0 0 0 0 0 0 6 6 8 6,7 6 6 6 6,0 11414 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 7 7 6 6,7 11416 0 0 0 0 0 0 8 7 8 7,7 8 8 8 8,0 11418 0 0 0 0 0 0 5 4 4 4,3 6 6 6 6,0 11420 0 0 0 0 0 0 8 7 7 7,3 7 7 8 7,3 média 0,0 0,1 6,2 6,9 SD 0,0 0,3 1,4 0,8 11422 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 6 6 6 6,0 11424 0 0 0 0 0 0 8 7 7 7,3 9 7 8 8,0 11426 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 6 6 6 6,0 11428 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 7 7,0 GCGT3- 11430 0 0 0 1 1 1 10 9 10 9,7 8 8 9 8,3 T02 TG4T-5Chol 1000 ng 11432 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 7 7 7 7,0 11434 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 7 7 7,0 11436 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 8 7 9 8,0 11438 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 7 7 7,0 11440 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 8 8 9 8,3 média 0,0 0,1 6,9 7,3 SD 0,0 0,3 1,1 0,9

11442 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 8 7,3 11444 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 6 6 6 6,0 11446 0 0 0 0 0 0 5 4 5 4,7 5 5 6 5,3 11448 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 8 8 9 8,3 GCGT3- 11450 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 6 6 7 6,3 T03 TG4T-5Chol 5000 ng 11452 0 0 0 0 0 0 6 5 6 5,7 7 7 7 7,0 11454 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 6 7 6,7 11456 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 6 6 6 6,0 11458 0 0 0 0 0 0 6 5 6 5,7 6 6 7 6,3 11460 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 7 7 8 7,3 média 0,0 0,0 5,9 6,7 SD 0,0 0,0 0,7 0,9 ODN2, GCGT3-TG4T

[0277] Os resultados de HI individuais expressos como títulos de Log2 dos grupos de dose de ODN1 de 100 ng, 1000 ng e 5000 ng são indicados na Tabela 63. Os títulos de HI média e desvio padrão desses grupos são indicados na FIG. 72 (dias 14 e 21 pv) e na FIG. 73 (todos os dados) em comparação com os títulos médios do grupo de vacina NDV diluída.

[0278] Os grupos ODN2, GCGT3-TG4Tmostraram títulos de HI significativamente maiores em comparação com a vacina NDV diluída (título de HI média: 4,8 Log2/SD 1,0). Esse foi o caso no dia 14 pós-vacinação para todas as três doses; 100 ng: título de HI média 7,1 Log2/SD 1,2 (p=0,0003), 1000 ng: título de HI média 6,4 Log2/SD 0,7 (p=0,0027) e 5000 ng: título de HI média 6,1 Log2/SD 1,1 (p=0,0236). No dia 21, as diferenças significativas foram observadas apenas na dose de 100 ng com um título de HI média de 7,6 Log2/SD 0,8 (p=0,0083) quando comparada à vacina NDV (título de HI 6,2 Log2/SD 1,0). Os títulos de HI média para 1000 ng e 5000 ng eram 7,1 Log2/0,6 (p=0,0696) e 7,2 Log2/SD 1,0 (p=0,0956) respectivamente (FIG. 72). Tabela 63:

11462 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 7 7 8 7,3 11464 0 0 0 0 0 0 8 7 8 7,7 7 8 8 7,7 11466 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 8 8 7 7,7 11468 0 0 0 0 0 0 8 7 8 7,7 8 9 8 8,3 GCGT3- 11470 0 0 0 0 0 0 7 6 7 6,7 7 7 7 7,0 T04 TG4T 11472 0 0 0 0 0 0 10 10 9 9,7 10 9 8 9,0 100 ng 11474 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 7 7 7,0 11476 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 7 7 6 6,7 11478 0 0 0 0 0 0 8 6 6 6,7 7 7 7 7,0 11480 0 0 0 0 0 0 9 8 7 8,0 9 9 8 8,7 média 0,0 0,0 7,1 7,6 SD 0,0 0,0 1,2 0,8 11482 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 7 7,0 11484 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 7 7,0 11486 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 7 7,0 11488 0 0 0 0 0 0 6 8 6 6,7 8 8 8 8,0 GCGT3- 11490 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 6 6 6 6,0 T05 TG4T 11492 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 8 7,3 1000 ng 11494 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 7 7,0 11496 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 8 7 7,3 11498 0 0 0 0 0 0 8 7 7 7,3 9 7 8 8,0 11500 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 6 7 6,7 média 0,0 0,0 6,4 7,1 SD 0,0 0,0 0,7 0,6 11502 0 0 0 0 0 0 8 7 7 7,3 10 8 9 9,0 11504 0 0 0 0 0 0 7 7 6 6,7 8 7 7 7,3 11506 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 6 7 6,7 11508 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 8 6 7 7,0 GCGT3- 11510 0 0 0 0 0 0 8 7 7 7,3 9 8 8 8,3 T06 TG4T 11512 0 0 0 0 0 0 8 6 7 7,0 9 7 8 8,0 5000 ng 11514 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 6 6 7 6,3 11516 0 0 0 0 0 0 7 6 6 6,3 7 7 7 7,0 11518 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 7 6 8 7,0 11520 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 6 5 6 5,7 média 0,0 0,0 6,1 7,2 SD 0,0 0,0 1,1 1,0 ODN3, 2006-PTO

[0279] Os resultados de HI individuais expressos como títulos Log2 dos grupos de dose de ODN1 de 100 ng, 1000 ng e 5000 ng medidos são indicados na Tabela 64. Durante o desempenho de ensaio de HI em triplicata, um resultado isolado foi observado para o animal 11570 no dia 21, isso foi provavelmente causado por um erro de pipetagem (AF não adicionado suficiente) e, portanto, esse resultado foi omitido da análise final (realçado na Tabela 64). Então, para esse animal e data, o título de HI média se baseou na medição em duplicata.

[0280] Os títulos de HI média e desvio padrão desses grupos são indicados na FIG. 74 (dias 14 e 21 pv) e na FIG. 75 (todos os dados) em comparação com os títulos médios do grupo de vacina NDV diluída.

