TW202330921A - 免疫原性組成物及其用途 - Google Patents

免疫原性組成物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202330921A
TW202330921A TW111145101A TW111145101A TW202330921A TW 202330921 A TW202330921 A TW 202330921A TW 111145101 A TW111145101 A TW 111145101A TW 111145101 A TW111145101 A TW 111145101A TW 202330921 A TW202330921 A TW 202330921A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
immunogen
polyribonucleotide
sequence
sequence encoding
cyclic
Prior art date
Application number
TW111145101A
Other languages
English (en)
Inventor
珍妮佛 Ａ 尼爾森
艾瑞克 保羅 卡特
麥可 多納多 墨菲
Original Assignee
美商旗艦先鋒創新有限責任公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 filed Critical 美商旗艦先鋒創新有限責任公司
Publication of TW202330921A publication Critical patent/TW202330921A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本揭露提供了涉及可用於疫苗的開發和生產的編碼免疫原和多聚化結構域的環狀多核糖核苷酸的組成物、藥物製劑和方法。

Description

免疫原性組成物及其用途
疫苗接種對人類和動物健康都做出了巨大貢獻。自1796年發明第一款疫苗以來，疫苗已被認為是藉由在受試者中激發免疫響應來預防多種傳染病最成功的方法。根據世界衛生組織的資料，免疫接種目前每年預防所有年齡段2-3百萬例死亡。如今，已開發出疫苗來預防和控制包括白喉、破傷風、百日咳、流感和麻疹在內的超過20種傳染病的傳播，並已使得天花被完全根除。然而，仍然需要開發新的和改良的免疫原性組成物及其用途。
本揭露提供了涉及編碼一或多種免疫原（包括多聚化結構域）的環狀多核糖核苷酸的組成物、藥物製劑和方法。本揭露還提供了使用編碼一或多種免疫原（包括多聚化結構域）的環狀多核糖核苷酸之方法。本揭露還提供了環狀多核糖核苷酸，其包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的第一表現序列和編碼佐劑的第二表現序列。本揭露還提供了環狀多核糖核苷酸，其包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的表現序列和刺激先天性免疫系統的非編碼序列。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑在投與後可在受試者中誘導免疫響應。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑可用於治療或預防受試者的疾病、病症或病狀。
在第一方面，本揭露提供了包括開讀框的環狀多核糖核苷酸，該開讀框包括編碼免疫原的序列和編碼多聚化結構域的序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列和編碼多聚化結構域的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列、編碼免疫原的第三序列和編碼多聚化結構域的第四序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼多聚化結構域的第三序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼多聚化結構域的第一序列和編碼免疫原的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼多聚化結構域的第一序列、編碼免疫原的第二序列和編碼多聚化結構域的第三序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼多聚化結構域的第一序列、編碼免疫原的第二序列、編碼多聚化結構域的第三序列和編碼免疫原的第四序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼多聚化結構域的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列。
在一些實施方式中，多聚化結構域或每個多聚化結構域包括T4 foldon結構域。在一些實施方式中，多聚化結構域或每個多聚化結構域包括鐵蛋白結構域。在一些實施方式中，多聚化結構域或每個多聚化結構域包括β環肽。在一些實施方式中，多聚化結構域或每個多聚化結構域包括AaLS肽。在一些實施方式中，多聚化結構域或每個多聚化結構域包括二氧四氫蝶啶合酶結構域。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列和編碼T4 foldon結構域的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列和編碼鐵蛋白結構域的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列和編碼β環肽的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列和編碼AaLS肽的第二序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼T4 foldon結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼T4 foldon結構域的第二序列和編碼鐵蛋白結構域的第三序列。
在一些實施方式中，開讀框包括按5’至3’順序排列的編碼免疫原的第一序列、編碼鐵蛋白結構域的第二序列和編碼T4 foldon結構域的第三序列。
在一些實施方式中，每個免疫原獨立地與分泌訊息序列可操作地連接。
在一些實施方式中，開讀框與IRES可操作地連接。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括與第二IRES可操作地連接的編碼第二多肽的第二開讀框。
在一些實施方式中，第二多肽係多肽免疫原。在一些實施方式中，第二多肽係多肽佐劑。在一些實施方式中，多肽佐劑係細胞介素、趨化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激因子、傳訊分子、轉錄激活因子、細胞介素受體、細菌組分、病毒組分或先天性免疫系統的組分。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括作為先天性免疫系統刺激因子的非編碼核糖核酸序列。在一些實施方式中，先天性免疫系統刺激因子選自富含GU的模體、富含AU的模體、包括dsRNA的結構化區域、或適配體。
在另一方面，本揭露提供了免疫原性組成物，其包括本文所述之環狀多核糖核苷酸和藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，組成物進一步包括第二環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，第二環狀多核糖核苷酸包括編碼免疫原的開讀框。在一些實施方式中，第二環狀多核糖核苷酸包括編碼多肽佐劑的開讀框。在一些實施方式中，第二環狀多核糖核苷酸包括作為先天性免疫系統刺激因子的非編碼核糖核酸序列。
在另一方面，本揭露提供了在受試者中誘導針對免疫原的免疫響應之方法，該方法包括向該受試者投與本文所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物。
在另一方面，本揭露提供了在受試者中治療或預防疾病、病症或障礙之方法，該方法包括向該受試者投與本文所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物。
在一些實施方式中，受試者係人類受試者。
在一些實施方式中，方法進一步包括向該受試者投與佐劑。
在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與多肽免疫原。 定義
本揭露將針對特定實施方式並參考某些附圖進行描述，但是本揭露不限於此，而是僅由申請專利範圍來限定。除非另有說明，否則下文陳述的術語通常應以其共識來理解。
如本文所用，術語「適應性免疫響應」係指體液或細胞介導的免疫響應。為了本揭露之目的，「體液免疫響應」係指由抗體分子介導的免疫響應，而「細胞免疫響應」係由T淋巴球和/或其他白血球介導的免疫響應。
如本文所用，術語「佐劑」係指增加免疫響應，例如增加針對免疫原的特異性免疫響應的組成物（例如，化合物、多肽、核酸或脂質）。增加免疫響應包括強化或擴大抗體和細胞免疫響應中的任一者或兩者的特異性。
如本文所用，術語「載劑」意指促進將組成物（例如，多核糖核苷酸）運輸或遞送到受試者、組織或細胞中的化合物、組成物、試劑或分子。載劑之非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料）、奈米顆粒（例如，封裝或共價連接結合至環狀多核糖核苷酸的奈米顆粒）、脂質體、融合體、離體分化的網狀紅血球、胞泌體、蛋白質載劑（例如，共價連接至多核糖核苷酸的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。
如本文所用，術語「circRNA」、「環狀多核糖核苷酸」、「環狀RNA」和「環狀多核糖核苷酸分子」可互換使用，並意指具有沒有游離末端（即，沒有游離3’和/或5’末端）的結構的多核糖核苷酸分子，例如通過共價鍵（例如，共價閉合的）或非共價鍵形成環狀或環形結構的多核糖核苷酸分子。環狀多核糖核苷酸可為共價閉合的多核糖核苷酸。
如本文所用，術語「環化效率」係所得環狀多核糖核苷酸相對於其非環狀起始材料的測量。
術語「稀釋劑」意指包括本文所述之組成物（例如，包括環狀多核糖核苷酸的組成物）可以稀釋或溶解於其中的非活性溶劑的媒介物。稀釋劑可為RNA增溶劑、緩衝劑、等滲劑或其混合物。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑之非限制性實例包括水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑（諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油（特別是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固體稀釋劑之非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。
如本文所用，術語「疾病」、「病症」和「病狀」各自指亞健康狀態，例如，典型地被或將會被醫療專業人員診斷或治療的狀態。
如本文所用，術語「表位」係指被抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的免疫原的一部分或全部。表位可為線性表位，例如核酸或胺基酸的連續序列。表位可為構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。再如，構象表位包括基於其二級結構或三級結構在免疫原性序列的折疊構象中形成表位的核酸。
如本文所用，術語「表現序列」係編碼產物（例如，肽或多肽（例如，免疫原））的核酸序列或調控核酸。編碼肽或多肽的示例性表現序列可以包括多個核苷酸三聯體，其中每一個都可以編碼胺基酸，並被稱為「密碼子」。
如本文所用，關於多肽或核酸序列（例如，多肽免疫原或編碼多肽免疫原的核酸序列）的術語「片段」係指多肽或核酸序列的連續的、少於全部的部分。例如，多肽免疫原或編碼多肽免疫原的核酸序列的片段，係指序列（如本文揭露的序列）的連續的、少於全部的部分（例如，整個長度的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%）。應理解，本揭露之所有內容考慮了本文揭露的所有免疫原的片段（例如，免疫原性片段）。
如本文所用，術語「GC含量」係指核酸序列中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分比。用於計算GC含量的公式為 (G+C)/(A+G+C+U) × 100%（對於RNA）或 (G+C)/(A+G+C+T) × 100%（對於DNA）。同樣地，術語「尿苷含量」係指核酸序列中尿苷（U）的百分比。用於計算尿苷含量的公式為U/(A+G+C+U) × 100%。同樣地，術語「胸苷含量」係指核酸序列中胸苷（T）的百分比。用於計算胸苷含量的公式為T/(A+G+C+T) × 100%。
如本文所用，術語「先天性免疫系統刺激因子」係指部分地藉由誘導參與先天性免疫的一或多個基因的表現來誘導先天性免疫響應的物質，該等基因包括但不限於I型干擾素（例如，IFNα、INFβ和/或IFNγ）、促炎性細胞介素（例如，IL-1、IL-12、IL-18、TNF-α和/或GM-CSF）、視黃酸誘導型基因-I（RIG-I，也稱為DDX58）、黑色素瘤分化相關基因5（MDA5，也稱為IFIH1）、2'-5'寡腺苷酸合酶1（OAS 1）、OAS樣蛋白（OASL）和/或蛋白激酶R（PKR）。先天性免疫系統刺激因子可充當佐劑（例如當與編碼免疫原的核糖核苷酸組合投與或一起配製時）。先天性免疫系統刺激因子可為單獨的分子實體（例如，不是由多核糖核苷酸編碼或作為序列併入多核糖核苷酸中的），例如STING（例如，caSTING）、TLR3、TLR4、TLR9、TLR7、TLR8、TLR7、RIG-I/DDX58和MDA-5/IFIH1或其組成型活性突變體。先天性免疫系統刺激因子可由多核糖核苷酸編碼（例如，由多核糖核苷酸表現）。多核糖核苷酸可以替代性地或進一步包括充當先天性免疫系統刺激因子的核糖核苷酸序列（例如，富含GU的模體、富含AU的模體、包括dsRNA的結構化區域、或適配體）。
如本文所用，術語「雜質」係存在於組成物（例如如本文所述之藥物組成物）中的不需要的物質。在一些實施方式中，雜質係與製程有關的雜質。在一些實施方式中，雜質係最終組成物中除期望產物之外（例如除如本文所述之活性藥物成分（例如，環狀多核糖核苷酸）之外）的產物相關物質。如本文所用，術語「與製程有關的雜質」係在最終的組成物、製劑或產物中，除本文所述之線性多核糖核苷酸以外，在組成物、製劑或產物的製造中使用、存在或生成的不需要的物質。在一些實施方式中，與製程有關的雜質係在多核糖核苷酸的合成或環化中使用的酶。如本文所用，術語「與產物有關的物質」係在組成物、製劑或產物或其任何中間體的合成過程中產生的物質或副產物。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸片段。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸單體。在一些實施方式中，與產物有關的物質係以下的一或多種：本文所述之多核糖核苷酸的衍生物或片段（例如10、9、8、7、6、5或4個核糖核酸、單核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段）。
如本文所用，術語「免疫原」係指包括被抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的一或多種表位的任何分子或分子結構。特別地，免疫原在受試者中誘導免疫響應（例如，如本文所定義的那樣具有免疫原性）。免疫原能夠在受試者中誘導免疫響應，其中該免疫響應係指當免疫原遇到免疫系統時誘導的一系列分子、細胞和生物事件。免疫響應可為體液和/或細胞免疫響應。該等可以包括抗體的產生以及B細胞和T細胞的擴增。為了確定是否已經發生免疫響應並跟蹤其進程，可以監測免疫受試者針對特定免疫原的免疫響應物的出現。對大多數免疫原的免疫響應誘導特異性抗體和特異性效應T細胞兩者的產生。在一些實施方式中，免疫原係宿主外源的。在一些實施方式中，免疫原不是宿主外源的。免疫原可以包括多肽、多糖、多核苷酸或脂質的全部或一部分。免疫原也可為混合的多肽、多糖、多核苷酸和/或脂質。例如，免疫原可為經翻譯修飾的多肽。「多肽免疫原」係指包括多肽的免疫原。多肽免疫原還可以包括一或多個翻譯後修飾，和/或可以與一或多個其他分子形成複合物，和/或可以呈三級或四級結構，每種結構可以決定或影響多肽的免疫原性。
如本文所用，術語「免疫原性」係指在特定的免疫響應測定中誘導超過預定閾值的對物質的響應的潛力。該測定可為，例如，某些炎性標誌物的表現、抗體的產生或如本文所述之免疫原性的測定。在一些實施方式中，當生物體或某種類型的免疫細胞的免疫系統暴露於免疫原時，可以誘導免疫響應。
可以使用總抗體測定法、確認試驗、抗體的滴定和同種型分析以及中和抗體評估來評價受試者血漿或血清中的抗體，從而評估免疫原性響應。總抗體測定法測量在已經投與了免疫原的受試者的血清或血漿中作為免疫響應的一部分而生成的所有抗體。檢測抗體最常用的試驗係ELISA（酶聯免疫吸附測定），檢測受試血清中與目標抗體結合的抗體，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。可藉由確認測定法進一步評估免疫原性響應。在總抗體評估之後，可以使用確認測定法來確認總抗體測定法的結果。競爭測定法可用於確認抗體與靶標特異性結合，並且篩選測定法中的陽性發現不是試驗血清或檢測試劑與該測定法中其他物質發生非特異性相互作用的結果。
可藉由同種型分析和滴定來評估免疫原性響應。同種型測定可用於僅評估相關抗體的同種型。例如，預期的同種型可為IgM和IgG，它們可以藉由同種型分析和滴定進行特異性檢測和定量，然後與存在的總抗體進行比較。
可以藉由中和抗體測定法（nAb）來評估免疫原性響應。中和抗體測定法（nAb）可用於確定響應於免疫原而產生的抗體是否中和免疫原，從而抑制免疫原對靶標產生作用並導致異常的藥物動力學行為。nAb測定法通常是基於細胞的測定法，其中靶細胞與抗體一起孵育。可以使用多種基於細胞的nAb測定法，包括但不限於細胞增殖、活力、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞毒性（CDC）、細胞病變效應抑制（CPE）、凋亡、配體刺激的細胞傳訊、酶活性、報告基因測定、蛋白質分泌、代謝活性、應激和粒線體功能。檢測讀數包括吸光度、螢光、發光、化學發光或流動式細胞測量術讀數。配體結合測定法還可用於體外測量免疫原和抗體的結合親和力，以評價中和功效。
此外，可以藉由使用從受試者獲得的T細胞上的細胞標誌物測量受試者中的T細胞活化來評估細胞免疫響應的誘導。可以從受試者收集血液樣本、淋巴結生檢樣本或組織樣本，並評價來自樣本的T細胞中的以下一或多種（例如，2、3、4種或更多種）活化標誌物：CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L、CD134、CD69、CD62L或CD44。也可以在體內動物模型中使用相同的方法評估T細胞活化。也可以藉由向體外T細胞（例如，從受試者、動物模型、儲庫或商業來源獲得的T細胞）添加免疫原並測量上述標誌物來進行此測定以評估T細胞活化。可以使用類似方法評估對其他免疫細胞（如嗜酸性球（標誌物：CD35、CD11b、CD66、CD69和CD81））、樹突細胞（標誌物：IL-8、MHC II類、CD40、CD80、CD83和CD86）、嗜鹼性球（CD63、CD13、CD4和CD203c）和嗜中性球（CD11b、CD35、CD66b和CD63）的活化的影響。可以使用流動式細胞測量術、免疫組織化學、原位雜交和其他允許測量細胞標誌物的測定法來評估該等標誌物。免疫原投與前後的比較結果可用於確定其影響。
如本文所用，術語「誘導免疫響應」係指引發、放大或維持受試者的免疫響應。誘導免疫響應可以指適應性免疫響應或先天性免疫響應。免疫響應的誘導可以如上所討論的那樣進行測量。
如本文所用，術語「線性對應物」係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間的任何百分比序列同一性）並且具有兩個游離末端的多核糖核苷酸分子（及其片段）（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））。在一些實施方式中，線性對應物（例如，環化前形式）係與環狀多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間的任何百分比序列同一性）且具有相同或相似的核酸修飾，並且具有兩個游離末端的多核糖核苷酸分子（及其片段）（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））。在一些實施方式中，線性對應物係與環狀多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間的任何百分比序列同一性）且具有不同的核酸修飾或不具有核酸修飾，並且具有兩個游離末端的多核糖核苷酸分子（及其片段）（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））。在一些實施方式中，作為線性對應物的多核糖核苷酸分子的片段係線性對應物多核糖核苷酸分子的比該線性對應物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’帽。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括聚腺苷尾。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括3’ UTR。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’ UTR。
如本文所用，術語「線性RNA」、「線性多核糖核苷酸」和「線性多核糖核苷酸分子」可互換使用並且意指具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中的一個或兩個可為游離末端或者可以與另一部分連接。線性RNA包括尚未經歷環化（例如，環化前）的RNA，並且可以用作起始材料通過例如夾板連接或化學、酶促、核酶或剪接催化的環化方法進行環化。
如本文所用，術語「經修飾的核糖核苷酸」意指具有至少一個針對糖、核鹼基或核苷間鍵的修飾的核苷酸。
如本文所用，術語「多聚化結構域」係指自組裝以形成多聚體（例如，二聚體、三聚體、四聚體或寡聚體）的多肽結構域。在特定實施方式中，多聚化結構域可以與多肽（例如，多肽免疫原）融合。在這樣的情況下，與多聚化結構域的融合導致在表現包括與多聚化結構域共價附接的免疫原的多肽時具有多於一種免疫原的多聚免疫原複合物的形成。
如本文所用，術語「裸遞送」意指在不借助載劑並且不對有助於遞送到細胞的部分進行共價修飾的情況下將配製物遞送至細胞。裸遞送配製物不含任何轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，環狀多核糖核苷酸的裸遞送配製物係包括沒有共價修飾的環狀多核糖核苷酸並且不含載劑的配製物。
如本文所用，術語「帶切口的RNA」和「帶切口的線性多核糖核苷酸」和「帶切口的線性多核糖核苷酸分子」可以互換使用並且意指由於環狀RNA切口或降解而產生的具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，術語「非環狀RNA」意指總的帶切口的RNA和線性RNA。
術語「藥物組成物」旨在還揭露包括在藥物組成物中的環狀多核糖核苷酸可用於藉由療法治療人體或動物體。因此，這意味著等同於「用於在療法中使用的環狀多核糖核苷酸」。
如本文所用，術語「多核苷酸」意指包括一或多個核酸亞基或核苷酸的分子，並且可以與「核酸」或「寡核苷酸」互換使用。多核苷酸可以包括一或多個選自腺苷（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）或其變體的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸（PO 3）基團。核苷酸可以包括核鹼基、五碳糖（核糖或去氧核糖）以及一或多個磷酸基團。核糖核苷酸係其中糖為核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或RNA可以指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個核糖核苷酸的大分子。去氧核糖核苷酸係其中糖係去氧核糖的核苷酸。
「多去氧核糖核苷酸」、「去氧核糖核酸」和「DNA」意指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個去氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可為核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可檢測標籤（如發光標籤）或標誌物（例如，螢光團）的去氧核糖核苷多磷酸，如例如去氧核糖核苷三磷酸（dNTP），其可以選自去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、尿苷三磷酸（dUTP）和去氧胸苷三磷酸（dTTP）dNTP。核苷酸可以包括可以摻入正在生長的核酸股中的任何亞基。此類亞基可為A、C、G、T或U，或對一或多個互補A、C、G、T或U有特異性或與嘌呤（即，A或G或其變體）或嘧啶（即C、T或U或其變體）互補的任何其他亞基。在一些實例中，多核苷酸係去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或其衍生物或變體。在一些情況下，僅舉數例，多核苷酸係短干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、質體DNA（pDNA）、短髮夾RNA（shRNA）、小核RNA（snRNA）、信使RNA（mRNA）、先質mRNA（pre-mRNA）、反義RNA（asRNA），並且涵蓋核苷酸序列及其任何結構實施方式，如單股、雙股、三股、螺旋、髮夾等。在一些情況下，多核苷酸分子係環狀的。多核苷酸可以具有各種長度。核酸分子可以具有至少約10個鹼基、20個鹼基、30個鹼基、40個鹼基、50個鹼基、100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、1千鹼基（kb）、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、50 kb或更大的長度。可以從細胞或組織中分離多核苷酸。如本文所體現的，多核苷酸序列可以包括分離和純化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和合成的DNA/RNA類似物。
多核苷酸（例如多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸）可以包括一或多種核苷酸變體，包括非標準核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸類似物和/或經修飾的核苷酸。經修飾的核苷酸之實例包括但不限於二胺基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷（galactosylqueosine）、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷（mannosylqueosine）、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、懷丁苷（wybutoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二胺基嘌呤等。在一些情況下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修飾，包括對三磷酸酯部分的修飾。這樣的修飾之非限制性實例包括長度更長的磷酸酯鏈（例如，具有4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸酯部分的磷酸酯鏈）和帶有硫醇部分（例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯）的修飾。核酸分子還可在鹼基部分處（例如，在典型地可用於與互補核苷酸形成氫鍵的一或多個原子處和/或在典型地不能與互補核苷酸形成氫鍵的一或多個原子處）、糖部分或磷酸骨架處被修飾。核酸分子還可含有胺修飾的基團，如胺基烯丙基1-dUTP（aa-dUTP）和胺基己基丙烯醯胺-dCTP（aha-dCTP），以允許胺反應性部分（如N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS））的共價附接。本揭露之寡核苷酸中標準DNA鹼基對或RNA鹼基對的替代物可以提供更高的密度（以位元/立方毫米計）、更高的安全性（抗天然毒素的偶然或有目的合成）、更容易辨別光程式性聚合酶（photo-programmed polymerases）或較低的二級結構。在Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A. Nat. Chem. Biol. [自然化學生物學] 2012年7月;8(7):612-4中描述了與用於從頭和/或擴增合成的天然和突變體聚合酶相容的這樣的替代性鹼基對，該文獻出於所有目的藉由援引併入本文。
如本文所用，「多肽」意指最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基（天然或非天然的）的聚合物。如本文所用，該術語係指任何大小、結構或功能的蛋白質、多肽和肽。多肽可以包括基因產物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述物質的片段和其他等同物、變體和類似物。多肽可為單分子或者可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。它們還可以包括單鏈或多鏈多肽（如抗體或胰島素），並且可為締合的或連接的。最常見的二硫鍵存在於多鏈多肽中。術語多肽也可以適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係相應的天然存在的胺基酸的人工化學類似物。
如本文所用，術語「預防」意指降低發展疾病、障礙或病症的可能性，或者可替代地，意指降低隨後發展的疾病或障礙中症狀的嚴重程度或頻率。可以將治療劑投與於相對於一般群體而言發展疾病或障礙的風險增加的受試者，以便預防疾病或病症的發展或減輕疾病或病症的嚴重程度。可以將治療劑作為預防劑投與（例如在疾病或障礙的任何症狀或表現發展之前）。
如本文中可互換使用的，術語「聚A」和「聚A序列」係指至少5個核苷酸長並由腺苷殘基組成的核酸分子的非翻譯連續區域。在一些實施方式中，聚A序列的長度為至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少40個或至少50個核苷酸。在一些實施方式中，聚A序列位於開讀框（例如，編碼多肽的開讀框）的3’（例如，下游），並且該聚A序列位於終止元件（例如，終止密碼子）的3’，使得該聚A不被翻譯。在一些實施方式中，聚A序列位於終止元件的3’並且係3’非翻譯區。
如本文所用，術語「調控元件」係修飾環狀多核糖核苷酸內表現序列的表現的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「複製元件」係可用於複製或者起始環狀多核糖核苷酸轉錄的序列和/或模體。
如本文所用，術語「全身遞送」和「全身投與」意指將藥物組成物或其他物質投與到循環系統（例如血液或淋巴系統）中的途徑。全身投與可以包括口服投與、腸胃外投與、鼻內投與、舌下投與、直腸投與、透皮投與或其任何組合。如本文所用，術語「非全身遞送」或「非全身投與」可以指除藥物組成物或其他物質的全身遞送以外的任何其他投與途徑（例如，所遞送的物質不進入受試者身體的循環系統（例如，血液和淋巴系統））。
如本文所用，術語「序列同一性」係藉由使用全域或局部比對演算法對兩個肽或兩個核苷酸序列進行比對來確定的。當序列（例如，藉由程式GAP或BESTFIT使用預設參數進行最佳比對時）至少具有某個最小百分比的序列同一性時，則可以將它們稱為「基本上相同」或「基本相似」。GAP使用Needleman和Wunsch全域比對演算法在兩個序列的整個長度上對其進行比對，從而最大程度地增加了匹配數目並最大程度地減少了空位數目。通常，使用GAP默認參數，空位產生罰分 = 50（核苷酸）/8（蛋白質），空位延伸罰分 = 3（核苷酸）/2（蛋白質）。對於核苷酸，使用的默認評分矩陣係nwsgapdna.cmp評分矩陣，而對於蛋白質，默認評分矩陣係Blosum62（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS [美國國家科學院院刊] 89, 915-919）。序列比對和百分比序列同一性的評分可以使用電腦程式來確定，諸如可從美國92121-3752加州聖地牙哥斯克蘭頓路9685號的阿賽樂德公司（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA）獲得的GCG Wisconsin套裝軟體10.3版或EmbossWin 2.10.0版（使用程式「needle」）確定。可替代地，或另外，可以藉由使用如FASTA、BLAST等的演算法對數據庫進行搜索來確定同一性百分比。序列同一性係指在序列的整個長度上的序列同一性。
「訊息序列」係指多肽序列（長度例如介於10至45個胺基酸之間），其存在於新生蛋白的多肽序列的N端，將多肽序列靶向分泌途徑。
如本文所用，術語「治療（treat和treating）」係指對受試者的疾病或障礙（例如，傳染疾病、癌症、毒性或過敏反應）的治療性治療。治療的效果可以包括與沒有治療性治療的情況下，該疾病或病症的狀態和/或狀況相比，逆轉、減輕、降低疾病的嚴重程度，治癒疾病，抑制疾病的進展，降低該疾病、或疾病或障礙的一或多種症狀或表現的復發的可能性，穩定（即不惡化）疾病或病症的狀態，和/或預防疾病或病症的傳播。
如本文所用，術語「終止元件」係終止環狀多核糖核苷酸中表現序列的翻譯的部分，諸如核酸序列。
如本文所用，術語「總核糖核苷酸分子」意指藉由核糖核苷酸分子的總質量所測量的任何核糖核苷酸分子的總量，包括線性多核糖核苷酸分子、環狀多核糖核苷酸分子、單體核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其經修飾的變體。
如本文所用，術語「翻譯效率」係從核糖核苷酸轉錄物產生蛋白質或肽的速率或量。在一些實施方式中，翻譯效率可以表示為給定量的編碼蛋白質或肽的轉錄物產生的蛋白質或肽的量（例如在給定的時間段內，例如在給定的翻譯系統，例如體外翻譯系統（像兔網狀紅血球裂解物）或體內翻譯系統（像真核細胞或原核細胞）中）。
如本文所用，術語「翻譯起始序列」係在環狀多核糖核苷酸中起始表現序列的翻譯的核酸序列。
本揭露提供了涉及編碼一或多種免疫原（包括多聚化結構域）的環狀多核糖核苷酸的組成物、藥物製劑和方法。本揭露還提供了使用編碼一或多種免疫原（包括多聚化結構域）的環狀多核糖核苷酸之方法。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑在投與後可在受試者中誘導免疫響應。本文所述之環狀多核糖核苷酸的組成物和藥物製劑可用於治療或預防受試者的疾病、病症或病狀。 環狀多核糖核苷酸
本文所述之環狀多核糖核苷酸可以包括本文所述之任何一或多種元件和編碼免疫原（包括多聚化結構域）的表現序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括如國際專利公開案號WO 2019/118919（特此藉由援引以其全文併入）中揭露的任何特徵或特徵的任何組合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸為至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸為500個核苷酸至20,000個核苷酸、1,000個核苷酸至20,000個核苷酸、2,000個核苷酸至20,000個核苷酸、或5,000個核苷酸至20,000個核苷酸。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸為500個核苷酸至10,000個核苷酸、1,000個核苷酸至10,000個核苷酸、2,000個核苷酸至10,000個核苷酸、或5,000個核苷酸至10,000個核苷酸。 免疫原
本文所述之環狀多核糖核苷酸包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的至少一個表現序列。本文所述之環狀多核糖核苷酸可包括多個表現序列，其中至少一個表現序列編碼免疫原（包括多聚化結構域）。本文所述之環狀多核糖核苷酸可包括兩或更多個（兩個、三個、四個、五個、六個或更多個）表現序列，其中每個表現序列編碼免疫原（包括多聚化結構域）。本文所述之環狀多核糖核苷酸可包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的第一表現序列和編碼佐劑的第二表現序列。本文所述之環狀多核糖核苷酸可包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的表現序列和刺激先天性免疫系統的非編碼序列。
免疫原包括被給定抗體或T細胞受體識別、靶向或結合的一或多個表位。表位可為線性表位，例如核酸或胺基酸的連續序列。表位可為構象表位，例如，含有在蛋白質的折疊構象中形成表位的胺基酸的表位。構象表位可以含有來自一級胺基酸序列的非連續胺基酸。再如，構象表位包括基於其二級結構或三級結構在免疫原性序列的折疊構象中形成表位的核酸。
在一些實施方式中，免疫原包括蛋白質、肽、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、核糖核蛋白、碳水化合物（例如，多糖）、脂質（例如，磷脂或甘油三酸酯）或核酸（例如，DNA、RNA）的全部或一部分。
在其他實施方式中，免疫原包括蛋白質免疫原或表位（例如，來自蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白或核糖核蛋白的肽免疫原或肽表位）。免疫原可以包括胺基酸、糖、脂質、磷醯基或磺醯基或其組合。
在特定實施方式中，免疫原係多肽免疫原。
多肽免疫原可以包括翻譯後修飾，例如糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂化。
在一些實施方式中，免疫原包括表位，該表位包括至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個胺基酸或更多個胺基酸。在一些實施方式中，表位包括或含有至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多21個、至多22個、至多23個、至多24個、至多25個、至多26個、至多27個、至多28個、至多29個或至多30個胺基酸或更少胺基酸。在一些實施方式中，表位包括或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有5個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有6個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有7個胺基酸。在一些實施方式中，表位含有8個胺基酸。在一些實施方式中，表位可為約8至約11個胺基酸。在一些實施方式中，表位可為約9至約22個胺基酸。
免疫原可以包括被B細胞識別的免疫原、被T細胞識別的免疫原或其組合。在一些實施方式中，免疫原包括被B細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原係被B細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原包括被T細胞識別的免疫原。在一些實施方式中，免疫原係被T細胞識別的免疫原。
表位可以包括被B細胞識別的表位，被T細胞識別的表位或其組合。在一些實施方式中，表位包括被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被B細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位包括被T細胞識別的表位。在一些實施方式中，表位係被T細胞識別的表位。
例如，用於經由電腦模擬鑒定免疫原和表位的技術例如在Sanchez-Trincado JL等人, Fundamentals and methods for T-and B-cell epitope prediction[T細胞和B細胞表位預測的基本原理和方法], J. Immunol. Res. [免疫學研究雜誌], 2017:2680160. doi: 10.1155/2017/2680160 (2017)；Grifoni, A等人, A Sequence Homology and Bioinformatic Approach Can Predict Candidate Targets for Immune Responses to SARS-CoV-2[序列同源性和生物信息學方法可以預測SARS-CoV-2免疫響應的候選靶標], Cell Host Microbe [細胞宿主與微生物], 27(4):671-80 (2020)；Russi RC等人, In silico prediction of epitopes recognized by T cells and B cells in PmpD: First step towards to the design of a Chlamydia trachomatis vaccine[PmpD中T細胞和B細胞識別的表位的電腦模擬預測：設計沙眼衣原體疫苗的第一步], Biomedical J. [生物醫學雜誌], 41(2):109-17 (2018)；Baruah V等人, Immunoinformatics‐aided identification of T cell and B cell epitopes in the surface glycoprotein of 2019‐nCoV[免疫資訊學輔助鑒定2019-nCoV表面糖蛋白中的T細胞和B細胞表位], J. Med. Virol. [醫學病毒學雜誌], 92(5), doi: 10.1002/jmv.25698 (2020)中已經揭露；其各自藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，免疫原包括多核苷酸。在一些實施方式中，免疫原係多核苷酸。在一些實施方式中，免疫原包括RNA。在一些實施方式中，免疫原係RNA。在一些實施方式中，免疫原包括DNA。在一些實施方式中，免疫原係DNA。在一些實施方式中，多核苷酸在環狀或線性多核糖核苷酸中編碼。
本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼任何數量的免疫原。在特定實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少25種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種、至少100種、至少120種、至少140種、至少160種、至少180種、至少200種、至少250種、至少300種、至少350種、至少400種、至少450種、至少500種或更多種免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼例如至多1種、至多2種、至多3種、至多4種、至多5種、至多6種、至多7種、至多8種、至多9種、至多10種、至多15種、至多20種、至多25種、至多30種、至多40種、至多50種、至多60種、至多70種、至多80種、至多90種、至多100種、至多120種、至多140種、至多160種、至多180種、至多200種、至多250種、至多300種、至多350種、至多400種、至多450種、至多500種或更少的免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或500種免疫原。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼多種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至100種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至50種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼1至10種免疫原；例如，環狀或線性多核糖核苷酸編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼2種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼3種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼4種免疫原。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼5種免疫原。
在一些實施方式中，該多種免疫原各自鑒別相同的靶標。換個說法，單個靶標可以包括該多種免疫原中的每一種，該多種免疫原中的每一種都可以源自同一靶標，和/或該多種免疫原中的每一種可以與一部分或整個靶標具有高度相似性。例如，靶標可為細胞，並且每種免疫原可以對應於該細胞的蛋白質。例如，靶標可為特定的癌細胞，並且每種免疫原可以對應於與該癌症相關的腫瘤抗原。因此，在一些實施方式中，該多種免疫原中的每一種均源自來自相同靶標的不同蛋白質。
在一些實施方式中，免疫原源自不同靶標。在一些實施方式中，該多種免疫原可以源自給定病毒的各種衣殼蛋白。例如，一種免疫原可以源自正痘病毒（Orthopoxvirus），另一種免疫原可以源自嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus），而第三免疫原可以源自黃病毒（Flavivirus）。例如，多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自黃熱病病毒、屈公病毒、茲卡病毒（Zika）、A型肝炎或B型肝炎。多核糖核苷酸可編碼來自黃熱病病毒、屈公病毒、茲卡病毒、A型肝炎和B型肝炎中的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自日本腦炎（Japanese encephalitis）、屈公病毒、茲卡病毒、A型肝炎或B型肝炎。多核糖核苷酸可編碼來自日本腦炎、屈公病毒、茲卡病毒、A型肝炎或B型肝炎的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自SARS-CoV-2、痘病毒、呼吸道融合細胞病毒或人類乳突狀瘤病毒。多核糖核苷酸可編碼來自SARS-CoV-2、痘病毒、呼吸道融合細胞病毒和人類乳突狀瘤病毒中的每一種的免疫原。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自皰疹病毒（CMV、EBV或VZV）。多核糖核苷酸可編碼來自以下每種皰疹病毒的免疫原：CMV、EBV或VZV。多核糖核苷酸可編碼多種免疫原，其中每種免疫原源自帶狀皰疹病毒（Singles）或西尼羅河病毒（West Nile Virus）。多核糖核苷酸可編碼來自帶狀皰疹病毒和西尼羅河病毒中的每一種的免疫原。
在一些實施方式中，免疫原具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施方式中，免疫原也具有小於100%的序列同一性。這可能指示由於遺傳漂變而彼此相關的免疫原，因此，單個環狀或線性多核糖核苷酸組成物或免疫原性組成物可能能夠誘導針對群體中以各種突變狀態存在的靶標的免疫響應，或者可能誘導針對具有相同免疫原的多個靶標的免疫響應，其中該免疫原與遺傳漂變相關。例如，免疫原可以藉由靶病毒的遺傳漂移而彼此相關。在一些實施方式中，該多種免疫原可以源自來自獨特但相關的病毒的受體結合結構域（RBD）。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸編碼免疫原的變體。變體可為天然存在的變體（例如，在來自不同病毒屬、種、分離株或準種的序列數據中鑒定的變體），或者可為如本文揭露的已經經由電腦模擬生成的衍生序列（例如，與野生型免疫原或表位相比，具有一或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合的免疫原或表位）。
免疫原來自例如病毒，諸如病毒表面蛋白、病毒膜蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣殼蛋白、病毒核衣殼蛋白、病毒刺突蛋白、病毒進入蛋白、病毒膜融合蛋白、病毒結構蛋白、病毒非結構蛋白、病毒調控蛋白、病毒輔助蛋白、分泌型病毒蛋白、病毒聚合酶蛋白、病毒DNA聚合酶、病毒RNA聚合酶、病毒蛋白酶、病毒糖蛋白、病毒融合蛋白、病毒螺旋衣殼蛋白、病毒二十面體衣殼蛋白、病毒基質蛋白、病毒複製酶、病毒轉錄因子或病毒酶。
