CN104718221B - Toll-样受体及免疫刺激性寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：toll‑样受体；包含此类toll‑样受体的细胞；检测免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法，其中此类方法使用此类toll‑样受体；通过使用该方法检测到的免疫刺激性寡脱氧核苷酸；此类免疫刺激性寡脱氧核苷酸在医药中的用途；以及包含此类免疫刺激性寡脱氧核苷酸的疫苗。

Description

Toll-样受体及免疫刺激性寡核苷酸
本发明涉及：杂合toll-样受体；包含此类toll-样受体的细胞；免疫刺激性寡脱氧核苷酸检测方法，其中，该方法使用此类toll-样受体；通过使用该方法检测到的免疫刺激性寡脱氧核苷酸；此类免疫刺激性寡脱氧核苷酸在医药中的用途；以及包含此类免疫刺激性寡脱氧核苷酸的疫苗。
在过去二十年中，在免疫科学中已发现，脊椎动物免疫系统拥有检测微生物感染和通过受体介导的对特有且保守的病原体特征的识别（所谓的病原体相关分子模式(PAMPs)与相关的宿主病原体识别受体(PRRs)相互作用）而引发快速免疫活化作用的机制(Iwasaki A, Medzhitov R. 2001和 Medzhitov R., 2009)。
目前清楚的是，这些PAMP中存在某些形式的病原体脱氧核糖核酸 (DNA)。在1995年，有报道称细菌DNA中非甲基化的 CpG 基序引发鼠B-细胞活化作用 (Krieg等人1995)。该研究首次在细菌免疫刺激性含非甲基化CpG的DNA的特异性识别与之前公认的CpG抑制以及哺乳动物DNA中广泛存在的CpG 甲基化之间建立起联系。最有效的B细胞刺激性非甲基化CpG 寡脱氧核苷酸 (CpG ODN)显示出拥有序列元件GACGTT。
这一领域中下一个里程碑性的论文是由日本大坂Shizuo Akira的实验室发表的(Hemmi等人2000)。通过在小鼠中的基因克隆以及靶向基因敲除方法，可以毫无疑义地表明小鼠中对CpG-ODN的细胞应答是由toll-样受体 9 (TLR9)介导的。接下来表明了CpG-ODN是主要通过NF κ-B途径的TLR9信号传导的激动剂 (Medzhitov 2001)。在接下来的十年中，已有相当多的关于基础研究主题以及关于一般性的潜在免疫治疗应用的研究发表(例如综述于Krieg 2002, 2003, 2006; Klinman 2004, Vollmer 2005, Wilson等人2006,Kindrachuk等人2008, Dorn和Kippenberger 2008, Vollmer和Krieg 2009, Wilson等人2009)。许多综述性文章关注于CpG-ODN的抗感染应用(Krieg 2007)，TLR9 激动剂在癌症治疗中的应用(Krieg 2007, Weiner 2009), TLR9 活化作用用于哮喘和过敏反应的治疗(Kline 2007, Kline 和Krieg 2008, Fonseca和Kline 2009)以及作为疫苗佐剂(Klinman等人2004, Klinman 2006, Daubenberger 2007, Wagner 2009, Mutwiri等人2009,Klinman等人2009)。
也已描述和讨论CpG ODN在兽医应用中，特别是在牛、猪、绵羊、犬、鸡和鱼中作为免疫刺激性试剂和疫苗佐剂 (Babiuk等人2003, Carrington和Secombes 2006, Griebel等人2005, Mutwiri等人2003, Singh和O'Hagan 2003, Werling和Jungi 2003)。
迄今为止，对于用作人和非人物种的免疫调节剂的特异性CpG ODN's的设计仍是非常随机的。其原因是多方面的；首先，尚无有关用于人TLR's的免疫调节CpG 基序与非人哺乳动物物种TLR's的免疫调节CpG 基序之间关联的任何知识。其次，还没有可用的具有信噪比水平低至足以允许选择性检测极低浓度CpG ODN's效果的含哺乳动物 TLR的体外细胞系统。此外，没有可用的高通量筛选方法，即使存在这样的高通量筛选方法，也没有作为免疫调节剂的CpG ODN's体内相对于体外效力之间的明确关联。
在本发明申请日时未公开的、申请号为 PCT/EP2011/074211的PCT专利申请中，发明人已描述了一种体外细胞系统，其适用于作为用于家禽的免疫调节剂的CpG ODN's的可重复体外测试和选择。该系统基于TLR21(鸡中TLR9的功能同源物)的克隆和异源表达。
为了研发类似的系统以测试作为用于哺乳动物（用于人物种且用于非人物种如犬、牛以及猪物种）的免疫调节剂的CpG ODN's，决定应用类似的方法，然而，现在基于尤其是(i.a.)犬、牛和猪toll-样受体 TLR9的克隆和表达。
为此，使用HEK293细胞的克隆系，其基因组中包含有整合型的pNifTy2-SEAP(Invivogen)，其提供基于测量分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)产生的NF-κB 活化报道基因测定(参见实施例部分)。本发明人表明了此类细胞系可广泛地应用于，以从多种脊椎动物 (牛、犬、猪、鸡)物种分离的TLR1/2、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7以及TLR8的稳定功能性表达为目的的实验中。
针对此背景，曾预期牛、犬和猪 TLR9的表达应是简单的，预期进一步被鸡 TLR9功能同源物TLR21基于格外运行良好的(exceptionally well-functioning) HEK293-pNifTy2-SEAP的功能性表达所加强。
然而，尽管成功地实现质粒引入的选择 (G418或潮霉素)这一事实，但用牛、犬和猪 TLR9进行的重复转染实验没有产生能用已知的标准TLR9 激动剂, 如2006-PTO(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)或2007-PTO (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)刺激的细胞系。仅在少数实验中，开始时可见到多克隆转染子合并物(pool)中的微弱信号。进一步细胞系培养时这些信号即消失，并且无法通过单细胞克隆来拯救。利用另一种含有NF-κB 活化作用报道基因的细胞类型，即牛巨噬细胞系BOMAC-pNifTy2-SEAP，进行了类似的实验。结果与之前在HEK293-pNifTy2-SEAP中见到的基本上一样。
功能性表达(如通过SEAP 信号显示的)的意外失败原因仍旧未知。为克服上述问题，利用293XL/裸细胞(InvivoGen)，表达人抗凋亡Bcl-XL基因的尝试，也没有产生足够高的SEAP表达水平。
因此，仍需要用于选择具有高免疫调节作用从而能以低剂量在哺乳动物中起效的CpG ODN's的具选择性且灵敏的系统。
本发明的一个目的在于提供此类具选择性且灵敏的CpG ODN选择系统。
目前令人惊奇地发现包含家禽 TLR21的Toll-白介素 I 受体抗性 (TIR) 结构域和哺乳动物 TLR9的胞外配体结合结构域的杂合toll-样受体，能够克服上述的低功能性表达或无表达的问题。
TLRs是非常保守的I型跨膜 (TM)蛋白，由N-末端信号肽、含富含亮氨酸重复的胞外配体结合结构域、单一的TM结构域、和主要由Toll-白介素 I 受体抗性 (TIR) 结构域构成的胞质区所构成。
仅作为实例：小鼠TLR9的胞外结构域跨越a.a. 1-820的区域，跨膜结构域跨越a.a. 820-838的区域，且胞质结构域跨越a.a. 838-1032的区域。TIR 结构域跨越a.a.872-1032的区域(Kajita等人, BBRC 343: 578-584 (2006))。
TLR9 和家禽同源物 TLR21的区室化在一定程度上区别于TLR1、2、4、5 和6的区室化，原因在于TLR9 和21中称作“胞外结构域”的部分位于内体性溶酶体(endolysosome)。结果，TLR9/21的TM区跨内体性溶酶体膜，而非细胞的质膜。Barton G.M. 和 Kagan, J.C.在Nature Reviews 9; 535-542 (2009)中对TLR的这一方面以及细胞生物学进行了总体综述。