[0281] Os grupos ODN3, 2006-PTOmostraram títulos de HI significativamente maiores em comparação com a vacina NDV diluída (título de HI média: 4,8 Log2/SD 1,0). Esse foi o caso no dia 14 pós-vacinação para duas doses; 1000 ng: título de HI média: 6,3 Log2/SD 1,2 (p=0,0081) e 5000 ng: título de HI média: 6,2 Log2/SD 0,8 (p=0,0059). O título de HI média da dose de 100 ng era 5,3 Log2/SD 0,5 (p=0,2090). No dia 21 pv, diferenças significativas foram medidas apenas em 5000 ng: título de HI média 7,3 Log2/SD 0,6 (p=0,0296). Nenhuma diferença significativa foi observada nas doses de 100 ng e 1000 ng, com os títulos de HI média de 6,6 Log2/SD 0,5 (p=0,7183) e 6,8 Log2/SD 1,1 (p=0,1685) respectivamente, quando comparadas à vacina NDV; título de HI 6,2 Log2/SD 1,0 (FIG. 74). Tabela 64:

11522 0 0 0 0 0 0 6 5 5 5,3 6 6 6 6,0 11524 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 6 6 6 6,0 11526 0 0 0 0 0 0 6 5 6 5,7 7 7 7 7,0 11528 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 6 7 6 6,3 11530 0 0 0 0 0 0 6 5 7 6,0 7 7 7 7,0 T07 2006-PTO 100 ng 11532 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 5 6 6 5,7 11534 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 7 7 7 7,0 11536 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 7 7 7 7,0 11538 0 0 0 0 0 0 4 4 5 4,3 7 6 7 6,7 11540 0 0 0 0 0 0 6 5 6 5,7 7 7 7 7,0 média 0,0 0,0 5,3 6,6 SD 0,0 0,0 0,5 0,5 11542 0 0 0 0 0 0 6 5 6 5,7 6 6 7 6,3 11544 0 0 0 0 0 0 6 4 6 5,3 7 7 7 7,0 11546 0 0 0 0 0 0 4 4 5 4,3 4 5 4 4,3 11548 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 6 6 7 6,3 11550 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 8 7,3 T08 2006-PTO 1000 ng 11552 0 0 0 0 0 0 7 7 8 7,3 7 7 8 7,3 11554 0 0 0 0 0 0 8 8 9 8,3 8 8 9 8,3 11556 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 6 6 6 6,0 11558 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 8 7,3 11560 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 8 8 8 8,0 média 0,0 0,0 6,3 6,8 SD 0,0 0,0 1,2 1,1 11562 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 8 7,3 11564 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 8 7,3 11566 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 7 7,0 11568 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 7 7,0 11570 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 7 11 7 7,0 T09 2006-PTO 5000 ng 11572 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 8 8 7,7 11574 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 6 7 7 6,7 11576 0 0 0 0 0 0 8 8 9 8,3 8 10 9 9,0 11578 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 7 7,0 11580 0 0 0 1 1 1 5 5 7 5,7 7 7 8 7,3 média 0,0 0,1 6,2 7,3 SD 0,0 0,3 0,8 0,6 Grupo de controle

[0282] Os resultados de HI individuais expressos como títulos Log2 dos grupos de dose de 10 µg e 100 µg de Poli I:C, as vacinas NDV diluídas e não diluídas e os grupos de controle negativo são indicados na Tabela 65. Os títulos de HI média e desvio padrão desses grupos são indicados na FIG. 76 (dias 14 e 21 pv) e na FIG. 77 (todos os dados) em comparação com os títulos médios do grupo de vacina NDV diluída.

[0283] Para Poli I:C, os grupos de controle positivo, os títulos de HI significativamente maiores foram apenas observados na dose de 100 µg: título de HI 7,5 Log2/SD 0,4 no dia 21 (p=0,0053) quando comparada à vacina NDV (6,2 Log2/SD 1,0). Os títulos de HI média no dia 14 pv dos grupos de dose de 10 µg e 100 µg eram 5,8 Log2/SD 1,3 (p=0,1859) e 5,5 Log2/SD 0,8 (p=0,1609), respectivamente. O título de HI média do grupo de dose de 10 µg no dia 21 pv era 6,4 Log2/SD 1,3 (p=0,7273). As diferenças significativas (p< 0,0001) foram observadas entre a vacina NDV não diluída (8,3/SD 0,5 e 8,5 Log2/SD 0,7) e o grupo de controle negativo em comparação com o grupo NDV diluído nos dias 14 e 21 pós- vacinação (4,8/SD 1,0 e 6,2 Log2/ SD 1,0, respectivamente) (FIG. 76). Tabela 65: 11582 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 6 5 6 5,7 11584 0 0 0 0 0 0 5 6 5 5,3 7 7 7 7,0 11586 0 0 0 0 0 0 5 5 6 5,3 5 5 6 5,3 11588 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 6 8 7,0 Vacina 11590 0 0 0 0 0 0 4 4 5 4,3 6 6 6 6,0 T10 sub-ótima 11592 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 7 7 8 7,3 (1:50) 11594 0 0 0 0 0 0 4 4 5 4,3 6 7 8 7,0 11596 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 8 7,3 11598 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 4 4 5 4,3 11600 0 0 0 0 0 0 3 3 4 3,3 5 5 6 5,3 média 0,0 0,0 4,8 6,2 SD 0,0 0,0 1,0 1,0