在一些實施方式中，免疫原來自該等病毒之一： 正黏液病毒（Orthomyxovirus）：有用的免疫原可以來自甲型、乙型或丙型流感病毒，諸如血球凝集素、神經胺酸酶或基質M2蛋白。在免疫原係甲型流感病毒血球凝集素的情況下，它可以來自任何亞型（例如HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hl l、H12、H13、H14、H15或H16）。
副黏液病毒科（ Paramyxoviridae）病毒：病毒免疫原包括但不限於源自肺炎病毒（Pneumovirus）（例如呼吸道融合細胞病毒（RSV））、風疹病毒（Rubulavirus）（例如腮腺炎病毒）、副黏液病毒（例如副流感病毒）、間質肺炎病毒（Metapneumovirus）和麻疹病毒（Morbillivirus）（例如麻疹病毒）、亨尼巴病毒（Henipavirus）（例如尼帕病毒（Nipah virus））。
痘病毒科（Poxviridae）：病毒免疫原包括但不限於源自正痘病毒的那些，正痘病毒例如天花（Variola vera），包括但不限於大天花（Variola major）和小天花（Variola minor）。
微小核糖核酸病毒（Picornavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自微小核糖核酸病毒的那些，微小核糖核酸病毒諸如腸病毒（Enterovirus）、鼻病毒（Rhinovirus）、嗜肝RNA病毒（Heparnavirus）、心臟病毒（Cardiovirus）和口蹄疫病毒（Aphthovirus）。在一個實施方式中，腸病毒係脊髓灰白質病毒（例如1型、2型和/或3型脊髓灰白質病毒）。在另一個實施方式中，腸病毒係EV71腸病毒。在另一個實施方式中，腸病毒係柯薩奇病毒（coxsackie）A或B。
崩芽病毒（Bunyavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自以下的那些：正布尼亞病毒（Orthobunyavirus），諸如加州腦炎病毒（California encephalitis virus）；白蛉病毒（Phlebovirus），諸如裂谷熱病毒（Rift Valley Fever virus）；或內羅病毒（Nairovirus），諸如克裡米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus）。
嗜肝RNA病毒（Heparnavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自嗜肝RNA病毒，諸如A型肝炎病毒（HAV）的那些。
絲狀病毒（Filovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自絲狀病毒的那些，絲狀病毒諸如伊波拉病毒（Ebola virus）（包括薩伊（Zaire）、象牙海岸（Ivory Coast）、雷斯頓（Reston）或蘇丹（Sudan）伊波拉病毒）或瑪律堡病毒（Marburg virus）。
披衣病毒（Togavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自披衣病毒（如風疹病毒（ Rubivirus）、α病毒（Alphavirus）或動脈炎病毒（ Arterivirus））的那些。這包括風疹病毒（rubella virus）。
黃病毒（Flavivirus）：病毒免疫原包括但不限於源自黃病毒的那些，黃病毒諸如蜱傳腦炎（TBE）病毒、登革熱（1、2、3或4型）病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒（Kyasanur Forest Virus）、西尼羅河腦炎病毒（West Nile encephalitis virus）、聖路易斯腦炎病毒（St. Louis encephalitis virus）、俄羅斯春夏腦炎病毒（Russian spring-summer encephalitis virus）、波瓦生腦炎病毒（Powassan encephalitis virus）、茲卡病毒。
瘟病毒（Pestivirus）：病毒免疫原包括但不限於源自瘟病毒的那些，瘟病毒諸如牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、經典豬瘟病毒（CSFV）或邊界病（Border disease）病毒（BDV）。
嗜肝DNA病毒：病毒免疫原包括但不限於源自嗜肝DNA病毒，諸如B型肝炎病毒的那些。B型肝炎病毒免疫原可為B型肝炎病毒表面免疫原（HBsAg）。
其他肝炎病毒：病毒免疫原包括但不限於源自C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒或G型肝炎病毒的那些。
棒狀病毒（Rhabdovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自棒狀病毒，如狂犬病病毒（Lyssavirus）（例如狂犬病毒（Rabies virus））和水皰病毒（Vesiculovirus，VSV）的那些。
杯狀病毒科（Caliciviridae）：病毒免疫原包括但不限於源自杯狀病毒科的那些，杯狀病毒科諸如諾沃克病毒（Norwalk virus）（諾羅病毒（Norovirus））和諾沃克樣病毒（諸如夏威夷病毒（Hawaii Virus）和雪山病毒（Snow Mountain Virus））。
反轉錄病毒（Retrovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自致癌病毒（Oncovirus）、慢病毒（Lentivirus）（例如HIV-1或HIV-2）或泡沫病毒（Spumavirus）的那些。
里奧病毒（Reovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自正里奧病毒（Orthoreovirus）、輪狀病毒（Rotavirus）、環狀病毒（Orbivirus）或科蜱病毒（Coltivirus）的那些。
微小病毒（Parvovirus）：病毒免疫原包括但不限於源自微小病毒B19的那些。
波卡病毒（Bocavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自波卡病毒的那些。
皰疹病毒（Herpesvirus）：病毒免疫原包括但不限於源自人皰疹病毒的那些，僅舉例而言，人皰疹病毒如單純皰疹病毒（HSV）（例如HSV 1型和2型）、水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、艾司坦-巴爾病毒（EBV）、巨細胞病毒（CMV）、人皰疹病毒6（HHV6）、人皰疹病毒7（HHV7）和人皰疹病毒8（HHV8）。
乳多泡病毒（Papovavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自乳頭瘤病毒（Papillomavirus）和多瘤病毒（Polyomavirus）的那些。（人）乳頭瘤病毒可為血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65（例如來自血清型6、11、16和/或18中的一或多種）。
正漢坦病毒（Orthohantavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自漢坦病毒（hantavirus）的那些。
沙粒病毒（Arenavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自瓜納瑞托病毒（Guanarito virus）、Junin病毒（Junin virus）、賴薩病毒（Lassa virus）、盧約病毒（Lujo virus）、馬丘波病毒（Machupo virus）、薩比亞病毒（Sabia virus）或白水河病毒（Whitewater Arroyo virus）的那些。
腺病毒（Adenovirus）：病毒免疫原包括源自腺病毒血清型36（Ad-36）的那些。
社區獲得性呼吸道病毒：病毒免疫原包括源自社區獲得性呼吸道病毒的那些。
冠狀病毒（Coronavirus）：病毒免疫原包括但不限於源自SARS冠狀病毒（例如，SARS-CoV-1和SARS-CoV-2）、MERS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎（IBV）、小鼠肝炎病毒（MHV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的那些。冠狀病毒免疫原可為刺突多肽或係刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）。冠狀病毒免疫原也可為包膜多肽、膜多肽或核衣殼多肽。
在一些實施方式中，免疫原來自感染魚類的病毒。在一些實施方式中，免疫原引發針對感染魚類的病毒的免疫響應。例如，感染魚類的病毒選自傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）、鮭魚胰臟疾病病毒（SPDV）、感染性胰臟壞死病毒（IPNV）、斑點叉尾鮰病毒（CCV）、魚淋巴囊腫病病毒（FLDV）、傳染性造血組織壞死症病毒（IHNV）、錦鯉皰疹病毒、鮭魚小核糖核酸樣病毒（也稱為大西洋鮭小核糖核酸樣病毒）、陸封鮭病毒（LSV）、大西洋鮭輪狀病毒（ASR）、鱒魚草莓病病毒（TSD）、銀鮭致癌病毒（CSTV）或病毒性出血性敗血症病毒（VHSV）。
在一些實施方式中，免疫原來自宿主受試者細胞。例如，可以藉由使用來自病毒用作進入因子的宿主細胞組分的免疫原或表位來產生阻斷病毒進入的抗體。
免疫原來自例如細菌，諸如細菌表面蛋白、細菌膜蛋白、細菌包膜蛋白、細菌內膜蛋白、細菌外膜蛋白、細菌周質蛋白、細菌進入蛋白、細菌膜融合蛋白、細菌結構蛋白、細菌非結構蛋白、分泌型細菌蛋白、細菌聚合酶蛋白、細菌DNA聚合酶、細菌RNA聚合酶、細菌蛋白酶、細菌糖蛋白、細菌轉錄因子、細菌酶或細菌毒素。
在一些實施方式中，免疫原引發來自該等細菌之一的免疫響應：無乳鏈球菌（ Streptococcus agalactiae）（也稱為B族鏈球菌或GBS）；釀膿鏈球菌（ Streptococcus pyogenes）（也稱為A族鏈球菌（GAS））；金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）；耐二甲苯青黴素金黃色葡萄球菌（MRSA）；表皮葡萄球菌（ Staphylococcus epidermis）；梅毒螺旋體（ Treponema pallidum）；土倫病法蘭西斯桿菌（ Francisella tularensis）；立克次氏體物種（Rickettsia species）；鼠疫耶氏桿菌（ Yersinia pestis）；腦膜炎雙球菌（ Neisseria meningitidis）：免疫原包括但不限於膜蛋白，諸如黏附素、自主轉運蛋白、毒素、鐵獲取蛋白和因子H結合蛋白；肺炎鏈球菌（ Streptococcus pneumoniae）；卡他莫拉菌（ Moraxella catarrhalis）；百日咳博多氏桿菌（ Bordetella pertussis）：免疫原包括但不限於百日咳毒素或類毒素（PT）、絲狀血球凝集素（FHA）、百日咳桿菌黏附素及凝集原2和3；破傷風梭菌（Clostridium tetani）：典型的免疫原係破傷風類毒素；白喉棒狀桿菌（ Cornynebacterium diphtheriae）：典型的免疫原係白喉類毒素；流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）；綠膿桿菌（ Pseudomonas aeruginosa）；沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）；肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae）；幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）；大腸桿菌（Escherichia coli）（免疫原包括但不限於源自產腸毒素的大腸桿菌（ETEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）、彌漫性黏附大腸桿菌（DAEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）和/或腸出血性大腸桿菌（EHEC）的免疫原）。ExPEC菌株包括尿道致病性大腸桿菌（UPEC）和腦膜炎/敗血症相關大腸桿菌（MNEC）。還包括炭疽桿菌（ Bacillus anthracis）；產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens）或肉毒梭狀芽孢桿菌（ Clostridium botulinums）；退伍軍人症嗜肺桿菌（ Legionella pneumophila）；伯納特柯克斯體（ Coxiella burnetiid）；布氏桿菌屬（ Brucella）的種，諸如流產布氏桿菌（ B. abortus）、犬布氏桿菌（ B. canis）、羊布氏桿菌（ B. melitensis）、木鼠布氏桿菌（ B. neotomae）、綿羊布氏桿菌（ B. ovis）、豬布氏桿菌（ B. suis）和鰭型布氏桿菌（ B. pinnipediae）。法蘭西斯桿菌屬（ Francisella）的種，諸如新兇手法蘭西斯桿菌（ F. novicida）、哲氏法蘭西斯桿菌（ F. philomiragia）和土倫病法蘭西斯桿菌（ F. tularensis）；淋病雙球菌（ Neisseria gonorrhoeae）；杜克雷嗜血桿菌（ Haemophilus ducreyi）；糞腸球菌（ Enterococcus faecalis）或屎腸球菌（ Enterococcus faecium）；腐生葡萄球菌（ Staphylococcus saprophyticus）；小腸結腸炎耶氏桿菌（ Yersinia enterocolitica）；結核分枝桿菌（ Mycobacterium tuberculosis）；單核細胞增多性李斯特氏菌（ Listeria monocytogenes）；霍亂弧菌（ Vibrio cholerae）；傷寒沙門氏菌（ Salmonella typhi）；博氏疏螺旋體（ Borrelia burgdorferi）；牙齦卟啉單胞菌（ Porphyromonas gingivalis）；和克雷白桿菌屬（Klebsiella）的種。
免疫原來自例如真菌，諸如真菌表面蛋白、真菌膜蛋白、真菌包膜蛋白、真菌內膜蛋白、真菌外膜蛋白、真菌周質蛋白、真菌進入蛋白、真菌膜融合蛋白、真菌結構蛋白、真菌非結構蛋白、分泌型真菌蛋白、真菌聚合酶蛋白、真菌DNA聚合酶、真菌RNA聚合酶、真菌蛋白酶、真菌糖蛋白、真菌轉錄因子、真菌酶或真菌毒素。
在一些實施方式中，真菌免疫原源自皮癬菌（Dermatophyte），包括：絮狀表皮癬菌（ Epidermophyton floccusum）、頭癬小孢黴（ Microsporum audouini）、犬小孢黴（ Microsporum canis）、畸變小孢黴（ Microsporum distortum）、馬小孢黴（ Microsporum equinum）、石膏樣小孢黴（ Microsporum gypsum）、奈米小孢黴（ Microsporum nanum）、疊瓦毛癬菌（ Trichophyton concentricum）、馬毛癬菌（ Trichophyton equinum）、雞毛癬菌（ Trichophyton gallinae）、石膏樣毛癬菌（ Trichophyton gypseum）、麥格尼毛癬菌（ Trichophyton megnini）、鬚毛癬菌（ Trichophyton mentagrophytes）、昆克努發癬菌（ Trichophyton quinckeanum）、紅色毛癬菌（ Trichophyton rubrum）、許蘭毛癬菌（ Trichophyton schoenleini）、斷髮毛癬菌（ Trichophyton tonsurans）、疣狀毛癬菌（ Trichophyton verrucosum）、疣狀毛癬菌白色變種（ T. verrucosum var. album）、盤狀變種（ var. discoides）、赫色變種（ var. ochraceum）、紫色毛癬菌（ Trichophyton violaceum）和/或蜜塊狀毛癬菌（ Trichophyton faviforme）；或來自於薰煙色麴菌（ Aspergillus fumigatus）、黃麴菌（ Aspergillus flavus）、黑麴菌（ Aspergillus niger）、小巢狀麴菌（ Aspergillus nidulans）、土麴菌（ Aspergillus terreus）、薩氏麴菌（ Aspergillus sydowi）、黃麴菌（ Aspergillus flavatus）、灰綠麴菌（ Aspergillus glaucus）、芽生裂殖菌（ Blastoschizomyces capitatus）、白色念珠菌（ Candida albicans）、烯醇化酶念珠菌（ Candida enolase）、熱帶念珠菌（ Candida tropicalis）、光滑念珠菌（ Candida glabrata）、克魯斯念珠菌（ Candida krusei）、近平滑念珠菌（ Candida parapsilosis）、類星形念珠菌（ Candida stellatoidea）、克魯斯念珠菌（ Candida kusei）、帕拉克斯念珠菌（ Candida parakwsei）、葡萄牙念珠菌（ Candida lusitaniae）、偽熱帶念珠菌（ Candida pseudotropicalis）、季也蒙念珠菌（ Candida guilliermondi）、卡氏枝孢黴（ Cladosporium carrionii）、粗球孢子菌（ Coccidioides immitis）、皮炎芽生菌（ Blastomyces dermatidis）、新型隱球菌（ Cryptococcus neoformans）、棒地黴（ Geotrichum clavatum）、莢膜組織胞漿菌（ Histoplasma capsulatum）、克留氏肺炎桿菌（ Klebsiella pneumoniae）、微孢子目（ Microsporidia）、腦胞內原蟲屬種（Encephalitozoon spp.）、腸間隔微孢子蟲（Septata intestinalis）和畢氏腸微孢子蟲（ Enterocytozoon bieneusi）；不太常見的係小孢子蟲屬種（ Brachiola spp）、微孢子蟲屬種（ Microsporidium spp.）、微粒子蟲屬種（ Nosema spp.）、新管小孢子蟲屬種（ Pleistophora spp.）、氣管普孢蟲屬種（ Trachipleistophora spp.）、條孢蟲屬種（ Vittaforma spp ）、巴西副球孢子菌（ Paracoccidioides brasiliensis）、肺胞囊蟲（ Pneumocystis carinii）、隱襲腐黴（ Pythiumn insidiosum）、橢圓形皮屑芽孢菌（ Pityrosporum ovale）、釀酒酵母（ Sacharomyces cerevisae）、布拉氏酵母（ Saccharomyces boulardii）、粟酒裂殖酵母（ Saccharomyces pombe）、尖端賽多孢子菌（ Scedosporium apiosperum）、申克孢子絲菌（ Sporothrix schenckii）、白吉利毛孢子菌（ Trichosporon beigelii）、弓蟲（ Toxoplasma gondii）、瑪律尼菲青黴（ Penicillium marneffei）、馬爾尼菲青黴屬種（ Malassezia spp.）、芳沙加菌屬種（ Fonsecaea spp.）、萬氏黴菌屬種（ Wangiella spp.）、孢子絲菌屬種（ Sporothrix spp.）、蛙糞黴屬種（ Basidiobolus spp.）、耳黴屬種（ Conidiobolus spp.）、酒麴菌屬種（ Rhizopus spp）、毛黴菌屬種（ Mucor spp）、犁頭黴屬種（ Absidia spp）、被孢黴屬種（ Mortierella spp）、小克銀漢黴屬種（ Cunninghamella spp）、瓶黴屬種（ Saksenaea spp.）、鏈格孢屬種（ Alternaria spp）、彎孢黴屬種（ Curvularia spp）、長蠕孢屬種（ Helminthosporium spp）、鐮刀菌屬種（ Fusarium spp）、麴菌屬種（ Aspergillus spp）、青黴屬種（ Penicillium spp）、鏈核盤菌屬種（ Monolinia spp）、絲核菌屬種（ Rhizoctonia spp）、擬青黴屬種（ Paecilomyces spp）、皮司黴屬種（ Pithomyces spp）和分枝孢子菌屬種（ Cladosporium spp）。
免疫原來自例如真核寄生蟲表面蛋白、真核寄生蟲膜蛋白、真核寄生蟲包膜蛋白、真核寄生蟲進入蛋白、真核寄生蟲膜融合蛋白、真核寄生蟲結構蛋白、真核寄生蟲非結構蛋白、分泌型真核寄生蟲蛋白、真核寄生蟲聚合酶蛋白、真核寄生蟲DNA聚合酶、真核寄生蟲RNA聚合酶、真核寄生蟲蛋白酶、真核寄生蟲糖蛋白、真核寄生蟲轉錄因子、真核寄生蟲酶或真核寄生蟲毒素。
在一些實施方式中，免疫原引發針對來自瘧原蟲屬（Plasmodium）的寄生蟲諸如惡性瘧原蟲（ P. falciparum）、間日瘧原蟲（ P. vivax）、三日瘧原蟲（ P. malariae）或卵形瘧原蟲（ P. ovale）的免疫響應。在一些實施方式中，免疫原引發針對來自魚虱科（Caligidae）的寄生蟲，特別是來自瘡痂魚虱屬（Lepeophtheirus）和魚虱屬（Caligus）屬的那些寄生蟲（例如海虱，如鮭瘡痂魚虱（ Lepeophtheirus salmonis）或大馬哈魚虱（ Caligus rogercresseyi））的免疫響應。在一些實施方式中，免疫原引發針對寄生蟲弓蟲的免疫響應。
在一些實施方式中，免疫原係癌症免疫原（例如，新表位）。例如，免疫原係與以下相關的新抗原和/或新表位：急性白血病、星形細胞瘤、膽道癌（膽管癌）、骨癌、乳癌、腦幹神經膠質瘤、細支氣管肺泡細胞肺癌、腎上腺癌、肛區癌、膀胱癌、內分泌系統癌、食道癌、頭或頸癌、腎癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、小腸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、尿道癌、子子宮頸癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、腎盂癌、陰道癌、外陰癌、子宮頸癌、慢性白血病、結腸癌、結直腸癌、皮膚黑色素瘤、室管膜瘤、表皮樣腫瘤、尤因氏肉瘤（Ewings sarcoma）、胃癌、成膠質細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、血液系統惡性腫瘤、肝細胞癌（肝癌）、肝細胞瘤，霍奇金病（Hodgkin's Disease）、眼內黑色素瘤、Kaposi氏肉瘤（Kaposi sarcoma）、肺癌、淋巴瘤、成神經管細胞瘤（medulloblastoma）、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、肌肉癌、中樞神經系統（CNS）贅生物、神經元癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、小兒惡性腫瘤、垂體腺瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、軟組織肉瘤、神經鞘瘤、皮膚癌、脊柱腫瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、子宮癌或腫瘤及其轉移癌，包括上述任何癌症的難治性形式或其任何組合。
在一些實施方式中，免疫原係選自以下的腫瘤抗原：(a) 睪丸癌抗原，諸如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族的多肽，例如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12（該等可用於例如處理黑色素瘤、肺部、頭頸、NSCLC、乳腺、胃腸道和膀胱腫瘤；(b) 突變的抗原，例如p53（與各種實性瘤（例如結直腸癌、肺癌、頭頸癌）相關）、p21/Ras（與例如黑色素瘤、胰臟癌和結直腸癌相關）、CDK4（與例如黑色素瘤相關）、MUMl（與例如黑色素瘤相關）、凋亡蛋白酶-8（與例如頭頸癌相關）、CIA 0205（與例如膀胱癌相關）、HLA-A2-R1701、β連環蛋白（與例如黑色素瘤相關）、TCR（與例如T細胞非霍奇金淋巴瘤相關）、BCR-abl（與例如慢性髓細胞性白血病相關）、磷酸丙糖異構酶、KIA 0205、CDC-27和LDLR-FUT；(c) 過表現的抗原，例如半乳凝素4（與例如結直腸癌相關）、半乳凝素9（與例如霍奇金病相關）、蛋白酶3（與例如慢性髓細胞性白血病相關）、WT 1（與例如各種白血病相關）、碳酸酐酶（與例如腎癌相關）、醛縮酶A（與例如肺癌相關）、PRAME（與例如黑色素瘤相關）、HER-2/neu（與例如乳癌、結腸癌、肺癌和卵巢癌相關）、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白（與例如肝細胞瘤相關）、KSA（與例如結直腸癌相關）、胃泌素（與例如胰臟癌和胃癌相關）、端粒酶催化蛋白、MUC-1（與例如乳癌和卵巢癌相關）、G-250（與例如腎細胞癌相關）、p53（與例如乳癌、結腸癌相關）和癌胚抗原（與例如乳癌、肺癌和胃腸道癌如結直腸癌相關）；(d) 共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素細胞分化抗原，諸如MART-l/黑色素A、gplOO、MC1R、促黑色素細胞激素受體（melanocyte-stimulating hormone receptor）、酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白-1/TRPl和酪胺酸酶相關蛋白-2/TRP2（與例如黑色素瘤相關）；(e) 前列腺相關抗原，如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2（與例如前列腺癌相關）；(f) 免疫球蛋白獨特型（例如，與骨髓瘤和B細胞淋巴瘤相關）；(g) 新抗原。在某些實施方式中，腫瘤免疫原包括但不限於pi 5、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、愛潑斯坦巴爾病毒抗原、EBNA、人類乳突狀瘤病毒（HPV）抗原（包括E6和E7）、B型肝炎和C型肝炎病毒抗原、人T細胞淋巴病毒抗原、TSP-180、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、mn-23Hl、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、pl6、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3 (CA 27.29YBCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90（Mac-2結合蛋白親環蛋白C相關蛋白）、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
在一些實施方式中，免疫原引發針對以下物質的免疫響應：花粉過敏原（樹木、草本植物、野草和禾木科植物花粉過敏原）；昆蟲或蜘蛛綱過敏原（吸入物、唾液和毒液過敏原，例如蟎過敏原、蟑螂和糠蚊過敏原、膜翅目毒液過敏原）；動物毛髮和頭皮屑過敏原（來自於例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等）；以及食物過敏原（例如麥醇溶蛋白）。來自樹木、禾本科植物和草本植物的重要花粉過敏原係源於以下的此類過敏原：分類的殼斗目（Fagales）、木犀目（Oleales）、松目（Pinales）和懸鈴木科（ platanaceae），包括但不限於樺樹（樺屬（ Betula））、榿木（榿木屬（ Alnus））、榛樹（榛屬（ Corylus））、角樹（鵝耳櫪屬（ Carpinus））和橄欖（洋橄欖屬（ Olea））、雪松（柳杉屬（ Cryptomeria）和檜屬（ Juniperus））、法國梧桐（懸鈴木屬（ Platanus））；禾本目（Poales），包括黑麥草屬（ Lolium）、梯牧草屬（ Phleum）、早熟禾屬（ Poa）、狗牙根屬（ Cynodon）、鴨茅屬（ Dactylis）、絨毛草屬（ Holcus）、虉草屬（ Phalaris）、黑麥屬（ Secale）和高粱屬（ Sorghum）的禾本科植物；菊目（ Asterales）和蕁麻目（ Urticales），包括豬草屬（ Ambrosia）、蒿屬（ Artemisia）和牆草屬（ Parietaria）的草本植物。其他重要的吸入性過敏原係來自塵蟎屬（ Dermatophagoides）和嗜黴蟎屬（ Euroglyphus）的屋塵蟎、貯藏蟎（例如嗜鱗蟎屬（ Lepidoglyphys）、食甜蟎屬（ Glycyphagus）和食酪蟎屬（ Tyrophagus））的那些過敏原；來自蟑螂、糠蚊和跳蚤，例如如小蠊屬（ Blatella）、大蠊屬（ Periplaneta）、搖蚊屬（ Chironomus）和蚤屬（ Ctenocepphalides）的那些過敏原；以及來自哺乳動物諸如貓、狗和馬的那些過敏原；毒液過敏原，包括源於叮或咬的昆蟲的此類過敏原，該等昆蟲諸如來自分類的膜翅目的那些，包括蜜蜂（蜜蜂科（ Apidae））、黃蜂（胡蜂科（ Vespidea））和螞蟻（蟻科（ Formicoidae））。
在一些實施方式中，免疫原源自例如毒液中的毒素，如來自以下的毒液：蛇（例如，大多數響尾蛇的種（例如，東菱斑響尾蛇）、褐蛇的種（例如，褐蛇王和東部褐蛇）、勒塞耳氏奎蛇（russel’s viper）、眼鏡蛇（例如，印度眼鏡蛇、眼鏡王蛇）、蝙蝠蛇的某些種（例如，普通蝙蝠蛇）、樹眼鏡蛇（例如，黑色樹眼鏡蛇）、鋸鱗蝰、南非樹蛇、杜布瓦海蛇、太攀蛇的種（例如，海岸太攀蛇和內陸太攀蛇）、銳蝮蛇的種（例如矛頭蛇和三色矛頭蝮）、巨蝮、銅頭蛇、食魚蝮、珊瑚蛇、死亡蛇、貝爾徹海蛇（Belcher’s sea snake）、虎蛇、澳大利亞黑蛇）、蜘蛛（例如，褐皮花蛛、黑寡婦毒蛛、巴西流浪蜘蛛、漏斗網蜘蛛、紐扣蜘蛛、澳大利亞赤背蜘蛛、卡提波蜘蛛、假黑寡婦蜘蛛、智利隱士蜘蛛、鼠蜘、粒突蛛屬（ Macrothele）的種、竹蟶屬（ Sicarius）的種、眼球突出型（ Exophthalmic）的種、狼蛛（ tarantulas）的某些種）、蠍子和其他蛛形綱動物（例如，肥尾蠍、以色列金蠍（deathstalker scorpion）、印度紅蠍、刺尾蠍屬（ Centruroides）的種、鉗蠍屬（ Tityus）的種，如巴西黃蠍）、昆蟲（例如，蜜蜂的種、黃蜂的種、某些螞蟻（如火蟻）、一些鱗翅目毛蟲的種、某些蜈蚣（ centipede）的種、槳足蟲圖倫冥府蝦（ remipede Xibalbanus tulumensis））、魚類（例如某些鯰魚的種（例如，條紋鰻鯰和其他鰻鯰）、某些黃貂魚的種（例如，藍斑黃貂魚）、蓑鮋、石魚、蠍子魚、蟾魚、鯖帶魚、虎鮋、帆鰭鮋（cockatoo waspfish）、斑馬鳚（striped blenny）、瞻星魚（stargazer）、銀鮫（chimaera）、鱸魚（weever）、狗鯊（dogfish shark））、刺胞動物（例如水母的某些種（例如伊魯康吉水母（Irukanjdi jellyfish）和箱型水母（box jellyfish））、水螅蟲類（例如，葡萄牙戰艦（Portuguese Man o’War））、海葵、珊瑚的某些種）、蜥蜴（例如，吉拉毒蜥、墨西哥須蜥、巨蜥屬（Varanus）的某些種（例如，科莫多巨蜥（Komodo dragon））、眼斑巨蜥和樹巨蜥）、哺乳動物（例如，南部短尾鼩、鴨嘴獸、歐鼴鼠、歐亞水鼩、地中海水鼩、北部短尾鼩、埃利奧特短尾鼩（Elliot’s short-tailed shrew）、溝齒鼩的某些種（例如古巴溝齒鼩（Cuban solenodon）、海地溝齒鼩（Hispaniolan solenodon））、懶猴（slow loiris））、軟體動物（例如，芋螺的某些種）、頭足類動物（例如，章魚的某些種（例如，藍圈章魚）、魷魚和烏賊）、兩棲動物（例如，青蛙，如箭毒蛙、布魯諾盔頭蛙（Bruno’s casque-headed frog）、綠蛙（Greening’s frog）、蠑螈（例如火蠑螈、伊比利亞有肋蠑螈（Iberian ribbed newt）））。
在一些實施方式中，毒素來自植物或真菌（例如蘑菇）。
在一些實施方式中，毒素免疫原源自毒素，如藍藻毒素（cyanotoxin）、二甲毒素（dinotoxin）、肌肉毒素、細胞毒素（例如，蓖麻毒蛋白、蜂毒（apitoxin）、黴菌毒素（mycotoxin）（例如，黃麴毒素（aflatoxin））、赭麴毒素（ochratoxin）、橘黴素（citrinin）、麥角生物鹼、棒麴毒素（patulin）、梭菌（fusarium）毒素、伏馬菌素（fumonisin）、新月毒素（trichothecene）、心臟毒素（cardiotoxin））、河豚毒素（tetrodotoxin）、箭毒蛙毒素（batrachotoxin）、肉毒桿菌毒素A、破傷風毒素A、白喉毒素、二噁英（dioxin）、毒蕈鹼、蟾蜍毒素（bufortoxin）、沙林（sarin）、溶血毒素（hemotoxin）、光毒素（phototoxin）、壞死毒素（necrotoxin）、腎毒素（nephrotoxin）和神經毒素（neurotoxin）（例如，鈣蛇毒（calciseptine）、眼鏡蛇毒蛋白（cobrotoxin）、鈣阻蛋白（calcicludine）、筒箭毒-I（fasciculin-I）、鈣利毒素（calliotoxin））。
來自多種微生物或癌症的免疫原可以用於環狀或線性多核糖核苷酸中。在一些情況下，免疫原與以上揭露的一種微生物相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原與以上揭露的兩或更多種微生物相關或由其表現。在一些情況下，免疫原與以上揭露的一種癌症相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原與以上揭露的兩或更多種癌症相關或由其表現。在一些實施方式中，免疫原源自如以上揭露的毒素。在一些實施方式中，免疫原來自以上揭露的兩或更多種毒素。
這兩或更多種微生物係有關的或無關的。在一些情況下，兩種或多種微生物在系統發育上有關。例如，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼來自兩或更多種病毒、病毒科的兩或更多個成員、病毒綱的兩或更多個成員、病毒目的兩或更多個成員、病毒屬的兩或更多個成員、病毒種的兩或更多個成員、兩或更多種細菌病原體的免疫原。在一些實施方式中，兩種或多種微生物在系統發育上無關。
在一些情況下，兩種或多種微生物在表現上有關。例如，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸包括或編碼來自兩或更多種呼吸道病原體、兩或更多種選擇劑、兩或更多種與嚴重疾病相關的微生物、兩或更多種與免疫受損受試者中的不良結果相關的微生物、兩或更多種與和妊娠有關的不良後果相關的微生物、兩種或多種與出血熱相關的微生物的免疫原。
本揭露之免疫原可以包括野生型序列。當描述免疫原時，術語「野生型」係指天然存在的且由基因組（例如，病毒基因組）編碼的序列（例如，核酸序列或胺基酸序列）。一個物種（例如，微生物物種）可以具有一個野生型序列，或者具有兩或更多個野生型序列（例如，在參考微生物基因組中存在一個規範的野生型序列，並且存在由突變產生的其他變體的野生型序列）。
當描述免疫原時，術語「衍生物」和「源自」係指與野生型序列的不同之處在於一或多個核酸或胺基酸，例如相對於野生型序列含有一或多個核酸或胺基酸插入、缺失和/或取代的序列（例如，核酸序列或胺基酸序列）。
免疫原衍生物序列係與野生型序列（例如，野生型核酸、蛋白質、免疫原或表位序列）具有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的序列。
在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的蛋白質的結構的一或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的蛋白質的功能的一或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。在一些實施方式中，免疫原含有影響細胞對所編碼的蛋白質的表現或加工的一或多個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
在一些實施方式中，免疫原含有影響所編碼的免疫原性核酸的結構的一或多個核酸插入、缺失、取代或其組合。
胺基酸的插入、缺失、取代或其組合可以引入翻譯後修飾的位點（例如，引入糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行切割的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合去除翻譯後修飾的位點（例如，去除糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或靶向進行切割的序列）。在一些實施方式中，胺基酸的插入、缺失、取代或其組合修飾翻譯後修飾的位點（例如，修飾位點以改變糖基化、泛素化、磷酸化、亞硝基化、甲基化、乙醯化、醯胺化、羥基化、硫酸化或脂質化位點，或切割的效率或特徵）。
胺基酸取代可為保守性或非保守性取代。保守性胺基酸取代可為一個胺基酸取代另一個相似生物化學性質（例如，電荷、大小和/或疏水性）的胺基酸。非保守性胺基酸取代可為一個胺基酸被具有不同生物化學特性（例如，電荷、大小和/或疏水性）的另一胺基酸取代。保守性胺基酸變化可為例如對多肽的二級或三級結構影響最小的取代。保守性胺基酸變化可為從一種親水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。親水性胺基酸可以包括Thr（T）、Ser（S）、His（H）、Glu（E）、Asn（N）、Gln（Q）、Asp（D）、Lys（K）和Arg（R）。保守性胺基酸變化可為從一種疏水性胺基酸到另一種親水性胺基酸的胺基酸變化。疏水性胺基酸可以包括Ile（I）、Phe（F）、Val（V）、Leu（L）、Trp（W）、Met（M）、Ala（A）、Gly（G）、Tyr（Y）和Pro（P）。保守性胺基酸變化可為從一種酸性胺基酸到另一種酸性胺基酸的胺基酸變化。酸性胺基酸可以包括Glu（E）和Asp（D）。保守性胺基酸變化可為從一種鹼性胺基酸到另一種鹼性胺基酸的胺基酸變化。鹼性胺基酸可以包括His（H）、Arg（R）和Lys（K）。保守性胺基酸變化可為從一種極性胺基酸到另一種極性胺基酸的胺基酸變化。極性胺基酸可以包括Asn（N）、Gln（Q）、Ser（S）和Thr（T）。保守性胺基酸變化可為從一種非極性胺基酸到另一種非極性胺基酸的胺基酸變化。非極性胺基酸可以包括Leu（L）、Val（V）、Ile（I）、Met（M）、Gly（G）和Ala（A）。保守性胺基酸變化可為從一種芳族胺基酸到另一種芳族胺基酸的胺基酸變化。芳族胺基酸可以包括Phe（F）、Tyr（Y）和Trp（W）。保守性胺基酸變化可為從一種脂族胺基酸到另一種脂族胺基酸的胺基酸變化。脂族胺基酸可以包括Ala（A）、Val（V）、Leu（L）和Ile（I）。在一些實施方式中，保守性胺基酸取代係以下各類之一的一個胺基酸到另一胺基酸的胺基酸變化：I類：Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；II類：Cys、Ser、Tyr、Thr；III類：Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；IV類：Lys、Arg、His；V類：Phe、Tyr、Trp、his；和VI類：Asp、Glu。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸取代。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。
這一或多個胺基酸取代可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸取代可為連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於本文揭露的序列（例如，野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多120個、至多140個、至多160個、至多180個或至多200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20、20-25、20-30、30-50、50-100或100-200個胺基酸缺失。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸缺失。
這一或多個胺基酸缺失可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸缺失可為連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個或至少50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列）包括至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-30、1-40、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、2-20、2-30、2-40、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、3-15、3-20、3-30、3-40、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、10-15、15-20或20-25個胺基酸插入。
在一些實施方式中，本揭露之免疫原衍生物或表位衍生物相對於野生型序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸插入。
這一或多個胺基酸插入可以處於N端、C端、胺基酸序列內，或為其組合。該等胺基酸插入可為連續的、非連續的或其組合。
在一些實施方式中，免疫原由環狀或線性多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫原係環狀或線性多核糖核苷酸滾環擴增的產物。
免疫原可以大量產生。這樣，免疫原可為可產生的任何蛋白質分子。免疫原可為可從細胞分泌或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜區室的多肽。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括融合蛋白，該融合蛋白包括本文揭露的兩或更多種免疫原。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括表位。在一些實施方式中，由本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸編碼的多肽包括包含本文揭露的兩或更多個表位的融合蛋白，例如包含來自本揭露之一或多種微生物的多個預測表位的人工肽序列。
在一些實施方式中，可以從環狀或線性多核糖核苷酸表現的免疫原係膜蛋白，例如，包括通常作為膜蛋白被發現的多肽序列，或經修飾為膜蛋白的多肽序列。在一些實施方式中，可以從本文揭露的環狀或線性多核糖核苷酸表現的示例性免疫原包括細胞內免疫原或胞質免疫原。
在一些實施方式中，免疫原的長度小於約40,000個胺基酸，小於約35,000個胺基酸，小於約30,000個胺基酸，小於約25,000個胺基酸，小於約20,000個胺基酸，小於約15,000個胺基酸小於約10,000個胺基酸，小於約9,000個胺基酸，小於約8,000個胺基酸，小於約7,000個胺基酸，小於約6,000個胺基酸，小於約5,000個胺基酸，小於約4,000個胺基酸，小於約3,000個胺基酸，小於約2,500個胺基酸，小於約2,000個胺基酸，小於約1,500個胺基酸，小於約1,000個胺基酸，小於約900個胺基酸，小於約800個胺基酸，小於約700個胺基酸，小於約600個胺基酸，小於約500個胺基酸，小於約400個胺基酸，小於約300個胺基酸，小於約250個胺基酸，小於約200個胺基酸，小於約150個胺基酸，小於約140個胺基酸，小於約130個胺基酸，小於約120個胺基酸，小於約110個胺基酸，小於約100個胺基酸，小於約90個胺基酸，小於約80個胺基酸，小於約70個胺基酸，小於約60個胺基酸，小於約50個胺基酸，小於約40個胺基酸，小於約30個胺基酸，小於約25個胺基酸，小於約20個胺基酸，小於約15個胺基酸，小於約10個胺基酸，小於約5個胺基酸，介於之間或更小的任何胺基酸長度都可用。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸包括一或多個免疫原序列並且構造成用於在受試者體內細胞中持續表現。在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸構造成使得該一或多個表現序列在細胞中在較晚的時間點的表現等於或高於較早的時間點的表現。在此類實施方式中，該一或多個免疫原序列的表現可以維持在相對穩定的水平或可以隨時間增加。免疫原序列的表現可以在延長的時間段內相對穩定。免疫原序列的表現可以瞬時相對穩定或僅有限的時間，例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天相對穩定。
在一些實施方式中，環狀或線性多核糖核苷酸在受試者中表現一或多種免疫原（例如瞬時或長期）。在某些實施方式中，免疫原的表現持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或介於之間的任何時間。在某些實施方式中，免疫原的表現持續不超過約30分鐘至約7天、或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或介於之間的任何時間。
免疫原表現包括翻譯本文提供的環狀或線性多核糖核苷酸的至少一個區域。例如，環狀或線性多核糖核苷酸可以在受試者中翻譯以生成包括本揭露之一或多種免疫原的多肽，從而刺激受試者中適應性免疫響應（例如，抗體響應和/或T細胞響應）的產生。在一些實施方式中，本揭露之環狀或線性多核糖核苷酸經翻譯以在人或動物受試者中產生一或多種免疫原，從而刺激人或動物受試者中適應性免疫響應（例如，抗體響應和/或T細胞響應）的產生。
在一些實施方式中，用於免疫原表現的方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸的總長度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%翻譯成多肽。在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成具有至少5個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、至少150個胺基酸、至少200個胺基酸、至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少400個胺基酸、至少500個胺基酸、至少600個胺基酸、至少700個胺基酸、至少800個胺基酸、至少900個胺基酸或至少1000個胺基酸的多肽。在一些實施方式中，用於蛋白質表現之方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成約5個胺基酸、約10個胺基酸、約15個胺基酸、約20個胺基酸、約50個胺基酸、約100個胺基酸、約150個胺基酸、約200個胺基酸、約250個胺基酸、約300個胺基酸、約400個胺基酸、約500個胺基酸、約600個胺基酸、約700個胺基酸、約800個胺基酸、約900個胺基酸或約1000個胺基酸的多肽。在一些實施方式中，方法包括將環狀或線性多核糖核苷酸翻譯成本文提供的連續多肽、本文提供的離散多肽或兩者。
在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括翻譯產物的修飾、折疊或其他翻譯後修飾。在一些實施方式中，用於免疫原表現之方法包括體內翻譯後修飾（例如經由細胞機制）。 多聚化
在某些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可編碼多聚化結構域。例如，環狀多核糖核苷酸可編碼作為免疫原的第一多肽和作為多聚化結構域的第二多肽。例如，多聚化結構域可以在與免疫原相同的開讀框上編碼，並作為具有免疫原的融合蛋白表現。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可編碼兩或更多種免疫原，並且每種免疫原可視需要與多聚化結構域融合。多聚化結構域可促進免疫原複合物（例如，包括多種免疫原的複合物）的形成。