仅作为哺乳动物 TLR's的实例，SEQ ID NO's 1、3 和 5 (核酸序列)以及SEQ IDNO's 2、4 和 6 (氨基酸序列)中分别给出了牛、猪和犬 TLR9的序列。
结果是，组合了哺乳动物 TLR9的胞外配体结合结构域的CpG ODN特异性和家禽TLR21 Toll-白介素 I 受体抗性 (TIR) 结构域的信号传导特性的本发明的杂合TLR's被经转染的细胞接受，而没有不能接受的副作用，同时它们非常适合于特定检测对哺乳动物物种具有特异性免疫刺激性的CpG ODN's。
用含编码此类杂合TLR's的DNA的质粒转染如 HEK293细胞或MDCK细胞，得到稳定的杂合TLR's表达，其继而，在用已知在哺乳动物中有活性的外源CpG ODN's(如2006-ODN和2007-ODN)刺激时，导致显著的NF-κB 活化作用。
因此，本发明的第一个实施方案涉及杂合toll-样受体，其特征在于，所述杂合toll-样受体包含家禽 TLR21的Toll-白介素 I 受体抗性 (TIR) 结构域和哺乳动物 TLR9的胞外配体结合结构域。
跨膜区(TM 区)和胞质结构域的非TIR相关部分的来源不是至关重要的，从这个意义上讲，这些可以独立地来源于TLR 9或TLR21。
在这一实施方案的优选形式中，哺乳动物 TLR9的胞外配体结合结构域是人、牛、猪或犬来源的。
其中哺乳动物 TLR9的胞外配体结合结构域为牛、猪或犬起源的本发明的杂合TLR's的实例分别在SEQ ID NO's 8、10和12 (核酸序列)和SEQ ID NO's 9、11和13 (氨基酸序列)中给出。
“免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸”指包含非甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷二核苷酸序列的寡脱氧核苷酸，其刺激起始信号级联放大以导致转录因子如NF-κB或干扰素调节因子3 (IRF3)的活化作用。正是这一活化作用进而导致炎性细胞因子的表达，以及其他细胞活化事件。NF-κB结合位点和受NF-κB影响的基因表达尤其由Schindler和Baichwal(1994)所描述。
术语寡脱氧核苷酸指脱氧核苷酸的短核酸聚合物；即包含与磷酸基团和可替换的有机碱连接的多个脱氧核糖的分子。此类有机碱是取代型嘧啶和取代型嘌呤。作为实例分别有胞嘧啶和胸腺嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤。
本发明的寡核苷酸可以包含修饰。此类修饰的实例为例如在位于核苷的3' 和/或5'末端的核苷间磷酸二酯桥(phosphodiester internucleoside bridge)中的修饰。此类修饰尤其涉及例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯对磷酸二酯的替代。
基本上，根据合成方法，一般两核苷酸之间的键的常见类型是：磷酸二酯(PDE)键和硫代磷酸酯(PTO)键。为了改进CpG ODN's的稳定性和免疫刺激性作用，合成的寡脱氧核苷酸的结构单元可以提供有硫代磷酸酯，使得它们形成PTO键。
其他修饰为例如以脱磷酸桥(dephospho bridge)替代磷酸二酯桥。脱磷酸桥的实例有甲基羟胺、formacetal和二亚甲基砜(dimethylenesulfone)基团。
仍其他的修饰为涉及由非天然核苷碱基替代天然核苷碱基的修饰，所述非天然核苷碱基如5-氟胞嘧啶、7-脱氮杂-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮杂-8-取代的鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5-溴-胞嘧啶、6-取代的胞嘧啶或N4-取代的胞嘧啶。
再其他的修饰是涉及糖单元替代的修饰；由经修饰的糖单元例如L-2'-脱氧核糖或2'-L-阿拉伯糖替代ß-核糖(ribose sugar)或ß-D-2'-核糖单元。
对寡核苷酸给出进一步介绍的教科书为例如 “PCR Primer: A LaboratoryManual”, 第二版, 2003, 由Carl W. Dieffenbach编辑, National Institute of Allergy and Infectious Diseases; Gabriela S. Dreksler, Uniformed Services University of the Health Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN978-087969654-2。
为了检测新CpG ODN's需要包含下述细胞的系统，所述细胞包含本发明的杂合TLR。
因此，本发明的第二个实施方案涉及包含本发明的杂合TLR的细胞。
如所述 (参见上文)，TLR9的CpG ODN 激动剂主要经由NF kappa-B (NF-κB)途径进行信号传导(Medzhitov 2001)。
因此，检测CpG ODN对细胞内(NF-κB)途径中的化合物的存在和量的作用指示其作为PAMP的活性。
Brownlie等人(2009)描述了基于NF-κB 荧光素酶的报道系统。其他的报道系统为例如基于IL-8 转录物测量或细胞因子分泌或对NO分泌的检测。
因此，该实施方案的优选形式涉及本发明的细胞，其特征在于，所述细胞包含含有NF-κB 报道基因的质粒。
如上所述此类报道系统虽然有用，但是仍具有缺点，即这些系统不是很灵敏。为了精确地测定现有的以及新开发的CpG ODN's的活性，灵敏的检测系统是必要条件。
本发明人目前利用本发明的检测系统，其显示出令人惊奇的灵敏性。该系统基于利用由报道基因编码的被称作分泌型碱性磷酸酶 (SEAP) 的酶作为报道酶。SEAP是哺乳动物系统中的报道酶 (Yang等人, 1997)。在该系统中，SEAP的表达受与ELAM启动子组合的5个NF-κB转录因子结合位点的控制(J. Biol. Chem. 1991, Feb 5; 266(4): 2466-73)。
因此，该第二个实施方案的更优选形式涉及本发明的细胞，其中，报道基因编码分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)。
该SEAP系统与作为底物的对硝基苯基磷酸盐(pNPP)一起应用。
相对于现有系统的另一重要改进在于，带有报道基因的质粒被引入并稳定保持于细胞之中。
至今，全部的检测系统均使用报道基因瞬时转染细胞。此类瞬时系统不能对CpGODN's效力进行可靠的并行比较。
通常，通过使细胞在一种或多种选择剂（例如抗生素，对其的抗性基因存在于质粒上）的压力下生长，以获得质粒的稳定保持。质粒丢失则将引起丢失所述质粒的细胞死亡。留下来的活细胞将仍携带所述质粒。稳定意味着在若干细胞分裂循环后所述质粒仍保持存在于所述细胞中，优选地，所述质粒被整合到细胞基因组中。
由于报道基因引入并稳定保持在细胞中，现在第一次可以产生CpG ODN's的可重复的剂量/应答曲线。若要在多种CpG ODN's活性之间进行可靠比较，此类曲线是必需的。
因此，该第二实施方案的另一优选形式涉及本发明的细胞，其包含编码NF-κB 报道基因的质粒，所述质粒稳定地保持于所述细胞之中。此类细胞非常适合用于筛选CpG分子，更具体而言筛选本发明的CpG分子。
实施例中对于如何获得这种包含能稳定保持于细胞中的编码报道基因的质粒的细胞，给出了充分的教导。
基本上，带有本发明的杂合TLR的任何细胞或细胞系（其允许引入并优选地稳定保持带有NF-κB 报道基因，优选如上所述SEAP基因的质粒），均适合于测试TLR9-特异性 CpGODN's。用于测试TLR9-特异性 CpG ODN's的此类合适的细胞系的一个实例是HEK293细胞系((ATCC 编号CRL-1573)。
用于测试TLR9-特异性 CpG ODN's的优选细胞系是Madin Darby 犬肾细胞系(ATCC编号 CCL-34) (MDCK)。
因此，该第二个实施方案的另一优选形式涉及本发明的细胞，其中，所述细胞是HEK293细胞，优选MDCK细胞。
在本发明的实施例部分详细地描述的方法和细胞系首次允许进行用于哺乳动物物种的多种CpG ODN's之间的可靠并行比较。