11602 0 0 0 0 0 0 8 8 8 8,0 9 9 10 9,3 11604 0 0 0 0 0 0 9 9 8 8,7 8 9 10 9,0 11606 0 0 0 0 0 0 7 7 8 7,3 8 8 9 8,3 11608 0 0 0 0 0 0 8 9 9 8,7 9 9 10 9,3 Vacina não 11610 0 0 0 0 0 0 9 9 9 9,0 10 9 10 9,7 T11 diluída 11612 0 0 0 0 0 0 8 8 9 8,3 8 8 8 8,0 11614 0 0 0 0 0 0 9 8 9 8,7 8 7 8 7,7 11616 0 0 0 0 0 0 8 8 8 8,0 7 8 8 7,7 11618 0 0 0 2 3 2,5 9 8 8 8,3 8 8 9 8,3 11620 0 0 0 0 0 0 8 8 8 8,0 8 8 8 8,0 média 0,0 0,3 8,3 8,5 SD 0,0 0,8 0,5 0,7 11622 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0,7 0 0 1 0,3 11624 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11626 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11628 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 controles 11630 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 T12 negativos 11632 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11634 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11636 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11638 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 11640 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 média 0,0 0,0 0,1 0,0 SD 0,0 0,0 0,2 0,1 11642 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 4 4 4 4,0 11644 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 7 7,0 11646 0 0 0 0 0 0 7 7 8 7,3 8 8 8 8,0 11648 0 0 0 0 0 0 5 4 5 4,7 6 6 6 6,0 Poli I:C T13 11650 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 6 6 6 6,0 10 µg 11652 0 0 0 0 0 0 7 7 7 7,0 7 7 7 7,0 11654 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 7 7 7 7,0 11656 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 5 5 5 5,0 11658 0 0 0 0 0 0 8 7 8 7,7 8 8 8 8,0 média 0,0 0,0 5,8 6,4 SD 0,0 0,0 1,3 1,3

11660 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4,0 7 7 7 7,0 11662 0 0 0 0 0 0 4 4 5 4,3 7 7 7 7,0 11664 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5,0 7 7 7 7,0 11666 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 8 7,3 Poli I:C T14 11668 0 0 0 0 0 0 6 6 7 6,3 8 8 8 8,0 100 µg 11670 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6,0 7 7 8 7,3 11672 0 0 0 0 0 0 6 6 5 5,7 7 8 9 8,0 11674 0 0 0 0 0 0 6 6 5 5,7 8 8 8 8,0 11676 0 0 0 1 0 0,5 7 7 6 6,7 8 8 8 8,0 média 0,0 0,1 5,5 7,5 SD 0,0 0,2 0,8 0,4 Conclusões

[0284] O objetivo foi estudar a atividade de adjuvante de três imunoestimulantes diferentes. Esse foi testado medindo- se a resposta sorológica após vacinação com vacinas de emulsão de óleo que contêm uma concentração sub-ótima de NDV inativada e concentrações diferentes de um de três imunoestimulantes diferentes.

[0285] Os imunoestimulantes a seguir foram investigados: ODN1: [CholTEG]- TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3- TG4T-5Chol”) (SEQ ID NO:252) (modificação de colesterila ligada a [CholTEG]=5’- trietilenoglicol), ODN2: TGGGGTTTTTTTTGCGTTTTTGCGTTTTTGCGTTTT (“GCGT3-TG4T”) (SEQ ID NO:252), ODN3: tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt (“2006-PTO”) (SEQ ID NO:3).

[0286] As cadeias principais de ODN1 e ODN2 imunes foram ligadas por fosfodiéster, enquanto a cadeia principal de ODN3 foi ligada por fosfotioato. A eficácia de cada ODN foi determinada em três doses diferentes; 100 ng, 1000 ng e 5000 ng, suplementadas para a vacina NDV sub-ótima.

[0287] A resposta serológica foi determinada nos dias 0 (antes da vacinação), 7, 14 e 21 após a vacinação para investigar a possibilidade de a adição desses imunoestimulantes também poder resultar em uma resposta imunológica precoce. Nos dias 0 e 7 após a vacinação (pv) nenhum nível de anticorpo contra NDV foi detectado, com exceção de um animal (#11618) no grupo de vacina de NDV não diluída no dia 7.

[0288] A resposta sorológica expressa como títulos de HI Log2 mostrou diferenças significativas (p<0,0001) entre as vacinas NDV não diluídas e sub-ótimas nos dias 14 e 21 pv, indicando que o fator de diluição de 50 vezes foi suficiente para criar dose de vacina sub-ótima.

[0289] O grupo de controle negativo permaneceu negativo durante o estudo inteiro, indicando que os imunoestimulantes sem vacina de NDV não resultaram em uma resposta imunológica não específica.

[0290] O grupo de dose de 100 µg de Poli I:C de controle positivo mostrou títulos de HI significativamente superiores em comparação com a vacina de NDV naïve no dia 21 (p=0,0053), indicando que esse grupo de dose serviu como um grupo de controle positivo válido.

[0291] O grupo de GCGT3-TG4T-5Chol (ODN1) mostrou títulos de HI significativamente superiores quando comparado à vacina de NDV diluída no dia 14 pv para todas as três doses; 100 ng (p=0,0214), 1000 ng (p=0,0003) e 5000 ng (p=0,0243). No dia 21 pv, no entanto, nenhuma diferença significante foi observada.

[0292] O grupo de GCGT3-TG4T (ODN2) mostrou títulos de HI significativamente superiores quando comparado à vacina de NDV diluída no dia 14 pv para todas as três doses; 100 ng (p=0,0003), 1000 ng (p=0,0027) e 5000 ng (p=0,0236). No dia 21, diferenças significativas (p=0,0083) foram medidas apenas no grupo de dose de 100 ng.

[0293] O grupo de 2006-PTO (ODN3) mostrou títulos de HI significativamente superiores em comparação com a vacina de NDV diluída no dia 14 pv para duas doses; 1000 ng (p=0,0081) e 5000 ng (p=0,0059). No dia 21 pv, diferenças significativas (p=0,0296) foram medidas apenas no grupo de dose de 5000 ng.

[0294] Em conclusão, os títulos de HI médios mais altos foram observados com o grupo de dose de GCGT3-TG4T (ODN2) de 100 ng, 7,1 Log2 (14 dias pv) e 7,6 Log2 (21 dias pv), indicando um aumento em títulos quando comparado à vacina de NDV naïve de 2,3 Log2 e 1,4 Log2 no dia 14 e 21 pv, respectivamente.

[0295] Os títulos do grupo de dose de GCGT3-TG4T-5Chol (ODN1) de 1000 ng, 6,9 Log2 e 7,3 Log2, no dia 14 e 21 pv, respectivamente, foram quase similares ao grupo de ODN2. No dia 14 pv, nenhuma diferença significativa (p=0,7513) entre os grupos de ODN1 e ODN2 foi observada.