編碼的免疫原的多聚化可有利於誘導免疫響應。免疫原與一或多種多聚化元件（例如，二聚化元件、三聚化元件、四聚化元件和寡聚化元件）的融合可導致多聚免疫原複合物（例如，在免疫的受試者中表現後形成多聚免疫原複合物）的形成。在一些實施方式中，多聚免疫原複合物的形成增加了免疫原的免疫原性。例如，多聚免疫原複合物的形成可藉由模擬外源病原體（例如，病毒）的感染來增加免疫原的免疫原性，其中多種潛在免疫原通常位於病原體的包膜處（例如，流感病毒的血球凝集素（HA）免疫原）。在一些實施方式中，多聚化複合物包括至少2、3、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100種免疫原。在一些實施方式中，免疫原複合物包括2至10、2至50、2至100、5至10、5至15、5至20、5至50、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至100、20至50、或20至100種免疫原。在一些實施方式中，免疫原複合物包括6個拷貝的免疫原（例如，環狀多核糖核苷酸編碼免疫原-foldon-免疫原融合蛋白）。在一些實施方式中，免疫原複合物包括24個拷貝的免疫原（例如，環狀多核糖核苷酸編碼免疫原-鐵蛋白融合蛋白）。在一些實施方式中，免疫原複合物包括60個拷貝的免疫原（例如，環狀多核糖核苷酸編碼免疫原-AaLS融合蛋白或編碼免疫原-β環肽）。
當在本揭露之上下文中與目的多肽免疫原組合使用時，這樣的多聚化元件可以位於目的多肽的N端或C端。在核酸水平上，這樣的多聚化元件的編碼序列典型地位於目的多肽或蛋白質的編碼序列的相同閱讀框中，5’或3’。
多聚化結構域可具有10至500個胺基酸殘基（例如，10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、10至50、50至500、100至500、150至500、200至500、250至500、300至500、350至500、400至500和450至500個殘基）。在一些實施方式中，多聚化結構域可包括20至2500個胺基酸殘基（例如，20至250、20至225、20至200、20至175、20至150、20至150、20至125、20至100、20至75、20至50、50至250、75至250、100至250、125至250、150至250、175至250、200至250和225至250個殘基）。
在一些實施方式中，與多聚化結構域融合的免疫原比免疫原的免疫原性至少2倍、5倍或10倍（例如，在人類受試者中）。在一些實施方式中，與多聚化結構域融合的免疫原比未與多聚化結構域融合的免疫原的免疫原性至少高20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%或500%（例如，在人類受試者中）。
特定的多聚化元件係寡聚化元件、四聚化元件、三聚化元件或二聚化元件。二聚化元件可選自例如，熱休克蛋白的二聚化元件/結構域、免疫球蛋白Fc結構域和白胺酸拉鍊（轉錄因子的鹼性區域白胺酸拉鍊類二聚化結構域）。三聚化和四聚化元件可選自例如工程化的白胺酸拉鍊（採用平行三聚體狀態的工程化a-螺旋捲曲螺旋肽）、來自腸桿菌屬噬菌體T4的纖維蛋白foldon結構域、GCN4pll、CCN4-pLI和p53。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括T4 foldon結構域。在特定實施方式中，T4 foldon結構域具有與GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL（SEQ ID NO: 29）具有至少95%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，T4 foldon具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列。在一些實施方式中，多聚化結構域係β環肽（參見Matsuura等人 (2010), Angew. Chem. Int. Ed. [德國應用化學], 49: 9662-9665）。在一些實施方式中，β環肽具有INHVGGTGGAIMAPVAVTRQLVGS（SEQ ID NO: 30）的胺基酸序列（其中C端絲胺酸殘基視需要存在或不存在），或具有與SEQ ID NO: 30具有至少95%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括AaLS肽。在特定實施方式中，AaLS肽具有與TDILGKYVINYLNKLKKKEDIFKEFLKW（SEQ ID NO: 31）具有至少95%同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，AaLS肽具有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列。
寡聚化元件可選自例如，鐵蛋白、界面活性劑D、副黏液病毒磷蛋白的寡聚化結構域、補體抑制劑C4結合蛋白（C4bp）寡聚化結構域、病毒感染性因子（Vif）寡聚化結構域、不育α模體（sterile alpha motif，SAM）結構域和血管性血友病因子D型結構域。
鐵蛋白形成寡聚體，並且係所有動物、細菌和植物中存在的高度保守的蛋白質。鐵蛋白係自發形成24個相同亞基的奈米顆粒的蛋白質。鐵蛋白-免疫原融合構建體潛在地形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括鐵蛋白結構域。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括具有以下胺基酸序列的鐵蛋白結構域： DIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIVFLNENNVPVQLTSISAPEHKFESLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKGKDHATFNFLQWYVSEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS（SEQ ID NO: 32）。
界面活性劑D蛋白（SPD）係自發自組裝以形成寡聚體的親水性糖蛋白。SPD-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。
副黏液病毒（負義RNA病毒）的磷蛋白作為病毒聚合酶的轉錄反式激活因子起作用。磷蛋白的寡聚化對病毒基因組複製至關重要。磷蛋白-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。
補體抑制劑C4結合蛋白（C4bp）也可用作融合配偶體來產生寡聚免疫原聚集物。C4bp的C端結構域（人中的57個胺基酸殘基和小鼠中的54個胺基酸殘基）對於C4bp或與其融合的其他多肽的寡聚化係必要且充分的。C4bp-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。病毒感染性因子（Vif）多聚化結構域已顯示在體外和體內均形成寡聚體。Vif的寡聚化涉及映射在C端結構域中殘基151至164與161 PPLP 164模體之間的序列（對於人HIV-1：TPKKIKPPLP（SEQ ID NO: 33））。Vif-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。
不育α模體（SAM）結構域係存在於參與許多生物過程的多種蛋白質中的蛋白質相互作用模組。在多種真核生物中發現了分佈在約70個殘基上的SAM結構域。SAM結構域已顯示同源和異源寡聚化，形成多個自締合寡聚化結構。SAM-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。血管性血友病因子（vWF）含有幾個D型結構域：D1和D2存在於N端前肽中，而剩餘的D結構域係寡聚化所必需的。vWF結構域存在於多種血漿蛋白中：補體因子B、C2、C 3和CR4；整合素（l-結構域）；VI、VII、XII和XIV型膠原蛋白；和其他細胞外蛋白質。vWF-免疫原融合構建體可形成可增強免疫響應的免疫原的寡聚聚集物或「簇」。
在一些實施方式中，多聚化結構域係二氧四氫蝶啶合酶結構域。二氧四氫蝶啶合酶可組裝成包括二氧四氫蝶啶合酶結構域的60個拷貝的複合物，其中每個二氧四氫蝶啶合酶結構域可與一或多個免疫原融合。在一些實施方式中，二氧四氫蝶啶合酶結構域包括SEQ ID NO: 34-44和115中任一項的胺基酸序列，或者與SEQ ID NO: 34-44和115中任一項具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 34 MQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 35 QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGCIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLANLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKCWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 36 QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKENISAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 37 QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 115 MQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLANLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR
二氧四氫蝶啶合酶結構域具有一或多個半胱胺酸取代以引入使由自組裝的亞基形成的二氧四氫蝶啶合酶複合物穩定的一或多個非天然二硫鍵。在一些實施方式中，通過以下來引入一或多個非天然二硫鍵：L121C-K131C、L121CG-K131C、L121GC-K131C、K7C-R40C、I3C-L50C、I82C-K131CG、E5C-R52C或E95C-A101C取代或其組合（如I3C-L50C和I82C-K131CG；E5C-R52C和I82C-K131CG；或E95C-A101C和I82C-K131CG）。殘基編號參照如SEQ ID NO: 34所示的二氧四氫蝶啶合酶亞基。非限制性實例包括： SEQ ID NO: 38（L121C-K131C） QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKENISAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTCEQAIERAGTCHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 39（L121CG-K131C） QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKENISAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTCCFEQAIERAGTCHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 40（L121GC-K131C） QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKENISAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTCFCEQAIERAGTCHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 41（K7C-R40C） QIYEGCLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVCVHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKENISAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 42（I3C-L50C，I82C-K131CG） QCYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITCVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLCRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTCGHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 43（E5C-R52C，I82C-K131CG） QIYCGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVCVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLCRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTCGHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR SEQ ID NO: 44（E95C-A101C，I82C-K131CG） QIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDCIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLCRGATPHFDYIASCVSKGLCDLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTCGHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR
國際公開案號WO 2020/061564，第25頁第1行至第26頁第20行描述了多肽多聚化的各種方法，將其藉由援引併入本文。
在一些實施方式中，多聚化結構域係核黃素合酶結構域。例如，核黃素合酶結構域可以具有與TDILGKYVINYLNKLKKKEDIFKEFLKW（SEQ ID NO: 116）具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方式中，核黃素合酶結構域可具有SEQ ID NO: 116的胺基酸序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可包括一或多個多聚化結構域。例如，環狀多核糖核苷酸可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10個多聚化結構域。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括兩個多聚化結構域。兩或更多個多聚化結構域可以彼此相鄰。可替代地，兩或更多個多聚化結構域可以被一或多個其他元件隔開。例如，兩個多聚化結構域可以被免疫原隔開。在特定實施方式中，環狀多核糖核苷酸可包括鐵蛋白結構域和T4 foldon結構域。鐵蛋白和T4 foldon結構域可以連接（例如，藉由Gly-Ser連接子）。在一些實施方式中，與T4 foldon結構域連接的鐵蛋白結構域具有以下的胺基酸序列： PGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLSGRSGGDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIVFLNENNVPVQLTSISAPEHKFESLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKGKDHATFNFLQWYVSEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS（SEQ ID NO: 45）。
合適的多聚化結構域可以選自例如根據國際專利申請WO 2017/081082的SEQ ID NO: 1116-1167的胺基酸序列的列表，或者該等序列的片段或變體。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼開讀框（例如，與IRES可操作地連接的開讀框），該開讀框包括如下表1或表2中描述和排列的元件。對於表1或表2中描述的實施方式，每種免疫原視需要包括分泌訊息序列。在表1或表2的實施方式包括多個免疫原的情況下，免疫原可以相同或不同（例如，選自本文所述之免疫原中的任一種）。在表1的實施方式包括多個多聚化結構域的情況下，多聚化結構域可以相同或不同（例如，選自本文所述之多聚化結構域中的任一個）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括多個開讀框，其中每個開讀框描述於表1或表2中。 [表1]. 包括免疫原和多聚化結構域的示例性構建體設計
區 1 區 2 區 3 區 4
免疫原 MD - -
免疫原 MD 免疫原 -
免疫原 MD 免疫原 MD
免疫原 MD MD -
MD 免疫原 - -
MD 免疫原 MD -
MD 免疫原 MD 免疫原
MD MD 免疫原 -
*MD = 各自獨立地選自本文所述之任何多聚化結構域 [表2]. 包括免疫原和多聚化結構域的示例性構建體設計
區 1 區 2 區 3 區 4
免疫原 T4 Foldon - -
免疫原 鐵蛋白 - -
免疫原 β-環（bann） - -
免疫原 AaLS - -
免疫原 T4 Foldon 免疫原 -
免疫原 T4 Foldon 鐵蛋白 -
免疫原 鐵蛋白 T4 Foldon   
內部核糖體進入位點
在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸包括一或多個內部核糖體進入位點（IRES）元件。在一些實施方式中，IRES與一或多個表現序列（例如，每個IRES與一或多個表現序列可操作地連接，其中每個表現序列視需要編碼免疫原，如包括多聚化結構域的免疫原）可操作地連接。在實施方式中，IRES位於異源啟動子與編碼序列（例如，編碼免疫原（包括多聚化結構域）的編碼序列）的5’末端之間。
包括在多核糖核苷酸中的合適的IRES元件包括能夠接合真核核糖體的RNA序列。在一些實施方式中，IRES元件係至少約5 nt、至少約8 nt、至少約9 nt、至少約10 nt、至少約15 nt、至少約20 nt、至少約25 nt、至少約30 nt、至少約40 nt、至少約50 nt、至少約100 nt、至少約200 nt、至少約250 nt、至少約350 nt或至少約500 nt。
在一些實施方式中，IRES元件源自生物體的DNA，該生物體包括但不限於病毒、哺乳動物和果蠅。這樣的病毒DNA可以源自但不限於小核糖核酸病毒互補DNA（cDNA）、腦心肌炎病毒（EMCV）cDNA和脊髓灰白質病毒cDNA。在一個實施方式中，衍生IRES元件的果蠅DNA包括但不限於來自黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的觸角足基因。
在一些實施方式中，IRES序列係以下病毒的IRES序列：桃拉綜合症（Taura syndrome）病毒、錐鼻蟲屬（Triatoma）病毒、泰勒氏腦脊髓炎病毒（Theiler's encephalomyelitis virus）、猿猴病毒40、入侵紅火蟻（Solenopsis invicta）病毒1、稻麥蚜（ Rhopalosiphumpadi）病毒、網狀內皮組織增生病毒、福爾曼脊髓灰白質病毒（fuman poliovirus）1、普勞提婭失速腸病毒（Plautia stall intestine virus）、喀什米爾蜜蜂病毒、人鼻病毒2、假桃病毒葉蟬病毒-1（ Homalodisca coagulatavirus-1）、人類免疫缺陷病毒1型、假桃病毒葉蟬病毒-1、Himetobi P病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人類腸道病毒71、馬鼻炎病毒、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、小核糖核酸樣病毒、腦心肌炎病毒（EMCV）、果蠅C病毒、十字花科菸草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹瀉病毒1、黑皇后細胞病毒、蚜蟲致死性麻痹病毒、禽腦脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪綠環斑病毒（Hibiscus chlorotic ringspot virus）、經典豬瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蠅觸角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-l、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-l、小鼠Rbm3、果蠅reaper、犬Scamper、果蠅Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、薩里病毒（Salivirus）、科薩病毒（Cosavirus）、副腸孤病毒（Parechovirus）、果蠅無毛、釀酒酵母（S. cerevisiae）TFIID、釀酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-l、猿猴小核糖核酸病毒、蕪菁皺縮病毒（Turnip crinkle virus）、eIF4G適配體、柯薩奇病毒（Coxsackievirus）B3（CVB3）或柯薩奇病毒A（CVB1/2）。在又另一實施方式中，IRES係柯薩奇病毒B3（CVB3）的IRES序列。在另外的實施方式中，IRES係腦心肌炎病毒的IRES序列。在另外的實施方式中，IRES係蒂勒腦脊髓炎病毒的IRES序列。
與野生型IRES序列相比，IRES序列可具有經修飾的序列。在一些實施方式中，當野生型IRES的最後一個核苷酸不是胞嘧啶核酸殘基時，可以修飾野生型IRES序列的最後一個核苷酸，使得其係胞嘧啶殘基。例如，IRES序列可為CVB3 IRES序列，其中將末端腺苷殘基修飾為胞嘧啶殘基。在一些實施方式中，經修飾的CVB3 IRES可具有以下的核酸序列： TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTA TCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAA CCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTC CTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAC（SEQ ID NO: 81）
在一些實施方式中，IRES序列係腸道病毒71（EV17）IRES。在一些實施方式中，將EV17 IRES序列的末端鳥苷殘基修飾為胞嘧啶殘基。在一些實施方式中，經修飾的EV71 IRES可具有以下的核酸序列： ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA（SEQ ID NO: 94）
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括側接至少一個（例如，2、3、4、5或更多個）表現序列的至少一個IRES。在一些實施方式中，IRES側接至少一個（例如2、3、4、5或更多個）表現序列的兩側。在一些實施方式中，多核糖核苷酸在每個表現序列的一側或兩側包括一或多個IRES序列，導致所得的一或多種肽和或一或多種多肽的隔開。例如，本文所述之多核糖核苷酸可包括與第一表現序列（例如，編碼第一免疫原，如包括多聚化結構域的第一免疫原）可操作地連接的第一IRES和與第二表現序列（例如，編碼第二免疫原，如包括多聚化結構域的第二免疫原）可操作地連接的第二IRES。
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括IRES（例如，與編碼區可操作地連接的IRES）。例如，多核糖核苷酸可以包括如在以下中描述的任何IRES：Chen等人 Mol. Cell [分子細胞] 81(20):4300-18, 2021；Jopling等人 Oncogene [致癌基因] 20:2664-70, 2001；Baranick等人 PNAS [美國國家科學院院刊] 105(12):4733-38, 2008；Lang等人 Molecular Biology of the Cell [細胞分子生物學] 13(5):1792-1801, 2002；Dorokhov等人 PNAS[美國國家科學院院刊] 99(8):5301-06, 2002；Wang等人 Nucleic Acids Research [核酸研究] 33(7):2248-58, 2005；以及Petz等人 Nucleic Acids Research [核酸研究] 35(8):2473-82, 2007，其各自特此藉由援引以其全文併入。 訊息序列
在一些實施方式中，可以從本文揭露的環狀多核糖核苷酸表現的示例性免疫原包括分泌性蛋白，例如天然包括訊息序列的蛋白質（例如，免疫原），或者通常不編碼訊息序列但修飾為含有訊息序列的蛋白質。在一些實施方式中，由環狀多核糖核苷酸編碼的一或多種免疫原包括分泌訊息。例如，分泌訊息可為分泌性蛋白的天然編碼的分泌訊息。在另一個實例中，分泌訊息可為分泌性蛋白的經修飾的分泌訊息。在其他實施方式中，由環狀多核糖核苷酸編碼的一或多種免疫原不包括分泌訊息。
在一些實施方式中，訊息序列選自SecSP38（MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA；SEQ ID NO: 1）；SecD4（MWWLLLLLL LLWPMVWA；SEQ ID NO: 2）、gLuc（MGVKVLFALICIAVAEAK；SEQ ID NO: 3）；INHC1（MASRLTLLTLLLLLLAGDRASS；SEQ ID NO: 4）；Epo（MGVHECP AWLWLLLSLLSLPLGLPVLG；SEQ ID NO: 5）；和IL-2（MYRMQLLSCIALSLA LVTNS；SEQ ID NO: 6）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼相同免疫原的多個拷貝（例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個）。在一些實施方式中，免疫原的至少一個拷貝包括訊息序列，且免疫原的至少一個拷貝不包括訊息序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼多種免疫原（例如，多種不同的免疫原或多種具有小於100%序列同一性的免疫原），其中該多種免疫原中的至少一種包括訊息序列且該多種免疫原中的至少一個拷貝不包括訊息序列。
在一些實施方式中，訊息序列係野生型訊息序列，其存在於相應野生型免疫原的N端（例如，當內源表現時）。在一些實施方式中，訊息序列與免疫原異源（例如當野生型免疫原內源性表現時係不存在的）。可以修飾編碼免疫原的多核糖核苷酸序列以去除編碼野生型訊息序列的核苷酸序列和/或添加編碼異源訊息序列的序列。
環狀多核糖核苷酸可進一步包括一或多種佐劑，每種佐劑都具有或沒有訊息序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼至少一種佐劑和至少一種免疫原。在一些實施方式中，至少一種編碼的佐劑包括訊息序列且該至少一種編碼的免疫原不包括訊息序列。在一些實施方式中，至少一種編碼的佐劑包括訊息序列且該至少一種編碼的免疫原包括訊息序列。在一些實施方式中，至少一種編碼的佐劑不包括訊息序列且該至少一種編碼的免疫原包括訊息序列。在一些實施方式中，編碼的佐劑和編碼的免疫原都不包括訊息序列。
在一些實施方式中，訊息序列係野生型訊息序列，其存在於相應野生型佐劑的N端（例如，當內源表現時）。在一些實施方式中，訊息序列與佐劑異源（例如當野生型佐劑內源性表現時係不存在的）。可以修飾編碼佐劑的多核糖核苷酸序列以去除編碼野生型訊息序列的核苷酸序列和/或添加編碼異源訊息序列的序列。
由多核糖核苷酸編碼的多肽（例如，由多核糖核苷酸編碼的免疫原或佐劑）可以包括將免疫原或佐劑引導至分泌途徑的訊息序列。在一些實施方式中，訊息序列可以引導免疫原或佐劑駐留在某些細胞器（例如，內質網、高爾基體或內體）中。在一些實施方式中，訊息序列將免疫原或佐劑引導至從細胞中分泌。對於分泌性蛋白，訊息序列可在分泌之後被切割，從而產生成熟蛋白質。在其他實施方式中，訊息序列可以嵌入細胞膜或某些細胞器中，產生跨膜區段，跨膜區段將蛋白錨定至細胞膜、內質網或高爾基體。在某些實施方式中，跨膜蛋白的訊息序列係在多肽N端的短序列。在其他實施方式中，第一跨膜結構域充當第一訊息序列，將蛋白質靶向膜。
在一些實施方式中，由多核糖核苷酸編碼的佐劑包括分泌訊息序列。在一些實施方式中，由多核糖核苷酸編碼的免疫原包括分泌訊息序列、跨膜插入訊息序列或不包括訊息序列。 調控元件
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個調控元件（例如，修飾環狀多核糖核苷酸內表現序列的表現的一或多個序列）。
調控元件可以包括位置與編碼表現產物的表現序列相鄰的序列。調控元件可以可操作地連接至相鄰序列。與不存在調控元件時表現的產物的量相比，調控元件可以增加表現的產物的量。調控元件可用於增加由環狀多核糖核苷酸編碼的一或多種免疫原和/或佐劑的表現。同樣地，調控元件可用於降低由環狀多核糖核苷酸編碼的一或多種免疫原和/或佐劑的表現。在一些實施方式中，調控元件可用於增加免疫原和/或佐劑的表現，而另一種調控元件可用於降低同一環狀多核糖核苷酸上另一種免疫原和/或佐劑的表現。此外，一個調控元件可以增加串聯附接的多個表現序列表現的產物（例如，免疫原或佐劑）的量。因此，一個調控元件可以增強一或多個表現序列（例如，免疫原或佐劑）的表現。也可以使用多種調控元件，例如，差異性地調控不同表現序列的表現。
在一些實施方式中，本文提供的調控元件可以包括選擇性翻譯序列。如本文所用，術語「選擇性翻譯序列」係指選擇性地起始或激活環狀多核糖核苷酸中的表現序列的翻譯的核酸序列，例如某些核糖開關適體酶。調控元件還可以包括選擇性降解序列。如本文所用，術語「選擇性降解序列」係指起始環狀多核糖核苷酸或環狀多核糖核苷酸的表現產物的降解的核酸序列。在一些實施方式中，調控元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節環狀多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可為翻譯強化子或翻譯抑制子。在一些實施方式中，翻譯起始序列可以充當調控元件。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸產生化學計量比的表現產物。滾環翻譯連續地以基本上相等的比率產生表現產物。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有化學計量的翻譯效率，使得表現產物以基本上相等的比率產生。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸具有多種表現產物（例如，來自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12種或更多種表現序列的產物）的化學計量翻譯效率。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸產生基本上不同比率的表現產物。例如，多種表現產物的翻譯效率可以具有以下的比率：1 : 10,000、1 : 7000、1 : 5000、1 : 1000、1 : 700、1 : 500、1 : 100、1 : 50、1 : 10、1 : 5、1 : 4、1 : 3或1 : 2。在一些實施方式中，可以使用調控元件來修改多個表現產物的比率。
國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0154] - [0161]中描述了調控元件的其他實例，將其特此藉由援引以其全文併入。 切割結構域
本揭露之環狀多核糖核苷酸可以包括切割結構域（例如，交錯元件或切割序列）。
術語「交錯元件」係指在翻譯期間誘導核糖體暫停的部分，諸如核苷酸序列。在一些實施方式中，交錯元件係具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，然後是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x = 任何胺基酸（SEQ ID NO: 7）。在一些實施方式中，交錯元件可以包括化學部分，如甘油、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾的核酸或其任何組合。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，交錯元件存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物（例如一或多種免疫原和/或一或多種佐劑）的隔開。在一些實施方式中，交錯元件係一或多個表現序列的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列（例如，一或多種免疫原和/或一或多種佐劑），並且該一或多個表現序列中的每一個被環狀多核糖核苷酸上的交錯元件與後繼的表現序列（例如，一或多種免疫原和/或一或多種佐劑）隔開。在一些實施方式中，交錯元件阻止 (a) 單個表現序列的兩輪翻譯或 (b) 兩或更多個表現序列的一輪或多輪翻譯生成單個多肽。在一些實施方式中，交錯元件係與該一或多個表現序列隔開的序列。在一些實施方式中，交錯元件包括該一或多個表現序列的表現序列的一部分。
在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交錯元件的實例，將其特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，由環狀核糖核苷酸編碼的多種免疫原和/或佐劑可以被每種免疫原之間的IRES隔開（例如，每種免疫原與單獨的IRES可操作地連接）。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括與第一表現序列可操作地連接的第一IRES和與第二表現序列可操作地連接的第二IRES。所有免疫原之間的IRES可為相同的IRES。不同免疫原之間的IRES可以不同。
在一些實施方式中，多種免疫原和/或佐劑可以被2A自切割肽隔開。例如，環狀多核糖核苷酸可編碼與編碼第一免疫原、2A和第二免疫原的開讀框可操作地連接的IRES。
在一些實施方式中，多種免疫原和/或佐劑可以被蛋白酶切割位點（例如，弗林蛋白酶切割位點）隔開。例如，環狀多核糖核苷酸可編碼與編碼第一免疫原、蛋白酶切割位點（例如，弗林蛋白酶切割位點）和第二免疫原的開讀框可操作地連接的IRES。
在一些實施方式中，多種免疫原和/或佐劑可以被2A自切割肽和蛋白酶切割位點（例如，弗林蛋白酶切割位點）隔開。例如，環狀多核糖核苷酸可編碼與編碼第一免疫原、2A、蛋白酶切割位點（例如，弗林蛋白酶切割位點）和第二免疫原的開讀框可操作地連接的IRES。環狀多核糖核苷酸還可以編碼與編碼第一免疫原、蛋白酶切割位點（例如，弗林蛋白酶切割位點）、2A和第二免疫原的開讀框可操作地連接的IRES。串聯的2A和弗林蛋白酶切割位點可稱為弗林蛋白酶-2A（其包括以任一方向排列的弗林蛋白酶-2A或2A-弗林蛋白酶）。
此外，由環狀核糖核苷酸編碼的多種免疫原和/或佐劑可以被IRES和2A序列兩者隔開。例如，IRES可以在一種免疫原和/或佐劑和第二免疫原和/或佐劑之間，而2A肽可以在第二免疫原和/或佐劑和第三免疫原和/或佐劑之間。特定IRES或2A自切割肽的選擇可用於在IRES或2A序列的控制下控制免疫原和/或佐劑的表現水平。例如，根據所選擇的IRES和/或2A肽，多肽上的表現可以更高或更低。
為了避免產生連續表現產物（例如免疫原和/或佐劑），同時保持滾環翻譯，可以包括交錯元件以在翻譯期間誘導核糖體暫停。在一些實施方式中，交錯元件在一或多個表現序列中的至少一個的3'末端。交錯元件可以被配置為在環狀多核糖核苷酸的滾環翻譯期間使核糖體停滯。交錯元件可以包括但不限於2A樣或CHYSEL（SEQ ID NO: 8）（順式作用的水解酶元件）序列。在一些實施方式中，交錯元件編碼具有C末端共有序列為X 1X 2X 3EX 5NPGP的序列，其中X 1不存在或G或H，X 2不存在或D或G，X 3係D或V或I或S或M，X 5係任何胺基酸（SEQ ID NO: 9）。在一些實施方式中，該序列包括具有強α-螺旋傾向的胺基酸的非保守序列，隨後是共有序列-D(V/I)ExNPGP（SEQ ID NO: 7），其中x=任何胺基酸。交錯元件之一些非限制性實例包括GDVESNPGP（SEQ ID NO: 10）、GDIEENPGP（SEQ ID NO: 11）、VEPNPGP（SEQ ID NO: 12）、IETNPGP（SEQ ID NO: 13）、GDIESNPGP（SEQ ID NO: 14）、GDVELNPGP（SEQ ID NO: 15）、GDIETNPGP（SEQ ID NO: 16）、GDVENPGP（SEQ ID NO: 17）、GDVEENPGP（SEQ ID NO: 18）、GDVEQNPGP（SEQ ID NO: 19）、IESNPGP（SEQ ID NO: 20）、GDIELNPGP（SEQ ID NO: 21）、HDIETNPGP（SEQ ID NO: 22）、HDVETNPGP（SEQ ID NO: 23）、HDVEMNPGP（SEQ ID NO: 24）、GDMESNPGP（SEQ ID NO: 25）、GDVETNPGP（SEQ ID NO: 26）、GDIEQNPGP（SEQ ID NO: 27）和DSEFNPGP（SEQ ID NO: 28）。
在一些實施方式中，本文所述之交錯元件切割表現產物，諸如在本文所述之共有序列的G和P之間。作為一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸包括至少一個交錯元件以切割表現產物。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括在每個表現序列後的交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括存在於每個表現序列的一側或兩側的交錯元件，導致由每個表現序列翻譯一或多種單獨肽和/或多肽。
在一些實施方式中，交錯元件包括一或多種在翻譯過程中誘導核糖體暫停的經修飾的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸（PNA）、𠰌啉代和鎖核酸（LNA）、以及乙二醇核酸（GNA）和蘇糖核酸（TNA）。諸如此類的實例藉由改變分子主鏈而不同於天然存在的DNA或RNA。示例性修飾可以包括對糖、核鹼基、核苷間鍵（例如對連接的磷酸酯/對磷酸二酯鍵/對磷酸二酯主鏈）進行的可在翻譯期間誘導核糖體暫停的任何修飾以及其任何組合。本文提供的一些示例性修飾在本文其他處描述。
在一些實施方式中，交錯元件以其他形式存在於環狀多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性環狀多核糖核苷酸中，交錯元件包括環狀多核糖核苷酸中的第一表現序列的終止元件，和將終止元件與第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列隔開的核苷酸間隔子序列。在一些實例中，第一表現序列的第一交錯元件在環狀多核糖核苷酸中的第一表現序列後繼表現的第一翻譯起始序列的上游（5'）。在一些情況下，第一表現序列和第一表現序列後繼表現序列係環狀多核糖核苷酸中的兩個隔開的表現序列。第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離可以使得第一表現序列及其後繼表現序列能夠連續翻譯。在一些實施方式中，第一交錯元件包括終止元件，並將第一表現序列的表現產物與其後繼表現序列的表現產物隔開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀多核糖核苷酸中後繼序列的第一翻譯起始序列上游包括第一交錯元件的環狀多核糖核苷酸被連續翻譯，而在第二表現序列後繼表現序列的第二翻譯起始序列的上游包括第二表現序列的交錯元件的對應環狀多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸中僅存在一個表現序列，並且第一表現序列及其後繼表現序列係相同的表現序列。在一些示例性環狀多核糖核苷酸中，交錯元件包括環狀多核糖核苷酸中第一表現序列的第一終止元件，和將終止元件與下游翻譯起始序列隔開的核苷酸間隔子序列。在一些此類實例中，環狀多核糖核苷酸中第一交錯元件在第一表現序列的第一翻譯起始序列的上游（5'）。在一些情況下，第一交錯元件和第一翻譯起始序列之間的距離使得能夠連續翻譯第一表現序列和任何後繼表現序列。在一些實施方式中，第一交錯元件將第一表現序列的一輪表現產物與第一表現序列的下一輪表現產物分開，從而產生離散的表現產物。在一些情況下，在環狀多核糖核苷酸中的第一序列的第一翻譯起始序列上游包括第一交錯元件的環狀多核糖核苷酸被連續翻譯，而在相應環狀多核糖核苷酸中的第二表現序列的第二翻譯起始序列上游包括交錯元件的相應環狀多核糖核苷酸不被連續翻譯。在一些情況下，相應環狀多核糖核苷酸中第二交錯元件與第二翻譯起始序列之間的距離係環狀多核糖核苷酸中第一交錯元件與第一翻譯起始序列之間的距離的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情況下，第一交錯元件與第一翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或更大。在一些實施方式中，第二交錯元件與第二翻譯起始之間的距離為至少2 nt、3 nt、4 nt、5 nt、6 nt、7 nt、8 nt、9 nt、10 nt、11 nt、12 nt、13 nt、14 nt、15 nt、16 nt、17 nt、18 nt、19 nt、20 nt、25 nt、30 nt、35 nt、40 nt、45 nt、50 nt、55 nt、60 nt、65 nt、70 nt、75 nt或大於第一交錯元件和第一翻譯起始之間的距離。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括多於一個表現序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個切割序列。在一些實施方式中，切割序列與表現序列相鄰。在一些實施方式中，切割序列在兩個表現序列之間。在一些實施方式中，切割序列包括在表現序列中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括2至10個切割序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括2至5個切割序列。在一些實施方式中，多個切割序列在多個表現序列之間；例如，環狀多核糖核苷酸可以包括三個表現序列和兩個切割序列，使得在每個表現序列之間存在一個切割序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括切割序列，例如在犧牲型circRNA或可切割的circRNA或自切割的circRNA中。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括兩或更多個切割序列，導致將環狀多核糖核苷酸分離成多個產物（例如miRNA、線性RNA、較小的環狀多核糖核苷酸等）。
在一些實施方式中，切割序列包括核酶RNA序列。核酶（來自核糖核酸酶，也稱為RNA酶或催化性RNA）係催化化學反應的RNA分子。許多天然核酶催化其自身的磷酸二酯鍵之一的水解，或催化其他RNA中的鍵的水解，但也發現天然核酶催化核糖體的胺基轉移酶活性。催化性RNA可以藉由體外方法「進化」。類似於上文討論的核糖開關活性，核酶及其反應產物可以調控基因表現。在一些實施方式中，將催化性RNA或核酶置於較大的非編碼RNA中，這使得核酶以許多拷貝存在於細胞內，用於大體積分子的化學轉化的目的。在一些實施方式中，適配體和核酶都可以在相同的非編碼RNA中編碼。
在一些實施方式中，切割序列編碼可切割的多肽連接子。例如，多核糖核苷酸可以編碼兩或更多種免疫原（例如，其中該兩或更多種免疫原由單個開讀框（ORF）編碼）。例如，兩或更多種免疫原可以由單個開讀框編碼，該開讀框的表現受IRES控制。在一些實施方式中，ORF進一步編碼多肽連接子，例如使得ORF的表現產物編碼兩或更多種免疫原，每種免疫原被編碼多肽連接子（例如，5-200、5至100、5至50、5至20、50至100或50至200個胺基酸的連接子）的序列隔開。多肽連接子可包括切割位點，例如，被蛋白酶（例如，在對受試者投與多核糖核苷酸之後受試者中的內源性蛋白酶）識別和切割的切割位點。在這樣的實施方式中，包括兩或更多種免疫原的胺基酸序列的單一表現產物在表現時裂解，從而使得該兩或更多種免疫原在表現後分離。示例性的蛋白酶切割位點係熟悉該項技術者已知的，例如，充當被金屬蛋白酶（例如，基質金屬蛋白酶（MMP），如MMP 1-28中的任一或多種）、解聚素（disintegrin）和金屬蛋白酶（ADAM，如ADAM 2、7-12、15、17-23、28-30和33中的任一或多種）、絲胺酸蛋白酶（例如，弗林蛋白酶）、尿激酶型纖溶酶原激活劑、蛋白裂解酶（matriptase）、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶或組織蛋白酶識別的蛋白酶切割位點的胺基酸序列。在一些實施方式中，該蛋白酶係MMP9和/或MMP2。在一些實施方式中，蛋白酶係蛋白裂解酶。
在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸係犧牲型環狀多核糖核苷酸、可切割的環狀多核糖核苷酸或自切割的環狀多核糖核苷酸。環狀多核糖核苷酸可以遞送細胞組分，包括例如，RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括被以下隔開的miRNA：(i) 可自切割的元件；(ii) 切割募集位點；(iii) 可降解連接子；(iv) 化學連接子；和/或 (v) 間隔子序列。在一些實施方式中，circRNA包括被以下隔開的siRNA：(i) 可自切割的元件；(ii) 切割募集位點（例如，ADAR）；(iii) 可降解連接子（例如，丙三醇）；(iv) 化學連接子；和/或 (v) 間隔子序列。可自切割的元件之非限制性實例包括錘頭結構、剪接元件、髮夾、D型肝炎病毒（HDV）、Varkud衛星（VS）和 glmS核酶。 翻譯起始序列
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼免疫原並且包括翻譯起始序列（例如起始密碼子）。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括科紮克或夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列包含科紮克序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括翻譯起始序列（例如，與表現序列相鄰，例如科紮克序列）。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如科紮克序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的隔開。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為環狀多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列基本上在環狀多核糖核苷酸的單股區內。在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻譯起始序列的其他實例，將其特此藉由援引以其全文併入。
環狀多核糖核苷酸可包括多於1個起始密碼子，例如但不限於至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個或多於60個起始密碼子。翻譯可以在第一個起始密碼子上起始或可以在第一個起始密碼子的下游起始。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以起始於不是第一起始密碼子（例如AUG）的密碼子。環狀多核糖核苷酸的翻譯可以在替代性的翻譯起始序列處起始，如國際專利公開案號WO 2019/118919 A1的[0164]中描述的那些，其藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，翻譯係藉由用Rocaglates處理真核起始因子4A（eIF4A）來起始的（藉由阻斷43S掃描來阻遏翻譯，導致過早的上游翻譯起始以及攜帶RocA-eIF4A靶序列的轉錄本的蛋白質表現降低，參見例如，www.nature.com/articles/nature17978）。 非翻譯區
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非翻譯區（UTR）。包括基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。