因此，本发明的仍另一实施方案涉及检测本发明的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法，其中，所述方法包括步骤：a)使寡脱氧核苷酸与本发明的细胞接触，b)检测所述报道基因产物的水平。
在所述方法的优选形式中，所述报道基因的产物是SEAP。
如下文的实施例中所示，本发明的杂合toll-样受体已被广泛地用于鉴定新CpGODN's。
以两位数或甚至有时以一位数纳摩尔浓度的本发明的CpG 寡脱氧核苷酸，大多数情况下，在体外测试系统和体内均是有活性的。
寡脱氧核苷酸的半最大有效浓度(EC50)是诱导随时间的推移给出半最大吸收变化的报道细胞中报道酶 SEAP (其产生在405 nm下吸收的有色产物)的量所必需的寡脱氧核苷酸的量。
所给出的Vmax指示为SEAP的显色底物被转化成具有405 nm吸收的有色组分的速度的指示。高 Vmax表示CpG ODN能够迅速地诱导TLR反应。
发现下述新免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸具有低EC50 (两位甚至一位数的nM浓度)，因而，其在极低浓度下已经非常有效：
应当紧记的是，全部这些新免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸都是硫代磷酸酯(phosphorothioate，PTO) 型的。
因此，本发明的又另一实施方案涉及具有以上给出的12种通式中任一种的免疫刺激性非甲基化 PTO 寡脱氧核苷酸。
通常发现，当n增加时，寡脱氧核苷酸的活性提高。当n增加时，该作用也随之提升。基本上，骨架结构的n的数值应因此至少为所示的n的数值。优选地，n的上限(upper range)是n ≤ 100，这仅因为合成的序列越长越难于制备这一事实。所以实践中，更优选的n的上限是n ≤ 40，甚至更优选n ≤ 20。
很可能将本发明的寡脱氧核苷酸，经由反应性化学基团，与载体或半抗原连接。此类连接增强组合分子的免疫刺激性作用。
此类组分的仅实例为例如地高辛(digoxigenin)、氨基己基-、德克萨斯红和生物素。
优选的载体或半抗原是3'- 和5'-标记的德克萨斯红和5'-标记的地高辛。寡脱氧核苷酸与半抗原/载体的连接是本领域所熟知的。
因此，该实施方案的优选形式涉及具有以上给出的12种通式之一的免疫刺激性非甲基化 PTO 寡脱氧核苷酸，其中，所述寡脱氧核苷酸与载体或半抗原相偶联。
本发明的另一实施方案涉及包含本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的载体。此类载体可以是核酸分子，如质粒、病毒、噬菌体或分子生物学中所用的任何其他载体。仅作为实例：包含免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的载体可以是，例如DNA分子，诸如在其中已经克隆本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸、在细菌中能增加的质粒。优选地，此类质粒具有有活性的复制起点，使得在宿主中存在极大量的质粒。使这种细菌大规模生长随后分离质粒，提供了合成生产本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸的替代方法。需要紧记的是，这一实施方案仅应用于PDE型的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸。
本发明的目的之一是提供能够连同抗原组分或编码抗原组分的遗传信息以及药学上可接受的载体一同用作预防或对抗传染病的疫苗中的成功的免疫刺激性组分的新CpGODN's。
一般而言，术语抗原组分指包含在施用于人或动物时能够诱导、刺激或增强免疫应答的至少一种表位的物质的组合物。
抗原组分可以是任何种类的抗原组分，但优选来源于这样的微生物或病毒，所述微生物或病毒以其野生型形式时对人或动物是致病的。
抗原组分可以是整个病原体（优选以灭活的或减毒的形式）、病原体的提取物或病原体的免疫原性蛋白(的免疫原性部分)。
如果抗原组分是病原体的免疫原性蛋白(的免疫原性部分)，优选地，所述免疫原性蛋白在体外培养的细胞中表达并从其中回收。
因此，另一实施方案涉及用于预防或对抗传染病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫刺激性量(immunostimulating amount)的本发明的寡脱氧核苷酸和/或本发明的载体、免疫原性量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息、以及药学上可接受的载体。
本领域技术人员可以理解，所述寡脱氧核苷酸的免疫刺激性量和所述抗原组分的免疫原性量强烈相关。本发明的优点之一在于提供能够降低预防或对抗传染病所需的抗原组分的量的新的寡脱氧核苷酸。
预防或对抗传染病所需的抗原组分的量指抗原组分的免疫原性量。
寡脱氧核苷酸的免疫刺激性量是能降低抗原组分的免疫原性量（即预防或对抗传染病所需的抗原组分的量）的量。
因此基本上，必然会发现措辞“寡脱氧核苷酸的免疫刺激性量”和“免疫原性量”彼此相关。
不言而喻，如果疫苗包含编码抗原组分的遗传信息，则由这一遗传信息所表达的抗原组分的量应该足以预防或对抗传染病，即它必须是免疫原性量。
本发明的非甲基化寡脱氧核苷酸是免疫刺激性的这一事实意味着它们增强疫苗中抗原组分的免疫效力。为此，与如果不存在本发明的寡脱氧核苷酸的情况相比，在很多情况下本发明的疫苗将包含较少的抗原组分或编码所述抗原组分的遗传信息。
在一些情况下，此类抗原组分，在没有免疫刺激性寡核苷酸添加的情况下，可能具有如此低的免疫原性特性以至于无论如何必需大量给予，尽管还是达不到所需的免疫原性水平。在这样的情况下，抗原组分可以以通常的高浓度给予，但是现在与本发明的寡脱氧核苷酸一起，以获得所需的免疫原性水平。
因此，根据经验，待与本发明的寡核苷酸一起施用的抗原组分或编码所述抗原组分的遗传信息的量，将等于或低于在不存在所述寡核苷酸的情况下给予的量。参与制备特定疫苗的技术人员知晓针对该特定疫苗的量。此外，实施例给出了例如待使用的抗原组分（例如用于犬物种的狂犬病疫苗）的量的教导。
需要与所述抗原组分或编码所述抗原组分的遗传信息一起施用的本发明的所述寡脱氧核苷酸的量，依赖于所选择的寡脱氧核苷酸以及抗原组分。
本发明的寡脱氧核苷酸非常合适的量通常在1-100纳摩尔之间变化。例如用5-50µg的平均长度为30个脱氧核苷酸的本发明的寡脱氧核苷酸（其在纳摩尔范围内体外测试中显示出活性）已获得了非常好的体内结果。
如果寡脱氧核苷酸选自在皮摩尔(picomolar)范围内具有活性的寡脱氧核苷酸的组，则本领域技术人员可以认识到在试验纳摩尔量之前，值得先对低于（可能是远低于）1纳摩尔的量，即皮摩尔量(如 100-1000 ng) 进行测试。本领域技术人员应当明了，可能存在针对本发明的每一种寡脱氧核苷酸的最佳量。
本发明的疫苗包含药学上可接受的载体。载体的性质尤其依赖于施用途径。如果施用途径是经口服或鼻内途径的，则所述载体可以仅是无菌水、生理盐溶液或缓冲液。如果优选的途径是注射，则所述载体应优选为等渗的且有使其适合于注射的pH限制。然而，此类载体是本领域所熟知的。
本发明的疫苗，除了所述抗原组分或编码所述抗原组分的遗传信息、以及本发明的寡脱氧核苷酸之外，还包含佐剂。一般而言，佐剂是以非特异性的方式加强宿主的免疫应答的物质。
本领域中已知许多佐剂均适合，如弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物(non-ionic block polymers)和聚胺如硫酸葡聚糖 (dextran sulphate)、聚羧乙烯(carbopol)和吡喃、氢氧化铝(alum hydroxide)。还经常使用的有磷酸铝(aluminphosphate)、皂苷、植物油如生育酚和矿物油。非常有效的佐剂是水包油乳状液和尤其是油包水乳状液，进一步也称作水包油佐剂和油包水佐剂。所述乳状液是本领域所熟知的。因此，所述疫苗优选地包含油包水佐剂。
优选地，抗原组分是或者来源于这样的病毒或微生物，所述病毒或微生物以其野生型形式时对人、猪、犬或牛物种是致病的。
对于大量的病原体，疫苗是市售的。这些病原体列于下文。