[0296] Os títulos do grupo de dose de 2006-PTO (ODN3) 5000 ng foram de 6,2 Log2 e 7,3 Log2 no dia 14 e 21 pv, respectivamente. No dia 14 pv, o grupo de ODN3 diferiu significativamente (p=0,0300) de ambos os grupos de ODN1 e ODN2 (FIG. 78 e FIG. 79).

[0297] No dia 21 pv, nenhuma diferença significativa entre todos os grupos de ODN foi mostrada.

[0298] Esses resultados, portanto, indicam que todos os ODNs tiveram a capacidade para aumentar significativamente a resposta serológica, especialmente no dia 14 após a vacinação, que também indica um estabelecimento precoce de imunidade.

MODALIDADES

[0299] Para ilustração adicional, modalidades não limitativas adicionais da presente invenção são apresentadas abaixo.

[0300] Por exemplo, a modalidade 1 é um oligonucleotídeo imunoestimulatório que compreende pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0301] A modalidade 2 é o oligonucleotídeo da modalidade 1, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina.

[0302] A modalidade 3 é o oligonucleotídeo, da modalidade 2, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende de três a oito nucleotídeos de guanina.

[0303] A modalidade 4 é o oligonucleotídeo da modalidade 3, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 92, 93, 96, 97, 100, 102, 104, 106, 108, 143 ou 252.

[0304] A modalidade 5 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID

NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264), ou TGGGGT (SEQ ID NO:265).

[0305] A modalidade 6 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 ou 138.

[0306] A modalidade 7 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-6 que compreende adicionalmente uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0307] A modalidade 8 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 2 a 7, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina, a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina, ou ambas compreendem uma sequência de G-quarteto.

[0308] A modalidade 9 é o oligonucleotídeo da modalidade 8, em que a sequência de G-quarteto é um sítio de interação para outras sequências de G-quarteto.

[0309] A modalidade 10 é o oligonucleotídeo da modalidade 9, em que a sequência de G-quarteto compreende TGGGGT (SEQ ID NO: 265).

[0310] A modalidade 11 é o oligonucleotídeo da modalidade 7, em que a primeira e a segunda pluralidades de nucleotídeos de guanina compreendem uma sequência G-wire.

[0311] A modalidade 12 é o oligonucleotídeo da modalidade 11, em que a sequência G-wire é um sítio de interação para outras sequências G-wire.

[0312] A modalidade 13 é o oligonucleotídeo da modalidade 10 ou 11, em que a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258.

[0313] A modalidade 14 é o oligonucleotídeo da modalidade 11 ou 12, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 252 ou GCGT-Gwire3.

[0314] A modalidade 15 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 7 a 14, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina são separadas por pelo menos um nucleotídeo.

[0315] A modalidade 16 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 1 a 3, que compreende adicionalmente um ligante entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0316] A modalidade 17 é o oligonucleotídeo da modalidade 16, em que o ligante compreende pelo menos três nucleotídeos.

[0317] A modalidade 18 é o oligonucleotídeo da modalidade 16 ou 17, em que o ligante compreende um hexaetilenoglicol, trietilenoglicol, propanodiol ou derivados dos mesmos.

[0318] A modalidade 19 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 16 a 18, em que o oligonucleotídeo compreende 2006-PDE5dG4-X1 ou 2006-PDE5dG4-X3.

[0319] A modalidade 20 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-19, em que o pelo menos um motivo de CpG é uma pluralidade de motivos de CpG.

[0320] A modalidade 21 é o oligonucleotídeo da modalidade 20, em que a pluralidade de motivos de CpG compreende dois,

três, quatro ou cinco motivos de CpG.

[0321] A modalidade 22 é o oligonucleotídeo da modalidade 20 ou 21, em que cada motivo de CpG é separado dos outros motivos de CpG por pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo.

[0322] A modalidade 23 é o oligonucleotídeo da modalidade 22, em que o pelo menos um nucleotídeo é um a quatro nucleotídeos de timina.

[0323] A modalidade 24 é o oligonucleotídeo da modalidade 22 ou 23, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:217, 218, 219, ou 220.

[0324] A modalidade 25 é o oligonucleotídeo da modalidade 20, em que cada um dos motivos de CpG é separado dos outros motivos de CpG por um espaçador.

[0325] A modalidade 26 é o oligonucleotídeo da modalidade 25, em que o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato.

[0326] A modalidade 27 é o oligonucleotídeo da modalidade 26, em que a ponte de desoxirribosefosfato é abásica.

[0327] A modalidade 28 é o oligonucleotídeo da modalidade 27, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:221.

[0328] A modalidade 29 é o oligonucleotídeo da modalidade 25, em que o espaçador compreende uma cadeia de carbono.

[0329] A modalidade 30 é o oligonucleotídeo da modalidade 29, em que a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono.

[0330] A modalidade 31 é o oligonucleotídeo da modalidade 30, em que a cadeia de carbono é derivada de etanodiol.

[0331] A modalidade 32 é o oligonucleotídeo da modalidade 31, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X2, em que X2 é etanodiol.

[0332] A modalidade 33 é o oligonucleotídeo da modalidade 29, em que a cadeia de carbono compreende três átomos de carbono.

[0333] A modalidade 34 é o oligonucleotídeo da modalidade 33, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,3-propanodiol.

[0334] A modalidade 35 é o oligonucleotídeo da modalidade 33 ou 34, em que o nucleotídeo compreende CG-Gw2X2, Gw2X2- 2, ou ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2- 5, CG-G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4, ou CG-G4T16X2-5, em que X2 é uma cadeia de três carbono; 2006-PDE5dG4-X2 em que X2 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol; ou 2006-PDE5dG4-X4, em que X4 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol.

[0335] A modalidade 36 é o oligonucleotídeo ou nucleotídeo da modalidade 29, em que a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono.

[0336] A modalidade 37 é o oligonucleotídeo da modalidade 36, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol.

[0337] A modalidade 38 é o oligonucleotídeo da modalidade 36 ou 37, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X4, em que X4 é uma cadeia de quatro carbonos derivada de 1,4- butanodiol.