在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性非翻譯區，將其特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A序列。在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性聚A序列，將其特此藉由援引以其全文併入。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。該等AU富集簽名可能會增加表現產物的轉化率。
富含UTR AU的元件（ARE）的引入、去除或修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，免疫或炎性響應的一或多種標誌物的水平）。工程化特定的環狀多核糖核苷酸時，可以將ARE的一或多個拷貝引入環狀多核糖核苷酸中，並且ARE的該等拷貝可以調節表現產物的翻譯和/或產生。同樣，可以對ARE進行鑒別和去除或工程化至環狀多核糖核苷酸以調節細胞內穩定性，從而影響所得蛋白質的翻譯和產生。
應當理解，可以將來自任何基因的任何UTR摻入環狀多核糖核苷酸的相應側翼區中。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少帽，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括以下序列中的一或多個：編碼一或多種miRNA的序列、編碼一或多種複製蛋白的序列、編碼外源基因的序列、編碼治療劑的序列、調控元件（例如，翻譯調節子，例如，翻譯強化子或抑制子）、翻譯起始序列、靶向內源基因的一或多種調控核酸（例如，siRNA、lncRNA、shRNA）和編碼治療性mRNA或蛋白的序列。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少降解易感性的事實可以意味著環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或僅在核酸外切酶存在下有限程度地降解（例如，與核酸外切酶不存在時相當或相似）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些實施方式中，當暴露於核酸外切酶時，環狀多核糖核苷酸降解減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’帽。 終止元件
在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括至少一個終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列可操作地連接的終止元件。在一些實施方式中，多核苷酸缺少終止元件。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且每個表現序列可具有或可不具有終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且表現序列缺少終止元件，使得多核糖核苷酸被連續翻譯。終止元件的排除可導致表現產物的滾環翻譯或連續表現。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且每個表現序列可具有或可不具有終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且表現序列缺少終止元件，使得環狀多核糖核苷酸被連續翻譯。由於缺少核糖體停滯或脫落，終止元件的排除可導致表現產物（例如肽或多肽）的滾環翻譯或連續表現。在這樣的實施方式中，滾環翻譯通過每個表現序列來表現連續表現產物。在一些其他實施方式中，表現序列的終止元件可為交錯元件的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中的一或多個表現序列包括終止元件。然而，在環狀多核糖核苷酸中進行滾環翻譯或後繼（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列的表現。在此類情況下，當核糖體遇到終止元件（例如，終止密碼子）並終止翻譯時，表現產物可以從核糖體上脫落。在一些實施方式中，在核糖體（例如核糖體的至少一個亞基）與環狀多核糖核苷酸保持接觸時翻譯終止。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在一或多個表現序列的末端包括終止元件。在一些實施方式中，一或多個表現序列包括兩或更多個連續的終止元件。在這樣的實施方式中，翻譯終止並且滾環翻譯終止。在一些實施方式中，核糖體與環狀多核糖核苷酸完全脫離。在一些這樣的實施方式中，在環狀多核糖核苷酸中產生隨後的（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列可需要核糖體在翻譯起始之前與環狀多核糖核苷酸重新接合。通常，終止元件包括發出翻譯終止訊息的框內核苷酸三聯體（例如，UAA、UGA、UAG）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中的一或多個終止元件係閱讀框移位的終止元件，例如但不限於，可終止翻譯的脫框（off-frame）或-1及+ 1移位的閱讀框（例如，隱藏的終止）。框移位的終止元件包括出現在表現序列的第二閱讀框和第三閱讀框中的核苷酸三聯體，TAA、TAG和TGA。框移位的終止元件可能對防止通常對細胞有害的mRNA誤讀很重要。在一些實施方式中，終止元件係終止密碼子。
在一些實施方式中，表現序列包括聚A序列（例如，在表現序列的3’末端，例如終止元件的3’）。在一些實施方式中，聚A序列的長度大於10個核苷酸。在一個實施方式中，聚A序列的長度大於15個核苷酸（例如，至少或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、和3,000個核苷酸）。在一些實施方式中，根據國際專利公開案號WO 2019/118919 A1的[0202]-[0204]中對聚A序列的描述來設計聚A序列，將其藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，表現序列缺少聚A序列（例如，在表現序列的3’末端）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A、缺少聚A或具有經修飾的聚A以調節環狀多核糖核苷酸的一或多種特徵。在一些實施方式中，缺少聚A或具有經修飾的聚A的環狀多核糖核苷酸改善了一或多種功能特徵（例如免疫原性（例如，免疫或炎性響應的一或多種標誌物的水平）、半衰期和/或表現效率）。
國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了終止元件的其他實例，將其特此藉由援引以其全文併入。 間隔子序列
在一些實施方式中，本文所述之環狀多核糖核苷酸包括間隔子序列。在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括一或多個間隔子序列。間隔子係指在兩個相鄰的多核苷酸區域之間提供距離或靈活性的任何連續的核苷酸序列（例如，一或多個核苷酸）。間隔子可以存在於本文所述之任一核酸元件之間。間隔子還可以存在於本文所述核酸元件內。
間隔子的長度可為例如至少5個（例如，至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。在一些實施方式中，每個間隔子區的長度係至少5個（例如，至少10、至少15、至少20個）核糖核苷酸。每個間隔子區的長度可為例如 5至500個（例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個）核糖核苷酸。第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區可包括聚A序列。第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區可包括聚A-C序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括聚A-G序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括聚A-T序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括隨機序列。
在一些實施方式中，間隔子序列的長度可為，例如，至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、或至少30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係不多於100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係20至50個核苷酸。在某些實施方式中，間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。
間隔子序列可為聚A序列、聚A-C序列、聚C序列、或聚U序列。
在一些實施方式中，間隔子序列可為聚A-T、聚A-C、聚A-G或隨機序列。
在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性間隔子序列，將該申請特此藉由援引以其全文併入。 修飾
相對於參考序列（尤其是親本多核糖核苷酸），環狀多核糖核苷酸可以包括本揭露範圍內包括的一或多個取代、插入和/或添加、缺失和共價修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個轉錄後修飾（例如，加帽、切割、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、醯化、磷酸化、離胺酸和精胺酸殘基的甲基化、乙醯化、以及硫醇基團和酪胺酸殘基的亞硝基化等）。該一或多個轉錄後修飾可為任何轉錄後修飾，諸如已經在RNA中鑒定出的多於一百種不同的核苷修飾中的任一種（Rozenski, J, Crain, P和McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update[RNA修飾資料庫：1999年更新], Nucl Acids Res [核酸研究] 27: 196-97）。在一些實施方式中，第一分離核酸包括信使RNA（mRNA）。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括至少一個選自以下群組的核苷：如國際專利公開案號WO 2019/118919 A1的[0311]中描述的那些，將其藉由援引以其全文併入本文。
環狀多核糖核苷酸可包括任何有用的修飾，例如針對糖、核鹼基或核苷間鍵（例如針對連接的磷酸酯/針對磷酸二酯鍵/針對磷酸二酯主鏈）。嘧啶核鹼基的一或多個原子可被視需要經取代的胺基、視需要經取代的硫醇、視需要經取代的烷基（例如，甲基或乙基）或鹵代（例如，氯代或氟代）替代或取代。在某些實施方式中，在每個糖和核苷間鍵中存在修飾（例如，一或多個修飾）。修飾可為對去氧核糖核酸（DNA）、蘇糖核酸（TNA）、乙二醇核酸（GNA）、肽核酸（PNA）、鎖核酸（LNA）或其雜交體的核糖核酸（RNA）修飾。本文描述了其他修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一種N(6)甲基腺苷（m6A）修飾以增加翻譯效率。在一些實施方式中，m6A修飾可降低環狀多核糖核苷酸的免疫原性（例如，降低免疫或炎性響應的一或多種標誌物的水平）。
在一些實施方式中，修飾可以包括化學或細胞誘導的修飾。例如，細胞內RNA修飾之一些非限制性實例如Lewis和Pan在「RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions [核糖核酸的修飾和結構共同引導核糖核酸和蛋白的相互作用]」, Nat Reviews Mol Cell Biol [自然評論：分子細胞生物學], 2017, 18:202-10中所述。
在一些實施方式中，對環狀多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化學修飾可以增強免疫逃避。環狀多核糖核苷酸可以藉由本領域眾所周知的方法合成和/或修飾，如Current protocols in nucleic acid chemistry [核酸化學現行方案], Beaucage, S.L等人 (編輯), John Wiley & Sons [約翰·威利父子出版公司], 紐約市, 紐約州, 美國（將其特此藉由援引併入）中描述的那些方法。修飾包括例如末端修飾，如5'末端修飾（磷酸化（單、二和三磷酸化）、軛合、反向連接等）、3'末端修飾（軛合、DNA核苷酸、反向連接等）、鹼基修飾（例如，用穩定的鹼基、不穩定的鹼基或與擴展的配偶體庫鹼基配對的鹼基替代）、鹼基去除（脫鹼基核苷酸）或鹼基軛合。經修飾的核糖核苷酸鹼基還可以包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些實施方式中，舉幾個功能作用，鹼基修飾可以調節環狀多核糖核苷酸的表現、免疫響應、穩定性、亞細胞定位。在一些實施方式中，修飾包括雙正交核苷酸，例如 非天然鹼基。參見例如，Kimoto等人, Chem Commun (Camb) [化學通訊 (劍橋)], 2017, 53:12309, DOI: 10.1039/c7cc06661a，將該文獻藉由援引以其全文特此併入。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的一或多個核糖核苷酸的糖修飾（例如在2'位置或4'位置）或糖替代以及主鏈修飾可以包括磷酸二酯鍵的修飾或替代。環狀多核糖核苷酸之具體實例包括但不限於包括經修飾的主鏈或非天然核苷間鍵（如核苷間修飾，包括磷酸二酯鍵的修飾或替代）的環狀多核糖核苷酸。具有經修飾的主鏈的環狀多核糖核苷酸尤其包括在主鏈中不具有磷原子的那些。出於本申請之目的，並且如本領域中有時提及的，在其核苷間主鏈中不具有磷原子的經修飾的RNA也可以被認為是寡核苷。在特定實施方式中，環狀多核糖核苷酸將包括在其核苷間主鏈中具有磷原子的核糖核苷酸。
經修飾的環狀多核糖核苷酸主鏈可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（如3'-伸烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、亞膦酸酯、胺基磷酸酯（如3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫羰基胺基磷酸酯（thionophosphoramidate）、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5'鍵的硼烷磷酸酯，該等的2'-5'連接的類似物，以及具有相反極性的那些，其中相鄰的核苷單元對3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以帶負電荷或帶正電荷。
可摻入環狀多核糖核苷酸中的經修飾的核苷酸可在核苷間鍵（例如磷酸酯主鏈）上被修飾。在此，在多核苷酸主鏈之上下文中，短語「磷酸酯」和「磷酸二酯」可互換使用。可以藉由用不同的取代基替代一或多個氧原子來修飾主鏈磷酸酯基團。此外，經修飾的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述之另一個核苷間鍵合進行的對未修飾的磷酸酯部分的整體替代。經修飾的磷酸酯基團之實例包括但不限於硫代磷酸酯、亞磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯（boranophosphates/boranophosphate esters）、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的兩個非連接氧都被硫替代。也可以藉由用氮（橋連的胺基磷酸酯）、硫（橋連的硫代磷酸酯）和碳（橋連的亞甲基膦酸酯）替代連接氧來修飾磷酸酯連接子。
提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通過非天然硫代磷酸酯主鏈鍵賦予RNA和DNA聚合物穩定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增強的核酸酶抗性，並因此在細胞環境中具有更長的半衰期。與環狀多核糖核苷酸連接的硫代磷酸酯有望通過減弱細胞先天免疫分子的結合/激活來降低先天免疫響應。
在特定實施方式中，經修飾的核苷包括α-硫代-核苷（例如，5'-0-(l-硫代磷酸)-腺苷、5'-0-(l-硫代磷酸)-胞苷(a-硫代胞苷)、5'-0-(l-硫代磷酸)-鳥苷、5'-0-(l-硫代磷酸)-尿苷或5'-0-(1-硫代磷酸)-假尿苷）。
本文描述了可根據本揭露使用的其他核苷間鍵，包括不包含磷原子的核苷間鍵。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包括一或多種細胞毒性核苷。例如，細胞毒性核苷可以被摻入環狀多核糖核苷酸中，如雙功能修飾。細胞毒性核苷可以包括但不限於阿糖腺苷、5-氮雜胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、環戊烯基胞嘧啶、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、l-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他濱、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱、氟尿苷、吉西他濱、替加氟和尿嘧啶的組合、替加氟（(RS)-5-氟-l-(四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(lH,3H)-二酮）、曲沙他濱、替紮西他濱、2'-去氧-2'-亞甲基胞苷（DMDC）和6-巰基嘌呤。其他實例包括氟達拉濱磷酸酯、N4-山崳醯基-l-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕櫚醯基-l-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055（阿糖胞苷5'-花生酸酯）。
環狀多核糖核苷酸可以沿著分子的整個長度均一地修飾或可以不如此。例如，一或多種或所有類型的核苷酸（例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任一或多種或全部）在環狀多核糖核苷酸中，或在其給定的預定序列區中可以被或可以不被均一地修飾。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括肌苷，相對於病毒RNA，肌苷可以説明免疫系統將環狀多核糖核苷酸表徵為內源性。肌苷的摻入還可以介導改善RNA穩定性/減少降解。參見例如Yu, Z等人, (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as 「self」. [藉由ADAR1進行的RNA編輯將dsRNA標記為「自身」] Cell Res [細胞研究]. 25, 1283-1284，其藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸（或其給定序列區域）中的所有核苷酸均被修飾。在一些實施方式中，修飾可以包括可增強表現的m6A；可減弱免疫響應的肌苷；可增加RNA穩定性或翻譯通讀（交錯元件）的假尿苷；可增加穩定性的m5C；以及有助於亞細胞易位（例如，核定位）的2,2,7-三甲基鳥苷。
在環狀多核糖核苷酸的各個位置上可以存在不同的糖修飾、核苷酸修飾和/或核苷間鍵合（例如，主鏈結構）。熟悉該項技術者將理解，核苷酸類似物或其他一或多個修飾可以位於環狀多核糖核苷酸的任何一或多個位置，使得環狀多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修飾也可為非編碼區域修飾。環狀多核糖核苷酸可包括約1%至約100%的經修飾的核苷酸（相對於總核苷酸含量，或相對於一或多種類型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一或多種）或任何中間百分比（例如，1%至20%＞、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%和95%至100%）。 生產方法
本揭露提供了用於產生環狀多核糖核苷酸之方法，該等方法包括例如，重組技術或化學合成。例如，用於產生RNA環的DNA分子可以包括天然存在的核酸序列的DNA序列、其修飾形式、或編碼通常在自然界中不存在的合成多肽的DNA序列（例如，嵌合分子或融合蛋白）。DNA和RNA分子可以使用多種技術修飾，該等技術包括但不限於經典誘變技術和重組技術，如定點誘變、化學處理核酸分子以誘導突變、限制性酶切割核酸片段、連接核酸片段、聚合酶鏈反應（PCR）擴增或誘變核酸序列的選定區域、合成寡核苷酸混合物以及連接混合物基團以「建造」核酸分子混合物及其組合。
環狀多核糖核苷酸可以根據任何可用的技術來製備，該技術包括但不限於化學合成和酶促合成。在一些實施方式中，線性初級構建體或線性RNA可以被環化或連接以產生本文所述之circRNA。環化或連接的機制可通過以下方法來發生：如，化學、酶促、夾板連接或核酶催化的方法。新形成的5’-3’鍵聯可為分子內鍵或分子間鍵。例如，夾板連接酶（如SplintR®連接酶）可用於夾板連接。根據此方法，單股多核苷酸（夾板）（如單股DNA或RNA）可被設計成與線性多核糖核苷酸的兩端雜交，使得在與單股夾板雜交時可以將兩端並列。因此，夾板連接酶可以催化線性多核糖核苷酸並列的兩端連接，產生circRNA。在一些實施方式中，DNA或RNA連接酶可用於環狀多核苷酸的合成。作為一個非限制性實例，連接酶可為circ連接酶或環狀連接酶。
在另一個實例中，線性多核糖核苷酸的5’或3’末端可以編碼連接酶核酶序列，使得在體外轉錄期間，所得線性circRNA包括能夠將線性多核糖核苷酸的5’末端與線性多核糖核苷酸的3’末端連接的活性核酶序列。連接酶核酶可以源自第I組內含子、D型肝炎病毒、髮夾核酶，或者可以藉由SELEX（藉由指數富集進行的配體系統進化）進行選擇。
在另一個實例中，可藉由使用至少一個非核酸部分將線性多核糖核苷酸環化或連接。例如，至少一個非核酸部分可與線性多核糖核苷酸5’端附近或3’端附近的區域或特徵反應，以環化或連接線性多核糖核苷酸。在另一個實例中，至少一個非核酸部分可以位於或連接至或靠近線性多核糖核苷酸的5’端或3’端。非核酸部分可為同源的或異源的。作為非限制性實例，非核酸部分可為鍵，如疏水鍵、離子鍵、可生物降解的鍵或可切割的鍵。作為另一個非限制性實例，非核酸部分係連接部分。作為又一個非限制性實例，非核酸部分可為寡核苷酸或肽部分，諸如，如本文所述之適配體或非核酸連接子。
在另一個實例中，線性多核糖核苷酸可以藉由自剪接環化或連接。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸可包括自連接的環E序列。在另一個實施方式中，線性多核糖核苷酸可包括自環化內含子（例如，5’和3’剪接連接）或自環化催化內含子，如I型、II型或III型內含子。I型內含子自剪接序列之非限制性實例可包括源自T4噬菌體基因td的自剪接排列內含子-外顯子序列，和鳥類眼原蟲、魚腥藍細菌（cyanobacterium Anabaena）前tRNA-Leu基因或鳥類眼原蟲前rRNA的間插序列（IVS）rRNA。
在一些實施方式中，多核糖核苷酸可包括催化內含子片段，如I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半。第一和第二退火區可以位於催化內含子片段內。I型催化內含子係自剪接核酶，該等自剪接核酶通過雙金屬離子磷醯基轉移機制催化其自身從mRNA、tRNA和rRNA先質上切除。重要的是，RNA本身自催化內含子的去除而不需要外源酶，如連接酶。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因或鳥類眼原蟲前rRNA。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因，並且3’外顯子片段包括第一退火區，並且5’外顯子片段包括第二退火區。第一退火區可包括例如5至50個，例如10至15個（例如，10、11、12、13、14或15個）核糖核苷酸，並且第二退火區可包括例如，5至50個，例如10至15個（例如，10、11、12、13、14或15個）核糖核苷酸。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自鳥類眼原蟲前rRNA，並且I型催化內含子片段的3’一半包括第一退火區，並且5’外顯子片段包括第二退火區。在一些實施方式中，3’外顯子包括第一退火區，並且I型催化內含子片段的5’一半包括第二退火區。第一退火區可包括例如，6至50個，例如10至16個（例如，10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸，並且第二退火區可包括例如6至50個，例如10至16個（例如，10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因、鳥類眼原蟲前rRNA基因或T4噬菌體td基因。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自T4噬菌體td基因。3’外顯子片段可包括第一退火區，並且I型催化內含子片段的5’部分可包括第二退火區。第一退火區可包括例如2至16個，例如10至16個（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸，並且第二退火區可包括例如2至16個，例如10至16個（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半係線性多核苷酸的5’端。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半係線性多核糖核苷酸的3’端。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- AACAACAGATAACTTACAGCTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAATG-3’（SEQ ID NO: 97）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’- AAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTT-3’（SEQ ID NO: 98）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 97的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 98的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- CTTCTGTTGATATGGATGCAGTTCACAGACTAAATGTCGGTCGGGGAAGATGTATTCTTCTCATAAGATATAGTCGGACCTCTCCTTAATGGGAGCTAGCGGATGAAGTGATGCAACACTGGAGCCGCTGGGAACTAATTTGTATGCGAAAGTATATTGATTAGTTTTGGAGTACTCG-3’（SEQ ID NO: 99）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’- AAATAGCAATATTTACCTTTGGAGGGAAAAGTTATCAGGCATGCACCTGGTAGCTAGTCTTTAAACCAATAGATTGCATCGGTTTAAAAGGCAAGACCGTCAAATTGCGGGAAAGGGGTCAACAGCCGTTCAGTACCAAGTCTCAGGGGAAACTTTGAGATGGCCTTGCAAAGGGTATGGTAATAAGCTGACGGACATGGTCCTAACCACGCAGCCAAGTCCTAAGTCAACAGAT-3’（SEQ ID NO: 100）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 99的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 100的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- GGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATG-3’（SEQ ID NO: 101）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’- TAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACT-3’（SEQ ID NO: 102）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 101的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 102的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’-TAAACAACTAACAGCTTTAGAAGGTGCAGAGACTAGACGGGAGCTACCCTAACGGATTCAGCCGAGGGTAAAGGGATAGTCCAATTCTCAACATCGCGATTGTTGATGGCAGCGAAAGTTGCAGAGAGAATGAAAATCCGCTGACTGTAAAGGTCGTGAGGGTTCGAGTCCCTCCGCCCCCA-3’（SEQ ID NO: 103）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-ACGGTAGACGCAGCGGACTTAGAAAACTGGGCCTCGATCGCGAAAGGGATCGAGTGGCAGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAAACTTTAAACATTMAAGTCATGGCAATCCTGAGCCAAGCTAAAGC-3’（SEQ ID NO: 104）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 103的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 104的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- TTAAACTCAAAATTTAAAATCCCAAATTCAAAATTCCGGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTAAAGCCGAGGGTAAAGGGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCTGAAGTTGCTGAAGCAACAAGGCAGTAGTGAAAGCTGCGAGAGAATGAAAATCCGTTGACTGTAAAAAGTCGTGGGGGTTCAAGTCCCCCCACCCCC-3’（SEQ ID NO: 105）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTTAAGTGGAAGCTCTCAAATTCAGGGAAACCTAAATCTGAATACAGATATGGCAATCCTGAGCCAAGCCCAGAAAATTTAGACTTGAGATTTGATTTTGGAG-3’（SEQ ID NO: 106）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 105的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 106的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- GGCTTTCAATTTGAAATCAGAAATTCAAAATTCAGGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTAAAGGCGAGGGTAAAGGGAGAGTCCAATTCTTAAAGCCTGAAGTTGTGCAAGCAACAAGGCAACAGTGAAAGCTGTGGAAGAATGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGGGGGTTCAAGTCCCCCCACCCCC-3’（SEQ ID NO: 107）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTCAAGTGGAAGCTCTCAAATTCAGGGAAACCTAAATCTGAATACAGATATGGCAATCCTGAGCCAAGCCCGGAAATTTTAGAATCAAGATTTTATTTT-3’（SEQ ID NO: 108）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 107的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 108的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTTAAAGGCGAGGGTGAAGGGACAGTCCAGACCACAAACCAGTAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGATGGTAAGCATAACCCGAAGGTCAGTGGTTCAAATCCACTTCCCGCCACCAAATTAAAAAAACAATAA-3’（SEQ ID NO: 109）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTTAAAGGCGAGGGTGAAGGGACAGTCCAGACCACAAACCAGTAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGATGGTAAGCATAACCCGAAGGTCAGTGGTTCAAATCCACTTCCCGCCACCAAATTAAAAAAACAATAA-3’（SEQ ID NO: 110）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 109的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 110的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- ACAACAGATAACTTACTAACTTACAGCTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAATGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA-3’（SEQ ID NO: 111）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-AGACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTTAGTAAGTT-3’（SEQ ID NO: 112）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 111的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 112的序列。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半與5’- AACAACAGATAACTTACTAGTTACTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAATGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA-3’（SEQ ID NO: 113）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半與5’-AGACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTT-3’（SEQ ID NO: 114）的序列具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）的序列同一性。
在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半具有SEQ ID NO: 113的序列，並且I型催化內含子片段的5’一半具有SEQ ID NO: 114的序列。
在另一個實例中，線性多核糖核苷酸可以由非核酸部分環化或連接，該非核酸部分引起線性多核糖核苷酸的5’和3’末端、附近或與之相連的原子、分子表面之間的吸引力。可以藉由分子間作用力或分子內作用力來環化或連接一或多個線性多核糖核苷酸。分子間作用力之非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導偶極力、誘導偶極誘導偶極力、凡得瓦力和倫敦分散力。分子內作用力之非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、抓氫鍵（agnostic bond）、偶極鍵、軛合、超軛合和反向鍵。
在另一個實例中，線性多核糖核苷酸可包含靠近5’端和靠近3’端的核酶RNA序列。當序列暴露於核酶的其餘部分時，核酶RNA序列可以共價地連接至肽。共價連接至5’端和3’端附近的核酶RNA序列的肽可以相互締合，從而導致線性多核糖核苷酸環化或連接。在另一個實例中，在使用本領域已知的各種方法（如但不限於蛋白質連接）進行連接之後，共價連接至5’端和3’端附近的核酶RNA的肽可導致線性初級構建體或線性mRNA環化或連接。用於在本發明之線性初級構建體或線性多核糖核苷酸中使用的核酶之非限制性實例，或者摻入或共價地連接肽之方法的非窮舉列表在美國專利申請案號US 20030082768中描述，將該專利申請的內容藉由援引以其全文併入本文。
在又另一實例中，環化的化學方法可用於產生環狀多核糖核苷酸。這樣的方法可以包括但不限於點擊化學（例如，基於炔烴和疊氮化物的方法，或可點擊的鹼基）、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半縮醛胺-亞胺交聯、鹼基修飾、及其任何組合。
在另一個實例中，可以使用無細胞系統中（例如，藉由體外 轉錄）轉錄的去氧核糖核苷酸模板產生線性RNA來產生環狀多核糖核苷酸。線性多核糖核苷酸產生剪接相容的多核糖核苷酸，該多核糖核苷酸可以自剪接以產生環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以下來產生環狀多核糖核苷酸之方法（例如，在無細胞系統中）：提供線性多核糖核苷酸；以及在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3'和5'剪接位點的條件下自剪接線性多核糖核苷酸；從而產生環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以下來產生環狀多核糖核苷酸之方法：提供編碼線性多核糖核苷酸的去氧核糖核苷酸；在無細胞系統中轉錄去氧核糖核苷酸以產生線性多核糖核苷酸；視需要純化剪接相容的線性多核糖核苷酸；以及在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3’和5’剪接位點的條件下自剪接線性多核糖核苷酸，從而產生環狀多核糖核苷酸。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以下來產生環狀多核糖核苷酸之方法：提供編碼線性多核糖核苷酸的去氧核糖核苷酸；在無細胞系統中轉錄去氧核糖核苷酸以產生線性多核糖核苷酸（其中該轉錄在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3’和5’剪接位點的條件下在溶液中發生），從而產生環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含5’斷裂內含子和3’斷裂內含子（例如，用於產生環狀多核糖核苷酸的自剪接構建體）。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含5'退火區和3'退火區。
用於體外轉錄和/或自剪接的合適條件可包括在一或多個方面模擬生理條件的任何條件（例如，溶液或緩衝液，如水性緩衝液或溶液）。在一些實施方式中，合適的條件包括在0.1-100 mM之間的Mg2+離子或其鹽（例如，1-100 mM、1-50 mM、1-20 mM、5-50 mM、5-20 mM或5-15 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括在1-1000 mM之間的K +離子或其鹽，如KCl（例如，1-1000 mM、1-500 mM、1-200 mM、50-500 mM、100-500 mM或100-300 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括在1-1000 mM之間的Cl-離子或其鹽，如KCl（例如，1-1000 mM、1-500 mM、1-200 mM、50-500 mM、100-500 mM或100-300 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括在0.1-100 mM之間的Mn2+離子或其鹽，如MnCl2（例如，0.1-100 mM、0.1-50 mM、0.1-20 mM、0.1-10 mM、0.1-5 mM、0.1-2 mM、0.5- 50 mM、0.5-20 mM、0.5-15 mM、0.5-5 mM、0.5-2 mM或0.1-10 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括二硫蘇糖醇（DTT）（例如，1-1000 μM、1-500 μM、1-200 μM、50-500 μM、100-500 μM、100-300 μM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、0.1-20 mM、0.1-10 mM、0.1-5 mM、0.1-2 mM、0.5-50 mM、0.5-20 mM、0.5-15 mM、0.5-5 mM、0.5-2 mM或0.1-10 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括在0.1 mM與100 mM之間的核糖核苷三磷酸（NTP）（例如，0.1-100 mM、0.1-50 mM、0.1-10 mM、1-100 mM、1-50 mM或1-10 mM）。在一些實施方式中，合適的條件包括4至10的pH（例如，5至9的pH、6至9的pH或6.5至8.5的pH）。在一些實施方式中，合適的條件包括4°C至50°C的溫度（例如，10°C至40°C、15°C至40°C、20°C至40°C、或30°C至40°C）。
在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸從去氧核糖核酸（例如，本文所述之去氧核糖核酸，如DNA載體、線性化DNA載體、或cDNA）產生。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸藉由在無細胞系統中轉錄（例如，體外 轉錄）從去氧核糖核酸進行轉錄。
在另一個實例中，環狀多核糖核苷酸可以在細胞，例如原核細胞或真核細胞中產生。在一些實施方式中，向細胞提供外源多核糖核苷酸（例如，本文所述之線性多核糖核苷酸或編碼本文所述之線性多核糖核苷酸的轉錄的DNA分子）。線性多核糖核苷酸可以在細胞中從向細胞提供的外源DNA分子轉錄。線性多核糖核苷酸可以在細胞中從向該細胞瞬時提供的外源重組DNA分子轉錄。在一些實施方式中，外源DNA分子不整合到細胞的基因組中。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸在細胞中從整合到細胞基因組中的重組DNA分子轉錄。
在一些實施方式中，細胞係原核細胞。在一些實施方式中，包括本文所述之多核糖核苷酸的原核細胞可為細菌細胞或古細菌細胞。例如，包括本文所述之多核糖核苷酸的原核細胞可為大腸桿菌、嗜鹽古細菌（例如，沃氏嗜鹽富饒菌（ Haloferax volcaniii））、鞘胺醇單胞菌（ Sphingomonas）、藍細菌（例如，細長聚球藻（ Synechococcus elongatus）、螺旋藻（ Spirulina）（節旋藻（ Arthrospira））屬物種和集胞藻屬物種（Synechocystis spp.））、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、放線菌（例如，野村菌屬（ Nonomuraea）、北裡孢菌屬（ Kitasatospora）或高溫雙岐菌屬（ Thermobifida））、芽孢桿菌屬物種（ Bacillus spp）（例如，枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）、炭疽芽孢桿菌（ Bacillus anthracis）、蠟樣芽孢桿菌（ Bacillus cereus））、β變形桿菌（例如，伯克氏菌屬（ Burkholderia））、α變形桿菌（例如，農桿菌屬（ Agrobacterium））、假單胞菌屬（ Pseudomonas）（例如，戀臭假單胞菌（ Pseudomonas putida））和腸桿菌。原核細胞可以在培養基中生長。原核細胞可以包含在生物反應器中。
該細胞可為真核細胞。在一些實施方式中，真核細胞係單細胞真核細胞。在一些實施方式中，單細胞真核生物係單細胞真菌細胞，如酵母細胞（例如，釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和其他酵母屬物種（ Saccharomyces spp.）、酒香酵母屬物種（ Brettanomyces spp）、裂殖酵母屬物種（ Schizosaccharomyces spp）、有孢圓酵母屬物種（ Torulaspora spp）和畢赤酵母屬物種（ Pichia spp））。在一些實施方式中，單細胞真核細胞係單細胞動物細胞。單細胞動物細胞可為從多細胞動物分離並在培養中生長的細胞，或其子細胞。在一些實施方式中，單細胞動物細胞可以去分化。在一些實施方式中，單細胞真核細胞係單細胞植物細胞。單細胞植物細胞可為從多細胞植物中分離並在培養中生長的細胞，或其子細胞。在一些實施方式中，單細胞植物細胞可以去分化。在一些實施方式中，單細胞植物細胞來自植物愈傷組織。在實施方式中，單細胞細胞係植物細胞原生質體。在一些實施方式中，單細胞真核細胞係單細胞真核藻類細胞，如單細胞綠藻、矽藻、眼蟲、或甲藻。目的單細胞真核藻類之非限制性實例包括杜氏鹽藻（ Dunaliella salina）、普通小球藻（ Chlorella vulgaris）、食用小球藻（ Chlorella zofingiensis）、雨生紅球藻（ Haematococcus pluvialis）、富油新綠藻（ Neochloris oleoabundans）和其他新綠球藻屬物種（ Neochloris spp）、原管藻（ Protosiphon botryoides）、布朗葡萄藻（ Botryococcus braunii）、隱球菌屬物種（ Botryococcus braunii）、萊茵衣藻（ Chlamydomonas reinhardtii）和其他衣藻屬物種（ Chlamydomonas spp）。在一些實施方式中，單細胞真核細胞係原生生物細胞。在一些實施方式中，單細胞真核細胞係原生動物細胞。
在一些實施方式中，真核細胞係多細胞真核生物的細胞。例如，多細胞真核生物可選自由以下組成之群組：脊椎動物、無脊椎動物、多細胞真菌、多細胞藻類和多細胞植物。在一些實施方式中，真核生物體係人。在一些實施方式中，真核生物體係非人脊椎動物。在一些實施方式中，真核生物體係無脊椎動物。在一些實施方式中，真核生物體係多細胞真菌。在一些實施方式中，真核生物體係多細胞植物。在一些實施方式中，真核細胞係人的細胞或非人類哺乳動物的細胞，如非人類靈長類動物（例如，猴子、猿）、有蹄類動物（例如，牛科動物，包括牛、水牛、野牛、綿羊、山羊和麝牛；豬；駱駝科動物，包括駱駝、美洲駝、和羊駝；鹿，羚羊；以及馬科動物，包括馬和驢）、食肉動物（例如，狗、貓）、齧齒動物（例如，大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、松鼠）或兔類動物（例如，兔、野兔）。在一些實施方式中，真核細胞係鳥的細胞，如以下鳥類分類群的成員：雞形目（例如，雞、火雞、雉雞、鵪鶉）、雁形目（例如，鴨、鵝）、古顎總目 （例如，鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如，鴿子、野鴿）或鸚形目（例如，鸚鵡）。在一些實施方式中，真核細胞係節肢動物（例如，昆蟲、蛛形綱、甲殼動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲或軟體動物的細胞。在實施方式中，真核細胞係多細胞植物的細胞，如被子植物（其可為雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如，針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、馬尾植物、石鬆類、或苔蘚植物。在實施方式中，真核細胞係真核多細胞藻類的細胞。