因此，更优选地，所述病毒和微生物选自人乳头状瘤病毒，引起结核病、白喉、百日咳、破伤风、肺炎或脑膜炎的细菌，麻疹病毒，脊髓灰质炎病毒，乙肝病毒，钩端螺旋体(Leptospira)，Mycobacterium hyopneumomiae，牛呼吸道合胞体病毒，口蹄疫病毒，牛病毒性腹泻病毒(Viral Diarrhoea virus)，猪繁殖与呼吸综合征病毒，犬细小病毒，犬副流感病毒，犬冠状病毒，犬瘟热病毒，犬腺病毒，猪圆环病毒2，牛疱疹病毒，狂犬病毒，猪瘟病毒(classical swine fever virus)，马疱疹病毒，猪细小病毒，大肠杆菌(Escherichia coli)，巴斯德氏菌属(Pasteurella) (尤其是多杀巴斯德氏菌(P. multocida))，博德特氏菌属(Bordetella) (尤其是支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica))，伪狂犬病毒，丹毒丝菌属(Erysipelothrix)，副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，牛副流感病毒，曼氏杆菌属(Mannheimia) (尤其是溶血性曼氏杆菌(M. haemolytica))，梭杆菌属(Fusobacterium)，胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)，马链球菌(Streptococcus equi)， Chlamidophila，大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，网尾线虫属(Dictyocaulis)，弓形虫 (Toxoplasma gondii)，巴贝虫属(Babesia) (尤其是犬巴贝虫(B. canis))，新孢子虫属(Neospora)，贾第虫属(Giardia)，肉孢子虫属(Sarcocystis)和利什曼属(Leishmania)。
本发明的又另一个实施方案涉及本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸，其与免疫量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息、以及药学上可接受的载体组合用作药物。
本发明的仍另一个实施方案涉及本发明的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸，其与免疫量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息、以及药学上可接受的载体组合用于预防或对抗哺乳动物物种优选人、猪、牛和犬物种中的传染病。
附图图例：
图1：MDCK (犬) – pNifTyhyg：与不同PAMPs的反应性。纵轴：mOD450nm/min。
图2：MDCK (犬) – pNifTyhyg：与不同PAMPs的反应性。纵轴：mOD450nm/min。
图3：MDcanK-pNifTyhyg-单细胞克隆 1-46-huTNF-α刺激。横轴：从左至右；克隆1至克隆46、合并物和对照。
图4：PCR “缝合” 策略。
图5：canTLR9-21MDCKpNifTyhyg-单细胞克隆 1-54-2006-PTO刺激。横轴：从左至右；克隆1至克隆54，接下来是“canTLR9-TLR21-合并物” (单细胞克隆前的多克隆细胞系)。以成对的柱给出反应性：左侧柱(灰色) 是用1 微摩尔(microM) 的2006-PTO刺激的水平，右侧柱(黑色是对照)。
图6-18：MDCK-pNifTyhyg-pIRESpuro-canTLR9-21融合体：用如所示的几种PAMPs的刺激。
图19：MDCK-pNifTyhyg-猪TLR9/TLR21-单细胞克隆 1-75 ODN-2006-PTO刺激。横轴：从左至右；克隆1至克隆75、合并物、“犬(canis)-TLR9/21-克隆17” (犬TLR9-21 融合克隆细胞系 (编号17)作为阳性对照)和“MDCK-pNifTyhyg” (用于转染实验的基础MDCK 细胞系)。
图20-31：MDCK-pNifTyhyg-猪TLR9/TLR21-融合体，用如所示的几种PAMPs测试。
图32：如所示的具有和不具有hio-tcg-8-PTO 的Nobivac狂犬病疫苗的抗体效价。
实施例
实施例 1.
牛 toll-样受体 9 (TLR-9)的基因克隆
由当地的屠宰场获得新鲜牛脾脏作为牛 TLR9信使RNA (mRNA)的来源。基本上根据Chomczynski 和Sacchi (1987)概要介绍，利用可商购的试剂盒及其说明书(TRIZOL® ,GIBCOBRL)，由牛脾脏组织制备总RNA。基本上按照逆转录酶 (-Expand ReverseTranscriptase, Roche)供应商所描述的，由牛脾脏总RNA合成第一链cDNA。设计了用于聚合酶链式反应 (PCR)扩增牛 TLR9 (Genbank AY859726) 从起始密码子区到终止密码子下游的 3'UTR区的引物(Bov-TLR9-for 和Bov-TLR9-rev，见下文)。然而，利用牛脾脏第一链cDNA目的在于扩增全长产物 (预计：~ 3100 bp)的起初的PCR实验(Expand High FidelityPCR试剂盒, Roche) 被重复证实为阴性的。对牛 TLR9基因更仔细地检视表明GC含量高(~64%)。因此，决定测试针对这一具体问题进行了优化的PCR系统(AdvantageTM GC2,Clontech)。相应的PCR反应产生了预期大小(~ 3100 bp)的弱DNA片段。
引物序列：
将所述PCR片段克隆入pCR2.1-Topo (Invitrogen)，对四个克隆进行测序，以鉴定出PCR无错版本(pCR2.1-Topo-牛TLR9)。利用引物引入的KpnI和XbaI限制酶位点，切出牛TLR9插入物，经琼脂糖凝胶纯化，亚克隆入经KpnI/XbaI切割的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(neo) 和pcDNA3.1(hyg) (均来自Invitrogen)，分别产生 pcDNA3.1(neo)-牛TLR9 和pcDNA3.1(hyg)-牛TLR9。对相应的插入物进行再测序 (见下文)。
pcDNA3.1 插入序列牛TLR9 (引物序列以下划线标示，起始/终止密码子以粗体突出显示)，3090 bp。
将翻译序列和保存于Genbank 的10条牛 TLR9 全长cDNA序列(2011年9月， P8-141108-prot-280109.pro Bov-TLR9-NM_183081.pro Bov-rom-TLR9-EF076723.pro Bov-ang-TLR9-EF076724.pro Bov-braf-TLR9-EF076725.pro Bov-brah-TLR9-EF076726.proBov-char-TLR9-EF076727.pro Bov-hol-TLR9-EF076728.pro Bov-lim-TLR9-EF076729.pro Bov-pied-TLR9-EF076731.pro Bov-TLR9-AY859726.pro)进行比对。11 条牛 TLR9多肽序列的比对 (ClustalW; DNAStar)显示在7个位置的多态性。在5种情况下，我们的TLR9 克隆(P8-141108-prot-280109)的翻译序列与大多数多肽序列一致。在另外两个位置，如在Genbank序列AY859726中发现了相同的残基。
因此得出结论，已克隆了正确版本的牛TLR9。
实施例2
猪 toll-样受体 9 (TLR-9)的基因克隆
由当地的屠宰场获得新鲜猪脾脏作为猪 TLR9信使RNA (mRNA)的来源。基本上根据Chomczynski 和Sacchi (1987)概要介绍，利用可商购的试剂盒及其说明书(TRIZOL® ,GIBCOBRL)，由猪脾脏组织制备总RNA。基本上按照逆转录酶 (Expand ReverseTranscriptase, Roche)供应商所描述的，由猪脾脏总RNA合成第一链cDNA。