[0338] A modalidade 39 é o oligonucleotídeo da modalidade 25, em que o espaçador compreende uma unidade química repetida.

[0339] A modalidade 40 é o oligonucleotídeo da modalidade 39, em que a unidade química repetida é um etileno glicol.

[0340] A modalidade 41 é o oligonucleotídeo da modalidade 39 ou 40, em que o oligonucleotídeo compreende CCGC-Gw2X1, em que X1 é um espaçador derivado de hexaetilenoglicol.

[0341] A modalidade 42 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-41, que compreende adicionalmente pelo menos um análogo de nucleotídeo.

[0342] A modalidade 43 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-42, que compreende adicionalmente uma cadeia principal de fosfodiéster.

[0343] A modalidade 44 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-43, que compreende adicionalmente uma cadeia principal de fosforotioato.

[0344] A modalidade 45 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-44, que compreende adicionalmente uma fração de lipídio.

[0345] A modalidade 46 é o oligonucleotídeo da modalidade 45, em que a fração de lipídio é um colesterol.

[0346] A modalidade 47 é o oligonucleotídeo da modalidade 45 ou 46, em que a fração de lipídio está em ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0347] A modalidade 48 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-47, em que o motivo de CpG compreende um elemento de sequência de CpG que tem pelo menos quatro nucleotídeos.

[0348] A modalidade 49 é o oligonucleotídeo da modalidade 48 que compreende pelo menos dois elementos de sequência de CpG.

[0349] A modalidade 50 é o oligonucleotídeo da modalidade 48 ou 49 que compreende pelo menos três elementos de sequência de CpG.

[0350] A modalidade 51 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades 48 a 50, em que os elementos de sequência de CpG são GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT, TCGC, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0351] A modalidade 52 é o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-51 que compreende adicionalmente uma extremidade 3’ terminal de nucleotídeo de tri-timina.

[0352] A modalidade 53 é o oligonucleotídeo da modalidade 55, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215.

[0353] A modalidade 54 é uma vacina para prevenir ou tratar doença infecciosa que compreende o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-53.

[0354] A modalidade 55 é um vetor que compreende o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-54.

[0355] A modalidade 56 é uma composição imunoestimulatória que compreende o oligonucleotídeo de qualquer uma das modalidades anteriores 1-55.

[0356] A modalidade 57 é a composição imunoestimulatória da modalidade 56 que compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0357] A modalidade 58 é a composição imunoestimulatória da modalidade 57, em que o oligonucleotídeo e o carreador são ligados.

[0358] A modalidade 59 é a composição imunoestimulatória da modalidade 56 que compreende adicionalmente um hapteno.

[0359] A modalidade 60 é a composição imunoestimulatória da modalidade 57, em que o oligonucleotídeo e o hapteno são ligados.

[0360] A modalidade 61 é um método de estimulação de receptor semelhante a toll 21 (TLR21) que compreende:

administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo um oligonucleotídeo imunoestimulatório que tem pelo menos um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo, sendo que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina.

[0361] A modalidade 62 é o método da modalidade 61, em que a concentração do oligonucleotídeo é menor que 20 nM.

[0362] A modalidade 63 é o método da modalidade 61 ou 62, em que o oligonucleotídeo compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0363] A modalidade 64 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 63, em que a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente um hapteno.

[0364] A modalidade 65 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 64, em que a meia concentração máxima (EC50) do oligonucleotídeo é menor que 100 pM.

[0365] A modalidade 66 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 65, em que a sequência de nucleotídeo enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, ou TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264).

[0366] A modalidade 67 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 66, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 ou

138.

[0367] A modalidade 68 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 67, em que o oligonucleotídeo compreende adicionalmente uma sequência G-wire.

[0368] A modalidade 69 é o método da modalidade 68, em que a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258.

[0369] A modalidade 70 é o método da modalidade 68, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 252 ou GCGT-Gwire3.

[0370] A modalidade 71 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 70, que compreende uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina são separadas por pelo menos um nucleotídeo.

[0371] A modalidade 72 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 71, em que o oligonucleotídeo compreende adicionalmente um ligante entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0372] A modalidade 73 é o método da modalidade 72, em que o ligante compreende pelo menos três nucleotídeos.

[0373] A modalidade 74 é o método da modalidade 72, em que o ligante compreende um hexaetilenoglicol, trietilenoglicol, propanodiol ou derivados dos mesmos.

[0374] A modalidade 75 é o método da modalidade 72 a 74, em que o oligonucleotídeo compreende 2006-PDE5dG4-X1 ou 2006-PDE5dG4-X3.

[0375] A modalidade 76 é o método da modalidade 72 a 75, em que o pelo menos um motivo de CpG é uma pluralidade de motivos de CpG.

[0376] A modalidade 77 é o método da modalidade 76, em que a pluralidade de motivos de CpG compreende dois, três, quatro ou cinco motivos de CpG.

[0377] A modalidade 78 é o método da modalidade 76 ou 77, em que cada motivo de CpG é separado dos outros motivos de CpG por pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo.

[0378] A modalidade 79 é o método da modalidade 78, em que o pelo menos um nucleotídeo é um a quatro nucleotídeos de timina.

[0379] A modalidade 80 é o método da modalidade 78 ou 79, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:217, 218, 219 ou 220.

[0380] A modalidade 81 é o método da modalidade 76 ou 77, em que cada um dos motivos de CpG é separado dos outros motivos de CpG por um espaçador.

[0381] A modalidade 82 é o método da modalidade 81, em que o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato.

[0382] A modalidade 83 é o método da modalidade 82, em que a ponte de desoxirribosefosfato é abásica.

[0383] A modalidade 84 é o método da modalidade 82 ou 83, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:221.

[0384] A modalidade 85 é o método da modalidade 81, em que o espaçador compreende uma cadeia de carbono.

[0385] A modalidade 86 é o método da modalidade 85, em que a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono.

[0386] A modalidade 87 é o método da modalidade 86, em que a cadeia de carbono é derivada de etanodiol.

[0387] A modalidade 88 é o método da modalidade 86 ou 87, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X2, em que X2 é etanodiol.