該等真核細胞可以在培養基中生長。該等真核細胞可以包含在生物反應器中。
生物反應器之實例包括但不限於攪拌罐（例如，充分混合的）生物反應器和管式（例如，活塞流）生物反應器、氣升式生物反應器、膜攪拌罐、旋轉過濾攪拌罐、振動混合器、流化床反應器、和膜生物反應器。操作生物反應器的模式可為間歇的或連續的過程。當試劑和產物流連續地進出系統時，生物反應器係連續的。間歇式生物反應器可以具有連續的再循環流，但沒有連續的試劑進料或產物收穫。本揭露之一些方法涉及大規模生產環狀多核糖核苷酸。對於大規模生產方法，該方法可以在1升（L）至50 L或更多（例如，5 L、10 L、15 L、20 L、25 L、30 L、35 L、40 L、45 L、50 L或更多）的體積中進行。在一些實施方式中，該方法可以在5 L至10 L、5 L至15 L、5 L至20 L、5 L至25 L、5 L至30 L、5 L至35 L、5 L至40 L、5 L至45 L、10 L至15 L、10 L至20 L、10 L至25 L、20 L至30 L、10 L至35 L，10 L至40 L、10 L至45 L、10 L至50 L、15 L至20 L、15 L至25 L、15 L至30 L、15 L至35 L、15 L至40 L、15 L至45 L或15 L至50 L的體積中進行。在一些實施方式中，生物反應器可產生至少1 g的環狀RNA。在一些實施方式中，生物反應器可以產生1-200 g環狀RNA（例如，1-10 g、1-20g、1-50 g、10-50 g、10-100 g、50-100 g、50-200 g環狀RNA）。在一些實施方式中，產生的量係測量值/升（例如，1-200 g/升）、/批或反應（例如，1-200 g/批或反應）、或/單位時間（例如，1-200 g/小時或/天）。在一些實施方式中，可以串聯使用多於一個生物反應器以增加產生能力（例如，可以串聯使用一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、或九個生物反應器）。
製備本文所述之環狀多核糖核苷酸的方法描述於以下中：例如，Khudyakov和Fields, Artificial DNA: Methods and Applications[人工DNA：方法與應用], CRC出版社（2002）；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications[ 合成生物學：工具和應用 ](第一版), Academic Press [學術出版社] (2013)；和Egli和Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化學與生物學], (第一版), Wiley-VCH [威利-VCH出版社] (2012)。
其他地方也描述了合成環狀多核糖核苷酸的各種方法（參見，例如，美國專利案號US 6210931、美國專利案號US 5773244、美國專利案號US 5766903、美國專利案號US 5712128、美國專利案號US 5426180、美國公開案號US 20100137407、國際公開案號W01992001813和國際公開案號W02010084371，以及Petkovic 等人, Nucleic Acids Res [核酸研究]. 43:2454-65 (2015)；將其各自內容藉由援引以其全文併入本文）。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係純化的，例如，去除了游離核糖核酸、線性或帶切口的RNA、DNA、蛋白質等。在一些實施方式中，可以藉由本領域通常使用的任何已知方法純化環狀多核糖核苷酸。純化方法之非限制性實例包括柱層析法、凝膠切除、粒徑排阻等。 免疫接種
在一些實施方式中，本揭露之方法包括用包含本文揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物為受試者免疫接種。在一些實施方式中，免疫原由環狀多核糖核苷酸表現。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導針對由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原的免疫響應。在一些實施方式中，免疫接種在受試者中誘導免疫響應（例如，誘導與由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原結合的抗體的產生）。在一些實施方式中，免疫接種係為了治療或預防受試者（例如，人類受試者）的疾病、障礙或病症。在一些實施方式中，免疫接種係為了在受試者中產生抗體（例如在非人哺乳動物中產生抗體用於純化）。在一些實施方式中，免疫原性組成物在單一組成物中包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在一些實施方式中，受試者進一步用第二佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用第二免疫原性組成物免疫接種。
受試者用包含任何數量的環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。受試者用例如包含至少1種環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。受試者用例如包括至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少20種不同的環狀多核糖核苷酸或更多種不同的環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含至多1種環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1種環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。在一些實施方式中，受試者用包含約1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-20、2-15、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-15、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-15、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、4-4、4-3、5-20、5-15、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、5-10、10-15或15-20種不同的環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種。不同的環狀多核糖核苷酸具有彼此不同的序列。例如，它們可以包括或編碼不同的免疫原、重疊的免疫原、相似的免疫原或相同的免疫原（例如，具有相同或不同的調控元件、起始序列、啟動子、終止元件或本揭露之其他元件）。在受試者用包含兩或更多種不同的環狀多核糖核苷酸的一或多種免疫原性組成物免疫接種的情況下，這兩或更多種不同的環狀多核糖核苷酸可以處於相同或不同的免疫原性組成物中並且同時或在不同時間免疫接種。可以將包含兩或更多種不同的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、第一佐劑或其組合。在特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸與不含任何載劑的稀釋劑的免疫原性組成物用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者。在另一個特定實施方式中，免疫原性組成物包含本文所述之環狀多核糖核苷酸和第一佐劑。
在某些實施方式中，進一步向受試者投與第二佐劑。佐劑增強先天免疫響應，繼而增強受試者中的適應性免疫響應。佐劑可為如下所討論的任何佐劑。在某些實施方式中，佐劑作為免疫原性組成物的一部分與環狀多核糖核苷酸一起配製。在某些實施方式中，佐劑不是包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物的一部分。在某些實施方式中，佐劑與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物分開投與。在這方面，佐劑與包括環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與於受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與佐劑。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與佐劑。將佐劑投與到與包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物相同的解剖位置或不同的解剖位置。
在一些實施方式中，受試者用第二藥劑，例如不是環狀多核糖核苷酸的疫苗（如下所述）進一步免疫接種。該疫苗與包括環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物共同投與（例如同時投與）或在不同的時間投與於受試者。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時或24小時，或介於之間的任何分鐘數或小時數，投與該疫苗。例如，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。在一些實施方式中，在包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77或84天，或介於之間的任何天數，投與該疫苗。
受試者可以用免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種任何合適的次數，以實現所需的響應。例如，初免-加強免疫接種策略可用於引發全身和/或黏膜免疫。可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種受試者例如，至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或至少15次或更多次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種，至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多15次或至多20次或更少次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。
在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種一次。在一些實施方式中，可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種受試者兩次。在一些實施方式中，可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種受試者三次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種四次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種五次。在一些實施方式中，受試者可以用本揭露之免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種七次。
可以選擇合適的時間間隔以間隔兩次或更多次免疫接種。該等時間間隔可以適用於用相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種多次，例如，相同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合可以經由相同的免疫接種途徑或不同的免疫接種途徑以相同的量或不同的量投與。該等時間間隔可以適用於用不同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合進行多次免疫接種，例如，不同免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如蛋白質亞基疫苗）或其組合可以經由相同的免疫接種途徑或不同的免疫接種途徑以相同的量或不同的量投與。該等時間間隔可適用於用不同藥劑，例如，包含第一環狀多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包含第二環狀多核糖核苷酸的第二免疫原性組成物進行免疫接種。該等時間間隔可適用於用不同藥劑，例如，包括第一環狀多核糖核苷酸的第一免疫原性組成物和包括蛋白質免疫原（例如，蛋白質亞基）的第二免疫原性組成物進行免疫接種。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、40、48或72小時。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18、20、21、24、28或30天。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8週。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過約1、2、3、4、5、6、7或8個月。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少8小時、至少9小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少24小時、至少36小時或至少72小時或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多1小時、至多2小時、至多3小時、至多4小時、至多5小時、至多6小時、至多7小時、至多8小時、至多9小時、至多10小時、至多15小時、至多20小時、至多24小時、至多36小時或至多72小時或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天或至少30天或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多15天、至多20天、至多21天、至多22天、至多23天、至多24天、至多25天、至多26天、至多27天、至多28天、至多29天、至多30天、至多32天、至多34天或至多36天或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週或至少8週或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2週、至多3週、至多4週、至多5週、至多6週、至多7週、至多8週或更少時間。
在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月或至少8個月或更長時間。在一些實施方式中，兩次免疫接種之間經過至多2個月、至多3個月、至多4個月、至多5個月、至多6個月、至多7個月、至多8個月、至多9個月、至多10個月、至多11個月或至多12個月或更少時間。
在一些實施方式中，該方法包括向受試者預投與一種藥劑以改善對包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性響應。在一些實施方式中，藥劑係如本文揭露的免疫原（例如，蛋白質免疫原）。例如，該方法包括在投與包含編碼蛋白質免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸前1至7天投與蛋白質免疫原。在一些實施方式中，在投與包括編碼蛋白質免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸前1、2、3、4、5、6或7天投與蛋白質免疫原。蛋白質免疫原可以作為蛋白質製劑投與，在質體（pDNA）中編碼，存在於病毒樣顆粒（VLP）中，以脂質奈米顆粒的形式配製等。
在一些實施方式中，該方法包括在向受試者投與了包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸之後，向受試者投與一種藥劑以改善對包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的免疫原性響應。在一些實施方式中，藥劑係如本文揭露的免疫原（例如，蛋白質免疫原）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含編碼蛋白質免疫原的序列。例如，該方法包括在向受試者投與包括編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸的1年內（例如，在11個月、10個月、9個月、8個月、7個月、6個月、5個月、4個月、3個月、2個月和1個月內）投與蛋白質免疫原。在一些實施方式中，該方法包括向受試者投與本文所述之任一種環狀多核糖核苷酸或本文所述之任一種免疫原性組成物和蛋白質亞基。
在一些實施方式中，蛋白質免疫原具有與由環狀多核糖核苷酸編碼的免疫原相同的胺基酸序列。例如，多肽免疫原可對應於由環狀多核糖核苷酸的序列編碼的多肽免疫原（例如，與之具有90%、95%、96%、97%、98%或100%的胺基酸序列同一性）。在一些實施方式中，蛋白質免疫原具有與由環狀多核糖核苷酸編碼的免疫原的胺基酸序列不同的胺基酸序列。例如，多肽免疫原與由環狀多核糖核苷酸的序列編碼的多肽免疫原具有少於90%（例如，80%、70%、30%、20%或10%）的胺基酸序列同一性。
受試者可以在任何合適數目的解剖部位用免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合免疫接種。可以將相同的免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於多個解剖部位，可以將包括相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於不同的解剖部位，可以將包括相同或不同的環狀多核糖核苷酸的不同免疫原性組成物、佐劑、疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合投與於相同的解剖部位，或其任何組合。例如，可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於兩個不同的解剖部位，和/或可以將包含環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物投與於一個解剖部位，並且可以將佐劑投與於不同的解剖部位。
任兩或更多個解剖途徑的免疫接種可以經由相同的免疫接種途徑（例如，肌內）或藉由兩或更多種免疫接種途徑來進行。在一些實施方式中，將本揭露之包括環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包括環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物、佐劑或疫苗（例如，蛋白質亞基疫苗）或其組合向受試者的至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個或至多10個解剖部位或更少解剖部位免疫接種。在一些實施方式中，將本揭露之包括環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物或佐劑免疫接種至受試者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個解剖部位。
免疫接種可以經由任何合適的途徑。免疫接種途徑之非限制性實例包括靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外、胸骨內、腦內、眼內、病灶內、腦室內、腦池內或實質內，例如注射和輸注。在一些情況下，免疫接種可以經由吸入進行。可以藉由相同或不同的途徑進行兩次或更多次免疫接種。
可以向本揭露之受試者投與任何適量的環狀多核糖核苷酸。例如，受試者可以用至少約1 ng、至少約10 ng、至少約100 ng、至少約1 μg、至少約10 μg、至少約100 μg、至少約1 mg、至少約10 mg、至少約100 mg或至少約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用至多約1 ng、至多約10 ng、至多約100 ng、至多約1 μg、至多約10 μg、至多約100 μg、至多約1 mg、至多約10 mg、至多約100 mg或至多約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。在一些實施方式中，受試者可以用約1 ng、約10 ng、約100 ng、約1 μg、約10 μg、約100 μg、約1 mg、約10 mg、約100 mg或約1 g的環狀多核糖核苷酸免疫接種。
在一些實施方式中，該方法進一步包括評價受試者對免疫原的抗體響應。在一些實施方式中，評價係在投與包含編碼免疫原的序列的環狀多核糖核苷酸之前和/或之後。 抗體的產生和純化
用本文所述之多核糖核苷酸（例如，編碼免疫原（包括多聚化結構域）的多核糖核苷酸）免疫接種受試者可在受試者中誘導產生與由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原結合的抗體（例如，產生抗體）。在一些實施方式中，免疫接種係為了在受試者（例如，人或非人動物）中產生抗體，該等抗體係從受試者中定量或純化的（例如，用於診斷或治療用途）。因此，本發明之環狀多核糖核苷酸可用於產生多株或單株抗體（例如，多株或單株抗體）之方法中。
例如，本揭露提供了向非人動物（例如，非人哺乳動物，如山羊、豬、兔、大鼠、小鼠、美洲駝、駱駝、馬、驢或牛（奶牛））投與本文所述之環狀多核糖核苷酸（例如，編碼免疫原（包括多聚化結構域）的）。環狀多核糖核苷酸可以根據本文所述之任何組成物、配製物、途徑或投與、量或給藥方案投與（例如，視需要與佐劑一起，在同一組成物中或作為給藥方案的一部分投與）。在一些實施方式中，非人動物具有人源化免疫系統（例如，具有人源化免疫系統的牛）。
可以從用環狀多核糖核苷酸免疫接種的受試者中收集包括由包括如本文揭露的環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物產生的多株抗體的血漿。可以定量（例如，用於人類受試者的診斷目的）或純化（例如，用於在治療方法中使用或用於單株抗體的開發）該等多株抗體。血漿可以藉由熟悉該項技術者已知的方法，例如經由血漿去除術來收集。可以從同一受試者收集血漿一次或多次，例如，在免疫接種後的給定時間內各自多次、免疫接種後多次、免疫接種之間多次、或其任意組合。
與免疫原（包括多聚化結構域）特異性結合的抗體或其片段（例如，多株抗體，如人或人源化多株抗體）可藉由本文所述之方法產生。可以藉由熟悉該項技術者已知的方法從血液（例如，從血漿或血清）中純化抗體或其片段。
可以使用熟悉該項技術者熟知的技術從血漿中純化多株抗體。例如，將血漿pH調節至4.8（例如，滴加20%乙酸），以1.0的辛酸/總蛋白比率用辛酸進行分級分離，然後離心澄清（例如，在室溫下10,000 g離心20 min）。將含有多株抗體（例如，IgG多株抗體）的上清液用1 M tris中和至pH 7.5，0.22 μM過濾，並用抗人免疫球蛋白特異性柱（例如，抗人IgG輕鏈特異性柱）進行親和力純化。多株抗體藉由特異性結合雜質（例如來自非人動物的非人抗體）的親和柱進一步純化。將多株抗體儲存在合適的緩衝液，例如由10 mM麩胺酸單鈉鹽、262 mM D-山梨糖醇和吐溫（Tween）（0.05 mg/ml）（pH 5.5）組成的無菌過濾緩衝液中。測定純化的多株抗體的量和濃度。進行HPLC粒徑排阻層析法以確定是否存在聚集物或多聚體。在一些實施方式中，人多株抗體從具有人源化免疫系統的非人類動物根據Beigel, JH等人, Lancet Infect. Dis. [柳葉刀感染病學], 18:410-18 (2018)（包括補充附錄）純化，其藉由援引以其全文併入本文。
本揭露還提供了在人類受試者中產生抗體，例如 用於治療性治療和/或診斷之方法。例如，本揭露提供了在投與本文所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物後，定量受試者中抗免疫原抗體的水平之方法。可以藉由本領域已知的方法（例如，進行抗體滴度測定）進行定量，例如藉由從受試者獲得血液樣本，並使用標準技術（如酶聯免疫測定（ELISA））定量抗免疫原抗體水平。抗體也可以藉由熟悉該項技術者已知的方法純化。 佐劑
佐劑會增強在接受佐劑和/或包含該佐劑的免疫原性組成物的受試者中引發的免疫響應（體液和/或細胞免疫響應）。在一些實施方式中，如本文所揭露的，將佐劑投與於受試者。在一些實施方式中，佐劑用於本文所述之方法中以產生如本文所述之免疫響應。在特定實施方式中，佐劑用於促進受試者中針對由環狀多核糖核苷酸表現的免疫原的免疫響應。在一些實施方式中，佐劑和多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物，並投與於受試者。在一些實施方式中，佐劑和環狀多核糖核苷酸在分開的組成物中共同投與。在一些實施方式中，將佐劑與環狀多核糖核苷酸混合或配製為單一組成物以獲得免疫原性組成物，將該免疫原性組成物投與於受試者。
佐劑可為環狀多核糖核苷酸的組分（例如，多核糖核苷酸序列），可為由多核糖核苷酸的表現序列編碼的多肽佐劑，可為並非由多核糖核苷酸編碼的分子（例如小分子、多肽或核酸分子）。佐劑可以與多核糖核苷酸一起配製在同一藥物組成物中。佐劑可以與多核糖核苷酸組合分開投與（例如，作為單獨的藥物組成物）。
在一些實施方式中，佐劑由環狀多核糖核苷酸編碼。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼多於一種佐劑。例如，環狀多核糖核苷酸編碼2至100種佐劑。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼2至10種佐劑。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼2種佐劑。由環狀多核糖核苷酸編碼的一或多種佐劑可包括N端訊息序列，例如，將表現的多肽佐劑引導至分泌途徑的N端訊息序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼3種佐劑。在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼4種佐劑。在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼5種佐劑。在一些實施方式中，佐劑由編碼一或多種免疫原的同一多核糖核苷酸編碼。佐劑和免疫原可以在同一多核糖核苷酸上共同遞送。在一些實施方式中，由多核糖核苷酸編碼的佐劑係作為先天性免疫系統刺激因子的序列（例如，多核糖核苷酸序列）。先天性免疫系統刺激因子序列可以包括至少5個、至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或至少500個核糖核苷酸。先天性免疫系統刺激因子序列可以包括5至1000個、10至500個、20至500個、10至100個、20至100個、20至50個、100至500個、500至1000個或10至1000個核糖核苷酸。例如，作為先天性免疫系統刺激因子的序列可以選自富含GU的模體、富含AU的模體、包括dsRNA的結構化區域、或適配體。
佐劑可為TH1佐劑和/或TH2佐劑。本揭露考慮的其他佐劑包括但不限於以下的一或多種： 含礦物質的組成物。適於在本揭露中用作佐劑的含礦物質的組成物包括礦物鹽，諸如鋁鹽和鈣鹽。本揭露包括礦物鹽，如氫氧化物（例如羥基氧化物）、磷酸鹽（例如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽）、硫酸鹽等，或不同礦物化合物的混合物，其中化合物呈任何合適的形式（例如凝膠、結晶、無定形形式等）。鈣鹽包括磷酸鈣（例如，「CAP」）。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。
油乳劑組成物。適用於在本揭露中用作佐劑的油乳劑組成物包括角鯊烯-水乳劑，如MF59（5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5% Span，使用微細流體均質機配製為亞微米顆粒）、AS03（水包油乳劑中的α-生育酚、角鯊烯和聚山梨醇酯80）、Montanide配製物（例如Montanide ISA 51、Montanide ISA 720）、不完全弗氏佐劑（IFA）、完全弗氏佐劑（CFA）和不完全弗氏佐劑（IFA）。
小分子。適於在本揭露中用作佐劑的小分子包括咪喹莫特或847、瑞喹莫德或R848和嘎德莫特。
聚合物奈米顆粒。適於在本揭露中用作佐劑的聚合物奈米顆粒包括聚(a-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚內酯（包括聚己內酯）、聚對二氧環己酮、聚戊內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪胺酸衍生的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮或聚酯-醯胺及其組合。
皂苷（即，糖苷，附接至一條或多條糖側鏈的多環苷元）。適於在本揭露中用作佐劑的皂苷配製物包括純化配製物，諸如QS21，以及脂質配製物，諸如ISCOM和ISCOM基質。QS21作為STIMULON（TM）在市場上銷售。皂苷配製物也可以包含固醇，諸如膽固醇。皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物（ISCOM）的獨特顆粒。ISCOM典型地還包含磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷都可用於ISCOM中。較佳的是，ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一或多種。視需要，ISCOM可以不含另外的洗滌劑。
脂多糖。適於在本揭露中使用的佐劑包括腸細菌脂多糖（LPS）的無毒衍生物。此類衍生物包括單磷醯基脂質A（MPLA）、哌喃葡萄糖基脂質A（GLA）和3-O-去醯化MPL（3dMPL）。3dMPL係3去氧-醯化單磷醯基脂質A與4、5或6條醯化鏈的混合物。其他無毒的LPS衍生物包括單磷醯基脂A模擬物，如胺基烷基葡糖胺磷酸鹽衍生物，例如，RC-529。
脂質體。適於在本揭露中用作佐劑的脂質體包括病毒體和CAF01。
脂質奈米顆粒。適於在本揭露中使用的佐劑包括脂質奈米顆粒（LNP）及其組分。
脂肽（即，包含一或多個脂肪酸殘基和兩或更多個胺基酸殘基的化合物）。適於在本揭露中用作佐劑的脂肽包括Pam2（Pam2CSK4）和Pam3（Pam3CSK4）。
糖脂。適於在本揭露中用作佐劑的糖脂包括索狀因子（海藻糖二黴菌酸酯）。
從革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌衍生（合成或純化）的肽和肽聚糖，諸如MDP（N-乙醯-胞壁醯-L-丙胺醯-D-異麩醯胺酸）適於在本揭露中用作佐劑。
適用於用作佐劑的碳水化合物（含碳水化合物）或多糖包括右旋糖酐（例如，支鏈微生物多糖）、硫酸右旋糖酐、香菇多糖、酵母聚糖、β-葡聚糖、deltin、甘露聚糖和幾丁質。
基於RNA的佐劑。適用於在本揭露中使用的基於RNA的佐劑係聚IC、聚IC:LC、具有或不具有5’三磷酸的髮夾RNA、病毒序列、含聚U的序列、dsRNA天然或合成RNA序列（例如，聚I:C）和核酸類似物（例如，環狀GMP-AMP或其他環狀二核苷酸，例如，環狀二-GMP、免疫刺激性鹼基類似物，例如，C8-取代和N7,C8-二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸）。在一些實施方式中，佐劑係本文所述之環狀多核糖核苷酸的線性多核糖核苷酸對應物。
基於DNA的佐劑。適用於在本揭露中使用的基於DNA的佐劑包括CpG（例如，CpG1018）、dsDNA和天然或合成的免疫刺激DNA序列。
蛋白質或肽。適於在本揭露中用作佐劑的蛋白質和肽包括鞭毛蛋白融合蛋白、MBL（甘露糖結合凝集素）、細胞介素和趨化因子。
病毒顆粒。適於用作佐劑的病毒顆粒包括病毒體（磷脂細胞膜雙層）。
在本揭露中使用的佐劑可為細菌來源的，如鞭毛蛋白、LPS或細菌毒素（例如 腸毒素（蛋白質），例如 熱不穩定毒素或霍亂毒素）。在本揭露中使用的佐劑可為雜交分子，諸如軛合至咪喹莫特的CpG。在本揭露中使用的佐劑可為真菌或與卵菌微生物相關分子模式（MAMP），諸如幾丁質或β-葡聚糖。在一些實施方式中，佐劑係無機奈米顆粒，如金奈米棒或基於二氧化矽的奈米顆粒（例如 介孔二氧化矽奈米顆粒（MSN））。在一些實施方式中，佐劑係用糖脂免疫調節劑（海藻糖6,6-二山崳酸酯（TDB），其可為位於分枝桿菌細胞壁上的索狀因子的合成變體）穩定的多組分佐劑或佐劑體系，如AS01、（AS01B）、AS03、AS04（MLP5 + 明礬）、明礬（氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物）、氫氧化鋁、氫氧化鎂、CFA（完全弗氏佐劑：IFA + 肽聚糖 + 海藻糖二黴菌酸酯）、CAF01（陽離子脂質體媒介物的兩組分體系（二甲基雙十八烷基銨（DDA）））。
細胞介素。佐劑可為編碼細胞介素的部分或全長DNA，該細胞介素如促炎性細胞介素（例如，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGFβ、TNF-α、TNF-β）、Th-1誘導細胞介素（例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18）或Th-2誘導細胞介素（例如，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13）。
趨化因子。佐劑可為編碼趨化因子（如，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、Rantes或TCA-3）的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA）。
佐劑可為編碼共刺激分子的部分或全長DNA，共刺激分子諸如CD80、CD86、CD40-L、CD70或CD27。
佐劑可為編碼先天性免疫系統刺激因子（部分、全長或突變的）的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA），該先天性免疫系統刺激因子如TLR4、TLR3、TLR3、TLR9、TLR7、TLR8、TLR7、RIG-I/DDX58或MDA-5/IFIH1；或組成型活性（ca）先天性免疫刺激因子，諸如caTLR4、caTLR3、caTLR3、caTLR9、caTLR7、caTLR8、caTLR7、caRIG-I/DDX58或caMDA-5/IFIH1。
佐劑可為編碼銜接子或傳訊分子的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA），該銜接子或傳訊分子如STING（例如 caSTING）、TRIF、TRAM、MyD88、IPS1、ASC、MAVS、MAPK、IKK-α、IKK複合物、TBK1、β-連環蛋白和凋亡蛋白酶1。
佐劑可為編碼轉錄激活因子，如可以上調免疫響應的轉錄激活因子（例如，AP1、NF-κB、IRF3、IRF7、IRF1或IRF5）的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA）。佐劑可為編碼細胞介素受體諸如IL-2β、IFN-γ或IL-6的部分或全長DNA。
佐劑可為編碼細菌組分，如鞭毛蛋白或MBL的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA）。
佐劑可為編碼先天性免疫系統任何組分的部分或全長DNA或RNA（例如，環狀多核糖核苷酸或mRNA）。
在一些實施方式中，將編碼一或多種免疫原的環狀多核糖核苷酸與佐劑（例如，作為與環狀多核糖核苷酸分開的分子實體的佐劑，或在分開的環狀多核糖核苷酸上編碼的佐劑）組合投與於受試者。如說明書全篇使用的術語「與......組合」包括作為治療方案的一部分投與的任何兩種組成物。這可以包括例如配製成單一藥物組成物的多核糖核苷酸和佐劑。這還包括，例如，根據限定的治療或給藥方案，作為分開的組成物投與給受試者的多核糖核苷酸和佐劑。佐劑可以在多核糖核苷酸投與之前、基本上同時或之後投與給受試者。佐劑可以在多核糖核苷酸投與之前或之後的1天、2天、5天、10天、20天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月內投與。佐劑可以藉由與多核糖核苷酸相同的投與途徑（例如，皮內、肌內、皮下、靜脈內、腹膜內、局部或口服）或不同的途徑來投與。 遞送
本文所述之環狀多核糖核苷酸可以包括在含載劑或不含載劑的藥物組成物中。
本文所述之藥物組成物可為配製的，例如包括載劑（如藥物載劑和/或聚合物載劑，例如脂質體），並藉由已知方法遞送至有需要的受試者（例如人或非人農業動物或家畜，例如牛、狗、貓、馬、家禽）。此類方法包括但不限於轉染（例如，脂質介導的陽離子聚合物、磷酸鈣、樹狀聚合物）；電穿孔或其他破壞膜的方法（例如，核轉染）、病毒遞送（例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、AAV）、顯微注射、微粒轟擊（「基因槍」）、fugene、直接聲波載入、細胞擠壓、光轉染、原生質體融合、刺穿感染、磁轉染、胞泌體介導的轉移、脂質奈米顆粒介導的轉移、及其任何組合。遞送方法也描述於例如Gori等人, Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy [人類基因治療用CRISPR/Cas9基因組編輯技術的傳遞和特異性]. Human Gene Therapy [人類基因治療]. 2015年7月, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人, Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitroand in vivo[陽離子脂質介導的蛋白質遞送能夠在體外和體內進行有效的基於蛋白質的基因組編輯]. Nat Biotechnol [自然生物技術]. 2014年10月30日;33(1):73-80。
在一些實施方式中，可以以「裸」遞送配製物遞送環狀多核糖核苷酸。裸遞送配製物將環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對環狀多核糖核苷酸進行共價修飾，也無需對環狀多核糖核苷酸進行部分或完全封裝。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中環狀多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，並且環狀多核糖核苷酸沒有部分或完全封裝。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸未與有助於遞送至細胞的部分（如蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物）共價結合。在一些實施方式中，可以將環狀多核糖核苷酸與魚精蛋白或魚精蛋白鹽（例如硫酸魚精蛋白）一起在遞送配製物中遞送。
沒有與有助於遞送至細胞的部分結合的共價修飾的多核糖核苷酸可以不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有與有助於遞送至細胞的部分結合的共價修飾的多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物可以不含以下任何或全部物質：轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，裸遞送配製物可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、l,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、l-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
裸遞送配製物可以包含非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可以包括不表現出活性細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可以包括緩衝劑，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑可為溶劑、非水性溶劑、稀釋劑、懸浮助劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑、或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物可以包含稀釋劑，諸如腸胃外可接受的稀釋劑。稀釋劑（例如，腸胃外可接受的稀釋劑）可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑（例如，腸胃外可接受的稀釋劑）可為RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑之實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑之實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N′-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙烷磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑之實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
在一些實施方式中，配製物包括細胞穿透劑。在一些實施方式中，配製物係局部配製物，並且包括細胞穿透劑。細胞穿透劑可以包括有機化合物，諸如具有一或多個羥基官能基的醇。在一些情況下，細胞穿透劑包括醇，諸如但不限於一元醇、多元醇、不飽和脂族醇和脂環醇。細胞穿透劑可以包括以下的一或多種：甲醇、乙醇、異丙醇、苯氧乙醇、三乙醇胺、苯乙醇、丁醇、戊醇、鯨蠟醇、乙二醇、丙二醇、變性醇、苯甲醇（特別是變性醇）、二醇、硬脂醇、鯨蠟硬脂醇、薄荷醇、聚乙二醇（PEG）-400、乙氧基化脂肪酸或羥乙基纖維素。在某些實施方式中，細胞穿透劑包括乙醇。細胞穿透劑可以包括如WO 2020/180751或WO 2020/180752中所述之任何量或任何配製物中的任何細胞滲透劑，將其特此藉由援引以其全文併入。
在一些實施方式中，如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、如本文揭露的藥物原料藥或如本文揭露的藥物成品藥處於腸胃外核酸遞送系統中。腸胃外核酸遞送系統可以包括如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、所揭露的藥物原料藥或如本文揭露的藥物成品藥和腸胃外可接受的稀釋劑。在一些實施方式中，腸胃外核酸遞送系統中的如本文揭露的藥物製劑、如本文揭露的藥物組成物、如本文揭露的藥物原料藥或如本文揭露的藥物成品藥不含任何載劑。
本揭露進一步關於包括本文所述之環狀多核糖核苷酸的宿主或宿主細胞。在一些實施方式中，宿主或宿主細胞係脊椎動物、哺乳動物（例如人）或其他生物體或細胞。
在一些實施方式中，與由參考化合物（例如對應於所述環狀多核糖核苷酸的線性多核苷酸）觸發的響應相比，環狀多核糖核苷酸降低或不能產生宿主免疫系統的不需要的響應。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸在宿主中係非免疫原性的。一些免疫響應包括但不限於體液免疫響應（例如，免疫原特異性抗體的產生）和細胞介導的免疫響應（例如，淋巴球增殖）。
在一些實施方式中，使宿主或宿主細胞接觸（例如，遞送至或投與於）環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，宿主係哺乳動物，諸如人。可以在投與後的任何時間測量宿主中環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸、表現產物或兩者的量。在某些實施方式中，測定培養物中宿主生長的時程。如果在環狀多核糖核苷酸或線性多核糖核苷酸的存在下生長增加或減少，則環狀多核糖核苷酸或表現產物或兩者都被認為在增加或減少宿主的生長方面係有效的。
將如本文所述之環狀多核糖核苷酸分子遞送至細胞、組織或受試者的方法包括將如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥投與於細胞、組織或受試者。
在一些實施方式中，細胞係真核細胞。在一些實施方式中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施方式中，細胞係有蹄類動物細胞。在一些實施方式中，細胞係動物細胞。在一些實施方式中，細胞係免疫細胞。在一些實施方式中，組織係結締組織、肌肉組織、神經組織或上皮組織。在一些實施方式中，組織係器官（例如，肝、肺、脾、腎等）。
在一些實施方式中，遞送方法係體內方法。例如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸的遞送方法包括向有需要的受試者腸胃外投與，將如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥經腸胃外投與給有需要的受試者。再如，將環狀多核糖核苷酸遞送至受試者的細胞或組織的方法包括將如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥腸胃外投與至該細胞或組織。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的量在受試者中有效地引發生物響應。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的量有效地對受試者的細胞或組織具有生物學作用。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥包含載劑。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥包含稀釋劑而不含任何載劑。
在一些實施方式中，腸胃外投與藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥。在一些實施方式中，藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥通過靜脈內、動脈內、腹膜內、皮內、顱內、鞘內、淋巴內、皮下或肌內投與。在一些實施方式中，腸胃外投與係靜脈內、肌內、眼、皮下、皮內或局部投與。
在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥經肌內投與。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥經皮下投與。在一些實施方式中，如本文所述之藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥局部投與。在一些實施方式中，該藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥經氣管內投與。
在一些實施方式中，該藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥藉由注射投與。投與可為全身投與或局部投與。在一些實施方式中，如本文所述之任何遞送方法均用載劑進行。在一些實施方式中，無需借助於載劑或細胞穿透劑即可進行如本文所述之任何遞送方法。
在一些實施方式中，在投與步驟後至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或至少5天在細胞、組織或受試者中檢測到環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物。在一些實施方式中，在投與步驟之前評價細胞、組織或受試者中環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物的存在。在一些實施方式中，在投與步驟之後評價細胞、組織或受試者中環狀多核糖核苷酸或從該環狀多核糖核苷酸翻譯的產物的存在。 配製物