设计了用于聚合酶链式反应 (PCR)扩增猪 TLR9 (Genbank NM_213958) 从起始密码子区到终止密码子下游的 3'UTR区的引物(PigTLR9for1和PigTLR9rev1，见下文)。然而，利用猪脾脏第一链cDNA目的在于扩增全长产物(预计：3246 bp) 的起初的PCR实验被重复证实为阴性的。因此，决定利用唯一的Xho I 位点，将猪 TLR9基因分成两个大小大致相等的片段 (分别为1501 bp 和1745 bp)，其更适宜PCR方法。为此，在正向，于Xho I 位点上游设计了引物，在反向，于Xho I下游设计了引物(PigTLR9XhoI-for和PigTLR9XhoI-rev，见下文)，以产生在唯一的XhoI位点附近重叠的PCR片段。
引物序列：
PCR反应 (Expand High Fidelity PCR试剂盒, Roche) 利用引物对PigTLR9for1/ PigTLR9XhoI-rev (用于扩增5' 基因片段)和PigTLR9XhoI-for/PigTLR9rev1 (用于扩增3' 基因片段)进行。相应的PCR产物经琼脂糖凝胶纯化，克隆入pCR2.1-topo (Invitrogen)，并对三个克隆的每一个进行测序以鉴定PCR无错版本。利用基于载体和基于PCR片段的XhoI位点，相应的5'- 和3'-PCR片段连接成全长猪 TLR9基因。经HindIII/NotI消化，从相应的构建体(pCR2.1-Topo-猪TLR9)中切出所述插入物，经琼脂糖凝胶纯化，亚克隆入经HindIII/NotI切割的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(neo) 和pcDNA3.1(hyg) (均来自 Invitrogen)中，分别产生pcDNA3.1(neo)-猪TLR9 和 pcDNA3.1(hyg)-猪TLR9。对相应的插入物进行再测序(见下文)。
pcDNA3.1 插入序列猪TLR9 (引物序列以下划线标示，起始/终止密码子以粗体突出显示，唯一的XhoI 位点突出显示)
将翻译序列和保存于Genbank的4条猪 TLR9 全长cDNA序列 (2011年9月， P1-181109-prot.pro, 猪-TLR9-NM_213958.pro, 猪-TLR9-AK349013.pro, 猪-TLR9-GU138029.pro, 猪-TLR9-AY859728.pro)进行比对。5条猪TLR9多肽序列的比对(ClustalW;DNAStar)显示在9个位置的多态性。在每一种情况下，我们的TLR9 克隆(P1-181109-prot)的翻译序列均与大多数多肽序列一致，并与cDNA 克隆AY859728的翻译相同。
因此得出结论，已克隆了正确版本的猪TLR9。
实施例3
犬 toll-样受体 9 (TLR-9)的基因克隆
从Zyagen购买犬淋巴结和犬脾脏的总RNA并用作TLR9信使RNA (mRNA)的来源。基本上按照逆转录酶 ( Expand Reverse Transciptase, Roche)供应商的描述由犬脾脏或淋巴结总RNA合成第一链cDNA。
设计了用于聚合酶链式反应 (PCR)扩增犬 TLR9 (Genbank NM_001002998) 从起始密码子区到终止密码子的引物(Canis-TLR9-for和Canis-TLR9-rev，见下文)。然而，利用犬淋巴结和脾脏第一链cDNA目的在于扩增全长产物(预计：~ 3100 bp) 的起初的PCR实验被重复证实为阴性的。因此，决定制备两个重叠的TLR9基因部分，其更适宜PCR方法，为PCR重叠延伸方法作准备。为此设计引物以产生具有~ 1600 bp的5'-PCR 犬 TLR9产物(犬-TLR9-for和CanTLR9olr，见下文)，和具有~ 1700 bp的3'-PCR 犬 TLR9产物(CanTLR9olf和犬-TLR9-rev)。
引物序列：
实施PCR反应 (Expand High Fidelity PCR试剂盒, Roche)，相应的PCR产物经琼脂糖凝胶纯化，克隆入pCR2.1-Topo (Invitrogen)中，对三个克隆的每一个进行测序，通过它们的翻译产物彼此比较，并与数据库序列NM_00102998 和 AY859723进行比较，以鉴定PCR无错版本。然后，通过重叠延伸方法将这些 (pCR2.1-Topo-canTLR9-Nterm和 pCR2.1-Topo-canTLR9-Cterm ) 用于连接犬 TLR9基因的5' 和3'区。为此，用仅9个循环和校正(proof-reading)聚合酶(Phusion® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase,Thermo Scientific) PCR扩增pCR2.1-Topo-canTLR9-Nterm (引物：Canis-TLR9-for和CanTLR9olr ) 和 pCR2.1-Topo-canTLR9-Cterm (引物：CanTLR9olf 和 Canis-TLR9-rev)的插入物。所得的PCR产物经琼脂糖凝胶纯化，然后用于在利用引物Canis-TLR9-for和Canis-TLR9-rev的重叠延伸-PCR组合进行组合。所得的~ 3100 bp PCR产物经琼脂糖凝胶纯化，并克隆入pCRBlunt-II (Invitrogen)。对4个独立的克隆进行测序，选择一个克隆用于进一步处理(pCR2.1-Topo-犬TLR9)。
经HindIII/XbaI消化从这一构建体切出插入物，经琼脂糖凝胶纯化，亚克隆入经HindIII/XbaI切割的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(neo) 和 pcDNA3.1(hyg) (均来自Invitrogen)，分别产生pcDNA3.1(neo)-犬TLR9 和 pcDNA3.1(hyg)-犬TLR9。对相应的插入物进行再测序(见下文)。
pcDNA3.1 插入序列犬TLR9 (引物序列以下划线标示，起始/终止密码子以粗体突出显示)
将翻译序列与保存于Genbank的2条犬 TLR9 全长cDNA序列(2011年9月， P1-010709-prot.pro, TLR-9-NM_001002998.pro, TLR-9-AY859723.pro)进行比对。3条犬TLR9多肽序列的比对 (ClustalW; DNAStar)显示在8个位置的多态性。除了一个位置(在我们的序列中为T459，在两条数据库序列中为P459)，我们的TLR9 克隆(P1-010709-prot)中的全部多态性位置均与NM_00102998或AY859723一致。在来自犬淋巴结和脾脏cDNA的4个独立的PCR产物中已确认T459，表明其对应于供体犬的基因型。
因此得出结论，已克隆了正确版本的犬 TLR9。
实施例4
Madine-Darby 犬肾细胞作为NF-κB 活化作用报道细胞
Madine-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞获自ATCC ，其保持于MEM、1x 非必需氨基酸、8%(v/v) iFCS中。测试已用完的生长培养基(spent growth medium) 中分泌型碱性磷酸酶活性的存在是阴性的，这是将该细胞系用于报道基因测定的必要条件。
作为第一步，计划用pNifTy2-SEAP (Invivogen)（含受控于NF-κB结合位点的分泌型碱性磷酸酶 (SEAP) 报道基因和作为选择标记物的博莱霉素(zeocin)抗性基因的质粒）转染MDCK细胞。然而，本发明人的研究表明MDCK细胞大部分对博莱霉素有抗性(高至 mg/ml范围)，因而排除了使用pNifTy2-SEAP。因此，决定利用含NF-κB结合位点和pNifTy2-SEAP的SEAP基因的Swa I/NheI片段替代pcDNA3.1(hyg)中的CMV启动子区和部分多接头 (Nru I/Xba I消化质粒并经琼脂糖凝胶分离大片段)来生成‘pNifTy-hyg-SEAP’。因此，现在可通过向培养基中添加潮霉素（一种对MDCK细胞有效的细胞抑制剂）选择报道基因盒的存在。
用pNifTy-hyg-SEAP转染MDCK细胞，施加选择压力(300 µg/ml 潮霉素)，并通过在选择培养基中的重复继代培养选择抗性系。通过人肿瘤坏死因子 (huTNF-α, NF-κB 途径正确行使功能以及报道基因活化的阳性对照)以及通过选择病原体相关的分子模式(PAMPs, 如大肠杆菌脂多糖 (LPS, TLR4)、聚I/聚C (双链 RNA, TLR3)、胞壁酰二肽(MDP, NOD2)、PAM3CysSK4 (合成的脂肽, TLR1/2)、和R-848 (TLR7的低分子量激动剂)，测试所选的细胞系的SEAP诱导作用。结果如图1和2 (图2 是图1 y-轴的展开)所示。