[0388] A modalidade 89 é o método da modalidade 85, em que a cadeia de carbono compreende três átomos de carbono.

[0389] A modalidade 90 é o método da modalidade 89, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,3-propanodiol.

[0390] A modalidade 91 é o método da modalidade 89 ou 90, em que o nucleotídeo compreende CG-Gw2X2, Gw2X2-2, ou ODN- X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG-Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG- G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2-3, CG-G4T16X2-4, ou CG- G4T16X2-5, em que X2 é uma cadeia de três carbono; 2006- PDE5dG4-X2 em que X2 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol; ou 2006-PDE5dG4-X4, em que X4 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol.

[0391] A modalidade 92 é o método da modalidade 85, em que a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono.

[0392] A modalidade 93 é o método da modalidade 92, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol.

[0393] A modalidade 94 é o método da modalidade 92 ou 93, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X4, em que X4 é uma cadeia de quatro carbonos derivada de 1,4-butanodiol.

[0394] A modalidade 95 é o método da modalidade 81, em que o espaçador compreende uma unidade química repetida.

[0395] A modalidade 96 é o método da modalidade 95, em que a unidade química repetida é um etileno glicol.

[0396] A modalidade 97 é o método da modalidade 95 ou 96, em que o oligonucleotídeo compreende CCGC-Gw2X1, em que X1 é um espaçador derivado de hexaetilenoglicol.

[0397] A modalidade 98 é o método de qualquer uma das modalidades anteriores 61-97, que compreende adicionalmente pelo menos um análogo de nucleotídeo.

[0398] A modalidade 99 é o método de qualquer uma das modalidades anteriores 61-98, que compreende adicionalmente uma fração de lipídio.

[0399] A modalidade 100 é o método da modalidade 99, em que a fração de lipídio é colesterol.

[0400] A modalidade 101 é o método da modalidade 99 ou 100, em que a fração de lipídio está em ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0401] A modalidade 102 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 101, em que o motivo de CpG compreende um elemento de sequência de CpG que tem pelo menos quatro nucleotídeos.

[0402] A modalidade 103 é o método da modalidade 102, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois elementos de sequência de CpG.

[0403] A modalidade 104 é o método da modalidade 102 ou 103, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos três elementos de sequência de CpG.

[0404] A modalidade 105 é o método de qualquer uma das modalidades 101 a 104, em que os elementos de sequência de CpG são GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT, TCGC, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0405] A modalidade 106 é o método da modalidade 61 que compreende adicionalmente uma extremidade de terminal 3’ de nucleotídeo de tri-timina.

[0406] A modalidade 107 é o método da modalidade 106, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215.

[0407] A modalidade 108 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 107, em que a composição imunoestimulatória compreende uma vacina para prevenir ou tratar doença infecciosa.

[0408] A modalidade 109 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 107, em que a composição imunoestimulatória compreende um vetor.

[0409] A modalidade 110 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 109, em que a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0410] A modalidade 111 é o método da modalidade 110, em que o oligonucleotídeo e o carreador são ligados.

[0411] A modalidade 112 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 111, em que a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente um hapteno.

[0412] A modalidade 113 é o método de qualquer uma das modalidades 112, em que o oligonucleotídeo e o hapteno são ligados.

[0413] A modalidade 114 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 113, em que a administração é realizada de modo intravenoso, intramuscular, intramamário, intradérmico, intraperitoneal, subcutâneo, por meio de aspersão, por meio de aerossol, em ovo, de modo mucosal, transdérmico, por meio de imersão, de modo oral, intraocular, intratraqueal ou intranasal.

[0414] A modalidade 115 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 114, em que o indivíduo é um animal.

[0415] A modalidade 116 é o método de qualquer uma das modalidades 61 a 115, em que o indivíduo é um membro de uma espécie de ave.

[0416] A modalidade 117 é um método para aumentar a atividade estimulatória de TLR21 de um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de CpG que compreende fusionar a extremidade 5’ do oligonucleotídeo a uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina.

[0417] A modalidade 118 é o método da modalidade 117, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina é uma sequência de G-quarteto.

[0418] A modalidade 119 é o método da modalidade 118, em que a sequência de G-quarteto compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina.

[0419] A modalidade 120 é o método da modalidade 119, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende três a oito nucleotídeos de guanina.

[0420] A modalidade 121 é o método da modalidades 119 ou 120, em que a sequência de G-quarteto compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, ou TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264).

[0421] A modalidade 122 é o método de qualquer uma das modalidades 117 a 121, em que o oligonucleotídeo compreende uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina.

[0422] A modalidade 123 é o método de qualquer uma das modalidades 117 a 122, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma sequência G-wire.

[0423] A modalidade 124 é o método da modalidade 123, em que a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258.

[0424] A modalidade 125 é o método de qualquer uma das modalidades 119 a 124, em que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina são separadas por pelo menos um nucleotídeo.

[0425] A modalidade 126 é o método da modalidade 117, que compreende adicionalmente inserir um ligante entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0426] A modalidade 127 é o método da modalidade 126, em que o ligante compreende pelo menos três nucleotídeos.

[0427] A modalidade 128 é o método da modalidade 126 ou 127, em que o ligante compreende um hexaetilenoglicol, trietilenoglicol, propanodiol ou derivados dos mesmos.

[0428] A modalidade 129 é o método de qualquer uma das modalidades 126 a 128, em que o oligonucleotídeo compreende 2006-PDE5dG4-X1 ou 2006-PDE5dG4-X3.

[0429] A modalidade 130 é o método da modalidade 117, em que o pelo menos um motivo de CpG é uma pluralidade de motivos de CpG.

[0430] A modalidade 131 é o método da modalidade 130, em que a pluralidade de motivos de CpG compreende dois, três, quatro ou cinco motivos de CpG.

[0431] A modalidade 132 é o método da modalidade 130 ou 131 que compreende adicionalmente inserir pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo entre os motivos de CpG.

[0432] A modalidade 133 é o método da reivindicação 132, em que o pelo menos um nucleotídeo é um a quatro nucleotídeos de timina.

[0433] A modalidade 134 é o método da modalidade 117, que compreende adicionalmente inserir um espaçador entre cada um dos motivos de CpG.