在本揭露之一些實施方式中，藉由本文所述之方法製備的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）或其製劑可被配製在組成物中，例如用於遞送到細胞、植物、無脊椎動物、非人脊椎動物或人類受試者的組成物，例如農業、獸用或藥物組成物。在一些實施方式中，多核糖核苷酸被配製在藥物組成物中。在一些實施方式中，組成物包括多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、佐劑或其組合。在特定實施方式中，組成物包括本文所述之多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包括多核糖核苷酸和不含任何載劑的稀釋劑的組成物用於將多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）裸遞送給受試者。
藥物組成物可視需要包括一或多種額外活性物質，例如治療和/或預防活性物質。藥物組成物可以視需要包括充當本文所述之組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸的組成物）的媒介物或介質的非活性物質，諸如由美國食品和藥品管理局（United States Food and Drug Administration）（FDA）批准並且在非活性成分數據中列出的任一種非活性成分。本發明之藥物組成物可為無菌的和/或無熱原的。可以在以下中找到藥學配製物的配製和/或生產中的一般考慮：例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐]第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005（藉由援引併入本文）。非活性物質之非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水性溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、懸浮助劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油、及其混合物。
儘管本文提供的藥物組成物的描述主要針對適合於投與於人的藥物組成物，但是熟悉該項技術者應理解，此類組成物通常適合於投與於任何其他動物，例如非人動物，例如非人哺乳動物。為了使組成物適合於投與於各種動物而對適合於投與於人的藥物組成物的修飾係熟知的，並且普通獸醫藥理師可僅通過普通實驗（如果有的話）來設計和/或進行此種修飾。我們設想向其投與藥物組成物的受試者包括但不限於人和/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關的哺乳動物，如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括商業相關的鳥類，如家禽、雞、鴨、鵝和/或火雞。
本文描述的藥物組成物的配製物可以藉由藥理學領域中已知的或以後開發的任何方法來製備。通常，這樣的製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一或多種其他輔助成分結合，然後，如果必要和/或期望的話，將產品分開、成形和/或包裝。
在一些實施方式中，製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係存在不多於1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml或2 mg/ml的線性多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的環狀多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）、99.1%（w/w）、99.2%（w/w）、99.3%（w/w）、99.4%（w/w）、99.5%（w/w）、99.6%（w/w）、99.7%（w/w）、99.8%（w/w）、99.9%（w/w）、或100%（w/w）的分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的線性多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的帶切口多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、或15%（w/w）的帶切口多核糖核苷酸分子。
在一些實施方式中，關於製劑中存在的組合的帶切口和線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的組合的帶切口和線性多核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，藥物製劑係最終環狀多核糖核苷酸成品藥的中間體藥物製劑。在一些實施方式中，藥物製劑係原料藥或活性藥物成分（API）。在一些實施方式中，藥物製劑係用於投與於受試者的成品藥。
在一些實施方式中，對環狀多核糖核苷酸的製劑（在減少線性RNA之前、期間或之後）進一步處理以基本上去除DNA、蛋白質污染物（例如，細胞蛋白質（如宿主細胞蛋白質）或蛋白質製程雜質）、內毒素、單核苷酸分子、和/或與製程有關的雜質。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物可以包含：(i) 本文揭露的化合物（例如，環狀多核糖核苷酸）；(ii) 緩衝劑；(iii) 非離子型洗滌劑；(iv) 張度劑；和/或 (v) 穩定劑。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物係穩定的液體藥物配製物。在一些實施方式中，本文揭露的藥物配製物包含魚精蛋白或魚精蛋白鹽（例如，硫酸魚精蛋白）。
本揭露提供了包括本文所述之環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物。本揭露之免疫原性組成物可以包含稀釋劑或載劑、佐劑或其任何組合。本揭露之免疫原性組成物還可以包括一或多種免疫調節劑，例如一或多種佐劑。佐劑可以包括下面進一步討論的TH1佐劑和/或TH2佐劑。在一些實施方式中，免疫原性組成物包含不含任何載劑的稀釋劑，並且用於將環狀多核糖核苷酸裸遞送至受試者。
本揭露之免疫原性組成物用於在受試者中引起免疫響應。免疫響應較佳的是保護性的，並且較佳的是涉及抗體響應（通常包括IgG）和/或細胞介導的免疫響應。例如，用包括本揭露之環狀多核糖核苷酸的免疫原性組成物使受試者免疫以誘導免疫響應。在另一個實例中，用包括含免疫原的線性多核糖核苷酸的免疫原性組成物使受試者免疫，以刺激與免疫原結合的抗體的產生。藉由該等用途和方法在受試者中引起免疫響應，可以保護受試者免受各種疾病和/或感染，例如免受如上所討論的細菌和/或病毒疾病。在某些實施方式中，免疫原性組成物係疫苗組成物。根據本揭露的疫苗可為預防性的（即預防感染）或治療性的（即治療感染），但是典型地將是預防性的。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物。在一些實施方式中，受試者係動物，較佳的是哺乳動物，例如人。在一個實施方式中，受試者係人。在其他實施方式中，受試者係非人哺乳動物，例如選自牛（例如，奶牛和肉牛）、綿羊、山羊、豬、馬、狗或貓。在其他實施方式中，受試者係鳥，例如母雞或公雞、火雞、鸚鵡。在一些實施方式中，動物不是小鼠或兔子或牛。在特定實施方式中，在免疫原性組成物用於預防用途的情況下，人係兒童（例如，幼兒或嬰兒）或青少年。在另一個實施方式中，在免疫原性組成物用於治療用途的情況下，人係青少年或成人。旨在用於兒童的免疫原性組成物也可以投與給成人，例如以評估安全性、劑量、免疫原性等。
根據本揭露製備的免疫原性組成物可用於治療兒童和成人。人類受試者可小於1歲、小於5歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。在特定實施方式中，接受免疫原性組成物的人類受試者係老年人（例如，≥ 50歲、≥ 60歲和≥ 65歲）、年輕人（例如，≤ 5歲）、住院患者、醫護人員、武裝部隊和軍事人員、孕婦、長期病患者或免疫缺陷患者。然而，免疫原性組成物不僅僅適合於該等群組，並且可以更普遍地用於群體中。
在一些實施方式中，受試者進一步用佐劑免疫接種。在一些實施方式中，受試者進一步用疫苗免疫接種。 防腐劑
本文提供的組成物或藥物組成物可以包括用於單次投與的材料，或者可以包括用於多次投與的材料（例如，「多劑量」套組（kit））。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。該組成物或藥物組成物可以包含一或多種防腐劑，諸如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。防腐劑可用於防止使用過程中的微生物污染。合適的防腐劑包括：殺藻銨、硫柳汞、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二鈉、山梨酸、Onamer M或熟悉該項技術者已知的其他藥劑。在眼科產品中，例如，此類防腐劑可以以0.004%至0.02%的水平採用。在本文所述之組成物中，防腐劑（例如殺藻銨）可以按重量計以0.001%至小於0.01%，例如0.001%至0.008%，較佳的是約0.005%的水平採用。
多核糖核苷酸可易受周圍環境中可能豐富的RNA酶的影響。本文提供的組成物可以包含抑制RNA酶活性的試劑，從而防止多核糖核苷酸降解。在一些情況下，該組成物或藥物組成物包含熟悉該項技術者已知的任何RNA酶抑制劑。替代性地或另外，可以在無RNA酶的環境中製備本文提供的組成物中的多核糖核苷酸和細胞穿透劑和/或藥學上可接受的稀釋劑或載劑、媒介物、賦形劑或其他試劑。該組成物可以在無RNA酶的環境中配製。
在一些情況下，本文提供的組成物可為無菌的。可以在本領域已知的合適的媒介物中將組成物配製成無菌溶液或懸浮液。可以藉由常規的已知滅菌技術對組成物進行滅菌，例如，可以對組成物進行無菌過濾。 鹽
在一些情況下，本文提供的組成物或藥物組成物包括一或多種鹽。為了控制張度，本文提供的組成物可以包括生理鹽如鈉鹽。其他鹽可以包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在一些情況下，該組成物與一或多種藥學上可接受的鹽一起配製。該一或多種藥學上可接受的鹽可以包括無機離子，諸如鈉、鉀、鈣、鎂離子等的那些鹽。此類鹽可以包括與無機酸或有機酸的鹽，該等無機酸或有機酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、苦杏仁酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或馬來酸。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 緩衝劑 /pH
本文提供的組成物或藥物組成物可以包括一或多種緩衝劑，如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；琥珀酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑（例如，含氫氧化鋁佐劑）；或檸檬酸鹽緩衝劑。在一些情況下，包含5-20 mM範圍內的緩衝劑。
本文提供的組成物或藥物組成物可以具有約5.0至約8.5、約6.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約7.0至約7.8的pH。該組成物或藥物組成物可以具有約7的pH。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 洗滌劑 / 界面活性劑
根據預期的投與途徑，本文提供的組成物或藥物組成物可以包括一或多種洗滌劑和/或界面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑（通常稱為「吐溫（Tween）」），例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商標出售的環氧乙烷（EO）、環氧丙烷（PO）和/或環氧丁烷（BO）的共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；重複的乙氧基(氧基-l,2-乙二基)基團的數目可以變化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9（Triton X-100或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼（卵磷脂）；壬基酚聚氧乙烯醚，諸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（稱為Brij界面活性劑），諸如三乙二醇單月桂基醚（Brij 30）；和脫水山梨糖醇酯（通常稱為「SPAN」），諸如脫水山梨糖醇三油酸酯（Span 85）和脫水山梨糖醇單月桂酸酯、辛基酚聚醚（諸如辛基酚聚醚9（Triton X-100）或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、十六烷基三甲基溴化銨（「CTAB」）或去氧膽酸鈉。該一或多種洗滌劑和/或界面活性劑可僅以痕量存在。在一些情況下，該組成物可以包含小於各1 mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非離子界面活性劑。界面活性劑可以按其「HLB」（親水/親脂平衡值）進行分類。在一些情況下，界面活性劑的HLB為至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 稀釋劑
在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和稀釋劑。
稀釋劑可為非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑之非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、助懸劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可為經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。非載劑賦形劑可為適於投與於非人動物（例如，適合獸醫用途）的任何非活性成分。為了使組成物適於向各種動物投與，對適於向人投與的組成物的修飾得到很好的理解，並且普通技術的獸醫藥理師可以僅通過普通的實驗（如果有）來設計和/或進行此類修飾。
在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，無需借助於載劑並且無需對環狀多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全封裝。
裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中環狀多核糖核苷酸沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對環狀多核糖核苷酸的部分或完全封裝。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施方式中，裸遞送配製物不含以下任何或全部：轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。在一些實施方式中，裸遞送配製物不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、l,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、l-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
在某些實施方式中，裸遞送配製物包括非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括不表現出細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括緩衝液，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑係溶劑、非水溶劑、稀釋劑、助懸劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、透明質酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施方式中，裸遞送配製物包括稀釋劑。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑係RNA增溶劑、緩衝劑或等滲劑。RNA增溶劑之實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑之實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N′-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙烷磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑之實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。 載劑
在一些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和載劑。
在某些實施方式中，免疫原性組成物包含在囊泡或其他基於膜的載劑中的如本文所述之環狀多核糖核苷酸。
在其他實施方式中，免疫原性組成物包括在或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中之環狀多核糖核苷酸。在一個實施方式中，免疫原性組成物包含在脂質體或其他類似囊泡中之環狀多核糖核苷酸。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性隔室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可為陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其負載物免受血漿酶的降解，並且將其負載轉運穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。
囊泡可由幾種不同類型的脂質製成；然而，最常使用磷脂生成作為藥物載劑的脂質體。製備多層囊泡脂質之方法係本領域已知的（參見例如美國專利案號6,693,086，其關於多層囊泡脂質製備的傳授內容藉由援引併入文中）。儘管當脂質膜與水溶液混合時，囊泡的形成係自發的，但也可以藉由使用均質器、超音波儀或擠壓裝置以振盪的形式施加力來加快囊泡的形成（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可以藉由擠出通過具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotech [自然生物技術], 15:647-652, 1997中所述，其涉及擠出脂質製備的教導藉由援引併入本文。
在某些實施方式中，本揭露之免疫原性組成物包含環狀多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒，例如本文所述之脂質奈米顆粒。脂質奈米顆粒係為如本文所述之環狀多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一個實例。奈米結構化的脂質載劑（NLC）係經修飾的固體脂質奈米顆粒（SLN），其保留了SLN的特性，提高了藥物的穩定性和載藥量，並防止了藥物洩漏。聚合物奈米顆粒（PNP）係藥物遞送的重要組成部分。該等奈米顆粒可以有效地將藥物遞送引導至特定靶並改善藥物穩定性和受控的藥物釋放。也可以使用脂質聚合物奈米顆粒（PLN），其係一種組合了脂質體和聚合物的新型載劑。該等奈米顆粒具有PNP和脂質體的互補優勢。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供了穩定的結構，磷脂殼提供了良好的生物相容性。這樣，這兩種組分提高了藥物封裝有效率，促進了表面修飾，並防止了水溶性藥物的洩漏。對於綜述，參見，例如，Li等人 2017, Nanomaterials 7 [奈米材料7], 122; doi:10.3390/nano7060122。
載劑之另外的非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐修飾的植物糖原或糖原型材料）、蛋白質載劑（例如，與環狀多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）、或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。碳水化合物載劑之非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐改性的植物糖原β-糊精。陽離子載劑之非限制性實例包括脂轉染胺（lipofectamine）、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、l,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、l-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N,N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二-十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）和N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）。蛋白質載劑之非限制性實例包括人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。
外來體也可用作本文所述之環狀RNA組成物或製劑的藥物遞送媒介物。對於綜述，參見Ha等人 2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B [藥學學報] 第6卷, 第4期, 第287-296頁；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化的紅血球也可以用作本文所述之環狀RNA組成物或製劑的載劑。參見，例如，國際專利公開案號WO 2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO 2016/183482；WO 2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 111(28): 10131-136；美國專利9,644,180；Huang等人 2017. Nature Communications [自然通訊] 8: 423；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 111(28): 10131-136。
例如國際專利公開案號WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。
病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之環狀多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。
例如國際專利公開案號WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO 2020/041784中所述之植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之環狀RNA組成物或製劑。
微泡也可以用作載劑遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。參見，例如，US 7115583；Beeri, R.等人，Circulation. [循環] 2002年10月1日; 106(14):1756-59；Bez, M.等人, Nat Protoc. [自然實驗手冊] 2019年4月; 14(4): 1015-26；Hernot, S.等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2008年6月30日; 60(10): 1153-66；Rychak, J.J.等人, Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2014年6月; 72: 82-93。在一些實施方式中，微泡係白蛋白包被的全氟化碳微泡。
包含本文所述之環狀多核糖核苷酸的載劑可以包含多個顆粒。顆粒可具有30至700奈米（例如，30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700奈米）的中值粒度。可以優化顆粒的大小以有利於包括環狀多核糖核苷酸在內的有效載荷沈積到細胞中。環狀多核糖核苷酸沈積到某些細胞類型中可有利於不同的粒度。例如，可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到抗原呈遞細胞中。可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到樹突細胞中。另外，可以優化粒度以使環狀多核糖核苷酸沈積到引流淋巴結細胞中。 脂質奈米顆粒
本揭露提供的組成物、方法和遞送系統可以採用本文所述之任何合適的載劑或遞送形式，在某些實施方式中包括脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包括一或多種離子脂質，如非陽離子脂質（例如，中性或陰離子或兩性離子脂質）；一或多種軛合脂質（諸如WO 2019217941的表5中描述的PEG軛合的脂質或軛合至聚合物的脂質；其藉由援引以其全文併入本文）；一或多種固醇（例如，膽固醇）。
可用於奈米顆粒形成的脂質（例如，脂質奈米顆粒）包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其藉由援引併入本文—例如，含脂質的奈米顆粒可包括WO 2019217941的表4中的一或多種脂質。脂質奈米顆粒可以包括另外的要素，諸如聚合物，諸如藉由援引併入的WO 2019217941的表5中描述的聚合物。
在一些實施方式中，軛合脂質，當存在時，可以包括以下的一或多種：PEG-二醯基甘油（DAG）（如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些（藉由援引併入）和前述的組合。
在一些實施方式中，可摻入脂質奈米顆粒中的固醇包括膽固醇或膽固醇衍生物中的一或多種，諸如藉由援引併入的W0 2009/127060或US 2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括藉由援引併入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些實施方式中，脂質顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質、抑制顆粒聚集的軛合脂質和固醇。該等組分的量可以獨立地變化，以獲得所需特性。例如，在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質、軛合脂質和甾醇，該可電離脂質的量為總脂質的約20 mol %至約90 mol %（在其他實施方式中，該可電離脂質可為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的20%-70%（mol）、30%-60%（mol）或40%-50%（mol）；約50 mol %至約90 mol %）；該非陽離子脂質的量為總脂質的約5 mol %至約30 mol %；該軛合脂質的量為總脂質的約0.5 mol %至約20 mol %，該甾醇的量為總脂質的約20 mol %至約50 mol %。總脂質與核酸的比率可以根據需要變化。例如，總脂質與核酸（質量或重量）的比率可為約10 : 1至約30 : 1。
在一些實施方式中，脂質與核酸的比率（質量/質量比率；w/w比）可處於約1 : 1至約25 : 1、約10 : 1至約14 : 1、約3 : 1至約15 : 1、約4 : 1至約10 : 1、約5 : 1至約9 : 1或約6 : 1至約9 : 1的範圍內。可以調節脂質和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂質奈米顆粒配製物的總脂質含量可在約5 mg/ml至約30 mg/mL的範圍內。
可用於（例如，與其他脂質組分組合）形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物的一些非限制性實例包括： (i)
在一些實施方式中，包括式 (i) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (ii)
在一些實施方式中，包括式 (ii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (iii)
在一些實施方式中，包括式 (iii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (iv) (v)
在一些實施方式中，包括式 (v) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (vi)
在一些實施方式中，包括式 (vi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (vii) (viii)
在一些實施方式中，包括式 (viii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (ix)
在一些實施方式中，包括式 (ix) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (x) 其中 X 1係O、NR 1或直接鍵，X 2係C2-5伸烷基，X 3係C(=O)或直接鍵，R 1係H或Me，R 3係C1-3烷基，R 2係C1-3烷基，或R 2與它所附接的氮原子和X 2的1-3個碳原子一起形成4-員、5-員或6-員環，或X 1係NR 1，R 1和R 2與它們所附接的氮原子一起形成5-員或6-員環，或R 2與R 3和它們所附接的氮原子一起形成5-員、6-員或7-員環，Y 1係C2-12伸烷基，Y 2選自 （在任一取向上），（在任一取向上），（在任一取向上）， n為0至3，R 4為C1-15烷基，Z 1為C1-6伸烷基或直接鍵， （在任一取向上）或不存在，條件是如果Z 1係直接鍵，則Z 2不存在； R 5係C5-9烷基或C6-10烷氧基，R 6係C5-9烷基或C6-10烷氧基，W係亞甲基或直接鍵，並且R 7係H或Me，或其鹽，條件是如果R 3和R 2係C2烷基，X 1係O，X 2係直鏈C3伸烷基，X 3係C(=0)，Y 1係直鏈Ce伸烷基，(Y 2)n-R 4係 ，R 4係直鏈C5烷基，Z 1係C2伸烷基，Z 2不存在，W係亞甲基，並且R 7係H，則R 5和R 6不是Cx烷氧基。
在一些實施方式中，包括式 (xii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xi)
在一些實施方式中，包括式 (xi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 其中R = (xii) (xiii) (xiv)
在一些實施方式中，LNP包括具有式 (xiii) 之化合物和具有式 (xiv) 之化合物。 (xv)
在一些實施方式中，包括式 (xv) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xvi)
在一些實施方式中，包括具有式 (xvi) 配製物的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xvii) 其中X = (xviii)(a) (xviii)(b) (xix)
在一些實施方式中，用於形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物藉由以下反應之一製成： (xx)(a) (xx)(b)。
在一些實施方式中，包括式 (xxi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，具有式 (xxi) 的LNP係藉由WO 2021113777描述的LNP（例如，具有式 (1) 之脂質，如WO 2021113777的表1的脂質）。 (xxi) 其中 每個n獨立地是2-15的整數；L 1和L 3各自獨立地是-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」表示與R 1或R 3的附接點； R 1和R 3各自獨立地是直鏈或支鏈C 9-C 20烷基或C 9-C 20烯基，其視需要被選自由以下組成之群組的一或多個取代基取代：側氧基、鹵代、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥基烷基、二羥基烷基、羥基烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基和烷基碸烷基；以及 R 2選自由以下組成之群組：
在一些實施方式中，包括式 (xxii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，具有式 (xxii) 的LNP係由WO 2021113777描述的LNP（例如，具有式 (2) 的脂質，如WO 2021113777的表2的脂質）。 (xxii) 其中 每個n獨立地是1-15的整數； R 1和R 2各自獨立地選自由以下組成之群組： R 3選自由以下組成之群組：
在一些實施方式中，包括式 (xxiii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，具有式 (xxiii) 的LNP係由WO 2021113777描述的LNP（例如，具有式 (3) 的脂質，如WO 2021113777的表3的脂質）。 (xxiii) 其中 X選自-O-、-S-或-OC(O)-*，其中*表示與R 1的附接點； R 1選自由以下組成之群組： 且R 2選自由以下組成之群組：
在一些實施方式中，本文所述之組成物（例如，核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）或蛋白質）在包括可電離脂質的LNP中提供。在一些實施方式中，可電離脂質係十七烷-9-基8-((2-羥乙基)(6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）；例如，如US 9,867,888（藉由援引以其全文併入本文）的實例1中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯（LP01），例如，如WO 2015/095340（藉由援引以其全文併入本文）的實例13中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係9-((4-二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯（L319），例如如US 2012/0027803（藉由援引以其全文併入本文）的實例7、實例8或實例9中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係1,1'-((2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基)氮烷二基)雙(十二烷-2-醇)（C12-200），例如，如WO 2010/053572（藉由援引以其全文併入本文）的實例14和實例16中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係咪唑膽固醇酯（ICE）脂質(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-十四氫-lH-環戊烯並[a]菲-3-基 3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如來自WO 2020/106946（藉由援引以其全文併入本文）的結構 (I)。
在一些實施方式中，可電離脂質可為陽離子脂質、可電離陽離子脂質，例如可以根據pH以帶正電荷的形式或中性形式存在的陽離子脂質，或可以容易地質子化的含胺脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質係例如在生理條件下能夠帶正電的脂質。示例性的陽離子脂質包括一或多個帶有正電荷的胺基。在一些實施方式中，脂質顆粒包括與中性脂質、可電離含胺脂質、可生物降解的炔脂質、類固醇、包括多不飽和脂質的磷脂、結構脂質（例如固醇）、PEG、膽固醇和聚合物軛合脂質中的一或多種配製的陽離子脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質可為可電離的陽離子脂質。如本文所揭露的示例性陽離子脂質可具有超過6.0的有效pKa。在實施方式中，脂質奈米顆粒可包括具有與第一陽離子脂質不同的有效pKa（例如，大於第一有效pKa）的第二陽離子脂質。脂質奈米顆粒可包括40莫耳%至60莫耳%的封裝在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合的陽離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物軛合的脂質和治療劑，例如本文所述之核酸（例如RNA（例如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））。在一些實施方式中，核酸與陽離子脂質共同配製。核酸可以吸附到LNP（例如包括陽離子脂質的LNP）的表面。在一些實施方式中，核酸可以封裝在LNP（例如包括陽離子脂質的LNP）中。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包括靶向部分，例如用靶向劑包被的靶向部分。在實施方式中，LNP配製物係生物可降解的。在一些實施方式中，包括一或多種本文所述之脂質（例如式 (i)、(ii)、(ii)、(vii) 和/或 (ix)）的脂質奈米顆粒封裝至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或100%的RNA分子。
可用於脂質奈米顆粒配製物中的示例性可電離脂質包括但不限於藉由援引併入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂質包括但不限於下式中的一或多種：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US 2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US 2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W0 2013/016058的A；W02012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；W0 2009/132131的I、II、III或IV；US 2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US 2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US 10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人 (2020) 的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人 (2017) 的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I；和WO 2021/113777的 (1)、(2)、(3) 或 (4)。示例性脂質還包括WO 2021/113777的表1-16中任一個的脂質。
在一些實施方式中，可電離脂質係MC3 (6Z,9Z,28Z,3 lZ)-三十七烷-6,9,28,3 l-四烯-l9-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3），例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例9中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係脂質ATX-002，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例10中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3,l6-二烯-l-胺（化合物32），例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例11中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例12中所述。
示例性非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-甲酸酯（DOPE-mal）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-磷脂醯-乙醇胺（DSPE）、單甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-單甲基PE）、二甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-二甲基PE）、l8-l-反式PE、l-硬脂醯-2-油醯-磷脂醯乙醇胺（SOPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、卵磷脂醯膽鹼（EPC）、二油醯磷脂醯絲胺酸（DOPS）、神經鞘磷脂（SM）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油（DMPG）、二硬脂醯磷脂醯甘油（DSPG）、二芥醯基磷脂醯膽鹼（DEPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油（POPG）、二反油烯醯-磷脂醯乙醇胺（DEPE）、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂（ESM）、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼或其混合物。應當理解，也可以使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。該等脂質中的醯基基團較佳的是為源自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。在某些實施方式中，另外的示例性脂質包括但不限於藉由援引併入本文的Kim等人 (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386描述的那些。在一些實施方式中，這樣的脂質包括被發現改善mRNA肝轉染的植物脂質（例如，DGTS）。
適用於脂質奈米顆粒中的非陽離子脂質之其他實例包括但不限於非磷脂質，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙醯基棕櫚酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸鹽、烷基-芳基硫酸鹽、聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂等。其他非陽離子脂質在WO 2017/099823或美國專利公開US 2018/0028664中有描述，其內容藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，非陽離子脂質係油酸或藉由援引以其全文併入的US 2018/0028664的式I、II或IV之化合物。非陽離子脂質可以占例如脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0%-30%（莫耳）。在一些實施方式中，非陽離子脂質含量係脂質奈米顆粒中存在的總脂質的5%-20%（莫耳）或10%-15%（莫耳）。在實施方式中，可電離脂質與中性脂質的莫耳比為約2 : 1至約8 : 1（例如，約2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒不包括任何磷脂。
在一些方面，脂質奈米顆粒可進一步包括如固醇的組分以提供膜完整性。可用於脂質奈米顆粒中的一種示例性固醇係膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，如5a-膽甾烷醇、53-糞甾烷醇、膽甾醇基-(2 ’-羥基)-乙基醚、膽甾醇基-(4'- 羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5a-膽甾烷、膽甾烯酮、5a-膽甾烷酮、5p-膽甾烷酮和膽甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些實施方式中，膽固醇衍生物係極性類似物，例如，膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚。示例性的膽固醇衍生物在PCT公開W0 2009/127060和美國專利公開US 2010/0130588中有描述，其各自藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，提供膜完整性的組分，如固醇，可以包括脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0%-50%（莫耳）（例如，0%-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%或40%-50%）。在一些實施方式中，此類組分係脂質奈米顆粒的總脂質含量的20%-50%（莫耳）、30%-40%（莫耳）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包括聚乙二醇（PEG）或軛合的脂質分子。通常，該等用於抑制脂質奈米顆粒的聚集和/或提供空間穩定。示例性的軛合脂質包括但不限於PEG-脂質軛合物、聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）、陽離子聚合物脂質（CPL）軛合物及其混合物。在一些實施方式中，軛合脂質分子係PEG-脂質軛合物，例如(甲氧基聚乙二醇)軛合脂質。
示例性的PEG-脂質軛合物包括但不限於PEG-二醯基甘油（DAG）（諸如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽或其混合物。另外的示例性PEG-脂質軛合物描述於以下中：例如，US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904、和US 2018/0028664以及WO2017/099823，所有該等的內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質係US 2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V之化合物，其內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，兩者的內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-DAA軛合物可為例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕櫚基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂質可為以下的一或多種：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油脂醯胺、PEG-二硬脂基甘油脂醯胺、PEG-膽固醇（l-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺基甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)）、PEG-DMB（3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚）和1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包括PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包括選自以下的結構：
在一些實施方式中，與PEG以外的分子軛合的脂質也可用於代替PEG-脂質。例如，聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）和陽離子聚合物脂質（GPL）軛合物可用於代替PEG-脂質或與PEG-脂質一起使用。