huTNF-α有效地诱导多克隆MDCK-pNifTy-hyg-SEAP细胞系中SEAP的产生，这是将该细胞系用于报道基因测定的第二个必要条件。将针对5种不同模式识别受体的PAMP投放到(feeding into)NF-κB途径显示出低SEAP诱导作用或无SEAP诱导作用，其表明我们的MDCK-pNifTy-hyg-SEAP细胞系不表达或表达极少拷贝的相应受体，这是将该细胞系用于报道基因测定的第三个必要条件。在dsRNA的情况下观察到最高背景(尽管仍很低)，其后是MDP，而LPS、PAM3CysSK4和R-848实际上未显示出。
这些结果促使发明人进行MDCK-pNifTy-hyg-SEAP细胞系的单细胞克隆，以稳定在多克隆系中所观察到的特性，并以鉴定更佳的克隆。通过在96孔板中有限稀释和随后增殖(expansion)选择出46个克隆，用huTNF-α对其进行刺激以鉴定具有最高NF-κB诱导的SEAP产生能力的克隆(参见图3)。
实施例5
犬、猪和牛TLR9-21融合构建体的生成和亚克隆入表达载体pIRES-puro
利用“PCR-缝合(PCR-sewing)”方案产生编码牛 TLR9胞外结构域和鸡 TLR21胞内结构域的融合构建体。
“PCR-缝合”需要3个步骤(参见图4)：第一，通过PCR向应融合到一个构建体中的DNA片段添加互补序列。第二，在不添加引物的情况下将具有互补序列的两个片段在PCR反应中结合。所述互补序列能使所述片段退火，并通过DNA聚合酶引发延长反应。在第三个PCR步骤中，加入与嵌合分子的5' 和3' 末端退火的引物，以扩增融合分子。
通过PCR从pcDNA3.1(neo)-牛 TLR9构建体(部分1)扩增编码牛TLR9胞外结构域的序列，编码鸡 TLR21的跨膜和胞内结构域的序列从pcDNA3.1(neo)-鸡 TLR21 (序列如下)扩增。通过PCR利用具有5' 突出端的引物(序列如下)将互补序列添加到胞外 (TLR9)片段的3'末端和TLR21片段的5'末端。全部的PCR应用Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche)进行。
pcDNA3.1(neo)-鸡 TLR21 插入序列，起始/终止密码子以粗体突出显示。
用于牛 TLR9 (胞外结构域)的引物：
用于鸡 TLR21 (跨膜和胞内结构域)的引物：
。
将所述融合产物克隆入 pCRII-TOPO (Invitrogen)，对一个 (1个) 克隆进行测序以检测所述序列是否是PCR无错的(PCR error-free)。序列包含一个 (1个) 编码突变，利用Stratagene的Quik Change II XL定点诱变试剂盒和以下引物将其进行了改正：
诱变引物：
所述诱变程序之后，对多个(5个)克隆进行测序以检验定点诱变是否成功，以及是否未引入新的突变。使用正确的克隆，利用引物引入的EcoRI和EcoRV位点将融合构建体再克隆入pIRESpuro3 (Clontech)。对所得载体(pIRESpuro-bovTLR9-21)中的融合构建体再次测序(见下文)。
pIRESpuro-bovTLR9-21 插入序列，(部分) 引物序列以下划线标示，TLR21 (编码)序列以斜体标示，起始/终止密码子以粗体突出显示。
猪TLR9的胞外结构域和鸡TLR21的跨膜和胞内结构域的融合构建体的克隆
应用上述的“PCR-缝合”方案生成编码猪 TLR9的胞外结构域和鸡 TLR21的胞内结构域的融合构建体。
通过PCR从pcDNA3.1(neo)-猪TLR9构建体(实施例 2中所描述的)扩增编码猪TLR9的胞外结构域的序列，以及从pcDNA3.1(neo)-鸡 TLR21(序列如上)扩增编码鸡 TLR21的跨膜和胞内结构域的序列。利用具有5' 突出端的引物 (序列如下)通过PCR将互补序列添加到胞外 (TLR9)片段的3'末端和TLR21片段的5'末端。全部的PCR均使用Expand HighFidelity PCR试剂盒 (Roche)。
用于猪 TLR9 (胞外结构域)的引物：
用于鸡 TLR21 (跨膜和胞内结构域)的引物：
将融合产物克隆入 pCRII-TOPO (Invitrogen)，对一个 (1个) 克隆进行测序，以检查所述序列是否是PCR无错的。这一克隆是正确的，将其用于利用引物引入的EcoRI和NotI位点将将所述融合构建体再克隆入pIRESpuro3 (Clontech)。对pIRESpuro3中的所述融合构建体的5'和3'连接位点进行测序，以检查质粒中所述片段的正确插入。正确的所得载体是pIRESpuro-porTLR9-21 (序列如下)。
pIRESpuro-porTLR9-21 插入序列，(部分) 引物序列以下划线标示，TLR21 (编码)序列以斜体标示，起始/终止密码子以粗体突出显示。
犬的TLR9胞外结构域和鸡 TLR21的跨膜和胞内结构域的融合构建体的克隆
利用上述的“PCR-缝合”方案生成编码犬TLR9胞外结构域和鸡 TLR21的胞内结构域的融合构建体。
通过PCR从pcDNA3.1(neo)-犬 TLR9构建体(实施例3中所描述的) 扩增编码犬TLR9胞外结构域的序列，以及从pcDNA3.1(neo)-鸡 TLR21(序列如上)扩增编码鸡 TLR21的跨膜和胞内结构域的序列。通过PCR利用具有5' 突出端的引物(序列如下)将互补序列添加到胞外 (TLR9)片段的3'末端和TLR21片段的5'末端。全部的PCR均使用Expand HighFidelity PCR试剂盒 (Roche)。
用于犬 TLR9 (胞外结构域)的引物：
用于鸡 TLR21 (跨膜和胞内结构域)的引物：
将融合产物克隆入 pCRII-TOPO (Invitrogen)，并对一个 (1个) 克隆进行测序，以检查所述序列是否是PCR无错的。所述序列包含一个编码突变和一个沉默突变。编码突变利用Quik Change II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)和以下引物进行改正：
诱变引物：
所述诱变程序之后，对多个(8个)克隆进行测序，以检查定点诱变是否已成功。一个克隆包含经改正的核苷酸。将该克隆用于利用引物引入的EcoRI以及存在于pCRII-TOPO中的EcoRI位点将所述融合构建体再克隆入pIRESpuro3 (Clontech)。对所得的载体(pIRESpuro-canTLR9-21)进行完全测序。测序鉴定到两个沉默突变，其不影响氨基酸序列。因此得出结论，这一克隆可用于进一步的应用。
pIRESpuro-canTLR9-21 插入序列，(部分)引物序列以下划线标示，TLR21 (编码)序列以斜体标示，起始/终止密码子以粗体突出显示。
实施例6
用犬 TLR9-21 融合构建体转染MDCK-pNifTyhyg-SEAP
a) 转染和克隆的选择
为了研究MDCK-pNifTyhyg-SEAK-克隆15用于表达和检测TLR9-21 融合构建体的潜力，用pIRES-puro-犬TLR9-21转染这一克隆细胞系。通过用补充有300 µg/ml 潮霉素和8 µg/ml嘌呤霉素的培养基重复传代选择转染子。对所得的多克隆细胞系与标准的寡核苷酸 ODN-2006-PTO的测试显示出SEAP分泌的诱导作用。进行了单细胞克隆，将54个克隆增殖用于与ODN-2006-PTO进行进一步测试(参见下图)。鉴定出许多显示诱导出大量SEAP的克隆。选择了具有最佳信噪比的4个克隆(编号17、23、32和40)进行增殖，并以生成冷冻稳定保藏物。再次测试后，选择克隆编号17进行下一步的实验(参见图5)。
b) MDCK-pNifTyhyg-SEAP-pIRESpuro-canTLR9-21-克隆17：寡核苷酸的刺激活性的测试
实验1：
对一系列的硫代磷酸酯寡核苷酸 (PTO-ODNs、硫代(thio)5-4 直至硫代5-10)以及来自人药物的标准寡核苷酸2006-PTO和2007-PTO进行了测试。
由这一实验可以推定，生成的表达pIRESpuro-canTLR9-21的MDCK-pNifTyhyg细胞系能够通过计算EC50 值定义不同的效力(参见图6)。