[0434] A modalidade 135 é o método da modalidade 134, em que o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato.

[0435] A modalidade 136 é o método da modalidade 135, em que a ponte de desoxirribosefosfato é abásica.

[0436] A modalidade 137 é o método da modalidade 134, em que o espaçador compreende uma cadeia de carbono.

[0437] A modalidade 138 é o método da modalidade 137, em que a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono.

[0438] A modalidade 139 é o método da modalidade 137 ou 138, em que a cadeia de carbono é derivada de etanodiol.

[0439] A modalidade 140 é o método da modalidade 137, em que a cadeia de carbono compreende três átomos de carbono.

[0440] A modalidade 141 é o método da modalidade 137 ou 140, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,3- propanodiol.

[0441] A modalidade 142 é o método da modalidade 137, em que a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono.

[0442] A modalidade 143 é o método da modalidade 137 ou 142, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol.

[0443] A modalidade 144 é o método da modalidade 137, em que o espaçador compreende uma unidade química repetida.

[0444] A modalidade 145 é o método da modalidade 137 ou 144, em que a unidade química repetida é um etileno glicol.

[0445] A modalidade 146 é o método de qualquer uma das modalidades 137, 144 ou 145, em que o espaçador é derivado de hexaetilenoglicol.

[0446] A modalidade 147 é o método de qualquer uma das modalidades 117 a 146 que compreende adicionalmente inserir pelo menos um análogo de nucleotídeo.

[0447] A modalidade 148 é o método de qualquer uma das modalidades 117 a 147 que compreende adicionalmente inserir uma fração de lipídio.

[0448] A modalidade 149 é o método da modalidade 148, em que a fração de lipídio é um colesterol.

[0449] A modalidade 150 é o método da modalidade 148 ou 149, em que a fração de lipídio está em ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0450] A modalidade 151 é o método de qualquer uma das modalidades 117 a 150, que compreende adicionalmente modificar os nucleotídeos adjacentes ao motivo de CpG.

[0451] A modalidade 152 é um método de elicitação de uma resposta imune em um indivíduo que compreende: administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma composição imunoestimulatória que compreende um oligonucleotídeo que tem pelo menos um motivo de dinucleotídeo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0452] A modalidade 153 é o método da modalidade 152, em que a concentração do oligonucleotídeo é menor que 20 nM.

[0453] A modalidade 154 é o método da modalidade 152 ou 153, em que a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0454] A modalidade 155 é o método de qualquer uma das modalidades 152 a 154, em que a composição imunoestimulatória compreende adicionalmente um hapteno.

[0455] A modalidade 156 é o método de qualquer uma das modalidades 152 a 155, em que a meia concentração máxima (EC50) da composição imunoestimulatória é menor que 100 pM.

[0456] A modalidade 157 é o método da modalidade 152, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma sequência de G-quarteto.

[0457] A modalidade 158 é o método de qualquer uma das modalidades 152 a 156, em que a sequência de G-quarteto compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264), ou TGGGGT (SEQ ID NO:265).

[0458] A modalidade 159 é o método de qualquer uma das modalidades 152 a 157, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 ou

138.

[0459] A modalidade 160 é o método da modalidade 152, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma sequência G-wire.

[0460] A modalidade 161 é o método da modalidade 160, em que a sequência G-wire compreende SEQ ID NO:257 ou 258.

[0461] A modalidade 162 é o método da modalidade 160, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 141, 142, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 252 ou GCGT-Gwire3.

[0462] A modalidade 163 é o método da modalidade 152, em que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende primeira e segunda pluralidades de nucleotídeos de guanina separadas por pelo menos um nucleotídeo.

[0463] A modalidade 164 é o método da modalidade 152, em que o oligonucleotídeo compreende adicionalmente um ligante entre a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina e o pelo menos um motivo de CpG.

[0464] A modalidade 165 é o método da modalidade 164, em que o ligante compreende pelo menos três nucleotídeos.

[0465] A modalidade 166 é o método da modalidade 164, em que o ligante compreende um hexaetilenoglicol, trietilenoglicol, propanodiol ou derivados dos mesmos.

[0466] A modalidade 167 é o método da modalidade 164 a 166, em que o oligonucleotídeo compreende 2006-PDE5dG4-X1 ou 2006-PDE5dG4-X3.

[0467] A modalidade 168 é o método da modalidade 152, em que o pelo menos um motivo de CpG é uma pluralidade de motivos de CpG.

[0468] A modalidade 169 é o método da modalidade 168, em que a pluralidade de motivos de CpG compreende dois, três, quatro ou cinco motivos de CpG.

[0469] A modalidade 170 é o método da modalidade 168 ou 169, em que cada motivo de CpG é separado dos outros motivos de CpG por pelo menos um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo.

[0470] A modalidade 171 é o método da modalidade 170, em que o pelo menos um análogo de nucleotídeo é um a quatro nucleotídeos de timina.

[0471] A modalidade 172 é o método da modalidade 170 ou 171, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:217, 218, 219 ou 220.

[0472] A modalidade 173 é o método da modalidade 168 ou 169, em que cada um dos motivos de CpG é separado dos outros motivos de CpG por um espaçador.

[0473] A modalidade 174 é o método da modalidade 173, em que o espaçador é uma ponte de desoxirribosefosfato.

[0474] A modalidade 175 é o método da modalidade 174, em que a ponte de desoxirribosefosfato é abásica.

[0475] A modalidade 176 é o método da modalidade 174 ou 175, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO:221.

[0476] A modalidade 177 é o método da modalidade 173, em que o espaçador compreende uma cadeia de carbono.

[0477] A modalidade 178 é o método da modalidade 177, em que a cadeia de carbono compreende dois átomos de carbono.

[0478] A modalidade 179 é o método da modalidade 177 ou 178, em que a cadeia de carbono é derivada de etanodiol.

[0479] A modalidade 180 é o método de qualquer uma das modalidades 177 a 179, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X2 em que X2 é etanodiol.

[0480] A modalidade 181 é o método da modalidade 177, em que a cadeia de carbono compreende três átomos de carbono.