示例性的軛合脂質（即PEG-脂質、（POZ）-脂質軛合物、ATTA-脂質軛合物和陽離子聚合物-脂質）在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS專利申請（所有該等的內容藉由援引以其全文併入本文）中描述。
在一些實施方式中，PEG或軛合脂質可包括脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0%-20%（莫耳）。在一些實施方式中，PEG或軛合脂質的含量為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0.5%-10%或2%-5%（莫耳）。可電離脂質、非陽離子脂質、固醇和PEG/軛合脂質的莫耳比可以根據需要變化。例如，脂質顆粒可包括按組成物的莫耳或總重量計30%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計0%-60%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計0%-30%的非陽離子脂質和按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。較佳的是，該組成物包括按組成物的莫耳或總重量計30%-40%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計40%-50%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計10%-20%的非陽離子脂質。在一些其他實施方式中，組成物係按組成物的莫耳或總重量計50%-75%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計20%-40%的膽固醇，和按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。該組成物可含有按組成物的莫耳或總重量計60%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計25%-35%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質。該組成物還可含有按組成物的莫耳或總重量計至多90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%至15%的非陽離子脂質。該配製物也可為脂質奈米顆粒配製物，例如包括按組成物的莫耳或總重量計8%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計5%-30%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計0%-20%的膽固醇；按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%至25%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計10%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計5%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計1%至15%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計2%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-20%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計甚至高達90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%-10%的非陽離子脂質，或按組成物的莫耳或總重量計甚至100%的陽離子脂質。在一些實施方式中，脂質顆粒配製物包括莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇化脂質。在一些其他實施方式中，脂質顆粒配製物包括莫耳比為60 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質。
在一些實施方式中，脂質顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質（例如磷脂）、固醇（例如膽固醇）和聚乙二醇化脂質，其中可電離脂質的脂質莫耳比的範圍為20至70莫耳%，目標為40-60，非陽離子脂質的莫耳百分比的範圍為在0至30，目標為0至15，固醇的莫耳百分比的範圍為20至70，目標為30至50，並且聚乙二醇化脂質的莫耳百分比的範圍為1至6，目標為2至5。
在一些實施方式中，脂質顆粒包括莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質/非陽離子脂質/固醇/軛合脂質。
在一方面，本揭露提供了包括磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺的脂質奈米顆粒配製物。
在一些實施方式中，還可以包括一或多種另外的化合物。那些化合物可以單獨投與，或者另外的化合物可以包括在本發明之脂質奈米顆粒中。換言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂質奈米顆粒可含有不同於第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以選自由以下組成之群組：小的或大的有機分子或無機分子、單糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白質、其肽類似物和衍生物、肽模擬物、核酸、核酸類似物和衍生物、由生物材料製成的提取物，或其任何組合。
在一些實施方式中，LNP包括可生物降解的、可電離的脂質。在一些實施方式中，LNP包括(9Z,l2Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 十八碳-9,l2-二烯酸酯，也稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一種可電離脂質。參見，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086，以及其中提供的參考文獻的脂質。在一些實施方式中，在LNP脂質之上下文中術語陽離子和可電離係可互換的，例如，其中可電離脂質根據pH係陽離子的。
在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以在數十nm和數百nm之間，例如藉由動態光散射（DLS）測量的。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm或約90 nm至約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約70 nm至約100 nm。在特定實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約80 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑範圍為約l mm至約500 mm、約5 mm至約200 mm、約10 mm至約100 mm、約20 mm至約80 mm、約25 mm至約60 mm、約30 mm至約55 mm、約35 mm至約50 mm，或約38 mm至約42 mm。
在一些情況下，LNP可為相對均質的。多分散性指數可用於指示LNP的均質性，例如脂質奈米顆粒的粒度分佈。小的（例如，小於0.3）多分散性指數通常指示窄的粒度分佈。LNP的多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施方式中，LNP的多分散性指數可為約0.10至約0.20。
LNP的ζ電位可用於指示組成物的電動電位。在一些實施方式中，ζ電位可以描述LNP的表面電荷。具有相對低電荷（正電荷或負電荷）的脂質奈米顆粒通常是期望的，因為更高電荷的物質可能不理想地與體內的細胞、組織和其他元素相互作用。在一些實施方式中，LNP的ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。
蛋白質和/或核酸的封裝效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被封裝或以其他方式與LNP締合的蛋白質和/或核酸的量。理想的封裝效率係高的（例如，接近100%）。封裝效率可以例如藉由比較在用一或多種有機溶劑或洗滌劑破碎脂質奈米顆粒之前和之後含有脂質奈米顆粒的溶液中蛋白質或核酸的量來測量。陰離子交換樹脂可用於測量溶液中游離蛋白質或核酸（例如RNA）的量。螢光可用於測量溶液中游離蛋白質和/或核酸（例如RNA）的量。對於本文所述之脂質奈米顆粒，蛋白質和/或核酸的封裝效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少80%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少90%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少95%。
LNP可以視需要包括一層或多層包衣。在一些實施方式中，LNP可以配製在具有包衣的膠囊、膜或片劑中。包含本文所述之組成物的膠囊、膜或片劑可具有任何可用的尺寸、拉伸強度、硬度或密度。
另外的示例性脂質、配製物、方法和LNP表徵由WO 2020/061457、WO 2021/113777和 WO 2021226597傳授，其各自藉由援引以其全文併入本文。其他示例性脂質、配製物、方法和LNP表徵由Hou等人 Lipid nanoparticles for mRNA delivery [用於mRNA遞送的脂質奈米顆粒]. Nat Rev Mater [自然評論材料] (2021). doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0傳授，其藉由援引以其全文併入本文（參見例如Hou等人的圖2的示例性脂質和脂質衍生物）。
在一些實施方式中，使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾公司（Thermo Fisher））或TransIT-mRNA轉染試劑（米盧斯生物公司（Mirus Bio））進行體外或離體細胞脂質轉染。在某些實施方式中，使用GenVoy_ILM可電離脂質混合物（精密奈米系統（Precision NanoSystems））配製LNP。在某些實施方式中，使用2,2‐二亞油烯基‐4‐二甲基胺基乙基‐[1,3]‐二氧戊環（DLin‐KC2‐DMA）或二亞油烯基甲基‐4‐二甲基胺基丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3）配製LNP，其配製和體內用途在Jayaraman等人 Angew, Chem Int Ed Engl [德國應用化學] 51(34):8529-33 (2012)中傳授，其藉由援引以其全文併入本文。
優化用於遞送CRISPR-Cas系統（例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA）的LNP配製物在兩者均藉由援引併入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，並且可用於遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸和線性多核糖核苷酸。
可用於遞送核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）的另外的特定LNP配製物在兩者均藉由援引併入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西蘭（patisiran）中使用的以名稱ONPATTRO銷售的配製物。
多核糖核苷酸（例如，在實施方式中，編碼本文所述之免疫原或多肽的至少一部分（例如，抗原部分）的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的示例性給藥在LNP中配製，其中：(a) LNP包含陽離子脂質、中性脂質、膽固醇和PEG脂質，(b) LNP具有80 nm至160 nm的平均粒度，並且 (c) 多核糖核苷酸包含：(i) 5'-帽結構；(ii) 5'-UTR；(iii) N1-甲基-假尿苷、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤；(iv) 3'-UTR；以及 (v) 聚-A區域。在實施方式中，在LNP中配製的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）係疫苗。
多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）的示例性給藥可包括約0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100 mg/kg（RNA）。在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）免疫原性組成物的劑量為30-200 mcg，例如，30 mcg、50 mcg、75 mcg、100 mcg、150 mcg或200 mcg。包括多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）的AAV的示例性給藥可包括約10 11、10 12、10 13和10 14vg/kg的MOI。 套組
在一些方面，本揭露提供了套組。在一些實施方式中，套組包括 (a) 本文所述之環狀多核糖核苷酸、免疫原性組成物或藥物組成物，以及視需要 (b) 資訊材料。在一些實施方式中，套組進一步包含本文所述之佐劑，該佐劑可以在單獨的組成物中提供，以作為限定給藥方案的一部分與環狀多核糖核苷酸、免疫原性組成物或藥物組成物組合投與。資訊材料可為描述性的、指導性的、行銷性的或係與本文所述方法和/或用於本文所述方法的藥物組成物或環狀多核糖核苷酸的用途相關的其他材料。藥物組成物或環狀多核糖核苷酸可包含用於單次投與（例如，單劑量形式）的材料，或可包含用於多次投與（例如，「多劑量」套組）的材料。
套組的資訊材料的形式不受限制。在一個實施方式中，資訊材料可包括關於藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥的生產的資訊，藥物組成物、藥物原料藥或藥物成品藥的分子量，濃度，有效期，批次或生產地點資訊等。在一個實施方式中，資訊材料涉及用於投與藥物組成物劑型之方法。在一個實施方式中，資訊材料涉及用於投與環狀多核糖核苷酸劑型之方法。
除了本文所述之藥物組成物和環狀多核糖核苷酸的劑型之外，該套組還可包括其他成分，如溶劑或緩衝液、穩定劑、防腐劑、調味劑（例如，苦味拮抗劑或增甜劑）、香料、染料或著色劑（例如用於將套組中的一或多種組分著色或染色）、或其他化妝品成分、和/或用於治療本文所述病症或障礙的第二藥劑。可替代地，套組中可包括其他成分，但在與本文所述藥物組成物或環狀多核糖核苷酸不同的組成物或容器中。在這樣的實施方式中，套組可包括將本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）和其他成分混合，或者將本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）與其他成分一起使用的說明書。
在一些實施方式中，將套組的組分儲存在惰性條件下（例如，在氮氣或另一種惰性氣體諸如氬氣下）。在一些實施方式中，將套組的組分儲存在無水條件下（例如，用乾燥劑）。在一些實施方式中，將組分儲存在遮光容器，如琥珀色小瓶中。
本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）的劑型可以以任何形式，例如液體、乾燥或凍乾形式提供。較佳的是本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）係基本上純的和/或無菌的。當在液體溶液中提供本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）時，液體溶液較佳的是為水溶液，其中較佳的是無菌水溶液。當本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）以乾燥形式提供時，通常藉由添加合適的溶劑來重構。套組中可以視需要提供溶劑，例如無菌水或緩衝液。
該套組可包括用於含有本文所述劑型的組成物的一或多個容器。在一些實施方式中，套組含有用於組成物和資訊材料的單獨容器、分隔物或隔室。例如，藥物組成物或環狀多核糖核苷酸可以裝在瓶子、小瓶或注射器中，並且資訊材料可以裝在塑膠套管（plastic sleeve）或包中。在其他實施方式中，套組的單獨元件包含在單個未分開的容器中。例如，本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）的劑型包含在瓶、小瓶或注射器中，其上附有標籤形式的資訊材料。在一些實施方式中，套組包括多個（例如，一包）單獨的容器，每個容器含有一或多個單位劑型的本文所述之藥物組成物或環狀多核糖核苷酸。例如，該套組包括多個注射器、安瓿、箔包或泡罩包裝，每個含有單個單位劑量的本文所述之劑型。
套組的容器可為氣密的、防水的（例如，不受水分或蒸發變化的影響）和/或不透光的。
該套組視需要包括適用於劑型的使用的裝置，例如注射器、移液管、鑷子、量勺、拭子（例如，棉簽或木簽）或任何這樣的裝置。
本發明之套組可包括不同強度的劑型，以向受試者提供適用於本文所述之起始期方案、誘導期方案或維持期方案中的一或多個的劑量。可替代地，套組可包括刻痕片劑，以允許使用者根據需要投與分劑量。 實例
提出旨在說明而非限制本揭露之以下實例，以向熟悉該項技術者提供可以如何使用、實現和評價本文所述之組成物和方法的描述。該等實例旨在僅是本揭露之示例，而無意限制發明人視為其發明的內容範圍。 實例 1 ：編碼多聚化和免疫原序列的環狀 RNA 的設計、生成和純化
此實例描述了編碼多聚化結構域（例如，鐵蛋白、bann、T4 foldon或AaLS foldon結構域）和免疫原的環狀RNA的設計和體外生成和純化。
將環狀RNA設計為包括內部核糖體進入位點（IRES）和編碼與多聚化結構域融合的免疫原的核苷酸序列。在此實例中，將DNA構建體設計為包括IRES、多核苷酸負載物和間隔子元件。該多核苷酸負載物包括ORF。ORF包括分泌訊息序列或天然前導序列，以及編碼免疫原和多聚化結構域的核苷酸序列。表3提供了包括SARS-CoV-2 RBD免疫原或與T4 foldon、bann或鐵蛋白多聚化結構域融合的流感HA免疫原的構建體設計。 [表3]：構建體設計
ORF 核酸序列 ORF 胺基酸序列 描述 IRES
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATTGCTGTGGCCGAGGCCAAGAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCCGTGTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCGGGTATATCCCTGAAGCCCCCAGGGACGGCCAGGCTTACGTCAGAAAGGATGGAGAGTGGGTGCTCTTGAGCACCTTCCTG （SEQ ID NO: 84） MGVKVLFALICIAVAEAKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL（SEQ ID NO: 85） gLuc訊息序列； SARS-CoV-2 RBD免疫原； T4 foldon多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）或CVB3（SEQ ID NO: 80）
atgggagtcaaagttctgtttgccctgatctgcattgctgtggccgaggccaagagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcatcaaccacgtgggcggaaccggcggcgccatcatggcccccgtggccgtgacccggcagctggtgggcagc （SEQ ID NO: 88） MGVKVLFALICIAVAEAKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFINHVGGTGGAIMAPVAVTRQLVGS（SEQ ID NO: 89） gLuc訊息序列；SARS-CoV-2 RBD免疫原；Bann多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）
atgggagtcaaagttctgtttgccctgatctgcattgctgtggccgaggccaagagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatccgtgtatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcgacatcattaagctgctcaacgagcaggtgaacaaggagatgaacagctccaacctgtacatgagcatgagcagctggtgctacacccacagcctggacggcgccggcctgttcctgtttgaccacgccgctgaggaatacgagcacgccaagaaactgatcgtgttcctgaacgagaacaacgtgcccgtgcagctgaccagcatcagcgcccccgagcacaagttcgagagcctgacccagatcttccagaaggcctacgagcacgagcagcacatcagcgagagcatcaacaacatcgtcgaccacgccatcaagggcaaggaccacgccaccttcaacttcctgcagtggtacgtgagcgagcagcacgaggaggaggtgctgttcaaggacatcctggacaagatcgagctgatcggcaacgagaaccacggcctgtacctggccgaccagtacgtgaagggcatcgccaagagccgcaaaagt （SEQ ID NO: 86） MGVKVLFALICIAVAEAKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIVFLNENNVPVQLTSISAPEHKFESLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKGKDHATFNFLQWYVSEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS（SEQ ID NO: 87） gLuc訊息序列；SARS-Cov-2 RBD免疫原；鐵蛋白多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）
ATGAAAGCCATTCTGGTCGTCCTCCTGTATACCTTTGCCACAGCTAACGCTGATACCCTCTGCATTGGCTATCACGCTAACAACAGTACCGATACCGTCGACACAGTGCTCGAGAAAAACGTCACCGTCACCCATAGCGTCAACCTCCTGGAAGACAAACATAACGGAAAACTGTGTAAGCTCCGGGGAGTGGCTCCCCTCCACCTCGGCAAGTGTAATATCGCCGGCTGGATTCTCGGCAATCCTGAGTGTGAAAGCCTCAGCACAGCCAGTTCTTGGAGTTACATTGTCGAAACCCCTAGCAGCGATAACGGAACCTGTTACCCTGGCGATTTCATTGATTACGAGGAACTGCGCGAACAGCTCAGCTCTGTGAGCAGTTTCGAACGGTTTGAGATTTTCCCTAAGACAAGCAGTTGGCCTAACCACGACAGTAACAAAGGCGTCACCGCCGCTTGCCCTCACGCTGGAGCCAAAAGCTTTTACAAAAACCTCATTTGGCTCGTCAAGAAGGGAAACAGTTACCCTAAGCTCAGCAAAAGCTATATTAACGATAAAGGCAAAGAAGTCCTCGTCCTCTGGGGAATTCACCACCCTAGCACAAGCGCTGACCAACAAAGTCTGTATCAAAACGCTGACGCTTACGTCTTTGTGGGAAGCTCTCGGTATAGCAAAAAGTTTAAGCCTGAGATTGCCATTCGGCCTAAGGTCCGCGACGGAGAGGGACGCATGAATTATTATTGGACACTGGTCGAACCCGGAGACAAAATCACATTCGAAGCCACAGGCAATCTGGTCGTGCCTCGCTACGCTTTTGCTATGGAACGCAACGCTGGCAGTGGCATTATTATTAGCGATACCCCTGTCCACGATTGTAACACAACCTGTCAGACACCCAAAGGCGCTATCAATACCAGTCTGCCTTTCCAAAACATTCACCCTATCACAATCGGAAAGTGTCCCAAATACGTCAAAAGTACAAAACTGCGCCTGGCTACCGGACTGCGCAACATTCCCAGTATCCAAAGCCGCGGCCTCTTCGGAGCCATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGCTGGACCGGAATGGTCGACGGCTGGTACGGCTATCATCATCAAAACGAACAAGGAAGTGGATACGCCGCTGATCTCAAGAGTACACAAAACGCTATTGACGAAATTACCAATAAGGTCAACAGTGTGATTGAGAAAATGAATACCCAATTCACAGCCGTCGGCAAAGAGTTTAACCATCTGGAAAAGCGCATCGAAAACCTCAACAAAAAGGTCGACGACGGATTCCTCGACATTTGGACATATAACGCTGAACTGCTGGTCCTGCTCGAAAACGAACGCACCCTCGATTATCACGATAGTAACGTCAAAAACCTCTACGAAAAGGTCCGGAGTCAGCTCAAGAATAACGCTAAGGAAATCGGAAACGGCTGTTTTGAGTTTTACCATAAGTGTGACAATACCTGTATGGAAAGCGTCAAAAACGGAACATACGATTACCCTAAGTATAGCGAAGAGGCTAAGCTCAACCGCGAGGAAATTGACGGAGTGAAACTGGAAAGCACACGGATTTACGGCGGCGGCGGCAGTGGCTATATCCCCGAGGCCCCCCGGGACGGCCAGGCCTACGTGCGGAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGTTGAGCACCTTCCTGGGCGGCGGAGGCACATGAAGGCCATCCTGGTGGTTCTGCTGTACACCTTCGCCACCGCCAACGCCGACACCCTGTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCGACACCGTGGACACCGTGCTGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTCGAGGACAAGCACAACGGCAAGCTGTGCAAGCTGCGGGGCGTGGCCCCCCTGCACCTGGGCAAGTGCAATATTGCTGGCTGGATCCTGGGCAACCCCGAGTGCGAGAGCCTGAGCACCGCTAGCAGTTGGAGCTACATCGTGGAAACACCCAGCTCTGACAACGGCACCTGCTACCCCGGCGACTTCATCGACTACGAGGAGCTGCGGGAGCAGCTGAGCAGCGTGAGCTCCTTCGAGCGGTTCGAGATCTTCCCCAAGACCAGCAGCTGGCCCAATCACGATAGCAATAAGGGCGTGACCGCCGCCTGCCCCCACGCCGGCGCCAAGAGCTTCTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCCAAGCTGAGCAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAGGAGGTCCTGGTCCTGTGGGGCATCCACCACCCCAGCACCAGCGCCGACCAGCAGAGCCTGTACCAGAACGCCGACGCCTACGTGTTCGTGGGCAGCAGCCGGTACAGCAAGAAGTTCAAGCCCGAGATCGCCATCCGGCCCAAGGTGCGGGACGGCGAGGGCCGGATGAACTACTACTGGACCCTGGTGGAGCCCGGCGACAAGATCACCTTCGAGGCCACCGGCAACCTGGTGGTGCCCCGGTACGCCTTCGCCATGGAGCGGAACGCCGGCAGCGGCATCATAATCAGCGACACCCCCGTGCACGACTGCAACACCACTTGCCAGACCCCCAAGGGCGCCATCAACACCAGCCTGCCCTTCCAGAACATCCACCCCATCACCATCGGCAAGTGCCCCAAGTACGTGAAAAGCACCAAGCTGCGGCTGGCCACCGGCCTGCGGAACATCCCCAGCATCCAGAGCCGGGGCCTGTTCGGCGCTATTGCCGGCTTCATCGAGGGCGGGTGGACCGGCATGGTGGACGGCTGGTACGGCTACCACCACCAGAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACCTCAAAAGTACCCAGAACGCCATCGACGAGATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTCACCGCCGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGCGGATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAGCTGCTGGTGCTGCTGGAGAACGAGCGGACCCTGGACTACCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGCGGAGCCAGCTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAGGCCAAGCTGAACCGGGAGGAAATCGACGGCGTGAAGCTGGAGAGCACCCGGATCTAC（SEQ ID NO: 93） MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDGEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYGGGGS GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGGGSMKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDGEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIY（SEQ ID NO: 92） 天然前導序列；流感A H1N1血球凝集素（HA）免疫原；（A/加利福利亞/07/2009）；T4 foldon多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）
atgaaggccatcctggtggtcctgctgtacaccttcgccaccgccaacgccgacaccctgtgcatcggctaccacgccaacaatagcaccgacaccgtggacaccgtgctggagaagaacgtgaccgtgacccacagcgtgaacctgctggaggacaagcacaacggcaagctgtgcaagctgcggggcgtggcccccctgcacctgggcaagtgcaatattgctggctggatcctgggcaaccccgagtgcgagagcctgagcaccgccagctcctggagctacatcgtggaaacacccagcagcgacaacggcacctgctaccccggcgacttcatcgactacgaggaactgcgggagcagctgagctctgtgagcagcttcgagcggttcgagatcttccccaagaccagcagctggcccaatcacgatagcaataagggcgtgaccgccgcttgcccccacgccggcgccaagagcttctacaagaacctgatctggctggtgaagaaaggcaacagctaccccaagctgagcaagagctacatcaacgacaagggcaaggaggtgctggtgctgtggggcatccaccatcccagcaccagcgccgaccagcaaagcctgtaccagaacgccgacgcctacgtgttcgtgggcagctcccggtacagcaagaagttcaagcccgagatcgccatccggcccaaggtgcgggacggcgagggccggatgaactactattggaccctggtggagcccggcgacaagatcaccttcgaggccaccggcaacctggtggtgccccggtacgccttcgccatggagcggaacgccggcagcggcatcattatcagcgacacccccgtgcacgactgcaacaccacctgccagacccccaagggcgccatcaacaccagcctgcccttccagaacatccaccccatcaccatcggcaagtgccccaagtacgtgaaaagcaccaagctgcggctggccaccggcctgcggaacatccccagcatccagagccggggcctgttcggcgctattgccggcttcatcgagggcggctggaccggcatggtggacggctggtacggctaccaccaccagaacgagcagggcagcggctacgccgccgacctcaaaagtacccagaacgccatcgacgagatcaccaacaaggtgaacagcgtgatcgagaagatgaacacccagttcaccgccgtgggcaaggagttcaaccacctggagaagcggatcgagaacctgaacaagaaggtggacgacggcttcctggacatctggacctacaacgccgagctgctcgtgctgctggagaacgagcggaccctggactaccacgacagcaacgtgaagaacctgtacgagaaggtgcggagccagctgaagaacaacgccaaggagatcggcaacggctgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacacctgcatggagagcgtgaagaacggcacctacgactaccccaagtacagcgaggaggccaagctgaaccgggaggagatcgacggcgtgaagctggagagcacccggatctacggcggcgggggcagcatcaaccacgtgggcggcaccggcggagccatcatggcccccgtggccgtgacccggcagctggtgggc（SEQ ID NO: 91） MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDGEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYGGGGSINHVGGTGGAIMAPVAVTRQLVG（SEQ ID NO: 90） 天然前導序列；流感A H1N1血球凝集素（HA）免疫原（A/加利福利亞/07/2009）；Bann多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）
ATGAAGGCCATCCTGGTGGTCCTGCTGTACACCTTCGCCACCGCCAACGCCGACACCCTGTGCATCGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGACACCGTGGACACCGTGCTGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAACGGCAAGCTGTGCAAGCTGCGGGGCGTGGCCCCCCTGCACCTGGGCAAGTGCAATATTGCTGGCTGGATCCTGGGCAACCCCGAGTGCGAGAGCCTGAGCACCGCCAGCTCCTGGAGCTACATCGTGGAAACACCCAGCAGCGACAACGGCACCTGCTACCCCGGCGACTTCATCGACTACGAGGAACTGCGGGAGCAGCTGAGCTCTGTGAGCAGCTTCGAGCGGTTCGAGATCTTCCCCAAGACCAGCAGCTGGCCCAATCACGATAGCAATAAGGGCGTGACCGCCGCTTGCCCCCACGCCGGCGCCAAGAGCTTCTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAAGGCAACAGCTACCCCAAGCTGAGCAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAGGAGGTGCTGGTGCTGTGGGGCATCCACCATCCCAGCACCAGCGCCGACCAGCAAAGCCTGTACCAGAACGCCGACGCCTACGTGTTCGTGGGCAGCTCCCGGTACAGCAAGAAGTTCAAGCCCGAGATCGCCATCCGGCCCAAGGTGCGGGACGGCGAGGGCCGGATGAACTACTATTGGACCCTGGTGGAGCCCGGCGACAAGATCACCTTCGAGGCCACCGGCAACCTGGTGGTGCCCCGGTACGCCTTCGCCATGGAGCGGAACGCCGGCAGCGGCATCATTATCAGCGACACCCCCGTGCACGACTGCAACACCACCTGCCAGACCCCCAAGGGCGCCATCAACACCAGCCTGCCCTTCCAGAACATCCACCCCATCACCATCGGCAAGTGCCCCAAGTACGTGAAAAGCACCAAGCTGCGGCTGGCCACCGGCCTGCGGAACATCCCCAGCATCCAGAGCCGGGGCCTGTTCGGCGCTATTGCCGGCTTCATCGAGGGCGGCTGGACCGGCATGGTGGACGGCTGGTACGGCTACCACCACCAGAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACCTCAAAAGTACCCAGAACGCCATCGACGAGATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTCACCGCCGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGCGGATCGAGAACCTGAACAAGAAGGTGGACGACGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAGCTGCTCGTGCTGCTGGAGAACGAGCGGACCCTGGACTACCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGCGGAGCCAGCTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAGGCCAAGCTGAACCGGGAGGAGATCGACGGCGTGAAGCTGGAGAGCACCCGGATCTACGGCGGCGGGGGCAGCGACATCATTAAGCTGCTCAACGAGCAGGTGAACAAGGAGATGAACAGCTCCAACCTGTACATGAGCATGAGCAGCTGGTGCTACACCCACAGCCTGGACGGCGCCGGCCTGTTCCTGTTTGACCACGCCGCTGAGGAATACGAGCACGCCAAGAAACTGATCGTGTTCCTGAACGAGAACAACGTGCCCGTGCAGCTGACCAGCATCAGCGCCCCCGAGCACAAGTTCGAGAGCCTGACCCAGATCTTCCAGAAGGCCTACGAGCACGAGCAGCACATCAGCGAGAGCATCAACAACATCGTCGACCACGCCATCAAGGGCAAGGACCACGCCACCTTCAACTTCCTGCAGTGGTACGTGAGCGAGCAGCACGAGGAGGAGGTGCTGTTCAAGGACATCCTGGACAAGATCGAGCTGATCGGCAACGAGAACCACGGCCTGTACCTGGCCGACCAGTACGTGAAGGGCATCGCCAAGAGCCGCAAAAGT（SEQ ID NO: 95） MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDGEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYGGGGSDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIVFLNENNVPVQLTSISAPEHKFESLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKGKDHATFNFLQWYVSEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS（SEQ ID NO: 96） 天然前導序列；流感A H1N1血球凝集素（HA）免疫原；鐵蛋白多聚化結構域 EMCV （SEQ ID NO: 79）
也將DNA構建體設計為包括經修飾的CVB3 IRES（SEQ ID NO: 80）和作為ORF的與T4 foldon多聚化結構域融合的RSV F免疫原（具有其天然前導序列）或人MPV F免疫原（具有其天然前導序列）的組合。
在此實例中，使用本文所述之方法藉由自剪接來產生環狀RNA。在存在7.5 mM的NTP的情況下，藉由體外轉錄使用T7 RNA聚合酶從包括以上列出的模體的DNA模板合成未經修飾的線性RNA。用RNA純化套組（新英格蘭生物學實驗室公司（New England Biolabs），T2050）純化合成的線性RNA。自剪接發生在轉錄期間；不需要另外的反應。藉由尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳（尿素-PAGE）或逆相柱層析法來純化環狀RNA。 實例 2 ：具有多聚化結構域的免疫原的體外表現
此實例證明在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現具有多聚化結構域的免疫原。
如實例1所述，產生編碼與T4 foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 84；胺基酸SEQ ID NO: 85結構域）（circRNA-RBD-Foldon）。編碼不具有多聚化結構域的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 82；胺基酸 SEQ ID NO: 83）（circRNA-RBD（單體））藉由本文所述之方法產生和純化。兩種構建體包括具有以下作為IRES元件的核酸序列的EMCV： ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA（SEQ ID NO: 79）。
根據製造商的說明，使用Lipofectamine MessengerMax（英傑公司（Invitrogen），LMRNA015）將環狀RNA轉染到HEK293T中。使用單獨的MessengerMax（空白）作為對照。還使用重組SARS-CoV-2 RBD蛋白（義翹神州生物技術有限公司（Sino Biological）；40592-V08H）和SARS-CoV-2 RBD三聚體蛋白（百普賽斯生物科技股份有限公司（Acro Biosystems）；SPD-C52M5-200 ug）作為對照（分別為RBD對照和RBD-三聚體對照）。24小時後收穫細胞上清液。將樣本經由SDS-PAGE在非變性或變性條件（上樣緩衝液，不具有與具有β-巰基乙醇）下跑膠。然後用2G1抗RBD單株抗體（艾博抗公司（Abcam），ab277624）作為一抗，並且用螢光「680CW」山羊抗小鼠IgG（Licor公司，926-68070）作為二抗，進行西方印漬術。結果示於 圖 6，其中星號表示在變性條件下運行的樣本（即，在上樣緩衝液中包括β-巰基乙醇的樣本）。
圖 6示出circRNA RBD在HEK293T中表現RBD單體，並且編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的circRNA在體外表現並形成三聚體結構（三聚體）。 實例 3 ：在小鼠模型中由環狀 RNA 體內表現免疫原
此實例證明由環狀RNA體內表現具有和不具有多聚化結構域的免疫原。
如實例1所述，產生編碼與Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 84；胺基酸SEQ ID NO: 85結構域）（circRNA-RBD-Foldon（三聚體））。編碼不具有多聚化結構域的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA（核酸SEQ ID NO: 82；胺基酸 SEQ ID NO: 83）（circRNA-RBD（單體））藉由本文所述之方法產生和純化。兩種構建體包括作為IRES元件的EMCV（SEQ ID NO: 79）。
將純化的環狀RNA配製成脂質奈米顆粒以獲得環狀RNA製劑。簡言之，將環狀RNA在pH = 4的25 mM乙酸鹽緩衝液中稀釋（通過0.2 um過濾器過濾）至0.2 µg/uL的濃度。首先藉由將可電離脂質（例如ALC0315）、膽固醇、DSPC和DMG-PEG2000以50/38.5/10/1.5 mol%的莫耳比溶解在乙醇中（通過0.2 um無菌過濾器過濾）來配製脂質奈米顆粒（LNP）。最終可電離脂質/RNA重量比為6/1 w/w。使用微流體系統將脂質和RNA溶液在微混合器晶片中混合，流速比為3/1緩衝液/乙醇且總流速為1 ml/min。然後將LNP在pH = 7.4的PBS中透析3小時以去除乙醇。根據需要，可使用截止值為100 kDa的Amicon離心過濾器將LNP濃縮至所需的RNA濃度。
在第0天（初免）和第28天（加強）經由肌肉注射將5-µg劑量的環狀RNA製劑投與於每組三隻Balb/C小鼠（n = 3）。在初免後24小時，從每隻小鼠中收集血清樣本。使用SARS-CoV-2 RBD免疫原特異性ELISA測量單體和三聚體的表現。將ELISA板用捕獲抗體（義翹神州生物技術有限公司（SinoBiological），40150-D003）包被過夜。用TBST + 2% BSA將板封閉，將血清在封閉緩衝液中稀釋，然後添加至板中。用HRP軛合的檢測抗體（40150-D001-H，義翹神州生物技術有限公司）檢測RBD。數據在 圖 7中顯示為每組三隻動物之平均值。在初免後24小時，在血清中檢測到相似水平的SARS-CoV-2 RBD和與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原。
結果顯示，在小鼠模型中，SARS-CoV-2 RBD和與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原由環狀RNA以相當的水平表現。 實例 4 ：小鼠模型中來自環狀 RNA 的免疫原的免疫原性
此實例證明編碼具有多聚化結構域的免疫原的環狀RNA在小鼠中誘導免疫原特異性響應。
在第14、27、35和42天，從投與如實例3中所述之環狀RNA製劑的小鼠中分離血清樣本。如下藉由ELISA測量結合抗體響應：測定各血清樣本中是否存在RBD特異性IgG。將ELISA板在4°C下用在100 µL的1X包被緩衝液（百進生技公司（Biolegend），421701）中的SARS-CoV-2 RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08B；100 ng）或SARS-CoV-2-RBD（義翹神州生物技術有限公司，40592-V08H）包被過夜。然後用封閉緩衝液（含2% BSA和0.05%吐溫20的TBS）將板封閉1小時。將血清樣本連續稀釋8次（4倍稀釋，從500至8,192,000），然後添加到每個孔中的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用含Tween®洗滌劑的1X Tris緩衝液（TBS-T）洗滌三次後，將板與抗小鼠IgG HRP檢測抗體（艾博抗公司，ab97023）孵育1小時，接著用TBS-T洗滌三次，然後添加四甲基苯（百進生技公司，421101）。使ELISA板反應10-20分鐘，然後使用0.2 N硫酸淬滅。在450 nm下測定光密度（O.D.）值。終點滴度定義為吸光度值高於背景4倍的最後一次稀釋。