可显示出，对具有结构元件如gtcgtc的免疫刺激性 ODNs而言，cg元件的数目是重要的：9>7>6>5>>4>>3 (参见上表)。这一实验也直接地概括出该细胞系对生成结构活性关系(SAR)以及导致免疫刺激性 ODNs优化的潜力。
还显示出从人研究中已知的PTO-ODNs (2006-PTO和2007-PTO)对犬 TLR9-21融合蛋白具有高效力，但就对于犬 TLR9-21融合体而言，本发明人的初始‘致优化(leadoptimization)’的至少一个候选物(硫代5-10)与这些人标准ODNs相比效力相同或效力略微更高。
实验2：
一系列已经证实对鸡TLR21 (融合部分的供体)具有高效力的磷酸二酯寡核苷酸(10 PDE-ODNs)连同来自人药物的标准寡核苷酸2006-PTO对犬 TLR9-21 融合体进行测试(参见图7)。
结果：在测试范围 (500 nM – 3.9 nM) 内，10 个PDE-ODNs均没有显示出任何SEAP诱导活性，而2006-PTO显示~ 4 nM 的EC50，即对这一ODN的预期范围。
解释：ODNs的识别受控于N-末端融合部分 (在这种情况下为犬 TLR9)。由于所测试的ODNs对鸡 TLR21显示出一位数的nM或甚至pM的 EC50，而2006-PTO对该受体(31 nM)比对犬 TLR9-21融合体的效力更弱，所以PDE-ODN识别具有强烈的物种特异性。
实验3：
该实验是对已在文献中用于人和小鼠背景下的PTO-ODNs：1668-PTO、2216-PTO和2395-PTO所进行的。
所有三种PTO-ODNs均对犬 TLR9-21融合体是有活性的，具有两位数nM的EC50值。
然而，关于SEAP生产的最大可达到的刺激(Vmax)，效力次序为：1668 > 2395 >2216 (参见图8)。值得注意的是，相同ODNs对鸡 TLR21的测试显示，2216-PTO是无活性的，1668-PTO 具有~ 1000 nM 的EC50，且只有2395-PTO 具有一定的效力，显示出EC50 为39.4nM。
实验4：
基于已公开的寡核苷酸 1668-PTO、2216-PTO和2395-PTO哪些可能是活性元件形式来尝试进行‘致优化’。在亲本ODN中，这些活性元件以下划线和/或以斜体表示，并然后在mod1/2 ODNs中以重复排列：
基于EC50值证明了所述‘致优化’是成功的。在全部三种情况下，mod1/2 PTO-ODN版本均比它们的亲本 PTO ODN更有效力。此外，在2216-PTO和2395-PTO的情况下，可见Vmax中的明显升高。六个新设计的PTO-ODNs中的五个在范例2006-PTO的活性区域内 (参见图9)。
实验5：
基于可能的活性元件尝试对已公开的寡核苷酸 2007-PTO 进行‘致优化’。
将含cg的元件添加到5'-末端或3'-末端或两者、以及2007-PTO的二聚化并没有导致活性(均关于 EC50 和Vmax)的改进，但也没有导致活性丧失。保持了一位数的纳摩尔活性。在迄今为止的文献中未见报道过列出的ODNs(参见图10)。
实验6：
在此测试在文献中提及的两种PTO-ODNs (ODN-17和ODN-Ling1)。还测试了替代在硫代5-8中的CpG元件的全部(硫代5-8pde2A)和部分(硫代5-8pde2B)硫代磷酸酯键的影响。此外，还对免疫调节元件–ttcgtc-的多聚体进行测试。
文献中已有报道，在CpG元件内的PDE键替代PTO，有时加强PTO-ODNs的刺激活性。利用硫代5-8对这一思路进行了测试。据发明人掌握的情况，PDE修饰的版本对犬 TLR9-21融合体的活性远低于亲本‘仅-PTO’ODN。他们已鉴定出对犬 TLR9-21融合体具有与2006-PTO类似活性的另一种新型PTO-ODN：硫代9-5。此外，证明Ling1-PTO是有效的PTO-ODN (参见图11) 。
实验7：
在此测试了一些已证明当与5'-和3'dG串(runs)组合时对鸡 TLR21具有高活性的PDE 寡核苷酸的PTO版本。然而，所述 PTO版本缺少 5'-和3'dG串(因此，减去G，'mG')。
证明全部测试的ODNs 具有高效力，且 EC50 和Vmax 值与标准PTO-ODN 2006相同或接近 (参见图12)。
实验8：
基于ODNs X4、X43、Z11和CC-X的活性元件(鸡 TLR21)，测试了另一系列的PTO-ODNs 对犬 TLR9-21融合体的效力。
所有的新 PTO-寡核苷酸对犬 TLR9-21具有高刺激活性(在一位数纳摩尔范围内的EC50)和相当的Vmax，在Z11-30-PTO和CC-X-30-PTO 的情况下具有低于2 nM 的EC50s。迄今为止，还没有提及过这些PTO-ODN关于将其用于犬中(参见图13和14)。
实验9：
在该试验中测试了常用的免疫刺激性元件gacgtt 和 gtcgtt的重复对犬 TLR9-21融合体的效力。
在重复元件gacgtt的情况下，实验表明重复数是重要的。五聚体达到了低于2 nM的EC50。一定程度上未得以解释的是，这一新批次2216-PTO的低 EC50。然而，Vmax 值明显低于所有其他测试的ODN (参见图15)。
实验10：
在实验中试验了三联体和四联体元件的重复对犬TLR9-21融合体的效力。
* 由于活性差无法计算EC50 和 Vmax。
明显地，虽然TCG-8是高活性的，但ACG-8没有显示出对犬 TLR9-21融合体的任何刺激。在该研究中详细地研究了PTO-ODN TCGT-6的‘SAR’；用全部其他碱基替代了5'T 然后是3'T。出人意料地，就EC50而言，全部的衍生物均证明具有高活性，没有观察到显著的活性损失。就Vmax而言，观察到CCGT-6效力损失较多，GCGT-6损失较少。仅含G/C的PTO-ODNs在这一测定中仅有微不足道的活性。
这是基于四核苷酸基序的六聚体对canTLR9-21的综合结构活性关系的测定(参见图16和17)。
实验11：
在这一实验中，对免疫调节六聚体和四聚体序列元件的组合对犬 TLR9-21融合体的效力进行测试 (参见图18)。
结论：显示MDCK-pNifTyhyg-SEAP-pIRESpuro-canTLR9-21 是犬 TLR9配体鉴定的独特筛选工具。已鉴定出许多新型活性ODNs。
实施例7
用猪 TLR9-21 融合构建体转染MDCK-pNifTyhyg-SEAP
a) 转染和克隆的选择
用pIRES-puro-猪TLR9-21转染MDCK-pNifTyhyg-SEAK-克隆15。通过用补充有300µg/ml 潮霉素和 8 µg/ml嘌呤霉素的培养基重复传代选择转染子。对所得的多克隆细胞系与标准寡核苷酸 ODN-2006-PTO的测试显示出SEAP分泌的诱导作用。进行了单细胞克隆，并将75个克隆增殖用于与ODN-2006-PTO进行进一步测试。鉴定出许多显示出SEAP诱导作用的克隆。选择了许多具有最佳信噪比的克隆进行增殖，并以生成冷冻稳定保藏物。再次测试后，选择克隆编号20用于进一步的实验(参见图19)。
b) MDCK-pNifTyhyg-SEAP-pIRESpuro-猪 TLR9-21-克隆20：寡核苷酸刺激活性的测试
实验1：
对一系列硫代磷酸酯寡核苷酸 (PTO-ODNs、硫代5-4 直至硫代5-10、硫代9-3以及硫代9-5) 以及来自人药物的标准寡核苷酸2006-PTO进行了测试。
由这一实验可以推定，所生成的表达 pIRESpuro-猪TLR9-21的MDCK-pNifTyhyg细胞系能够通过计算EC50 值定义不同的效力。
显示出对于具有结构元件如gtcgtc的免疫刺激性 ODNs而言，cg元件的数目是重要的： 9~7>6>5>4>3(参见上表)。这一实验也直接地概括出这一细胞系对生成结构活性关系(SAR)以及导致免疫刺激性 ODNs优化的潜力。
还显示出从人研究中已知的2006-PTO对猪 TLR9-21融合蛋白具有高效力。此外，还测试了替代硫代5-8中的CpG元件的全部(硫代5-8pde2A)和部分 (硫代5-8pde2B) 硫代磷酸酯键的影响。据发明人掌握的情况，PDE-修饰的版本对猪 TLR9-21融合体的活性远低于亲本‘仅PTO’ODN。最后，对硫代9-3和硫代9-5（其分别是基序 ttcgtc的三聚体和四聚体）进行了测试(结果，参见图20)。
实验2：
在此测试了一些已证明当与5'-和3'dG串组合时对鸡 TLR21具有高活性的PDE 寡核苷酸的PTO版本。然而，所述 PTO版本缺少 5'-和3'dG串 (因此，减去G，'mG')。