[0481] A modalidade 182 é o método da modalidade 177 ou 181, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,3- propanodiol.

[0482] A modalidade 183 é o método de qualquer uma das modalidades 177, 181 ou 182, em que o nucleotídeo compreende CG-Gw2X2, Gw2X2-2, ou ODN-X3, CG-Gw2X2-1, CG-Gw2X2-3, CG- Gw2X2-4, CG-Gw2X2-5, CG-G4T16X2-1, CG-G4T16X2-2, CG-G4T16X2- 3, CG-G4T16X2-4, ou CG-G4T16X2-5, em que X2 é uma cadeia de três carbono; 2006-PDE5dG4-X2 em que X2 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol; ou 2006-PDE5dG4-X4, em que X4 é uma cadeia de três carbonos derivada de propanodiol.

[0483] A modalidade 184 é o método da modalidade 177, em que a cadeia de carbono compreende quatro átomos de carbono.

[0484] A modalidade 185 é o método da modalidade 177 ou 184, em que a cadeia de carbono é derivada de 1,4-butanodiol.

[0485] A modalidade 186 é o método de qualquer uma das modalidades 177, 184 ou 185, em que o oligonucleotídeo compreende ODN-X4, em que X4 é uma cadeia de quatro carbonos derivada de 1,4-butanodiol.

[0486] A modalidade 187 é o método da modalidade 173, em que o espaçador compreende uma unidade química repetida.

[0487] A modalidade 188 é o método da modalidade 187, em que a unidade química repetida é um etileno glicol.

[0488] A modalidade 189 é o método da modalidade 187 ou 188, em que o oligonucleotídeo compreende CCGC-Gw2X1 e em que X1 é um espaçador derivado de hexaetilenoglicol.

[0489] A modalidade 190 é o método de qualquer uma das modalidades 152 a 189 que compreende adicionalmente pelo menos um análogo de nucleotídeo.

[0490] A modalidade 191 é o método das modalidades 152 a 190 que compreende adicionalmente fixar uma fração de lipídio ao oligonucleotídeo.

[0491] A modalidade 192 é o método da modalidade 191, em que a fração de lipídio é colesterol.

[0492] A modalidade 193 é o método da modalidade 191 ou 192, em que a fração de lipídio está em ou perto da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

[0493] A modalidade 194 é o método da modalidade 152, em que o motivo de CpG compreende um elemento de sequência de CpG que tem pelo menos quatro nucleotídeos.

[0494] A modalidade 195 é o método da modalidade 194 que compreende pelo menos dois elementos de sequência de CpG.

[0495] A modalidade 196 é o método da modalidade 194 ou

195 que compreende pelo menos três elementos de sequência de CpG.

[0496] A modalidade 197 é o método de qualquer uma das modalidades 194 a 196, em que os elementos de sequência de CpG são GCGA, GCGG, ACGC, CCGC, GCGT, TCGC, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0497] A modalidade 198 é o método da modalidade 152 que compreende adicionalmente inserir uma corrida de nucleotídeo de tri-timina na extremidade de terminal 3’ do oligonucleotídeo.

[0498] A modalidade 199 é o método da modalidade 198, em que o oligonucleotídeo compreende SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 ou 215.

[0499] A modalidade 200 é um oligonucleotídeo imunoestimulatório que compreende SEQ ID NO:252.

[0500] A modalidade 201 é o oligonucleotídeo da modalidade 200, que compreende adicionalmente uma modificação de 5’ colesterila.

[0501] A modalidade 202 é o oligonucleotídeo da modalidade 201, em que a modificação de 5’ colesterila compreende um ligante de trietilenoglicol.

[0502] Quando se introduzem os elementos da presente revelação ou a modalidade preferencial (ou modalidades preferenciais) dos mesmos, os artigos "um", "uma", "o, a" e o termo "dito" pretendem significar que existem um ou mais dos elementos. Os termos “que compreende”, “que inclui” e “que tem” se destinam a ser inclusivos e significar que pode haver elementos adicionais diferentes dos elementos listados.

[0503] Em vista do exposto acima, deve-se observar que os diversos objetos da invenção são obtidos e outros resultados vantajosos são alcançados.

[0504] Visto que diversas alterações podem ser feitas nos produtos e métodos acima sem se afastar do escopo da revelação, pretende-se que toda matéria contida na descrição acima seja interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Oligonucleotídeo isolado imunoestimulatório caracterizado por compreender um motivo de CpG e uma sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina que começa em ou dentro de quatro nucleotídeos da terminação 5’ do oligonucleotídeo.

2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende uma primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina.

3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina compreende de três a oito nucleotídeos de guanina.

4. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, sendo o oligonucleotídeo caracterizado por compreender SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 92, 93, 96, 97, 100, 102, 104, 106, 108, 143 ou 252.

5. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência enriquecida por nucleotídeo de guanina compreende TTAGGG, TTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO:261), TTTTGGGG, GGGGTTTT, GGGGTTTTGGGG (SEQ ID NO:262), TTAGGG, TTAGGGTTAGGGTTTT (SEQ ID NO:263), TGTGGGTGTGTGTGGG (SEQ ID NO: 268), GGAGG, TGGAGGC, TGGAGGCTGGAGGC (SEQ ID NO:264), ou TGGGGT (SEQ ID NO:265).

6. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo o oligonucleotídeo caracterizado por compreender SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 134, 136, 137 ou 138.

7. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender adicionalmente uma segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina entre a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina e o motivo de CpG.

8. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de nucleotídeos de guanina, a segunda pluralidade de nucleotídeos de guanina, ou ambas compreendem uma sequência de G-quarteto.

9. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda pluralidades de nucleotídeos de guanina compreendem uma sequência G-wire.

10. Vacina caracterizada por compreender o oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

11. Vetor caracterizado por compreender o oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

12. Composição imunoestimulatória caracterizada por compreender o oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

13. Composição imunoestimulatória, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

14. Composição imunoestimulatória, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo e o carreador são ligados.

15. Ligante TLR21 sintético caracterizado pelo fato de o ligante TLR21 sintético é o oligonucleotídeo conforme definido na reivindicação 1.