圖 8示出用編碼SARS-CoV-2RBD的circRNA或編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的circRNA進行免疫接種後第14、27、35和42天的平均終點滴度。在注射後第42天，將小鼠處死，收穫脾臟，並且根據製造商的方案（邁博太科公司（Mabtech），3321-4HPT-10）藉由ELISpot測定測試SARS-CoV-2 RBD T細胞響應。簡言之，收穫脾臟並將其加工成單細胞懸浮液。將脾細胞以每孔0.5 M細胞接種在IFN-γ ELISpot板上。脾細胞不受刺激或用RBD 1 ug/mL或RBD肽庫（JPT，PM-WCPV-S-RBD-2）刺激。將細胞培養過夜，第二天根據製造商的方案將板顯色。
結果顯示，circRNA SARS-CoV-2 RBD和編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的circRNA在免疫接種後在小鼠中引發T細胞響應（ 圖 9）。
在噬菌斑減少中和試驗（PRNT）中測試注射後第42天收集的血清中和抗體滴度。簡而言之，將血清連續稀釋，與SARS-CoV-2病毒原液混合，並置於Vero E6細胞上。用低熔點瓊脂糖覆蓋板並孵育3天，隨後固定並用結晶紫染色。中和滴度報告為ID50：血清使噬菌斑數目減少百分之五十（50%）的稀釋度。 圖 10示出circRNA SARS-CoV-2 RBD和編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的circRNA均生成針對SARS-CoV-2的中和抗體。
實例4的結果表明，具多聚化結構域由環狀RNA表現的免疫原在小鼠中誘導免疫原特異性響應。 實例 5 ：非人靈長類動物模型中來自環狀 RNA 的免疫原的體內表現
此實例證明，在非人靈長類動物（NHP）中由環狀RNA體內表現具有多聚化結構域的免疫原。
如實例1所述，產生編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原（核酸SEQ ID NO: 84；胺基酸SEQ ID NO: 85）和包括EMCV（SEQ ID NO: 79）作為IRES的環狀RNA。
如實例3所述，將環狀RNA配製在LNP中（LNP配製的環狀RNA）。還藉由與等體積的AddaSO3™佐劑溶液混合來配製環狀RNA（有佐劑的環狀RNA）。
在第0天（初免）和第28天（加強）經由肌內注射將30 µg或100 µg劑量的LNP配製的環狀RNA，或者1000 µg劑量的有佐劑的環狀RNA投與於每組三隻食蟹猴（n = 3）。在初免後6小時、第1天、第4天、第6天，從每隻猴子中收集血清樣本。根據製造商的方案（MDS，S-PLEX SARS-CoV-2刺突套組，K150ADJS-2），使用SARS-CoV-2刺突免疫測定法來測量與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原水平。
在投與有佐劑的環狀RNA的猴子的血清中未檢測到與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原表現。在接受100 µg LNP配製的環狀RNA的猴子的血清中檢測到與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原（ 圖 11 ，數據顯示為每組三隻動物的平均值）。在初免後6小時檢測到約3500 fg/mL的與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原水平，其中與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的濃度在收集樣本的初免後6天期間降低。 實例 6 ：非人靈長類動物模型中來自環狀 RNA 的免疫原的免疫原性
此實例證明編碼具有多聚化結構域的免疫原的環狀RNA在非人靈長類動物（NHP）中誘導免疫原特異性響應。
如實例5中所述，在初免後第14、35、42和56天，從投與100 µg劑量的LNP配製的環狀RNA或1000 µg劑量的有佐劑的環狀RNA的猴子中分離血清樣本。
根據製造商的方案（MDS，S-PLEX SARS-CoV-2刺突套組，K150ADJS-2），使用SARS-CoV-2刺突免疫測定法來測量結合抗體。NHP血清以1 : 1000或1 : 5000或1 : 50 000稀釋。使用合併的血清標準品內推結合抗體濃度，並且結果報告為以的幾何平均國際單位/mL。
圖 12示出在預采血時、在用有佐劑的環狀RNA和LNP配製的環狀RNA進行免疫接種後第14天和第42天的抗體的幾何平均值。結果顯示，LNP配製的環狀RNA在初免後第42天引發了RBD特異性結合抗體，並且有佐劑的環狀RNA引發與獲得的相似水平的RBD特異性結合抗體。
在噬菌斑減少中和試驗（PRNT）中測試預采血時、初免後第14天和第42天收集的血清中的中和抗體滴度。簡而言之，將血清連續稀釋，與SARS-CoV-2病毒原液混合，並置於Vero E6細胞上。用低熔點瓊脂糖覆蓋板並孵育3天，隨後固定並用結晶紫染色。中和滴度報告為ID50：血清使噬菌斑數目減少百分之五十（50%）的稀釋度。數據在 圖 13中顯示為在預采血時、加強後第14天和第42天的幾何平均中和滴度。
圖 13示出了LNP配製的編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA和有佐劑的編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA引發了中和SARS-CoC-2中和抗體。 實例 7 ：非人靈長類動物模型中來自環狀 RNA 的免疫原的 T 細胞響應
在免疫接種前和免疫接種後第42天收穫並冷凍周圍血單核細胞（PBMC）。解凍PBMC，並使用ELISpot測定法檢測SARS-CoV-2 RBD特異性T細胞的存在。將細胞以0.2 M/孔鋪板在IFN-γ或IL-4 ELISpot板（ImmunoSpot）上，並且不受刺激或用SARS-CoV-2肽池（JPT，PM-WCPVS-2）刺激。將ELISPOT板根據製造商的方案進行處理。 實例 8 ：編碼多聚化和免疫原序列的環狀 RNA 的設計、生成和純化
此實例描述了編碼多聚化結構域（例如，鐵蛋白、bann、T4 foldon或AaLS）和免疫原（例如，gE VZV免疫原或SARS-CoV2 RBD免疫原）的環狀RNA的設計和體外生成及純化。將環狀RNA設計為包括IRES和編碼VZV或與多聚化結構域融合的另一免疫原的核酸序列。一些環狀RNA編碼天然前導序列或分泌訊息。
在該實例中，藉由兩種示例性方法之一生成環狀RNA，並再次用RNA純化系統純化。 示例性方法 1 ： DNA 夾板連接
該方法藉由夾板連接產生環狀RNA。使用夾板DNA將RppH處理的線性RNA環化。使用T7 RNA聚合酶藉由體外轉錄從DNA區段合成未經修飾的線性RNA。轉錄的RNA用RNA純化系統（新英格蘭生物學實驗室公司（New England Biolabs））純化，用RNA 5'磷酸水解酶（RppH）（新英格蘭生物學實驗室公司，M0356）按照製造商的說明處理。替代性地或另外，RNA在GMP相對於GTP過量的情況下轉錄。
夾板連接如下進行：藉由使用RNA連接酶處理轉錄的線性RNA和長度介於10至40個核苷酸之間的DNA夾板來生成環狀RNA。為了純化環狀RNA，在4%變性PAGE上解析連接混合物，並切除對應於每個環狀RNA的RNA條帶。碾碎切除的RNA凝膠片段，並用凝膠洗脫緩衝劑（0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA）在37°C下洗脫RNA一小時。替代性地或另外，藉由柱層析法純化環狀RNA。收穫上清液，並藉由向碾碎的凝膠中添加凝膠洗脫緩衝劑再次洗脫RNA，並孵育一小時。藉由離心過濾器去除凝膠碎片，並用乙醇沈澱。使用瓊脂糖凝膠電泳作為驗證純度和環化的品質控制測量。 示例性方法 2 ：藉由自剪接內含子進行環化
該方法藉由自剪接產生環狀RNA。環狀RNA在體外生成。未修飾的線性RNA從包括以上列出的所有模體的DNA模板體外轉錄。體外轉錄反應包括1 µg模板DNA T7 RNA聚合酶啟動子、10X T7反應緩衝液、7.5 mM ATP、7.5 mM CTP、7.5 mM GTP、7.5 mM UTP、10 mM DTT、40 U RNA酶抑制劑和T7酶。在37°C下轉錄4小時。將轉錄的RNA用1 U的DNA酶I在37°C下DNA酶處理15分鐘。為了有利於藉由自剪接進行的環化，添加額外的GTP至終濃度2 mM，在55°C下孵育15分鐘。然後將RNA進行柱純化，並藉由UREA-PAGE視覺化。 實例 9 ：具有多聚化結構域的免疫原的體外表現
此實例描述了在哺乳動物細胞中由環狀RNA表現免疫原。為了測量來自RNA構建體的具有多聚化結構域的免疫原的表現，根據本文所述之方法生產和純化編碼免疫原的環狀RNA。使用MessengerMax（英傑公司，LMRNA）將環狀RNA（1皮莫耳）轉染到HEK293T（24孔板中無血清培養基中，每孔200,000個細胞）中。24小時後收穫細胞上清液。ELISA如下進行：將捕獲抗體於4°C在100 µL PBS中包被到ELISA板（MaxiSorp 442404，96孔）上過夜。用TBS-T洗滌三次後，將板用封閉緩衝液（含2% FBS和0.05%吐溫20的TBS）封閉1小時。然後將上清液稀釋液添加到每個孔的100 µL封閉緩衝液中，並在室溫下孵育1小時。用TBS-T洗滌三次後，將板與HRP檢測抗體在室溫下孵育1小時。將四甲基苯（Pierce 34021）添加到每個孔中，使其反應5-15分鐘，然後用2 N硫酸淬滅。將在450 nm下測定光密度（OD）值。藉由對來自用編碼具有或不具有多聚化結構域的免疫原的環狀RNA轉染的細胞的上清液運行非變性Blue Native PAGE來確定成功的免疫原多聚化的驗證。將Blue Native凝膠轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以進行用特異性一抗和抗同種型螢光標記的二抗探測免疫原的西方印漬術。預期多聚化的免疫原的分子量將高於非多聚化的免疫原的分子量。 實例 10 ：在小鼠模型中由環狀 RNA 體內表現免疫原
此實例證明由環狀RNA體內表現具有和不具有多聚化結構域的免疫原。如實例8中所述設計和產生環狀RNA。將環狀RNA配製成脂質奈米顆粒，以獲得環狀RNA製劑。將不同濃度的環狀RNA製劑投與於每組3隻小鼠，包括具有不編碼多聚化結構域的環狀RNA的組。在第0天向小鼠肌內投與環狀RNA製劑，4週後第二次投與。將對照組小鼠用媒介物和非環狀RNA進行處理。在整個時間過程中採集血樣，以藉由ELISA監測血清中免疫原特異性抗體滴度。在給藥後1天、2天、3天和7天，以及然後每週（持續9週）藉由頜下出血將每隻小鼠的血液（約100 µl）收集到乾燥的試管中。藉由在4°C下以1,300 g離心25分鐘來收集血清，並按照製造商的說明藉由ELISA來測量免疫原水平。
將小鼠在終點時間點處死。收穫脾臟和血液，並且藉由流動式細胞測量術和ELISpot測試脾細胞和血清的免疫原特異性。在感染抑制測定中測試收集的血清，以確定血清抗體的中和能力。 實例 11 ：在小鼠模型中由與佐劑一起遞送的環狀 RNA 體內表現免疫原
此實例證明具有和不具有多聚化結構域的免疫原由藉由與佐劑（如AddaSO3™佐劑）一起遞送而免疫增強的環狀RNA體內表現。如實例8中所述設計和產生環狀RNA。還藉由與等體積的AddaSO3™佐劑溶液混合來配製環狀RNA。在第0天向小鼠肌內投與環狀RNA/佐劑製劑，4週後第二次投與。將對照組小鼠用媒介物和非環狀RNA進行處理。可以包括含有環狀RNA但不含佐劑或LNP中配製的環狀RNA的其他對照組。在整個時間過程中採集血樣，以藉由ELISA監測血清中免疫原特異性抗體滴度。在給藥後1天、2天、3天和7天，以及然後每週（持續9週）藉由頜下出血將每隻小鼠的血液（約100 µl）收集到乾燥的試管中。藉由在4°C下以1,300 g離心25分鐘來收集血清，並按照製造商的說明藉由ELISA來測量免疫原水平。
將小鼠在終點時間點處死。收穫脾臟，並且藉由流動式細胞測量術和ELISpot測試脾細胞的免疫原特異性T細胞。在感染抑制測定中測試收集的血清，以確定血清抗體的中和能力。 實例 12 ：具有和不具有 foldon 結構域的小鼠中不同劑量的 SARS-Cov-2 受體結合結構域（ RBD ）環狀 RNA 的評價
此實例測量肌內或皮內注射不同配製物和不同劑量的具有和不具有foldon序列的編碼RBD的環狀RNA（circRNA）的小鼠的免疫響應。將小鼠分成十三個相等的組：注射PBS和非環狀RNA的對照組、circRNA-RBD 0.1 µg LNP配製物、circRNA-RBD 1.0 µg LNP配製物、circRNA-RBD 0.1 µg LNP配製物（具有foldon）、circRNA-RBD 1.0 µg LNP配製物（具有foldon）、circRNA-RBD 0.1 µg AddaSO3配製物、circRNA-RBD 1.0 µg AddaSO3配製物、circRNA-RBD 0.1 µg AddaSO3配製物（具有foldon）、circRNA-RBD 1.0 µg AddaSO3配製物（具有foldon）、circRNA-RBD 0.1 µg CpG+Alum配製物、circRNA-RBD 1.0 µg CpG+Alum配製物、circRNA-RBD 0.1 µg CpG+Alum配製物（具有foldon）、和circRNA-RBD 1.0 µg CpG+Alum配製物（具有foldon）。評估配製物的能力以證明由編碼多種抗原表現的環狀RNA的投與產生抗體響應。
注射後4小時，藉由頜下出血將每隻小鼠的血液（約100 µl）收集到乾燥的試管中。注射後24小時每組終止兩隻小鼠，其餘小鼠在第14、28和35天放血取樣。在第49天將小鼠處死，進行最後的放血和脾臟收集。收穫脾臟，並且藉由流動式細胞測量術和ELISpot測試RBD免疫原特異性T細胞。 其他實施方式
在不脫離本發明之範圍和精神的情況下，本發明所述之組成物、方法和用途的各種修改和變化對熟悉該項技術者將是顯而易見的。雖已結合具體實施方式描述了本發明，但應當理解，所要求的發明不應當過度地局限於此類具體實施方式。事實上，對於熟悉該項技術者顯而易見的用於進行本發明的所述方式的各種修改旨在落入本發明之範圍內。
所有出版物、專利和專利申請均藉由援引以其全文併入本文，其程度如同特別且單獨地指出將每個單獨的出版物、專利或專利申請藉由援引以其全文併入一樣。
無
[ 圖 1]係編碼免疫原和一或多個多聚化結構域的示例性多核糖核苷酸構建體和示例性相應免疫原複合物之示意圖。
[ 圖 2]係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，每個表現序列與IRES可操作地連接，並且其中至少一個表現序列係免疫原（包括多聚化結構域）。
[ 圖 3]係包括兩個表現序列的示例性環狀RNA之示意圖，這兩個表現序列被切割結構域（例如，2A、弗林蛋白酶位點或弗林蛋白酶-2A）隔開，其中至少一個表現序列係免疫原（包括多聚化結構域），並且全部表現序列與IRES可操作地連接。
[ 圖 4]示出了包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的ORF和多核苷酸佐劑序列（例如，刺激先天性免疫系統的非編碼核苷酸序列）的環狀RNA之示意圖。
[ 圖 5]示出了多個環狀RNA之示意圖，其中第一環狀RNA包括編碼免疫原（包括多聚化結構域）的ORF，並且第二環狀RNA包括編碼第二免疫原或多肽佐劑的ORF。
[ 圖 6]示出了用編碼重組SARS-CoV-2 RBD免疫原（circRNA RBD）或與foldon多聚化結構域（circRNA-RBD-Foldon）融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀多核糖核苷酸轉染24小時後HEK293T細胞中的表現的凝膠，其中星號表示樣本在變性條件下運行。 圖 6示出circRNA RBD表現RBD單體，並且編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的circRNA在體外表現並形成三聚體結構（三聚體）。
[ 圖 7]示出了在投與編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA或編碼與foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA後，小鼠血清中SARS-CoV-2 RBD免疫原的表現。
[ 圖 8]示出了在投與初始劑量（初免後劑量）的編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA或編碼與foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA後14天、27天、35天和42天，小鼠血清中產生了結合抗體。
[ 圖 9]示出了在投與初始劑量（初免後劑量）的編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA或編碼與foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA後42天，小鼠中引發了T細胞響應。
[ 圖 10]示出了在投與初始劑量（初免後劑量）的編碼SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA或編碼與foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的環狀RNA後42天，小鼠血清中產生了針對SARS-CoV-2的中和抗體。
[ 圖 11]示出了在經由肌內注射投與100 µg劑量的LNP配製的環狀RNA或1000 µg劑量的LNP配製的環狀RNA後，食蟹猴血清中與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的表現。
[ 圖 12]示出了在投與初始劑量（初免後劑量）的編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的LNP配製的環狀多核糖核苷酸或編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的有佐劑的環狀多核糖核苷酸後第42天，RBD特異性抗體在食蟹猴中引發。 圖 13示出了在投與初始劑量（初免後劑量）的編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的LNP配製的環狀多核糖核苷酸或編碼與T4 Foldon多聚化結構域融合的SARS-CoV-2 RBD免疫原的有佐劑的環狀多核糖核苷酸後第42天，中和抗體在食蟹猴中引發。
無

Claims (26)

  1. 一種環狀多核糖核苷酸，其包含開讀框，該開讀框包含編碼免疫原的序列和編碼多聚化結構域的序列。
  2. 如請求項1所述之環狀多核糖核苷酸，其中該開讀框包含按5’至3’順序排列的： (a) 編碼免疫原的第一序列和編碼多聚化結構域的第二序列； (b) 編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列； (c) 編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列、編碼免疫原的第三序列和編碼多聚化結構域的第四序列； (d) 編碼免疫原的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼多聚化結構域的第三序列； (e) 編碼多聚化結構域的第一序列和編碼免疫原的第二序列； (f) 編碼多聚化結構域的第一序列、編碼免疫原的第二序列和編碼多聚化結構域的第三序列； (g) 編碼多聚化結構域的第一序列、編碼免疫原的第二序列、編碼多聚化結構域的第三序列和編碼免疫原的第四序列；或 (h) 編碼多聚化結構域的第一序列、編碼多聚化結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列。
  3. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多聚化結構域或每個多聚化結構域包含T4 foldon結構域。
  4. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多聚化結構域或每個多聚化結構域包含鐵蛋白結構域。
  5. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多聚化結構域或每個多聚化結構域包含β環肽。
  6. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多聚化結構域或每個多聚化結構域包含AaLS肽。
  7. 如請求項1或2所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多聚化結構域或每個多聚化結構域包含二氧四氫蝶啶合酶結構域。
  8. 如請求項1所述之環狀多核糖核苷酸，其中該開讀框包含按5’至3’順序排列的： (a) 編碼免疫原的第一序列和編碼T4 foldon結構域的第二序列； (b) 編碼免疫原的第一序列和編碼鐵蛋白結構域的第二序列； (c) 編碼免疫原的第一序列和編碼β環肽的第二序列； (d) 編碼免疫原的第一序列和編碼AaLS肽的第二序列； (e) 編碼免疫原的第一序列、編碼T4 foldon結構域的第二序列和編碼免疫原的第三序列； (f) 編碼免疫原的第一序列、編碼T4 foldon結構域的第二序列和編碼鐵蛋白結構域的第三序列；或 (g) 編碼免疫原的第一序列、編碼鐵蛋白結構域的第二序列和編碼T4 foldon結構域的第三序列。
  9. 如請求項1-8中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中每種免疫原獨立地與分泌訊息序列可操作地連接。
  10. 如請求項1-9中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該開讀框與IRES可操作地連接。
  11. 如請求項1-10中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸進一步包含與第二IRES可操作地連接的編碼第二多肽的第二開讀框。
  12. 如請求項11所述之環狀多核糖核苷酸，其中該第二多肽係多肽免疫原。
  13. 如請求項11所述之環狀多核糖核苷酸，其中該第二多肽係多肽佐劑。
  14. 如請求項13所述之環狀多核糖核苷酸，其中該多肽佐劑係細胞介素、趨化因子、共刺激分子、先天性免疫刺激因子、傳訊分子、轉錄激活因子、細胞介素受體、細菌組分或先天性免疫系統的組分。
  15. 如請求項1-14中任一項所述之環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸進一步包含作為先天性免疫系統刺激因子的非編碼核糖核酸序列。
  16. 如請求項15所述之環狀多核糖核苷酸，其中該先天性免疫系統刺激因子選自富含GU的模體、富含AU的模體、包含dsRNA的結構化區域、或適配體。
  17. 一種免疫原性組成物，其包含如請求項1-16中任一項所述之環狀多核糖核苷酸和藥學上可接受的賦形劑。
  18. 如請求項17所述之免疫原性組成物，其中該組成物進一步包含第二環狀多核糖核苷酸。
  19. 如請求項18所述之免疫原性組成物，其中該第二環狀多核糖核苷酸包含編碼免疫原的開讀框。
  20. 如請求項18所述之免疫原性組成物，其中該第二環狀多核糖核苷酸包含編碼多肽佐劑的開讀框。
  21. 如請求項18所述之免疫原性組成物，其中該第二環狀多核糖核苷酸包含作為先天性免疫系統刺激因子的非編碼核糖核酸序列。
  22. 一種在受試者中誘導針對免疫原的免疫響應之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-21中任一項所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物。
  23. 一種在受試者中治療或預防疾病、病症或障礙之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-21中任一項所述之環狀多核糖核苷酸或免疫原性組成物。
  24. 如請求項22或23所述之方法，其中該受試者係人受試者。
  25. 如請求項22-24中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該受試者投與佐劑。
  26. 如請求項22-25中任一項所述之方法，該方法進一步包括向該受試者投與多肽免疫原。
TW111145101A 2021-11-24 2022-11-24 免疫原性組成物及其用途 TW202330921A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163283029P 2021-11-24 2021-11-24
US63/283,029 2021-11-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202330921A true TW202330921A (zh) 2023-08-01

Family

ID=84901161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111145101A TW202330921A (zh) 2021-11-24 2022-11-24 免疫原性組成物及其用途

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP4436598A2 (zh)
KR (1) KR20240122785A (zh)
CN (1) CN118555966A (zh)
AR (1) AR127764A1 (zh)
AU (1) AU2022397300A1 (zh)
CA (1) CA3238735A1 (zh)
IL (1) IL312965A (zh)
MX (1) MX2024006440A (zh)
TW (1) TW202330921A (zh)
WO (1) WO2023097003A2 (zh)

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1147812A (en) 1915-03-09 1915-07-27 George E Pancoast Web-printing machine.
JPH06500014A (ja) 1990-07-25 1994-01-06 シンジーン，インコーポレイテッド 多数の核酸相補体を生成させる環状伸長法
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
CA2127461A1 (en) 1992-01-13 1993-07-22 Michael D. Been Enzymatic rna molecules
US5773244A (en) 1993-05-19 1998-06-30 Regents Of The University Of California Methods of making circular RNA
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US5849727A (en) 1996-06-28 1998-12-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents
JP4656675B2 (ja) 1997-05-14 2011-03-23 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US6210931B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
JP4842821B2 (ja) 2003-09-15 2011-12-21 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド ポリエチレングリコール修飾脂質化合物およびその使用
JP4380411B2 (ja) 2004-04-30 2009-12-09 澁谷工業株式会社 滅菌方法
SG158175A1 (en) 2004-12-27 2010-01-29 Silence Therapeutics Ag Lipid complexes coated with peg and their use
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
JP2009534690A (ja) 2006-07-10 2009-09-24 メムシック，インコーポレイテッド 磁場センサーを用いて偏揺れを感知するためのシステム、および、前記システムを用いた携帯用の電子装置
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
CA2709875C (en) 2008-01-02 2019-07-16 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
PT2279254T (pt) 2008-04-15 2017-09-04 Protiva Biotherapeutics Inc Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
PL2350043T3 (pl) 2008-10-09 2014-09-30 Tekmira Pharmaceuticals Corp Ulepszone aminolipidy i sposoby dostarczania kwasów nukleinowych
EA029762B1 (ru) 2008-10-20 2018-05-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
AU2009311667B2 (en) 2008-11-07 2016-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
WO2010054384A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
NO2355851T3 (zh) 2008-11-10 2018-09-01
WO2010084371A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
CA2767127A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
ES2579936T3 (es) 2009-08-20 2016-08-17 Sirna Therapeutics, Inc. Nuevos lípidos catiónicos con diversos grupos de cabeza para el suministro oligonucleotídico
EP2506879A4 (en) 2009-12-01 2014-03-19 Protiva Biotherapeutics Inc PREPARATIONS OF SNALP CONTAINING ANTIOXIDANTS
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
US20130116419A1 (en) 2010-01-22 2013-05-09 Daniel Zewge Post-synthetic chemical modification of rna at the 2'-position of the ribose ring via "click" chemistry
WO2011097480A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal compositions and methods for the treatment of disease
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
CA2800401C (en) 2010-06-03 2020-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
EP3542789A3 (en) 2010-08-31 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
BR112013004585B1 (pt) 2010-09-20 2021-09-08 Merck Sharp & Dohme Corp Lipídeo catiônico, composição de lnp, e, uso de um lipídeo catiônico
CN103260611A (zh) 2010-09-30 2013-08-21 默沙东公司 用于寡核苷酸递送的低分子量阳离子脂质
CA2813024A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9617461B2 (en) 2010-12-06 2017-04-11 Schlumberger Technology Corporation Compositions and methods for well completions
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
WO2012162210A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Ring constrained cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2760477B1 (en) 2011-09-27 2018-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
UA119028C2 (uk) 2011-10-27 2019-04-25 Массачусеттс Інстітьют Оф Текнолоджі Функціоналізовані на n-кінці амінокислотні похідні, здатні утворювати мікросфери, що інкапсулюють лікарський засіб
WO2013070324A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived microvesicle compositions for diagnosis and treatment of disease
CN103930398B (zh) 2011-11-18 2016-08-24 日油株式会社 具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质
CA3165769A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
US20140308304A1 (en) 2011-12-07 2014-10-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
CA2856737C (en) 2011-12-07 2023-09-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
JP6182457B2 (ja) 2011-12-12 2017-08-16 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質を含有するドラックデリバリーシステムのための脂質ナノ粒子
WO2013116126A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU2013222179B2 (en) 2012-02-24 2017-08-24 Arbutus Biopharma Corporat ion Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
DK2830594T3 (en) 2012-03-27 2018-08-13 Sirna Therapeutics Inc DIETHER-BASED BIOLOGICALLY DEGRADABLE CATIONIC LIPIDS FOR siRNA RELEASE
JP6352950B2 (ja) 2013-03-08 2018-07-04 ノバルティス アーゲー 活性薬物の送達のための脂質と脂質組成物
US20160151284A1 (en) 2013-07-23 2016-06-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
CN112656954A (zh) 2013-10-22 2021-04-16 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
WO2015073587A2 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
US9365610B2 (en) 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
CA2930602C (en) 2013-11-18 2019-05-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for rna delivery
US10426737B2 (en) 2013-12-19 2019-10-01 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
ES2865825T3 (es) 2014-04-01 2021-10-18 Rubius Therapeutics Inc Procedimientos y composiciones para inmunomodulación
SI3766916T1 (sl) 2014-06-25 2023-01-31 Acuitas Therapeutics Inc. Formulacije novih lipidov in lipidnih nanodelcev za dostavo nukleinskih kislin
US20180135012A1 (en) 2015-05-13 2018-05-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
LT3310764T (lt) 2015-06-19 2023-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Alkenilu pakeisti 2,5-piperazindionai ir jų panaudojimas kompozicijose, skirtose agento pristatymui į subjektą ar ląstelę
SI3313829T1 (sl) 2015-06-29 2024-09-30 Acuitas Therapeutics Inc. Lipidi in formulacije lipidnih nanodelcev za dostavo nukleinskih kislin
WO2017004526A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 University Of Louisville Research Foundation, Inc. EDIBLE PLANT-DERIVED MICROVESICLE COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF miRNA AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER
RS63030B1 (sr) 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularno isporučivanje terapeutskih sredstava
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
CA3003055C (en) 2015-10-28 2023-08-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2017081082A2 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Curevac Ag Optimized nucleic acid molecules
EP3964200A1 (en) 2015-12-10 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
EP3397613A1 (en) 2015-12-30 2018-11-07 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
HRP20220147T1 (hr) 2016-01-11 2022-04-15 Rubius Therapeutics, Inc. Pripravci i postupci povezani s multimodalnim terapijskim staničnim sustavima za indikacije raka
CN117731805A (zh) 2016-03-30 2024-03-22 因特利亚治疗公司 用于crispr/cas成分的脂质纳米颗粒制剂
AU2017293931A1 (en) 2016-07-07 2019-01-17 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems expressing exogenous RNA
JP2019536793A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 固形腫瘍に浸透させるための細胞系に関連する組成物および方法
AU2018221227A1 (en) 2017-02-17 2019-08-15 Rubius Therapeutics, Inc. Functionalized erythroid cells
IL270496B1 (en) 2017-05-08 2024-07-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Intra-membrane aid preparations and their uses
SG11202000765PA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Generation Bio Co Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
FI3688162T3 (fi) 2017-09-29 2024-05-15 Intellia Therapeutics Inc Formulaatioita
TWI839337B (zh) 2017-09-29 2024-04-21 美商英特利亞醫療公司 用於基因組編輯之多核苷酸、組合物及方法
US20200306286A1 (en) 2017-12-15 2020-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
AU2019265018A1 (en) 2018-05-11 2020-11-26 Beam Therapeutics Inc. Methods of suppressing pathogenic mutations using programmable base editor systems
AR116016A1 (es) 2018-08-24 2021-03-25 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Métodos para fabricar paquetes mensajeros vegetales
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
WO2020061564A1 (en) 2018-09-23 2020-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 env fusion peptide nanoparticle carrier conjugates and their use
JP7543259B2 (ja) 2018-10-18 2024-09-02 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 活性剤の脂質ナノ粒子送達のための脂質
AU2019384557A1 (en) 2018-11-21 2021-06-10 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mRNA encoding CFTR
US20220142896A1 (en) 2019-03-01 2022-05-12 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Polyribonucleotides and cosmetic uses thereof
KR20210134716A (ko) 2019-03-01 2021-11-10 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 위한 조성물, 방법, 및 키트
AU2020261419A1 (en) 2019-04-25 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
JP2023504568A (ja) 2019-12-04 2023-02-03 オルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 環状ｒｎａ組成物及び方法
DE202021003575U1 (de) * 2020-02-04 2022-01-17 Curevac Ag Coronavirus-Vakzine
AU2021269137A1 (en) 2020-05-08 2022-12-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular RNA compositions and methods
CN116323945A (zh) 2020-06-25 2023-06-23 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 驱动环状rna翻译的遗传元件和使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4436598A2 (en) 2024-10-02
MX2024006440A (es) 2024-08-19
IL312965A (en) 2024-07-01
CN118555966A (zh) 2024-08-27
WO2023097003A3 (en) 2023-07-27
KR20240122785A (ko) 2024-08-13
CA3238735A1 (en) 2023-06-01
AU2022397300A1 (en) 2024-06-27
WO2023097003A2 (en) 2023-06-01
AR127764A1 (es) 2024-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7420841B2 (ja) 核酸送達のためのイオン化可能な脂質
TW202218669A (zh) 免疫原性組成物及其用途
TW202340228A (zh) 水痘－帶狀皰疹病毒免疫原組成物及其用途
EP4153152A1 (en) Compositions and methods for producing human polyclonal antibodies
CA3212653A1 (en) Immunogenic compositions
US20230193311A1 (en) Immunogenic compositions and uses thereof
WO2023122789A1 (en) Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
TW202330921A (zh) 免疫原性組成物及其用途
US20240009298A1 (en) Immunogenic compositions and uses thereof
WO2023096990A1 (en) Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2024192422A1 (en) Immunogenic compositions and uses thereof