此外，对来自已公开报道中的两种 PTO-ODNs (ODN17和ODN-Ling1) 进行测试。尽管X4- X4-I- 和 X4-II- PTO-衍生物均证实效力上有活性的(potently active)，具有30-50 nM之间的EC50值，但就EC50 和预期的Vmax而言，对鸡 TLR21具有高效力的X4-pent-PDE证实为差的刺激物。有趣的是，尽管ODN-17-PTO (gtcgtt三联体) 具有高于100 nM的 EC50，但 ODN-Ling1-PTO证实与 2006-PTO的活性相当 (参见图21)。
实验3：
在这一实验中，测试了三联体和四联体元件的重复对猪 TLR9-21融合体的效力。
*由于活性差无法计算EC50 和 Vmax。
ACG-8未显示仅对猪 TLR9-21融合体的较小刺激，而TCG-8具有~ 62 nM的EC50。在这一研究中，详细研究了PTO-ODN TCGT-6的‘SAR’；用全部其他碱基替代了5'T 然后是3'T。显示出就EC50而言， TCGT-6 明显是最佳的衍生物，表现甚至优于标准2006-PTO。类似对于canTLR9-21，就Vmax而言，观察到CCGT-6对猪TLR9-21效力损失较多，GCGT-6损失较少。仅含G/C的PTO-ODNs在这一测定中仅有微不足道的活性，GCGC-6 是最佳的。
这是基于四核苷酸基序的六聚物对猪TLR9-21的综合结构活性关系的测定(参见图22和23)。
实验4：
在此基于已公开的寡核苷酸 1668-PTO、2216-PTO和2395-PTO可能有活性的元件形式尝试进行致优化。 在亲本ODN中，这些‘活性元件’以下划线和/或以斜体表示，并随后在mod1/2 ODNs中重复排列：
结果：参见图24、25和26。
实验5：
在该试验中测试了常用的免疫刺激性元件gacgtt 和gtcgtt的重复对猪 TLR9-21融合体的效力。
结果：参见图27。
实验6：
在此基于已公开的寡核苷酸 2007-PTO可能有活性的元件形式尝试进行‘致优化’。
结果：参见图28。
实验7：
基于ODNs X4、X43、Z11和CC-X的活性元件(鸡 TLR21)，测试了另外一系列PTO-ODNs 对猪 TLR9-21融合体的效力。
大部分的新 PTO-寡核苷酸对猪 TLR9-21具有高刺激活性(在一位数纳摩尔范围内的EC50)和相当的Vmax。尤其有效力的似乎是Z11的基序 (ctcgtc) 。迄今为止，还没有在猪的背景中提及这些PTO-ODNs (参见图29和30)。
实验8：
在这一实验中，测试了免疫调节六聚体和四聚体序列元件的组合对猪 TLR9-21融合体的效力。
在这一实验中，多种含gtcgtc-、gtcgtt-、gtcgac- 和tcgt的PTO-ODN 的组合证实对猪 TLR9-21具有类似的两位数纳摩尔效力(参见图31)。
实施例8
实验设计
使用两组每组5只(N=5)3-4个月龄未针对狂犬病进行接种的比格(Beagle)幼犬，其母犬在过去的12个月中未针对狂犬病进行接种。用1 ml各个疫苗组合物接种幼犬。在即将接种前 (T=0)以及接种后T=2、T=4、T=6、T=8、T=12、T=16、T=20 和 T=24周，采集血样，并测定针对狂犬病毒的抗体效价。
组和接种
疫苗
Nobivac® Rabies
制剂 ： 商购的疫苗
呈现形式 ： 10 ml 带塞小瓶(flacons)
供应商 ： Intervet International BV, Boxmeer, 荷兰。
剂量和施用
将幼犬在颈部皮下(s.c.)接种1 ml的Nobivac® Rabies疫苗，并添加有(组2)或未添加(组1) 5 µg硫代-tcg-8-PTO (TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)/ 1 ml。
抗体的诱导
在即将接种前(T=0)和接种后T=2、T=4、T=6、T=8、T=12、T=16、T=20 和 T=24周从每一只幼犬采集血样。允许血样在2-8℃下凝结过夜。离心后，将血清转移到合适的容器中，并在-20℃下储存直至分析。利用快速荧光灶抑制试验 (Rapid Fluorescent FocusInhibition Test，RFFIT)（其为一种病毒中和试验）测定血清中针对狂犬病的抗体效价。
快速荧光灶抑制试验 (RFFIT)
RFFIT 已被国际公认为用于定量狂犬病中和抗体的存在的标准体外试验。将待检测的血清进行连续3-倍稀释，并与等体积的含标准剂量(根据WHO/PHEUR 具有30-300病灶形成单位 (Focus Forming Units，FFU)之间的效价)的狂犬病毒悬液混合。所述血清/病毒混合物在37℃和5% CO2下孵育 90分钟。在预孵育时段后，为使未中和的病毒生长，将易感细胞(BHK细胞)加入所述混合物中，并于37℃和5% CO2 下孵育24小时以形成单细胞层。在孵育和狂犬病毒特异性免疫染色后，通过显微镜观察所述单细胞层的荧光灶(fluorescentfoci)，然后计算效价(以IU/ml计)。
结果：如从图32中可见，在接受Nobivac狂犬病疫苗以及 CpG ODN 硫代-tcg-8-PTO (TCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG)的犬中发现的抗狂犬病毒效价是接受相同狂犬病疫苗而无该CpG ODN的犬中的量的三倍。

Claims (5)

1.用于预防或对抗犬物种中的传染病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫刺激性量的具有通式 [tcg]n的免疫刺激性非甲基化 PTO 寡脱氧核苷酸，其中 n≥6，或与载体或半抗原偶联的所述寡脱氧核苷酸，和/或包含所述寡脱氧核苷酸的载体，免疫量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息、和药学上可接受的载体。
2.权利要求1的疫苗，其特征在于，所述抗原组分或编码抗原组分的遗传信息来源于其野生型形式对犬物种是致病的微生物。
3.权利要求2的疫苗，其特征在于，所述微生物选自人乳头状瘤病毒，引起结核病、白喉、百日咳、破伤风、肺炎或脑膜炎的细菌，麻疹病毒，脊髓灰质炎病毒，乙肝病毒，钩端螺旋体(Leptospira)，Mycobacterium hyopneumomiae，牛呼吸道合胞体病毒，口蹄疫病毒，牛病毒性腹泻病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，犬细小病毒，犬副流感病毒，犬冠状病毒，犬瘟热病毒，犬腺病毒，猪圆环病毒2，牛疱疹病毒，狂犬病毒，猪瘟病毒，马疱疹病毒，猪细小病毒，大肠杆菌(Escherichia coli)，巴斯德氏菌属(Pasteurella)，博德特氏菌属(Bordetella)，伪狂犬病毒，丹毒丝菌属(Erysipelothrix)，副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)，牛副流感病毒，曼氏杆菌属(Mannheimia)，梭杆菌属(Fusobacterium)，胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)，马链球菌(Streptococcus equi)，Chlamidophila，大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)，网尾线虫属(Dictyocaulis)，弓形虫(Toxoplasma gondii)，巴贝虫属(Babesia)，新孢子虫属(Neospora)，贾第虫属(Giardia)，肉孢子虫属(Sarcocystis)和利什曼属(Leishmania)。
4.权利要求2或3的疫苗，其中所述微生物是病毒。
5.权利要求2或3的疫苗，其特征在于，所述微生物选自多杀巴斯德氏菌(P. multocida)、支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)、溶血性曼氏杆菌(M. haemolytica)和犬巴贝虫(B. canis)。
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